JP2005156327A - バイオアッセイ用基板及びその製造方法 - Google Patents

Abstract

【課題】 ＤＮＡ解析装置に対する装置移動の方向に沿って生じた汚れに関わらず、プローブ物質とサンプル物質との相互作用を検出する。
【解決手段】 １種類のプローブＤＮＡを、バイオアッセイ用基板１の円心を中心とした複数の同心円のうち、２つ以上の円の円周上に設けられたウェル８に固着させる。また、１種類のプローブＤＮＡを、バイオアッセイ用基板１の半径方向に沿った複数の直線のうち、２つ以上の直線上に設けられたウェル８に固着させる。
【選択図】 図４

Description

本発明は、例えばＤＮＡ解析装置で使用されるＤＮＡチップなど、プローブ物質とサンプル物質との相互作用を検出するバイオアッセイ用基板及びその製造方法に関する。

現在、マイクロアレイ技術によって所定のＤＮＡが微細配列された、いわゆるＤＮＡチップ又はＤＮＡマイクロアレイ（以下、ＤＮＡチップと総称する。）と呼ばれるＤＮＡの配列解析用の集積基板が、遺伝子の突然変異、ＳＮＰｓ（一塩基多型）分析、遺伝子発現頻度解析などに利用されており、創薬、臨床診断、薬理ジェノミクス、法医学、その他の分野において広範に活用され始めている。

ＤＮＡチップを用いてＤＮＡの配列を解析する方法は、先ず、ＤＮＡチップ上にプローブＤＮＡを固相化（固定化）させる。そして、細胞、組織等から抽出したｍＲＮＡ（messenger RNA）を逆転写ＰＣＲ（Polymerase Chain Reaction）反応等により蛍光プローブｄＮＴＰを組み込みながらＰＣＲ増幅することでサンプルＤＮＡを生成し、このサンプルＤＮＡをＤＮＡチップ上に固相化されたプローブＤＮＡに滴下して、サンプルＤＮＡとプローブＤＮＡとをハイブリダイゼーションさせる。続いて、ＤＮＡの２重らせん内に蛍光標識剤を挿入し、所定の検出器でその蛍光測定を行う。このことにより、サンプルＤＮＡとプローブＤＮＡとの塩基配列が同一であるか否かを判別する。

以上説明したＤＮＡチップを、ディスク状にすることが提案されている（例えば、特許文献１）。ＤＮＡチップをディスク状にすることにより、光ディスクと同様に取り扱い、光ディスクの分野で培われた基板技術及びサーボ技術をＤＮＡチップ技術に応用させることが可能となる。

ディスク状のＤＮＡチップを用いてＤＮＡの配列を解析する場合には、プローブＤＮＡとサンプルＤＮＡとの反応領域となる複数のウェルに、先ず、プローブＤＮＡを滴下して固着させる。続いて、ＤＮＡチップをＤＮＡ解析装置に装着し、ＤＮＡチップを回転させながら、蛍光標識インターカレータ及びサンプルＤＮＡが含有された溶液をウェルに滴下し、プローブＤＮＡとサンプルＤＮＡとをハイブリダイゼーションさせる。ハイブリダイゼーションさせると、２重らせん内に蛍光標識インターカレータが挿入して結合する。続いて、ハイブリダイゼーションに寄与しなかったサンプルＤＮＡ及び蛍光標識インターカレータをＤＮＡチップ上から洗浄する。続いて、ＤＮＡチップを回転させながら励起光をディスク表面に照射し、励起光の照射により蛍光標識剤から発生する蛍光を光検出器で検出し、その蛍光の発光位置からサンプルＤＮＡと結合したプローブＤＮＡを特定する。

このように、ディスク状のＤＮＡチップを用いてＤＮＡの配列を解析すると、ＤＮＡチップを回転させながら蛍光検出を行うことができるので、これまでの光ディスク装置の技術を利用することができる。従って、ＤＮＡ配列の解析装置を簡易化することができるとともに、検出速度の向上、並びに、１度に解析できるサンプル数の増大などを図ることが可能となり、ＤＮＡの配列の解析を効率良く行うことが可能となる。

特開２００１−２３８６７４号公報

ところで、ＤＮＡチップでは、同じ種類のプローブＤＮＡを複数のウェルに固着させ、同じ種類のプローブＤＮＡが固着された複数のウェルに、サンプルＤＮＡが含有された溶液を、例えばサンプルＤＮＡの濃度を変化させながら滴下してハイブリダイゼーションさせることなどにより、プローブＤＮＡとサンプルＤＮＡとのハイブリダイゼーションを特定するときの精度を向上させている。

ＤＮＡチップの複数のウェルに同じ種類のプローブＤＮＡを固着させる場合には、同じ種類のプローブＤＮＡを、図１０に示すように、ＤＮＡチップ１００の円心を中心とした複数の円のうち、１つの円の円周上に設けられたウェル１０１に集中的に固着させたり、図１１に示すように、半径方向に沿った複数の直線のうち、１つの直線上に設けられたウェル１０１に集中的に固着させたり、図１２に示すように所定の領域Ｒ内に設けられたウェル１０１に集中的に固着させている。

なお、図１０〜１２は、ＤＮＡチップ１００の表面の一部拡大図である。図１０〜１２中probe１〜１０は、ウェル１０１の底面に固着されているプローブＤＮＡの種類を示しており、ＰＴＣはポジティブコントロールを示しており、ＮＴＣはネガティブコントロールを示している。また、図１０〜１２では、矢印Ａで示す方向が円心を中心とした円の円周方向であり、矢印Ｂで示す方向が半径方向である。また、図１０〜１２では、各ウェル８間の間隙などを省略して示している。

しかしながら、ディスク状のＤＮＡチップ１００では、表面に、図１３中Ｓ１に示すような、円心を中心とした円の円周に沿った汚れや、図１３中Ｓ２に示すような、半径方向に沿った汚れ、図１３中Ｓ３に示すような、特定の領域Ｒ全体に亘った汚れなどが生じる。汚れが生じた位置に配置されたウェルは、プローブＤＮＡとサンプルＤＮＡとのハイブリダイゼーションを検出することが困難となる。

従って、同じ種類のプローブＤＮＡを、ＤＮＡチップの円心を中心とした１つの円の円周上に設けられた複数のウェルや、半径方向に沿った１つの直線上に設けられた複数のウェル、特定の領域内に設けられた複数のウェルなどに集中して固着させると、同じ種類のプローブＤＮＡが固着されたウェルの大部分又は全てが損傷し、特定の種類のプローブとサンプルＤＮＡとのハイブリダイゼーションを特定することができなくなるという不都合が生じ易くなる。

本発明は、以上説明した従来の実情を鑑みて提案されたものであり、円心を中心とした円周に沿った汚れや、半径方向に沿った汚れなどが生じた場合にも、プローブ物質とサンプル物質とを相互作用させた結果を検出することが可能となるバイオアッセイ用基板及びその製造方法を提供することを目的とする。

本発明に係るバイオアッセイ用基板は、プローブ物質とサンプル物質との相互作用に基づく生化学分析を行うバイオアッセイ装置で使用されるディスク状のバイオアッセイ用基板において、上記プローブ物質と上記サンプル物質との反応を検出する複数の反応領域が、円心を中心とした複数の円周上に設けられており、上記反応領域のうち所定のプローブ物質とサンプル物質との反応を検出する複数の反応領域は、上記複数の円周のうち２つ以上の円周上に設けられることを特徴とする。

また、本発明に係るバイオアッセイ用基板は、プローブ物質とサンプル物質との相互作用に基づく生化学分析を行うバイオアッセイ装置で使用されるディスク状のバイオアッセイ用基板において、上記プローブ物質と上記サンプル物質との反応を検出する複数の反応領域が、半径方向に沿った複数の直線上に設けられており、上記反応領域のうち所定のプローブ物質と上記サンプル物質との反応を検出する複数の反応領域は、上記半径方向に沿った複数の直線のうち２つ以上の直線上に設けられることを特徴とする。

また、本発明に係るバイオアッセイ用基板は、プローブ物質とサンプル物質との相互作用に基づく生化学分析を行うバイオアッセイ装置で使用されるバイオアッセイ用基板において、上記プローブ物質と上記サンプル物質との反応を検出する複数の反応領域が設けられており、上記反応領域のうち所定のプローブ物質と上記サンプル物質との反応を検出する複数の反応領域は、上記複数の反応領域が設けられている範囲のうち、所定の範囲内に限定して設けられないことを特徴とする。

本発明に係るバイオアッセイ用基板の製造方法は、プローブ物質とサンプル物質との相互作用に基づく生化学分析を行うバイオアッセイ装置で使用されるバイオアッセイ用基板の製造方法において、ディスク状の基板の主面に対して、上記サンプル物質を添加する添加領域を、上記基板の円心を中心とした複数の円周上に複数形成する添加領域形成工程と、上記添加領域に対して上記プローブ物質を固着させ、上記プローブ物質と上記サンプル物質との反応を検出する反応領域を複数形成する反応領域形成工程を備え、上記反応領域形成工程では、１種類の上記プローブ物質を、上記基板の円心を中心とした複数の円周のうち２つ以上の円周上に形成された添加領域に対して固着させることを特徴とする。

また、本発明に係るバイオアッセイ用基板の製造方法は、プローブ物質とサンプル物質との相互作用に基づく生化学分析を行うバイオアッセイ装置で使用されるバイオアッセイ用基板の製造方法において、ディスク状の基板の主面に対して、上記サンプル物質を添加する領域を、半径方向に沿った複数の直線上に複数形成する添加領域形成工程と、上記添加領域に対して上記プローブ物質を固着させ、上記プローブ物質と上記サンプル物質との反応を検出する反応領域を複数形成する反応領域形成工程を備え、上記反応領域形成工程では、１種類の上記プローブ物質を、半径方向に沿った複数の直線のうち２つ以上の直線上に形成された添加領域に対して固着させることを特徴とする。

また、本発明に係るバイオアッセイ用基板の製造方法は、プローブ物質とサンプル物質との相互作用に基づく生化学分析を行うバイオアッセイ装置で使用されるバイオアッセイ用基板の製造方法において、基板の主面に対して、上記サンプル物質を添加する添加領域を複数形成する反応領域形成工程と、上記添加領域に対して上記プローブ物質を固着させ、上記プローブ物質と上記サンプル物質との反応を検出する反応領域を複数形成する反応領域形成工程を備え、上記反応領域形成工程では、１種類の上記プローブ物質を、上記添加領域が形成されている範囲のうち、特定の範囲内に形成されている添加領域に限定して固着させないことを特徴とする。

本発明に係るバイオアッセイ用基板では、所定のプローブ物質とサンプル物質との反応を検出する複数の反応領域は、上記複数の円周のうち２つ以上の円周上に設けられている。すなわち、所定のプローブ物質とサンプル物質との反応を検出する複数の反応領域は、円心を中心とした１つの円の円周上に限定して設けられない。

従って、本発明に係るバイオアッセイ用基板は、円心を中心とした円周方向に沿って汚れが生じたときにも、所定のプローブ物質とサンプル物質との反応を検出する複数の反応領域の全部又は大部分が損傷を受けることを回避することが可能となる。すなわち、円周方向に沿った汚れに関わらず、プローブ物質とサンプル物質との相互作用を検出することが可能となる。

また、本発明に係るバイオアッセイ用基板では、所定のプローブ物質とサンプル物質との反応を検出する複数の反応領域は、半径方向に沿った複数の直線のうち、２つ以上の直線上に設けられる。すなわち、所定のプローブ物質とサンプル物質との反応を検出する複数の反応領域は、半径方向に沿った１つの直線上に限定して設けられない。

従って、本発明に係るバイオアッセイ用基板は、半径方向に沿って汚れが生じたときにも、所定のプローブ物質とサンプル物質との反応を検出する複数の反応領域の全部又は大部分が損傷を受けることを回避することが可能となる。すなわち、半径方向に沿った汚れに関わらず、プローブ物質とサンプル物質との相互作用を検出することが可能となる。

また、本発明に係るバイオアッセイ用基板では、反応領域のうち所定のプローブ物質とサンプル物質との反応を検出する複数の反応領域は、複数の反応領域が設けられている範囲のうち、所定の範囲内に限定して設けられない。すなわち、所定のプローブ物質とサンプル物質との反応を検出する複数の反応領域は、全体に亘って分散して位置するように設けられる。

従って、本発明に係るバイオアッセイ基板は、所定の領域が全面的に汚れたときにも、所定のプローブ物質とサンプル物質との反応を検出する複数の反応領域の全部又は大部分が損傷を受けることを回避することが可能となる。すなわち、所定の領域全面に亘る汚れに関わらず、プローブ物質とサンプル物質との相互作用を検出することが可能となる。

また、本発明に係るバイオアッセイ用基板の製造方法によれば、１種類の上記プローブ物質を、上記基板の円心を中心とした複数の円周のうち２つ以上の円周上に形成された添加領域に対して固着させる。すなわち、円心を中心とした１つの円の円周上に設けられた複数の反応領域上に限定して固着させない。

従って、本発明に係るバイオアッセイ用基板の製造方法によれば、円心を中心とした円周方向に沿って汚れが生じたときにも、特定の種類のプローブ物質が固着されている反応領域の全部又は大部分が損傷を受けることを回避することができ、汚れに関わらず、プローブ物質とサンプル物質との相互作用を検出することができるバイオアッセイ用基板を提供することが可能となる。

また、本発明に係るバイオアッセイ用基板の製造方法によれば、１種類のプローブ物質を、半径方向に沿った複数の直線のうち、２つ以上の直線上に設けられた複数の添加領域に固着させる。すなわち、半径方向に沿った１つ直線上に設けられた複数の反応領域上に限定して固着させない。

従って、本発明に係るバイオアッセイ用基板の製造方法によれば、半径方向に沿って汚れが生じたときにも、特定の種類のプローブ物質が固着されている反応領域の全部又は大部分が損傷を受けることを回避することができ、汚れに関わらず、プローブ物質とサンプル物質との相互作用を検出することができるバイオアッセイ用基板を提供することが可能となる。

また、本発明に係るバイオアッセイ用基板の製造方法によれば、１種類のプローブ物質を、添加領域が形成されている範囲のうち、特定の範囲内に形成されている添加領域に限定して固着させない。すなわち、１種類のプローブ物質を、分散して配置されている添加領域に固着させる。

従って、本発明に係るバイオアッセイ用基板の製造方法によれば、所定の領域が全面的に汚れたときにも、所定のプローブ物質とサンプル物質との反応を検出する複数の反応領域の全部又は大部分が損傷を受けることを回避することができ、汚れに関わらず、プローブ物質とサンプル物質との相互作用を検出することができるバイオアッセイ用基板を提供することが可能となる。

以下、本発明を実施するための最良の形態について、図面を参照しながら詳細に説明する。

（生化学分析用基板）
まず、図１及び図２に示すような、本発明を適用した生化学分析方法で使用するバイオアッセイ用基板１について説明する。

図１にバイオアッセイ用基板１の上面を模式的に表した図を示し、図２にバイオアッセイ用基板１の断面を模式的に表した図を示す。

バイオアッセイ用基板１の全体形状は、例えば、ＣＤ（Compact Disk）や、ＤＶＤ（Digital Versatile Disk）等の光ディスクと同様に、主面が円形とされた平板状（以下、ディスク状という。）とされている。バイオアッセイ用基板１の主面の中心には、中心孔２が形成されている。中心孔２には、当該バイオアッセイ用基板１が後述するＤＮＡ解析装置に装着されたときに、当該バイオアッセイ基板１を保持及び回転させるためのチャッキング機構が挿入される。

バイオアッセイ用基板１は、図２に示すように、基板層３上に、固相化層５と、ウェル形成層６とが順次積層されることによって、形成されている。なお、以下の説明では、バイオアッセイ用基板１のウェル形成層６の表面を上面１ａ、基板層３側の表面を下面１ｂという。

基板層３は、後述する蛍光標識剤を励起する励起光、及び蛍光標識剤の蛍光を透過する材料である。例えば、基板層３は、石英ガラス、シリコン、ポリカーボネート、ポリスチレン等の材料で形成されている。

固相化層５は、基板層３上に形成された層である。固相化層５は、プローブＤＮＡの一端を固相化させるための材料から形成されている。本例では、固相化層５は、シランにより表面修飾可能なＳｉＯ_２が、例えばスパッタリングや電子ビーム蒸着等により５０ｎｍの厚さに成膜された層となっている。

ウェル形成層６は、固相化層５上に形成された層である。ウェル形成層６は、複数のウェル８が形成された層である。

ウェル８は、その内部空間が、プローブＤＮＡ（検出用ヌクレオチド鎖）とサンプルＤＮＡ（標的ヌクレオチド鎖）とが相互作用する場、具体的には、ハイブリダイゼーション反応する場となる。

ウェル８は、バイオアッセイ用基板１の上面１ａ側に開口したくぼみ状となっており、サンプルＤＮＡが含まれた溶液などの液体が滴下されたときに、その液体を保留することができる程度の深さ及び大きさとなっている。例えば、ウェル８は、開口部が１００μｍ四方の大きさに形成され、深さが５μｍ程度とされ、底面１１に固相化層５が露出している。

複数のウェル８は、円心から外周方向に放射状に向かう複数の直線、すなわち半径方向に沿った直線上に、例えば４００μｍの間隔で、等間隔に並んで配置されている。すなわち、円心から外周方向に放射状に向かう複数の直線と、円心を中心としており等間隔で描かれた複数の円との交点上に、配置されている。

このようなウェル形成層６は、図３に示すように、固相化層５の上に感光性ポリイミド１３をスピンコート等で５μｍ程度の厚さに塗布する（ステップＳ１）。続いて、塗布した感光性ポリイミド１３上に所定のパターンのフォトマスク１４を形成し、このフォトマスク１４を用いて感光性ポリイミド１３を露光及び現像する（ステップＳ２）。このことにより、ウェル形成層６に複数のウェル８（添加領域）が形成される（ステップＳ３）。さらに、ウェル８の底面１１には、プローブＤＮＡ（Ｐ）が固着される（ステップＳ４）。

バイオアッセイ用基板１では、１種類のプローブＤＮＡは、後述するＤＮＡ解析装置に対する相対移動方向に沿った複数の曲線又は直線上のウェル８のうち、少なくとも２つ以上の曲線又は直線上に形成されたウェル８に固着される。

具体的に説明すると、バイオアッセイ用基板１は、ＤＮＡ解析装置に装着されて回転する。従って、円心を中心とした複数の同心円が、ＤＮＡ解析装置に対するバイオアッセイ用基板１の相対移動方向に沿った曲線となる。したがって、同じ種類のプローブは、円心を中心とする異なる円の円周上に設けられたウェル８に固着される。言いかえると、同じ種類のプローブは、１つの円の円周上に設けられたウェル８だけではなく、必ず異なる円の円周上に設けられたウェル８にも固着され、１つの円の円周上に設けられたウェル８に集中して固着されない。

また、バイオアッセイ用基板１がＤＮＡ解析装置に装着されると、後述するように、サンプルＤＮＡを含む溶液が貯留された滴下ヘッドなどが、バイオアッセイ基板１の半径方向に沿って移動する。従って、半径に沿った直線が、ＤＮＡ解析装置に対するバイオアッセイ用基板１の相対移動方向に沿った直線となる。したがって、同じ種類のプローブは、半径に沿った異なる直線上に設けられたウェル８に固着される。言いかえると、同じ種類のプローブは、半径方向に沿った複数の直線のうち１つの直線上に設けられたウェル８だけではなく、異なる直線上に設けられたウェル８にも固着され、１つの直線上に設けられた複数のウェル８に集中して固着されない。

同じ種類のプローブＤＮＡは、例えば、図４に示すように、半径方向に沿った複数の直線のうち互いに隣接する直線上に設けられており、且つ互いに隣接する円周上に設けられているウェル８に固着されることが好ましい。

以上説明した位置関係で同じ種類のプローブＤＮＡが固着されることにより、バイオアッセイ用基板１は、円心を中心とした円の円周に沿った汚れが生じたときや、半径方向に沿った汚れが生じたときにも、特定の種類のプローブＤＮＡが固着されているウェル８の全部又は大部分が損傷を受けることを回避することができる。従って、バイオアッセイ用基板１は、円心を中心とした円の円周方向に沿った汚れや半径方向に沿った汚れに関わらず、ＤＮＡの配列分析を行うことが可能となる。

なお、半径方向に沿った複数の直線のうち互いに隣接する直線上に設けられており、且つ互いに隣接する円周上に設けられている複数のウェル８の中には、特定の種類のプローブが固着されているウェル８の他に、プローブが固着されていないウェル８が配置されていても良い。プローブが固着されていないウェル８は、例えば、キャリブレーション用に使用することができる。

また、同じ種類のプローブＤＮＡは、バイオアッセイ基板１上のウェル８が設けられている領域のうち、特定の領域Ｒ内に設けられた複数のウェル８に集中的に固着されない。言い換えると、同じ種類のプローブＤＮＡは、互いにできるだけ離れた位置に設けられたウェル８に固着される。すなわち、同じ種類のプローブＤＮＡは、分散して位置するウェル８に固着される。

この位置関係で同じ種類のプローブＤＮＡが固着されることにより、バイオアッセイ用基板１は、例えばＤＮＡ解析装置との衝突などにより、領域Ｒが全面的に損傷されたときにも、特定の種類のプローブＤＮＡが固着されているウェル８の全部又は大部分が損傷を受けることを回避することが可能となり、ＤＮＡの配列分析を行うことが可能となる。なお、この位置関係で配置したウェルの中にも、プローブが固着されていないウェル８が配置されていても良い。

また、図５に示すように、例えば方形状など、ディスク状以外の形状のバイオアッセイ基板２０についても、同じ種類のプローブＤＮＡは、特定の領域Ｒ’内に設けられた複数のウェル２１に集中的に固着されない。この位置関係で同じ種類のプローブＤＮＡが固着されることにより、バイオアッセイ用基板２０は、領域Ｒ’が全面的に損傷されたときにも、特定の種類のプローブＤＮＡが固着されているウェル２１の全部又は大部分が損傷を受けることを回避することが可能となり、ＤＮＡの配列分析を行うことが可能となる。

なお、図４は、バイオアッセイ用基板１の表面の一部拡大図である。図４中probe１〜１０は、ウェル８の底面に固着されているプローブＤＮＡの種類を示しており、ＰＴＣはポジティブコントロールを示しており、ＮＴＣはネガティブコントロールを示している。また、図４では、矢印Ａで示す方向が円心を中心とした円の円周方向であり、矢印Ｂで示す方向が半径方向である。また、図４では、各ウェル８間の間隙や、後述するアドレスピットなどを省略して示している。

なお、ウェル８は、一端が官能基により修飾されたプローブＤＮＡが底面１１（固相化層５が露出した部分）に結合するように、当該底面１１が官能基により表面修飾されていることが好ましい。例えば、ウェル８は、図６に示すように、ＳＨ基１５を有するシラン分子により、底面１１（ＳｉＯ_２から形成されている固相化層５）が表面修飾される。このため、ウェル８の底面１１には、例えばＳＨ基で一端が修飾されたプローブＤＮＡを結合させることができる。このようにバイオアッセイ用基板１では、ウェル８の底面１１に、プローブＤＮＡの一端を結合させることができるので、図７に示すように、底面１１から垂直方向に鎖が伸びるように、プローブＤＮＡ（Ｐ）を結合させることができる。

また、バイオアッセイ用基板１には、バイオアッセイ用基板１の下面１ｂ側からレーザ光を照射することにより読み取り可能なアドレスピット９が形成されている。アドレスピット９は、バイオアッセイ用基板１の平面上における各ウェル８の位置を特定するための情報である。アドレスピット９から情報を光学的に読み取ることによって、複数存在するウェル８のうち、現在レーザ光を照射しているウェル８がどれであるかを特定することが可能となる。このようなアドレスピット９が設けてあることによって、後述する滴下装置による溶液の滴下位置の制御や、対物レンズによる蛍光検出位置の特定を行うことができる。

以上のようなバイオアッセイ用基板１では、１種類のプローブＤＮＡが、円心を中心とした複数の同心円のうち、２つ以上の円の円周上に設けられたウェル８に固着される。また、バイオアッセイ用基板１では、１種類のプローブＤＮＡが、バイオアッセイ用基板１の半径方向に沿った複数の直線のうち、２つ以上の直線上に設けられたウェル８に固着される。

従って、本発明を適用したバイオアッセイ用基板１によれば、円心を中心とした円の円周に沿った損傷を受けたときや、半径方向に沿った損傷を受けたときにも、特定の種類のプローブＤＮＡが固着されているウェル８の全部又は大部分が損傷を受けることを回避することが可能となり、円心を中心とした円の円周に沿った損傷や半径方向に沿った損傷に関わらず、ＤＮＡの配列分析を行うことが可能となる。

（ＤＮＡ配列解析方法）
つぎに、上述したバイオアッセイ用基板１を使用したＤＮＡの塩基配列の解析方法について説明する。

先ず、生体から抽出したサンプルＤＮＡが含有された試料溶液Ｓを、上述したバイオアッセイ用基板１上の各ウェル８に滴下する。

試料溶液Ｓの滴下制御は、光ディスクの駆動システムと同様に、バイオアッセイ用基板１を駆動制御することにより行う。すなわち、図８に示すように、バイオアッセイ用基板１を、上面１ａを上にして平行に保持しながら回転駆動するとともに、レーザ光Ｖをバイオアッセイ用基板１の下側（下面１ｂ側）から照射してアドレスピット９を検出することによりウェル８の位置を特定しながら、滴下位置の制御を行えばよい。

続いて、サンプルＤＮＡの滴下後、バイオアッセイ用基板１の主面に対して垂直方向の交流電界を、加熱しながら印加する。例えば、ウェル８内に１ＭＶ／ｍ、１ＭＨｚ程度の交流電界を印加する。

このような処理をすると、サンプルＤＮＡとプローブＤＮＡとが垂直方向に伸張して立体障害の少ない状態となるとともに、サンプルＤＮＡがバイオアッセイ用基板１に対して垂直方向に移動する。この結果、互いの塩基配列が相補的な関係にあるサンプルＤＮＡとプローブＤＮＡとが同一のウェル８内にある場合には、それらがハイブリダイゼーションを起こす。

続いて、ハイブリダイゼーションを起こさせた後に、蛍光標識インターカレータ等をバイオアッセイ用基板１のウェル８内に滴下する。このような蛍光標識剤は、ハイブリダイゼーションを起こしたプローブＤＮＡとサンプルＤＮＡとの２重らせん間に挿入して結合する。

続いて、バイオアッセイ用基板１の表面１ａを純水等で洗浄し、ハイブリダイゼーションを起こしていないウェル８内のサンプルＤＮＡ及び蛍光標識剤を除去する。この結果、ハイブリダイゼーションを起こしたウェル８内にのみ、蛍光標識剤が残存することとなる。

続いて、光ディスクの駆動システムと同様にバイオアッセイ用基板１を駆動制御することにより、ウェル８からの蛍光の検出を行う。すなわち、バイオアッセイ用基板１を保持しながら回転駆動するとともに、レーザ光Ｖをバイオアッセイ用基板１の下側（下面１ｂ側）から照射してアドレスピット９を検出することによりウェル８の位置を特定する。それと同時に、励起光をバイオアッセイ用基板１の下側（下面ｂ側）から検出する。そして、どのウェル８から蛍光が発生されているか、又は蛍光が発生されていないかを検出する。

続いて、バイオアッセイ用基板１上の蛍光が発生していたウェル８の位置を示すマップを作成する。そして、作成したマップ、並びに、各ウェルにどのような塩基配列のプローブＤＮＡが固着されていたかを示す配置マップに基づき、サンプルＤＮＡの配列解析を行う。

（ＤＮＡ解析装置）
つぎに、上述したバイオアッセイ用基板１を使用してサンプルＤＮＡの配列を解析するＤＮＡ解析装置について説明する。

図９に示すように、ＤＮＡ解析装置５１は、上述したバイオアッセイ用基板１を保持して回転させるディスク装填部５２と、ハイブリダイゼーションのための各種溶液を貯留するとともにバイオアッセイ用基板１のウェル８にその溶液を滴下する滴下部５３と、バイオアッセイ用基板１から励起光を検出するための励起光検出部５４と、上記各部の管理及び制御を行う制御／サーボ部５５とを備えている。

ディスク装填部５２は、バイオアッセイ用基板１の中心孔２内に挿入して当該バイオアッセイ用基板１を保持するチャッキング機構６１と、チャッキング機構６１を駆動することによりバイオアッセイ用基板１を回転させるスピンドルモータ６２とを有している。ディスク装填部５２は、上面１ａ側が上方向となるようにバイオアッセイ用基板１を水平に保持した状態で、当該バイオアッセイ用基板１を回転駆動する。ディスク装填部５２では、バイオアッセイ用基板１を水平に保持することによって、ウェル８に滴下された溶液が垂れてしまうといった問題を回避することができる。

滴下部５３は、試料溶液Ｓや蛍光標識剤Ｓ’を貯留する貯留部６３と、貯留部６３内の試料溶液Ｓや蛍光標識剤Ｓ’をバイオアッセイ用基板１に滴下する滴下ヘッド６４とを有している。

滴下ヘッド６４は、水平に装填されたバイオアッセイ用基板１の上面１ａの上方に配置されている。さらに、滴下ヘッド６４は、バイオアッセイ用基板１のアドレスピットから読み出される位置情報及び回転同期情報に基づいて、バイオアッセイ用基板１との相対位置を半径方向に制御し、サンプルＤＮＡ（標的ヌクレオチド鎖Ｔ）を含有する試料溶液Ｓを所定のウェル８の反応領域に正確に追従して滴下する構成とされている。また、貯留部６３と滴下ヘッド６４との組み合わせは、ハイブリダイゼーションのために使用する試料溶液Ｓの数だけある。

また、滴下部５３では、バイオアッセイ用基板１上の所定の位置に正確に試料溶液を滴下するために、例えば、いわゆる「インクジェットプリンティング方式」に基づく滴下方法が採用されている。「インクジェットプリンティング方式」は、滴下ヘッド６４にいわゆるインクジェットプリンタで用いられるインク噴出機構を適用する方法であり、インクジェットプリンタのようなノズルヘッドからバイオアッセイ用基板１に試料溶液Ｓを噴射するものである。

励起光検出部５４は、光学ヘッド７０を有している。光学ヘッド７０は、水平に装填されたバイオアッセイ用基板１の下方側、すなわち、下面１ｂ側に配置されている。光学ヘッド７０は、例えば、図示していないスレッド機構等により、バイオアッセイ用基板１の半径方向に移動自在とされている。

光学ヘッド７０は、対物レンズ７１と、対物レンズ７１を移動可能に支持する２軸アクチュエータ７２と、導光ミラー７３とを有している。

対物レンズ７１は、その中心軸がバイオアッセイ用基板１の表面に対して略垂直となるように２軸アクチュエータ７２に支持されている。従って、対物レンズ７１は、バイオアッセイ用基板１の下方側から入射された光束を、当該バイオアッセイ用基板１に対して集光することができる。

２軸アクチュエータ７２は、バイオアッセイ用基板１の表面に対して垂直な方向、及び、バイオアッセイ用基板１の半径方向の２方向に、対物レンズ７１を移動可能に支持している。２軸アクチュエータ７２を駆動することにより、対物レンズ７１により集光された光の焦点を、バイオアッセイ用基板１の表面に対して垂直な方向及び半径方向に移動させることができる。従って、この光学ヘッド７０では、光ディスクシステムにおけるジャストフォーカス制御並びに位置決め制御と同様の制御を行うことができる。

導光ミラー７３は、光路Ｘ上に対して４５°の角度で配置されている。光路Ｘは、励起光Ｐ、蛍光Ｆ、サーボ光Ｖ及び反射光Ｒが、光学ヘッド７０に対して入射及び出射する光路である。導光ミラー７３には、励起光Ｐ及びサーボ光Ｖが光路Ｘ上から入射される。導光ミラー７３は、励起光Ｐ及びサーボ光Ｖを反射して９０°屈折させて、対物レンズ７１に入射させる。対物レンズ７１に入射された励起光Ｐ及びサーボ光Ｖは、当該対物レンズ７１により集光されてバイオアッセイ用基板１に照射される。また、導光ミラー７３には、蛍光及びサーボ光Ｖの反射光Ｒが、バイオアッセイ用基板１から対物レンズ７１を介して入射される。導光ミラー７３は、蛍光Ｆ及び反射光Ｒを反射して９０°屈折させて、光路Ｘ上に出射する。

なお、光学ヘッド７０をスレッド移動させる駆動信号及び２軸アクチュエータ７２を駆動する駆動信号は、制御／サーボ部５５から与えられる。

また、励起光検出部５４は、励起光Ｐを出射する励起光源７４と、励起光源７４から出射された励起光Ｐを平行光束とするコリメータレンズ７５と、コリメータレンズ７５により平行光束とされた励起光Ｐを光路Ｘ上で屈折させて導光ミラー７３に照射する第１のダイクロックミラー７６とを有している。

励起光源７４は、蛍光標識剤を励起可能な波長のレーザ光源を有する発光手段である。励起光源７４から出射される励起光Ｐは、ここでは波長が４０５ｎｍのレーザ光源である。なお、励起光Ｐの波長は、蛍光標識剤を励起できる波長であればどのような波長であってもよい。コリメータレンズ７５は、励起光源７４から出射された励起光Ｐを平行光束にする。第１のダイクロックミラー７６は、波長選択性を有する反射鏡であり、励起光Ｐの波長の光のみを反射して、蛍光Ｆ及びサーボ光Ｖの波長の光を透過する。第１のダイクロックミラー７６は、光路Ｘ上に４５°の角度で配置されており、コリメータレンズ７５から出射された励起光Ｐを反射して９０°屈折させ、導光ミラー７３に励起光Ｐを照射している。

また、励起光検出部５４は、蛍光Ｆを検出するアバランジェフォトダイオード７７と、蛍光Ｆを集光する集光レンズ７８と、光学ヘッド７０から光路Ｘ上に出射された蛍光Ｆを屈折させてアバランジェフォトダイオード７７に照射する第２のダイクロックミラー７９とを有している。

アバランジェフォトダイオード７７は、非常に感度の高い光検出器であり、微弱光量の蛍光Ｆを検出することが可能である。なお、アバランジェフォトダイオード７７により検出する蛍光Ｆの波長は、ここでは４７０ｎｍ程度である。また、この蛍光Ｆの波長は、蛍光標識剤の種類により異なるものである。

集光レンズ７８は、アバランジェフォトダイオード７７上に蛍光を集光するためのレンズである。

第２のダイクロックミラー７９は、光路Ｘ上に４５°の角度で配置されるとともに、導光ミラー７３側から見て第１のダイクロックミラー７６の後段に配置されている。従って、第２のダイクロックミラー７９には、蛍光Ｆ、サーボ光Ｖ及び反射光Ｒが入射し、励起光Ｐは入射しない。第２のダイクロックミラー７９は、光学ヘッド７０の導光ミラー７３から出射された蛍光Ｆを反射して９０°屈折させ、集光レンズ７８を介してアバランジェフォトダイオード７７に蛍光Ｆを照射する。

アバランジェフォトダイオード７７では、このように検出した蛍光Ｆの光量に応じた電気信号を発生し、その電気信号を制御／サーボ部５５に供給する。

また、励起光検出部５４は、サーボ光Ｖを出射するサーボ光源８０と、サーボ光源８０から出射されたサーボ光Ｖを平行光束とするコリメータレンズ８１と、サーボ光Ｖの反射光Ｒを検出するフォトディテクト回路８２と、非点収差を生じさせてフォトディテクト回路８２に対して反射光Ｒを集光するシリンドリカルレンズ８３と、サーボ光Ｖと反射光Ｒとを分離する光セパレータ８４とを有している。

サーボ光源８０は、例えば７８０ｎｍの波長のレーザ光を出射するレーザ光源を有する発光手段である。なお、サーボ光Ｖの波長は、アドレスピットが検出できる程度の波長であり、励起光Ｐ及び蛍光Ｆの波長と異なっていれば７８０ｎｍに限らずどのような波長であってもよい。

コリメータレンズ８１は、サーボ光源８０から出射されたサーボ光Ｖを平行光束にする。平行光束とされたサーボ光Ｖは光セパレータ８４に入射される。

フォトディテクト回路８２は、反射光Ｒを検出するディテクタと、検出した反射光Ｒからフォーカスエラー信号、位置決めエラー信号、及びアドレスピットの再生信号を生成する信号生成回路とを有している。反射光Ｒは、サーボ光Ｖがバイオアッセイ用基板１で反射して生成された光であるので、その波長は、サーボ光と同一の７８０ｎｍである。

なお、フォーカスエラー信号は、対物レンズ７１により集光された光の合焦位置と、バイオアッセイ用基板１の基板層３との位置ずれ量を示すエラー信号である。フォーカスエラー信号が０となったときに、対物レンズ７１とバイオアッセイ用基板１との間の距離が最適になる。位置決めエラー信号は、所定のウェル８の位置と、焦点位置とのディスク半径方向に対する位置ずれ量を示す信号である。位置決めエラー信号が０となったときに、サーボ光Ｖのディスク半径方向に対する照射位置が任意のウェル８に一致したこととなる。アドレスピットの再生信号は、バイオアッセイ用基板１に記録されているアドレスピットに記述されている情報内容を示す信号である。この情報内容を読み出すことにより、現在サーボ光Ｖを照射しているウェル８を特定することができる。

フォトディテクト回路８２は、反射光Ｒに基づき生成されたフォーカスエラー信号、位置決めエラー信号及びアドレスピットの再生信号を制御／サーボ部５５に供給する。

シリンドリカルレンズ８３は、フォトディテクト回路８２上に反射光Ｒを集光するとともに非点収差を生じさせるためのレンズである。このように非点収差を生じさせることによりフォトディテクト回路８２によりフォーカスエラー信号を生成させることができる。

光セパレータ８４は、偏光ビームスプリッタからなる光分離面８４ａと１／４波長板８４ｂにより構成されている。光セパレータ８４では、１／４波長板８４ｂの逆側から入射された光を光分離面８４ａが透過し、その透過光の反射光が１／４波長板８４ｂ側から入射された場合には光分離面８４ａが反射する機能を有している。光セパレータ８４は、光分離面８４ａが光路Ｘ上に４５°の角度で配置されているとともに、導光ミラー７３側から見て第２のダイクロックミラー７９の後段に配置されている。従って、光セパレータ８４では、コリメータレンズ８１から出射された反射光Ｒを反射することにより９０°屈折させ、シリンドリカルレンズ８３を介してフォトディテクト回路８２に反射光Ｒを照射する。

制御／サーボ部５５は、励起光検出部５４により検出されたフォーカスエラー信号、位置決めエラー信号及びアドレスピットの再生信号に基づき、各種のサーボ制御を行う。

すなわち、制御／サーボ部５５は、フォーカスエラー信号に基づき光学ヘッド７０内の２軸アクチュエータ７２を駆動して対物レンズ７１とバイオアッセイ用基板１との間の間隔を制御し、フォーカスエラー信号が０となるようにサーボ制御を行う。また、制御／サーボ部５５は、位置決めエラー信号に基づき光学ヘッド７０内の２軸アクチュエータ７２を駆動して対物レンズ７１をバイオアッセイ用基板１の半径方向に移動制御し、フォーカスエラー信号が０となるようにサーボ制御を行う。また、制御／サーボ部５５は、アドレスピットの再生信号に基づき光学ヘッド７０のスレッド移動制御を行って光学ヘッド７０を所定の半径位置に移動し、目的のウェル位置に対物レンズ７１を移動させる。

また、制御／サーボ部５５は、ハイブリダイゼーション時に、交流電力発生部３１を制御し、電力の供給の制御も行う。

以上のようなＤＮＡ解析装置５１では、次のような動作を行う。

ＤＮＡ解析装置５１は、バイオアッセイ用基板１を回転させながら、ウェル８上にサンプルＤＮＡが含有された溶液を滴下し、プローブＤＮＡとサンプルＤＮＡとをハイブリダイゼーションさせる。ハイブリダイゼーション時には上述した電界の制御も行う。また、ハイブリダイゼーション処理の済んだバイオアッセイ用基板１上に、蛍光標識剤を含んだバッファ溶液を滴下する。

また、ＤＮＡ解析装置５１は、蛍光標識剤が滴下された後のバイオアッセイ用基板１を回転させ、励起光Ｐを当該バイオアッセイ用基板１の下面１ｂ側から入射させてウェル８内の蛍光標識剤に照射し、その励起光Ｐに応じてその蛍光標識剤から発生した蛍光Ｆをバイオアッセイ用基板１の下方から検出する。

ここで、ＤＮＡ解析装置５１は、励起光Ｐとサーボ光Ｖとを同一の対物レンズ７１を介してバイオアッセイ用基板１に照射している。このため、ＤＮＡ解析装置５１では、サーボ光Ｖを用いたフォーカス制御、位置決め制御、並びにアドレス制御を行うことによって、励起光Ｐの照射位置、すなわち、蛍光Ｆの発光位置を特定することが可能となり、その蛍光の発光位置からサンプルＤＮＡと結合したプローブを特定することができる。

本発明を適用したバイオアッセイ用基板の平面図である。 同バイオアッセイ用基板の断面図である。 同バイオアッセイ用基板のウェルを形成する工程を示した図である。 本発明を適用したディスク状のバイオアッセイ用基板において固着されるプローブの位置を示す図である。 本発明の適用した方形状のバイオアッセイ用基板において固着されるプローブの位置を示す図である。 ウェルの底面に修飾されるＳＨ基を有するシラン分子を示す図である。 ウェルの底面に結合したプローブＤＮＡを示す図である。 本発明を適用したバイオアッセイ用基板に対する溶液の滴下制御を説明するための図である。 同バイオアッセイ用基板を用いてＤＮＡ解析を行うＤＮＡ解析装置の構成図である。 バイオアッセイ用基板の円心を中心とした１つの円の円周上に設けられたウェルに、同一のプローブが固着された状態を示す図である。 バイオアッセイ用基板の半径方向に沿った１つの直線上に設けられたウェルに、同一のプローブが固着された状態を示す図である。 バイオアッセイ用基板の所定の領域内に設けられた複数のウェルに、同一のプローブが固着された状態を示す図である。 バイオアッセイ用基板に生じる汚れを示す図である。

符号の説明

１ バイオアッセイ用基板、２ 中心孔、３ 基板層、４ 透明電極層、５ 固相化層、６ ウェル形成層、８ ウェル、９ ピット

Claims (22)

1. プローブ物質とサンプル物質との相互作用に基づく生化学分析を行うバイオアッセイ装置で使用されるディスク状のバイオアッセイ用基板において、
   上記プローブ物質と上記サンプル物質との反応を検出する複数の反応領域が、円心を中心とした複数の円周上に設けられており、
   上記反応領域のうち所定のプローブ物質とサンプル物質との反応を検出する複数の反応領域は、上記複数の円周のうち２つ以上の円周上に設けられることを特徴とするバイオアッセイ用基板。
2. 上記所定のプローブ物質と上記サンプル物質との反応を検出する複数の反応領域は、上記所定のプローブ物質が固着されている領域と、上記プローブ物質が固着されていない領域とを含むことを特徴とする請求項１記載のバイオアッセイ用基板。
3. 上記所定のプローブ物質と上記サンプル物質との反応を検出する複数の反応領域は、半径方向に沿った複数の直線のうち、２つ以上の直線上に設けられることを特徴とする請求項１記載のバイオアッセイ用基板。
4. 上記所定のプローブ物質と上記サンプル物質との反応を検出する複数の反応領域は、上記複数の反応領域が設けられている範囲のうち、所定の範囲内に限定して設けられないことを特徴とする請求項１記載のバイオアッセイ用基板。
5. プローブ物質とサンプル物質との相互作用に基づく生化学分析を行うバイオアッセイ装置で使用されるディスク状のバイオアッセイ用基板において、
   上記プローブ物質と上記サンプル物質との反応を検出する複数の反応領域が、半径方向に沿った複数の直線上に設けられており、
   上記反応領域のうち所定のプローブ物質と上記サンプル物質との反応を検出する複数の反応領域は、上記半径方向に沿った複数の直線のうち２つ以上の直線上に設けられることを特徴とするバイオアッセイ用基板。
6. 上記所定のプローブ物質と上記サンプル物質との反応を検出する複数の反応領域は、上記所定のプローブ物質が固着されている領域と、上記プローブ物質が固着されていない領域とを含むことを特徴とする請求項５記載のバイオアッセイ用基板。
7. 上記所定のプローブ物質と上記サンプル物質との反応を検出する複数の反応領域は、上記複数の反応領域が設けられている範囲のうち、所定の範囲内に限定して設けられないことを特徴とする請求項５記載のバイオアッセイ用基板。
8. プローブ物質とサンプル物質との相互作用に基づく生化学分析を行うバイオアッセイ装置で使用されるバイオアッセイ用基板において、
   上記プローブ物質と上記サンプル物質との反応を検出する複数の反応領域が設けられており、
   上記反応領域のうち所定のプローブ物質と上記サンプル物質との反応を検出する複数の反応領域は、上記複数の反応領域が設けられている範囲のうち、所定の範囲内に限定して設けられないことを特徴とするバイオアッセイ用基板。
9. 上記所定のプローブ物質と上記サンプル物質との反応を検出する複数の反応領域は、上記所定のプローブ物質が固着されている領域と、上記所定のプローブ物質が固着されていない領域とを含むことを特徴とする請求項８記載のバイオアッセイ用基板。
10. 当該バイオアッセイ用基板の形状は、ディスク状であることを特徴とする請求項８記載のバイオアッセイ用基板。
11. 当該バイオアッセイ用基板の形状は、矩形状であることを特徴とする請求項８記載のバイオアッセイ用基板。
12. プローブ物質とサンプル物質との相互作用に基づく生化学分析を行うバイオアッセイ装置で使用されるバイオアッセイ用基板の製造方法において、
    ディスク状の基板の主面に対して、上記サンプル物質を添加する添加領域を、上記基板の円心を中心とした複数の円周上に複数形成する添加領域形成工程と、
    上記添加領域に対して上記プローブ物質を固着させ、上記プローブ物質と上記サンプル物質との反応を検出する反応領域を複数形成する反応領域形成工程を備え、
    上記反応領域形成工程では、１種類の上記プローブ物質を、上記基板の円心を中心とした複数の円周のうち２つ以上の円周上に形成された添加領域に対して固着させることを特徴とするバイオアッセイ用基板の製造方法。
13. 上記反応領域形成工程では、上記プローブ物質を、全ての上記添加領域に固着させないことを特徴とする請求項１２記載のバイオアッセイ用基板の製造方法。
14. 上記添加領域形成工程では、上記添加領域を、半径方向に沿った複数の直線上に形成し、
    上記反応領域形成工程では、１種類の上記プローブ物質を、上記複数の直線のうち２つ以上の直線上に形成された上記添加領域に対して固着させることを特徴とする請求項１２記載のバイオアッセイ用基板の製造方法。
15. 上記プローブ物質固着工程では、１種類の上記プローブ物質を、上記添加領域が形成されている範囲のうち、特定の範囲内に形成されている添加領域に限定して固着させないことを特徴とする請求項１２記載のバイオアッセイ用基板の製造方法。
16. プローブ物質とサンプル物質との相互作用に基づく生化学分析を行うバイオアッセイ装置で使用されるバイオアッセイ用基板の製造方法において、
    ディスク状の基板の主面に対して、上記サンプル物質を添加する領域を、半径方向に沿った複数の直線上に複数形成する添加領域形成工程と、
    上記添加領域に対して上記プローブ物質を固着させ、上記プローブ物質と上記サンプル物質との反応を検出する反応領域を複数形成する反応領域形成工程を備え、
    上記反応領域形成工程では、１種類の上記プローブ物質を、半径方向に沿った複数の直線のうち２つ以上の直線上に形成された添加領域に対して固着させることを特徴とするバイオアッセイ用基板の製造方法。
17. 上記反応領域形成工程では、上記プローブ物質を、全ての上記添加領域に固着させないことを特徴とする請求項１６記載のバイオアッセイ用基板の製造方法。
18. 上記プローブ物質固着工程では、１種類の上記プローブ物質を、上記添加領域が形成されている範囲のうち、特定の範囲内に形成されている添加領域に限定して固着させないことを特徴とする請求項１６記載のバイオアッセイ用基板の製造方法。
19. プローブ物質とサンプル物質との相互作用に基づく生化学分析を行うバイオアッセイ装置で使用されるバイオアッセイ用基板の製造方法において、
    基板の主面に対して、上記サンプル物質を添加する添加領域を複数形成する反応領域形成工程と、
    上記添加領域に対して上記プローブ物質を固着させ、上記プローブ物質と上記サンプル物質との反応を検出する反応領域を複数形成する反応領域形成工程を備え、
    上記反応領域形成工程では、１種類の上記プローブ物質を、上記添加領域が形成されている範囲のうち、特定の範囲内に形成されている添加領域に限定して固着させないことを特徴とするバイオアッセイ用基板の製造方法。
20. 上記反応領域形成工程では、上記プローブ物質を、全ての上記添加領域に固着させないことを特徴とする請求項１９記載のバイオアッセイ用基板の製造方法。
21. 上記基板の形状は、ディスク状であることを特徴とする請求項１９記載のバイオアッセイ用基板の製造方法。
22. 上記基板の形状は、矩形状であることを特徴とする請求項１９記載のバイオアッセイ用基板の製造方法。

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