CN110836924B - 一种双功能激光可裂解探针及其制备方法和质谱应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种双功能激光可裂解探针及其制备方法和质谱应用。采用“一锅反应法”，以聚乙二醇酯为连接臂，通过金‑硫键自组装作用使不同识别基团和质谱报告基团与金纳米粒子连接，得到双功能激光可裂解探针。将该双功能激光可裂解探针应用于质谱检测和成像分析，借助于识别基团对糖苷、核酸、蛋白质、小分子物质等一系列物质的高特异性识别和探针的信号放大设计，能够实现对目标待测物的简单、原位、高灵敏度、定量分析，为相关的生物学过程解释，免疫分析、临床早期诊断、肿瘤标志物筛选和预后治疗等领域提供了有力工具。

Description

一种双功能激光可裂解探针及其制备方法和质谱应用

技术领域

本发明涉及一种双功能材料的制备方法及其质谱应用，具体涉及一种简单易行、普适性强的激光可裂解探针的合成方法，以及基于该探针建立的针对目标待测物的原位、高灵敏、定量的质谱检测和成像方法。

背景技术

蛋白质、核酸、抗原抗体、聚糖等生物大分子作为生命有机体的重要组成部分广泛参与到细胞粘附与识别、免疫应答、受体激活、细菌感染等一系列重要的生物学过程当中。此外，这些物质的结构及含量变化与很多疾病如感染、肿瘤、心血管病、肝病、肾病、糖尿病以及某些遗传性疾病等的发生、发展密切相关，因而受到了广泛关注。在恶性肿瘤细胞中，其细胞膜凝集素或其受体的糖链上往往出现分子量增加、糖链分支增加或者特定糖苷数量增加等现象，而蛋白质和核酸则作为临床上的肿瘤标志物，用于辅助疾病的确诊和分型。因此，建立针对这些目标待测物的简单、原位、灵敏、定量的分析方法对解释相关的生物学过程，免疫分析、临床早期诊断、肿瘤标志物筛选和预后治疗尤为重要。

质谱依靠其强大的结构解析、多物质同时检测能力和优异的定性定量能力已经被广泛应用于疾病相关的组学研究当中。然而，传统的质谱分析方法通常包括复杂的样品前处理步骤。以细胞的糖组学研究为例，往往需要经历细胞裂解、提取蛋白质、酶解、富集糖蛋白、去糖基化等一系列步骤，极易造成样品损失和结果的平均化，丢失了待测物的原位和空间信息。此外，很多目标待测物存在着离子化效率低、质谱信号响应差、产生大量不完整碎片导致谱图解析困难的问题，因此它们的原位、灵敏和快速定量检测仍然是质谱领域面临的挑战。

可裂解分子探针通常指一系列在特定刺激(如酶，酸碱性环境，光照等条件)下发生分子内化学键断裂，裂解为容易被分析和检测的报告基团，从而实现更为灵敏的分析和检测的化合物。一般而言，在可裂解分子探针一端连接可以与目标待测物发生相互作用并结合的识别基团，另一端连接可通过特定刺激实现释放的报告基团。可裂解分子探针的引入将对目标待测物的检测转化为对报告基团质谱信号的检测，大大提高了质谱对目标分子的检测能力。而质谱成像是研究分子空间分布情况的新兴技术，具有不需要荧光标记、样品前处理简单、可以提供目标分子及其空间分布信息等优点，在临床病理学研究、组学研究和药物筛选等领域具有广泛的应用前景，已成为当前成像分析的前沿和热点研究领域。文献(C.F.Dai,L.H.Cazares,L.F.Wang,Y.Chu,S.M.L.Wang,D.A.Troyer,O.J.Semmes,R.R.Drake,and B.H.Wang.Chemical Communications,2011,47,10338-10340.和Z.Y.He,Q.S.Chen,F.M.Chen,J.Zhang,H.F.Li and J.M.Lin.Chemical Science,2016,7,5448-5452.)中报道了利用光裂解探针用于生物分子的原位检测方法，然而这些方法要么在探针合成上步骤繁琐，缺乏普适性，导致缺少质谱报告基团而不利于多种待测物的同时分析，要么需要二次放大策略提高检测灵敏度，从而引入了冗长的样品前处理步骤；此外，这些探针在进行质谱分析时均需要添加额外的基质辅助待测物的解吸附离子化，功能单一。

发明内容

针对现有可裂解探针合成方法繁琐，缺乏普适性，功能单一，在分析目标待测物时样品前处理复杂的问题，本发明的目的在于克服上述缺陷，开发一种双功能激光可裂解探针，提供普适性合成方法，建立针对一系列目标待测物的简单、原位、灵敏、定量的质谱检测和成像方法。

为了实现上述目的，本发明采取如下的技术方案：

一种双功能激光可裂解探针，包括金纳米粒子基底及其上修饰的识别基团和质谱报告基团，所述识别基团和质谱报告基团与金纳米粒子基底的连接方式如式I所示：

其中，-S(CH₂)_x(OCH₂CH₂)_mR'为质谱报告基团，其与金纳米粒子通过金-硫键自组装作用相连，x和m为自然数，R'代表氢、羟基、烷氧基、羧基、氨基或烷胺基；R代表识别基团，其与金纳米粒子通过连接臂-SCH₂CH₂(OCH₂CH₂)_nOCH₂CH₂CONH-相连，n为5～10的整数。

式I中，优选的，x为2～11的整数，m为3～10的整数。所述烷氧基优选C1～C5的烷氧基，例如甲氧基、乙氧基等；所述烷胺基优选C1-C5的烷胺基，例如甲胺基、二甲胺基等。

进一步的，所述双功能激光可裂解探针中金纳米粒子基底的粒径优选为10～20nm，识别基团和质谱报告基团在金纳米粒子基底表面形成厚度1.5～3nm厚的化学修饰层，所构成的双功能激光可裂解探针的粒径一般为15～23nm。

本发明所述的双功能激光可裂解探针中，所述质谱报告基团优选为(11-巯基十一烷基)m(乙二醇)，在激光解吸附离子化质谱中，产生三簇特征质谱报告基团信号，当质谱报告基团为(11-巯基十一烷基)六(乙二醇)时(即式I中x＝11，m＝6，R'＝-OH时)，它们的质荷比分别为893.6，925.6，957.6。

所述识别基团为带有氨基的具有识别功能的基团，其能与目标待测物发生特定的相互作用，从而具有识别功能。

本发明还提供了一种制备所述的双功能激光可裂解探针的合成方法，包括以下步骤：

(1)以式II所示的N-琥珀酰亚胺聚乙二醇酯和带氨基的识别基团为原料，将其溶解于4-羟乙基哌嗪乙磺酸缓冲液或者碳酸氢钠缓冲液中，识别基团上的氨基与N-琥珀酰亚胺发生取代反应，将识别基团修饰在连接臂的两端，得到式III所示的结构：

其中R代表识别基团，n为5～10的整数；

(2)将金纳米粒子溶液，碳酸钾或者碳酸钠加入上述步骤(1)的溶液中，继续反应，识别基团修饰的连接臂发生分子内二硫键断裂，通过金-硫自组装作用修饰在金纳米粒子表面，得到识别基团修饰的金纳米粒子，连接方式如式IV所示：

(3)将质谱报告基团加入上述步骤(2)的溶液中继续反应，所述质谱报告基团是端基为巯基的聚乙二醇分子同系物，其通过金-硫自组装作用修饰在金纳米粒子表面，得到由识别基团和质谱报告基团修饰的激光可裂解探针。

上述双功能激光可裂解探针的制备方法，采用“一锅反应法”在金纳米粒子基底上修饰识别基团和质谱报告基团。其中，步骤(1)所述的N-琥珀酰亚胺聚乙二醇酯是指端基为N-琥珀酰亚胺，内部由二硫键连接的聚乙二醇酯(见式II)；所述的识别基团是指能与目标待测物发生相互作用，具有识别功能的基团，通常是带有氨基功能团的蛋白质、核酸适配体、小分子化合物等，所述蛋白质例如凝集素、抗原抗体、肿瘤标志物糖蛋白等一系列物质。优选的，识别基团与N-琥珀酰亚胺聚乙二醇酯的摩尔比例为1∶1～2∶1；所述4-羟乙基哌嗪乙磺酸缓冲液或碳酸氢钠缓冲液的pH为7.5～8.5，浓度为10-100mM。步骤(1)反应时间优选为12～24h；反应温度为室温。

步骤(2)中，所述金纳米粒子的粒径范围为10～20nm，所添加的金纳米粒子溶液的浓度为5～20nM。金纳米粒子的制备可以通过柠檬酸三钠还原氯金酸的方法，例如：要制备粒径为13nm，浓度为15nM的金纳米粒子溶液，具体方法是将10mL 38.8mM的柠檬酸三钠溶液加入沸腾的100mL 1mM氯金酸溶液中，待溶液变为紫红色后继续反应10min，移去热源，自然冷却后即得金纳米粒子溶液。

优选的，步骤(2)的反应中，所述识别基团与金纳米粒子的摩尔浓度比例为50∶1～500∶1；碳酸钾或碳酸钠的最终浓度为1～5mM；反应时间4～12h，反应温度为室温。

步骤(3)中所述的质谱报告基团是指端基为巯基的聚乙二醇分子同系物，如式V所示：

其中x和m为自然数，具体以不同目标待测物体系定值；R'为包括氢、羟基、烷氧基、羧基、氨基、烷胺基等在内的官能团。

优选的，式V中，x为2～11的整数，m为3～10的整数；所述烷氧基优选C1～C5的烷氧基，例如甲氧基、乙氧基等；所述烷胺基优选C1-C5的烷胺基，例如甲胺基、二甲胺基等。代表性的质谱报告基团例如：

HSCH₂CH₂(OCH₂CH₂)_mOCH₃；

HS(CH₂)₁₁(OCH₂CH₂)_mOH；

HS(CH₂)₁₁(OCH₂CH₂)_mCOOH；

HS(CH₂)₁₁(OCH₂CH₂)_mN(CH₃)₃ ⁺；……

考虑到质谱报告基团本身产生的非特异性吸附应降到最低，优选为(11-巯基十一烷基)m(乙二醇)，其分子结构式如下：

(11-巯基十一烷基)m(乙二醇)与金纳米粒子的连接方式如下所示：

式VI和式VII中，m优选为3～10的整数。

步骤(3)中，质谱报告基团与金纳米粒子的摩尔浓度比例为5000∶1～50000∶1；反应时间12～24h，反应温度为室温。

端基为巯基的聚乙二醇分子同系物的制备可以通过一种普适性的三步合成法，包括取代反应、加成反应和醇解反应，以(11-巯基十一烷基)m(乙二醇)为例，反应方程式如下：

本发明中双功能激光可裂解探针的制备方法简单易行，采用“一锅反应法”，所有反应只需在室温搅拌下进行；该方法具备普适性，通过选择不同的识别基团和质谱报告基团即可设计针对多种目标待测物的探针，实现多目标同时检测。该普适性制备方法可用于合成一系列识别聚糖、核酸、蛋白质、小分子化合物等物质的探针，有望广泛应用于解释相关的生物学过程、免疫分析、质谱成像、疾病临床诊断、肿瘤标志物筛选以及预后治疗等领域。

本发明中双功能激光可裂解探针具有双重功能，不仅能够识别和结合目标待测物，还可作为激光解吸附离子化质谱的基质，促进待测物的解吸附离子化过程，直接应用于质谱检测和成像分析。因而该探针很好地解决了当前可裂解探针的缺陷，具有合成方法简单，具备普适性，样品前处理步骤简单，功能多样的优点。

在上述双功能激光可裂解探针的基础上，本发明还提供了一种针对聚糖、核酸、蛋白、小分子化合物等一系列目标待测物的原位质谱分析方法，即使用所述的双功能激光可裂解探针作为分析工具，借助于识别基团对目标待测物的高特异性识别和探针的信号放大设计，将对待测物的检测转化为对大量质谱报告基团的检测，实现了对目标待测物的简单、原位、高灵敏度、定量分析。

具体的，本发明针对目标待测物的原位的质谱分析方法，将所述双功能激光可裂解探针与含有目标待测物的样本共孵育，然后清洗除去未结合的双功能激光可裂解探针，样本干燥后用于激光解吸附离子化质谱的检测和成像质谱的分析。本发明的质谱分析方法不仅可以对样本中的目标待测物进行定性分析，还可以进行定量和半定量分析。在半定量分析中，将含有不同数量目标待测物的样本分别与双功能激光可裂解探针共孵育，清洗除去未结合的双功能激光可裂解探针，样本干燥后加入一定量的内标分子，通过质谱图中探针和内标分子上的质谱报告基团的相对强度对目标待测物进行半定量分析。

上述质谱分析方法中，所述的样本可以是含有聚糖、核酸、蛋白质或小分子化合物等目标待测物的一系列样本，如生物样本例如细胞、体液、组织，环境样本例如海水、土壤、食物样本等。激光波长由仪器激光器确定，一般为337nm或355nm，激光强度和频率以能产生质谱报告基团信号为准，但在测试过程中需保持不变。

所述的内标分子通常是利用不同于激光可裂解探针的另一种巯基聚乙二醇分子同系物修饰的金纳米粒子，其与本发明中质谱报告基团的连接方式类似，同样通过金-硫自组装作用连接。由于两种质谱报告基团具有相似的离子化效率和质谱响应，因此它们的相对强度可以对目标待测物进行半定量分析，避免系统误差。

本发明中针对目标待测物的质谱分析方法首先通过激光可裂解探针表面的识别基团与待测物之间发生相互作用进行结合，随后利用激光解吸附离子化质谱对结合的金纳米粒子探针进行原位检测，激光作用下，质谱报告基团从金纳米粒子探针表面解吸附离子化从而得到特征质谱信号，反映了目标待测物的含量。该方法将对目标待测物的检测转化为对大量质谱报告基团的检测，无需二次放大即可实现原位、高灵敏、定性定量分析，避免了对待测物进行直接检测时的离子化效率低，质谱响应较差，谱图解析困难等问题。

本发明中针对目标待测物的分析方法，样品前处理步骤简单，无需添加任何额外基质即可直接进行质谱检测和成像分析。通过简单的孵育，清洗，自然干燥步骤，该探针即可实现癌症和癌旁组织，组织中不同病变以及不同结构区域的区分，有望于直接用于临床早期诊断和肿瘤标志物的筛选。

附图说明

图1为本发明所制备的双功能激光可裂解探针的合成路线及其质谱应用的示意图。

图2为本发明实施例1所制备的双功能激光可裂解探针的透射电子显微镜图。

图3为本发明实施例1所制备的双功能激光可裂解探针的激光解吸附离子化质谱图。

图4为实施例2中两种双功能激光可裂解探针与MCF-7细胞孵育后的质谱原位检测结果。

图5为实施例3中两种双功能激光可裂解探针与肝细胞癌组织和癌旁组织孵育后的质谱成像结果。

具体实施方式

下面结合附图，通过实施例进一步阐述本发明的技术方案，但是本申请的保护范围不受这些实施例的具体条件的限制。

实施例1：

双功能激光可裂解探针的合成，采用“一锅反应法”，具体的制备方法如下：

向50mL圆底烧瓶中加入5mL 10mM 4-羟乙基哌嗪乙磺酸缓冲液(pH＝7.5)，加入5mg刀豆蛋白凝集素(或6.86mg接骨木凝集素)和55μL浓度为0.45mM的4,7,10,13,16,19,22,25,32,35,38,41,44,47,50,53-十六烷氧杂-28,29-二硫杂五十六烷二酸二-N-琥珀酰亚胺酯(式II，n＝7时)，反应混合物在室温下搅拌12小时，向溶液中加入33mL 15nM的金纳米粒子溶液和11mg碳酸钾(最终浓度为1.8mM)，继续搅拌反应12小时。随后，加入2.5mL10mM的质谱报告分子(11-巯基十一烷基)六(乙二醇)(或(11-巯基十一烷基)四(乙二醇))，在室温下继续搅拌24小时。混合溶液在12000rmp条件下离心，并用去离子水清洗三次除去杂质，金纳米粒子重新分散于去离子水中，得到最终浓度为10nM的双功能激光可裂解探针，保存在4℃下直至使用。

双功能激光可裂解探针的合成路线如图1所示；所合成的双功能激光可裂解探针的透射电子显微镜图如图2所示，探针粒径为15-23nm，以19nm居多；激光解吸附离子化质谱图如图3所示，图3所检测到的报告基团(以(11-巯基十一烷基)六(乙二醇)为例)质谱特征信息如表1所示。

质荷比	893.6	925.6	957.6
				对应的分子式	[M-M+Na]<sup>+</sup>	[M-S-M+Na]<sup>+</sup>	[M-S-S-M+Na]<sup>+</sup>

其中M为(11-巯基十一烷基)六(乙二醇)质谱报告基团，三簇质谱峰分别对应于以C-C键，以S和以S-S键连接后加钠的产物，当报告基团为(11-巯基十一烷基)m(乙二醇)时，可得类似的特征峰。

实施例2：

将实施例1制备的双功能激光可裂解探针用于细胞表面糖苷的原位分析，其具体步骤如下：

将浓度为10⁵/mL的细胞悬浮液滴加在ITO导电玻璃表面，将该玻璃置于细胞培养箱中，在37℃，5％CO₂的氛围下培养24小时，使细胞自然贴壁生长。随后小心取出玻璃片，吸去玻璃表面的培养基，用PBS磷酸缓冲液清洗细胞一遍，加入1mL多聚甲醛溶液固定细胞10min，固定后将多聚甲醛溶液吸去并用PBS磷酸缓冲液清洗细胞三遍。之后在玻璃表面加入重新分散于PBS溶液(含0.1mM Ca²⁺和Mn²⁺)，浓度为1nM的两种激光可裂解探针(分别用刀豆蛋白和(11-巯基十一烷基)六(乙二醇)修饰或者接骨木凝集素和(11-巯基十一烷基)四(乙二醇)修饰)，与细胞在37℃条件下孵育1小时。孵育结束，用PBS磷酸缓冲液清洗细胞三遍，洗去未结合的探针，在室温下自然干燥，利用激光解吸附离子化质谱进行分析。

细胞与激光可裂解探针孵育之后的质谱图如图4所示，特征质谱峰对应(11-巯基十一烷基)六(乙二醇)和(11-巯基十一烷基)四(乙二醇)在激光下的信号，分别反映了细胞表面甘露糖和唾液酸的含量。

实施例3：

将实施例1制备的双功能激光可裂解探针用于组织表面糖苷的原位成像分析，其具体步骤如下：

利用冰冻切片法，以15％明胶水溶液为包埋剂，在-20℃条件下对新鲜肝细胞癌和癌旁组织进行切片，切片厚度为8μm，贴于ITO导电玻璃表面，癌组织和癌旁组织置于同一片ITO玻璃上。在组织切片上滴加重新分散于PBS溶液(含0.1mMCa²⁺和Mn²⁺)，浓度为10nM的激光可裂解探针，在37℃条件下孵育1小时。孵育结束，用PBS磷酸缓冲液清洗组织三遍，洗去未结合的探针，最后用去离子水清洗一遍。组织在室温下自然干燥，利用激光解吸附离子化成像质谱进行分析。

两种双功能激光可裂解探针与肝细胞癌组织和癌旁组织孵育后的质谱成像结果如图5所示。特征质谱峰对应(11-巯基十一烷基)六(乙二醇)或(11-巯基十一烷基)四(乙二醇)在激光下的信号，反映了组织表面甘露糖或唾液酸的含量。肝细胞癌组织中唾液酸含量明显高于癌旁组织，而甘露糖含量则基本保持不变。

Claims (13)

1.一种双功能激光可裂解探针，包括金纳米粒子基底及其上修饰的识别基团和质谱报告基团，所述识别基团和质谱报告基团与金纳米粒子基底的连接方式如式I所示：

其中，-S(CH₂)_x(OCH₂CH₂)_mR'为质谱报告基团，其与金纳米粒子通过金-硫键自组装作用相连，x和m为自然数，R'代表氢、羟基、烷氧基、羧基、氨基或烷胺基；R代表识别基团，其与金纳米粒子通过连接臂-SCH₂CH₂(OCH₂CH₂)_nOCH₂CH₂CONH-相连，n为5～10的整数。

2.如权利要求1所述的双功能激光可裂解探针，其特征在于，式I中x为2～11的整数，m为3～10的整数；所述烷氧基为C1～C5的烷氧基；所述烷胺基为C1-C5的烷胺基。

3.如权利要求1所述的双功能激光可裂解探针，其特征在于，所述双功能激光可裂解探针的粒径为15～23nm，其中金纳米粒子基底的粒径为10～20nm。

4.如权利要求1所述的双功能激光可裂解探针，其特征在于，所述质谱报告基团为(11-巯基十一烷基)m(乙二醇)，其中m为3～10的整数。

5.如权利要求1所述的双功能激光可裂解探针，其特征在于，所述识别基团为带有氨基的具有识别功能的基团。

6.一种双功能激光可裂解探针的制备方法，包括以下步骤：

1)以式II所示的N-琥珀酰亚胺聚乙二醇酯和带氨基的识别基团为原料，将其溶解于4-羟乙基哌嗪乙磺酸缓冲液或者碳酸氢钠缓冲液中，识别基团上的氨基与N-琥珀酰亚胺聚乙二醇酯发生取代反应，将识别基团修饰在连接臂的两端，得到式III所示的结构：

其中，R代表识别基团，n为5～10的整数；

2)将金纳米粒子溶液，碳酸钾或者碳酸钠加入步骤1)的溶液中继续反应，识别基团修饰的连接臂发生分子内二硫键断裂，通过金-硫自组装作用修饰在金纳米粒子表面，得到识别基团修饰的金纳米粒子，连接方式如式IV所示：

3)将质谱报告基团加入步骤2)的溶液中继续反应，所述质谱报告基团是端基为巯基的聚乙二醇分子同系物，其通过金-硫自组装作用修饰在金纳米粒子表面，得到由识别基团和质谱报告基团修饰的激光可裂解探针。

7.如权利要求6所述的制备方法，其特征在于，所述的识别基团是带有氨基功能团的蛋白质、核酸适配体或小分子化合物，步骤1)中所述识别基团与N-琥珀酰亚胺聚乙二醇酯的摩尔比例为1∶1～2∶1；所述4-羟乙基哌嗪乙磺酸缓冲液或碳酸氢钠缓冲液的pH为7.5～8.5，浓度为10-100mM。

8.如权利要求6所述的制备方法，其特征在于，步骤2)中所述金纳米粒子的粒径范围为10～20nm，所述识别基团与金纳米粒子的摩尔浓度比例为50∶1～500∶1；碳酸钾或碳酸钠的终浓度为1～5mM。

9.如权利要求6所述的制备方法，其特征在于，步骤3)中所述的质谱报告基团是式V所示的端基为巯基的聚乙二醇分子同系物：

其中，x和m为自然数，R'代表氢、羟基、烷氧基、羧基、氨基或烷胺基。

10.如权利要求9所述的制备方法，其特征在于，所述质谱报告基团是(11-巯基十一烷基)m(乙二醇)，其结构如式VI所示：

步骤3)反应后，(11-巯基十一烷基)m(乙二醇)与金纳米粒子的连接方式如下所示：

式VI和式VII中，m为3～10的整数。

11.如权利要求6所述的制备方法，其特征在于，步骤3)中质谱报告基团与金纳米粒子的摩尔浓度比例为5000∶1～50000∶1。

12.一种原位质谱分析方法，将权利要求1～5任一所述的双功能激光可裂解探针与含有目标待测物的样本共孵育，然后清洗除去未结合的双功能激光可裂解探针，样本干燥后直接用于激光解吸附离子化质谱的检测和成像质谱的分析。

13.如权利要求12所述的原位质谱分析方法，其特征在于，将含有不同数量目标待测物的样本分别与所述双功能激光可裂解探针共孵育，清洗除去未结合的双功能激光可裂解探针，样本干燥后加入一定量的内标分子，通过质谱图中探针和内标分子上的质谱报告基团的相对强度对目标待测物进行半定量分析。

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