JP5512285B2 - 細胞内標的を検出するための粒子 - Google Patents
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Description
本発明は、Cancer Center for Nanotechnology Excellence(NCI/CCNE)により授与された助成金番号IU54−CA119341、およびNIH Director’s Pioneer Awardにより授与された5DPIOD000285、およびNSCEにより授与された助成金番号EEC−0647560の下、政府支援によりなされた。政府は本発明に一定の権利を有する。
本発明は、ナノ粒子を用いて標的分子の細胞内濃度を検出する方法であって、該ナノ粒子が、標的分子と特異的に会合できる結合部を含み、前記会合が、標的分子との会合後に測定できる、検出可能マーカーの変化を起こす方法に関する。
標識オリゴヌクレオチドは、核酸、タンパク質などの特定の高分子標的を検出するための使用広範なプローブである。高い特異性で標的に結合する能力のために、それらは、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)手順などのインビトロアッセイにおいて有用なものとなっている。しかし、細胞は、核酸の取込みに当然ながら抵抗し、また、こうした外来性の遺伝物質を除去する多様な経路を含有してもいるので、こうしたタイプの標的特異的プローブを生細胞中に送達することは、依然として主要な難題である。したがって、特異的な結合性、蛍光性のシグナル伝達能の双方を保持するように、こうした物質を細胞中に送達する方法は、大変興味深い。
本発明では、標的分子の細胞内濃度を決定する方法であって、標的分子のナノ粒子との会合を可能とする条件下で、標的分子をナノ粒子と接触させるステップを含み、ナノ粒子が前記標的分子に特異的な結合部を含み、該結合部がマーカーで標識されており、標的分子およびナノ粒子の会合が、マーカーの検出可能な変化を起こし、検出可能マーカーの変化が、前記標的分子の細胞内濃度に比例する、方法が提供される。
本明細書に示す方法は、1つまたは複数の特定の標的部を特異的に認識し、それと会合する、1つまたは複数の結合部を含むように修飾されたナノ粒子の物理的性質および適用を活用する。本明細書では、標的分子の細胞内濃度は、標的分子に特異的である結合部を含むナノ粒子を用いて決定できることが示される。本発明では、該結合部がマーカーで標識され、標的分子とナノ粒子との会合が、マーカーの検出可能な変化を生じ、検出可能マーカーの変化が、前記標的分子の細胞内濃度に比例する。細胞内標的には、標的細胞中に自然に出現するもの、天然の標的であって、細胞中に導入された(しかし、その細胞型には通常見出されない)もの、または自然には出現しないが、標的細胞中に導入された合成標的が含まれることは理解されよう。
本明細書で使用する場合、ナノ粒子上で官能化される、または標的分子としての「ポリヌクレオチド」という用語は、オリゴヌクレオチドという用語と互換的に使用される。
オリゴヌクレオチドの具体例には、修飾された骨格または非天然ヌクレオシド間連結部を含有するものが含まれる。修飾された骨格を有するオリゴヌクレオチドは、骨格中にリン原子を保持するもの、および骨格中にリン原子を有していないものを包含する。ヌクレオシド間骨格中にリン原子を有していない修飾オリゴヌクレオチドは、「オリゴヌクレオチド」の意味内に入ると見なされる。
本明細書で使用する場合、用語「ポリペプチド」とは、天然に由来する、合成で生成される、または組換えで産生される、ペプチド、タンパク質、アミノ酸のポリマー、ホルモン、ウィルスおよび抗体を指す。ポリペプチドは、リポタンパク質、および例えばグリコシル化タンパク質などの翻訳後修飾タンパク質、ならびに、構造の一部として、D−アミノ酸、DもしくはL立体配置の修飾した、誘導体化した、もしくは非天然のアミノ酸、および/またはペプト模倣(peptomimetic)単位を有するタンパク質またはタンパク質性物質も包含する。
本明細書で使用する場合の「マーカー」は、「標識」と互換的であり、特定される相互作用化合物の種類に関わりなく、ポリヌクレオチドまたはポリペプチドの複合体形成を観察可能な変化で検出する方法が提供される。一態様では、複合体形成は、裸眼または分光法で観察される色変化を起こす。金ナノ粒子を用いた場合、ナノ粒子の凝集に伴って赤から青への色変化が起こり、しばしば裸眼で検出される。本発明では、凝集は、標的分子の特異的だが異なる部分に対する結合部を各々含有する個別のナノ粒子が、同じ標的分子に結合する結果、起こると想定している。
蛍光分子でオリゴヌクレオチドを標識し、蛍光を測定する方法は、当技術分野で周知である。適切な蛍光分子も、当技術分野で周知であり、制限はないが、1,8−ANS(1−アニリノナフタレン−8−スルホン酸)、1−アニリノナフタレン−8−スルホン酸(1,8−ANS)、5(および6)−カルボキシ−2’,7’−ジクロロフルオレッセインpH9.0、5−FAM pH9.0、5−ROX(5−カルボキシ−X−ローダミン、トリエチルアンモニウム塩)、5−ROX pH7.0、5−TAMRA、5−TAMRA pH7.0、5−TAMRA−MeOH、6JOE、6,8−ジフルオロ−7−ヒドロキシ−4−メチルクマリンpH9.0、6−カルボキシローダミン6G pH7.0、6−カルボキシローダミン6G塩酸塩、6−HEX,SE pH9.0、6−TET,SE pH9.0、7−アミノ−4−メチルクマリンpH7.0、7−ヒドロキシ−4−メチルクマリン、7−ヒドロキシ−4−メチルクマリンpH9.0、Alxa 350、Alxa 405、Alxa 430、Alxa 488、Alxa 532、Alxa 546、Alxa 555、Alxa 568、Alxa 594、Alxa 647、Alxa 660、Alxa 680、Alxa 700、Alxa Fluor 430抗体コンジュゲートpH7.2、Alxa Fluor 488抗体コンジュゲートpH8.0、Alxa Fluor 488ヒドラジド−水、Alxa Fluor 532抗体コンジュゲートpH7.2、Alxa Fluor 555抗体コンジュゲートpH7.2、Alxa Fluor 568抗体コンジュゲートpH7.2、Alxa Fluor 610 R−フィコエリトリンストレプトアビジンpH7.2、Alxa Fluor 647抗体コンジュゲートpH7.2、Alxa Fluor 647 R−フィコエリトリンストレプトアビジンpH7.2、Alxa Fluor 660抗体コンジュゲートpH7.2、Alxa Fluor 680抗体コンジュゲートpH7.2、Alxa Fluor 700抗体コンジュゲートpH7.2、アロフィコシアニンpH7.5、AMCAコンジュゲート、アミノクマリン、APC(アロフィコシアニン)、Atto 647、BCECFpH5.5、BCECFpH9.0、BFP(青色蛍光タンパク質)、BO−PRO−1−DNA、BO−PRO−3−DNA、BOBO−1−DNA、BOBO−3−DNA、BODIPY650/655−X,MeOH、BODIPY FLコンジュゲート、BODIPY FL,MeOH、Bodipy R6G SE、BODIPY R6G,MeOH、BODIPY TMR−X抗体コンジュゲートpH7.2、Bodipy TMR−Xコンジュゲート、BODIPY TMR−X,MeOH、BODIPY TMR−X,SE、BODIPY TR−XファラシジンpH7.0、BODIPY TR−X,MeOH、BODIPY TR−X,SE、BOPRO−1、BOPRO−3、カルセイン、カルセインpH9.0、カルシウムクリムゾン、カルシウムクリムゾンCa2+、カルシウムグリーン、カルシウムグリーン−1Ca2+、カルシウムオレンジ、カルシウムオレンジCa2+、カルボキシナフトフルオレッセインpH10.0、カスケードブルー、カスケードブルーBSApH7.0、カスケードイエロー、カスケードイエロー抗体コンジュゲートpH8.0、CFDA、CFP(シアン蛍光タンパク質)、CI−NERFpH2.5、CI−NERFpH6.0、シトリン、クマリン、Cy2、Cy3、Cy3.5、Cy5、Cy5.5、CyQUANT GR−DNA、ダンシルカダベリン、ダンシルカダベリン,MeOH、DAPI、DAPI−DNA、ダポキシル(2−アミノエチル)スルホンアミド、DDAOpH9.0、Di−8 ANEPPS、Di−8−ANEPPS−脂質、DiI、DiO、DM−NERFpH4.0、DM−NERFpH7.0、DsRed、DTAF、dTomato、eCFP(強化シアン蛍光タンパク質)、eGFP(強化緑色蛍光タンパク質)、エオシン、エオシン抗体コンジュゲートpH8.0、エリスロシン−5−イソチオシアネートpH9.0、臭化エチジウム、エチジウムホモ二量体、エチジウムホモ二量体−1−DNA、eYFP(強化黄色蛍光タンパク質)、FDA、FITC、FITC抗体コンジュゲートpH8.0、FlAsh、Fluo−3、Fluo−3Ca2+、Fluo−4、フルオルルビー、フルオレッセイン、フルオレッセイン0.1M NaOH、フルオレッセイン抗体コンジュゲートpH8.0、フルオレッセインデキストランpH8.0、フルオレッセインpH9.0、フルオロエメラルド、FM1−43、FM1−43脂質、FM4−64、FM4−64,2%CHAPS、FuraレッドCa2+、Furaレッド高Ca、Furaレッド低Ca、Fura−2Ca2+、Fura−2高Ca、Fura−2無Ca、GFP(S65T)、HcRed、Hoechst 33258、Hoechst 33258−DNA、Hoechst 33342、Indo−1Ca2+、Indo−1無Ca、Indo−1飽和Ca、JC−1、JC−1pH8.2、リッサミンローダミン、LOLO−1−DNA、Lucifer Yellow, CH、LysoSensor Blue、LysoSensor Blue pH5.0 、LysoSensor Green、LysoSensor Green pH5.0、LysoSensor Yellow pH3.0、LysoSensor Yellow pH9.0、LysoTracker Blue、LysoTracker Green、LysoTracker Red、マグネシウムグリーン、マグネシウムグリーンMg2+、マグネシウムオレンジ、Marina Blue、mBanana、mCherry、mHoneydew、MitoTracker Green、MitoTracker Green FM, MeOH、MitoTracker Orange、MitoTracker Orange, MeOH、MitoTracker Red、MitoTracker Red, MeOH、mOrange、mPlum、mRFP、mStrawberry、mTangerine、NBD−X、NBD−X,MeOH、NeuroTrace 500/525、緑色蛍光ニッスル染色RNA、ナイルブルーEtOH、ナイルレッド、ナイルレッド脂質、ニッスル、オレゴングリーン488、オレゴングリーン488抗体コンジュゲートpH8.0、オレゴングリーン514、オレゴングリーン514抗体コンジュゲートpH8.0、パシフィックブルー、パシフィックブルー抗体コンジュゲートpH8.0、フィコエリトリン、PicoGreen dsDNA定量試薬、PO−PRO−1、PO−PRO−1−DNA、PO−PRO−3、PO−PRO−3−DNA、POPO−1、POPO−1−DNA、POPO−3、ヨウ化プロピジウム、ヨウ化プロピジウム−DNA、R−フィコエリトリンpH7.5、ReAsH、レゾルフィン、レゾルフィンpH9.0、Rhod−2、Rhod−2Ca2+、ローダミン、ローダミン110、ローダミン110pH7.0、ローダミン123,MeOH、ローダミングリーン、ローダミンファロイジンpH7.0、ローダミンレッド−X抗体コンジュゲートpH8.0、ローダミングリーンpH7.0、ロドールグリーン抗体コンジュゲートpH8.0、サファイア、SBFI−Na+、ナトリウムグリーンNa+、スルホローダミン101,EtOH、SYBRグリーンI、SYPROルビー、SYTO13−DNA、SYTO45−DNA、SYTOXブルー−DNA、テトラメチルローダミン抗体コンジュゲートpH8.0、テトラメチルローダミンデキストランpH7.0、テキサスレッド−X抗体コンジュゲートpH7.2、TO−PRO−1−DNA、TO−PRO−3−DNA、TOTO−1−DNA、TOTO−3−DNA、TRITC、X−Rhod−1Ca2+、YO−PRO−1−DNA、YO−PRO−3−DNA、YOYO−1−DNAおよびYOYO−3−DNAを包含する。
本明細書で使用する場合、「ナノ粒子」とは、任意の1つの寸法が10μm未満、好ましくは5μm未満の小さな構造体を指す。一般に、想定しているナノ粒子は、本明細書に記載するようなオリゴヌクレオチドに対して、高い担持能を有する任意の化合物または物質を包含する。本発明の実施に有用なナノ粒子には、ナノ粒子が他の方法で検出可能なマーカーを消光する能力を有する限り、金属(例えば、金、銀、銅および白金)、半導体(例えば、CdSe、CdS、およびZnSで被覆したCdSまたはCdSe)、および磁性(例えば、フェロマグネタイト)コロイド状物質が含まれる。本発明の実施に有用な他のナノ粒子には、ZnS、ZnO、TiO2、AgI、AgBr、HgI2、PbS、PbSe、ZnTe、CdTe、In2S3、In2Se3、Cd3P2、Cd3As2、InAsおよびGaAsが挙げられる。ナノ粒子のサイズは、好ましくは約5nm〜約150nm(平均直径)、より好ましくは約5nm〜約50nm、最も好ましくは約10nm〜約30nmである。ナノ粒子のサイズは、約5〜約10nm、または約5〜約20nm、または約5〜約30nm、または約5〜約40nm、または約5〜約60nm、または約5〜約70nm、または約5〜約80nm、または約5〜約90nm、または約5〜約100nm、または約5〜約110nm、または約5〜約120nm、または約5〜約130nm、または約5〜約140nm、または約10〜約20nm、または約10〜約40nm、または約10〜約50nm、または約10〜約60nm、または約10〜約70nm、または約10〜約80nm、または約10〜約90nm、または約10〜約100nm、または約10〜約110nm、または約10〜約120nm、または約10〜約130nm、または約10〜約140nm、または約10〜約150nmであると想定されている。ナノ粒子はまた、棒状、角柱、または四面体でもよい。
他の実施形態では、検出可能変化は、ナノ粒子上でのオリゴヌクレオチドのハイブリッド形成時に検出可能変化を生じる分子(例えば、制限はないが、蛍光性の分子および色素)で、オリゴヌクレオチドを標識することにより創出される。例えば一態様では、ナノ粒子上に官能化されたオリゴヌクレオチドまたはポリペプチドは、ナノ粒子取付末端に対して遠位にある末端に結合したマーカーを有しており、標的と会合していない状態では、マーカーのある遠位末端は、マーカーの蛍光を消光するのに十分に近くナノ粒子近傍に配置している。一態様では、金属および半導体ナノ粒子は、既知の蛍光消光剤であり、その消光作用の大きさは、ナノ粒子と蛍光分子との距離に依存する。したがって、1本鎖状態では、ナノ粒子に結合したオリゴヌクレオチドは、二次構造折畳みを介してオリゴヌクレオチドにより形成される、例えばヘアピン構造によってナノ粒子と相互作用するが、その折畳みのために、蛍光分子は、相当な消光が観察されるようにナノ粒子に近接する。同様に、非結合状態では、ナノ粒子に結合したポリペプチドは、マーカーをナノ粒子に近接させる立体構造を取り、マーカーが消光されることになろう。認識配列を介した標的分子の結合によるポリヌクレオチドまたはポリペプチドの複合体形成時には、蛍光分子がナノ粒子から遠ざかり、蛍光の消光が減衰することになろう(図1)。オリゴヌクレオチドの有用な長さは、実験的に決定することができる。したがって、様々な態様では、蛍光標識したオリゴヌクレオチドまたはポリペプチドを結合させた金属および半導体ナノ粒子は、本明細書に記載するアッセイ方式のいずれにおいても使用される。
提示した方法に使用するナノ粒子は、長さが約5〜約100ヌクレオチドであるオリゴヌクレオチドまたはその修飾型で官能化される。オリゴヌクレオチドが、長さ約5〜約90ヌクレオチド、長さ約5〜約80ヌクレオチド、長さ約5〜約70ヌクレオチド、長さ約5〜約60ヌクレオチド、長さ約5〜約50ヌクレオチド、長さ約5〜約45ヌクレオチド、長さ約5〜約40ヌクレオチド、長さ約5〜約35ヌクレオチド、長さ約5〜約30ヌクレオチド、長さ約5〜約25ヌクレオチド、長さ約5〜約20ヌクレオチド、長さ約5〜約15ヌクレオチド、長さ約5〜約10ヌクレオチドである方法も想定しており、サイズ長さが中間的な全てのオリゴヌクレオチドは、オリゴヌクレオチドが所望の結果を実現できる程度にまで、明確に開示されている。したがって、長さがヌクレオチド個数にして5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99および100のオリゴヌクレオチドが想定されている。
本発明の一態様では、結合部中に認識配列を含有するオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドが、本明細書に記載するようにナノ粒子に結合している。本明細書で使用する場合の「認識配列」とは、対象とする標的分子に部分的または完全に相補的である配列を意味すると理解される。
この実施例は、蛍光標識オリゴヌクレオチドで修飾した金ナノ粒子剤が、細胞内分子標的の検出に使用できると実証することを意図している。概念実証として、蛍光標識オリゴヌクレオチドで修飾した金ナノ粒子を用いた、2種の細胞型におけるmRNA標的の細胞内検出は、非常に有効であることが示されている。こうした作用剤は、細胞に容易に進入し、蛍光顕微鏡、フローサイトメトリーの双方を用いて容易に読み取ることができる蛍光シグナルを生じる、
具体的には、13nmの金ナノ粒子を、一端はチオール部、他端は蛍光色素を末端とし、構造スイッチング認識配列を含有する異なる数配列で修飾した。標的のない状態では、色素分子は、金ナノ粒子表面に近接しているため、消光され、蛍光シグナルを発しない。標的のある状態では、色素分子は、金ナノ粒子表面から離れており、蛍光シグナルが観察される(図1)。
細胞に進入し、細胞内標的分子を検出する金ナノ粒子の能力の使用を更に例示するために、インビトロ細胞培養実験を実施した。
蛍光標識オリゴヌクレオチドで修飾した金ナノ粒子剤を、オリゴヌクレオチド担持量および蛍光シグナル伝達能について更に調べた。これらの実験の結果から、各金ナノ粒子は、認識配列を含有するおよそ60個の蛍光オリゴヌクレオチドで官能化されていることが確認される。更に、各種のオリゴヌクレオチド修飾金ナノ粒子剤の1nM溶液をKCN溶液中で分解すると、いずれもほぼ同じ蛍光を示した。まとめると、この特性決定データは、標的のない状態では、蛍光標識オリゴヌクレオチドで修飾した金ナノ粒子剤が、同じ蛍光シグナルを表すことを示しており、したがって、観察された細胞内シグナル伝達が、特定の細胞内結合事象により起こされたことが確認される。
13nmのAuNPを用いて、ナノフレアを調製した。このサイズの粒子は、効率的な消光剤であり、オリゴヌクレオチドで高密度に官能化することができ(Mirkinら、1996年、Nature 382巻、607〜609頁)、しかも可視光を効率的に散乱せず、これが、干渉が最小限の光学プローブの設計に重要なためである。
合成標的でナノフレアプローブのシグナル伝達能を確立した後、生細胞に進入し、可視化し、RNA標的を検出するプローブの能力を調べた。サバイビン転写物に対する相補領域を組み込むように、ナノフレアを設計したが、この転写物は、癌の治療剤および診断剤における潜在的な使用のために相当な関心を受けている標的である(Altieriら、2003年、Oncogene 22巻、8581〜8589頁)。多数のサバイビン転写物を発現する(Pengら、2005年、Cancer Res. 65巻、1909〜1917頁)SKBR3細胞系(ヒト乳癌)をモデルとして使用して、サバイビンターゲティングナノフレアを試験した。サバイビンの認識およびレポーター配列は、上記に示す通りである(配列番号1および配列番号2)。対照として、非相補配列を含有する第2のプローブを調製した。この非相補的プローブは、サバイビンプローブと類似のバックグランド蛍光、融解性およびシグナル伝達能を有するように設計され、その通り有すると決定された。サバイビン対照プローブのオリゴヌクレオチド配列は、以下の通りであった。
ナノフレアの細胞進入、向上したシグナル伝達および低いバックグランドが、細胞内RNA量の変化に対する高い感度となる適用例を示すために、siRNAノックダウン実験を行って、SKBR3細胞モデルにおけるサバイビンRNA転写物の量を減少させた。細胞がおよそ50%集密していたとき、ヒトサバイビンに対するsiRNA(Santa Cruz)を、Lipofectamine 2000(Invitrogen)を用いて細胞に送達した(siRNA濃度は、20、40および80nM)。24時間後、培地を、ナノフレアプローブを含有する培地(粒子濃度50pM)と交換した。6時間後、細胞を洗浄し、新鮮な培地を添加した。細胞を更に12時間培養し、フローサイトメトリーを用いて分析した。
Claims (9)
- 標的分子の細胞内濃度を決定する方法であって、該標的分子のナノ粒子との会合を可能とする条件下で、該標的分子を該ナノ粒子と接触させるステップを含み、該ナノ粒子が該標的分子に特異的なポリヌクレオチドである結合部を含み、該結合部がマーカーで標識されており、該標的分子および該ナノ粒子の会合が、該マーカーの検出可能な変化をもたらし、該検出可能マーカーの変化が、該標的分子の細胞内濃度に比例し、ポリヌクレオチドである前記結合部が前記ナノ粒子に共有結合しており、前記マーカーが、ポリヌクレオチドである前記結合部とハイブリッド形成しているポリヌクレオチドに結合した標識であって、前記結合部の前記標的分子との会合が、前記ハイブリッド形成しているポリヌクレオチドを放出し、前記マーカーが前記放出後に検出可能である、前記方法。
- 前記結合部がDNAである、請求項1に記載の方法。
- 前記結合部がRNAである、請求項1に記載の方法。
- 前記ポリヌクレオチドに結合した前記標識は、該標識を有する該ポリヌクレオチドが前記結合部とハイブリッド形成している場合に、消光される、請求項1に記載の方法。
- 前記結合部が、検出可能な標識であるマーカーを含むポリヌクレオチドであり、該マーカーは、ポリヌクレオチドである結合部が前記標的分子と会合している場合にのみ、検出可能である、請求項1に記載の方法。
- 前記マーカーは、前記結合部が前記標的分子と会合していない場合、消光される、請求項5に記載の方法。
- 前記ナノ粒子が、多数の結合部を含む、請求項1に記載の方法。
- 前記結合部が、1つの標的分子と特異的に会合する、請求項7に記載の方法。
- 前記結合部が、複数の標的分子と特異的に会合する、請求項7に記載の方法。
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