JP5943943B2 - 核染色のための量子ドットの適用 - Google Patents
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Description
から選択される。
(1)量子ドットと;
DNA結合分子を含むDNA結合部分を含むコンジュゲートであって、DNA結合分子が主溝バインダー、DNA介入剤、DNAアルキル化剤、又はそれらの組合せであるコンジュゲート。
(2)DNA結合部分が、4',6-ジアミジノ-2-フェニルインドール(DAPI)、ビス-ベンズイミド染料、ソラレン、又はナフタレンジイミドから選択されるDNA結合分子を含む、(1)に記載のコンジュゲート。
(3)DNA結合部分がリンカーをさらに含み、コンジュゲートが次の構造:
量子ドット−リンカー−DNA結合分子
を有する(1)に記載のコンジュゲート。
(4)リンカーが、1〜30炭素長さの脂肪族鎖又はnが2〜15である(-OCH 2 CH 2 -)nを含む(3)に記載のコンジュゲート。
(5)リンカーが多官能性リンカーであり、複数のDNA結合分子が多官能性リンカーに結合している(3)に記載のコンジュゲート。
(6)DNA結合部分が
である(3)に記載のコンジュゲート。
(7)核を可視化する方法において、
組織試料をプロテアーゼで前処理して前処理された組織試料を形成し;
前処理された組織試料を、a)ナノ粒子及びb)DNA結合分子を含むDNA結合部分を含むコンジュゲートと共に、コンジュゲートが前処理された組織試料内に核を挿入させるのに十分な条件下でインキュベートし、ここでコンジュゲートは核内においてDNAに結合しており;
ナノ粒子を可視化させ、よって核を可視化させる
ことを含む方法。
(8)ナノ粒子が、量子ドット、金属ナノ粒子、金属酸化物ナノ粒子、又は遷移金属錯体ナノ粒子を含む(7)に記載の方法。
(9)ナノ粒子が量子ドットを含み、ナノ粒子の可視化が、量子ドットの光安定性蛍光の可視化を含む(7)に記載の方法。
(10)DNA結合分子が副溝バインダー、主溝バインダー、DNA介入剤、DNAアルキル化剤、又はそれらの組合せである(7)に記載の方法。
(11)DNA結合分子が、4',6-ジアミジノ-2-フェニルインドール(DAPI)、ビス-ベンズイミド染料、ソラレン、又はナフタレンジイミドである(10)に記載の方法。
(12)DNA結合部分がリンカーをさらに含み、コンジュゲートが次の構造:
ナノ粒子−リンカー−DNA結合分子
を有する(7)に記載の方法。
(13)DNA結合部分が
である(12)に記載の方法。
(14)コンジュゲートが、少なくとも20nMの濃度で組織試料と共にインキュベートされる(7)に記載の方法。
(15)核の特徴を定量的に測定するコンピューター画像解析技術を使用することをさらに含む(7)に記載の方法。
(16)核の特性が、染色体分布、倍数性、形状、サイズ、テクスチャ特性、コンテクスチャ特性、又はそれらの組合せを含む(15)に記載の方法。
(17)組織試料がプロテアーゼで4−8分前処理され、組織試料がプロテアーゼでの前処理前に固定される(7)に記載の方法。
(18)コンジュゲートと共に前処理された組織試料をインキュベートする前に、組織試料内の標的にハイブリダイズ可能なプローブを提供し;
プローブが組織試料内の標的にハイブリダイズするのに十分な条件下でプローブを組織試料と共にインキュベートし;
プローブを検出する
ことをさらに含む(7)に記載の方法。
(19)プローブの検出が、プローブと結合した量子ドットの可視化を含む(18)に記載の方法。
(20)コンジュゲートのナノ粒子が、プローブと結合した量子ドットとは異なる波長で蛍光を発光可能な量子ドットを含む(19)に記載の方法。
(21)組織試料について蛍光インサイツハイブリダイゼーション法を実施することをさらに含む(7)に記載の方法。
(22)蛍光インサイツハイブリダイゼーション法が、HER2アッセイ、TMPRSS2-ERGアッセイ、Chr17アッセイ、又はそれらの組合せを含む(21)に記載の方法。
(23)核を可視化するためのキットであって、
プロテアーゼ酵素及びプロテアーゼバッファーを含有し、プロテアーゼバッファーが、プロテアーゼ酵素がタンパク質分解活性を示すのに十分な塩濃度及びpHを有するプロテアーゼ酵素組成物、
a)ナノ粒子とb)DNA結合分子を含むDNA結合部分とを含むコンジュゲート;
プロテアーゼ酵素組成物で前処理された組織試料内にコンジュゲートが核を挿入するのを可能にするのに十分な塩濃度及びpHを有する反応バッファー
を含むキット。
(24)ナノ粒子が、量子ドット、金属ナノ粒子、金属酸化物ナノ粒子、又は遷移金属錯体ナノ粒子を含む(23)に記載のキット。
(25)DNA結合分子が、副溝バインダー、主溝バインダー、DNA介入剤、DNAアルキル化剤、又はそれらの組合せである(23)に記載のキット。
以下の解釈の用語及び略語が、本開示をより良好に記述し、本開示の実施において当業者の指針となるように提供される。ここで使用される場合、「含む(comprising)」は「含む(including)」を意味し、単数形態「a」又は「an」又は「the」は、特に明確に示されない限り、複数への言及を含む。「又は」なる用語は、特に明確に示されない限り、言及される代替要素の単一の要素あるいは2以上の要素の組合せを意味する。
ナノ物質、例えば量子ドット、ナノ結晶、及びナノ粒子は、それらの構造-及び化学-依存性の電子及び光学特性のために、それらの小分子フルオロフォアカウンターパートに対して独特の利点をもたらす。ナノ物質、例えば半導体性のナノ結晶は、ブロードなスペクトル光学吸収性、大きなストークスシフト、狭い発光スペクトル、及び/又は光安定性の高量子収率等の光学特性を有する。これにより、ナノ物質は、優れた光学レポーターとなる。発光スペクトルが狭いため、ナノ結晶はそれらの光学的シグナチュアにより差別化でき、光ルミネセンスシグナルの回旋がほんんどないか又は全くないマルチプレックス蛍光アッセイに使用することができる。シグナルのスペクトル範囲は、UVから近IRに及びうる。
核DNAにナノ物質を向ける能力は、DNAと相互作用可能な小分子にナノ粒子(例えば、量子ドット)をコンジュゲートさせることによって提供される。ナノ物質を標的にしDNAに向ける小分子は、有機分子、無機分子、又は遷移金属錯体でありうる。これらの薬剤は、水素結合、静電気的相互作用、ファンデルワールス力、及び/又は共有結合を介して、DNAと相互作用する。それらは、副溝及び主溝バインダー、ホスフェート骨格バインダー、介入剤、及び塩基修正剤/アルキル化剤等、DNAに対する位置選択性をベースにしたカテゴリーにさらに分類することができる。例示的な小分子には、限定されるものではないが、DNA溝バインダー、例えばDAPI及びヘキスト染料;介入剤、例えばソラレン、ナフタレンジイミド、及びSYBR101(Invitrogen Corporationから入手可能な蛍光染料)、及びDNA塩基修正剤、例えばソラレンが含まれる。いくつかのDNA相互作用分子は、メカニズムの組み合わせ、すなわち副溝結合と介入、介入とアルキル化等、及び他の組合せを介して相互作用する。例示的な分子には、レキシトロプシン、コンビレキシン、ペプチド核酸、及びトポイソメラーゼIインヒビター(例えば、インデノイソキノリン)が含まれる(例えば、Pindurら, Current Medicinal Chemistry, 2005, 12:2805-2847.)。
DNAの副溝に結合する小分子には、限定されるものではないが、DAPI、ヘキスト染料、ジスタマイシンA、ネトロプシン、アクチノマイシンD、レキシトロプシン、コンビレキシン、N-メチルピロール及びN-メチルイミダゾールポリアミドが含まれる。ヘキスト染料はビス-ベンズイミド類のファミリーである。ヘキスト染料の一つ、ヘキスト33342の構造を以下に示す:
他の一般的なヘキスト染料はヘキスト33258であり、エチル基の代わりに水素を有する点がヘキスト33342とは異なる。
DAPIは2本鎖DNAの副溝においてATヌクレオチドクラスターと会合し、核対比染料として使用されうる。DAPIは青色蛍光を生じるが、他の蛍光染料のように、DAPIは、経時的に光ルミネセンス強度の光誘発性劣化を被る。
介入剤は、2本鎖DNAの塩基の間に挿入されることによって、DNAと相互作用する分子であり;それらは、ファンデルワールス力により所定位置に保持される。例示的なDNA挿入剤には、限定されるものではないが、アクチノマイシンD、コンビレキシン、ソラレン及びナフタレンジイミド(NDI)が含まれる:
これらの分子に量子ドットがコンジュゲートすることで核染色が生じる。染色強度は、特定の介入剤及び細胞又は組織試料に適用されるコンジュゲートの濃度に少なくとも部分的に依存する。
ソラレンリガンドにより提供される他の利点は、DNAの塩基に量子ドットを共有的に結合させる能力である。UV照射下(すなわち>350nm)、ソラレンは、塩基、チミジンに光誘起された2+2付加環化を被る。このプロセスにより、ソラレン-量子ドットのコンジュゲートがDNAに共有的に結合される。アルキル化剤である他のDNAバインダーには、限定されるものではないが、レキシトロプシンのアナログ及び誘導体、及びピロール-イミダゾール-ポリアミド(例えば、ナイトロジェンマスタード)が含まれる(Pindurら)。
ナノ物質、例えば量子ドット、及び少なくとも1のDNA結合、又は標的分子を有するDNA結合部分は、ナノ物質及び/又はDNA-標的分子に、活性化したカルボキシル部分とアミンを利用する標準的な縮合技術と合わせられる。いくつかのDNA結合分子は修飾なしに使用されて、ナノ物質/DNA結合部分コンジュゲートが調製される。例えば、スクシンイミジル-[4-(ソラレン-8-イルオキシ)]ブチラートというソラレン誘導体が商業的に入手可能であり、如何なるさらなる修飾もなく使用可能である。
図10に示すように、ソラレンのスクシンイミジルエステルは、量子ドットの表面上の第1級アミン基と反応することができ、量子ドット-ソラレンコンジュゲートを提供する。
ここに記載の組織試料を、当該技術分野で知られ、又は今後開発される任意の方法を使用して調製することができる。一般的に、組織試料は、培地に組織を固定し包埋することにより調製される。
細胞の核における染色体又はDNAの分布は、コンピュータ及び画像解析技術を使用して、定性的及び/又は定量的に測定することができる。(例えば、Rodenackerら, Analytical Cellular Pathology (2003) 25:1-36を参照)。これらの測定、又は特徴は、異常な細胞挙動の初期兆候を検出し、及び/又は癌を診断し、また患者の成績及び予後を予測するために、使用することができる。
核の可視化を実施するためのキットの実施態様は、ナノ物質/DNA結合部分コンジュゲート、及びプロテアーゼ酵素組成物で前処理された組織試料内においてコンジュゲートが核に入るのに十分な塩濃度及びpHを有する反応バッファーを含む。いくつかの実施態様では、ナノ物質はナノ粒子、例えば金属ナノ粒子又は量子ドットである。DNA結合分子は副溝バインダー、主溝バインダー、介入剤、DNAアルキル化剤、又はその組合せでありうる。
NDI-C6-NHS合成
攪拌棒を具備する10mLのCEMマイクロ波反応容器において、1,4,5,8-ナフタレンテトラカルボン酸二無水物50mg(0.186mmol、1当量、シグマ(Sigma)N181)、N,N-ジメチルエチレンジアミン20.3μL(0.186mmol、1当量、シグマ39030)及びトリエチルアミン25μL(0.186mmol、1当量、シグマT0886)を、無水DMF3mL(EMD biosciences)に溶解させた。CEMディスカバー(Discover)マイクロ波で混合物を140℃まで加熱し、5分、140℃の温度を保持するために、照射中に冷却した。6-アミノカプロン酸24mg(0.186mmol、1当量、シグマA2504)及びトリエチルアミン50μL(0.372mmol、2当量、シグマT0886)を反応物に添加し、140℃まで加熱し、さらに5分冷却した。粗反応物を分取逆相HPLC(10:90のCH3CN:H2Oに0.05%のTFAから90:10の勾配まで、60分以上かけて、360nmでモニタリング)によって精製した。63%の収率で、茶色の粉末が分離された。分析用HPLCの保持時間、5.06分。1H NMR(400MHz、d6-DMSO)δ9.54(s,1H)、8.69(s,4H)、4.43(t,J=5.6Hz,2H)、4.06(t,J=7.4Hz,2H)、3.49(t,J=5.5Hz,3H)、2.92(s,6H)、2.24(t,J=7.3Hz,2H)、1.75−1.63(m,2H)、1.63−1.51(m,2H)、1.39(dd,J=15.0,8.0Hz,2H)。13C NMR(101MHz,DMSO)δ174.89、163.65、163.06、130.98、130.90、126.95、126.74、126.66、126.58、55.14、43.21、35.90、33.94、27.61、26.48、24.67。MS(TOF ESI+)m/z452.1(M+H)。
(1)44mg(0.097mmol、1当量)、N-ヒドロキシスクシンイミド12.3mg(0.107mmol、1.1当量、シグマ130672)、トリエチルアミン68μL(0.485mmol、5当量、シグマT0866)、及びN,N'-ジシクロヘキシルカルボジイミド107μL(ジクロロメタンに入った1.0M溶液、0.107mmol、1.1当量、シグマ379115)を、2mLのジクロロメタン(Sigma)に溶解させた。反応体を2時間攪拌し、焼結ガラス漏斗を通して濾過し、真空で濃縮した。残留物を25mLの酢酸エチルに溶解させ、2部の脱イオン水で洗浄し、無水硫酸ナトリウム上で乾燥させ、濾過し、褐色の油になるまで濃縮したところ、収率90%であった。分析用HPLCの保持時間、6.65分。1H NMR(400MHz、CDCl3)δ8.77(s,4H)、4.38(t,J=6.7Hz,2H)、4.29−4.16(m,2H)、2.83(s,4H)、2.74(t,J=6.5Hz,2H)、2.66(t,J=7.4Hz,2H)、2.39(s,6H)、1.84(tt,J=15.4、7.7Hz,4H)、1.57(dd,J=15.0,7.2Hz,2H)。13C NMR(101MHz,CDCl3)δ169.14、168.46、162.99、162.84、131.02、130.98、126.78、126.71、126.62、56.86、45.68、40.49、38.47、30.78、27.52、26.14、25.58、24.23。MS(TOF ESI+)549.1(M+H)。
NDI-PEG4-NHS合成
攪拌棒を具備する10mLのCEMマイクロ波反応容器において、1,4,5,8-ナフタレンテトラカルボキシル二無水物50mg(0.186mmol、1当量、シグマ(Sigma)N181)、N,N-ジメチルエチレンジアミン20.3μL(0.186mmol、1当量、シグマ39030)及びトリエチルアミン25μL(0.186mmol、1当量、シグマT0886)を、無水N,N-ジメチルホルムアミド3mL(EMD biosciences)に溶解させた。CEMディスカバー(Discover)マイクロ波にて、混合物を140℃まで加熱し、5分冷却した。アミノ-dPEG4-COOH49.4mg(0.186mmol、1当量、クアンタバイオデザイン(QuantaBioDesign)10244)及びトリエチルアミン50μL(0.372mmol、2当量、シグマT0886)を反応体に添加し、140℃まで加熱し、さらに5分冷却した。粗反応体を分取逆相HPLC(10:90のCH3CN:H2Oに0.05%のTFAから90:10の勾配まで、60分以上かけて、360nmでモニタリング)。63%の収率で、茶色の粉末が分離された。分析用HPLCの保持時間、5.69分。MS(TOF ESI+)m/z586.2(M+H)。
(1)69mg(0.118mmol、1当量)、N-ヒドロキシスクシンイミド14.2mg(0.124mmol、1.05当量、シグマ130672)、及びN-(3-ジメチルアミノプロピル)-N'-エチルカルボジイミドヒドロクロリド24.8mg(0.130mmol、1.1当量、シグマ379115)を、2mLのジクロロメタン(Sigma)に溶解させた。反応体を一晩攪拌し、真空で濃縮した。残留物を25mLの酢酸エチルに溶解させ、2部の脱イオン水で洗浄し、濃縮した。定量的収率で褐色の油が分離された。分析用HPLCの保持時間、6.03分。MS(TOF ESI+)683.1(M+H)。
(NMe3)+-NDI-C6-NHS合成
攪拌棒を具備する、10mLのCEMマイクロ波反応容器において、1,4,5,8-ナフタレンテトラカルボキシル二無水物50mg(0.186mmol、1当量、シグマN181)、(2-アミノエチル)トリメチルアンモニウムクロリドヒドロクロリド32.6mg(0.186mmol、1当量、シグマ284556)、及びトリエチルアミン78μL(0.558mmol、3当量、シグマT0886)を、無水DMF3mL(EMD biosciences)に溶解させた。CEMディスカバー(Discover)マイクロ波にて、混合物を140℃まで加熱し、5分冷却した。6-アミノカプロン酸24mg(0.186mmol、1当量、シグマA2504)及びトリエチルアミン78μL(0.558mmol、3当量、シグマT0886)を反応体に添加し、140℃まで加熱し、さらに5分冷却した。粗反応体を分取逆相HPLC(10:90のCH3CN:H2Oに0.05%のTFAから90:10の勾配まで、60分以上かけて、360nmでモニタリング)。91%の収率で、緑/茶色の油性固形物が分離された。HPLCの保持時間、6.09分。
(5)79mg(0.169mmol、1当量)、N-ヒドロキシスクシンイミド23.4mg(0.203mmol、1.2当量、シグマ130672)、トリエチルアミン70.8μL(0.558mmol、3当量、シグマT0886)及びN-(3-ジメチルアミノプロピル)-N'-エチルカルボジイミドヒドロクロリド38.9mg(0.203mmol、1.2当量、シグマ379115)を、2mLのジクロロメタン(Sigma)に溶解させた。反応体を一晩攪拌し、真空で濃縮した。残留物を25mLの酢酸エチルに溶解させ、脱イオン水で洗浄した(2x25mL)、濃縮した。水層を25mLのジクロロメタンで抽出した。有機層を組合せ、濃縮した。定量的収率で褐色の油が分離された。分析用HPLCの保持時間、6.94分。
ビスリンカー含有NDI-C6の合成
3,5-ジヒドロキシ安息香酸3g(19.5mmol、1当量、TCI D2554)、アミノヘキサン酸メチル3.89g(21.4mmol、1.1当量、フルカ(Fluka)07270)、トリエチルアミン8.14mL(58.4mmol、3.0当量、シグマT0886)、及びN,N'-ジシクロヘキシルカルボジイミド29.2mL(1.0M溶液、29.2mmol、1.5当量s、シグマ379115)を、100mLのジクロロメタンで希釈し、一晩攪拌した。粗反応体を濾過し、真空で濃縮した。残留物を酢酸エチル(200mL)で希釈し、1MのHCl(200mL)、飽和NaHCO3(200mL)及びブライン(200mL)で洗浄した。溶液を真空で濃縮し、0.2μmのシリンジフィルターを通過させ、330gのRedisep(登録商標)(Teledyne Isco, Inc., Lincoln, NE)シリコンゲルカラム(酢酸エチル:ヘキサン 5:95勾配から100:0)でのフラッシュクロマトグラフィーにより精製した。収率23%で白色の粉末。分析用HPLCの保持時間、4.08分。1H NMR(400MHz,MeOD)δ6.71(d,J=2.2Hz,2H)、6.42(t,J=2.2Hz,1H)、4.92(s,3H)、3.66(s,3H)、3.41−3.29(m,3H)、2.35(t,J=7.4Hz,2H)、1.64(ddt,J=18.4、14.9、7.4Hz,4H)、1.47−1.33(m,2H)。13C NMR(101MHz,MeOD)δ174.53、169.19、158.43、136.67、105.29、105.05、50.61、39.31、33.28、28.71、26.09、24.29。MS(TOF ESI+)282.4(M+H)。
(7)695 mg(2.47mmol、1当量)、tert-ブチル 3-ブロモプロピルカルバマート1.765 g(7.41mmol、3当量)、及び炭酸カリウム1.366g(9.88mmol、4当量、シグマ310263)を、12mLのN,N-ジメチルホルムアミドで希釈し、50℃まで、一晩加熱した。溶媒を真空で除去し、残留物を酢酸エチルに溶解させ、ブラインで洗浄し、無水硫酸マグネシウム上で乾燥させ、濾過し、白色の固形物になるまで濃縮した。粗物質をフラッシュクロマトグラフィー(50gのBiotage(登録商標)SNAPカラム(Biotage, LLC, Charlotte, NC)、酢酸エチル:ヘキサン12:88勾配から100:0)により精製した。収率73%で白色の固形物が得られた。分析用HPLCの保持時間、10.34分。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ6.89(d,J=2.2Hz,2H)、6.53(t,J=2.2Hz,1H)、6.49(t,J=5.7Hz,1H)、4.84(s,2H)、4.01(t,J=5.9Hz,4H)、3.66(s,3H)、3.44(dd,J=13.1、6.9Hz,2H)、3.31(dd,J=12.3、6.1Hz,4H)、2.33(t,J=7.4Hz,2H)、1.96(p,J=6.1Hz,4H)、1.65(tt,J=15.2、7.5Hz,4H)、1.51−1.35(m,20H)。13C NMR(101 MHz,CDCl3)δ174.12、167.24、159.95、156.03、136.95、105.61、104.28、79.26、65.86、51.55、39.78、37.78、33.84、29.47、29.21、28.41、26.39、24.44。MS(TOF ESI+)596.8 (M+H)。
(8)587mg(0.99mmol、1当量)を、ジクロロメタンにトリフルオロ酢酸が溶解した20%溶液5mLに溶解させ、室温で2.5時間攪拌した。溶媒を真空で除去し、残留物をトルエン/メタノールで共沸した。任意のさらなる精製をすることなく、物質を先に進めた。分析用HPLCの保持時間、4.77分。1H NMR(400MHz,D2O)δ6.77(s,2H)、6.59(s,1H)、4.02(t,J=5.7Hz,4H)、3.22−3.14(m,5H)、3.08 (t,J=7.1Hz,4H)、2.20(t,J=6.6Hz,2H)、2.02(dt,J=12.7,6.4Hz,4H)、1.44(d,J=2.6Hz,4H)、1.19(dd,J=14.6,7.4Hz,2H)。13C NMR(101MHz,D2O)δ178.76、177.34、169.73、169.71、162.89、162.54、159.24、136.18、117.65、114.75、106.06、104.75、65.79、51.93、48.77、39.69、37.32、33.55、33.42、27.92、27.87、26.30、25.52、25.47、23.83。MS(TOF ESI+)418.5(M+Na)。
(9)660.4mg(1.06mmol、1当量)、Fmoc-dPEG4-NHS1.548g(2.65mmol、2.5当量)及びジイソプロピルアミン553μL(3.18mmol、3当量、フルカ03440)を5.3mLのジクロロメタンに溶解させ、室温で一晩攪拌した。粗反応体をフラッシュクロマトグラフィー(Biotage SNAP 50gのシリカゲルカラム、100:0 酢酸エチル:メタノールの勾配から85:15)。分離された577mgの淡褐色の油−41%。分析用HPLCの保持時間、10.51分。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ 7.75(d,J=6.7Hz,2H)、7.60 (d,J=6.2Hz,2H)、7.50−7.35(m,3H)、7.30 (d,J=6.4Hz,2H)、6.97(s,1H)、6.50(s,1H)、4.32(d,J=5.8Hz,2H)、4.21(d,J=5.4Hz,1H)、3.98(s,2H)、3.62(d,J=19.2Hz,20H)、3.42(dd,J=31.9,4.0Hz,11H)、3.12(s,2H)、2.53(d,J=23.4Hz,4H)、2.29(s,1H)、1.94(s,2H)、1.62(d,J=6.6Hz,3H)、1.41(dd,J=17.6,5.6Hz,11H)。13C NMR(101MHz,CDCl3)δ174.20、167.34、161.85、161.51、159.91、157.34、143.93、141.22、136.80、127.70、127.08、125.16、119.94、115.39、105.82、70.05、69.80、67.55、66.79、65.90、53.62、51.50、50.62、47.12、41.98、40.61、39.90、36.60、33.88、29.13、28.74、26.47、25.28、24.54、18.53、17.40、11.80。MS(TOF ESI+)1334.8(M+H)。
(10)577mg(0.432mmol、1当量)及びDBU135μL(0.9mmol、2.1当量)を、2mLのN,N-ジメチルホルムアミドに溶解させ、一晩攪拌した。溶媒を真空で除去した。残留物を水(50mL)に溶解させ、ジクロロメタン(50mL)及び酢酸エチル(50mL)で洗浄した。粗物質を調製用逆相HPLC(10:90のCH3CN:H2Oに0.05%のTFAから90:10の勾配まで、60分以上かけて)。分離された収率23.4%。分析用HPLCの保持時間、5.37分。MS(TOF ESI+)890.6(M+H)。図18及び図19は、それぞれ化合物(11)の1H及び13C NMRスペクトルを示す。
(11)89.9mg(0.08mmol、1当量)、(2)110.3mg(0.201mmol、2.5当量)及びジイソプロピルエチルアミン42μL(0.241mmol、3当量)を3mLのジクロロメタンに溶解させ、室温で一晩攪拌した。粗物質を調製用HPLC(30:70のCH3CN:0.05%TFAのアイソクラチック。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.70(d,J=48.5Hz,7H)、7.50(s,1H)、6.91(s,2H)、6.51(s,1H)、3.98(s,4H)、3.85−3.49(m,34H)、3.38(s,6H)、3.13(s,3H)、2.51(s,3H)、2.32(t,J=7.4Hz,2H)、1.95(s,4H)、1.71−1.56(m,4H)、1.44−1.33(m,2H)。13C NMR(101MHz,CDCl3)δ174.23、172.48、167.96、161.29、160.92、160.55、160.18、160.01、136.50、120.33、117.45、114.56、111.68、105.69、104.70、70.12、70.06、69.93、69.85、69.71、69.60、67.46、66.82、65.79、53.46、51.49、40.01、39.53、36.51、36.08、33.84、28.96、28.70、26.41、24.48。MS(TOF ESI+)1756.9(M+H)。
QD490:NDI-C6を使用する、HER2 3-イン-1における、染色体17プローブとHER2 DNAプローブの評価
染色プロトコル:
以下に提示するDNA染色プロトコルは、QD490:NDI-C6と合わせて、HER2 3-イン-1異種移植(VMSIカタログ番号783-4332)へのものを称するが、全ての遺伝子プローブアッセイを含むことを一般的とすることができる。プロトコルは、必要ならば、遺伝子プローブ及び組織型に応じて変えることができる。以下、自動化されたVMSI Benchmark(登録商標)XT機器からの手順に適合させたものである。
1.スライド上の、ホルマリン固定されたパラフィン包埋組織を75℃まで4分加熱し、EZPrepTM(10X、VMSI #950−102)で2回処理し、75℃で容量を調節し、その後、Liquid CoverslipTM(VMSI #650−010)を適用した。ついで、スライドを76℃まで4分加熱し、スライドをすすぎ、EZPrepTM容量を調節し、組織の脱パラフィン化のために、Liquid CoverslipTMを用いた。スライドを37℃まで冷却し、4分インキュベートし、反応バッファー(10X、VMSI#950−300)ですすいだ。
2.ついで、スライドを95℃まで加熱し、8、12、8分の3サイクルで、Cell Condition #2(CC2 VMSI#950−123)で前処理し、ついで、各サイクル後に、短いLiquid CoverslipTMを適用した。ついで、スライド用ヒーターを停止させ、スライドを反応バッファーで3回すすぎ、各時にLiquid CoverslipTMを適用した。
3.スライドを37℃まで加熱し、4分インキュベートし、反応バッファーで1回すすいだ。ISH-プロテアーゼ3を8分適用し、反応バッファーで2回すすいだ。
4.スライドをSSC(10X、VMSI#950−110)で2回すすいだ。
5.1滴の銀インサイツハイブリダイゼーション(SISH)検出溶液(VMSI SISH検出キット#780−001)を適用し、4分インキュベートした。
6.2滴のDNP標識されたHER2 DNAプローブ(VMSI#780−4332)又はDNP標識された染色体17プローブ(VMSI#780−4331)を適用し、4分インキュベートし、ついで、核酸変性のためにスライドを95℃まで12分加熱した(DNP=2,4-ジニトロフェノール)。
7.12分インキュベートした後、短いLiquid CoverslipTMを適用し、スライドを、HER2DNAプローブを使用する場合は52℃で2時間、又は染色体17プローブを使用する場合は44℃で2時間ハイブリダイゼーションした。
8.プローブをハイブリダイゼーションした後、スライドをSSCで2回すすぎ、72℃で8分、スライドを冷却した後に、2.0xSSDの緊縮洗浄を3回受容した。
9.スライドを反応バッファーですすぎ、37℃まで4分温めた。ついで、1滴のQD655:マウス抗-DNPを、Liquid CoverslipTMを有する双方のプローブスライドに適用し、37℃で32分インキュベートした。
10.ついで、スライドを反応バッファーで3回すすぎ、QD490:NDI C6を、室温でLiquid CoverslipTMと共に32分、スライドにおいてインキュベートした。
11.スライドを機器から取り外し、反応バッファーで2回洗浄した。ついで、配列有するライドを階級的アルコールとキシレンで脱水し、カバースリップを手作業で適用した。
Claims (15)
- ナノ粒子と、
DNA結合分子及び分枝状リンカーを含むDNA結合部分とを含むコンジュゲートであって、DNA結合分子が副溝バインダー、主溝バインダー、DNA介入剤、DNAアルキル化剤、又はそれらの組合せであり、コンジュゲートが次の構造:
ナノ粒子−リンカー−DNA結合分子
を有し、
DNA結合分子が
である、コンジュゲート。 - ナノ粒子が、量子ドット、金属ナノ粒子、金属酸化物ナノ粒子又は遷移金属複合体ナノ粒子を含む、請求項1に記載のコンジュゲート。
- DNA結合部分が、4',6-ジアミジノ-2-フェニルインドール(DAPI)、ビス-ベンズイミド染料、ソラレン、又はナフタレンジイミドから選択されるDNA結合分子を含む、請求項1または2に記載のコンジュゲート。
- 分枝状リンカーが、1〜30炭素原子長さの脂肪族鎖又はnが2〜15である(-OCH2CH2-)nを含む請求項1〜3のいずれか一項に記載のコンジュゲート。
- 分枝状リンカーが多官能性リンカーを含み、複数のDNA結合分子が多官能性リンカーに結合している請求項1〜4のいずれか一項に記載のコンジュゲート。
- 固定された組織試料における核を可視化する方法において、
組織試料をプロテアーゼで前処理して前処理された組織試料を形成し;
前処理された組織試料を、請求項1から5の何れか一項に記載のコンジュゲートと共に、コンジュゲートが前処理された組織試料内に核を挿入させるのに十分な条件下でインキュベートし、ここでコンジュゲートは核内においてDNAに結合しており;
ナノ粒子を可視化させ、よって核を可視化させる
ことを含む方法。 - ナノ粒子が量子ドットを含み、ナノ粒子の可視化が、量子ドットの光安定性蛍光の可視化を含む請求項6に記載の方法。
- コンジュゲートが、少なくとも20nMの濃度で組織試料と共にインキュベートされる請求項6または7に記載の方法。
- 核の特性を定量的に測定するコンピューター画像解析技術を使用することをさらに含む請求項6〜8のいずれか一項に記載の方法。
- 核の特性が、染色体分布、倍数性、形状、サイズ、テクスチャ特性、コンテクスチャ特性、又はそれらの組合せを含む請求項9に記載の方法。
- 組織試料がプロテアーゼで4〜8分間前処理され、組織試料がプロテアーゼでの前処理前に固定される請求項6〜10のいずれか一項に記載の方法。
- コンジュゲートと共に前処理された組織試料をインキュベートする前に、組織試料内の標的にハイブリダイズ可能なプローブを提供し;
プローブが組織試料内の標的にハイブリダイズするのに十分な条件下でプローブを組織試料と共にインキュベートし;
プローブを検出する
ことをさらに含む請求項6〜11のいずれか一項に記載の方法。 - プローブの検出が、プローブと結合した量子ドットの可視化を含み、コンジュゲートのナノ粒子が、プローブと結合した量子ドットとは異なる波長で蛍光を発光可能な量子ドットを含む請求項12に記載の方法。
- 組織試料について蛍光インサイツハイブリダイゼーション法を実施することをさらに含む請求項6〜13のいずれか一項に記載の方法。
- 蛍光インサイツハイブリダイゼーション法が、HER2アッセイ、TMPRSS2-ERGアッセイ、Chr17アッセイ、又はそれらの組合せを含む請求項14に記載の方法。
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