ES2588514T3 - Aplicación de puntos cuánticos para la tinción nuclear - Google Patents

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Abstract

Un conjugado, que comprende: una nanopartícula; y un resto de unión a ADN que comprende una molécula de unión a ADN y un engarzador, en el que la molécula de unión a ADN es un agente de unión al surco menor, un agente de unión al surco mayor, un intercalante de ADN, un agente alquilante de ADN, o una combinación de los mismos, y en el que el conjugado tiene la estructura nanopartícula-engarzador-molécula de unión a ADN.

Description

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DESCRIPCION
Aplicacion de puntos cuanticos para la tincion nuclear Campo
La presente invencion se refiere, en general, a un sistema y metodo para la tincion nuclear en muestras de tejido. Pueden obtenerse determinaciones nucleares cuantitativas de muestras de patologfas examinadas al microscopio de fluorescencia. En ciertas realizaciones, la presente invencion proporciona un metodo para determinar simultaneamente la morfolog^a y textura nuclear con otros ensayos de deteccion multiple sobre el mismo portaobjetos.
Antecedentes
La determinacion de las caractensticas nucleares mediante analisis de imagen automatizado es una potente estrategia en la deteccion, diagnostico y pronostico de diversos estados de la enfermedad. Estas caractensticas han incluido tradicionalmente la morfologfa, ploidfa, textura y aspectos contextuales. Una de las realizaciones de mas exito de esta tecnologfa se ha aplicado al cribado masivo del cancer de cuello de utero en forma de sistemas comerciales de generacion de imagenes de Hologic™ (el ThinPrep® Imaging System) y Becton, Dickinson and Company (FocalPoint™). Otros sistemas comerciales incluyen OralAdvance™ y LungSign™, de Perceptronix Medical Inc. Laboratories, para la deteccion precoz del cancer oral y de pulmon, respectivamente.
La morfologfa nuclear se refiere en general, a determinaciones de forma y tamano; tales como las que describen redondez del penmetro. La ploidfa se aplica en general por medio de un protocolo estequiometrico de tincion (p. ej., tionina-Feulgen) para determinar recuento anomalo de cromosomas, denominado aneuploidfa e implica la determinacion de la densidad optica integrada a lo largo del area nuclear. Los metodos de analisis de la textura se consideran en general, bien como estadfsticos o bien como estructurales. Ambas estrategias producen medidas descriptivas de la variacion espacial y de densidad de la estructura interna o del patron de cromatina de un nucleo. Por ultimo, los aspectos contextuales miden la distribucion espacial de los ordenamientos internucleares dentro de la estructura de un tejido.
Todos estos metodos se han aplicado de forma individual y en combinacion para discriminar con exito entre normal y patologfa anomala en diversos tipos de tejido. Aunque el enfoque de este trabajo se ha aplicado en general a la generacion de imagenes de campo claro, tambien se ha llevado a cabo alguna investigacion sobre la evaluacion de dichas estrategias en la microscopfa de fluorescencia.
Sin embargo, los fluoroforos tradicionales sufren varios problemas que reducen su utilidad en la aplicacion de dichas tecnicas a esta modalidad. El fotoblanqueo es un problema clave que degrada la senal de la muestra a lo largo de tiempo, incluso en el intervalo de tiempo necesario para la captura de la imagen. La sensibilidad y especificidad a las moleculas diana (p. ej., ADN) es tambien un factor limitante en las metodologfas de tincion tradicionales. Por ejemplo, el colorante de contraste nuclear DAPI (4',6-diamidino-2-fenilindol) ampliamente utilizado, es util para localizar la posicion y forma de los nucleos celulares, pero no se une de forma espedfica para reproducir una textura nuclear interpretable. Otros colorantes fluorescentes usados como colorantes de contraste y marcadores de ADN incluyen los colorantes de Hoechst (p. ej., Hoechst 33258 y Hoechst 33342) y yoduro de propidio. Estos materiales, sin embargo, sufren degradacion de la intensidad de fotoluminiscencia y cambio espectral fotoinducidos.
La tecnica previa existente en el uso de los colorantes fluorescentes como colorantes y marcadores de ADN utiliza complejos organicos e inorganicos y organicos de moleculas pequenas. La aplicacion de un sistema de tincion de contraste basado en nanomateriales proporciona un medio para superar los errores inherentes al uso de fluoroforos de moleculas pequenas debido a sus caractensticas opticas fotoestables. Los nanomateriales de los puntos cuanticos se han usado en su mayona para detectar ADN usando sistemas basados en FRET (siglas en ingles de transferencia de energfa de resonancia de fluorescencia) o TEF (transferencia electronica fotoinducida). (Dubertret, Nature Materials (2005), 4(11): 797-798.) Otra aplicacion que emplea nanomateriales es el uso de puntos cuanticos conjugados con sondas a base de acido nucleico que pueden hibridar con sus secuencias de ADN complementario diana. (Bentolila et al., Cell Biochemistry and Biophysics (2006), 45(1):59-70.) El punto cuantico actua como un indicador visual para las secuencias diana. Sin embargo, la aplicacion de dicho colorante no es compatible con los ensayos de FISH (siglas en ingles de hibridacion in situ fluorescente) para TMPRSS-ERG y HER2 porque una sonda ADN marcado que puede unirse generalmente a las moleculas de ADN pueden hibridar con el gen diana, evitando asf la hibridacion de la sonda del gen diana y enmascarando la presencia del gen diana. El uso de puntos cuanticos con moleculas que interaccionan con el ADN para tenir ADN nuclear en celulas y tejidos fijados no se ha publicado en la bibliograffa cientffica.
Sumario
Se desvelan realizaciones de conjugados de nanopartfcula/resto de union a ADN y metodos para usar los conjugados para visualizar un nucleo. Tambien se desvelan kits para realizar el metodo.
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Las realizaciones del conjugado incluyen una nanopartfcula (p. ej., un punto cuantico, una nanopartfcula metalica, una nanopartfcula de oxido metalico, una nanopartfcula de complejo de metal de transicion) y un resto de union a ADN que comprende una molecula de union a ADN y un engarzador (p. ej., una cadena alifatica o polialquilenglicol) tales que el conjugado tiene la estructura nanopartfcula-engarzador-molecula de union a ADN. Las realizaciones particulares que se desvelan se refieren a un conjugado que comprende un punto cuantico y un resto de union a ADN que comprende una molecula de union al ADN. La molecula de union a ADN puede ser un agente de union al surco menor, un agente de union al surco mayor, un intercalante de ADN, un agente alquilante de ADN, o una combinacion de los mismos. En algunas realizaciones, la molecula de union al ADN es 4',6-diamidino-2-fenilindol (DAPI), colorantes de bis-bencimida, psoraleno, o naftalendiimida.
En realizaciones particulares, el resto de union a ADN incluye un engarzador multifuncional y una pluralidad de agentes de union al surco menor, intercalantes de ADN, agentes alquilantes del ADN, o una combinacion de los mismos. Por ejemplo, el engarzador multifuncional puede comprender dos cadenas de polietilenglicol unidas a un ester de W-hidroxisuccinimida y una molecula de union al ADN se une a cada cadena de polietilenglicol. En realizaciones particulares, el resto de union al ADN se selecciona entre
imagen1
o
imagen2
El nucleo se visualiza pretratando una muestra de tejido, tal como una muestra de tejido fijado, con una proteasa para permeabilizar el nucleo y despues incubando la muestra de tejido pretratada con un conjugado de nanopartfcula/molecula de union al ADN. El conjugado entra en un nucleo y se une al ADN en el nucleo. La nanopartfcula se visualiza despues, visualizandose asf el nucleo. En algunas realizaciones, la nanopartfcula es un punto cuantico y la fluorescencia del punto cuantico se detecta para visualizar el nucleo.
El conjugado se incuba con la muestra de tejido a una concentracion de al menos 5 nM, tal como al menos 25 nM o al menos 50 nM. Cuando la nanopartfcula se visualiza, se obtiene una imagen del nucleo y pueden usarse tecnicas informaticas y de analisis de imagen para determinar de forma cuantitativa aspectos nucleares tales como distribucion cromosomica, ploidia, forma, tamano, aspectos de la textura (p. ej., area superficial), aspectos contextuales (p. ej., distancia al lfmite nuclear) y combinaciones de los mismos.
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En ciertas realizaciones, se realizan uno o mas procedimientos adicionales sobre la muestra de tejido. Por ejemplo, pueden aplicarse a la muestra de tejido y detectarse una o mas sondas capaces de hibridar con una o mas dianas dentro de la muestra de tejido. En algunos casos, la sonda hibridada se detecta visualizando un punto cuantico asociado con la sonda. Si el conjugado de nanoparffcula/molecula de union a ADN incluye un punto cuantico, el punto cuantico de la sonda se selecciona para emitir fluorescencia a una longitud de onda diferente de la del punto cuantico del conjugado. En realizaciones particulares, el procedimiento adicional es un procedimiento de hibridacion in situ fluorescente.
Los kits para llevar a cabo las realizaciones del metodo incluyen una composicion enzimatica de proteasa, un conjugado de nanoparffcula/molecula de union a ADN y un tampon de reaccion. La composicion enzimatica de proteasa incluye una enzima proteasa en un tampon que tiene una concentracion de sal y un pH suficientes para permitir que la enzima proteasa presente actividad proteofftica. El tampon de reaccion tiene una concentracion de sal y un pH suficientes para posibilitar que el conjugado entre en un nucleo dentro de una muestra de tejido pretratada con la composicion enzimatica de proteasa.
Lo anterior y otros objetos, aspectos, y ventajas de la invencion se haran mas evidentes a partir de la siguiente descripcion detallada, que prosigue con referencia a las figuras adjuntas.
Breve descripcion de los dibujos
La fig. 1 es un diagrama esquematico de un conjugado de molecula de union a ADN-punto cuantico unido a ADN.
La fig. 2 es una fotograffa a color, usando un filtro de DAPI, de una realizacion de un conjugado de molecula de union a ADN-punto cuantico usado para la tincion de contraste de nucleos de tejido prostatico.
Las figs. 3A-B son fotograffas de nucleos celulares con tincion de contraste con un conjugado de punto cuantico- DAPI (fig. 3A) y DAPI (fig. 3B).
La fig. 4 es una fotograffa que ilustra nucleos de tejido epitelial con tincion de contraste con un conjugado de punto cuantico-psoraleno (QD490PEG-NH-psoraleno).
La fig. 5 es una fotograffa que ilustra nucleos de tejido prostatico con tincion de contraste con un conjugado de punto cuantico-naftalendiimida (QD490:NDI-C6).
La fig. 6 es una fotograffa que ilustra la tincion de contraste de nucleos de tejido prostatico con conjugado de QD490:NDI-C6 en conjunto con un ensayo de FISH utilizando una sonda de tMprSS2 que contiene los puntos cuanticos QD565 y QD655.
La fig. 7 es una fotograffa que ilustra la tincion de contraste de nucleos de tejido prostatico con conjugado de QD490:NDI-C6 en conjunto con un ensayo de FISH utilizando una sonda de HER2-CHR17 que contiene los puntos cuanticos QD565 y QD655.
La fig. 8 es una fotograffa que ilustra la tincion de contraste de nucleos de tejido prostatico con conjugado de QD490:NDI-C6 en conjunto con un ensayo de FISH utilizando sondas de TMPRSS2, ERG5'3', SLC45A3, y ETV1 conjugadas con los puntos cuanticos QD565, QD585, QD605 y QD655, respectivamente.
La fig. 9 es un esquema sintetico para anadir restos de ester de N-hidroxisuccinimida (NHS) a moleculas de union a ADN en los que los Ri y R2 son independientemente una cadena alifatica sustituida o sin sustituir, aromatica sustituida o sin sustituir, heteroaromatica, o un polialquilheteroatomo tal como una cadena de oxido de alquileno (p. ej., un polialquilenglicol).
La fig. 10 representa una reaccion entre un ester succinimidilo de un resto de union al ADN y un grupo amina libre en un punto cuantico, produciendo asf un conjugado de punto cuantico-resto de union al aDn.
La fig. 11 es un espectro de fluorescencia de una mezcla de puntos cuanticos que emiten fluorescencia a 490 nm, 565 nm, y 655 nm.
La fig. 12 es una fotograffa de celulas de tejido prostatico despues de realizar un ensayo de TMPRSS2. Los nucleos se han sometido a tincion de contraste con un conjugado de QD490:NDI-C6 a una concentracion de 25 nM. Las sondas de FISH que utilizan los puntos cuanticos QD565 y QD655 tambien son claramente visibles.
La fig. 13 es una fotograffa de celulas de tejido mamario despues de realizar un ensayo de HER2-Chrl7. Los nucleos se han sometido a tincion de contraste con un conjugado de QD490:NDI-C6 a una concentracion de 25 nM. Las sondas de FISH que utilizan los puntos cuanticos QD565 y QD655 tambien son claramente visibles.
La fig. 14 es una imagen de campo oscuro de tejido prostatico. Los nucleos se han sometido a tincion de contraste con un conjugado de QD490:NDI-C6 a una concentracion de 25 nM.
La fig. 15 es una tincion de tejido de hematoxilina y eosina en campo pseudo claro producida convirtiendo la imagen de campo oscuro de la fig. 14. La imagen tiene un aumento de 40X.
La fig. 16 es una fotograffa de tejido pulmonar tenido con un conjugado de QD490-NDI-C6.
La fig. 17 es una fotograffa de tejido de cuello de utero tenido con un conjugado de QD490-NDI-C6.
La fig. 18 es el espectro de RMN 1H del compuesto (11), esquema 4.
La fig. 19 es el espectro de RMN 13C del compuesto (11), esquema 4.
Descripcion detallada
En general, la presente divulgacion tiene que ver con un sistema y un metodo mejorados para reproducir y determinar caracteffsticas nucleares en la microscopfa de fluorescencia. Es de particular interes la capacidad de
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reproducir la textura nuclear de una manera que anteriormente solo ha^a sido posible en modalidades de campo claro. Ademas, las realizaciones del sistema y del metodo que se desvelan no intervienen con protocolos de tincion adicionales, posibilitando as^ la determinacion simultanea de multiples fuentes de informacion a partir del mismo tejido.
Las determinaciones de la textura nuclear pueden clasificarse ampliamente en las siguientes areas: 1) estadfstica descriptiva de la distribucion de la cromatina; 2) aspectos de la textura discretos; 3) valores extremos; 4) markoviana; 5) longitud de serie y 6) aspectos de textura fractal. Todas estas estrategias necesitan alta sensibilidad, especificidad y contraste de tincion del patron de la cromatina (heterocromatina y eucromatina) dentro del nucleo celular. Estos metodos determinan y describen la forma en la que vana la intensidad de la imagen con la distribucion espacial. Por ejemplo, la tincion nuclear relativamente uniforme, tal como DAPI, resulta en escasa o nula informacion de la textura, mientras que una tincion de tionina-Feulgen de campo claro resulta en un alto nivel de informacion de la textura que puede usarse para discriminar entre normal y patologfa anomala.
Una propiedad deseable adicional de una metodologfa de tincion para el examen nuclear es la estequiometna, la cual se refiere a una correlacion directa entre el contenido de ADN y la intensidad de la tincion. La estequiometna permite un analisis de la ploidfa consistente por medio del cual son detectables conjuntos cromosomas anomalos. Un defecto de los colorantes de contraste nucleares fluorescentes tradicionales tales como DAPI es que no son intnnsecamente estequiometricos e incluso se decoloran en condiciones de fotoblanqueo, separando ademas la correlacion entre moleculas diana e intensidad de la imagen.
La presente divulgacion proporciona una combinacion de indicadores opticos y sondas de interaccion con el ADN que permiten la visualizacion y determinacion preferentes de la estructura y contenido de ADN. Se desvelan realizaciones de restos de union a ADN conjugados con nanomateriales. Los restos de union a ADN comprenden al menos una molecula de union a ADN. Las moleculas de union a ADN son capaces de dirigir y unir los nanomateriales al ADN en los nucleos celulares. La fig. 1 es un diagrama esquematico que representa un resto de union a ADN y su nanomaterial conjugado (p. ej., un punto cuantico) unido al ADN. Tambien se desvelan realizaciones de un metodo para usar los conjugados de resto de union a ADN/nanomaterial para definir el nucleo, delinear su lfmite y establecer su morfologfa en una celula. La fig. 2 es una imagen con filtro para DAPI de una realizacion de un conjugado de molecula de union a ADN-punto cuantico usado para la tincion de contraste de nucleos de tejido prostatico.
Las realizaciones de los nanomateriales desvelados, p. ej., puntos cuanticos, y restos de union a ADN, proporcionan un medio para definir y delimitar los nucleos en el tejido. Los puntos cuanticos proporcionan una senal fluorescente fotoestable. Debido a la emision fotoestable, los puntos cuanticos de amplio espectro de absorcion (los espectros de absorcion del punto cuantico abarcan las regiones superiores e inferiores del ultravioleta y pueden extenderse dentro de la region visible, dependiendo del tamano de los puntos cuanticos), y de altos rendimientos cuanticos (p. ej., > 30 %, > 50 %, o incluso > 80 %), son fluoroforos superiores comparados con sus homologos de molecula pequena. Esto permite la tincion fluorescente de nucleos en el tejido en conjunto con ensayos de FISH tales como los ensayos de HER2 y TMPRSS2-ERG fluorescentes.
Las moleculas de union a ADN son organicas, inorganicas y complejos de metales de transicion que se unen al ADN mediante union al surco mayor y/o menor, intercalacion, union a la cadena principal de fosfato y/o alquilacion del ADN. Los diferentes agentes de union a ADN dirigen cada uno el nanomaterial al ADN, pero la afinidad particular de cada agente de union al ADN determina el perfil de tincion del ADN en el nucleo. El repertorio de agentes de union a ADN permite una alta selectividad y regioselectividad molecular.
I. Terminos y definiciones
Las siguientes explicaciones de terminos y abreviaturas se proporcionan para describir mejor la presente divulgacion y para guiar a los expertos habituales en la tecnica en la practica de la presente divulgacion. Tal como se usa en el presente documento, "que comprende/comprendiendo" significa "que incluye/incluyendo" y las formas del singular "un" o "una", o "el" o "la" incluyen referencias en plural a menos que el contexto dicte claramente otra cosa. El termino "o" se refiere a un elemento individual de elementos alternativos enunciados o una combinacion de dos o mas elementos, a menos que el contexto indique claramente otra cosa.
A menos que se explique otra cosa, todos los terminos tecnicos y cientfficos que se usan en el presente documento tienen el mismo significado que el normalmente entendido por un experto habitual en la materia a la cual pertenece esta divulgacion. Aunque pueden usarse metodos y materiales similares o equivalentes a los que se describen en el presente documento en la practica o el ensayo de la presente invencion, a continuacion se describen metodos y materiales adecuados. Los materiales, metodos y ejemplos son solo ilustrativos y no pretenden ser limitantes. Otros aspectos de la divulgacion son aparentes a partir de la siguiente descripcion detallada y de las reivindicaciones.
A menos que se indique otra cosa, debe entenderse que todos los numeros que expresan cantidades de componentes, pesos moleculares, porcentajes, temperaturas, tiempos, y asf sucesivamente, tal como se usan en la memoria descriptiva o las reivindicaciones se modifican mediante el termino "alrededor de". Por consiguiente, a
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menos que se indique otra cosa, de forma impUcita o expKcita, los parametros numericos expuestos son aproximaciones que pueden depender de las propiedades deseadas que se buscan y/o de los Smites de deteccion en las condiciones/metodos de ensayo convencionales. Cuando se distingan de forma implfcita o explfcita realizaciones de la tecnica previa que se discute, los numeros de la realizacion no son aproximados a menos que se citen las palabras "alrededor de".
Pueden encontrarse definiciones de terminos comunes en biologfa molecular en Benjamin Lewin, Genes VII, publicado por Oxford University Press, 2000 (ISBN 019879276X); Kendrew et al. (ed.), The Encyclopedia of Molecular Biology, publicado por Blackwell Publishers, 1994 (ISBN 0632021829); y Robert A. Meyers (ed.), Molecular Biology and Biotechnology: a Comprehensive DeskReference, publicado por Wiley, John & Sons, Inc., 1995 (ISBN 0471186341); y otras referencias similares. Las definiciones de terminos comunes en qrnmica pueden encontrarse, por ejemplo, en Richard J. Lewis, Sr. (ed.), Hawley's Condensed Chemical Dictionary, publicado por John Wiley & Sons, Inc., 1997 (ISBN 0-471-29205-2).
Con el fin de facilitar la revision de diversas realizaciones de la divulgacion, se proporcionan las siguientes explicaciones de terminos espedficos:
Alifatico: Compuesto sustancialmente a base de hidrocarburo, o un radical del mismo (p. ej., C6H13, para un radical hexano), que incluye alcanos, alquenos, alquinos, incluyendo versiones dclicas de los mismos, y que incluye ademas disposiciones de cadena lineales o ramificada y tambien todos los estereoisomeros e isomeros de posicion. A menos que se manifieste expresamente otra cosa, un grupo alifatico contiene de uno a veinticinco atomos de carbono; por ejemplo, de uno a quince, de uno a diez, de uno a seis, o de uno a cuatro atomos de carbono. La expresion "alifatico inferior" se refiere a un grupo alifatico que contiene de uno a diez atomos de carbono. Una cadena alifatica puede ser sustituida o sin sustituir. A menos que se le denomine expresamente como "alifatico sin sustituir" un grupo alifatico puede ser, bien sustituido, o bien sin sustituir. Un grupo alifatico puede estar sustituido con uno o mas sustituyentes (hasta dos sustituyentes por cada carbono metileno en una cadena alifatica, o hasta un sustituyente por cada carbono de un enlace doble -C=C- en una cadena alifatica, o hasta un sustituyente para un carbono de un grupo metino terminal). Los sustituyentes alifaticos de ejemplo incluyen, por ejemplo, amina, amida, sulfonamida, halogeno, ciano, carboxi, hidroxi, mercapto, trifluorometilo, alquilo, alcoxi, alquiltio, tioalcoxi, arilalquilo, heteroarilo, alquilamino, dialquilamino, u otra funcionalidad.
Compuestos aromaticos o arilo son tfpicamente hidrocarburos dclicos no saturados que tienen enlaces dobles y simples alternos. El benceno, un anillo de 6 carbonos que contiene tres enlaces dobles, es un compuesto aromatico tfpico.
Bis es un prefijo que significa "dos veces" u "otra vez". Se usa en nomenclatura qrnmica para indicar que un grupo o radical qmmico aparece dos veces en una molecula. Por ejemplo, un bis-ester tiene dos grupos ester.
Combilexina: Una molecula que combina una cadena de poliamida de union al surco menor, espedfica de secuencia con un intercalante.
Conjugado: Compuesto que tiene una nanopartfcula, tal como un punto cuantico y una molecula acoplada de forma eficaz a la nanopartfcula, bien de forma directa, o bien indirecta, mediante cualquier medio adecuado. Por ejemplo, la molecula puede estar acoplada a la nanopartfcula de forma covalente o no covalente (p. ej., de forma electrostatica). Tambien es posible la union indirecta de la molecula a la nanopartfcula, tal como mediante el uso de un "engarzador", siempre que el engarzador no afecte negativamente a la luminiscencia del punto cuantico o a la funcion de la molecula. Los engarzadores moleculares conocidos en la tecnica incluyen compuestos alifaticos, oxidos de alquileno, aminas primarias, tioles, estreptavidina, neutravidina, biotina, o compuestos similares.
Conjugar, unir, enlazar o ligar: Acoplar una primera unidad a una segunda unidad. Esto incluye, pero no se limita a, enlazar de forma covalente una molecula a otra molecula, enlazar de forma no covalente una molecula a otra molecula (p. ej., enlazar de forma electrostatica) (vease, por ejemplo, la patente de EE.UU. n.° 6.921.496, que desvela metodos para la conjugacion electrostatica), enlazar de forma no covalente una molecula a otra molecula mediante enlace de hidrogeno, enlazar de forma no covalente una molecula a otra molecula mediante fuerzas de van der Waals y cualquiera o todas las combinaciones de dichos acoplamientos.
Tincion de contraste es un metodo de postratamiento de muestras despues de que ya se han tenido con agentes para detectar una o mas dianas, de modo que sus estructuras pueden visualizarse mas facilmente con un microscopio. Por ejemplo, se usa una tincion de contrasta de forma opcional antes de poner el cubreobjetos para conseguir una tincion inmunohistoqmmica mas mtida. Los colorantes de contraste difieren de un colorante primario en el color. Son bien conocidos numerosos colorantes de contraste, tales como hematoxilina, eosina, verde metilo, azul de metileno, Giemsa, azul Alcian, DAPI, y rojo nuclear rapido. En algunos ejemplos, pueden mezclarse entre sf uno o mas colorantes para producir el colorante de contraste. Esto proporciona flexibilidad y la capacidad de elegir colorantes. Por ejemplo, puede seleccionarse un primer colorante para la mezcla que tenga un atributo particular, pero que, en cambio, no tenga un atributo deseado diferente. Puede anadirse un segundo colorante a la mezcla que presente el atributo deseado que falta. Por ejemplo, pueden mezclarse entre sf azul de toluidina, DAPI y azul celeste
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de pontamina para formar un colorante de contraste.
Detectar: Determinar si un agente (tal como una senal o un antigeno, protema o acido nucleico particular) esta presente o ausente, por ejemplo, en una muestra. En algunos ejemplos, esto puede incluir ademas la cuantificacion y/o localizacion, por ejemplo, la localizacion dentro de una celula o compartimento celular particular. "Detectar" se refiere a cualquier metodo de determinar si algo existe o no existe, tal como determinar si una molecula diana esta presente en una muestra biologica. Por ejemplo, "detectar" puede incluir usar un dispositivo visual o mecanico para determinar si una muestra presenta una caractenstica espedfica. En ciertos ejemplos, deteccion se refiere a observar de forma visual una sonda unida a una diana, u observar que una sonda no se une a una diana. Por ejemplo, la microscopia optica y otros medios de microscopfa se usan normalmente para detectar precipitados cromogenicos para los metodos que se describen aqm.
Emision o senal de emision: Luz de una longitud de onda particular generada a partir de una fuente. En ejemplos particulares, se emite una senal de emision a partir de un fluoroforo despues de que el fluoroforo absorbe luz a su(s) longitud(es) de onda de excitacion.
Excitacion o senal de excitacion: Luz de una longitud de onda particular necesaria y/o suficiente para excitar un electron de transicion a un nivel de energfa superior. En ejemplos particulares, una excitacion es la luz de una longitud de onda particular necesaria y/o suficiente para excitar un fluoroforo a un estado tal que el fluoroforo emitira una longitud de onda de luz diferente (tal como mas larga) que la longitud de onda de luz de la senal de excitacion.
Fluorescencia es la emision de radiacion visible por un atomo o molecula que pasa de un estado electronico superior a inferior, en la que el intervalo de tiempo entre la absorcion y la emision de energfa es de 10-8 a 10-3 segundos. La fluorescencia se produce cuando el atomo o molecula absorbe energfa de una fuente de excitacion (p. ej., una lampara de ultravioleta) y despues emite la energfa como radiacion visible.
Hibridacion in situ fluorescente (FISH): La FISH es una tecnica que se usa para detectar y localizar la presencia o ausencia de secuencias de ADN espedficas en los cromosomas. El FISH usa sondas fluorescentes que se unen solo a las partes del cromosoma con las que muestran un alto grado de similitud de secuencia. El FISH tambien puede usarse para detectar secuencias de ARNm particulares dentro de las muestras de tejido.
Un grupo funcional es un grupo espedfico de atomos dentro de una molecula que es responsable de las reacciones qmmicas caractensticas de la molecula. Los grupos funcionales de ejemplo incluyen, sin limitacion, alcano, alqueno, alquino, areno, halo (fluoro, cloro, bromo, yodo), epoxido, hidroxilo, carbonilo (cetona), aldelddo, ester carbonato, carboxilato, eter, ester, peroxi, hidroperoxi, carboxamida, amina (primaria, secundaria, terciaria), amonio, imida, azida, cianato, isocianato, tiocianato, nitrato, nitrito, nitrilo, nitroalcano, nitroso, piridilo, fosfato, sulfonilo, sulfuro, tiol (sulfidrilo), disulfuro,
Compuestos heteroarilo son compuestos aromaticos que tienen al menos un heteroatomo, es decir, uno o mas atomos de carbono en el anillo se han reemplazado con un atomo que tiene al menos un par libre de electrones, tfpicamente nitrogeno, oxfgeno, o azufre.
Intercalacion: Termino que se refiere a la insercion de un material (p. ej., un ion o molecula) dentro de la microestructura de otro material. Por ejemplo, el psoraleno puede insertarse o intercalarse dentro del surco menor de una helice de ADN bicatenario.
Lexitropsina: Miembro de una familia de analogos de los antibioticos naturales netropsina y distamicina.
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Engarzador: Molecula o grupo de atomos situada entre dos restos. Por ejemplo, un conjugado de punto cuantico- resto de union a ADN puede incluir un engarzador entre el punto cuantico y una molecula de union a ADN. Tfpicamente, los engarzadores son bifuncionales, es decir, el engarzador incluye un grupo funcional en cada extremo, en el que los grupos funcionales se usan para acoplar el engarzador a los dos restos. Los dos grupos
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funcionales pueden ser los mismos, es dedr, un engarzador homobifuncional, o diferentes, es dedr, un engarzador heterobifuncional.
Resto: Un resto es un fragmento de una molecula, o una porcion de un conjugado.
Deteccion multiple: Deteccion de multiples dianas en una muestra de forma sustancialmente simultanea o secuencial, segun se desee, usando varios conjugados diferentes. La deteccion multiple puede incluir identificar y/o cuantificar acidos nucleicos, generalmente aDn, ARN, peptidos, protemas, tanto de forma individual como en cualquiera y en todas las combinaciones. La deteccion multiple tambien puede incluir detectar dos o mas de un gen, un mensajero y una protema en una celula en su contexto anatomico.
Nanomaterial: Material con aspectos morfologicos y/o propiedades especiales procedentes de sus dimensiones nanometricas (es decir, que tienen una dimension que es menor de 100 nm). Los nanomateriales estan constituidos rtpicamente por nanopartfculas. Las nanoparrtculas de un material dado pueden tener propiedades muy diferentes en comparacion con partfculas mayores del mismo material. Por ejemplo, las sustancias opacas pueden hacerse transparentes (p. ej., el cobre), los materiales inertes pueden hacerse catalrticos (p. ej., el platino, el oro), los materiales estables (p. ej., el aluminio) pueden hacerse combustibles, los aislantes pueden hacerse conductores (p. ej., la silicona), etc.
Nanopartfcula: Partfcula nanometrica con un tamano que se mide en nanometros, por ejemplo, una partfcula nanoscopica que tiene al menos una dimension de menos de 100 nm. Los ejemplos de nanoparrtculas incluyen nanopartfculas paramagneticas, nanopartfculas superparamagneticas, nanoparrtculas metalicas, nanopartfculas metaloides, nanopartfculas de oxido metalico, materiales de tipo fulereno, nanotubos inorganicos, dendnmeros (tales como con quelatos metalicos unidos de forma covalente), nanofibras, nanocuernos, nanocebollas, nanobastones, nanoprismas, nanocuerdas y puntos cuanticos Una nanoparrtcula puede producir una senal detectable, por ejemplo, a traves de la absorcion y/o emision de fotones (incluyendo radiofrecuencia y fotones visibles) y resonancia de plasmon.
Acido peptidonucleico: Polfmero artificial que comprende una cadena principal de unidades de repeticion de N-(2- aminoetil)glicina ligadas mediante enlaces peprtdicos. Varias bases de purina y pirimidina, B, estan ligadas a la cadena principal mediante enlaces metilencarbonilo.
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Fotoblanqueo: Hacerse menos absorbente, reflectante o fluorescente tras la exposicion a la luz; blanquearse o decolorarse mediante la exposicion a la luz. El fotoblanqueo se refiere a la degradacion o la destruccion fotoqmmica de un fluoroforo.
Fotoestable: Estable frente al cambio fotoqmmico. Tal como se usa en el presente documento, fotoestable significa que la senal detectable no disminuye a lo largo del tiempo con la exposicion a la luz.
Sonda: Acido nucleico aislado, oligonucleotido sintetico aislado, unido a un molecula marcadora o indicadora detectable. Los marcadores rtpicos incluyen isotopos radioactivos, sustratos enzimaticos, cofactores, ligandos, agentes quimioluminiscentes o fluorescentes, haptenos y enzimas. Se discuten metodos para el marcaje y orientacion en la eleccion de marcadores apropiados para diversos fines, p. ej., en Sambrook et al. (En: Molecular Cloning: A Laboratory Manual, CSHL, New York, 1989) y Ausubel et al. (En: Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publ. Assoc. y Wiley-Intersciences, 1992).
Un experto habitual en la materia apreciara que la especificidad de una sonda particular aumenta con su longitud. Por tanto, pueden seleccionarse sondas para proporcionar una especificidad adecuada y pueden comprender al menos 17, 20, 23, 25, 30, 35, 40, 45, 50 o mas nucleotidos consecutivos de la secuencia de nucleotidos deseada. En ejemplos particulares, las sondas pueden ser de al menos 100, 250, 500, 600 o 1000 nucleotidos consecutivos de la secuencia de nucleotidos deseada.
Punto cuantico: Partfcula nanometrica que presenta propiedades electronicas y opticas dependientes del tamano debido al confinamiento cuantico. Se han construido puntos cuanticos, por ejemplo, de materiales semiconductores (p.ej., selenuro de cadmio y sulfuro de plomo) y de cristalitos (cultivados por medio de epitaxia de haces moleculares), etc. Hay una variedad de puntos cuanticos que tienen diversas qmmicas superficiales y caractensticas
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de fluorescencia disponibles comercialmente de Invitrogen Corporation, Eugene, OR (veanse, por ejemplo, las patentes de EE.UU. n.° 6.815.064. 6.682.596 y 6.649.138). Tambien hay puntos cuanticos disponibles comercialmente de Evident Technologies (Troy, NY). Otros puntos cuanticos incluyen puntos cuanticos de aleaciones tales como puntos cuanticos de ZnSSe, ZnSeTe, ZnSTe, CdSSe, CdSeTe, ScSTe, HgSSe, HgSeTe, HgSTe, ZnCdS, ZnCdSe, ZnCdTe, ZnHgS, ZnHgSe, ZnHgTe, CdHgS, CdHgSe, CdHgTe, ZnCdSSe, ZnHgSSe, ZnCdSeTe, ZnHgSeTe, CdHgSSe, CdHgSeTe, InGaAs, GaAlAs, e InGaN (se desvelan puntos cuanticos de aleacion y metodos para fabricar los mismos, por ejemplo, en la publicacion de EE.UU. n.° 2005/0012182 y la publicacion PCT WO 2005/001889).
Muestra: el termino “muestra” se refiere a cualquier sustancia (o material) lfquida, semisolida o solida dentro o sobre la cual puede estar presente una diana. En particular, una muestra puede ser una muestra biologica o una muestra obtenida a partir de un material biologico. Los ejemplos de muestras biologicas incluyen muestras de tejido y muestras citologicas. En algunos ejemplos, la muestra biologica se obtiene a partir de un sujeto animal, tal como un sujeto humano. Una muestra biologica es cualquier muestra solida o muestra de fluido obtenida de, excretada por o segregada por cualquier organismo vivo, incluyendo sin limitacion, organismos unicelulares, tales como bacterias, levaduras, protozoos, y amebas entre otros, organismos pluricelulares (tales como plantas o animales, incluyendo muestras de un sujeto humano sano o aparentemente sano o un paciente humano afectado por una afeccion o enfermedad para su diagnostico o investigacion, tal como el cancer. Por ejemplo, una muestra biologica puede ser un lfquido biologico obtenido de, por ejemplo, sangre, plasma, suero, orina, bilis, lfquido asdtico, saliva, lfquido cefalorraqmdeo, humor acuoso o humor vftreo, o cualquier secrecion corporal, un trasudado, un exudado (por ejemplo, lfquido obtenido de un absceso o cualquier otro sitio de infeccion o inflamacion), o lfquido obtenido de una articulacion (por ejemplo, una articulacion normal o una articulacion afectada por una enfermedad). Una muestra biologica tambien puede ser una muestra obtenida de cualquier organo o tejido (incluyendo una muestra de biopsia o autopsia, tal como una biopsia tumoral) o puede incluir una celula (ya sea una celula primaria o una celula cultivada) o un medio acondicionado por cualquier celula, tejido u organo. En algunos ejemplos, una muestra biologica es un extracto nuclear. En algunos ejemplos, una muestra biologica es un citoplasma bacteriano. En otros ejemplos, una muestra es una muestra de ensayo. Por ejemplo, una muestra de ensayo es una celula, un tejido o sedimento celular preparado a partir de una muestra biologica obtenida de un sujeto. En un ejemplo, el sujeto es una que esta en riesgo o ha adquirido una afeccion o enfermedad particular.
Colorante: Cualquier entidad biologica o qmmica que, cuando se aplica a las moleculas diana en la muestra biologica, hace a las moleculas detectables al examen microscopico. Los colorantes incluyen, sin limitacion, sondas de acidos nucleicos, anticuerpos, colorantes y otros reactivos detectables que, en combinacion o por sf mismos resultan en un producto final coloreado (mediante metodologfas de deteccion por fluorescencia o campo claro). Un colorante de contraste es un colorante de un color que contrasta, o un colorante que se aplica hacer mas discernibles los efectos de otro colorante.
Tejido: Coleccion de celulas interconectadas que realizan una funcion similar dentro de un organismo. Cualquier coleccion de celulas que puede montarse sobre un portaobjetos de cristal para microscopio convencional incluyendo, sin limitacion, secciones de organos, secciones de tumor, fluidos corporales, frotis, secciones congeladas, preparaciones citologicas, y lmeas celulares.
II. Nanomateriales
Los nanomateriales, tales como puntos cuanticos, nanocristales y nanopartfculas proporcionan ventajas exclusivas sobre sus homologos fluoroforos de molecula pequena debido a sus propiedades opticas y electronicas dependientes de sus caractensticas estructurales y qmmicas. Los nanomateriales tales como los nanocristales semiconductores poseen propiedades opticas tales como absorcion optica de amplio espectro, un gran desplazamiento de Stokes, espectro de emision estrechos y/o altos rendimientos cuanticos fotoestables. Esto permite que los nanomateriales sean excelentes indicadores opticos. Debido a los estrechos espectros de emision, los nanocristales pueden diferenciarse por sus distintivos opticos y pueden usarse en ensayos fluorescentes de deteccion multiple con escasa o nula convolucion de la senal fotoluminiscente. El intervalo espectral de la senal puede oscilar desde el UV hasta dentro del IR cercano.
Los nanomateriales adecuados incluyen puntos cuanticos, nanopartfculas metalicas, y nanopartfculas de oxido metalico. Por ejemplo, las nanopartfculas metalicas proporcionan una tincion optica de contraste del ADN nuclear en microscopfa de campo claro. Los metales adecuados incluyen, pero no se limitan a, oro, plata, paladio, platino, y aleaciones de metales de transicion (p. ej., Au/Ag). Los nanomateriales a base de complejos de metales de transicion, p. ej., las nanopartfculas de tipo azul de Prusia, tambien son adecuados. Los complejos metalicos de tipo azul de Prusia comprenden una estructura cristalina tridimensional que incluye dos tipos de atomos metalicos en una red cristalina de tipo NaCl reticulada con grupos ciano (vease, p. ej., la publicacion de patente de EE.UU. n.° 2010/0133487), los metales de ejemplo incluyen vanadio, cromo, molibdeno, tungsteno, manganeso, hierro, rutenio, cobalto, mquel, platino, y cobre. Las nanopartfculas de oxido metalico, incluyendo alumina, sflice y titanio pueden ser adecuadas. Las nanopartfculas de oxido metalico dopadas con lantanidos fluorescentes tambien pueden usarse en la generacion de imagenes fluorescentes, pero no son adecuadas para la generacion de imagenes de campo claro. Todos estos materiales pueden modificarse para portar los restos de union a ADN y emplearse para detectar y tenir
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ADN nuclear.
Los puntos cuanticos son partmulas nanocristalinas semiconductors y sin limitar la presente invencion para su uso con partmulas emisoras de luz de un tamano particular, miden tipicamente 2-10 nm de tamano. Los puntos cuanticos son fluoroforos estables, suelen ser resistentes al fotoblanqueo y tienen un amplio intervalo de longitud de onda de excitacion y estrechos espectros de emision. Pueden seleccionarse puntos cuanticos que tienen caractensticas de emision particulars, tales como emisiones a longitudes de onda particulars, de modo que pueden usarse varios puntos cuanticos diferentes que tienen varias caractensticas de emision diferentes para identificar varias dianas diferentes.
En algunas realizaciones, los puntos cuanticos estan protegidos por una cubierta de oxido de trioctilfosfina (TOPO, por sus siglas en ingles) unida de forma electrostatica y por un polfmero anfffilo intercalante para inducir solubilidad en agua. Este polfmero tiene aproximadamente 30 grupos amina terminales para su funcionalizacion adicional. Vease E.W. Williams, et al. "Surface-Modified Semiconductive and Metallic Nanoparticles Having Enhanced Dispersibility in Aqueous Media", Patente de EE.UU. n.° 6.649.138. Los grupos amina terminales pueden usarse para conjugar el punto cuantico con un resto de union a ADN.
Los conjugados de puntos cuanticos se caracterizan por rendimientos cuanticos comparables a los colorantes tradicionales mas brillantes disponibles. Ademas, estos fluoroforos a base de puntos cuanticos absorben 10-1000 mas luz que los colorantes tradicionales. La emision a partir de los puntos cuanticos es estrecha y simetrica, lo cual significa que el solapamiento con otros colores se reduce al mmimo, resultando en un flujo mmimo hacia canales de deteccion adyacentes y una interferencia atenuada, a pesar de que pueden usarse muchos mas colores de forma simultanea. Los espectros de emision simetricos y ajustables pueden variarse de acuerdo con el tamano y la composicion del material de las partfculas, lo cual permite una distribucion espacial flexible y cercana de diferentes puntos cuanticos sin un solapamiento espectral sustancial. Ademas, sus espectros de absorcion son amplios, lo cual hace posible excitar de forma simultanea a todas las variantes de color de los puntos cuanticos usando una unica longitud de onda de excitacion, reduciendo asf al mmimo la autofluorescencia de la muestra.
Los microscopios de fluorescencia convencionales son una herramienta economica para la deteccion de conjugados de puntos cuanticos. Dado que los conjugados de puntos cuanticos son practicamente fotoestables, se puede dedicar tiempo con el microscopio a encontrar las regiones de interes y a concentrarse adecuadamente en las muestras.
III. Moleculas que interaccionan con el ADN
La capacidad para dirigir un nanomaterial al ADN nuclear se proporciona conjugando el nanomaterial (p. ej., un punto cuantico) con una molecula pequena que es capaz de interaccionar con el ADN. Las moleculas pequenas que se dirigen a los nanomateriales y los dirigen hacia el ADN pueden ser moleculas organicas, moleculas inorganicas, o complejos de metales de transicion. Estos agentes interaccionan con el ADN a traves de enlaces de hidrogeno, interacciones electrostaticas, fuerzas de van der Waals y/o enlaces covalentes. Pueden clasificarse adicionalmente en categonas basadas en su regioselectividad por el ADN, tales como agentes de union a los surcos menor y mayor, agentes de union a la cadena principal de fosfato, intercalantes y agentes modificadores de bases/alquilantes. Las moleculas pequenas de ejemplo incluyen, pero no se limitan a, agentes de union a los surcos del ADN tales como DAPI y colorante de Hoechst; intercalantes tales como psoraleno, naftalendiimida y SYBR101 (un colorante fluorescente, disponible de Invitrogen Corporation), y modificadores de las bases del ADN tales como psoraleno. Algunas moleculas que interaccionan con el ADN interaccionan a traves de una combinacion de mecanismos, es decir, union al surco menor e intercalacion, intercalacion y alquilacion y otras combinaciones. Las moleculas de ejemplo incluyen lexitropsinas, combilexinas, acidos peptido nucleicos e inhibidores de la topoisomerasa I (p. ej., indenoisoquinolinas). (Vease, p. ej., Pindur et al., Current Medicinal Chemistry, 2005, 12:2805-2847.)
A. Agentes de union al surco menor
Las moleculas pequenas que se unen al surco menor incluyen, pero no se limitan a, DAPI, los colorantes de Hoechst, distamicina A, netropsina, actinomicina D, lexitropsinas, combilexinas, poliamidas de W-metil pirrol y W-metil imidazol. Los colorantes de Hoechst son una familia de bis-bencimidas. La estructura de un colorante de Hoechst, Hoechst 33342, se muestra a continuacion:
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Otro colorante de Hoechst comun es el Hoechst 33258, que difiere del Hoechst 33342 porque tiene un hidrogeno en lugar del grupo etilo.
El DAPI, o 4',6-diamidino-2-fenilindol, es otro agente de union al surco menor:
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DPI se asocia con los grupos de nucleotidos AT en el surco menor del ADN bicatenario y puede usarse como un colorante de contraste nuclear. El DAPI produce fluorescencia azul; sin embargo, al igual que otros colorantes fluorescentes, el DAPI sufre degradacion fotoinducida de la intensidad de fotoluminiscencia a lo largo del tiempo.
La alta afinidad del DAPI por el surco menor del ADN puede utilizarse para dirigir un punto cuantico hacia el ADN nuclear, produciendo ADN tenido con puntos cuanticos en celulas y tejido fijados. De manera destacable, el patron y morfologfa de tincion de los nucleos es similar a la tincion de DAPI (fig. 3A-B). El examen espectroscopico de la tincion muestra tanto la senal optica sucinta del punto cuantico como el amplio distintivo indicativo del colorante organico, DAPI. La ventaja de este conjugado es que proporciona una tincion y morfologfa nucleares muy similares al DAPI, a la vez que posee la senal fotoestable del punto cuantico.
B. Intercalantes de ADN
Los intercalantes son moleculas que interaccionan con el ADN insertandose entre las bases del ADN bicatenario; se mantienen en su posicion mediante fuerzas de van der Waals. Los ejemplos de intercalantes de ADN incluyen, pero no se limitan a, actinomicina D, combilexinas, psoraleno y naftalendiimida (NDI):
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Ester NHS de naftalendiimida
Ester NHS de psoraleno
La conjugacion de puntos cuanticos con estas moleculas resulta en tincion nuclear. La intensidad de la tincion depende, al menos en parte, del intercalante particular y de las concentraciones del conjugado aplicado a la muestra de celula o tejido.
El punto cuantico de psoraleno demuestra una alta afinidad por el ADN nuclear en el tejido. La tincion muestra las caractensticas morfologicas del nucleo. A una concentracion de 100 nM, el nucleo esta claramente delimitado del tejido circundante (vease, p. ej., la fig. 4).
Se observa aun mayor especificidad y afinidad por el ADN nuclear cuando se conjuga un punto cuantico con naftalendiimida. Se observan delimitacion y morfologfa distintas a concentraciones de 50 nM y mayores (vease, p. ej., la fig. 5). Las concentraciones cercanas a 25 nM tinen adecuadamente el lfmite periferico del nucleo y muestran cierto grado de morfologfa nuclear. De hecho, concentraciones de solo 6 nM son capaces de tenir el nucleo y diferenciarlo del tejido circundante. Por tanto, los conjugados de punto cuantico-naftalendiimida son utiles para la tincion de contraste nuclear en tejidos fijados a concentraciones mayores de 5 NM, mayores de 20 nM, o mayores de 50 nM, tales como concentraciones que oscilan de 5 nM a 100 nM, de 20 nM a 75 nM, o de 25 nM a 50 nM.
El estrecho espectro de emision del punto cuantico permite el uso de la tincion nuclear en conjunto con otras sondas que utilizan puntos cuanticos que emiten fluorescencia a longitudes de onda diferentes. Por ejemplo, cuanto se uso una sonda de punto cuantico-naftalendiimida para tenir tejido prostatico a concentraciones de 25 nM, tambien fueron visibles las sondas de punto cuantico de FISH los ensayos fluorescentes tanto de color doble de TMPRSS2 (3'5' ERG) (Fig. 6) como de color doble de HER2-Chr17 (FIG. 7). Este conjugado de punto cuantico tambien se uso en un ensayo de FISH con cuatro sondas cuanticas TMpRsS2 (3' 5' ERG), ERG, SLC45A3, y ETV1 (fig. 8). En cada uno de estos ensayos, los colorantes de ADN mostraron un rendimiento superior debido a su estabilidad espectral y a su solapamiento de espectros mmimo.
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C. Agentes alquilantes del ADN
Otra ventaja proporcionada por el ligando de psoraleno es la capacidad para unir de forma covalente el punto cuantico a las bases del ADN. Con irradiacion UV (es decir, >350 nm), el psoraleno sufre una cicloadicion 2+2 fotoinducida a la base timidina. Este proceso une de forma covalente el conjugado de punto cuantico-psoraleno al ADN. Otros agentes de union al aDn que son agentes alquilantes incluyen, pero no se limitan a, analogos y derivados de lexitropsinas y poliamidas de pirrol-imidazol (tales como mostazas de nitrogeno) (Pindur et al.).
IV. Preparacion de conjugados de nanomaterial/resto de union a ADN
Los nanomateriales, p. ej., puntos cuanticos, y restos de union a ADN que comprenden al menos una molecula de union o dirigida hacia el aDn, se juntan con tecnicas de condensacion convencionales utilizando restos carboxilo activados y aminas sobre el nanomaterial y/o molecula dirigida hacia el ADN. Algunas moleculas de union a ADN pueden usarse sin modificacion para preparar conjugados de nanomaterial/resto de union a ADN. Por ejemplo, succinimidil-[4-(psoralen-8-iloxi)] butirato, un derivado del psoraleno, esta disponible comercialmente y puede usarse sin ninguna modificacion adicional.
En algunas realizaciones, se modifica un resto de union a ADN para facilitar la conjugacion con un nanomaterial, tal como un punto cuantico o una nanopartfcula metalica. Para facilitar mas la conjugacion, el nanomaterial tambien puede modificarse para incluir grupo(s) funcional(es) adecuados para la conjugacion. Por ejemplo, los puntos cuanticos pueden incluir una capa pasivante funcionalizada externa que comprende grupos amino. Las nanopartfculas metalicas pueden incluir, de forma similar, una capa funcionalizada externa que comprende grupos funcionales (p. ej., amino, ciano, tiol, carboxilo etc.) adecuada para su conjugacion con una molecula de union a ADN.
En una realizacion particular, la modificacion de un resto de union a ADN para incluir un grupo funcional ester de N- hidroxisuccinimida permite la conjugacion de la molecula de union a ADN con un punto cuantico por medio del resto de ester NHS y un grupo amino del punto cuantico. La fig. 9 ilustra un esquema sintetico general para la adicion de restos ester NHS a restos de union a ADN, p. ej., naftalendiimida Los Ri y R2 son independientemente una cadena alifatica sustituida o sin sustituir, aromatica sustituida o sin sustituir, heteroaromatica, o de polialquilheteroatomo tal como una cadena de oxido de alquileno (p. ej., un polialquilenglicol).
El resto ester NHS puede reaccionar con un grupo amina primaria sobre la superficie de un punto cuantico, formando un conjugado de punto cuantico-resto de union a ADN, tal como se muestra a continuacion, donde "DBM" representa un resto de union a ADN y "QD" representa un "punto cuantico" (siglas en ingles).
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Tal como se muestra en la fig. 10, un ester succinimidilo de psoraleno puede reaccionar con un grupo amina primaria sobre la superficie de un punto cuantico para proporcionar un conjugado de punto cuantico-psoraleno.
En otra realizacion, puede modificarse un resto de union a ADN para incluir un resto ester de tetrafluorofenilo (TFP, por sus siglas en ingles). El resto ester TFP puede reaccionar con un grupo amina primaria sobre la superficie del punto cuantico, formando un conjugado de punto cuantico-resto de union al ADN.
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En otra realizacion, puede modificarse un resto de union a ADN para incluir un resto ester de 4-sulfo-2,3,5,6- fluorofenilo (STP). El resto ester STP puede reaccionar con un grupo amina primaria sobre la superficie del punto cuantico, formando un conjugado de punto cuantico-resto de union al ADN.
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En otra realizacion mas, puede modificarse un resto de union a ADN para incluir un resto de cloruro de sulfonilo. El de cloruro de sulfonilo puede reaccionar con un grupo amina primaria sobre la superficie del punto cuantico, formando un conjugado de punto cuantico-resto de union al ADN.
dbmso2ci + qdnh2 -» dbmso2-nhqd + HCI
Tambien pueden emplearse otras transformaciones qmmicas que son adecuadas en un entorno acuoso, p. ej., con NDI-C6 (naftalendiimida con un engarzador C6). Otros metodos de acoplamiento adecuados se describen, p. ej., por Hermanson (Bioconjugate Techniques, segunda edicion, 2 de mayo de 2008). La purificacion de conjugados a partir de moleculas que interaccionan con el ADN libres puede hacerse con cromatograffa de exclusion por tamano.
En algunas realizaciones, el conjugado de punto cuantico-resto de union a ADN incluye un engarzador entre el punto cuantico y la molecula de union a ADN. El engarzador proporciona distancia entre el punto cuantico y la molecula de union a ADN y puede reducir restricciones estructurales, facilitando asf la union del conjugado al ADN. Puede usarse cualquier engarzador conocido actualmente para este proposito, o desarrollado en el futuro, para formar realizaciones de los conjugados que se desvelan. Los engarzadores utiles pueden ser tanto homo como heterobifuncionales.
Una primera clase de engarzadores adecuados incluye compuestos alifaticos, tales como cadenas de hidrocarburo alifatico que tienen uno o mas sitios de insaturacion, o cadenas alquilo. La cadena alifatica tambien incluye tfpicamente grupos funcionales terminales que facilitan el acoplamiento a una molecula de union a ADN. La longitud de la cadena puede variar, pero tfpicamente tiene una longitud de 1-30 atomos de carbono. Sin embargo, Un experto en la tecnica apreciara que, si un engarzador particular tiene mas de 30 atomos y aun opera de forma eficaz para ligar una nanopartfcula a una molecula de union a ADN y el conjugado aun funciona de la forma deseada, entonces, dichos ligamientos de cadena estan dentro del alcance de la presente divulgacion.
Una segunda clase de engarzadores utiles para practicar realizaciones de la presente divulgacion incluye oxidos de alquileno. Los oxidos de alquileno se representan en el presente documento mediante referencia a glicoles, tales como etilenglicoles. En algunas realizaciones, es util que la hidrofilicidad del engarzador aumente en relacion con la longitud de cadena de su cadena de hidrocarburo. Un experto en la tecnica apreciara que, a medida que aumenta el numero de atomos de oxfgeno, tambien puede aumentar la hidrofilicidad del compuesto. Por tanto, los engarzadores de la presente invencion pueden tener una formula de (-OCH2CH2-)n en la que n es de alrededor de 2 a alrededor de 15, pero mas particularmente es de alrededor de 2 a alrededor de 8. En la publicacion de EE.UU. n.° 2006/0246524 y en la publicacion de EE.UU. n.° 2007/0117153, se describen engarzadores heterobifuncionales que pueden ser utiles para llevar a la practica ciertas realizaciones desveladas de la presente invencion. Se han sintetizado y conjugado con puntos cuanticos engarzadores que contienen psoraleno y naftalendiimida (NDI) (mostrados a continuacion).
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En algunas realizaciones, la sensibilidad y selectividad del colorante de punto cuantico aumenta mediante el uso de engarzadores de ramification multifuncional a los cuales se unen de forma covalente una pluralidad de moleculas de union a ADN. En algunas realizaciones, los engarzadores son engarzadores bis a los cuales se ligan dos moleculas 5 de union a ADN. En ciertas realizaciones, el engarzador bis incluye dos cadenas de polietilenglicol ligadas a un resto comun tal como un ester de W-hidroxisuccinimida. Las cadenas de polietilenglicol tienen una formula PEGn en la que n es 1-50, tal como 4 u 8. En una realization particular, el engarzador tiene la siguiente estructura qmmica.
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En algunas realizaciones, un punto cuantico puede conjugarse con el engarzador multifuncional por medio de una reaction de condensation con el resto de W-hidroxisuccinimida del engarzador. Los engarzadores ramificados aumentan la concentration local de moleculas de union a ADN, aumentando asi la afinidad por el ADN nuclear. Los ejemplos de engarzadores bis que contienen psoraleno y naftalendiimida (NDI) tienen las siguientes estructuras.
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La conjugation de un nanocristal con un maximo de emision en la region de menor longitud de onda del espectro visible con una molecula de union al ADN proporciona un sustitutivo a base de nanomateriales fotoestable para 20 colorantes de contraste del ADN comunes tales como los colorantes de acidos nucleicos DAPI y de Hoechst. Los conjugados finales pueden usarse para dirigir y unir el nanomaterial a un ADN bicatenario. Cuando se usa un nanocristal semiconductor como nanomaterial, la fotoluminiscencia del punto cuantico y, posiblemente, de la molecula de union al ADN senalaran la union del conjugado al ADN. Si este conjugado se aplica al ADN que se encuentra en el nucleo de una celula, el conjugado se unira de forma selectiva a la cromatina del nucleo, 25 proporcionando visualization del ADN dentro del nucleo. Esto proporciona una detection, delimitation y morfologia
fluorescentes del nucleo.
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Los puntos cuanticos disponibles comercialmente con maximos de emision alrededor de 490 nm sirven como un nanomaterial apropiado que se corresponde estrechamente con los maximos espectrales de los colorantes de ADN comunes. Estos nanocristales conjugados con las moleculas que interaccionan con el ADN, tales como derivados de naftalendiimida y psoraleno, proporcionan una tincion nuclear del ADN en el tejido que se corresponde y sobrepasa el rendimiento de los colorantes de contraste DAPI y de Hoechst. Las ventajas del sistema de nanocristales semiconductores se basan en las propiedades fotoffsicas del nanomaterial. Por ejemplo, el espectro de fotoluminiscencia de un punto cuantico de 490 nm es estrecho y no solapa de forma significativa con el espectro de los puntos cuanticos de 565 o de cualquier punto cuantico de frecuencia inferior (fig. 11), superando asf el solapamiento de fluorescencia espectral intrmseco de los colorantes organicos de ADN. Por el contrario, pueden emplearse puntos cuanticos emisores de mayor longitud de onda en conjunto con restos de union a ADN para delimitar el nucleo en tejido fijado. Por tanto, pueden utilizarse puntos cuanticos con propiedades fotoluminiscentes fuera de los espectros de emision de los colorantes de FISH (hibridacion in situ fluorescente) sin convolucion de las senales de FISH.
Otra ventaja es la estabilidad de la senal fotoluminiscente. Se sabe que los fluoroforos comunes sucumben al fotoblanqueo, lo cual resulta en intensidad reducida y cambios en los distintivos espectrales de una materia de segundos a minutos. Sin embargo, en algunas realizaciones, los conjugados de punto cuantico-molecula de union a ADN no muestran cambios en la intensidad o frecuencia de la emision en excitacion continua para un exceso de 30 minutos. Esta ventaja se alcanza totalmente en conjunto con ensayos que usan puntos cuanticos complementarios espectralmente tales como el ensayo de punto cuantico de TMPRSS2 de prostata (fig. 12). Esta tecnologfa tiene aplicacion para una variedad de ensayos fotoluminiscentes de campo oscuro, incluyendo la deteccion del a base de puntos cuanticos del gen HER2 en tejido mamario (fig. 13). La estabilidad de la senal del conjugado permite la preparacion de portaobjetos para archivo de muestras de tejido fijado con nucleos visualizados, superando asf la desventaja intrmseca del DAPI.
La tincion nuclear a base de puntos cuanticos tambien sirve como un marcador de nucleos fluorescente que puede usarse en conjunto con las tecnicas de generacion de imagenes de pseudo hematoxilina y eosina. Aqrn el QD490, o cualquier otro nanocristal semiconductor, proporcionan la tincion equivalente a la hematoxilina. Esto proporciona el campo pseudo claro de las imagenes de campo oscuro de los ensayos de FISH fluorescentes (fig. 14-15).
V. Preparacion de la muestra
Las muestras de tejido que se describen en el presente documento pueden prepararse usando cualquier metodo conocido actualmente o desarrollado de aqrn en adelante en la tecnica. En general, las muestras de tejido se preparan fijando e incluyendo el tejido en un medio.
En algunos ejemplos, se usa un medio de inclusion. Un medio de inclusion es un material inerte en el cual se incluyen tejidos y/o celulas para conservarlos para futuros analisis. La inclusion tambien permite cortar las muestras de tejido en secciones finas. Los medios de inclusion incluyen, pero no se limitan a, parafina, celoidina, compuesto OCT™, agar, plasticos, o acnlicos.
Numerosos medios de inclusion son hidrofobos; por tanto, puede ser necesario eliminar el material inerte antes del analisis histologico o citologico, el cual utiliza fundamentalmente reactivos hidrofilos. El termino desparafinacion o desparafinado se usa ampliamente en el presente documento para referirse a la eliminacion parcial o total de cualquier tipo de medio de inclusion de una muestra biologica. En algunas realizaciones, las secciones incluidas en parafina se desparafinan usando detergentes acuosos y calor.
El proceso de fijacion de una muestra puede variar. La fijacion de una muestra de tejido conserva los constituyentes celulares y tisulares en un estado lo mas parecido posible al vivo y permite someterlos a procedimientos preparatorios sin cambios significativos. La fijacion detiene los procesos de autolisis y descomposicion bacteriana que comienzan tras la muerte celular y estabiliza los constituyentes celulares y tisulares para que resistan las etapas posteriores del procesamiento tisular, tales como para la IHQ o la HIS.
Los tejidos pueden fijarse mediante cualquier proceso adecuado, incluyendo la perfusion o mediante la inmersion en un fijador. Los fijadores pueden clasificarse en agentes reticulantes (tales como aldehndos, p. ej., formaldehndo, paraformaldehndo y glutaraldehndo, asf como agentes reticulantes no aldehndos), agentes oxidantes (p. ej., complejos e iones metalicos, tales como tetroxido de osmio y acido cromico), agentes desnaturalizantes de protemas (p. ej., acido acetico, metanol, y etanol), fijadores de mecanismo desconocido (p. ej., cloruro mercurico, acetona y acido pfcrico), reactivos de combinacion (p. ej., fijador de Carnoy, metacarn, lfquido de Bouin, fijador B5, lfquido de Rossman y lfquido de Gendre), microondas y fijadores diversos (p. ej., fijacion por volumen excluido y fijacion por vapor). Tambien pueden incluirse aditivos en el fijador, tales como tampones, detergentes, acido tanico, fenol, sales metalicas (tales como cloruro de cinc, sulfato de cinc y sales de litio) y lantano.
El fijador usado mas frecuentemente para preparar muestras para IHQ es el formaldefndo, generalmente en forma de una solucion de formalina (formaldehndo al 4 % en una solucion tampon, denominado como formalina tamponada al 10 %). En un ejemplo, el fijador es formalina tamponada neutra al 10 %.
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En multiples casos, se ha demostrado que el tejido sobrefijado (fijado durante duraciones mayores de 48 horas) proporciona una mayor cantidad de autofluorescencia de fondo que el tejido fijado durante ~24 horas. La intensidad de senal del colorante nuclear de punto cuantico cae significativamente (aproximadamente 30-50 %) en muestras que exceden las 48 horas de tiempo de fijacion, en comparacion con los tejidos fijados entre 24-48 horas.
Debido al tamano de un conjugado de punto cuantico, los nucleos en las celulas y tejidos fijados no son accesibles normalmente. Para permitir que el punto cuantico entre en el nucleo y tina el ADN, hay que pretratar el tejido con una proteasa. La duracion y concentracion del tratamiento de proteasa, en conjunto con la concentracion del conjugado de punto cuantico, determina el grado de la tincion del nucleo. En la mayona de los tejidos, un tratamiento de 4-8 minutos con la proteasa (p. ej., proteasa III) es suficiente para permitir la delimitacion del nucleo con el colorante de tincion de punto cuantico en el tejido fijado.
Ademas de la airngdala, con el conjugado QD490:NDI-C6 se han tenido xenotrasplantes de mama y tejido prostatico, tejidos de cuello de utero y de pulmon. Ambos tejidos muestran una excelente tincion con una cantidad minima de fondo (fig. 16-17).
VI. Determinaciones de la textura
La distribucion de los cromosomas o el ADN en los nucleos de las celulas puede determinarse de forma cualitativa y/o cuantitativa usando un ordenador y tecnicas de analisis de imagen. (Vease, p. ej., Rodenacker, et al., Analytical Cellular Pathology (2003) 25:1-36.) Estas determinaciones, o aspectos, pueden usarse para detectar signos precoces de comportamiento celular anomalo y/o diagnosticar cancer, asf como predecir resultados y pronosticos de pacientes.
Los aspectos que parecen tener el mayor poder discriminatorio son los aspectos de la textura. Dichos aspectos describen de forma cuantitativa la variacion de la intensidad del patron de la cromatina en el nucleo celular. Los aspectos de la textura de la cromatina usados mas ampliamente se basan en una evaluacion estadfstica o probabilfstica de los niveles de gris en la imagen microscopica reproducida.
Recientemente se ha introducido una nueva clase de aspectos de textura basada en una segmentacion estructural de los agregados de cromatina (vease, p. ej., la patente de EE.UU: n.° 7.574.304). En esta estrategia, se hace un analisis informatico de las partfculas claras y oscuras de los aspectos de una imagen nuclear. En la bibliograffa pueden encontrarse numerosos aspectos para caracterizar el tamano, forma, lfmites y textura de los objetos de la imagen. Aunque estos aspectos se desarrollaron para el fin de caracterizar los nucleos celulares, pueden aplicarse de forma mas general a cualquier objeto de imagen, incluyendo partfculas nucleares segmentadas.
Algunos aspectos que pueden aplicarse en las realizaciones de la presente divulgacion incluyen aspectos morfometricos (p. ej., area, penmetro, factor G), aspectos densitometricos (p. ej., volumen, valor de gris medio, dinamica de mmimos regional), aspectos de la textura (p. ej., area superficial) y aspectos contextuales (tales como distancia al lfmite nuclear). Con al ultimo caso, los aspectos contextuales se analizan informaticamente a partir de (i) un grafo de vecindad definido sobre las partfculas oscuras; (ii) un grafo de vecindad definido sobre las partfculas claras; y/o (iii) un grafo de vecindad definido tanto sobre las partfculas claras como las partfculas oscuras. El tipo preferido de grafo de vecindad es el grafo de Delaunay. Para un grafo dado, puede definirse una matriz de coaparicion para cada aspecto de una partfcula y vecinas relacionadas en un espacio bidimensional digitalizado. Por ejemplo, a partir del histograma de areas de partfculas oscuras y del grafo de vecindad definido sobre estas partfculas, es posible construir una matriz tal que la entrada en la fila i y en la columna j representa el numero de veces que una partfcula de area i esta adyacente a una partfcula de area j. Para mantener el tamano de matriz manejable y/o evitar tener una matriz dispersa, puede reducirse el numero de intervalos del histograma del aspecto en consideracion. Para cada matriz de coaparicion, los aspectos de la matriz de coaparicion pueden analizarse informaticamente y usarse como aspectos del nucleo. Una vez que se han analizado informaticamente dichos aspectos, se usan algoritmos convencionales de reconocimiento de patrones para la seleccion de aspectos y el entrenamiento del clasificador. Pueden aplicarse al problema algoritmos tales como analisis discriminado, redes neuronales artificiales y/o maquinas de vectores de soporte al problema en una rutina de ensayo/entrenamiento/validacion bien conocida para los expertos en la tecnica. El resultado de dicho diseno clasificador es generalmente una curva de la caractenstica operativa del receptor (COR) que resume la sensibilidad y especificidad de las compensaciones disponibles para el sistema. Una ventaja de la presente divulgacion sobre la tecnica previa es que las determinaciones de los aspectos que son de entrada a dichos sistemas de reconocimiento de patrones son de mucha mas alta calidad de lo que era posible con colorantes de contraste nucleares menos espedficos. Esto se traduce en determinaciones mas precisas, mejor sensibilidad y especificidad de las COR y, por tanto, ensayos diagnosticos, predictivos y/o pronosticos mas potentes.
VII. Kits
Las realizaciones de un kit para realizar la visualizacion del nucleo incluyen un conjugado de nanomaterial/ resto de union a ADN y un tampon de reaccion que tiene una concentracion de sal y un pH suficientes para posibilitar que el conjugado entre en un nucleo dentro de un tejido pretratado con una composicion enzimatica de proteasa. En
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algunas realizaciones, el nanomaterial es una nanopartfcula, tal como una nanopartfcula metalica o un punto cuantico. La molecula de union a ADN puede ser un agente de union al surco menor, un agente de union al surco mayor, un intercalante, un agente alquilante de ADN, o una combinacion de los mismos.
En algunas realizaciones, los kits incluyen ademas una enzima proteasa y un tampon de proteasa que tiene una concentracion de sal y un pH suficientes para permitir que la enzima proteasa presente actividad proteolftica. La enzima proteasa y el tampon de proteasa pueden combinarse y proporcionarse como una composicion de proteasa. Los kits tambien incluyen tfpicamente una hoja de instrucciones para realizar el metodo de visualizacion del nucleo.
VIII. Ejemplos
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Sntesis de NDI-C6-NHS
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En un recipiente de reaccion de 10 ml de microondas CEM con una barra de agitacion se disolvieron 50 mg (0,186 mmol, 1 equivalente, Sigma N818) de dianhidrido 1,4,5,8-naftalentetracarboxflico, 20,3 ml (0,186 mmol, 1 equivalente, Sigma 39030) de N,N-dimetiletilendiamina y 25 ml (0,186 mmol, 1 equivalente, Sigma T0886) de trietilamina en 3 ml de DMF anhidra (EMD Biosciences). La mezcla se calento a 140 °C, con enfriamiento durante la irradiacion para mantener una temperatura de 140 °C, en un microondas CEM Discover durante 5 minutos. Se anadieron a la reaccion 24 mg (0,186 mmol, 1 equivalente, Sigma A2504) de acido 6-aminocaproico y 50 ml (0,372 mmol, 2 equivalentes, Sigma T0886) de trietilamina y se calentaron a 140 °C, con enfriamiento durante 5 minutos mas. La reaccion en bruto se purifico mediante HPLc de fase inversa preparativa (CH3CNTFA 0,05 % 10:90 en gradiente de H2O hasta 90:10 a lo largo de 60 minutos, supervisando a 360 nm). Se aislo un polvo de color pardo en rendimiento del 63 %. Tiempo de retencion analftico del HPLC 5,06 min. RMN 1H (400 MHz, d6-DMSO) 6 9,54 (s, 1 H), 8,69 (s, 4 H), 4,43 (t, J= 5,6 Hz, 2 H), 4,06 (t, J= 7,4 Hz, 2 H), 3,49 (t, J= 5,5 Hz, 3 H), 2,92 (s, 6 H), 2,24 (t, J= 7,3 Hz, 2 H), 1,75-1,63 (m, 2 H), 1,63-1,51 (m, 2 H), 1,39 (dd, J= 15,0, 8,0 Hz, 2 H). RMN 13C (101 MHz, DMSO) 6 174,89, 163,65, 163,06, 130,98, 130,90, 126,95, 126,74, 126,66, 126,58, 55,14, 43,21, 35,90, 33,94, 27,61, 26,48, 24,67. MS (TOF ESI+) m/z 452.1 (M+H).
Compuesto (2)
Se disolvieron 44 mg (0,097 mmol, 1 equivalente) de (1), 12,3 mg (0,107 mmol, 1,1 equivalentes, Sigma 130672) de N-hidroxisuccinimida, 68 ml (0,485 mmol, 5 equivalentes, Sigma T0866) de trietilamina y 107 ml (solucion 1,0 M en diclorometano, 0,107 mmol, 1,1 equivalentes, Sigma 379115) de N,N'-diciclohexilcarbodiimida en 2 ml de diclorometano (Sigma). La reaccion se agito durante 2 horas, se filtro a traves de un embudo de vidrio sinterizado y se concentro al vacfo. El residuo se disolvio en 25 ml de acetato de etilo, se lavo con dos porciones de agua desionizada, se seco sobre sulfato sodico anhidro, se filtro y se concentro hasta dar un aceite de color pardo, con un rendimiento del 90% Tiempo de retencion analftico del HPLC 6,65 min. RMN 1H (400 MHz, CDCh) 6 8,77 (s, 4 H), 4,38 (t, J= 6,7 Hz, 2 H), 4,29-4,16 (m, 2 H), 2,83 (s, 4 H), 2,74 (t, J= 6,5 Hz, 2 H), 2,66 (t, J= 7,4 Hz, 2 H), 2,39 (s, 6 H), 1,84 (tt, J= 15,4, 7,7 Hz, 4 H), 1,57 (dd, J= 15,0, 7,2 Hz, 2 H). RMN 13C (101 MHz, CDCla) 6 169,14, 168,46, 162,99, 162,84, 131,02, 130,98, 126,78, 126,71, 126,62, 56,86, 45,68, 40,49, 38,47, 30,78, 27,52, 26,14, 25,58, 24,23. MS (TOF ESI+) 549,1 (M+H).
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En un recipiente de reaccion de 10 ml de microondas CEM con una barra de agitacion se disolvieron 50 mg (0,186 mmol, 1 equivalente, Sigma N818) de dianhidrido 1,4,5,8-naftalentetracarboxflico, 20,3 ml (0,186 mmol, 1 equivalente, Sigma 39030) de N,N-dimetiletilendiamina y 25 ml (0,186 mmol, 1 equivalente, Sigma T0886) de trietilamina en 3 ml de N,N-dimetilformamida anhidra (EMD Biosciences). La mezcla se calento a 140 °C en un microondas CEM Discover, con enfriamiento durante 5 minutos. Se anadieron a la reaccion 49,4 mg (0,186 mmol, 1 equivalente, QuantaBioDesign 10244) de Amino-dPEG4-COOH y 50 ml (0,372 mmol, 2 equivalentes, Sigma T0886) de trietilamina y se calentaron a 140 °C, con enfriamiento durante 5 minutos mas. La reaccion en bruto se purifico mediante HPLC de fase inversa preparativa (CH3CNTFA 0,05 % 10:90 en gradiente de H2O hasta 90:10 a lo largo de 60 minutos, supervisando a 360 nm). Se aislo un aceite de color pardo en rendimiento del 63 %. Tiempo de retencion analftico del HPLC 5,69 min. MS (TOF ESI+) m/z 586,2 (M+H).
Compuesto (4)
Se disolvieron 69 mg (0,118 mmol, 1 equivalente) de (3), 14,2 mg (0,124 mmol, 1,05 equivalentes, Sigma 130672) de N-hidroxisuccinimida y 24,8 mg (0,130 mmol, 1,1 equivalentes, Sigma 379115) de clorhidrato de N-(3- dimetilaminopropil)-N'-etilcarbodiimida en 2 ml de diclorometano (Sigma). La reaccion se agito durante toda la noche y se concentro al vado. El residuo se disolvio en 25 ml de acetato de etilo, se lavo con dos porciones de agua desionizada y se concentro. Se aislo un aceite de color pardo en rendimiento cuantitativo. Tiempo de retencion analftico del HPLC 6,03 min. MS (TOF ESI+) 683,1 (M+H).
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Esquema 3:
Cr(CH3)3N*CH2CH,NH5
HOOC-C5H10-NH
TEA, DMF
TEA. DMF
|jd , 140 C, 5 -run
uo 140 C, 5 min
HO-Su, EDAC
DCM.t.a., 2 h
Compuesto (5)
En un recipiente de reaccion de 10 ml de microondas CEM con una barra de agitacion se disolvieron 50 mg (0,186 mmol, 1 equivalente, Sigma N818) de dianhidrido 1,4,5,8-naftalentetracarboxflico, 32,6 mg (0,186 mmol, 1 equivalente, Sigma 284556) de clorhidrato de (2-aminoetil)trimetilamonio y 78 ml (0,558 mmol, 3 equivalentes, Sigma T0886) en 3 ml de DMF anhidra (EMD Biosciences). La mezcla se calento a 140 °C en un microondas CEM Discover, con enfriamiento durante 5 minutos. Se anadieron a la reaccion 24 mg (0,186 mmol, 1 equivalente, Sigma A2504) de acido 6-aminocaproico y 78 ml (0,558 mmol, 3 equivalentes, Sigma T0886) de trietilamina y se calentaron a 140 °C, con enfriamiento durante 5 minutos mas. La reaccion en bruto se purifico mediante HPLC de fase inversa preparativa (CH3CNTFA 0,05 % 10:90 en gradiente de H2O hasta 90:10 a lo largo de 60 minutos, supervisando a 360 nm). Se aislo un polvo de color verdoso/pardo en rendimiento del 91 %. Tiempo de retencion del HPLC 6,09 min.
Compuesto (6)
Se disolvieron 79 mg (0,169 mmol, 5 equivalentes) de (5), 23,4 mg (0,203 mmol, 1,2 equivalentes, Sigma 130672) de N-hidroxisuccinimida, 70,8 ml (0,508 mmol, 3 equivalentes, Sigma T0866) de trietilamina y 38,9 mg (0,203 mmol, 1,2 equivalentes, Sigma 379115) de clorhidrato de N-(3-dimetilaminopropil)-N'-etilcarbodiimida en 2 ml de diclorometano (Sigma). La reaccion se agito durante toda la noche y se concentro al vado. El residuo se disolvio en 25 ml de acetato de etilo, se lavo con agua (2 x 25 ml), La fase acuosa se extrajo con 25 ml de diclorometano. Las fases organicas se combinaron y se concentraron. Se aislo un aceite de color pardo en rendimiento cuantitativo. Tiempo de retencion analftico del HPLC 6,94 min.
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Se diluyeron 3 g (19,5 mmol, 1 equivalente, TCI D2554) de acido 3,5-dihidroxibenzoico, 3,89 g (21,4 mmol, 1,1 equivalentes, Fluka 07270) de metil aminohexanoato, 8,14 ml (58,4 mmol, 3,0 equivalentes, Sigma T0886) de trietilamina y 29,2 ml (solucion 1,0 M, 29,2 mmol, 1,5 equivalentes, Sigma 379115) de W,W’-diciclohexilcarbodiimida con 100 ml of diclorometano y se agitaron durante toda la noche. La reaccion en bruto se filtro y se concentro al vado. El residuo se diluyo en acetato de etilo (200 ml) y se lavo con HCl 1 M (200 ml), NaHCO3 saturado (30 ml) y salmuera (15 ml). La solucion se concentro al vado, se hizo pasar a traves de un filtro de jeringa de 0,2 pm y se purifico mediante cromatograffa ultrarrapida en una columna de gel de sflice de 330 g Redisep® (Teledyne Isco, Inc., Lincoln, NE) (gradiente de acetato de etilo:hexanos 5:95 hasta 100:0). Rendimiento del 23 % de un polvo de color blanco Tiempo de retencion analftico del HPLC 4,08 min. RMN 1H (400 MHz, MeOD) 6 6,71 (d, J= 2,2 Hz, 2 H), 6,42 (t, J= 2,2 Hz, 1 H), 4,92 (s, 3 H), 3,66 (s, 3 H), 3,41-3,29 (m, 3 H), 2,35 (t, J= 7,4 Hz, 2 H), 1,64 (ddt, J= 18,4, 14,9, 7,4 Hz, 4 H), 1,47-1,33 (m, 2 H). RMN 13C (101 MHz, MeOD) 6 174,53 (s, 169,19, 158,43, 136,67, 105,29, 105,05, 50,61, 39,31, 33,28, 28,71,26,09, 24,29. MS (TOF ESI+) 282,4 (M+H).
Compuesto (8)
Se diluyeron 695 mg (2,47 mmol, 1 equivalente) de (7), 1,765 g (7,41 mmol, 3 equivalentes) de ferc-butil 3- bromopropilcarbamato y 1,366 g (9,88 mmol, 4 equivalentes, Sigma 310263) de carbonato potasico con 12 ml de W,W-dimetilformamida y se calentaron a 50 °C durante toda la noche. El disolvente se elimino al vado, el residuo se disolvio con acetato de etilo, se lavo con salmuera, se seco sobre sulfato de magnesio anhidro, se filtro y se concentro hasta dar un solido de color blanco. El material bruto se purifico mediante cromatograffa ultrarrapida en columna de 50g Biotage® SNAP column (Biotage, LLC, Charlotte, nC) (gradiente de acetato de etilo:hexanos 12:88 hasta 100:0). Rendimiento del 73 % de un solido de color blanco Tiempo de retencion analftico de HPLC 10,34 min.
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RMN 1H (400 MHz, CDCI3) 6 6,89 (d, J= 2,2 Hz, 2 H), 6,53 (t, J= 2,2 Hz, 1 H), 6,49 (t, J= 5,7 Hz, 1 H), 4,84 (s, 2 H), 4,01 (t, J= 5,9 Hz, 4 H), 3,66 (s, 3 H), 3,44 (dd, J= 13,1, 6,9 Hz, 2 H), 3,31 (dd, J= 12,3, 6,1 Hz, 4 H), 2,33 (t, J= 7,4 Hz, 2 H), 1,96 (p, J= 6,1 Hz, 4 H), 1,65 (tt, J= 15,2, 7,5 Hz, 4 H), 1,51-1,35 (m, 20 H). RMN 13C (101 MHz, CDCI3) 6 174,12, 167,24, 159,95, 156,03, 136,95, 105,61, 104,28, 79,26, 65,86, 51,55, 39,78, 37,78, 33,84, 29,47, 29,21, 28,41, 26,39, 24,44. MS (TOF ESI+) 596,8 (M+H).
Compuesto (9)
Se disolvieron 587 mg (0.99 mmol, 1 equivalente) de (8) en 5 ml de una solucion al 20 % de acido trifluoroacetico en diclorometano y se agitaron a temperatura ambiente durante 2,5 horas. El disolvente se elimino al vado y el residuo se destilo azeotropicamente con tolueno/metanol. Se continuo con el material sin ninguna purificacion adicional. Tiempo de retencion analttico del HPLC 4,77 min. RMN 1H (400 MHz, D2O) 6 6,77 (s, 2 H), 6,59 (s, 1 H), 4,02 (t, J= 5,7 Hz, 4 H), 3,22-3,14 (m, 5 H), 3,08 (t, J= 7,1 Hz, 4 H), 2,20 (t, J= 6,6 Hz, 2 H), 2,02 (dt, J= 12,7, 6,4 Hz, 4 H), 1,44 (d, J= 2,6 Hz, 4 H), 1,19 (dd, J= 14,6, 7,4 Hz, 2 H). RMN 13C (101 MHz, D2O) 6 178,76, 177,34, 169,73, 169,71, 162,89, 162,54, 159,24, 136,18, 117,65, 114,75, 106,06, 104,75, 65,79, 51,93, 48,77, 39,69, 37,32, 33,55, 33,42, 27,92, 27,87, 26,30, 25,52, 25,47, 23,83. MS (TOF ESI+) 418,5 (M+Na).
Compuesto (10)
Se disolvieron 660,4 mg (1,06 mmol, 1 equivalente) de (9), 1,548 g (2,65 mmol, 2,5 equivalentes) de Fmoc-dPEG4- NHS y 553 ml (3,18 mmol, 3 equivalentes, Fluka 03440) de diisopropiletilamina en 5,3 ml de diclorometano y se agitaron a temperatura ambiente durante toda la noche. La reaccion en bruto se purifico mediante cromatograffa ultrarrapida (columna de gel de sflice de 50g Biotage SNAP, gradiente de acetato de etilo:metanol hasta 85:15). Se aislaron 577 g de un aceite de color pardo claro - 41 %. Tiempo de retencion analttico del HPLC 10,51 min. RMN 1H (400 MHz, CDCh) 6 7,75 (d, J= 6,7 Hz, 2 H), 7,60 (d, J= 6,2 Hz, 2 H), 7,50-7,35 (m, 3 H), 7,30 (d, J= 6,4 Hz, 2 H),
6.97 (s, 1 H), 6,50 (s, 1 H), 4,32 (d, J= 5,8 Hz, 2 H), 4,21 (d, J= 5,4 Hz, 1 H), 3,98 (s, 2 H), 3,62 (d, J= 19,2 Hz, 20 H), 3,42 (dd, J= 31,9, 4,0 Hz, 11 H), 3,12 (s, 2 H), 2,53 (d, J= 23,4 Hz, 4 H), 2,29 (s, 1 H), 1,94 (s, 2 H), 1,62 (d, J= 6,6 Hz, 3 H), 1,41 (dd, J= 17,6, 5,6 Hz, 11 H). RMN 13C (101 MHz, CDCh) 6 174,20, 167,34, 161,85, 161,51, 159,91, 157,34, 143,93, 141,22, 136,80, 127,70, 127,08, 125,16, 119,94, 115,39, 105,82, 70,05, 69,80, 67,55, 66,79, 65,90, 53,62, 51,50, 50,62, 47,12, 41,98, 40,61, 39,90, 36,60, 33,88, 29,13, 28,74, 26,47, 25,28, 24,54, 18,53, 17,40, 11,80. MS (TOF ESI+) 1334,8 (M+H).
Compuesto (11)
Se disolvieron 577 mg (0,432 mmol, 1 equivalente) de (10) y 135 ml (0,9 mmol, 2,1 equivalentes) en 2 ml de N,N- dimetilformamida y se agitaron a durante toda la noche. El disolvente se elimino al vado, El residuo se disolvio en agua (50 ml) y se lavo con diclorometano (50 ml9 y acetato de etilo (50 ml). El material en bruto se purifico mediante HPLC de fase inversa preparativa (CH3CNTFA 0,05 % 10:90 en gradiente de H2O hasta 90:10 a lo largo de 60 minutos). Rendimiento aislado, 23,4 % Tiempo de retencion analftico del HPLC 5,37 min. MS (TOF ESI+) 890,6 (M+H). Las figs. 18 y 19 representan respectivamente los espectros de RMN 13C y 1H del compuesto (11).
Compuesto (12)
Se disolvieron 89,9 mg (0,08 mmol, 1 equivalente) de (11), 110,3 mg (0,201 mmol, 2,5 equivalentes) de (2) y 42 ml (0,241 mmol, 3 equivalentes) de diisopropiletilamina en 3 ml de diclorometano y se agitaron a temperatura ambiente durante toda la noche. El material en bruto se purifico mediante HPLC de fase inversa preparativa (CH3CNTFA 0,05 % 30:70 isocratico). RMN 1H (400 MHz, CDCh) 6 7,70 (d, J= 48,5 Hz, 7 H), 7,50 (s, 1 H), 6,91 (s, 2 H), 6,51 (s, 1 H),
3.98 (s, 4 H), 3,85-3,49 (m, 34 H), 3,38 (s, 6 H), 3,13 (s, 3 H), 2,51 (s, 3 H), 2,32 (t, J= 7,4 Hz, 2 H), 1,95 (s, 4 H), 1,71-1,56 (m, 4 H), 1,44-1,33 (m, 2 H). RMN 13C (101 MHz, CDCh) 6 174,23, 172,48, 167,96, 161,29, 160,92, 160,55, 160,18, 160,01, 136,50, 120,33, 117,45, 114,56, 111,68, 105,69, 104,70, 70,12, 70,06, 69,93, 69,85, 69,71, 69,60, 67,46, 66,82, 65,79, 53,46, 51,49, 40,01, 39,53, 36,51, 36,08, 33,84, 28,96, 28,70, 26,41, 24,48. MS (TOF ESI+) 1756,9 (M+H).
El compuesto 13 puede sintetizarse hidrolizando el ester medico del compuesto 12 en condiciones alcalinas usando metodos bien establecidos, p. ej., hidroxido de litio. El compuesto 13 puede convertirse al compuesto 14 usando las mismas condiciones y reactivos usados para sintetizar los compuestos 2, 4 y 6.
Ejemplo 5
Evaluacion de la sonda HER2 DNA y de la sonda Chromosome 17 sobre portaobjetos HER2 3-in-1 Xenografts usando QD490:NDI-C6
Protocolo de tincion:
Aunque el protocolo de tincion de ADN que se presenta a continuacion se refiere a las sondas HER2 DNA (Ventana Medical Systems, Inc. (VMSI) n.° de cat. 780-4332) y/o Chromosome 17 (VMSI n.° de cat. 780-4331) sobre
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portaobjetos HER2 3-in-1 Xenografts (VMSI n.° de cat. 783-4332) en conjunto con QD490:NDI-C6, puede generalizarse para incluir todos los ensayos con sondas genicas. El protocolo puede variarse segun sea necesario, dependiendo de la sonda genica y el tipo de tejido. El siguiente es el procedimiento adaptado a partir del VMSI Benchmark® XT Instrument:
1. El tejido fijado en formalina e incluido en parafina del portaobjetos se calento a 75 °C durante 4 minutos y se trato dos veces con EZPrep™ (10X, VMSI n.° 950-102), se ajusto el volumen a 75 °C antes de la aplicacion de Liquid Coverslip™ (VMSI n.° 650-010). Despues el portaobjetos se calento a 76°C durante 4 minutos, el portaobjetos se aclaro y se ajusto el volumen con EZPrep™, seguido de Liquid Coverslip™ para desparafinar el tejido. El portaobjetos se enfrio a 37 °C, se incubo durante 4 minutos y se aclaro una vez con tampon de reaccion (10X, VMSI n.° 950-300).
2. El portaobjetos se calento despues a 95 °C y se pretrato con Cell Condition n.° 2 (CC2 VMSI n.° 950-123) durante tres ciclos de 8, 12, y 8 minutos seguidos por una aplicacion corta del Liquid Coverslip™ despues de cada ciclo. El calentador de portaobjetos se deshabilito y el portaobjetos se aclaro tres veces con tampon de reaccion seguidas de una aplicacion de Liquid Coverslip™ cada vez.
3. El portaobjetos se calento a 37 °C, se incubo durante 4 minutos y se aclaro una vez con tampon de reaccion. Se aplico ISH-Protease 3 durante 8 minutos y se aclaro dos veces con tampon de reaccion.
4. El portaobjetos se aclaro dos veces con sSc (10X, VMSI n.° 950-110).
5. Se aplico una gota de solucion de deteccion de hibridacion in situ con plata (SISH por sus siglas en ingles) (un componente del kit VMSI SISH Detection Kit n.° 780-001) y se incubo durante 4 minutos.
6. Se aplicaron dos gotas de sonda HER2 DNA marcada con DNP (VMSI n.° 780-4332) o la sonda Chromosome 17 marcada con DNP (VMSI n.° 780-4331) y se incubo durante 4 minutos, y despues se calento el portaobjetos a 95 °C durante 12 minutos para la desnaturalizacion del acido nucleico. (DNP = siglas en ingles de 2,4- dinitrofenol)
7. Despues de la incubacion de 12 minutos, se realizo una aplicacion corta de Liquid Coverslip™ y el portaobjetos se hibrido a 52 °C durante 2 horas al usar la sonda HER2 DNA, o a 44 °C durante 2 horas al usar la sonda Chromosome 17 probe.
8. Despues de la hibridacion de la sonda, el portaobjetos se aclaro en SSC dos veces y se sometio a tres lavados con rigurosidad de SSC 2,0 X a 72 °C durante 8 minutos cada uno, tras los cuales se dejo enfriar el portaobjetos.
9. El portaobjetos se aclaro en tampon de reaccion y se calento a 37 °C durante 4 minutos. Despues, se aplico una gota de QD655:anti DNP de raton con Liquid Coverslip™ a los dos portaobjetos con las sondas y se incubo durante 32 minutos a 37 °C.
10. El portaobjetos se sometio despues a 3 aclarados con tampon de reaccion antes de incubar el QD490:NDI C6 sobre el portaobjetos durante 32 minutos con Liquid Coverslip™ a temperatura ambiente.
11. El portaobjetos se retiro del equipo y se lavo dos veces con tampon de reaccion. Los portaobjetos se deshidrataron despues con alcohol graduado y xileno antes de la aplicacion manual de un cubreobjetos.

Claims (17)

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    REIVINDICACIONES
    1. Un conjugado, que comprende: una nanopartfcula; y
    un resto de union a ADN que comprende una molecula de union a ADN y un engarzador,
    en el que la molecula de union a ADN es un agente de union al surco menor, un agente de union al surco mayor, un intercalante de ADN, un agente alquilante de ADN, o una combinacion de los mismos, y en el que el conjugado tiene la estructura
    nanopartfcula-engarzador-molecula de union a ADN.
  2. 2. El conjugado de la reivindicacion 1, en la que la nanopartfcula comprende un punto cuantico, una nanopartfcula metalica, una nanopartfcula de oxido metalico, o una nanopartfcula de complejo de metal de transicion.
  3. 3. El conjugado de la reivindicacion 1, en el que el resto de union a ADN comprende una molecula de union a ADN seleccionada de 4',6-diamidino-2-fenilindol (DAPI), colorantes de bis-bencimida, psoraleno y naftalendiimida.
  4. 4. El conjugado de la reivindicacion 1, en el que el engarzador comprende una cadena alifatica de 1 a 30 atomos de carbono de longitud o (-OCH2CH2-)n en la que n es de 2 a 15.
  5. 5. El conjugado de la reivindicacion 1, en la que el engarzador es un engarzador multifuncional y una pluralidad de moleculas de union a ADN se une al engarzador multifuncional.
  6. 6. El conjugado de la reivindicacion 1, en la que el resto de union a ADN es
    imagen1
    o
    imagen2
  7. 7. Un metodo para visualizar un nucleo, que comprende:
    pretratar una muestra de tejido con una proteasa para formar una muestra de tejido pretratada;
    incubar la muestra de tejido pretratada con un conjugado de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6 en
    condiciones suficientes para permitir que el conjugado entre en un nucleo dentro de la muestra de tejido pretratada,
    en el que el conjugado se une al ADN en el nucleo; y
    visualizar la nanopartfcula, y visualizar asf el nucleo.
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  8. 8. El metodo de la reivindicacion 7, en la que la nanopartfcula comprende un punto cuantico y visualizar la nanopartfcula comprende visualizar la fluorescencia fotoestable del punto cuantico.
  9. 9. El metodo de la reivindicacion 7, en la que el conjugado se incuba con la muestra de tejido a una concentracion de al menos 20 nM.
  10. 10. El metodo de la reivindicacion 7, que comprende ademas usar tecnicas de analisis de imagen por ordenador para determinar de forma cuantitativa aspectos nucleares, opcionalmente en la que los aspectos nucleares incluyen distribucion cromosomica, ploidfa, forma, tamano, aspectos de textura, aspectos contextuales, o combinaciones de los mismos.
  11. 11. El metodo de la reivindicacion 7, en la que la muestra de tejido se pretrata con la proteasa durante 4-8 minutos y la muestra de tejido se fija antes de pretratar con la proteasa.
  12. 12. El metodo de la reivindicacion 7, que comprende ademas:
    proporcionar una sonda capaz de hibridar con una diana dentro de una muestra de tejido antes de incubar la muestra de tejido pretratada con el conjugado;
    incubar la sonda con la muestra de tejido en condiciones suficientes para permitir que la sonda hibride con la diana dentro de la muestra de tejido; y detectar la sonda.
  13. 13. El metodo de la reivindicacion 12, en la que detectar la sonda comprende visualizar un punto cuantico asociado con la sonda, y en la que la nanopartfcula del conjugado comprende un punto cuantico capaz de emitir fluorescencia a una longitud de onda diferente de la del punto cuantico asociado con la sonda.
  14. 14. El metodo de la reivindicacion 7, que comprende ademas realizar un procedimiento de hibridacion in situ fluorescente sobre la muestra de tejido, opcionalmente en la que el procedimiento de hibridacion in situ fluorescente comprende un ensayo de HER2, un ensayo de TMPRSS2-ERG, un ensayo de Chr17, o una combinacion de los mismos.
  15. 15. Un kit para visualizar un nucleo, que comprende:
    una composicion enzimatica de proteasa que comprende una enzima proteasa y un tampon de proteasa, en la que el tampon de proteasa tiene una concentracion de sal y un pH suficientes para permitir que la enzima proteasa presente actividad proteolttica;
    un conjugado que comprende a) una nanopartfcula y b) un resto de union a ADN que comprende una molecula de union a ADN; y
    un tampon de reaccion, en el que el tampon de reaccion tiene una concentracion de sal y un pH suficientes para posibilitar que el conjugado entre en un nucleo dentro de una muestra tejido pretratada con la composicion enzimatica de proteasa.
  16. 16. El kit de la reivindicacion 15, en la que la nanopartfcula comprende un punto cuantico, una nanopartfcula metalica, una nanopartfcula de oxido metalico, o una nanopartfcula de complejo de metal de transicion.
  17. 17. El kit de la reivindicacion 15, en el que la molecula de union a ADN es un agente de union al surco menor, un agente de union al surco mayor, un intercalante de ADN, un agente alquilante de ADN, o una combinacion de los mismos.
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