JP2005241453A

JP2005241453A - 円盤型バイオチップ、ビーズ読み取り装置、及びビーズ読み取りシステム

Info

Publication number: JP2005241453A
Application number: JP2004051922A
Authority: JP
Inventors: Sunao Nakao; 素直中尾; Toshiki Morita; 敏樹森田; Kanako Iwao; 華奈子岩尾
Original assignee: Hitachi Software Engineering Co Ltd
Current assignee: Hitachi Software Engineering Co Ltd
Priority date: 2004-02-26
Filing date: 2004-02-26
Publication date: 2005-09-08

Abstract

【課題】ビーズを読み取るためのコンパクトで低価格なチップとその読み取り装置を提供する。
【解決手段】円盤型バイオチップの表面に、サンプルビーズ注入口３と、該注入口から円盤型チップの外周部方向に伸びるビーズ流路２とを有する、円盤型チップ、及び上記円盤型チップを搭載するステージと、該ステージを回転させる駆動部と、該円盤型チップ中のビーズに対してレーザ照射部と、該ビーズからの発光を読み取るための読み取り部からなる上記円盤型チップ中のビーズを読み取る装置。
【選択図】図１

Description

本発明は、ポリスチレンビーズ、ポリプロピレンビーズ、磁気ビーズなどのビーズを用いて、生体高分子の検出及び測定に関わるプローブアレイ技術において、基板中の流路に配列されたビーズを、効率良く移動させ、ビーズからの発光を測定するための技術に関するものである。

生体高分子の検出、測定及び分析技術（以下、「検出」という）においては、様々な方法が提案されており、既に製品化され実用されているものも少なくない。そのような中で、既知のプローブ生体高分子を基板及び基質上に固定し、蛍光物質で標識施したサンプル生体高分子を、前記基板又は基質上に固定化されたプローブ生体高分子と反応させ、基板又は基質上の標識した蛍光物質由来の蛍光強度によりプローブ生体高分子とサンプル生体高分子の結合量を測定し、生体高分子の検出を行う手法があげられる。前記基質又は基板として選択されるものとして、平板及びビーズに大略構成され、それぞれマイクロアレイ技術及びビーズ利用技術として注目を集めている。

まず、平板を基質又は基板として用いたものとしてＤＮＡマイクロアレイがあげられる。ＤＮＡマイクロアレイとは、主に表面修飾ガラス基板上にプローブＤＮＡをスポットとして配列させ固定化したものである。ＤＮＡマイクロアレイは主に二種類あり、半導体技術を応用し基板上でプローブＤＮＡを合成していく方法と、既に合成されたオリゴＤＮＡあるいはｃＤＮＡを、液滴として基板上に配列させ固定化させる方法がある。

特許文献１には、分子生物学全般で使用されているＤＮＡや蛋白質に蛍光物質を標識して、レーザで蛍光物質を励起し、蛍光の発光量でＤＮＡや蛋白質の量を検出する読み取り方式では、バイオチップを読み取るのにチップを駆動させるメカニズムとレーザを振って読み取るラインセンサーのメカニズムが必要となり、コストが高くなり問題となっていたのを、読み取り装置を安価に実現可能とすることを目的として、蛍光物質で標識されたＤＮＡ又は蛋白質から成る検体を格納する複数のスポットが、円盤状の表面に径方向に向かって放射状に配列されたバイオチップ、及びこのバイオチップと、前記各スポットの検体にレーザ光を照射し、蛍光物質を励起させ、蛍光発光量を検出する手段とを備えたバイオチップ読み取り装置が開示されている。

ＤＮＡマイクロアレイに代表されるマイクロアレイ技術は、集積度が高く、一回の操作で膨大な情報量が得られることから、研究用途を中心に幅広く利用されているものである。しかし、プローブを固定化させる工程において高度な技術を要することや、一枚あたりの生産コストが高く、プローブの固定化において基質又は基板との結合力が比較的弱いことが問題となってきた。

一方、ビーズ技術においては、プローブと基質又は基板との結合が比較的強く、ビーズの合成が比較的安価に行うことが可能である点で優れているものの、ビーズ技術においては、ビーズのＩＤ化について高度な技術を要するという問題があった。

尚、上記例ではＤＮＡを用いた方法について紹介したが、これらをペプチドやたんぱく質あるいは細胞等の生体材料に置き換える技術についても進展している。

そこで、下記特許文献２に開示されるように、マイクロアレイ技術とビーズ利用技術を融合させた形態としてプローブアレイ技術が考案された。

特許文献２には、プローブの種類ごとに複数の微粒子にプローブを固定化し、複数のプローブに対する該微粒子を定められた個数ずつ集めてアレーとしたことを特徴とするプローブアレイが開示されている。本技術は、プローブを基質又は基板に固定化する工程と、プローブを基板上に配列させる工程を別とすることに大きな特徴を持つ。すなわち、予めビーズにプローブを固定化させ、該ビーズを基板上の溝やキャピラリー中などに配列させるものである。プローブの種類はビーズの位置情報において判断することができ、反応は溝やキャピラリー中にサンプル溶液を通過させることにより行う。これにより、マイクロアレイ技術の問題点とビーズ利用技術の問題点の多くを解決するだけでなく、プローブとサンプルとの反応性が向上することも期待でき、装置の自動化についても比較的容易に構築できることが考えられる。

ビーズを基質又は基板として用いたものとして、フローサイトメトリー技術を利用した方法があげられる。これは、ビーズをその直径に近い幅を有する流路（キャピラリー）中を移動させ、移動中のビーズの発光を測定するものである。

ここで、配列させ、サンプル溶液と反応させたビーズを移動させることで、従来のフローサイトメータを用いて、ハイブリダイゼーション等の反応を測定できるものである。このように、ビーズの読み取り機としてフローサイトメータを利用していた。フローサイトメータはベックマン社、コールター社などから販売されている。しかしながら、狭い流路（キャピラリー）中を微小なビーズを順調に移動させることに高度な技術を要するという問題があった。

特許第３３４６７２７号公報特開２０００−３４６８４２号公報

通常のフローサイトメータは細胞を読み取る装置であり、細胞を読み取るためのキャリブレーション用に粒径のそろったビーズを蛍光標識することで使用していた。蛍光標識したビーズはＤＮＡチップといった生体高分子を検出するための基盤としてビーズを利用できるようにしたシステムが存在するが、これらの測定装置はフローサイトメータを流用して定量しており、その再現性、定量性に問題があった。また、汎用の機械であるため、機械の大きさがおおきく、値段も高価なものであった。

本発明は、狭い流路（キャピラリー）中を微小なビーズを順調に移動させ、所定の順序に配列することにより、上記課題を解決する。

本発明では、円盤型のバイオチップ内空間を設けることで、空間内でのビーズの移動を可能にする。具体的には、ビーズの移動、整列、読み取りは円盤型のバイオチップを回転することで生まれる遠心力を利用する。又、ビーズの読み取り部分（レーザと読み取り用のフォトダイオード）はＣＤ（コンパクトディスク）やＤＶＤと同じ原理を利用し、中心から外周にむけて1次元的な移動と円盤型チップを支える中心軸の回転により、全面を読み取ることを可能にした。

即ち、第１に、本発明は、円盤型バイオチップの発明であり、円盤型バイオチップの表面に、サンプルビーズ注入口と、該注入口から円盤型チップの外周部方向に伸びるビーズ流路とを有する。ここで、サンプルビーズ注入口の直径、及びビーズ流路の幅としては、１〜１００μｍの範囲のものが、サンプル溶液とのハイブリダイゼーション反応等の測定には好適である。又、円盤型のバイオチップの材質としては、ビーズにレーザ光を照射し、蛍光発光を測定することから透明材料が好ましい。例えば、ポリスチレン、ポリプロピレン、ポリカーボネート、ガラス等が例示される。円盤型バイオチップの直径は特に制限されないが、取扱い性から１〜１００ｃｍ程度である。

第２に、本発明は上記円盤型バイオチップ中のビーズを読み取る装置の発明であり、上記円盤型バイオチップを搭載するステージと、該ステージを回転させる駆動部と、該円盤型バイオチップ中のビーズに対するレーザ照射部と、該ビーズからの発光を読み取るための読み取り部からなる。ここで、円盤型バイオチップ全体の読取りの効率化のためには、レーザ照射部及び読み取り部を移動可能とすることが好ましい。例えば、回転する円盤型バイオチップの外周部から中心部へ、又は逆に中心部から外周部へ直線移動させると、円盤型バイオチップのどの位置のビーズも測定できる。

第３に、本発明は上記円盤型バイオチップ中のビーズを読み取るシステムの発明であり、ステージに搭載された円盤型バイオチップの表面に、サンプルビーズ注入口と、該注入口から円盤型チップの外周部方向に伸びるビーズ流路とを有する円盤型バイオチップにビーズを注入し、配列させ、該円盤型チップを駆動部で回転させ、回転によって生じる遠心力で該ビーズを外周部方向に移動させ、該ビーズとサンプルビーズ注入口から注入したサンプル溶液を接触させて反応させ、該ビーズに対してレーザ照射し、該ビーズからの発光を読み取る。ここで、ビーズとしては、プラスチックビーズ、ガラスビーズ、及び磁気ビーズ等が好ましく例示される。又、ビーズ表面で起こす反応としては、ハイブリダイゼーション反応又は抗原−抗体反応が好ましく例示される。

本発明の円盤型バイオチップ、ビーズ読み取り装置により、狭い流路（キャピラリー）中を微小なビーズを順調に移動させ、所定の順序に配列させることができる。本発明の円盤型バイオチップ及びその読み取り装置は、コンパクトであり、市販のＣＤやＤＶＤといった装置で読み取りを行うことを可能とした。更に、パーソナルコンピューターを内臓することを可能にした。

以下、本発明を実施する場合の形態を、図面を参照して具体的に説明する。
図１は、本発明の円盤型バイオチップ及び読み取り装置の構成図である。直径１０ｃｍのプラスティック製の円盤状基板１に直径が１０μｍの流路（キャピラリー）２が掘ってある。該円盤状基板の上部に、同じく直径１０ｃｍのプラスティック製の円盤の中心に１ｃｍ程度の穴をあけたものを圧着して、円盤型バイオチップが構成されている。流路（キャピラリー）２の円盤の中心よりには、サンプル溶液を注入するためのサンプル注入口３が開けられている。サンプル注入口３を利用して，ビーズが順次流路（キャピラリー）２中に配列されていく。ビーズは回転する円盤型バイオチップ１の遠心力により、中心部から外周部へと移動していく。

図１では、流路（キャピラリー）２は直線状のものを４本配置したが、これに限定されない。例えば、らせん状に中心部から外周部に向かっても良く、その本数も読み取り装置の精度により、１本から数１０本まで可能である。

円盤型バイオチップ１を、モーター４で回転させる。配列され、フローするビーズは、ポイントセンサー部５で励起され、発光を計測される。半導体励起固体レーザ６で５３２ｎｍのレーザ光を発信させ、ダイクロイックミラー７でレーザ光の波長のみを流路（キャピラリー）２の所定の位置に存在するビーズに向けて反射させ、レンズ８でレーザ光を絞って、ビーズに照射し、ビーズ表面のＤＮＡや蛋白質に標識している蛍光物質を励起し、蛍光を発光させる。レンズ８で発光した蛍光を集光して平行光にし、ダイクロイックミラー７を通り抜け、６２５ｎｍを選択的に透過する光学干渉フィルター９で蛍光以外の光をカットし、レンズ１０で絞り込み、ホトマル１１へ光を入れて検出する。

なお、本発明において、化学発光でＤＮＡや蛋白質の標識を発光させたときは、レーザ６を切り、光学干渉フィルター９を発光波長を選択的に透過する光学干渉フィルターに変更し読み取れば、蛍光方式と同様に、円盤型バイオチップのビーズを読み取ることができる。

更に、ポイントセンサー部５を直線方向１２に移動させることにより、円盤型バイオチップの全体を効率的に読み取ることが可能である。

図２にサンプルの調製方法を説明する図を示す。
直径が７μｍ程度のポリスチレンビーズ２２にプローブＤＮＡ２１を共有結合する。そのＤＮＡと相補鎖のＦＩＴＣ２３で蛍光標識したサンプルＤＮＡ２４をハイブリダイゼーション溶液中でＤＮＡのハイブリダイゼーション反応を行なうと、ポリスチレンビーズ表面に蛍光色素（ＦＩＴＣ）が存在することになる。

実際のハイブリダイゼーションは図３に示すように、１ｍＬのエッペンドルフチューブ中で３０℃〜６０℃の最適温度で行なった。ビーズには図３に記載している３種類のＤＮＡプローブ（（ａ）．ＡＴＣＧＡＴＣＧ、（ｂ）．ＡＴＣＧＣＴＣＧ、（ｃ）．ＡＴＣＣＣＣＣＧ）をそれぞれ１００個づつポリスチレンのビーズに共有結合し、合計を３００個とした。３００個のビーズはハイブリダイゼーションバッファーとまぜ、そこに蛍光標識したサンプルＤＮＡを添加した。蛍光標識したサンプルＤＮＡの配列は図３に示しているＣＧＡＴＣＧＡＴである。このＤＮＡ配列は３種類のＤＮＡプローブを内（ａ）．ＡＴＣＧＡＴＣＧと完全相補鎖、（ｂ）．ＡＴＣＧＣＴＣＧと１塩基変異、（ｃ）．ＡＴＣＣＣＣＣＧとは３塩基変異となっている。

ハイブリダイゼーション反応を終えたポリスチレンビーズは遠心分離して上澄みをウォッシュバッファーで洗浄し、ポリスチレンビーズに未反応なサンプルＤＮＡを取り除いた後、図１の円盤型チップの中心にバッファーごとポリスチレンビーズを流し込む。

図４に本装置の読み取り機構を説明した図を示す。図１に示円盤型バイオチップに、直径７μｍのビーズを含んだサンプル溶液を注入し、円盤型バイオチップを固定している軸４１で回転運動をすると、サンプル溶液はほどなく流路に充填され、このときにサンプルに使用している溶媒よりも比重の重いビーズを使用した場合においては図５で示したように流路の内部にビーズ５１〜５４が規則正しく整列される。

その後、円盤型バイオチップにレーザ光４２を照射し、そのときに光が透過するか否かを検出する受光部分４３と、ビーズ上の蛍光物質によって発生する蛍光を読み取るための受光部分４４で測定した数値を読み取り、記憶する。今回の蛍光を測定するのはＦＩＴＣであることから、蛍光の受光部分には５００ｎｍのハイパスフィルター４５を設置している。

図６に受光部４３で読み取った結果を、図７に受光部４４で読み取った結果を示す。図６から、流路のどの部分にビーズが存在しているのかを測定し、その測定した結果を元に、ビーズの存在する部分の蛍光強度を図７から読み取ったのを元に算出した結果を図８に示す。図８より、左から２番目のビーズ５２は蛍光強度が非常に高く、３番目のビーズ５３は強度は低いが、蛍光が出ており、他のビーズ５１、５４は蛍光はでていないことがわかる。

このことから、蛍光強度が非常に高いビーズ５２には配列（ａ）．ＡＴＣＧＡＴＣＧのＤＮＡプローブが結合しており、強度が低いが蛍光のでているビーズ５３は（ｂ）．ＡＴＣＧＣＴＣＧのＤＮＡプローブが結合しており、蛍光の出ていないビーズ５１、５４には配列（ｃ）．ＡＴＣＣＣＣＣＧのＤＮＡプローブが結合していることが判明した。

円盤型バイオチップ及びその読み取り装置の全体構成図。ビーズによるハイブリダイゼーション反応を説明する模式図。具体的なハイブリダイゼーション反応を説明する模式図。円盤型バイオチップの読み取り方式を説明する模式図。円盤型バイオチップの溝を拡大した図。溝にたまったビーズの拡大図と読み取り装置で読み取った強度グラフの関係を説明する図。溝にたまったビーズの拡大図と読み取り装置で読み取った強度グラフの関係を説明する別の図。図６と図７の強度グラフから、各ビーズの反応量の換算を説明する図。

符号の説明

１：円盤状基板、２：流路（キャピラリー）、３：サンプル注入口、４：モーター、５：ポイントセンサー部、６：半導体励起固体レーザ（５３２ｎｍ）、７：ダイクロイックミラー、８：レンズ、９：光学干渉フィルター、１０：レンズ、１１：ホトマル、１２：ポイントセンサー部の移動方向（直線方向）。
２１：プローブＤＮＡ、２２：５μｍのポリスチレンビーズ、２３：蛍光色素（ＦＩＴＣ）、２４：サンプルＤＮＡ。
４１：軸、４２：レーザ（４８８ｎｍ単色光発振半導体レーザ）、４３：フォトダイオードアレイ、４４：ＰＭＴ、４５：フィルター（５００ｎｍハイパス）。
５１、５２、５３、５４：ビーズ。

Claims

円盤型チップの表面に、サンプルビーズ注入口と、該注入口から円盤型チップの外周部方向に伸びるビーズ流路とを有することを特徴とする円盤型バイオチップ。
前記サンプルビーズ注入口の直径、及びビーズ流路の幅が１〜１００μｍであることを特徴とする請求項１に記載の円盤型バイオチップ。
前記円盤型のチップの材質が、ポリスチレン、ポリプロピレン、ポリカーボネート、ガラスから選択される透明な材料からなることを特徴とする請求項１又は２に記載の円盤型バイオチップ。
請求項１乃至３のいずれかに記載の円盤型バイオチップを搭載するステージと、該ステージを回転させる駆動部と、該円盤型チップ中のビーズに対するレーザ照射部と、該ビーズからの発光を読み取るための読み取り部からなるビーズ読み取り装置。
前記レーザ照射部及び読み取り部を移動可能としたことを特徴とする請求項４に記載のビーズ読み取り装置。
ステージに搭載された円盤型バイオチップの表面に、サンプルビーズ注入口と、該注入口から円盤型チップの外周部方向に伸びるビーズ流路とを有する円盤型チップにビーズを注入し、配列させ、該円盤型チップを駆動部で回転させ、回転によって生じる遠心力で該ビーズを外周部方向に移動させ、該ビーズとサンプルビーズ注入口から注入したサンプル溶液を接触させて反応させ、該ビーズに対してレーザ照射し、該ビーズからの発光を読み取るビーズ発光読み取りシステム。
前記ビーズが、プラスチックビーズ、ガラスビーズ、及び磁気ビーズから選択されることを特徴とする請求項６に記載のビーズ発光読み取りシステム。
前記反応が、ハイブリダイゼーション反応又は抗原−抗体反応であることを特徴とする請求項６又は７に記載のビーズ発光読み取りシステム。