JP2005003451A - 蛍光検出基板、蛍光検出装置及び方法 - Google Patents
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Abstract
【課題】制御光の反射率を高める。
【解決手段】本発明のディスク状ＤＮＡチップは、ターゲットＤＮＡ及び蛍光標識剤が表面側から滴下可能とされ、プローブＤＮＡが固定可能とされ、プローブＤＮＡとターゲットＤＮＡとの相互反応の場となる複数のセル６が形成された表面層５と、表面層５の下層に形成された平板状の第１の光透過層４と、第１の光透過層４の下層に形成された平板状の第２の光透過層３とが積層されている。第２の光透過層３には、蛍光標識剤の蛍光の励起光及び当該励起光を所望の位置に照射するための制御光とが裏面側から照射される。第１の光透過層４は、プローブＤＮＡとターゲットＤＮＡとが相互反応した後にセル６に残存している溶液の屈折率及び第２の光透過層３の屈折率よりも、高い屈折率を有している。
【選択図】 図２
【解決手段】本発明のディスク状ＤＮＡチップは、ターゲットＤＮＡ及び蛍光標識剤が表面側から滴下可能とされ、プローブＤＮＡが固定可能とされ、プローブＤＮＡとターゲットＤＮＡとの相互反応の場となる複数のセル６が形成された表面層５と、表面層５の下層に形成された平板状の第１の光透過層４と、第１の光透過層４の下層に形成された平板状の第２の光透過層３とが積層されている。第２の光透過層３には、蛍光標識剤の蛍光の励起光及び当該励起光を所望の位置に照射するための制御光とが裏面側から照射される。第１の光透過層４は、プローブＤＮＡとターゲットＤＮＡとが相互反応した後にセル６に残存している溶液の屈折率及び第２の光透過層３の屈折率よりも、高い屈折率を有している。
【選択図】 図２
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、例えばＤＮＡチップ等のバイオインフォマティクス（生命情報科学）分野において特に有用な蛍光検出基板、蛍光検出装置及び方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
現在、マイクロアレイ技術によって所定のＤＮＡが微細配列された、いわゆるＤＮＡチップ又はＤＮＡマイクロアレイ（以下、ＤＮＡチップと総称する。）と呼ばれるバイオアッセイ用の集積基板が、遺伝子の突然変異、ＳＮＰｓ（一塩基多型）分析、遺伝子発現頻度解析等に利用されており、創薬、臨床診断、薬理ジェノミクス、法医学その他の分野において広範に活用され始めている。
【０００３】
このＤＮＡチップは、ガラス基板やシリコン基板上に多種多数のＤＮＡオリゴヌクレオチド鎖や、ｃＤＮＡ（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ ＤＮＡ）等が集積されていることから、ハイブリダイゼーション等の分子間相互反応の網羅的解析が可能となる点が特徴とされている。
【０００４】
ＤＮＡチップによる解析手法の一例を簡潔に説明すれば、ガラス基板やシリコン基板上に固相化（固定化）されたＤＮＡプローブに対して、細胞、組織等から抽出したｍＲＮＡ（ｍｅｓｓｅｎｇｅｒ ＲＮＡ）を逆転写ＰＣＲ（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｃｈａｉｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ）反応等によって蛍光プローブｄＮＴＰを組み込みながらＰＣＲ増幅し、上記基板上においてハイブリダイゼーションを行い、所定の検出器で蛍光測定を行うというものである。
【０００５】
ここで、被処理ターゲット物質数の増大並びに検出精度及び検出速度の向上を図るために、光ディスクの分野で培われた基板技術及びサーボ技術を、ＤＮＡチップ技術に応用することができる（特許文献１参照。）。具体的には、プローブＤＮＡが固相化された複数の微小セルが表面に形成されたディスク基板をＤＮＡチップ技術に適用することができる。
【０００６】
このようなディスク基板を用いてＤＮＡ解析を行う場合には、当該ディスク基板を回転させながら、蛍光標識したターゲットＤＮＡが含有した溶液を微小セル上に滴下し、プローブＤＮＡとターゲットＤＮＡとを相互反応（ハイブリダイゼーション）させる。続いて、相互反応に寄与しなかったターゲットＤＮＡをディスク基板上から洗浄する。続いて、ディスク基板を回転させながら励起光を微小セルに照射し、励起光の照射により蛍光標識から発生する蛍光を光検出器で検出し、その蛍光の発光位置からターゲットＤＮＡと結合したプローブＤＮＡを特定する。
【０００７】
このようなディスク基板状のＤＮＡチップを用いたＤＮＡ解析では、ディスク基板を回転させながら相互反応を行わせることができるとともに、ディスク基板を高速回転させて蛍光検出を行うことができるので、解析装置を簡易化することができるとともに、検出速度の向上を図ることができる。
【０００８】
なお、ディスク基板を回転させながら蛍光の発光位置を特定するには、ディスク基板を回転させながら所望の１つの微小セルにのみに励起光を照射し、その照射位置が認識できる制御機能が必要となる。
【０００９】
このような制御を行うには、いわゆる光ディスクドライブと同様に、対物レンズを用いた光学系を用いてフォーカスサーボ制御及び位置決めサーボ制御等を適用すればよい。
【００１０】
ただし、ＤＮＡ解析装置では、励起光が蛍光標識剤に吸収されてしまうため励起光の反射光は非常に微小となってしまう。そのため、ＤＮＡ解析装置では、フォーカスサーボ制御や位置決めサーボ制御を行うために、励起光の波長とは異なる波長の制御光を対物レンズを介してディスク基板に照射し、その反射光に基づきサーボ制御のためのエラー信号を生成する必要がある。
【００１１】
【特許文献１】
特開２００１−２３８６７４号公報
【００１２】
【発明が解決しようとする課題】
ところで、ディスク基板状のＤＮＡチップを取り扱う解析装置では、ターゲットＤＮＡを含有した溶液をディスク基板に滴下する滴下機構と、蛍光を検出するための光学系とを同一装置内に設ければ、装置の取り扱いが非常に便利になる。滴下機構と光学系とを同一の装置に配置するには、滴下機構をディスク基板の上方側に設け、光学系をディスク基板の下方側に設けるのが、スペースを有効利用する上で好適である。
【００１３】
ここで、一つの解析装置内に、滴下機構と光学系とを設けた場合のサーボ用のレーザ光の照射経路を図７に示す。
【００１４】
図７に示すように、ディスク基板１０２の上方に設けられた滴下機構１０１からターゲットＤＮＡを含有した溶液を滴下する場合、当該ディスク基板１０２の上面１０２ａ側にプローブＤＮＡが固相化された微小セル１０３が形成される。
【００１５】
それに対して、サーボ用の制御光Ｖはディスク基板１０２の下面１０２ｂ側から入射されるが、サーボ制御のためのエラー信号を正確に生成するためには、微小セル１０３の近傍のディスク基板の上部境界層１０２ｃからの反射光を検出するのが望ましい。
【００１６】
しかしながら、サーボ用の制御光Ｖをディスク基板１０２の下面１０２ｂ側から入射した場合、その制御光Ｖを一端ディスク基板１０２を通過させなければならないので、ディスク基板１の上部境界層１０２ｃからは、高い反射率を得ることができない。
【００１７】
例えば、ハイブリダイゼーション等で用いられた溶液が微小セルに残存したとし、ディスク基板の材質が石英ガラスであるとすると、上部境界層１０２ｃの反射率は、約２．５％となり非常に低い。高い反射率が得られないと、サーボ制御のためのエラー信号として充分なＳ／Ｎ比を得ることができない。
【００１８】
また、ディスク基板の上部境界層１０２ｃでは、制御光Ｖの波長の反射率を高くすることが望ましいが、励起光及び蛍光の波長は反対に透過率が高い方が望ましい。
【００１９】
そこで、本発明では、励起光及び蛍光とは異なる波長の装置制御用の制御光の反射率を高めた蛍光検出基板、蛍光検出装置及び方法を提供することを目的とする。
【００２０】
例えば、本発明により、滴下機構を基板の上方側に設け、蛍光検出のための光学系を基板の下方側に設けた解析装置に適用可能なバイオアッセイ基板であって、励起光及び蛍光とは異なる波長の装置制御用の制御光の反射率を高めたバイオアッセイ基板を提供する。
【００２１】
【課題を解決するための手段】
本発明に係る蛍光検出基板は、測定溶液の蛍光検出を行なう蛍光検出基板であって、上記測定溶液の蛍光検出を行なうための検出領域を有する表面層と、上記表面層へ積層された第１の光透過層と、上記第１の光透過層へ積層された第２の光透過層とを備え、第２の光透過層には、上記蛍光検出を行なうための励起光及び当該励起光を所望の位置に照射するための制御光とが照射され、上記第１の光透過層は、上記測定溶液の屈折率及び上記第２の光透過層の屈折率よりも、高い屈折率を有している。
【００２２】
本発明に係る蛍光検出装置は、測定溶液の蛍光検出を行なうための検出領域を有する表面層と、上記表面層へ積層された第１の光透過層と、上記第１の光透過層へ積層された第２の光透過層とを備え、第２の光透過層に上記蛍光検出を行なうための励起光及び当該励起光を所望の位置に照射するための制御光とが照射され、上記第１の光透過層が上記測定溶液の屈折率及び上記第２の光透過層の屈折率よりも高い屈折率を有する蛍光検出基板に対して、上記励起光及び制御光を照射する照射手段と、上記蛍光を検出する蛍光検出手段とを備える。
【００２３】
本発明に係る蛍光検出方法は、測定溶液の蛍光検出を行なうための検出領域を有する表面層と、上記表面層へ積層された第１の光透過層と、上記第１の光透過層へ積層された第２の光透過層とを備え、第２の光透過層に上記蛍光検出を行なうための励起光及び当該励起光を所望の位置に照射するための制御光とが照射され、上記第１の光透過層が上記測定溶液の屈折率及び上記第２の光透過層の屈折率よりも高い屈折率を有する蛍光検出基板に対して、上記励起光及び制御光を照射するとともに、上記蛍光を検出する。
【００２４】
具体的に、本発明が適用されたバイオアッセイ基板は、ターゲット物質及び蛍光標識剤が表面側から滴下可能とされ、上記プローブ物質が固定可能とされ、プローブ物質とターゲット物質との相互反応の場となる複数の反応領域が形成された表面層と、上記表面層の反応領域の下層に形成された平板状の第１の光透過層と、上記第１の光透過層の下層に形成された平板状の第２の光透過層とが積層されている。
【００２５】
上記バイオアッセイ基板は、解析装置に装填され、装填された状態でプローブ物質とターゲット物質との相互反応に基づく生化学分析が行われる。
【００２６】
上記解析装置には、バイオアッセイ基板に対して溶液を滴下する滴下機構と、バイオアッセイ基板上に存在する蛍光標識剤の蛍光を検出のための光学系とが設けられている。上記バイオアッセイ基板は、溶液が表面に滴下されるように水平に解析装置に対して装填される。滴下装置は、装填されたバイオアッセイ基板の上方に配置され、光学系は、装填されたバイオアッセイ基板の下方に配置される。
【００２７】
上記解析装置は、蛍光標識剤が結合されたターゲット物質、又は、蛍光標識剤及びターゲット物質を、上記反応領域に滴下される。ターゲット物質に対応したプローブ物質が固定された反応領域では、滴下されたターゲット物質とプローブ物質とが相互反応する。さらに、相互反応した後のプローブ物質及びターゲット物質には、蛍光標識剤も結合する。
【００２８】
相互反応が終了すると、続いて、上記解析装置は、上記バイオアッセイ基板に裏面側から励起光及び制御光を照射する。励起光は、上記蛍光標識剤を発光させるための励起波長のレーザ光である。また、制御光は、上記励起光を任意の反応領域に照射するためのフォーカスサーボ及び位置決めサーボ用の制御光である。バイオアッセイ基板に入射された制御光は、当該バイオアッセイ基板により反射され、再度光学系に入射する。光学系は、その反射光に基づき、フォーカスサーボ及び位置決めサーボ制御のエラー信号を生成する。
【００２９】
そして、以上のような本発明が適用されたバイオアッセイ基板では、上記第１の光透過層の屈折率が、上記プローブ物質と上記ターゲット物質とが相互反応した後に上記反応領域に残存している溶液の屈折率及び上記第２の光透過層の屈折率よりも、高くされている。
【００３０】
このため、上記バイオアッセイ基板では、裏面側から入射されたフォーカスサーボ及び位置決めサーボ用の制御光の、上記第２の光透過層と上記溶液との間の境界部分での反射量が、大きくなる。
【００３１】
【発明の実施の形態】
以下、本発明の実施の形態として、本発明を適用したＤＮＡチップ（以下、ディスク基板と呼ぶ。）、並びに、このディスク基板を用いてＤＮＡ解析を行うＤＮＡ解析装置について説明をする。
【００３２】
（ディスク基板）
図１に本発明の実施の形態のディスク基板１の模式的な平面図を示し、図２に当該ディスク基板１の部分断面図を示す。
【００３３】
ディスク基板１は、例えば、ＣＤ（Ｃｏｍｐａｃｔ Ｄｉｓｋ）、ＤＶＤ（Ｄｉｇｉｔａｌ Ｖｅｒｓａｔｉｌｅ Ｄｉｓｋ）、ＭＤ（Ｍｉｎｉ Ｄｉｓｋ）等の光ディスクと同様の円形の平板状の形状を呈している。また、ディスク基板１の中心には、中心孔２が形成されている。中心孔２には、当該ディスク基板１がＤＮＡ解析装置に装填されたときに、当該ディスク基板１を保持及び回転させるためのチャッキング機構が挿入される。
【００３４】
ディスク基板１は、図２に示すように、基板層３と中間層４とＤＮＡ層５とを有している。基板層３は最下層に形成されており、中間層４は基板層３の上層に形成されており、ＤＮＡ層５は中間層４の上層であり最上層に形成されている。なお、以下、ディスク基板１のＤＮＡ層５側の表面を上面１ａ、基板層３側の表面を下面１ｂというものとする。
【００３５】
基板層３は、石英ガラス、シリコン、ポリカーボネート、ポリスチレン、その他の円板状に成型可能な合成樹脂等の材料で形成されている。また、基板層３の材料は、詳細を後述する励起光及び制御光並びに蛍光の波長の光を透過する材料である。
【００３６】
中間層４は、基板層３の屈折率よりも高い屈折率を有しており、且つ、ハイブリダイゼーションを行った後にディスク基板上に残存している溶液の屈折率よりも高い屈折率を有している。また、中間層４の材料は、詳細を後述する励起光及び制御光並びに蛍光の波長の光を透過する材料である。なお、この中間層４の屈折率及び膜厚等の設定については、詳細を後述する。
【００３７】
ＤＮＡ層５には、上面１ａ側に、プローブＤＮＡとターゲットＤＮＡとの相互反応の場となる複数のセル６が形成されている。各セル６は、ディスク基板１の中心から円周方向に放射状に向かう複数の列上に、等間隔に並んで配置されている。また、ＤＮＡ層５には、アドレスピット７が形成されている。アドレスピット７は、各セル６のディスク基板１上の配置を特定するための情報である。アドレスピット７は、光学ヘッドによりレーザ光を照射してその反射光を検出することにより、情報内容を読み取ることができる光学的な情報ピットである。このアドレスピット７から情報を光学的に読み取ることによって、対応する位置に配置されているセル６を特定することが可能となる。
【００３８】
図３に、１つのセル６の模式図を示す。
【００３９】
セル６は、図３に示すように、開口部が略矩形状とされた穴状の小室である反応領域８を有している。セル６は、プローブＤＮＡ（検出用ヌクレオチド鎖Ｄ）とターゲットＤＮＡ（標的ヌクレオチド鎖Ｔ）との間のハイブリダイゼーション反応の場となる。この反応領域８は、サンプルＤＮＡが含まれた溶液等が滴下されたときにその溶液を保留することができる程度の深さ及び大きさとなっており、この結果ハイブリダイゼーションが可能となっている。 また、セル６には、反応領域８に電場を形成するために、反応領域８の両端側に正電極９ａと負電極９ｂとが形成されている。正電極９ａ及び負電極９ｂに対しては、例えばディスク基板１の中心孔２を介して外部から与えられる電圧が印加される。さらに、セル６内の負電極９ｂ側の端面１０には、プローブＤＮＡが固相化できるように表面処理が施されている。
【００４０】
以上のようなディスク基板１では、円板状に形成されているため、光ディスクシステムと同様の再生システムを利用することにより、フォーカシングサーボ、半径方向に対する位置決めサーボ制御、アドレスピット７の情報を検出することができる。そのため、アドレスピット７の情報を１つ１つのセル６に対応させて形成しておくことにより、アドレスピット７の情報を読み出すことで特定の１つのセル６（或いは、グルーピングされた複数のセル）に対してのみレーザ光を照射することができる。
【００４１】
従って、例えば、特定の１つのセル６（又はグルーピングされた複数のセル６）に特定のプローブＤＮＡ（検出用ヌクレオチド鎖Ｄ）を固定化することができ、また、蛍光が発生しているセル６の位置を特定することもでき、このことから、さらに、ハイブリダイゼーションにより相互反応が生じたＤＮＡの解析することができる。
【００４２】
また、プローブＤＮＡ（検出用ヌクレオチド鎖Ｄ）毎に別個独立の条件を設定して、ハイブリダイゼーション反応を進行させることもできる。例えば、疾病発症のマーカー遺伝子をディスク基板１上にグルーピングして固定化して、１つのディスク基板１を用いて同時に複数の疾病の発現状況を確認することができる。
【００４３】
また、Ｔｍ（Ｍｅｌｔｉｎｇ Ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ）又はＧＣ含有率の違いに基づいて、固定化する検出用ヌクレオチド鎖をグルーピングしておくことも可能である。これにより、アクティブなハイブリダイゼーション反応が得られるバッファ組成、濃度等の反応条件、洗浄条件、滴下するサンプル溶液濃度等を、検出用ヌクレオチド鎖の性質に応じてきめ細かく選択することが可能となり、解析作業において疑陽性又は疑陰性が示される危険性を減少させることができる。
【００４４】
（ＤＮＡ解析装置）
つぎに、以上のようなディスク基板１を用いるＤＮＡ解析装置１１について、図４を参照して説明をする。
【００４５】
ＤＮＡ解析装置１１は、図４に示すように、ディスク基板１を保持して回転をさせるディスク装填部１２と、ハイブリダイゼーションのための各種溶液を貯留するとともにディスク基板１のセル６にその溶液を滴下する滴下部１３と、ディスク基板１から励起光を検出するための励起光検出部１４と、上記の各部の管理及び制御を行う制御／サーボ部１５とを備えている。
【００４６】
ディスク装填部１２は、ディスク基板１の中心孔２内に挿入して当該ディスク基板１を保持するチャッキング機構２１と、チャッキング機構２１を駆動することによりディスク基板１を回転させるスピンドルモータ２２と有している。ディスク装填部１２は、上面１ａ側が上方向となるようにディスク基板１を水平に保持した状態で、当該ディスク基板１を回転駆動する。ディスク装填部１２では、ディスク基板１を水平に保持することによって、セル６に滴下された溶液が垂れてしまうといった問題を回避することができる。
【００４７】
滴下部１３は、試料溶液Ｓを貯留する貯留部２３と、貯留部２３内の試料溶液Ｓをディスク基板１に滴下する滴下ヘッド２４とを有している。滴下ヘッド２４は、水平に装填されたディスク基板１の上面１ａの上方に配置されている。さらに、滴下ヘッド２４は、ディスク基板１のアドレスピット７から読み出される位置情報及び回転同期情報に基づいてディスク基板１との相対位置を半径方向に制御し、ターゲットＤＮＡ（標的ヌクレオチド鎖Ｔ）を含有する試料溶液Ｓを所定のセル６の反応領域８に正確に追従して滴下する構成とされている。また、貯留部２３と滴下ヘッド２４との組み合わせは、ハイブリダイゼーションのために使用する試料溶液の数だけある。
【００４８】
また、滴下部１３では、ディスク基板１上の所定の位置に正確に試料溶液Ｓを滴下するために、例えば、いわゆる「インクジェットプリンティング法」に基づく滴下方法が採用されている。「インクジェットプリンティング法」は、滴下ヘッド２４にいわゆるインクジェットプリンタで用いられるインク噴出機構を適用する方法であり、インクジェットプリンタのようなノズルヘッドからディスク基板１に試料溶液Ｓを噴射するものである。
【００４９】
励起光検出部１４は、光学ヘッド３０を有している。光学ヘッド３０は、水平に装填されたディスク基板１の下方側、すなわち、下面１ｂ側に配置されている。光学ヘッド３０は、例えば、図示していないスレッド機構等により、ディスク基板１の半径方向に移動自在とされている。
【００５０】
光学ヘッド３０は、対物レンズ３１と、対物レンズ３１を移動可能に支持する２軸アクチュエータ３２と、導光ミラー３３とを有している。対物レンズ３１は、その中心軸がディスク基板１の表面に対して略垂直となるように２軸アクチュエータ３２に支持されている。従って、対物レンズ３１は、ディスク基板１の下方側から入射された光束を当該ディスク基板１に対して集光することができる。２軸アクチュエータ３２は、ディスク基板１の表面に対して垂直な方向、及び、ディスク基板１の半径方向の２方向に対物レンズ３１を移動可能に支持している。２軸アクチュエータ３２を駆動することにより、対物レンズ３１により集光された光の焦点を、ディスク基板１の表面に対して垂直な方向及び半径方向に移動させることができる。従って、この光学ヘッド３０では、光ディスクシステムにおけるジャストフォーカス制御並びに位置決め制御と同様の制御を行うことができる。
【００５１】
導光ミラー３３は、光路Ｘ上に対して４５°の角度で配置されている。光路Ｘは、励起光Ｐ、蛍光Ｆ、サーボ光Ｖ及び反射光Ｒが、光学ヘッド３０に対して入射及び出射する光路である。導光ミラー３３には、励起光Ｐ及びサーボ光Ｖが光路Ｘ上から入射される。導光ミラー３３は、励起光Ｐ及びサーボ光Ｖを反射して９０°屈折させて、対物レンズ３１に入射する。対物レンズ３１に入射された励起光Ｐ及びサーボ光Ｖは、当該対物レンズ３１により集光されてディスク基板１に照射される。また、導光ミラー３３には、蛍光Ｆ及びサーボ光Ｖの反射光Ｒが、ディスク基板１から対物レンズ３１を介して入射される。導光ミラー３３は、蛍光Ｆ及び反射光Ｒを反射して９０°屈折させて、光路Ｘ上に出射する。
【００５２】
なお、光学ヘッド３０をスレッド移動させる駆動信号及び２軸アクチュエータ３２を駆動する駆動信号は、制御／サーボ部１５から与えられる。
【００５３】
また、励起光検出部１４は、励起光Ｐを出射する励起光源３４と、励起光源３４から出射された励起光Ｐを平行光束とするコリメータレンズ３５と、コリメータレンズ３５により平行光束とされた励起光Ｐを光路Ｘ上で屈折させて導光ミラー３３に照射する第１のダイクロックミラー３６とを有している。
【００５４】
励起光源３４は、蛍光標識剤を励起可能な波長のレーザ光源を有する発光手段である。励起光源３４から出射される励起光Ｐは、ここでは波長が４０５ｎｍのレーザ光である。なお、励起光Ｐの波長は、蛍光標識剤を励起できる波長であればどのような波長であってもよい。コリメータレンズ３５は、励起光源３４から出射された励起光Ｐを平行光束にする。第１のダイクロックミラー３６は、波長選択性を有する反射鏡であり、励起光Ｐの波長の光のみを反射して、蛍光Ｆ及びサーボ光Ｖ（その反射光Ｒ）の波長の光を透過する。第１のダイクロックミラー３６は、光路Ｘ上に４５°の角度を持って挿入されており、コリメータレンズ３５から出射された励起光Ｐを反射して９０°屈折させ、導光ミラー３３に励起光Ｐを照射している。
【００５５】
また、励起光検出部１４は、蛍光Ｆを検出するアバランジェフォトダイオード３７と、蛍光Ｆを集光する集光レンズ３８と、光学ヘッド３０から光路Ｘ上に出射された蛍光Ｆを屈折させてアバランジェフォトダイオード３７に照射する第２のダイクロックミラー３９とを有している。
【００５６】
アバランジェフォトダイオード３７は、非常に感度の高い光検出器であり、微弱な光量の蛍光Ｆを検出することが可能である。なお、アバランジェフォトダイオード３７により検出する蛍光Ｆの波長は、ここでは４７０ｎｍ程度である。また、この蛍光Ｆの波長は、蛍光標識剤の種類により異なるものである。集光レンズ３８は、アバランジェフォトダイオード３７上に蛍光Ｆを集光するためのレンズである。第２のダイクロックミラー３９は、光路Ｘ上に４５°の角度を挿入されているとともに、導光ミラー３３側から見て第１のダイクロックミラー３６の後段に配置されている。従って、第２のダイクロックミラー３９には、蛍光Ｆ、サーボ光Ｖ及び反射光Ｒが入射し、励起光Ｐは入射しない。第２のダイクロックミラー３９は、波長選択性を有する反射鏡であり、蛍光Ｆの波長の光のみを反射して、サーボ光（反射光Ｒ）の波長の光を透過する。第２のダイクロックミラー３９は、光学ヘッド３０の導光ミラー３３から出射された蛍光Ｆを反射して９０°屈折させ、集光レンズ３８を介してアバランジェフォトダイオード３７に蛍光Ｆを照射する。
【００５７】
アバランジェフォトダイオード３７では、このように検出した蛍光Ｆの光量に応じた電気信号を発生し、その電気信号を制御／サーボ部１５に供給する。
【００５８】
また、励起光検出部１４は、サーボ光Ｖを出射するサーボ光源４０と、サーボ光源４０から出射されたサーボ光Ｖを平行光束とするコリメータレンズ４１と、サーボ光Ｖの反射光Ｒを検出するフォトディテクト回路４２と、非点収差を生じさせてフォトディテクト回路４２に対して反射光Ｒを集光するシリンドリカルレンズ４３と、サーボ光Ｖと反射光Ｒとを分離する光セパレータ４４とを有している。
【００５９】
サーボ光源４０は、例えば７８０ｎｍの波長のレーザ光を出射するレーザ光源を有する発光手段である。なお、サーボ光Ｖの波長は、アドレスピット７が検出できる程度の波長であり、励起光Ｐ及び蛍光Ｆの波長と異なっていれば７８０ｎｍに限らずどのような波長であってもよい。コリメータレンズ４１は、サーボ光源４０から出射されたサーボ光Ｖを平行光束にする。平行光束とされたサーボ光Ｖは光セパレータ４４に入射される。
【００６０】
フォトディテクト回路４２は、反射光Ｒを検出するディテクタと、検出した反射光Ｒからフォーカスエラー信号、位置決めエラー信号、及びアドレスピット７の再生信号を生成する信号生成回路とを有している。反射光Ｒは、サーボ光Ｖがディスク基板１で反射して生成された光であるので、その波長は、サーボ光と同一の７８０ｎｍである。
【００６１】
なお、フォーカスエラー信号は、対物レンズ３２により集光された光の合焦位置と、ディスク基板１のＤＮＡ層５との位置ずれ量を示すエラー信号である。フォーカスエラー信号が０となったときに、対物レンズ３２とディスク基板１との間の距離が最適になる。位置決めエラー信号は、所定のセル６の位置と、焦点位置とのディスク半径方向に対する位置ずれ量を示す信号である。位置決めエラー信号が０となったときに、サーボ光Ｖのディスク半径方向に対する照射位置が任意のセル６に一致したこととなる。アドレスピット７の再生信号は、ディスク基板７に記録されているアドレスピット７に記述されている情報内容を示す信号である。この情報内容を読み出すことにより、現在サーボ光Ｖを照射しているセル７を特定することができる。
【００６２】
フォトディテクト回路４２は、反射光Ｒに基づき生成されたフォーカスエラー信号、位置決めエラー信号及びアドレスピット７の再生信号を制御／サーボ部１５に供給する。
【００６３】
シリンドリカルレンズ４３は、フォトディテクト回路４２上に反射光Ｒを集光するとともに非点収差を生じさせるためのレンズである。このように非点収差を生じさせることによりフォトディテクト回路４２によりフォーカスエラー信号を生成させることができる。
【００６４】
光セパレータ４４は、偏向ビームスプリッタからなる光分離面４４ａと１／４波長板４４ｂにより構成されている。光セパレータ４４では、１／４波長板４４ｂの逆側から入射された光を光分離面４４ａが透過し、その透過光の反射光が１／４波長板４４側から入射された場合には光分離面４４ａが反射する機能を有している。光セパレータ４４は、光分離面４４ａが光路Ｘ上に４５°の角度を挿入されているとともに、導光ミラー３３側から見て第２のダイクロックミラー３９の後段に配置されている。従って、光セパレータ４４では、コリメータレンズ４１から出射されたサーボ光Ｖを透過して光学ヘッド３０内の導光ミラー３３に対してそのサーボ光Ｖを入射させているとともに、光学ヘッド３０の導光ミラー３３から出射された反射光Ｒを反射することにより９０°屈折され、シリンドリカルレンズ４３を介してフォトディテクト回路４２に反射光Ｒを照射する。
【００６５】
制御／サーボ部１５は、励起光検出部１４により検出されたフォーカスエラー信号、位置決めエラー信号及びアドレスピット７の再生信号に基づき、各種のサーボ制御を行う。
【００６６】
すなわち、制御／サーボ部１５は、フォーカスエラー信号に基づき光学ヘッド３０内の２軸アクチュエータ３２を駆動して対物レンズ３１とディスク基板１との間の間隔を制御し、フォーカスエラー信号が０となるようにサーボ制御を行う。また、制御／サーボ部１５は、位置決めエラー信号に基づき光学ヘッド３０内の２軸アクチュエータ３２を駆動して対物レンズ３１をディスク基板１の半径方向に移動制御し、フォーカスエラー信号が０となるようにサーボ制御を行う。また、制御／サーボ部１５は、アドレスピット７の再生信号に基づき光学ヘッド３０のスレッド移動制御を行って光学ヘッド３０を所定の半径位置に移動し、目的のセル位置に対物レンズ３１を移動させる。
【００６７】
以上のような構成のＤＮＡ解析装置１１では、次のような処理を行う。すなわち、ディスク基板１を回転させながら、セル６上に蛍光標識したターゲットＤＮＡが含有した溶液を滴下し、プローブＤＮＡとターゲットＤＮＡとを相互反応（ハイブリダイゼーション）させる。
【００６８】
励起光検出部１４には、水平に装填されたディスク基板１を回転させ、励起光Ｐを当該ディスク基板１の下面１ｂ側から入射させてセル６内の蛍光標識剤に照射し、その励起光Ｐに応じてその蛍光標識剤から発生した蛍光Ｆをディスク基板１の下方から検出する。
【００６９】
ここで、ＤＮＡ解析装置１１では、励起光Ｐとサーボ光Ｖとを同一の対物レンズ３１を介してディスク基板１に照射している。そのため、ＤＮＡ解析装置１１では、サーボ光Ｖを用いたフォーカス制御、位置決め制御並びにアドレス制御を行うことによって、励起光Ｐの照射位置、すなわち、蛍光Ｆの発光位置を特定することが可能となり、その蛍光の発光位置からターゲットＤＮＡと結合したプローブＤＮＡを特定することができる。
【００７０】
（ＤＮＡ解析手順）
つぎに、以上のようなＤＮＡ解析装置１１を用いたＤＮＡ解析手順について説明をする。
【００７１】
まず、ＤＮＡ解析装置１１のディスク装填部１２にディスク基板１を水平に装填する。
【００７２】
続いて、ＤＮＡ解析装置１１により、フォーカスサーボ制御及び位置決めサーボ制御並びにアドレス制御を行いながらディスク基板１を回転させ、滴下ヘッド２４からプローブＤＮＡが含有した溶液を所定のセル６に対して滴下する。
【００７３】
続いて、ＤＮＡ解析装置１１により、フォーカスサーボ制御及び位置決めサーボ制御並びにアドレス制御を行いながらディスク基板１を回転させ、滴下ヘッド２４から蛍光標識されたターゲットＤＮＡが含有した溶液Ｓ、又は、ターゲットＤＮＡが含有した溶液及び蛍光標識剤が含有した溶液を、所定のセル６に対して滴下する。
【００７４】
続いて、プローブＤＮＡとターゲットＤＮＡとのハイブリダイゼーションを促進するために、例えば、ディスク基板１を恒温槽に移し、数時間加温する。
【００７５】
続いて、ディスク基板１を、例えば界面活性剤ＳＤＳを含むＳＳＣ（Ｓａｌｉｎｅ−Ｓｏｄｉｕｍ Ｃｉｔｒａｔｅ）バッファ溶液を用いて洗浄し、プローブＤＮＡと相互反応をしなかったターゲットＤＮＡをディスク基板１から除去する。
【００７６】
続いて、ＤＮＡ解析装置１１のディスク装填部１２に、ターゲットＤＮＡが固相化されたディスク基板１を水平に装填する。
【００７７】
続いて、ＤＮＡ解析装置１１により、フォーカスサーボ制御及び位置決めサーボ制御並びにアドレス制御を行いながらディスク基板１を回転させ、励起光Ｐを所定のセル６に照射する。この励起光Ｐの照射とともに、アドレス情報を検出しながら蛍光Ｆが発生しているか否かを検出する。
【００７８】
そして、ＤＮＡ解析装置１１は、ディスク基板１上の各セル６の位置と蛍光Ｆの発光の有無を示すマップ作成し、その作成したマップに基づきターゲットＤＮＡの解析を行う。
【００７９】
（中間層４の設定条件）
つぎに、ディスク基板１の下方から入射されたサーボ光Ｖが、中間層４で反射されるための条件について説明をする。
【００８０】
図５に示すように、ディスク基板１の下方（下面１ｂ）側から入射されたサーボ光Ｖは、中間層４内で多重反射される。
【００８１】
ここで、各定数を次のように定義する。
・雰囲気の屈折率＝１
・基板層３の屈折率＝ｎ０
・中間層４の屈折率＝ｎ１
・中間層４の膜厚＝ｄ
・セル６上に残存している検体（ターゲット物質）を含む溶液５０の屈折率＝ｎ２
・サーボ光Ｖの波長＝λ
・基板層３と中間層４の界面による振幅反射率＝ｒ０
・基板層３と中間層４の界面による振幅透過率＝ｔ０
・中間層４とセル６上に残存している検体（ターゲット物質）を含む溶液５０との界面による振幅屈折率＝ｒ１
・中間層４とセル６上に残存している検体（ターゲット物質）を含む溶液５０との界面による振幅透過率＝ｔ１
また、ｎ１＞ｎ０，ｎ１＞ｎ２である。さらに、基板層３及びセル６上に残存している検体（ターゲット物質）を含む溶液５０の膜圧は、サーボ光Ｖのコヒーレント長よりも十分大きいとする。
【００８２】
このとき、ストークスの定理からｒ０＝−ｒ０´、ｔ１ｔ１´＝１−ｒ１ ２（ただし、´は逆側の入射の場合の振幅反射率及び透過率を表す。）の関係を用いて、基板層４側から垂直にサーボ光Ｖが入射した場合の、検体（ターゲット物質）を含む溶液５０と中間層４との間の多重干渉による反射の振幅（ｒｍｕｌｔｉ）と透過の振幅（ｔｍｕｌｔｉ）を求めると、以下の式１及び式２に示すようになる。
【００８３】
【数１】
【００８４】
上式から中間層４による強度反射率（Ｒｍｕｌｔｉ）及び強度透過率（Ｔｍｕｌｔｉ）を算出すると、以下の式３及び式４に示すようになる。
【００８５】
【数２】
【００８６】
ここで、本実施の形態のディスク基板１のような３層構造の場合、光学的な反射面は、基板層３の表面（下面１ｂ）及び中間層４の２つが考えられるが、フォーカスサーボを考慮した場合には、ＤＮＡ層５により近い中間層４からの反射がより大きいことが望ましい。基板層３の表面（下面１ｂ）の強度反射率をＲ２として、以上の条件を数式で表すと、下記式５に示すようになる。
【００８７】
【数３】
【００８８】
さらに、基板層３の表面（下面１ｂ）の振幅反射率をｒ２とすれば、以下の式６に示すようになる。
【００８９】
【数４】
【００９０】
従って、式１〜式４を、上記式６に代入すると、下記式７が導かれる。
【００９１】
【数５】
【００９２】
すなわち、以上の式７の条件に従い、サーボ光波長λ、中間層４の屈折率（すなわち材料）及び中間層４の膜圧ｄを設定すれば、安定したフォーカスサーボをかけることができる。
【００９３】
例えば、基板層３の材質を石英、中間層４の材質をＲｕｔｌｉｅ型２酸化チタン、中間層４の膜圧を９２ｎｍ、検体（ターゲット物質）を含む溶液５０を純粋としたとき、上記式３、式４から強度反射率（Ｒｍｕｌｔｉ）及び強度透過率（Ｔｍｕｌｔｉ）を求めると、図６に示すようなスペクトルが得られる。この図６によれば、発振波長７８０ｎｍのレーザ光をサーボ光として用いれば、中間層４から約１９％の強度反射率が得られることがわかる。
【００９４】
例えば、中間層４が存在しない場合における基板層３と溶液５０との間の境界からの強度反射率Ｒ１２を算出すると、波長７８０ｎｍであれば、下式に示すように、０．２５％であるので、基板層３を設けたほうが大幅に反射率が高くなっていることがわかる。
【００９５】
【数６】
【００９６】
また、波長７８０ｎｍでの基板層３の表面（下面１ｂ）の強度反射率をＲ２は、波長７８０ｎｍであれば、下式に示すように、３．６％であるので、基板層３からの反射率の方が大きく、安定したフォーカスサーボがかけられることがわかる。
【００９７】
【数７】
【００９８】
さらに、中間層４では、サーボ光Ｖの反射率をより高くすることが望ましいが、励起光Ｐ及び蛍光Ｆに対しては反対に、より透過率が高い方が望ましい。すなわち、サーボ光Ｖの波長での反射率を大きく、励起光Ｐ及び蛍光Ｆの波長で小さくなるように、サーボ光波長λ、中間層４の屈折率（すなわち材料）及び中間層４の膜圧ｄを設定すればよい。
【００９９】
励起光Ｐの波長を４３０ｎｍ、蛍光Ｆの波長を４７０ｎｍ、サーボ光の波長を７８０ｎｍであるとする。このとき、励起光Ｐ及び蛍光Ｆの透過率は、図６に示すように、９５％、９８％と非常に高くなる。これに対して、サーボ光Ｖの透過率は８１％であり、サーボ光Ｖの透過率よりも、励起光Ｐ及び蛍光Ｆの透過率の方が非常に大きくなる。
【０１００】
つまり、励起光Ｐ及び蛍光Ｆの波長を、式４に示す条件において透過率がピーク値に近い波長に設定し、サーボ光Ｖの波長を式３に示す条件において反射率がピーク値に近い波長に設定すれば、大きな強度の蛍光Ｆを得ることができるとともに、安定したサーボをかけることができる。
【０１０１】
【発明の効果】
本発明に係る蛍光検出基板では、上記測定溶液の蛍光検出を行なうための検出領域を有する表面層と、上記表面層へ積層された第１の光透過層と、上記第１の光透過層へ積層された第２の光透過層とを備え、第２の光透過層には、上記蛍光検出を行なうための励起光及び当該励起光を所望の位置に照射するための制御光とが照射され、上記第１の光透過層は、上記測定溶液の屈折率及び上記第２の光透過層の屈折率よりも、高い屈折率を有している。
【０１０２】
このため上記蛍光検出基板では、フォーカスサーボ制御及び位置決めサーボ制御を正確且つ高速に行うことが可能となる。
【０１０３】
例えば、本発明が適用されたバイオアッセイ基板では、プローブ物質とターゲット物質との相互反応の場となる複数の反応領域が形成された表面層と、第１の光透過層と、第２の光透過層とが積層されている。第１の光透過層の屈折率は、上記プローブ物質と上記ターゲット物質とが相互反応した後に上記反応領域に残存している溶液の屈折率及び上記第２の光透過層の屈折率よりも、高くされている。
【０１０４】
このため、本発明に係るバイオアッセイ基板では、裏面側から入射されたフォーカスサーボ及び位置決めサーボ用の制御光の、上記第２の光透過層と上記溶液との間の境界部分での反射量が、大きくなる。
【０１０５】
そのため、本発明に係るバイオアッセイ基板では、フォーカスサーボ制御及び位置決めサーボ制御を正確且つ高速に行うことが可能となる。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明の実施の形態のバイオアッセイ基板の平面図である。
【図２】本発明の実施の形態のバイオアッセイ基板の断面図である。
【図３】上記バイオアッセイ基板に形成されたセルの模式図である。
【図４】上記バイオアッセイ基板が適用されるＤＮＡ解析装置の構成図である。
【図５】上記バイオアッセイ基板の中間層でのサーボ光の多重反射について説明するための図である。
【図６】基板層の材質を石英、中間層の材質をＲｕｔｌｉｅ型２酸化チタン、中間層の膜圧を９２ｎｍ、検体を含む溶液を純粋としたときの、強度反射率（Ｒｍｕｌｔｉ）及び強度透過率（Ｔｍｕｌｔｉ）のスペクトルを示す図である。
【図７】従来のＤＮＡ解析装置内に滴下機構と光学系とを設けた場合のサーボ用のレーザ光の照射経路を示す図である。
【符号の説明】
１ ディスク基板、２ 中心孔、３ 基板層、４ 中間層、５ ＤＮＡ層、６セル
【発明の属する技術分野】
本発明は、例えばＤＮＡチップ等のバイオインフォマティクス（生命情報科学）分野において特に有用な蛍光検出基板、蛍光検出装置及び方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
現在、マイクロアレイ技術によって所定のＤＮＡが微細配列された、いわゆるＤＮＡチップ又はＤＮＡマイクロアレイ（以下、ＤＮＡチップと総称する。）と呼ばれるバイオアッセイ用の集積基板が、遺伝子の突然変異、ＳＮＰｓ（一塩基多型）分析、遺伝子発現頻度解析等に利用されており、創薬、臨床診断、薬理ジェノミクス、法医学その他の分野において広範に活用され始めている。
【０００３】
このＤＮＡチップは、ガラス基板やシリコン基板上に多種多数のＤＮＡオリゴヌクレオチド鎖や、ｃＤＮＡ（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ ＤＮＡ）等が集積されていることから、ハイブリダイゼーション等の分子間相互反応の網羅的解析が可能となる点が特徴とされている。
【０００４】
ＤＮＡチップによる解析手法の一例を簡潔に説明すれば、ガラス基板やシリコン基板上に固相化（固定化）されたＤＮＡプローブに対して、細胞、組織等から抽出したｍＲＮＡ（ｍｅｓｓｅｎｇｅｒ ＲＮＡ）を逆転写ＰＣＲ（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｃｈａｉｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ）反応等によって蛍光プローブｄＮＴＰを組み込みながらＰＣＲ増幅し、上記基板上においてハイブリダイゼーションを行い、所定の検出器で蛍光測定を行うというものである。
【０００５】
ここで、被処理ターゲット物質数の増大並びに検出精度及び検出速度の向上を図るために、光ディスクの分野で培われた基板技術及びサーボ技術を、ＤＮＡチップ技術に応用することができる（特許文献１参照。）。具体的には、プローブＤＮＡが固相化された複数の微小セルが表面に形成されたディスク基板をＤＮＡチップ技術に適用することができる。
【０００６】
このようなディスク基板を用いてＤＮＡ解析を行う場合には、当該ディスク基板を回転させながら、蛍光標識したターゲットＤＮＡが含有した溶液を微小セル上に滴下し、プローブＤＮＡとターゲットＤＮＡとを相互反応（ハイブリダイゼーション）させる。続いて、相互反応に寄与しなかったターゲットＤＮＡをディスク基板上から洗浄する。続いて、ディスク基板を回転させながら励起光を微小セルに照射し、励起光の照射により蛍光標識から発生する蛍光を光検出器で検出し、その蛍光の発光位置からターゲットＤＮＡと結合したプローブＤＮＡを特定する。
【０００７】
このようなディスク基板状のＤＮＡチップを用いたＤＮＡ解析では、ディスク基板を回転させながら相互反応を行わせることができるとともに、ディスク基板を高速回転させて蛍光検出を行うことができるので、解析装置を簡易化することができるとともに、検出速度の向上を図ることができる。
【０００８】
なお、ディスク基板を回転させながら蛍光の発光位置を特定するには、ディスク基板を回転させながら所望の１つの微小セルにのみに励起光を照射し、その照射位置が認識できる制御機能が必要となる。
【０００９】
このような制御を行うには、いわゆる光ディスクドライブと同様に、対物レンズを用いた光学系を用いてフォーカスサーボ制御及び位置決めサーボ制御等を適用すればよい。
【００１０】
ただし、ＤＮＡ解析装置では、励起光が蛍光標識剤に吸収されてしまうため励起光の反射光は非常に微小となってしまう。そのため、ＤＮＡ解析装置では、フォーカスサーボ制御や位置決めサーボ制御を行うために、励起光の波長とは異なる波長の制御光を対物レンズを介してディスク基板に照射し、その反射光に基づきサーボ制御のためのエラー信号を生成する必要がある。
【００１１】
【特許文献１】
特開２００１−２３８６７４号公報
【００１２】
【発明が解決しようとする課題】
ところで、ディスク基板状のＤＮＡチップを取り扱う解析装置では、ターゲットＤＮＡを含有した溶液をディスク基板に滴下する滴下機構と、蛍光を検出するための光学系とを同一装置内に設ければ、装置の取り扱いが非常に便利になる。滴下機構と光学系とを同一の装置に配置するには、滴下機構をディスク基板の上方側に設け、光学系をディスク基板の下方側に設けるのが、スペースを有効利用する上で好適である。
【００１３】
ここで、一つの解析装置内に、滴下機構と光学系とを設けた場合のサーボ用のレーザ光の照射経路を図７に示す。
【００１４】
図７に示すように、ディスク基板１０２の上方に設けられた滴下機構１０１からターゲットＤＮＡを含有した溶液を滴下する場合、当該ディスク基板１０２の上面１０２ａ側にプローブＤＮＡが固相化された微小セル１０３が形成される。
【００１５】
それに対して、サーボ用の制御光Ｖはディスク基板１０２の下面１０２ｂ側から入射されるが、サーボ制御のためのエラー信号を正確に生成するためには、微小セル１０３の近傍のディスク基板の上部境界層１０２ｃからの反射光を検出するのが望ましい。
【００１６】
しかしながら、サーボ用の制御光Ｖをディスク基板１０２の下面１０２ｂ側から入射した場合、その制御光Ｖを一端ディスク基板１０２を通過させなければならないので、ディスク基板１の上部境界層１０２ｃからは、高い反射率を得ることができない。
【００１７】
例えば、ハイブリダイゼーション等で用いられた溶液が微小セルに残存したとし、ディスク基板の材質が石英ガラスであるとすると、上部境界層１０２ｃの反射率は、約２．５％となり非常に低い。高い反射率が得られないと、サーボ制御のためのエラー信号として充分なＳ／Ｎ比を得ることができない。
【００１８】
また、ディスク基板の上部境界層１０２ｃでは、制御光Ｖの波長の反射率を高くすることが望ましいが、励起光及び蛍光の波長は反対に透過率が高い方が望ましい。
【００１９】
そこで、本発明では、励起光及び蛍光とは異なる波長の装置制御用の制御光の反射率を高めた蛍光検出基板、蛍光検出装置及び方法を提供することを目的とする。
【００２０】
例えば、本発明により、滴下機構を基板の上方側に設け、蛍光検出のための光学系を基板の下方側に設けた解析装置に適用可能なバイオアッセイ基板であって、励起光及び蛍光とは異なる波長の装置制御用の制御光の反射率を高めたバイオアッセイ基板を提供する。
【００２１】
【課題を解決するための手段】
本発明に係る蛍光検出基板は、測定溶液の蛍光検出を行なう蛍光検出基板であって、上記測定溶液の蛍光検出を行なうための検出領域を有する表面層と、上記表面層へ積層された第１の光透過層と、上記第１の光透過層へ積層された第２の光透過層とを備え、第２の光透過層には、上記蛍光検出を行なうための励起光及び当該励起光を所望の位置に照射するための制御光とが照射され、上記第１の光透過層は、上記測定溶液の屈折率及び上記第２の光透過層の屈折率よりも、高い屈折率を有している。
【００２２】
本発明に係る蛍光検出装置は、測定溶液の蛍光検出を行なうための検出領域を有する表面層と、上記表面層へ積層された第１の光透過層と、上記第１の光透過層へ積層された第２の光透過層とを備え、第２の光透過層に上記蛍光検出を行なうための励起光及び当該励起光を所望の位置に照射するための制御光とが照射され、上記第１の光透過層が上記測定溶液の屈折率及び上記第２の光透過層の屈折率よりも高い屈折率を有する蛍光検出基板に対して、上記励起光及び制御光を照射する照射手段と、上記蛍光を検出する蛍光検出手段とを備える。
【００２３】
本発明に係る蛍光検出方法は、測定溶液の蛍光検出を行なうための検出領域を有する表面層と、上記表面層へ積層された第１の光透過層と、上記第１の光透過層へ積層された第２の光透過層とを備え、第２の光透過層に上記蛍光検出を行なうための励起光及び当該励起光を所望の位置に照射するための制御光とが照射され、上記第１の光透過層が上記測定溶液の屈折率及び上記第２の光透過層の屈折率よりも高い屈折率を有する蛍光検出基板に対して、上記励起光及び制御光を照射するとともに、上記蛍光を検出する。
【００２４】
具体的に、本発明が適用されたバイオアッセイ基板は、ターゲット物質及び蛍光標識剤が表面側から滴下可能とされ、上記プローブ物質が固定可能とされ、プローブ物質とターゲット物質との相互反応の場となる複数の反応領域が形成された表面層と、上記表面層の反応領域の下層に形成された平板状の第１の光透過層と、上記第１の光透過層の下層に形成された平板状の第２の光透過層とが積層されている。
【００２５】
上記バイオアッセイ基板は、解析装置に装填され、装填された状態でプローブ物質とターゲット物質との相互反応に基づく生化学分析が行われる。
【００２６】
上記解析装置には、バイオアッセイ基板に対して溶液を滴下する滴下機構と、バイオアッセイ基板上に存在する蛍光標識剤の蛍光を検出のための光学系とが設けられている。上記バイオアッセイ基板は、溶液が表面に滴下されるように水平に解析装置に対して装填される。滴下装置は、装填されたバイオアッセイ基板の上方に配置され、光学系は、装填されたバイオアッセイ基板の下方に配置される。
【００２７】
上記解析装置は、蛍光標識剤が結合されたターゲット物質、又は、蛍光標識剤及びターゲット物質を、上記反応領域に滴下される。ターゲット物質に対応したプローブ物質が固定された反応領域では、滴下されたターゲット物質とプローブ物質とが相互反応する。さらに、相互反応した後のプローブ物質及びターゲット物質には、蛍光標識剤も結合する。
【００２８】
相互反応が終了すると、続いて、上記解析装置は、上記バイオアッセイ基板に裏面側から励起光及び制御光を照射する。励起光は、上記蛍光標識剤を発光させるための励起波長のレーザ光である。また、制御光は、上記励起光を任意の反応領域に照射するためのフォーカスサーボ及び位置決めサーボ用の制御光である。バイオアッセイ基板に入射された制御光は、当該バイオアッセイ基板により反射され、再度光学系に入射する。光学系は、その反射光に基づき、フォーカスサーボ及び位置決めサーボ制御のエラー信号を生成する。
【００２９】
そして、以上のような本発明が適用されたバイオアッセイ基板では、上記第１の光透過層の屈折率が、上記プローブ物質と上記ターゲット物質とが相互反応した後に上記反応領域に残存している溶液の屈折率及び上記第２の光透過層の屈折率よりも、高くされている。
【００３０】
このため、上記バイオアッセイ基板では、裏面側から入射されたフォーカスサーボ及び位置決めサーボ用の制御光の、上記第２の光透過層と上記溶液との間の境界部分での反射量が、大きくなる。
【００３１】
【発明の実施の形態】
以下、本発明の実施の形態として、本発明を適用したＤＮＡチップ（以下、ディスク基板と呼ぶ。）、並びに、このディスク基板を用いてＤＮＡ解析を行うＤＮＡ解析装置について説明をする。
【００３２】
（ディスク基板）
図１に本発明の実施の形態のディスク基板１の模式的な平面図を示し、図２に当該ディスク基板１の部分断面図を示す。
【００３３】
ディスク基板１は、例えば、ＣＤ（Ｃｏｍｐａｃｔ Ｄｉｓｋ）、ＤＶＤ（Ｄｉｇｉｔａｌ Ｖｅｒｓａｔｉｌｅ Ｄｉｓｋ）、ＭＤ（Ｍｉｎｉ Ｄｉｓｋ）等の光ディスクと同様の円形の平板状の形状を呈している。また、ディスク基板１の中心には、中心孔２が形成されている。中心孔２には、当該ディスク基板１がＤＮＡ解析装置に装填されたときに、当該ディスク基板１を保持及び回転させるためのチャッキング機構が挿入される。
【００３４】
ディスク基板１は、図２に示すように、基板層３と中間層４とＤＮＡ層５とを有している。基板層３は最下層に形成されており、中間層４は基板層３の上層に形成されており、ＤＮＡ層５は中間層４の上層であり最上層に形成されている。なお、以下、ディスク基板１のＤＮＡ層５側の表面を上面１ａ、基板層３側の表面を下面１ｂというものとする。
【００３５】
基板層３は、石英ガラス、シリコン、ポリカーボネート、ポリスチレン、その他の円板状に成型可能な合成樹脂等の材料で形成されている。また、基板層３の材料は、詳細を後述する励起光及び制御光並びに蛍光の波長の光を透過する材料である。
【００３６】
中間層４は、基板層３の屈折率よりも高い屈折率を有しており、且つ、ハイブリダイゼーションを行った後にディスク基板上に残存している溶液の屈折率よりも高い屈折率を有している。また、中間層４の材料は、詳細を後述する励起光及び制御光並びに蛍光の波長の光を透過する材料である。なお、この中間層４の屈折率及び膜厚等の設定については、詳細を後述する。
【００３７】
ＤＮＡ層５には、上面１ａ側に、プローブＤＮＡとターゲットＤＮＡとの相互反応の場となる複数のセル６が形成されている。各セル６は、ディスク基板１の中心から円周方向に放射状に向かう複数の列上に、等間隔に並んで配置されている。また、ＤＮＡ層５には、アドレスピット７が形成されている。アドレスピット７は、各セル６のディスク基板１上の配置を特定するための情報である。アドレスピット７は、光学ヘッドによりレーザ光を照射してその反射光を検出することにより、情報内容を読み取ることができる光学的な情報ピットである。このアドレスピット７から情報を光学的に読み取ることによって、対応する位置に配置されているセル６を特定することが可能となる。
【００３８】
図３に、１つのセル６の模式図を示す。
【００３９】
セル６は、図３に示すように、開口部が略矩形状とされた穴状の小室である反応領域８を有している。セル６は、プローブＤＮＡ（検出用ヌクレオチド鎖Ｄ）とターゲットＤＮＡ（標的ヌクレオチド鎖Ｔ）との間のハイブリダイゼーション反応の場となる。この反応領域８は、サンプルＤＮＡが含まれた溶液等が滴下されたときにその溶液を保留することができる程度の深さ及び大きさとなっており、この結果ハイブリダイゼーションが可能となっている。 また、セル６には、反応領域８に電場を形成するために、反応領域８の両端側に正電極９ａと負電極９ｂとが形成されている。正電極９ａ及び負電極９ｂに対しては、例えばディスク基板１の中心孔２を介して外部から与えられる電圧が印加される。さらに、セル６内の負電極９ｂ側の端面１０には、プローブＤＮＡが固相化できるように表面処理が施されている。
【００４０】
以上のようなディスク基板１では、円板状に形成されているため、光ディスクシステムと同様の再生システムを利用することにより、フォーカシングサーボ、半径方向に対する位置決めサーボ制御、アドレスピット７の情報を検出することができる。そのため、アドレスピット７の情報を１つ１つのセル６に対応させて形成しておくことにより、アドレスピット７の情報を読み出すことで特定の１つのセル６（或いは、グルーピングされた複数のセル）に対してのみレーザ光を照射することができる。
【００４１】
従って、例えば、特定の１つのセル６（又はグルーピングされた複数のセル６）に特定のプローブＤＮＡ（検出用ヌクレオチド鎖Ｄ）を固定化することができ、また、蛍光が発生しているセル６の位置を特定することもでき、このことから、さらに、ハイブリダイゼーションにより相互反応が生じたＤＮＡの解析することができる。
【００４２】
また、プローブＤＮＡ（検出用ヌクレオチド鎖Ｄ）毎に別個独立の条件を設定して、ハイブリダイゼーション反応を進行させることもできる。例えば、疾病発症のマーカー遺伝子をディスク基板１上にグルーピングして固定化して、１つのディスク基板１を用いて同時に複数の疾病の発現状況を確認することができる。
【００４３】
また、Ｔｍ（Ｍｅｌｔｉｎｇ Ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ）又はＧＣ含有率の違いに基づいて、固定化する検出用ヌクレオチド鎖をグルーピングしておくことも可能である。これにより、アクティブなハイブリダイゼーション反応が得られるバッファ組成、濃度等の反応条件、洗浄条件、滴下するサンプル溶液濃度等を、検出用ヌクレオチド鎖の性質に応じてきめ細かく選択することが可能となり、解析作業において疑陽性又は疑陰性が示される危険性を減少させることができる。
【００４４】
（ＤＮＡ解析装置）
つぎに、以上のようなディスク基板１を用いるＤＮＡ解析装置１１について、図４を参照して説明をする。
【００４５】
ＤＮＡ解析装置１１は、図４に示すように、ディスク基板１を保持して回転をさせるディスク装填部１２と、ハイブリダイゼーションのための各種溶液を貯留するとともにディスク基板１のセル６にその溶液を滴下する滴下部１３と、ディスク基板１から励起光を検出するための励起光検出部１４と、上記の各部の管理及び制御を行う制御／サーボ部１５とを備えている。
【００４６】
ディスク装填部１２は、ディスク基板１の中心孔２内に挿入して当該ディスク基板１を保持するチャッキング機構２１と、チャッキング機構２１を駆動することによりディスク基板１を回転させるスピンドルモータ２２と有している。ディスク装填部１２は、上面１ａ側が上方向となるようにディスク基板１を水平に保持した状態で、当該ディスク基板１を回転駆動する。ディスク装填部１２では、ディスク基板１を水平に保持することによって、セル６に滴下された溶液が垂れてしまうといった問題を回避することができる。
【００４７】
滴下部１３は、試料溶液Ｓを貯留する貯留部２３と、貯留部２３内の試料溶液Ｓをディスク基板１に滴下する滴下ヘッド２４とを有している。滴下ヘッド２４は、水平に装填されたディスク基板１の上面１ａの上方に配置されている。さらに、滴下ヘッド２４は、ディスク基板１のアドレスピット７から読み出される位置情報及び回転同期情報に基づいてディスク基板１との相対位置を半径方向に制御し、ターゲットＤＮＡ（標的ヌクレオチド鎖Ｔ）を含有する試料溶液Ｓを所定のセル６の反応領域８に正確に追従して滴下する構成とされている。また、貯留部２３と滴下ヘッド２４との組み合わせは、ハイブリダイゼーションのために使用する試料溶液の数だけある。
【００４８】
また、滴下部１３では、ディスク基板１上の所定の位置に正確に試料溶液Ｓを滴下するために、例えば、いわゆる「インクジェットプリンティング法」に基づく滴下方法が採用されている。「インクジェットプリンティング法」は、滴下ヘッド２４にいわゆるインクジェットプリンタで用いられるインク噴出機構を適用する方法であり、インクジェットプリンタのようなノズルヘッドからディスク基板１に試料溶液Ｓを噴射するものである。
【００４９】
励起光検出部１４は、光学ヘッド３０を有している。光学ヘッド３０は、水平に装填されたディスク基板１の下方側、すなわち、下面１ｂ側に配置されている。光学ヘッド３０は、例えば、図示していないスレッド機構等により、ディスク基板１の半径方向に移動自在とされている。
【００５０】
光学ヘッド３０は、対物レンズ３１と、対物レンズ３１を移動可能に支持する２軸アクチュエータ３２と、導光ミラー３３とを有している。対物レンズ３１は、その中心軸がディスク基板１の表面に対して略垂直となるように２軸アクチュエータ３２に支持されている。従って、対物レンズ３１は、ディスク基板１の下方側から入射された光束を当該ディスク基板１に対して集光することができる。２軸アクチュエータ３２は、ディスク基板１の表面に対して垂直な方向、及び、ディスク基板１の半径方向の２方向に対物レンズ３１を移動可能に支持している。２軸アクチュエータ３２を駆動することにより、対物レンズ３１により集光された光の焦点を、ディスク基板１の表面に対して垂直な方向及び半径方向に移動させることができる。従って、この光学ヘッド３０では、光ディスクシステムにおけるジャストフォーカス制御並びに位置決め制御と同様の制御を行うことができる。
【００５１】
導光ミラー３３は、光路Ｘ上に対して４５°の角度で配置されている。光路Ｘは、励起光Ｐ、蛍光Ｆ、サーボ光Ｖ及び反射光Ｒが、光学ヘッド３０に対して入射及び出射する光路である。導光ミラー３３には、励起光Ｐ及びサーボ光Ｖが光路Ｘ上から入射される。導光ミラー３３は、励起光Ｐ及びサーボ光Ｖを反射して９０°屈折させて、対物レンズ３１に入射する。対物レンズ３１に入射された励起光Ｐ及びサーボ光Ｖは、当該対物レンズ３１により集光されてディスク基板１に照射される。また、導光ミラー３３には、蛍光Ｆ及びサーボ光Ｖの反射光Ｒが、ディスク基板１から対物レンズ３１を介して入射される。導光ミラー３３は、蛍光Ｆ及び反射光Ｒを反射して９０°屈折させて、光路Ｘ上に出射する。
【００５２】
なお、光学ヘッド３０をスレッド移動させる駆動信号及び２軸アクチュエータ３２を駆動する駆動信号は、制御／サーボ部１５から与えられる。
【００５３】
また、励起光検出部１４は、励起光Ｐを出射する励起光源３４と、励起光源３４から出射された励起光Ｐを平行光束とするコリメータレンズ３５と、コリメータレンズ３５により平行光束とされた励起光Ｐを光路Ｘ上で屈折させて導光ミラー３３に照射する第１のダイクロックミラー３６とを有している。
【００５４】
励起光源３４は、蛍光標識剤を励起可能な波長のレーザ光源を有する発光手段である。励起光源３４から出射される励起光Ｐは、ここでは波長が４０５ｎｍのレーザ光である。なお、励起光Ｐの波長は、蛍光標識剤を励起できる波長であればどのような波長であってもよい。コリメータレンズ３５は、励起光源３４から出射された励起光Ｐを平行光束にする。第１のダイクロックミラー３６は、波長選択性を有する反射鏡であり、励起光Ｐの波長の光のみを反射して、蛍光Ｆ及びサーボ光Ｖ（その反射光Ｒ）の波長の光を透過する。第１のダイクロックミラー３６は、光路Ｘ上に４５°の角度を持って挿入されており、コリメータレンズ３５から出射された励起光Ｐを反射して９０°屈折させ、導光ミラー３３に励起光Ｐを照射している。
【００５５】
また、励起光検出部１４は、蛍光Ｆを検出するアバランジェフォトダイオード３７と、蛍光Ｆを集光する集光レンズ３８と、光学ヘッド３０から光路Ｘ上に出射された蛍光Ｆを屈折させてアバランジェフォトダイオード３７に照射する第２のダイクロックミラー３９とを有している。
【００５６】
アバランジェフォトダイオード３７は、非常に感度の高い光検出器であり、微弱な光量の蛍光Ｆを検出することが可能である。なお、アバランジェフォトダイオード３７により検出する蛍光Ｆの波長は、ここでは４７０ｎｍ程度である。また、この蛍光Ｆの波長は、蛍光標識剤の種類により異なるものである。集光レンズ３８は、アバランジェフォトダイオード３７上に蛍光Ｆを集光するためのレンズである。第２のダイクロックミラー３９は、光路Ｘ上に４５°の角度を挿入されているとともに、導光ミラー３３側から見て第１のダイクロックミラー３６の後段に配置されている。従って、第２のダイクロックミラー３９には、蛍光Ｆ、サーボ光Ｖ及び反射光Ｒが入射し、励起光Ｐは入射しない。第２のダイクロックミラー３９は、波長選択性を有する反射鏡であり、蛍光Ｆの波長の光のみを反射して、サーボ光（反射光Ｒ）の波長の光を透過する。第２のダイクロックミラー３９は、光学ヘッド３０の導光ミラー３３から出射された蛍光Ｆを反射して９０°屈折させ、集光レンズ３８を介してアバランジェフォトダイオード３７に蛍光Ｆを照射する。
【００５７】
アバランジェフォトダイオード３７では、このように検出した蛍光Ｆの光量に応じた電気信号を発生し、その電気信号を制御／サーボ部１５に供給する。
【００５８】
また、励起光検出部１４は、サーボ光Ｖを出射するサーボ光源４０と、サーボ光源４０から出射されたサーボ光Ｖを平行光束とするコリメータレンズ４１と、サーボ光Ｖの反射光Ｒを検出するフォトディテクト回路４２と、非点収差を生じさせてフォトディテクト回路４２に対して反射光Ｒを集光するシリンドリカルレンズ４３と、サーボ光Ｖと反射光Ｒとを分離する光セパレータ４４とを有している。
【００５９】
サーボ光源４０は、例えば７８０ｎｍの波長のレーザ光を出射するレーザ光源を有する発光手段である。なお、サーボ光Ｖの波長は、アドレスピット７が検出できる程度の波長であり、励起光Ｐ及び蛍光Ｆの波長と異なっていれば７８０ｎｍに限らずどのような波長であってもよい。コリメータレンズ４１は、サーボ光源４０から出射されたサーボ光Ｖを平行光束にする。平行光束とされたサーボ光Ｖは光セパレータ４４に入射される。
【００６０】
フォトディテクト回路４２は、反射光Ｒを検出するディテクタと、検出した反射光Ｒからフォーカスエラー信号、位置決めエラー信号、及びアドレスピット７の再生信号を生成する信号生成回路とを有している。反射光Ｒは、サーボ光Ｖがディスク基板１で反射して生成された光であるので、その波長は、サーボ光と同一の７８０ｎｍである。
【００６１】
なお、フォーカスエラー信号は、対物レンズ３２により集光された光の合焦位置と、ディスク基板１のＤＮＡ層５との位置ずれ量を示すエラー信号である。フォーカスエラー信号が０となったときに、対物レンズ３２とディスク基板１との間の距離が最適になる。位置決めエラー信号は、所定のセル６の位置と、焦点位置とのディスク半径方向に対する位置ずれ量を示す信号である。位置決めエラー信号が０となったときに、サーボ光Ｖのディスク半径方向に対する照射位置が任意のセル６に一致したこととなる。アドレスピット７の再生信号は、ディスク基板７に記録されているアドレスピット７に記述されている情報内容を示す信号である。この情報内容を読み出すことにより、現在サーボ光Ｖを照射しているセル７を特定することができる。
【００６２】
フォトディテクト回路４２は、反射光Ｒに基づき生成されたフォーカスエラー信号、位置決めエラー信号及びアドレスピット７の再生信号を制御／サーボ部１５に供給する。
【００６３】
シリンドリカルレンズ４３は、フォトディテクト回路４２上に反射光Ｒを集光するとともに非点収差を生じさせるためのレンズである。このように非点収差を生じさせることによりフォトディテクト回路４２によりフォーカスエラー信号を生成させることができる。
【００６４】
光セパレータ４４は、偏向ビームスプリッタからなる光分離面４４ａと１／４波長板４４ｂにより構成されている。光セパレータ４４では、１／４波長板４４ｂの逆側から入射された光を光分離面４４ａが透過し、その透過光の反射光が１／４波長板４４側から入射された場合には光分離面４４ａが反射する機能を有している。光セパレータ４４は、光分離面４４ａが光路Ｘ上に４５°の角度を挿入されているとともに、導光ミラー３３側から見て第２のダイクロックミラー３９の後段に配置されている。従って、光セパレータ４４では、コリメータレンズ４１から出射されたサーボ光Ｖを透過して光学ヘッド３０内の導光ミラー３３に対してそのサーボ光Ｖを入射させているとともに、光学ヘッド３０の導光ミラー３３から出射された反射光Ｒを反射することにより９０°屈折され、シリンドリカルレンズ４３を介してフォトディテクト回路４２に反射光Ｒを照射する。
【００６５】
制御／サーボ部１５は、励起光検出部１４により検出されたフォーカスエラー信号、位置決めエラー信号及びアドレスピット７の再生信号に基づき、各種のサーボ制御を行う。
【００６６】
すなわち、制御／サーボ部１５は、フォーカスエラー信号に基づき光学ヘッド３０内の２軸アクチュエータ３２を駆動して対物レンズ３１とディスク基板１との間の間隔を制御し、フォーカスエラー信号が０となるようにサーボ制御を行う。また、制御／サーボ部１５は、位置決めエラー信号に基づき光学ヘッド３０内の２軸アクチュエータ３２を駆動して対物レンズ３１をディスク基板１の半径方向に移動制御し、フォーカスエラー信号が０となるようにサーボ制御を行う。また、制御／サーボ部１５は、アドレスピット７の再生信号に基づき光学ヘッド３０のスレッド移動制御を行って光学ヘッド３０を所定の半径位置に移動し、目的のセル位置に対物レンズ３１を移動させる。
【００６７】
以上のような構成のＤＮＡ解析装置１１では、次のような処理を行う。すなわち、ディスク基板１を回転させながら、セル６上に蛍光標識したターゲットＤＮＡが含有した溶液を滴下し、プローブＤＮＡとターゲットＤＮＡとを相互反応（ハイブリダイゼーション）させる。
【００６８】
励起光検出部１４には、水平に装填されたディスク基板１を回転させ、励起光Ｐを当該ディスク基板１の下面１ｂ側から入射させてセル６内の蛍光標識剤に照射し、その励起光Ｐに応じてその蛍光標識剤から発生した蛍光Ｆをディスク基板１の下方から検出する。
【００６９】
ここで、ＤＮＡ解析装置１１では、励起光Ｐとサーボ光Ｖとを同一の対物レンズ３１を介してディスク基板１に照射している。そのため、ＤＮＡ解析装置１１では、サーボ光Ｖを用いたフォーカス制御、位置決め制御並びにアドレス制御を行うことによって、励起光Ｐの照射位置、すなわち、蛍光Ｆの発光位置を特定することが可能となり、その蛍光の発光位置からターゲットＤＮＡと結合したプローブＤＮＡを特定することができる。
【００７０】
（ＤＮＡ解析手順）
つぎに、以上のようなＤＮＡ解析装置１１を用いたＤＮＡ解析手順について説明をする。
【００７１】
まず、ＤＮＡ解析装置１１のディスク装填部１２にディスク基板１を水平に装填する。
【００７２】
続いて、ＤＮＡ解析装置１１により、フォーカスサーボ制御及び位置決めサーボ制御並びにアドレス制御を行いながらディスク基板１を回転させ、滴下ヘッド２４からプローブＤＮＡが含有した溶液を所定のセル６に対して滴下する。
【００７３】
続いて、ＤＮＡ解析装置１１により、フォーカスサーボ制御及び位置決めサーボ制御並びにアドレス制御を行いながらディスク基板１を回転させ、滴下ヘッド２４から蛍光標識されたターゲットＤＮＡが含有した溶液Ｓ、又は、ターゲットＤＮＡが含有した溶液及び蛍光標識剤が含有した溶液を、所定のセル６に対して滴下する。
【００７４】
続いて、プローブＤＮＡとターゲットＤＮＡとのハイブリダイゼーションを促進するために、例えば、ディスク基板１を恒温槽に移し、数時間加温する。
【００７５】
続いて、ディスク基板１を、例えば界面活性剤ＳＤＳを含むＳＳＣ（Ｓａｌｉｎｅ−Ｓｏｄｉｕｍ Ｃｉｔｒａｔｅ）バッファ溶液を用いて洗浄し、プローブＤＮＡと相互反応をしなかったターゲットＤＮＡをディスク基板１から除去する。
【００７６】
続いて、ＤＮＡ解析装置１１のディスク装填部１２に、ターゲットＤＮＡが固相化されたディスク基板１を水平に装填する。
【００７７】
続いて、ＤＮＡ解析装置１１により、フォーカスサーボ制御及び位置決めサーボ制御並びにアドレス制御を行いながらディスク基板１を回転させ、励起光Ｐを所定のセル６に照射する。この励起光Ｐの照射とともに、アドレス情報を検出しながら蛍光Ｆが発生しているか否かを検出する。
【００７８】
そして、ＤＮＡ解析装置１１は、ディスク基板１上の各セル６の位置と蛍光Ｆの発光の有無を示すマップ作成し、その作成したマップに基づきターゲットＤＮＡの解析を行う。
【００７９】
（中間層４の設定条件）
つぎに、ディスク基板１の下方から入射されたサーボ光Ｖが、中間層４で反射されるための条件について説明をする。
【００８０】
図５に示すように、ディスク基板１の下方（下面１ｂ）側から入射されたサーボ光Ｖは、中間層４内で多重反射される。
【００８１】
ここで、各定数を次のように定義する。
・雰囲気の屈折率＝１
・基板層３の屈折率＝ｎ０
・中間層４の屈折率＝ｎ１
・中間層４の膜厚＝ｄ
・セル６上に残存している検体（ターゲット物質）を含む溶液５０の屈折率＝ｎ２
・サーボ光Ｖの波長＝λ
・基板層３と中間層４の界面による振幅反射率＝ｒ０
・基板層３と中間層４の界面による振幅透過率＝ｔ０
・中間層４とセル６上に残存している検体（ターゲット物質）を含む溶液５０との界面による振幅屈折率＝ｒ１
・中間層４とセル６上に残存している検体（ターゲット物質）を含む溶液５０との界面による振幅透過率＝ｔ１
また、ｎ１＞ｎ０，ｎ１＞ｎ２である。さらに、基板層３及びセル６上に残存している検体（ターゲット物質）を含む溶液５０の膜圧は、サーボ光Ｖのコヒーレント長よりも十分大きいとする。
【００８２】
このとき、ストークスの定理からｒ０＝−ｒ０´、ｔ１ｔ１´＝１−ｒ１ ２（ただし、´は逆側の入射の場合の振幅反射率及び透過率を表す。）の関係を用いて、基板層４側から垂直にサーボ光Ｖが入射した場合の、検体（ターゲット物質）を含む溶液５０と中間層４との間の多重干渉による反射の振幅（ｒｍｕｌｔｉ）と透過の振幅（ｔｍｕｌｔｉ）を求めると、以下の式１及び式２に示すようになる。
【００８３】
【数１】
上式から中間層４による強度反射率（Ｒｍｕｌｔｉ）及び強度透過率（Ｔｍｕｌｔｉ）を算出すると、以下の式３及び式４に示すようになる。
【００８５】
【数２】
ここで、本実施の形態のディスク基板１のような３層構造の場合、光学的な反射面は、基板層３の表面（下面１ｂ）及び中間層４の２つが考えられるが、フォーカスサーボを考慮した場合には、ＤＮＡ層５により近い中間層４からの反射がより大きいことが望ましい。基板層３の表面（下面１ｂ）の強度反射率をＲ２として、以上の条件を数式で表すと、下記式５に示すようになる。
【００８７】
【数３】
さらに、基板層３の表面（下面１ｂ）の振幅反射率をｒ２とすれば、以下の式６に示すようになる。
【００８９】
【数４】
従って、式１〜式４を、上記式６に代入すると、下記式７が導かれる。
【００９１】
【数５】
すなわち、以上の式７の条件に従い、サーボ光波長λ、中間層４の屈折率（すなわち材料）及び中間層４の膜圧ｄを設定すれば、安定したフォーカスサーボをかけることができる。
【００９３】
例えば、基板層３の材質を石英、中間層４の材質をＲｕｔｌｉｅ型２酸化チタン、中間層４の膜圧を９２ｎｍ、検体（ターゲット物質）を含む溶液５０を純粋としたとき、上記式３、式４から強度反射率（Ｒｍｕｌｔｉ）及び強度透過率（Ｔｍｕｌｔｉ）を求めると、図６に示すようなスペクトルが得られる。この図６によれば、発振波長７８０ｎｍのレーザ光をサーボ光として用いれば、中間層４から約１９％の強度反射率が得られることがわかる。
【００９４】
例えば、中間層４が存在しない場合における基板層３と溶液５０との間の境界からの強度反射率Ｒ１２を算出すると、波長７８０ｎｍであれば、下式に示すように、０．２５％であるので、基板層３を設けたほうが大幅に反射率が高くなっていることがわかる。
【００９５】
【数６】
また、波長７８０ｎｍでの基板層３の表面（下面１ｂ）の強度反射率をＲ２は、波長７８０ｎｍであれば、下式に示すように、３．６％であるので、基板層３からの反射率の方が大きく、安定したフォーカスサーボがかけられることがわかる。
【００９７】
【数７】
さらに、中間層４では、サーボ光Ｖの反射率をより高くすることが望ましいが、励起光Ｐ及び蛍光Ｆに対しては反対に、より透過率が高い方が望ましい。すなわち、サーボ光Ｖの波長での反射率を大きく、励起光Ｐ及び蛍光Ｆの波長で小さくなるように、サーボ光波長λ、中間層４の屈折率（すなわち材料）及び中間層４の膜圧ｄを設定すればよい。
【００９９】
励起光Ｐの波長を４３０ｎｍ、蛍光Ｆの波長を４７０ｎｍ、サーボ光の波長を７８０ｎｍであるとする。このとき、励起光Ｐ及び蛍光Ｆの透過率は、図６に示すように、９５％、９８％と非常に高くなる。これに対して、サーボ光Ｖの透過率は８１％であり、サーボ光Ｖの透過率よりも、励起光Ｐ及び蛍光Ｆの透過率の方が非常に大きくなる。
【０１００】
つまり、励起光Ｐ及び蛍光Ｆの波長を、式４に示す条件において透過率がピーク値に近い波長に設定し、サーボ光Ｖの波長を式３に示す条件において反射率がピーク値に近い波長に設定すれば、大きな強度の蛍光Ｆを得ることができるとともに、安定したサーボをかけることができる。
【０１０１】
【発明の効果】
本発明に係る蛍光検出基板では、上記測定溶液の蛍光検出を行なうための検出領域を有する表面層と、上記表面層へ積層された第１の光透過層と、上記第１の光透過層へ積層された第２の光透過層とを備え、第２の光透過層には、上記蛍光検出を行なうための励起光及び当該励起光を所望の位置に照射するための制御光とが照射され、上記第１の光透過層は、上記測定溶液の屈折率及び上記第２の光透過層の屈折率よりも、高い屈折率を有している。
【０１０２】
このため上記蛍光検出基板では、フォーカスサーボ制御及び位置決めサーボ制御を正確且つ高速に行うことが可能となる。
【０１０３】
例えば、本発明が適用されたバイオアッセイ基板では、プローブ物質とターゲット物質との相互反応の場となる複数の反応領域が形成された表面層と、第１の光透過層と、第２の光透過層とが積層されている。第１の光透過層の屈折率は、上記プローブ物質と上記ターゲット物質とが相互反応した後に上記反応領域に残存している溶液の屈折率及び上記第２の光透過層の屈折率よりも、高くされている。
【０１０４】
このため、本発明に係るバイオアッセイ基板では、裏面側から入射されたフォーカスサーボ及び位置決めサーボ用の制御光の、上記第２の光透過層と上記溶液との間の境界部分での反射量が、大きくなる。
【０１０５】
そのため、本発明に係るバイオアッセイ基板では、フォーカスサーボ制御及び位置決めサーボ制御を正確且つ高速に行うことが可能となる。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明の実施の形態のバイオアッセイ基板の平面図である。
【図２】本発明の実施の形態のバイオアッセイ基板の断面図である。
【図３】上記バイオアッセイ基板に形成されたセルの模式図である。
【図４】上記バイオアッセイ基板が適用されるＤＮＡ解析装置の構成図である。
【図５】上記バイオアッセイ基板の中間層でのサーボ光の多重反射について説明するための図である。
【図６】基板層の材質を石英、中間層の材質をＲｕｔｌｉｅ型２酸化チタン、中間層の膜圧を９２ｎｍ、検体を含む溶液を純粋としたときの、強度反射率（Ｒｍｕｌｔｉ）及び強度透過率（Ｔｍｕｌｔｉ）のスペクトルを示す図である。
【図７】従来のＤＮＡ解析装置内に滴下機構と光学系とを設けた場合のサーボ用のレーザ光の照射経路を示す図である。
【符号の説明】
１ ディスク基板、２ 中心孔、３ 基板層、４ 中間層、５ ＤＮＡ層、６セル
Claims (10)
- 測定溶液の蛍光検出を行なう蛍光検出基板において、
上記測定溶液の蛍光検出を行なうための検出領域を有する表面層と、
上記表面層へ積層された第１の光透過層と、
上記第１の光透過層へ積層された第２の光透過層とを備え、
第２の光透過層には、上記蛍光検出を行なうための励起光及び当該励起光を所望の位置に照射するための制御光とが照射され、
上記第１の光透過層は、上記測定溶液の屈折率及び上記第２の光透過層の屈折率よりも、高い屈折率を有していること
を特徴とする蛍光検出基板。 - 上記第１の光透過層における上記励起光又は蛍光の多重干渉による透過率が、上記制御光の多重干渉による透過率より大きい値となるように、上記励起光又は上記蛍光の波長、上記制御光の波長、並びに上記測定溶液および上記第２の光透過層の屈折率に応じた、上記第１の透過層の屈折率および膜厚を備えることを特徴とする請求項１に記載の蛍光検出基板。
- 上記第１の光透過層における上記制御光の多重干渉による反射率が、上記制御光の上記第２の光透過層の表面反射における反射率より大きい値となるように、上記制御光の波長、並びに上記測定溶液及び上記第２の光透過層の屈折率に応じた、上記第１の透過層の屈折率および膜厚を備えることを特徴とする請求項１に記載の蛍光検出基板。
- 上記第１の光透過層における上記励起光または蛍光の多重干渉による透過率が極大値周辺となるように、上記励起光又は上記蛍光の波長、並びに上記測定溶液及び上記第２の光透過層の屈折率に応じた、上記第１の透過層の屈折率および膜厚を備えることを特徴とする請求項１に記載の蛍光検出基板。
- 上記第１の光透過層における上記制御光の多重干渉による反射率が極大値周辺となるように、上記制御光、並びに上記測定溶液及び上記第２の光透過層の屈折率に応じた、上記第１の透過層の屈折率および膜厚を備えることを特徴とする請求項１に記載の蛍光検出基板。
- 上記検出領域にプローブ物質が固定化され、上記プローブ物質に対応したターゲット物質が注入されると、注入されたターゲット物質はプローブ物質と相互反応を起こし、相互反応後のプローブ物質もしくはターゲット物質には、上記励起光に応じた蛍光標識剤が結合しており、上記蛍光標識剤の蛍光の検出により上記プローブ物質及び上記ターゲット物質の上記相互反応を検出することを特徴とする請求項１に記載の蛍光検出基板。
- 上記プローブ物質及び上記ターゲット物質は、ヌクレオチド鎖もしくはタンパク質であり、上記相互反応は、上記プローブ物質と上記ターゲット物質の結合反応であることを特徴とする請求項６に記載の蛍光検出基板。
- 上記プローブ物質が固定化された検出領域に、上記ターゲット物質を表面側から滴下可能とし、上記励起光及び上記制御光を裏面側から照射し、上記蛍光標識剤の蛍光を裏面から測定することを特徴とする請求項６に記載の蛍光検出基板。
- 測定溶液の蛍光検出を行なうための検出領域を有する表面層と、上記表面層へ積層された第１の光透過層と、上記第１の光透過層へ積層された第２の光透過層とを備え、第２の光透過層に上記蛍光検出を行なうための励起光及び当該励起光を所望の位置に照射するための制御光とが照射され、上記第１の光透過層が上記測定溶液の屈折率及び上記第２の光透過層の屈折率よりも高い屈折率を有する蛍光検出基板に対して、上記励起光及び制御光を照射する照射手段と、
上記蛍光を検出する蛍光検出手段とを備える蛍光検出装置。 - 測定溶液の蛍光検出を行なうための検出領域を有する表面層と、上記表面層へ積層された第１の光透過層と、上記第１の光透過層へ積層された第２の光透過層とを備え、第２の光透過層に上記蛍光検出を行なうための励起光及び当該励起光を所望の位置に照射するための制御光とが照射され、上記第１の光透過層が上記測定溶液の屈折率及び上記第２の光透過層の屈折率よりも高い屈折率を有する蛍光検出基板に対して、上記励起光及び制御光を照射するとともに、上記蛍光を検出する蛍光検出方法。
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