JP4111099B2

JP4111099B2 - 生化学分析方法及び装置

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Publication number: JP4111099B2
Application number: JP2003297775A
Authority: JP
Inventors: 勇中尾; 啓由尾; 眞伸山本
Original assignee: Sony Corp
Current assignee: Sony Corp
Priority date: 2003-08-21
Filing date: 2003-08-21
Publication date: 2008-07-02
Anticipated expiration: 2023-08-21
Also published as: JP2005069778A

Description

本発明は、例えばＤＮＡチップ等のバイオインフォマティクス（生命情報科学）分野において有用な生化学分析方法並びに生化学分析装置に関する。

現在、マイクロアレイ技術によって所定のＤＮＡが微細配列された、いわゆるＤＮＡチップ又はＤＮＡマイクロアレイ（以下、ＤＮＡチップと総称する。）と呼ばれるバイオアッセイ用の集積基板が、遺伝子の突然変異、ＳＮＰｓ（一塩基多型）分析、遺伝子発現頻度解析等に利用されており、創薬、臨床診断、薬理ジェノミクス、法医学その他の分野において広範に活用され始めている。

このＤＮＡチップは、ガラス基板やシリコン基板上に多種多数のＤＮＡオリゴヌクレオチド鎖や、ｃＤＮＡ（complementary DNA）等が集積されていることから、ハイブリダイゼーション等の分子間相互反応の網羅的解析が可能となる点が特徴とされている。

ＤＮＡチップによる解析手法の一例を簡潔に説明すれば、ガラス基板やシリコン基板上に固相化（固定化）されたＤＮＡプローブに対して、細胞、組織等から抽出したｍＲＮＡ（messenger RNA）を逆転写ＰＣＲ（Polymerase Chain Reaction）反応等によって蛍光プローブｄＮＴＰを組み込みながらＰＣＲ増幅し、上記基板上においてハイブリダイゼーションを行い、所定の検出器で蛍光測定を行うというものである。

ＤＮＡチップをディスク状にすることにより、ＤＮＡチップを光ディスクと同様に取り扱い、光ディスクの分野で培われた基板技術及びサーボ技術をＤＮＡチップ技術に応用することが提案されている（特許文献１参照）。

ディスク基板状のＤＮＡチップを用いてＤＮＡ解析を行う場合には、プローブＤＮＡが表面に固着されたディスク基板を回転させながら、蛍光標識インターカレータ及びサンプルＤＮＡが含有した溶液を滴下し、プローブＤＮＡとサンプルＤＮＡとをハイブリダイゼーションさせる。ハイブリダイゼーションをさせると、２重らせん内にインターカレータが挿入して結合する。続いて、ハイブリダイゼーションに寄与しなかったサンプルＤＮＡ及び蛍光標識剤をディスク基板上から洗浄する。続いて、ディスク基板を回転させながら励起光をディスク表面に照射し、励起光の照射により蛍光標識から発生する蛍光を光検出器で検出し、その蛍光の発光位置からサンプルＤＮＡと結合したプローブＤＮＡを特定する。

このように、ディスク基板状のＤＮＡチップを用いたＤＮＡ解析では、ディスク基板を回転させながら蛍光検出を行うことができるので、これまでの光ディスク装置の技術を利用することができ、解析装置を簡易化することができるとともに、検出速度及び速度の向上、並びに、１回で解析できるサンプル数の増大を図ることができる。

特開２００１−２３８６７４号公報特開２００２−１２１５４９号公報

ところで、これまでのＤＮＡ解析には、一般に、蛍光標識剤として、有機蛍光色素が用いられていた。

しかしながら、蛍光検出のために有機蛍光色素を用いる場合、一定の光強度でπ電子のＬＵＭＯからＨＯＭＯへの遷移が過飽和状態となってしまい、一定強度以上の蛍光を得ることができなかった。

また、有機蛍光色素は、光励起により活性状態となると、周囲の水等と反応して分解してしまうため退色の効果が大きい。そのため、蛍光検出のために有機蛍光色素を用いる場合、大きな強度の励起光で励起をしたり、繰り返して蛍光検出をすることができなかった。

また、蛍光標識剤として、蛍光強度の大きい量子ドットを利用することも提案されている（特許文献２参照。）。しかしながら、このような蛍光標識剤を利用して高精度に蛍光検出を行うことは、これまで提案されていなかった。

本発明は、このような従来の実情に鑑みて提案されたものであり、蛍光標識剤から発生させる蛍光の強度が大きくなり、高精度に蛍光を検出することができる生化学分析方法及び装置を提供することを目的とする。

本発明に係る生化学分析方法は、表面に複数の反応領域が形成され、既知の複数のプローブ物質が所定の各反応領域内に固定された円板状のバイオアッセイ基板に対してサンプル物質を滴下して相互反応させるとともに、無機蛍光体を含む蛍光標識剤をプローブ物質とサンプル物質とが相互反応した物質に結合させる反応工程と、上記バイオアッセイ基板に対して所定の波長の励起光を照射し、当該励起光に応じて上記蛍光標識剤から発生される所定の波長の蛍光の有無を検出することにより、上記サンプル物質の生化学分析を行う分析工程とを有し、上記無機蛍光体は、励起子ボーア半径の４倍以下の結晶径の直接バンド間遷移型半導体であり、上記反応工程では、蛍光の波長が励起光及び制御光の波長と異なるように直径が設定された直接バンド間遷移型半導体を、上記蛍光標識剤に含有させて滴下し、上記分析工程では、励起光及び蛍光の波長とは異なる波長の制御光を対物レンズを介して上記バイオアッセイ基板に照射し、その反射光を検出して上記バイオアッセイ基板に対する上記励起光の照射位置を制御することによって、上記バイオアッセイ基板に対して上記励起光を上記対物レンズにより集光して照射する。

本発明に係る生化学分析装置は、表面に複数の反応領域が形成され、既知の複数のプローブ物質が所定の各反応領域内に固定された円板状のバイオアッセイ基板を保持する基板保持手段と、上記バイオアッセイ基板に対してサンプル物質を滴下するとともに無機蛍光体を含む蛍光標識剤を上記バイオアッセイ基板に滴下する滴下手段と、上記バイオアッセイ基板に対して所定の波長の励起光を照射し、当該励起光に応じて上記蛍光標識剤から発生される所定の波長の蛍光の有無を検出することにより、上記サンプル物質の生化学分析を行う分析手段とを備え、上記無機蛍光体は、励起子ボーア半径の４倍以下の結晶径の直接バンド間遷移型半導体であり、上記滴下手段は、蛍光の波長が励起光及び制御光の波長と異なるように直径が設定された直接バンド間遷移型半導体を、上記蛍光標識剤に含有させて滴下し、上記分析手段は、励起光及び蛍光の波長とは異なる波長の制御光を対物レンズを介して上記バイオアッセイ基板に照射し、その反射光を検出して上記バイオアッセイ基板に対する上記励起光の照射位置を制御することによって、上記バイオアッセイ基板に対して上記励起光を上記対物レンズにより集光して照射する。

以上の本発明に係る生化学分析方法及び装置では、バイオアッセイ基板に対物レンズにより集光した励起光を照射し、その励起光に応じて蛍光標識剤から発生される蛍光の有無を検出することにより、プローブ物質とサンプル物質との相互反応の状態を観察する。さらに、本発明に係る生化学分析方法及び装置では、プローブ物質とサンプル物質とが相互反応した物質に結合させる蛍光標識剤に、例えば無機酸化物蛍光体や起子ボーア半径の４倍以下の結晶サイズの直接バンド間遷移型半導体等の無機蛍光体を含める。

本発明に係る生化学分析方法及び装置では、バイオアッセイ基板に対物レンズにより集光した励起光を照射し、その励起光に応じて蛍光標識剤から発生される蛍光の有無を検出することにより、プローブ物質とサンプル物質との相互反応の状態を観察する。さらに、本発明に係る生化学分析方法及び装置では、プローブ物質とサンプル物質とが相互反応した物質に結合させる蛍光標識剤に、例えば励起子ボーア半径の４倍以下の結晶サイズの直接バンド間遷移型半導体等の無機蛍光体を含める。

このことにより本発明に係る生化学分析方法及び装置では、蛍光標識剤から発生させる蛍光の強度が大きくなり、精度が向上する。さらに、本発明に係る生化学分析方法及び装置では、蛍光標識剤として有機色素を用いた場合と比べて、光損傷が小さいため、退色が少ない。

以下、本発明の実施の形態として、本発明を適用したＤＮＡ解析装置並びにＤＮＡ解析方法について説明をする。

（ディスク基板）
まず、本実施の形態のＤＮＡ解析装置並びにＤＮＡ解析方法に適用されるディスク基板状のＤＮＡチップ（以下、単にディスク基板と呼ぶ。）について説明する。

図１に、ディスク基板１の模式的な平面図を示し、図２に当該ディスク基板１の部分断面図を示す。

ディスク基板１は、例えば、ＣＤ（Compact Disk）、ＤＶＤ（Digital Versatile Disk）、ＭＤ（Mini Disk）等の光ディスクと同様の円形の平板状の形状を呈している。また、ディスク基板１の中心には、中心孔２が形成されている。中心孔２には、当該ディスク基板１がＤＮＡ解析装置に装填されたときに、当該ディスク基板１を保持及び回転させるためのチャッキング機構が挿入される。

ディスク基板１は、図２に示すように、基板層３と、基板層３の上部に形成されたＤＮＡ層４とを有している。なお、以下、ディスク基板１のＤＮＡ層４側の表面を上面１ａ、基板層３側の表面を下面１ｂというものとする。

基板層３は、石英ガラス、シリコン、ポリカーボネート、ポリスチレン、その他の円板状に成型可能な合成樹脂等の材料で形成されている。また、基板層３の材料は、詳細を後述する励起光及び制御光並びに蛍光の波長の光を透過する材料である。

ＤＮＡ層４には、上面１ａ側に、プローブＤＮＡとサンプルＤＮＡとの相互反応の場、具体的にはハイブリダイゼーション反応の場となる複数のウェル６が形成されている。各ウェル６は、図１に示すように、ディスク基板１の中心から外周方向に放射状に向かう複数の列上に、等間隔に並んで配置されている。また、ＤＮＡ層４には、アドレスピット７が形成されている。アドレスピット７は、ディスク基板１上における各ウェル６の位置を特定するための情報である。アドレスピット７は、レーザ光を照射してその反射光を検出することにより、情報内容を読み取ることができる光学的な情報ピットである。アドレスピット７から情報を光学的に読み取ることによって、複数存在するウェルのうち、現在レーザ光を照射している位置の１つのウェル６（又は所定の領域に形成されている複数のウェル６群）がどれであるかを特定することが可能となる。このようなアドレスピット７が設けてあることによって、後述する滴下装置による溶液の滴下位置の制御や、対物レンズによる蛍光検出位置の特定を行うことができる。

図３に、１つのウェル６の模式図を示す。

ウェル６は、図３に示すように、開口部が略矩形状とされたくぼみ状の小室である反応領域８を有している。反応領域８は、プローブＤＮＡ（検出用ヌクレオチド鎖Ｄ）とサンプルＤＮＡ（標的ヌクレオチド鎖Ｔ）との間のハイブリダイゼーション反応の場となる。この反応領域８は、サンプルＤＮＡが含まれた溶液等が滴下されたときにその溶液を保留することができる程度の深さ及び大きさとなっており、この結果ハイブリダイゼーションが可能となっている。

また、ウェル６には、反応領域８に電場を形成するために、反応領域８の両端側に正電極９ａと負電極９ｂとが形成されている。正電極９ａ及び負電極９ｂに対しては、例えばディスク基板１の中心孔２を介して外部から与えられる電圧が印加される。さらに、ウェル６内の負電極９ｂ側の端面１０には、プローブＤＮＡが固相化できるように、例えば、メルカプト基を有するシラン分子により表面修飾処理が施されている。

以上のようなディスク基板１では、円板状に形成されているため、光ディスクシステムと同様の再生システムを利用することにより、レーザ光のフォーカシング位置を制御するためのフォーカシングサーボ制御、半径方向に対するレーザ光の照射位置や滴下装置による滴下位置の制御のための位置決めサーボ制御、並びに、アドレスピット７の情報検出処理をすることができる。つまり、アドレスピット７に記録してある情報内容と、そのアドレスピット７の近傍にあるウェル６とを対応させておくことにより、アドレスピット７の情報を読み出すことで、特定の１つのウェル６に対してのみレーザ光を照射して蛍光が発光しているウェル６の位置を特定したり、特定の１つのウェル６の位置と滴下装置との相対位置を制御して、その特定の１つのウェル６に対して溶液を滴下したりすることができる。

従って、例えば、特定の１つのウェル６（又はウェル６群）に特定のプローブＤＮＡ（検出用ヌクレオチド鎖Ｄ）を固定化することができ、また、ハイブリダイゼーションにより相互反応が生じたウェルの位置を検出することができる。

（ＤＮＡ解析装置）
つぎに、本発明の実施の形態のＤＮＡ解析装置１１について、図４を参照して説明をする。

ＤＮＡ解析装置１１は、図４に示すように、ディスク基板１を保持して回転をさせるディスク装填部１２と、ハイブリダイゼーションのための各種溶液を貯留するとともにディスク基板１のウェル６にその溶液を滴下する滴下部１３と、ディスク基板１から励起光を検出するための励起光検出部１４と、上記の各部の管理及び制御を行う制御/サーボ部１５とを備えている。

ディスク装填部１２は、ディスク基板１の中心孔２内に挿入して当該ディスク基板１を保持するチャッキング機構２１と、チャッキング機構２１を駆動することによりディスク基板１を回転させるスピンドルモータ２２と有している。ディスク装填部１２は、上面１ａ側が上方向となるようにディスク基板１を水平に保持した状態で、当該ディスク基板１を回転駆動する。ディスク装填部１２では、ディスク基板１を水平に保持することによって、ウェル６に滴下された溶液が垂れてしまうといった問題を回避することができる。

滴下部１３は、試料溶液Ｓや蛍光標識剤Ｓ´を貯留する貯留部２３と、貯留部２３内の試料溶液Ｓや蛍光標識剤Ｓ´をディスク基板１に滴下する滴下ヘッド２４とを有している。滴下ヘッド２４は、水平に装填されたディスク基板１の上面１ａの上方に配置されている。さらに、滴下ヘッド２４は、ディスク基板１のアドレスピット７から読み出される位置情報及び回転同期情報に基づいてディスク基板１との相対位置を半径方向に制御し、サンプルＤＮＡ（標的ヌクレオチド鎖Ｔ）を含有する試料溶液Ｓを所定のウェル６の反応領域８に正確に追従して滴下する構成とされている。また、貯留部２３は、貯留部２３と滴下ヘッド２４との組み合わせは、ハイブリダイゼーションのために使用する試料溶液の数だけある。

また、滴下部１３では、ディスク基板１上の所定の位置に正確に試料溶液Ｓを滴下するために、例えば、いわゆる「インクジェットプリンティング法」に基づく滴下方法が採用されている。「インクジェットプリンティング法」は、滴下ヘッド２４にいわゆるインクジェットプリンタで用いられるインク噴出機構を適用する方法であり、インクジェットプリンタのようなノズルヘッドからディスク基板１に試料溶液Ｓを噴射するものである。

励起光検出部１４は、光学ヘッド３０を有している。光学ヘッド３０は、水平に装填されたディスク基板１の下方側、すなわち、下面１ｂ側に配置されている。光学ヘッド３０は、例えば、図示していないスレッド機構等により、ディスク基板１の半径方向に移動自在とされている。

光学ヘッド３０は、対物レンズ３１と、対物レンズ３１を移動可能に支持する２軸アクチュエータ３２と、導光ミラー３３とを有している。対物レンズ３１は、その中心軸がディスク基板１の表面に対して略垂直となるように２軸アクチュエータ３２に支持されている。従って、対物レンズ３１は、ディスク基板１の下方側から入射された光束を当該ディスク基板１に対して集光することができる。２軸アクチュエータ３２は、ディスク基板１の表面に対して垂直な方向、及び、ディスク基板１の半径方向の２方向に対物レンズ１を移動可能に支持している。２軸アクチュエータ３２を駆動することにより、対物レンズ３１により集光された光の焦点を、ディスク基板１の表面に対して垂直な方向及び半径方向に移動させることができる。従って、この光学ヘッド３０では、光ディスクシステムにおけるジャストフォーカス制御並びに位置決め制御と同様の制御を行うことができる。

導光ミラー３３は、光路Ｘ上に対して４５°の角度で配置されている。光路Ｘは、励起光Ｐ、蛍光Ｆ、サーボ光Ｖ及び反射光Ｒが、光学ヘッド３０に対して入射及び出射する光路である。導光ミラー３３には、励起光Ｐ及びサーボ光Ｖが光路Ｘ上から入射される。導光ミラー３３は、励起光Ｐ及びサーボ光Ｖを反射して９０°屈折させて、対物レンズ３１に入射する。対物レンズ３１に入射された励起光Ｐ及びサーボ光Ｖは、当該対物レンズ３１により集光されてディスク基板１に照射される。また、導光ミラー３３には、蛍光Ｆ及びサーボ光Ｖの反射光Ｒが、ディスク基板１から対物レンズ３１を介して入射される。導光ミラー３３は、蛍光Ｆ及び反射光Ｒを反射して９０°屈折させて、光路Ｘ上に出射する。

なお、光学ヘッド３０をスレッド移動させる駆動信号及び２軸アクチュエータ３２を駆動する駆動信号は、制御/サーボ部１５から与えられる。

また、励起光検出部１４は、励起光Ｐを出射する励起光源３４と、励起光源３４から出射された励起光Ｐを平行光束とするコリメータレンズ３５と、コリメータレンズ３５により平行光束とされた励起光Ｐを光路Ｘ上で屈折させて導光ミラー３３に照射する第１のダイクロックミラー３６とを有している。

励起光源３４は、蛍光標識剤を励起可能な波長のレーザ光源を有する発光手段である。励起光源３４から出射される励起光Ｐは、ここでは波長が４０５ｎｍのレーザ光である。なお、励起光Ｐの波長は、蛍光標識剤を励起できる波長であればどのような波長であってもよい。コリメータレンズ３５は、励起光源３４から出射された励起光Ｐを平行光束にする。第１のダイクロックミラー３６は、波長選択性を有する反射鏡であり、励起光Ｐの波長の光のみを反射して、蛍光Ｆ及びサーボ光Ｖ（その反射光Ｒ）の波長の光を透過する。第１のダイクロックミラー３６は、光路Ｘ上に４５°の角度を持って挿入されており、コリメータレンズ３５から出射された励起光Ｐを反射して９０°屈折させ、導光ミラー３３に励起光Ｐを照射している。

また、励起光検出部１４は、蛍光Ｆを検出するアバランジェフォトダイオード３７と、蛍光Ｆを集光する集光レンズ３８と、光学ヘッド３０から光路Ｘ上に出射された蛍光Ｆを屈折させてアバランジェフォトダイオード３７に照射する第２のダイクロックミラー３９とを有している。

アバランジェフォトダイオード３７は、非常に感度の高い光検出器であり、微弱な光量の蛍光Ｆを検出することが可能である。なお、アバランジェフォトダイオード３７により検出する蛍光Ｆの波長は、ここでは４７０ｎｍ程度である。また、この蛍光Ｆの波長は、蛍光標識剤の種類により異なるものである。集光レンズ３８は、アバランジェフォトダイオード３７上に蛍光Ｆを集光するためのレンズである。第２のダイクロックミラー３９は、光路Ｘ上に４５°の角度をもって挿入されているとともに、導光ミラー３３側から見て第１のダイクロックミラー３６の後段に配置されている。従って、第２のダイクロックミラー３９には、蛍光Ｆ、サーボ光Ｖ及び反射光Ｒが入射し、励起光Ｐは入射しない。第２のダイクロックミラー３９は、波長選択性を有する反射鏡であり、蛍光Ｆの波長の光のみを反射して、サーボ光（反射光Ｒ）の波長の光を透過する。第２のダイクロックミラー３９は、光学ヘッド３０の導光ミラー３３から出射された蛍光Ｆを反射して９０°屈折させ、集光レンズ３８を介してアバランジェフォトダイオード３７に蛍光Ｆを照射する。

アバランジェフォトダイオード３７では、このように検出した蛍光Ｆの光量に応じた電気信号を発生し、その電気信号を制御/サーボ部１５に供給する。

また、励起光検出部１４は、サーボ光Ｖを出射するサーボ光源４０と、サーボ光源４０から出射されたサーボ光Ｖを平行光束とするコリメータレンズ４１と、サーボ光Ｖの反射光Ｒを検出するフォトディテクト回路４２と、非点収差を生じさせてフォトディテクト回路４２に対して反射光Ｒを集光するシリンドリカルレンズ４３と、サーボ光Ｖと反射光Ｒとを分離する光セパレータ４４とを有している。

サーボ光源４０は、例えば７８０ｎｍの波長のレーザ光を出射するレーザ光源を有する発光手段である。なお、サーボ光Ｖの波長は、アドレスピット７が検出できる程度の波長であり、励起光Ｐ及び蛍光Ｆの波長と異なっていれば７８０ｎｍに限らずどのような波長であってもよい。コリメータレンズ４１は、サーボ光源４０から出射されたサーボ光Ｖを平行光束にする。平行光束とされたサーボ光Ｖは光セパレータ４４に入射される。

フォトディテクト回路４２は、反射光Ｒを検出するディテクタと、検出した反射光Ｒからフォーカスエラー信号、位置決めエラー信号、及びアドレスピット７の再生信号を生成する信号生成回路とを有している。反射光Ｒは、サーボ光Ｖがディスク基板１で反射して生成された光であるので、その波長は、サーボ光と同一の７８０ｎｍである。

なお、フォーカスエラー信号は、対物レンズ３２により集光された光の合焦位置と、ディスク基板１のＤＮＡ層４との位置ずれ量を示すエラー信号である。フォーカスエラー信号が０となったときに、対物レンズ３２とディスク基板１との間の距離が最適になる。位置決めエラー信号は、所定のウェル６の位置と、焦点位置とのディスク半径方向に対する位置ずれ量を示す信号である。位置決めエラー信号が０となったときに、サーボ光Ｖのディスク半径方向に対する照射位置が任意のウェル６に一致したこととなる。アドレスピット７の再生信号は、ディスク基板７に記録されているアドレスピット７に記述されている情報内容を示す信号である。この情報内容を読み出すことにより、現在サーボ光Ｖを照射しているウェル６を特定することができる。

フォトディテクト回路４２は、反射光Ｒに基づき生成されたフォーカスエラー信号、位置決めエラー信号及びアドレスピット７の再生信号を制御/サーボ部１５に供給する。

シリンドリカルレンズ４３は、フォトディテクト回路４２上に反射光Ｒを集光するとともに非点収差を生じさせるためのレンズである。このように非点収差を生じさせることによりフォトディテクト回路４２によりフォーカスエラー信号を生成させることができる。

光セパレータ４４は、偏向ビームスプリッタからなる光分離面４４ａと１/４波長板４４ｂにより構成されている。光セパレータ４４では、１/４波長板４４ｂの逆側から入射された光を光分離面４４ａが透過し、その透過光の反射光が１/４波長板４４側から入射された場合には光分離面４４ａが反射する機能を有している。光セパレータ４４は、光分離面４４ａが光路Ｘ上に４５°の角度を挿入されているとともに、導光ミラー３３側から見て第２のダイクロックミラー３９の後段に配置されている。従って、光セパレータ４４では、コリメータレンズ４１から出射されたサーボ光Ｖを透過して光学ヘッド３０内の導光ミラー３３に対してそのサーボ光Ｖを入射させているとともに、光学ヘッド３０の導光ミラー３３から出射された反射光Ｒを反射することにより９０°屈折され、シリンドリカルレンズ４３を介してフォトディテクト回路４２に反射光Ｒを照射する。

制御/サーボ部１５は、励起光検出部１４により検出されたフォーカスエラー信号、位置決めエラー信号及びアドレスピット７の再生信号に基づき、各種のサーボ制御を行う。

すなわち、制御/サーボ部１５は、フォーカスエラー信号に基づき光学ヘッド３０内の２軸アクチュエータ３２を駆動して対物レンズ３１とディスク基板１との間の間隔を制御し、フォーカスエラー信号が０となるようにサーボ制御を行う。また、制御/サーボ部１５は、位置決めエラー信号に基づき光学ヘッド３０内の２軸アクチュエータ３２を駆動して対物レンズ３１をディスク基板１の半径方向に移動制御し、フォーカスエラー信号が０となるようにサーボ制御を行う。また、制御/サーボ部１５は、アドレスピット７の再生信号に基づき光学ヘッド３０のスレッド移動制御を行って光学ヘッド３０を所定の半径位置に移動し、目的のウェル位置に対物レンズ３１を移動させる。

以上のような構成のＤＮＡ解析装置１１では、次のような動作を行う。

ＤＮＡ解析装置１１は、ディスク基板１を回転させながら、ウェル６上にサンプルＤＮＡが含有した溶液を滴下し、プローブＤＮＡとサンプルＤＮＡとを相互反応（ハイブリダイゼーション）させる。また、ハイブリダイゼーション処理の済んだディスク基板１上に、蛍光標識剤を含んだバッファ溶液を滴下する。

また、ＤＮＡ解析装置１１は、蛍光標識剤が滴下された後のディスク基板１を回転させ、励起光Ｐを当該ディスク基板１の下面１ｂ側から入射させてウェル６内の蛍光標識剤に照射し、その励起光Ｐに応じてその蛍光標識剤から発生した蛍光Ｆをディスク基板１の下方から検出する。

ここで、ＤＮＡ解析装置１１では、励起光Ｐとサーボ光Ｖとを同一の対物レンズ３１を介してディスク基板１に照射している。そのため、ＤＮＡ解析装置１１では、サーボ光Ｖのフォーカス制御、位置決め制御並びにアドレス制御を行うことによって、励起光Ｐの焦点位置のフォーカス制御を行うことができ、さらに、励起光Ｐの照射位置すなわち蛍光Ｆの発光位置を特定することが可能となり、その蛍光の発光位置からサンプルＤＮＡと結合したプローブＤＮＡを特定することができる。

（ＤＮＡ解析方法）
つぎに、本実施の形態のＤＮＡ解析方法について説明をする。

最初に、ディスク基板１をＤＮＡ解析装置１１のディスク装填部１２に水平に装填する。

続いて、ＤＮＡ解析装置１１により、アドレスピット７に基づく位置制御を行いながらディスク基板１を回転させ、滴下ヘッド２４から、一端がメルカプト基等で修飾されたプローブＤＮＡが含有した溶液を所定のウェル６に対して滴下する。このとき、１つのディスク基板１に対して、複数種類のプローブＤＮＡが滴下する。だたし、１つのウェル６内には１種類のプローブＤＮＡが入るようにする。なお、各ウェル６にいずれの種類のプローブＤＮＡを滴下するかは、予めウェルとプローブＤＮＡとの対応関係を示す配置マップ等を準備しておき、その配置マップに基づき滴下制御する。

続いて、電極９ａ,９ｂから１ＭＶ/ｍ、１ＭＨｚ程度の交流電界を印加してプローブＤＮＡを伸張させるとともに、プローブＤＮＡをディスクに対して平行な方向に移動させて、予め表面修飾処理がされた端面１０に、プローブＤＮＡの修飾端を結合させ、ウェル６内にプローブＤＮＡを固相化（固定化）する。

続いて、ＤＮＡ解析装置１１により滴下ヘッド２４からサンプルＤＮＡが含有した溶液Ｓをバッファ塩を含む溶液とともに、ディスク基板１上の各ウェル６に滴下する。

続いて、サンプルＤＮＡの滴下後、ディスク基板１を恒温層等に移し、ウェル６内を数十度に加熱し、加熱した状態のまま電極９ａ,９ｂから１ＭＶ/ｍ、１ＭＨｚ程度の交流電界を印加する。このような処理をすると、サンプルＤＮＡとプローブＤＮＡとが伸張して立体障害の少ない状態となるとともに、サンプルＤＮＡがディスク基板１に対して平行な方向に移動する。この結果、互いの塩基配列が対応したサンプルＤＮＡとプローブＤＮＡとが同一のウェル６内にある場合には、それらがハイブリダイゼーションを起こす。

続いて、ハイブリダイゼーションを起こさせた後に、ＤＮＡ解析装置１１により、量子ドット蛍光剤（励起子ボーア半径の４倍以下の結晶径の直接バンド間遷移型半導体）、又は、ＺｎＯやＹ_２Ｏ_３Ｅｕ^３＋のような酸化物蛍光体等を含んだ蛍光標識剤を、ディスク基板１のウェル６内に滴下する。このような蛍光標識剤は、ハイブリダイゼーションを起こしたプローブＤＮＡとサンプルＤＮＡとの二重らせんの間に挿入して結合する。なお、蛍光標識剤については、詳細を後述する。

続いて、ディスク基板１の表面１ａを純水等で洗浄し、ハイブリダイゼーションを起こしていないウェル６内のサンプルＤＮＡ及び蛍光標識剤を除去する。この結果、ハイブリダイゼーションを起こしたウェル６内にのみ、蛍光標識剤が残存することとなる。

続いて、ＤＮＡ解析装置１１により、制御光Ｆを用いてフォーカスサーボ制御及び位置決めサーボ制御並びにアドレス制御を行いながらディスク基板１を回転させ、励起光Ｐを所定のウェル６に照射する。この励起光Ｐの照射とともに、アドレス情報を検出しながら蛍光Ｆが発生しているか否かを検出する。

そして、ＤＮＡ解析装置１１は、ディスク基板１上の各ウェル６の位置と蛍光Ｆの発光の有無を示すマップ作成する。そして、その作成したマップ、並びに、各ウェル６にどのような塩基配列のプローブＤＮＡが滴下されていたかを示す配置マップに基づき、サンプルＤＮＡの塩基配列の解析を行う。

（蛍光標識剤）
つぎに、以上のようなＤＮＡ解析に用いられる蛍光標識剤について説明をする。

本実施の形態のＤＮＡ解析装置では、ＤＮＡの二重らせん間に挿入する蛍光標識剤として、例えば、直接バンド遷移型半導体により構成された量子ドットをインターカレータに結合したものを用いている。以下、直接バンド遷移型半導体により構成された量子ドットをインターカレータに結合したものを、量子ドット蛍光標識剤という。

インターカレータとは、ＤＮＡの二重らせんの間に結合する有機物質である。

量子ドットとは、半導体原子が数百個から数千個集まった１０数ｎｍ程度の小さな塊である。量子ドットは、バルクサイズの連続的なバンド構造ではなく、離散的、不連続なエネルギー準位を取るので、電子のエネルギーが３次元量子井戸に強く閉じ込められる。そのため、電子を閉じ込めている障壁となっている量子ドットのサイズが小さくなればなるほど、伝導帯（ＬＵＭＯ）のエネルギーが上がり、価電子帯（ＨＯＭＯ）のエネルギーが下がり、価電子帯と伝導帯との間のバンドギャップエネルギが増大する。つまり、価電子帯から伝導帯へ電子を励起するエネルギーが増大する。量子ドットには、このようなサイズに応じてバンドキャップエネルギが変化するという効果（量子サイズ効果）がある。

さらに、蛍光体は光等を吸収するとバンド内に電子-ホール対（励起子）を発生するが、蛍光体のサイズがバルクサイズである場合、そのバンド構造は連続的となり生成された電子とホールとは別々に運動をするので、その発生が不安定である。それに対して、蛍光体のサイズが量子ドットサイズの場合、非常に狭い空間に電子とホールとが発生するので電子とホールとの波動関数の重なりが大きくなり、その（励起子の）発生が安定化している。従って、量子ドットの場合、電子-ホール対の遷移確率すなわち振動子強度がバルクサイズの直接バンド遷移型半導体よりも非常に大きくなる。つまり、量子ドットの場合には、励起光強度に対する蛍光強度が非常に大きくなる。量子ドットには、このような電子-ホール対の遷移確率が高くなり、蛍光強度が大きくなるという効果（閉じ込め効果）がある。このような閉じ込め効果が表れるのは、励起子ボーア半径の４倍以下の結晶径であるといわれている。

量子ドットには以上のような閉じ込め効果があるため、量子ドット蛍光標識剤を蛍光標識剤として用いると、励起光の強度を大きくしても蛍光強度が飽和せず、高い蛍光強度を得ることができる。例えば、図５に、従来の蛍光標識剤に使われている蛍光有機色素の励起強度に対する蛍光強度の変化と、量子ドット蛍光標識剤の励起強度に対する蛍光強度の変化とを表す模式図を示す。この模式図に示すように、量子ドット蛍光標識剤の場合、励起光の強度を大きくしても蛍光強度が飽和せず、高い蛍光強度を得ることができる。

従って、蛍光標識剤として量子ドットを用いた場合、照射する励起光を対物レンズにより集光して照射することが可能となる。このため、より強度の少ない励起光を用いて強い蛍光を検出することができる。

さらに、量子ドットが直接バンド遷移型半導体の場合、上述した量子サイズ効果によりバンドギャップが増大するため、下式に基づき、量子ドットのサイズＲ（Ｒは、量子ドットを球とみなした場合における半径）を制御することによって、蛍光の波長を可変制御することができる。

ただし、Ｅ_ｇ０はバルク結晶のバンドギャップであり、その他の定数は以下のとおり。

なお、ａ_Ｂ ^＊は励起子ボーア半径、ｍ_ｅは電子の有効質量、ｍ_ｈはホールの有効質量、κは端数（正しくは媒体の誘電率）、ｈはプランク定数である。

つまり、図６に示すように、量子ドットの結晶径Ｒを大きくすれば蛍光の波長が長くなり、量子ドットの結晶径Ｒを小さくすれば蛍光の波長を短くすることできる。

従って、蛍光標識剤に量子ドットを用いることにより、蛍光の波長を励起光及びサーボ光の波長に対して最適に設定することができる。例えば、トラッキングサーボを含めてサーボ光が吸光帯にかからないように調整でき、広い周波数範囲の励起光を用いることができる。

つぎに、量子ドット蛍光標識剤の具体例について説明をする。

例えば、蛍光標識剤として、図７に示すような、ＣｄＳe/ＺｎＳのコロイド型量子ドットを用いることができる。

このような量子ドットを用いた蛍光標識剤は、次のように生成することができる。

まず、ＣｄＳeの表面を、ＺｎＳとトリオクチルホスフィン｛（Ｃ_８Ｈ_１７）_３Ｐ｝とで処理し、直径３ｎｍ程度のコロイド型量子ドットを生成する。続いて、このコロイド型量子ドットを、例えば、図８に示すような、インターカレータに化学的に結合させる。

コロイド型量子ドットとインターカレータとの結合方法は、それぞれに互いに結合する官能基を結合させればよい。互いに結合する官能基の組み合わせは、例えば、次の表に示すとおりである。

（その他の蛍光標識剤）
なお、以上のような量子ドット蛍光標識剤ではなく、例えば、ＺｎＯやＹ_２Ｏ_３Ｅｕ^３＋のような、無機酸化物を蛍光標識剤として用いても良い。このような無機酸化物の蛍光標識剤は、ＬＵＭＯからＨＯＭＯへの遷移が過飽和状態レベルが有機色素の蛍光標識剤よりも高いため、強い蛍光を得ることができる。また、無機酸化物の蛍光標識剤は、反応による分解が生じないため退色しない。さらに、量子ドットのようにサイズを小さくしなくても、強い蛍光を得ることができる。

本実施の形態のＤＮＡ解析装置に適用されるＤＮＡチップ（ディスク基板）の平面図である。本実施の形態のＤＮＡ解析装置に適用されるＤＮＡチップ（ディスク基板）の断面図である。上記ＤＮＡチップに形成されているウェルを示す図である。本実施の形態のＤＮＡ解析装置のブロック構成図である。従来の蛍光標識剤に使われている蛍光有機色素の励起強度に対する蛍光強度の変化と、量子ドット蛍光標識剤の励起強度に対する蛍光強度の変化とを表す図である。量子ドットのサイズの変化と、蛍光の波長の変換の関係について示す図である。ＣｄＳe/ＺｎＳのコロイド型量子ドットを示す図である。インターカレータを示す図である。

符号の説明

１ディスク基板、２中心孔、３基板層、４ＤＮＡ層、６ウェル、８反応領域、１１ＤＮＡ解析装置、１２ディスク装填部、１３滴下部、１４励起光検出部、１５制御/サーボ部

Claims

表面に複数の反応領域が形成され、既知の複数のプローブ物質が所定の各反応領域内に固定された円板状のバイオアッセイ基板に対してサンプル物質を滴下して相互反応させるとともに、無機蛍光体を含む蛍光標識剤をプローブ物質とサンプル物質とが相互反応した物質に結合させる反応工程と、
上記バイオアッセイ基板に対して所定の波長の励起光を照射し、当該励起光に応じて上記蛍光標識剤から発生される所定の波長の蛍光の有無を検出することにより、上記サンプル物質の生化学分析を行う分析工程とを有し、
上記無機蛍光体は、励起子ボーア半径の４倍以下の結晶径の直接バンド間遷移型半導体であり、上記反応工程では、蛍光の波長が励起光及び制御光の波長と異なるように直径が設定された直接バンド間遷移型半導体を、上記蛍光標識剤に含有させて滴下し、
上記分析工程では、励起光及び蛍光の波長とは異なる波長の制御光を対物レンズを介して上記バイオアッセイ基板に照射し、その反射光を検出して上記バイオアッセイ基板に対する上記励起光の照射位置を制御することによって、上記バイオアッセイ基板に対して上記励起光を上記対物レンズにより集光して照射すること
を特徴とする生化学分析方法。
上記励起光の出射位置と上記蛍光の検出位置とを光学的に共役の関係とし、上記対物レンズによる励起光の合焦位置を上記バイオアッセイ基板の反応領域に一致させること
を特徴とする請求項１記載の生化学分析方法。
上記分析工程では、
上記バイオアッセイ基板を回転させ、回転させた上記バイオアッセイ基板に対して上記励起光を上記対物レンズにより集光して照射すること
を特徴とする請求項１記載の生化学分析方法。
上記分析工程では、励起光及び蛍光の波長とは異なる波長の制御光を上記対物レンズを介して上記バイオアッセイ基板に照射し、その制御光を上記バイオアッセイ基板上に合焦させるように上記対物レンズを移動させることにより、上記励起光のフォーカシング制御を行うこと
を特徴とする請求項１記載の生化学分析方法。
上記分析工程では、サンプル物質を滴下する側とは反対側から上記バイオアッセイ基板に対して上記励起光及び制御光を照射すること
を特徴とする請求項４記載の生化学分析方法。
プローブ物質とサンプル物質との相互反応に基づく生化学分析を行う生化学分析装置において、
表面に複数の反応領域が形成され、既知の複数のプローブ物質が所定の各反応領域内に固定された円板状のバイオアッセイ基板を保持する基板保持手段と、
上記バイオアッセイ基板に対してサンプル物質を滴下するとともに無機蛍光体を含む蛍光標識剤を上記バイオアッセイ基板に滴下する滴下手段と、
上記バイオアッセイ基板に対して所定の波長の励起光を照射し、当該励起光に応じて上記蛍光標識剤から発生される所定の波長の蛍光の有無を検出することにより、上記サンプル物質の生化学分析を行う分析手段とを備え、
上記無機蛍光体は、励起子ボーア半径の４倍以下の結晶径の直接バンド間遷移型半導体であり、上記滴下手段は、蛍光の波長が励起光及び制御光の波長と異なるように直径が設定された直接バンド間遷移型半導体を、上記蛍光標識剤に含有させて滴下し、
上記分析手段は、励起光及び蛍光の波長とは異なる波長の制御光を対物レンズを介して上記バイオアッセイ基板に照射し、その反射光を検出して上記バイオアッセイ基板に対する上記励起光の照射位置を制御することによって、上記バイオアッセイ基板に対して上記励起光を上記対物レンズにより集光して照射すること
を特徴とする生化学分析装置。
上記分析手段は、上記励起光を出射するレーザ光源と、上記蛍光を検出する検出器とを有し、上記レーザ光源の励起光の出射位置と上記検出器の蛍光の検出位置とが光学的に共役の関係に配置されており、さらに、上記対物レンズによる励起光の合焦位置を上記バイオアッセイ基板の反応領域に一致させていること
を特徴とする請求項６記載の生化学分析装置。
上記基板保持手段は、上記バイオアッセイ基板を回転駆動し、
上記分析手段は、上記基板保持手段により回転駆動された上記バイオアッセイ基板に対して上記励起光を上記対物レンズにより集光して照射すること
を特徴とする請求項６記載の生化学分析装置。
上記分析手段は、励起光及び蛍光の波長とは異なる波長の制御光を上記対物レンズを介して上記バイオアッセイ基板に照射し、その制御光を上記バイオアッセイ基板上に合焦させるように上記対物レンズを移動させることにより、上記励起光のフォーカシング制御を行うこと
を特徴とする請求項６記載の生化学分析装置。
上記分析手段は、サンプル物質を滴下する側とは反対側から上記バイオアッセイ基板に対して上記励起光及び制御光を照射すること
を特徴とする請求項９記載の生化学分析装置。