JP2005024404A - 化学反応用基板及びその製造方法並びにハイブリダイゼーション方法 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】ハイブリダイゼーション用基板1は、CD等の光ディスクと同様の主面が円形の平板状の形状を呈している。基板1は、中心孔2を中心に回転駆動される。基板1は、プローブDNAとサンプルDNAとのハイブリダイゼーション反応の場となるウェル8が表面1aに複数個形成されている。基板1の表面は、例えば、ポリビニルカルバゾール又はポリフェナザシリン等のπ共役ユニットを含むポリマーによりコーティングされている。このため、プローブDNAが伸張した状態でウェル内に固定される。
【選択図】 図2
Description
【発明の属する技術分野】
本発明は、例えばDNAチップ等の化学反応用基板及びその製造方法並びにヌクレオチド鎖をハイブリダイゼーションするハイブリダイゼーション方法に関する。
【0002】
【従来の技術】
現在、マイクロアレイ技術によって所定のDNA(デオキシリボ核酸の全長又は一部)が微細配列されたいわゆるDNAチップ又はDNAマイクロアレイ(以下、DNAチップと総称する。)と呼ばれる基板が、遺伝子の突然変異、SNPs(一塩基多型)分析、遺伝子発現頻度解析等に利用されており、創薬、臨床診断、薬理ジェノミクス、法医学その他の分野において広範に活用され始めている。
【0003】
DNAチップを用いたDNA解析手法は、細胞、組織等から抽出したmRNA(messenger RNA)を逆転写PCR(Polymerase Chain Reaction)反応等によって蛍光プローブdNTPを組み込みながらPCR増幅してサンプルDNAを生成し、そのサンプルDNAをDNAチップ上に固相化(固定化)されたプローブDNAに対して滴下して、プローブDNAとサンプルDNAとをハイブリダイゼーションさせる。そして、DNAの2重らせん内に蛍光標識剤を挿入し、所定の検出器でその蛍光測定を行う。このことにより、サンプルDNAとプローブDNAとの塩基配列が同一であるか否かを判別する。
【0004】
【特許文献1】
特開2001−165840号公報
【0005】
【発明が解決しようとする課題】
ところで、一本鎖DNAは、通常の状態においては直鎖状とはならずにランダムコイル状となるので、プローブDNAとサンプルDNAとをハイブリダイゼーションさせる場合に立体障害が大きく、効率的にハイブリダイゼーションを行うことが困難である。
【0006】
そこで、本発明では、このような従来の課題を解決するため、簡易な構成で効率的にハイブリダイゼーションを行うことができる化学反応用基板及びその製造方法並びにハイブリダイゼーション方法を提供することを目的とする。
【0007】
【課題を解決するための手段】
π共役ユニットを含むポリマーがコートされた基板にDNAを含有した溶液を滴下して乾燥させると、ヌクレオチド鎖が基板上に伸張した状態で固定される。このように伸張して固定するのは、ポリマーのπ共役ユニットとDNAの塩基対との間のπスタッキングによる作用であるものと考えられる。本発明者は、このように伸張した状態でDNAが固定されることを利用して、以下のような化学反応用基板及びその製造方法並びにハイブリダイゼーション方法の発明を行った。
【0008】
本発明に係る化学反応用基板は、ヌクレオチド鎖に対する化学反応を行なう基板である化学反応用基板であって、上記化学反応を行なう反応領域が基板表面に形成され、上記反応領域はπ共役ユニットを含むポリマーがコートされていることを特徴とする。
【0009】
本発明に係る基板製造方法は、ヌクレオチド鎖に対する化学反応を行なう基板である化学反応用基板を製造する基板製造方法であって、上記化学反応を行なう反応領域を基板表面に形成し、上記反応領域にπ共役ユニットを含むポリマーをコートすることを特徴とする。
【0010】
また、本発明に係るハイブリダイゼーション方法は、π共役ユニットを含むポリマーがコートされた基板上に上記プローブ用ヌクレオチド鎖を含む溶液を滴下し、滴下した溶液を乾燥させて上記ポリマー上に上記プローブ用ヌクレオチド鎖を固定し、プローブ用ヌクレオチド鎖とサンプル用ヌクレオチド鎖とをハイブリダイゼーションをさせる。
【0011】
上記の発明において、π共役ユニットを含むポリマーは、例えばポリビニルカルバゾール又はポリフェナザシリンである。
【0012】
【発明の実施の形態】
以下、本発明を適用した具体的な実施の形態として、本発明を適用したDNA解析用のハイブリダイゼーション用基板及びこのハイブリダイゼーション用基板を用いてDNA解析を行うハイブリダイゼーション方法について説明をする。
【0013】
(ハイブリダイゼーション用基板)
図1に本発明の実施の形態のハイブリダイゼーション用基板1の上面を模式的に表した図を示し、図2に本発明の実施の形態のハイブリダイゼーション用基板1の断面を模式的に表した図を示す。
【0014】
ハイブリダイゼーション用基板1の全体形状は、例えばCD(Compact Disk)、DVD(Digital Versatile Disk)等の光ディスクと同様に、主面が円形とされた平板状となっている。ハイブリダイゼーション用基板1の主面の中心には、中心孔2が形成されている。中心孔2には、当該ハイブリダイゼーション用基板1がDNA解析装置に装着されたときに、当該ハイブリダイゼーション用基板1を保持及び回転させるためのチャッキング機構が挿入される。
【0015】
ハイブリダイゼーション用基板1は、図2に示すように、下層側から、基板層3と、ウェル形成層4とから形成されている。なお、ハイブリダイゼーション用基板1ウェル形成層4側の表面を上面1a、基板層3側の表面を下面1bというものとする。
【0016】
基板層3は、石英ガラス、シリコン、ポリカーボネート、ポリスチレン等の材料で形成されている。
【0017】
ウェル形成層4は、基板層3上に形成された層である。ウェル形成層4は、ハイブリダイゼーション用基板1の上面1a側に開口したくぼみ状の複数のウェル8が形成された層である。
【0018】
ウェル8は、その内部空間が、プローブDNA(検出用ヌクレオチド鎖)とサンプルDNA(標的ヌクレオチド鎖)との相互反応の場、具体的には、ハイブリダイゼーション反応の場となる。ウェル8は、サンプルDNAが含まれた溶液等の液体が滴下されたときにその液体を保留することができる程度の深さ及び大きさとなっている。例えば、ウェル8は、開口部が100μm四方の大きさに形成され、深さが5μm程度とされている。
【0019】
このようなウェル形成層4は、図3に示すように、基板層3の上に感光性ポリミイド11をスピンコート等で5μm程度の厚さに塗布する(ステップS1)。続いて、塗布した感光性ポリミイド11上に所定のパターンのフォトマスク12を形成し、このフォトマスク12を用いて感光性ポリミイド11を露光及び現像する(ステップS2)。このことにより、ウェル形成層4に複数のウェル8が形成される(ステップS3)。
【0020】
ウェル形成層4は、さらに、図4に示すように、π共役ユニットを含むポリマー15により表面がコーティングされている。π共役ユニットを含むポリマー15は、例えば、ポリビニルカルバゾール又はポリフェナザシリン等の芳香族アミンを有するポリマーである。π共役ユニットを含むポリマー15を例えば適切な有機溶液に溶かし、その溶液をスピンコート方式で塗布することで、ウェル形成層4上にπ共役ユニットを含むポリマー15をコーティングすることができる。このようにウェル形成層4上を処理すると、少なくともウェル8の底面16がπ共役ユニットを含むポリマー15によりコートされる。
【0021】
ここで、バッファ溶液に溶かされた一本鎖DNAを、π共役ユニットを含むポリマーによりコートされたガラス上に滴下すると、一本鎖DNAを伸張した状態でガラス上に固定することができることが知られている(参照文献:Proceedings of 7th International Conference on Nanometer−Scale Science and Technology, TU−P−120, 24−28, June 2002, Sweden)。DNAを伸張した状態で固定することができる理由は、ポリマーのπ共役ユニット(例えば芳香族アミン)とDNAの塩基対との間のπスタッキングによる作用であるものと考えられている。
【0022】
従って、ポリビニルカルバゾール又はポリフェナザシリン等のπ共役ユニットを含むポリマー15によりウェル8の底面16をコートし、溶液に含有したヌクレオチド鎖を底面16上に滴下してその後に乾燥させると、ヌクレオチド鎖を伸張した状態で底面16に固定させることができる。
【0023】
また、ハイブリダイゼーション用基板1では、図1に示すように、複数のウェル8が、主面の中心から外周方向に放射状に向かう複数の列上に、例えば400μm程度の間隔で等間隔に並んで配置されている。
【0024】
また、ハイブリダイゼーション用基板1には、レーザ光を照射することにより読み取り可能なアドレスピットが形成されている。アドレスピットは、ハイブリダイゼーション用基板1の平面上における各ウェル8の位置を特定するための情報である。アドレスピットから情報を光学的に読み取ることによって、複数存在するウェル8のうち、現在レーザ光を照射している位置の1つのウェル8がどれであるかを特定することが可能となる。このようなアドレスピットが設けてあることによって、後述する滴下装置による溶液の滴下位置の制御や、対物レンズによる蛍光検出位置の特定を行うことができる。
【0025】
以上のようなハイブリダイゼーション用基板1では、円板状に形成されているため、光ディスクシステムと同様の再生システムを利用することにより、レーザ光のフォーカシング位置を制御するためのフォーカシングサーボ制御、半径方向に対するレーザ光の照射位置や滴下装置による滴下位置の制御のための位置決めサーボ制御、並びに、アドレスピットの情報検出処理をすることができる。つまり、アドレスピットに記録してある情報内容と、そのアドレスピットの近傍にあるウェル8とを対応させておくことにより、アドレスピットの情報を読み出すことで、特定の1つのウェル8に対してのみレーザ光を照射して蛍光が発光しているウェル8の位置を特定したり、特定の1つのウェル8の位置と滴下装置との相対位置を制御して、その特定の1つのウェル8に対して溶液を滴下したりすることができる。
【0026】
さらに、以上のようなハイブリダイゼーション用基板1では、ウェル8の底面16がπ共役ユニットを含むポリマー15によりコートされている。そのため、ランダムコイル状のDNAを伸張して固定することができるので、ハイブリダイゼーションを高速に行うことが可能となる。
【0027】
(DNA解析方法)
つぎに、以上のようなハイブリダイゼーション用基板1を用いたDNA解析方法について説明をする。
【0028】
まず、ハイブリダイゼーション用基板1をDNA解析装置に装填し、ハイブリダイゼーション用基板1を上面1a側が上方向となるように水平に保持するとともに、ハイブリダイゼーション用基板1を回転可能な状態にする。
【0029】
ハイブリダイゼーション用基板1の保持及び回転は、光ディスクドライブと同様のチャッキング機構を用いて行う。
【0030】
続いて、ハイブリダイゼーション用基板1を保持した状態で、プローブDNAが含有した溶液Sを、図5に示すように、例えば滴下用ノズル20を用いて所定のウェル8に対して滴下する。このとき、1つのハイブリダイゼーション用基板1を回転駆動して、特定のウェル8と滴下ノズル20との相対位置を制御しながらプローブDNAを滴下する。さらに、複数種類のプローブDNAをハイブリダイゼーション用基板1のそれぞれのウェル8に滴下する。だたし、1つのウェル8内には1種類のプローブDNAが入るようにする。なお、各ウェル8にいずれの種類のプローブDNAを滴下するかは、予めウェルとプローブDNAとの対応関係を示す配置マップ等を生成しておき、その配置マップに基づき滴下制御する。
【0031】
溶液Sの滴下制御は、光ディスクの駆動システムと同様にハイブリダイゼーション用基板1を駆動制御することにより行う。すなわち、図5に示すように、ハイブリダイゼーション用基板1を上面1aを上にして平行に保持しながら回転駆動するとともに、レーザ光Vをハイブリダイゼーション用基板1の例えば下側(下面1b側)から照射してアドレスピットを検出することによりウェル8の位置を特定しながら、滴下位置の制御を行えばよい。
【0032】
続いて、溶液Sを滴下したのちハイブリダイゼーション用基板1を乾燥させる。1つのウェル8内に滴下する溶液は微量となるので短時間で水分を蒸発させることが可能である。ウェル8内の水分を蒸発させると、ウェル8の底面16にコートされたπ共役ユニットを含むポリマー15上に、伸張した状態で、プローブDNAが固定される。
【0033】
続いて、生体から抽出したサンプルDNAが含有した溶液S´を滴下ノズル20を用いてハイブリダイゼーション用基板1上の各ウェル8に滴下する。
【0034】
続いて、サンプルDNAの滴下後、周囲の温度を60度C程度に維持して、プローブDNAとサンプルDNAとをハイブリダイゼーションさせる。
【0035】
このような処理をすると、プローブDNAが伸張して固定されている状態から、立体障害が少ない状態で溶液S´中に溶け出すので、サンプルDNAとのハイブリダイゼーションを効率的に行うことが可能となる。この結果、互いの塩基配列が相補的な関係にあるサンプルDNAとプローブDNAとが同一のウェル8内にある場合には、それらがハイブリダイゼーションを起こす。
【0036】
続いて、ハイブリダイゼーションを起こさせた後に、蛍光標識インターカレータ等(例えば、POPO−1,TOTO−1)をハイブリダイゼーション用基板1のウェル8内に滴下する。このような蛍光標識剤は、ハイブリダイゼーションを起こしたプローブDNAとサンプルDNAとの二重らせん間に挿入して結合する。
【0037】
続いて、光ディスクの駆動システムと同様にハイブリダイゼーション用基板1を駆動制御することにより、ウェル8からの蛍光の検出を行う。すなわち、ハイブリダイゼーション用基板1を保持しながら回転駆動するとともに、レーザ光Vをハイブリダイゼーション用基板1の下側(下面1b側)から照射してアドレスピットを検出することによりウェル8の位置を特定する。それと同時に、励起光をハイブリダイゼーション用基板1の下側(下面1b側)から照射して、その励起光に応じて生じる蛍光をやはり下面1b側から検出する。そして、どのウェル8から蛍光が発生されているか否かを検出する。
【0038】
続いて、ハイブリダイゼーション用基板1上の蛍光が発生していたウェル8の位置を示すマップ作成する。そして、その作成したマップ、並びに、各ウェル8にどのような塩基配列のプローブDNAが滴下されていたかを示す配置マップに基づき、サンプルDNAの塩基配列の解析を行う。
【0039】
以上のようなハイブリダイゼーション用基板1を用いたDNA解析方法では、π共役ユニットを含むポリマー15にプローブDNAを滴下して伸張させるので、サンプルDNAとの間のハイブリダイゼーションを高速に行うことが可能となる。
【0040】
【発明の効果】
本発明に係るハイブリダイゼーション用基板は、プローブ用ヌクレオチド鎖とサンプル用ヌクレオチド鎖とのハイブリダイゼーションの場が基板表面に形成され、その場にπ共役ユニットを含むポリマーがコートされている。また、本発明に係るハイブリダイゼーション方法は、π共役ユニットを含むポリマーがコートされた基板上に上記プローブ用ヌクレオチド鎖を含む溶液を滴下し、滴下した溶液を乾燥させて上記ポリマー上に上記プローブ用ヌクレオチド鎖を固定し、プローブ用ヌクレオチド鎖とサンプル用ヌクレオチド鎖とをハイブリダイゼーションをさせる。
【0041】
このことにより本発明では、プローブ用ヌクレオチド鎖を上記ポリマー上に伸張して固定し、その後にサンプル用ヌクレオチド鎖とハイブリダイゼーションさせる。従って、本発明では、簡易な構成で効率的にハイブリダイゼーションを行うことができる。
【図面の簡単な説明】
【図1】本発明の実施の形態のハイブリダイゼーション用基板の平面図である。
【図2】本発明の実施の形態のハイブリダイゼーション用基板の断面図である。
【図3】ハイブリダイゼーション用基板のウェルを形成する工程を示した図である。
【図4】π共役ユニットを有するポリマーが表面にコーティングされたウェルを示す図である。
【図5】ハイブリダイゼーション用基板に対して溶液の滴下制御を説明するための図である。
【符号の説明】
1 ハイブリダイゼーション用基板、2 中心孔、3 基板層、4 ウェル形成層、8 ウェル
Claims (9)
- ヌクレオチド鎖に対する化学反応を行なう基板である化学反応用基板において、
上記化学反応を行なう反応領域が基板表面に形成され、上記反応領域はπ共役ユニットを含むポリマーがコートされていること
を特徴とする化学反応用基板。 - 上記化学反応は、上記ヌクレオチド鎖のハイブリダイゼーション反応であることと特徴とする請求項1に記載の化学反応用基板。
- 上記反応領域は、上記化学反応を検出する検出表面をさらに有し、
上記検出表面は、上記π共役ユニットを含むポリマーがコートされていることを特徴とする請求項1に記載の化学反応用基板。 - 上記基板表面には、ヌクレオチド鎖に対する化学反応を行なう反応領域となる複数のウェルが形成され、上記ウェルの底面がπ共役ユニットを含むポリマーによりコートされていること
を特徴とする請求項1記載の化学反応用基板。 - 上記π共役ユニットを含むポリマーは、ポリビニルカルバゾール又はポリフェナザシリンであること
を特徴とする請求項1記載の化学反応用基板。 - ヌクレオチド鎖に対する化学反応を行なう基板である化学反応用基板を製造する基板製造方法において、
上記化学反応を行なう反応領域を基板表面に形成し、
上記反応領域にπ共役ユニットを含むポリマーをコートすること
を特徴とする基板製造方法。 - プローブ用ヌクレオチド鎖とサンプル用ヌクレオチド鎖とのハイブリダイゼーションをするハイブリダイゼーション方法において、
π共役ユニットを含むポリマーがコートされた基板上に上記プローブ用ヌクレオチド鎖を含む溶液を滴下し、
滴下した溶液を乾燥させて上記ポリマー上に上記プローブ用ヌクレオチド鎖を固定し、
プローブ用ヌクレオチド鎖とサンプル用ヌクレオチド鎖とをハイブリダイゼーションをさせること
を特徴とするハイブリダイゼーション方法。 - 上記基板には、プローブ用ヌクレオチド鎖とサンプル用ヌクレオチド鎖とのハイブリダイゼーションの場となる複数のウェルが形成され、上記ウェルの底面がπ共役ユニットを含むポリマーによりコートされていること
を特徴とする請求項7記載のハイブリダイゼーション方法。 - 上記π共役ユニットを含むポリマーは、ポリビニルカルバゾール又はポリフェナザシリンであること
を特徴とする請求項7記載のハイブリダイゼーション方法。
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JP2003190535A JP2005024404A (ja) | 2003-07-02 | 2003-07-02 | 化学反応用基板及びその製造方法並びにハイブリダイゼーション方法 |
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