KR20090125088A - 세포내 타겟 검출용 입자 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 결합 모이어티에 의해 변형된 나노 입자의 용도에 관한 것이다.

Description

세포내 타겟 검출용 입자{PARTICLES FOR DETECTING INTRACELLULAR TARGETS}
본 발명은, NCI/CCNE(Cancer Center for Nanotechnology Excellence)의 IU54-CA 119341, NIH 디렉터의 파이오니어 어워드의 5DPIOD000285, 및 NSEC의 교부번호 EEC-0647560로, 정부의 지원하에 이루어졌다. 정부가 본 발명의 일정 권리를 갖는다.
본 발명은 나노 입자를 이용하여 타겟 분자의 세포내 농도를 검출하는 방법에 관한 것으로, 상기 나노 입자는 타겟 분자와 특이적으로 조합할 수 있는 결합 모이어티를 포함하며, 상기 조합시 타겟 분자와의 조합 후 측정할 수 있는 검출가능한 마커에 변화가 발생한다.
표지된 올리고뉴클레오티드는 핵산 및 단백질과 같은 특이적인 마크로분자 타겟을 검출하기 위한 프로브로서 널리 이용되고 있다. 높은 특이성으로 타겟에 결합하는 이의 능력으로 인해, 이들을 중합효소 연쇄 반응(PCR) 프로토콜과 같은 시험관내 분석에 이용가능하다. 그러나, 이러한 타입의 타겟 특이적 프로브를 살아있는 세포내로 전달하는 것은, 세포는 본래 핵산 유입(uptake)에 저항적이며 이러한 외래 유전 물질을 제거하기 위한 다양한 경로를 가지고 있기 때문에, 해결해야할 과제로 남아있다. 따라서, 특이적인 결합 특성 및 형광 시그널링 능력 두가 지를 모두 보유하는 방식으로, 상기한 물질들을 세포내로 전달하는 방법은, 매우 흥미로운 일이다.
올리고뉴클레오티드-나노 입자 접합체의 발견과 그 이후의 진보로, 분자 진단(Elghanian et al ., 1997, Science 277: 1078-1081; Nam et al ., 2003, Science 308: 1884-1886)과 물질 설계(Mirkin et al ., 1996, Nature 382: 607-609; Alivisatos et al ., 1996, Nature 382: 609-611; Demers et al ., 2003, Angew . Chem. Int . Ed . 40: 3071-3073)에 다양한 새로운 기회가 생겨났다. 최근, 올리고뉴클레오티드-관능화된 나노 입자가 세포에 도입되어, 안티센스 물질로서 작용함으로써, 유전자 발현을 조절하는 것이 보고되었다(Rosi et al ., 2006, Science 312: 1027-1030). "안티센스 입자"는 단순히 전달 비히클이 아니고(Sandhu et al ., 2002, Bioconjugate Chem . 13: 3-6; Tkachenko et al ., 2003, J. Am . Chem . Soc . 125: 4700-4701), 오히려 세포에 내재화되어, 효소 분해에 저항적이며, 유리 올리고뉴클레오티드보다 2자리수나 큰 정도의 높은 친화성 상수로 세포내 타겟에 결합하는, 단일 엔티티로된 조절 및 형질감염 물질이다(Lytton-Jean and Mirkin, 2005, J. Am . Chem . Soc . 127: 12754-12755). 더욱이, 이것은, 록킹된 핵산(locked nucleic acid)과 같은 강력한, 즉 매우 안정한 디자이너 물질에 의해 쉽게 변형될 수 있으며(Seferos et al ., 2007, ChemBioChem 8: 1230-1232), 유전자 조절에 필요한 조건에서 무독성이다. 실제로, 세포는 용액 중의 유리 올리고뉴클레오티드와는 달리, 많은 수의 올리고뉴클레오티드-변형된 금 나노 입자를 쉽게 취하는 것으로 확인되었다. 이러한 특성으로 인해, 올리고뉴클레오티드-변형된 금 나노 입자 가 세포내 신속한 DNA 전달을 제공하며, 더불어 협동 특성에 기초하여 세포에서의 올리고뉴클레오티드의 효과를 증가시키는, 세포내 유전자 조절용 물질로서 사용될 수 있다는 것을 발견하게 되었다. 이러한 올리고뉴클레오티드 관능화된 나노 입자가 다양한 세포 타입에 도입되는 것이 확인되어, 이를 이용하여 올리고뉴클레오티드를 국소적으로 고농도로 존재시킬 수 있다.
또한, DNA로 밀도높게 관능화시킨 금 나노 입자가 매우 협력적인 방식으로 상보성 DNA에 결합하여, 금 나노 입자에 부착되어 있지 않은 유사 DNA 가닥에서 측정된 결합 강도 보다 2자리수 정도로 크게 증가시킨다는 것이 이미 확인되었다. 이러한 특성으로 인해, 나노 입자는 전술한 용도 이외에도 특히 DNA 및 단백질 진단 분석에 이용할 수 있다.
관심 대상의 올리고뉴클레오티드 중 한 클래스는 인지 서열을 이용하여 특이적 타겟을 검출할 수 있는 것이다. 이러한 타입의 구조체가, 살아있는 세포로 도입된다면, 특히 의학적 진단, 약물 개발 및 발생 및 분자 생물학적 적용에 특히 관심이 있을 것이다. 그러나, 현재의 전달/형질감염 전략에는, 1) 저 독성, 2) 높은 세포 유입성, 및 3) 위양성 신호를 초래하는 효소에 대한 내성 제공 등의, 이의 사용에 필요한 속성들이 부족한 실정이다.
인 시츄(in situ) 염색(Femino et al ., Science 280: 585-590, 1998; Kloosterman et al ., Nat . Methods 3: 27-29, 2006), 분자 비컨(molecular beacon)(Tyagi et al ., 1996, Nat . Biotechnol . 14: 303-308; Sokol et al ., 1998, Proc. Natl . Acad . Sci . USA 95: 11538-11543; Peng et al ., 2005, Cancer Res . 65: 1909-1917; Perlette et al ., 2001, Anal . Chem . 73: 5544-5550; Nitin et al ., 2004, Nucleic Acids Res . 32: e58), 및 FRET-페어(Santangelo et al ., 2004, Nucleic Acids Res . 32: e57; Bratu et al ., 2003, Proc . Natl . Acad . Sci . USA 100: 13308-13313)에 사용되는 것 등의, 세포내 RNA를 가시화하여 검출하기 위한 프로브는, 각각 외부 자극에 대해 반응하는 생물 시스템에서의 활성을 측정 및 정량하기 위한 중요한 생물학적 도구이다(Santangelo et al ., 2006, Annals of Biomedical Engineering 34: 39-50). 그러나, 올리고뉴클레오티드계 리포터를 세포 매질 및 세포에 전달하는 것은 세포내 검출에 있어 해결해야할 주된 과제인 것으로 밝혀졌다. 일반적으로, 올리고뉴클레오티드계 프로브의 세포 내재화에는, 독성일 수 있거나 세포 프로세스를 변형시킬 수 있는, 지질(Zabner et al ., 1995, J. Bio . Chem . 270: 18997-19007) 또는 덴드리머(Kukowska-Latallo et al ., 1996, Proc. Natl . Acad . Sci . USA 93: 4897-4902)와 같은 형질감염제(transfection agent)가 필요하다. 또한, 올리고뉴클레오티드는 세포내에서 분해되기 쉬우며(Opalinska and Gewirtz, 2002, Nat . Rev . Drug Disc . 1: 503-514), 플루오로포어로 표지된 프로브인 경우, 이러한 현상은 진양성과 구별할 수 없는 강한 백그라운드 신호를 발생시킬 수 있다(Li et al ., 2004, Nucleic Acids Res . 28: e52; Rizzo et al ., 2002, Molecular and Cellular Probes 16: 277-283).
이에, 매우 높은 특이성으로 타겟을 인지할 수 있는 나노 입자는 고안되어 있지만, 특이적인 상호작용으로부터 발생하는 포지티브 효과를, 특히 단일 세포 수준에서 그러한 상호 작용을 검출하는 감도로 검출하긴 어렵다.
따라서, 세포내로 도입되어 특이적인 타겟과 조합될 수 있는 물질과, 형성된 세포내 상호작용을 검출 및 정량하기 위한 방법의 개발이 당업계에 요구되고 있다.
발명의 개요
본 발명은, 타겟 분자와, 상기 타겟 분자에 특이적이며 마커로 표지된 결합 모이어티를 포함하고 있는 나노 입자와의, 조합이 허용되는 조건 하에서, 상기 타겟 분자를 상기 나노 입자와 접촉시키는 단계를 포함하며, 상기 타겟 분자와 상기 나노 입자의 조합시 마커에 검출가능한 변화가 이루어지며, 검출가능한 마커의 변화는 상기 타겟 분자의 세포내 농도에 비례하는, 타겟 분자의 세포내 농도를 검출하는 방법을 제공한다.
본 발명에 따른 방법의 일 예에 있어서, 결합 모이어티는 폴리뉴클레오티드이며, 다른 측면으로, 결합 모이어티는 폴리펩타이드이다. 결합 모이어티가 폴리뉴클레오티드인 예에서, 다른 측면으로, 결합 모이어티가 DNA 분자 또는 RNA 분자인 경우를 포함한다. 상기 방법의 다른 예에서, 타겟 분자는 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩타이드이다. 타겟 분자가 폴리뉴클레오티드인 경우, 다른 측면은 결합 모이어티가 DNA 분자 또는 RNA 분자인 경우를 포함한다.
일 예에서, 결합 모이어티는 나노 입자에 공유결합으로 부착된 폴리뉴클레오티드이고, 마커는 결합 모이어티 폴리뉴클레오티드에 혼성화되어 있는 폴리뉴클레오티드에 부착된 표지인, 방법을 제공하며, 여기에서, 결합 모이어티 폴리뉴클레오티드와 타겟 분자가 조합되면, 혼성화된 폴리뉴클레오티드가 분리되고, 이러한 분리 후 마커는 검출가능해진다. 일 측면에 있어서, 마커는 혼성화된 폴리뉴클레오티드에 부착되어 있으며, 마커를 지닌 혼성화된 폴리뉴클레오티드가 결합 모이어티와 혼성화되면, 마커는 소광(quench)된다.
다른 예로, 결합 모이어티는 나노 입자에 공유결합으로 부착된 폴리펩타이드이고, 마커는 상기 결합 모이어티 폴리펩타이드와 조합된 물질에 부착된 표지인, 방법을 제공하며, 여기에서, 상기 결합 모이어티 폴리펩타이드에 타겟 분자가 조합되면, 상기 조합된 물질이 대체되어, 이것이 분리되고, 분리된 후 마커는 검출할 수 있게 된다. 일 측면에서, 마커는 상기 물질에 부착되어 있으며, 상기 마커는 상기 결합 모이어티 폴리펩타이드와 상기 물질이 조합되어 있을 때에는 소광된다.
다른 예에서, 결합 모이어티가 마커로 표지되어 있고, 결합 모이어티가 타겟 분자와 조합되었을 때에만 상기 마커를 검출할 수 있는, 방법을 제공한다. 결합 모이어티가 폴리뉴클레오타이드인 예에서, 또다른 측면으로, 결합 모이어티가 DNA 분자 또는 RNA 분자인 경우를 포함한다. 상기 방법의 다른 예로, 타겟 분자는 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩타이드이다. 타겟 분자가 폴리뉴클레오티드인 예에서, 다른 측면으로, 결합 모이어티가 DNA 분자 또는 RNA 분자인 경우를 포함한다.
일 측면으로, 결합 모이어티는 폴리뉴클레오티드이고, 마커는 폴리뉴클레오티드 결합 모이어티가 타겟 분자와 조합되어 있지 않을 때에는 마커가 소광되도록 폴리뉴클레오티드 결합 모이어티에 부착되어 있다. 따라서, 폴리뉴클레오티드 결합 모이어티에 부착된 마커는 폴리뉴클레오티드 결합 모이어티가 타겟 분자와 조합되었을 때에만 검출할 수 있다.
다른 측면으로, 결합 모이어티는 폴리펩타이드이고, 마커는, 폴리펩타이드 결합 모이어티가 타겟 분자와 조합되어 있지 않을 때에는 마커가 소광되도록 폴리펩타이드 결합 모이어티에 부착되어 있다. 따라서, 폴리펩타이드 결합 모이어티에 부착된 마커는 폴리펩타이드 결합 모이어티가 타겟 분자와 조합되었을 때에만 검출할 수 있다.
또한, 상기 나노 입자가 다중 결합 모이어티들을 포함하는 방법을 제공한다. 일 측면으로, 다중 결합 모이어티들이 하나의 타겟 분자에 특이적으로 조합하는, 방법을 제공한다. 다른 측면으로, 다중 결합 모이어티들은 2개 이상의 타겟 분자에 특이적으로 조합한다.
다른 측면으로, 본 발명은 하기에 기술된 상세한 설명으로부터 명확해질 것이다. 그러나, 본 발명의 사상 및 범위내에서의 다양한 변화 및 수정은 당업자라면 상세한 설명으로부터 자명한 것이므로, 하기 상세한 설명 및 실시예들은, 본 발명의 바람직한 구현예를 나타내고 있지만, 단순히 예를 든 것에 불과한 것으로 이해되어야 한다.
발명의 상세한 설명
본 발명은 하나 이상의 특이적인 타겟 분자를 특이적으로 인지하여 조합하는, 하나 이상의 결합 모이어티를 포함하도록 변형된, 나노 입자의 물리적 특성과 적용을 이용하는 방법을 제공한다. 본원에서, 타겟 분자의 세포내 농도는 타겟 분자에 특이적인 결합 모이어티를 포함하는 나노 입자를 이용하여 결정할 수 있는 것으로 알려져 있다. 본 발명에서, 결합 모이어티는, 타겟 분자가 나노 입자에 조합되면 마커에 검출가능한 변화가 이루어지는 마커로 표지되며, 상기 검출가능한 마커에서의 변화는 상기 타겟 분자의 세포내 농도에 비례한다. 세포내 타겟은 타겟 세포내에서 천연적으로 형성되는 것, 세포로 도입된 천연적으로 형성된 것(그러나, 그 세포 타입에서는 통상적으로는 발견되지 않음), 타겟 세포에 도입된 천연적으로 형성되지 않는 합성 타겟을 포함하는 것으로 이해될 것이다.
본 발명의 다른 측면에서, 바람직한 타겟의 세포내 국지화는 또한 본원에 기술된 방법을 이용하여 결정할 수 있다.
본원에서, 용어 "결합 모이어티"는 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩타이드, 또는 목적한 타겟과 조합될 수 있는 상기 폴리뉴클레오티드나 폴리펩타이드 중 임의의 것의 임의의 그외 단편 또는 절편을 망라하는 것으로 이해된다. 이 용어는, 관심 대상의 소형 분자를 포함하지만, 이것으로 한정되는 것은 아니다. 당업계에서 이해되는 바와 같이, 용어 "소형 분자"는 천연 화합물, 천연 화합물의 변형 또는 합성 화합물인, 유기 및 무기 화합물을 포함한다.
본 발명의 방법은 결합 모이어티가 폴리뉴클레오티드 및/또는 폴리펩타이드이고, 타겟 분자가 폴리뉴클레오티드 및/또는 폴리펩타이드인, 세포내 타겟 분자를 인지하여 조합하는 결합 모이어티의 이용 방법을 특히 제공한다. 간단하게는 , 폴리뉴클레오티드 결합 모이어티는 폴리뉴클레오티드 타겟 분자와 특이적으로 조합하거나, 또는 폴리펩타이드 결합 모이어티는 폴리펩타이드 타겟 분자와 특이적으로 조합한다. 그러나, 또한, 폴리뉴클레오티드 결합 모이어티가 폴리펩타이드 타겟 분자와 특이적으로 조합하거나, 또는 폴리펩타이드 결합 모이어티가 폴리뉴클레오티드 타겟 분자와 특이적으로 조합하는 방법도 고려한다.
본원에서, 용어 "특이적으로 인지한다" 또는 "특이적으로 조합한다"는 결합 모이어티가 다른 모든 타겟 분자에 비해 높은 친화력으로 또는 총친화성(avidity)으로 하나의 타겟 분자를(와) 식별 및/또는 상호작용할 수 있는 것을 의미한다.
상기 방법은 결합 모이어티가 마커로 직접 또는 간접적으로 표지되고, 결합 모이어티와 타겟 분자의 조합으로 마커는 검출가능하게 되거나 또는 검출 가능성이 증가하게 되는 원리 하에서 작용한다. 따라서, 결합 모이어티가 타겟 분자와 조합되지 않았을 때, 마커는 상대적으로 검출불가능하거나 소광된다. 용어 "소광된다" 또는 "소광"은 흔히 형광 마커와 연관되는 것으로 이해되지만, 본원에서는 상대적으로 검출불가능할 때 임의 마커의 신호가 소광된 것으로 간주한다. 따라서, 형광 마커를 채택하는 본 명세서에 예시된 방법들은 단지 고려되는 방법들의 한가지 예를 제공한 것에 불과하며, 소광될 수 있는 모든 마커들이 예시적인 형광 마커 대신 사용할 수 있는 것으로 이해된다.
일 측면에 있어서, 마커는 결합 모이어티에 직접 부착되어 있는 표지이며, 다른 측면에 있어서, 마커는 결합 모이어티에 조합된 물질에 부착되어 있는 표지이며, 상기 물질은, 타겟 분자와 결합 모이어티의 조합이 상기 물질과 결합 모이어티와의 조합으로부터 상기 물질의 분리를 야기할 정도로 결합 모이어티에 대한 결합 친화력 또는 결합 총친화력이 낮다.
마커가 결합 모이어티에 직접 부착된 경우, 마커는 결합 모이어티가 타겟 분자와 조합되지 않았을 때 상대적으로 검출할 수 없거나 소광되도록 위치된다. 예컨대, 타겟 분자와 조합되어 있지 않은 폴리뉴클레오티드 결합 모이어티에서, 마커는 폴리뉴클레오티드 결합 모이어티내에서 형성되는 2차 구조를 통해 나노 입자 자체에 인접하게 위치할 수 있거나, 또는 마커는 임의의 소정 시기에 마커가 나노 입자에 근접하게 위치되어 그 신호가 소광되거나, 또는 나노 입자로부터 신호가 소광되지 않는 거리에서 자유롭게 수계 환경에서 너울거리도록(wavering)(여전히 나노 입자에 매여있기는 함), 수계 환경에서 자유롭게 너울거릴 수 있다. 폴리뉴클레오티드 결합 모이어티가 타겟 분자에 조합되지 않았을 때, 나노 입자에 근접하여 소과되는 위치에서 마커를 유지시키는 2차 구조가 없는 경우, 백그라운드 신호 수준이 반드시 검출되어야 하며, 폴리뉴클레오티드 결합 모이어티가 타겟 분자와 조합하면, 소광 효과를 부여하기에 충분한 나노 입자 근접 위치로부터 마커를 이동시킴으로써, 신호는 백그라운드 이상으로 강화될 것이다.
마찬가지로, 결합 모이어티가 폴리펩타이드일 때, 결합 모이어티 상의 마커는, 폴리펩타이드 결합 모이어티가 타겟 분자와 조합되었을 때 이루어지는 구조적 변화로 인해 나노 입자로부터 충분히 멀리 마커의 신호가 상대적으로 탈소광되는 마커의 이동이 발생되도록, 위치되어 있을 수 있다.
마커가 결합 모이어티와 간접적으로 조합되는, 방법의 경우, 결합 모이어티가 타겟 분자와 조합하면, 나노 입자가 마커에 소광 효과를 더이상 발휘할 수 없도록 마커의 물리적 분리가 야기된다. 예컨대, 폴리뉴클레오티드 결합 모이어티의 경우, 마커는, 나노 입자가 자체 소광 효과를 발휘하기에 충분한 나노 입자 근접 위치에 마커가 있게 하는 위치에서, 폴리뉴클레오티드 결합 모이어티에 혼성화할 수 있는 제2 폴리뉴클레오티드 상에 표지될 수 있다. 폴리뉴클레오티드 결합 분자가 타겟 분자를 인지하여 이와 조합하면, 혼성화되어 있던 표지된 폴리뉴클레오티드는 대체되어 분리됨으로써 나노 입자의 소광 효과는 줄어들게 된다.
따라서, 일 예에 있어서, 플루오로포어로 표지된 상보적인 폴리뉴클레오티드와 혼성화될 폴리뉴클레오티드 결합 모이어티를 포함하도록 변형된 금 나노 입자를, 살아있는 세포에서 RNA를 가시화하고 정량하기 위한 형질감염 물질 및 세포 "나노-플레어" 두가지 모두로 사용할 수 있는, 방법을 제공한다. 나노-플레어는 매우 효과적인 금의 형광 소광 특성(Dubertret et al ., 2001, Nat . Biotechnol . 19: 365-370), 형질감염제를 사용하지 않고 올리고뉴클레오티드 나노 입자 접합체를 세포내로 유입하는 특성 및 이러한 접합체의 효소적 안정성(Rosi et al., 2006, Science 312: 1027-1030)을 이용함으로써, 따라서 민감하고 효과적인 세포내 프로브를 창출하는데 있어서의 수많은 난제들을 해결한다. 특히, 나노-플레어는 강한 신호를 나타내며, 백그라운드 형광이 낮으며, 세포에 존재하는 RNA 전사체의 수적 변화에 민감하다. 따라서, 본원에 기술된 나노-플레어는, 비교적 다량의 특이적인 세포내 RNA와 직접 또는 간접적으로 상관성을 가진, 세포내 형광 신호를 제공하도록 설계된 올리고뉴클레오티드로 관능화된 나노 입자 접합체이다. 본원의 방법에서 검출하고자 하는 RNA는 mRNA 및 hnRNA를 포함하나, 이들로 한정되는 것은 아니다.
폴리펩타이드 결합 모이어티에 대해서도 유사한 메카니즘이 작용하는데, 이 메카니즘에서는, 물질이 마커로 표지되고, 상기 물질이 폴리펩타이드 결합 모이어티에 조합하면 상기 물질과 마커를 마커가 상대적으로 소광되기에 충분하게 나노 입자에 근접하도록 하는 방식으로 폴리펩타이드 결합 모이어티에 조합될 수 있다. 폴리펩타이드 결합 모이어티에 특이적인 타겟 분자가 조합되면, 상기 물질은 분리되거나 또는 본원에 기술된 나노-플레어로부터 분리되어, 나노 입자의 소광 효과는 완화된다.
결합 모이어티의 특이적인 성질과 상관없이, 플루오로포어로 표지된 올리고뉴클레오티드 또는 폴리펩타이드로 치밀하게 관능화된 나노 입자를 이용함으로써, 세포내 분자 검출과 일반적으로 관련있는 여러가지 문제점들이 개선된다. 이들 결합 모이어티는 미세주사나 세포 도입을 위한 보조 형질감염 시약을 필요로 하지 않으며, 효소적 분해에 대한 내성이 강하고, 연구 조건하에서는 무해하다.
폴리뉴클레오티드
본원에서, 나노 입자 상에 관능화된 것으로서 또는 타겟 분자로서의 용어 "폴리뉴클레오티드"는 올리고뉴클레오티드와 상호 호환적으로 사용된다.
용어 "뉴클레오티드" 또는 이의 복수형은 본원에 논의되어 있거나 당업계에 공지된 변형된 형태와 상호 호환적이다. 특정 예에서, 당업자는 천연 뉴클레오티드 뿐만 아니라 중합가능한 뉴클레오티드의 변형 형태를 망라하는 용어 "뉴클레오베이스"를 사용한다.
소정 서열의 폴리뉴클레오티드의 제조 방법은 당업계에 잘 알려져 있다. 예로, Sambrook et al ., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2nd ed. 1989) 및 F. Eckstein (ed.) Oligonucleotides and Analogues, 1st Ed. (Oxford University Press, New York, 1991)를 참조한다. 고상 합성 방법은 올리고리보뉴클레오티드 및 올리고데옥시리보뉴클레오티드(공지된 DNA 합성 방법도 RNA 합성에 사용가능함) 모두에 바람직하다. 올리고리보뉴클레오티드 및 올리고데옥시리보뉴클레오티드 역시 효소적으로 제조할 수 있다.
다양한 측면에 있어서, 제공되는 방법은 DNA 올리고뉴클레오티드, RNA 올리고뉴클레오티드 또는 이들 2가지 타입의 조합인, 폴리뉴클레오티드의 사용을 포함한다. 또한, 올리고뉴클레오티드의 변형된 형태는, 하나 이상의 변형된 뉴클레오티드간의 연결이 있는 형태를 포함하는 것으로 간주된다. 변형된 폴리뉴클레오티드 또는 올리고뉴클레오티드는 본원의 하기에서 상세하게 설명된다.
변형된 폴리고뉴클레오티드
올리고뉴클레오티드의 구체적인 예로는, 변형된 벡본이나 비천연적인 뉴클레오시드간의 연결을 포함하는 것이다. 변형된 벡본을 포함하는 올리고뉴클레오티드는 벡본에 P 원자를 가지고 있는 것, 벡본에 P 원자를 가지고 있지 않은 것을 포함한다. 이의 뉴클레오시드 벡본에 P 원자가 없는 변형된 올리고뉴클레오티드는 "올리고뉴클레오티드"에 포함되는 것으로 간주된다.
P 원자를 포함하는 변형된 올리고뉴클레오티드 벡본으로는, 예컨대 포스포로티오에이트, 키랄 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트, 포스포트리에스테르, 아미노알킬포스포트리에스테르, 메틸 및 그외 알킬 포스포네이트, 예컨대 3'-알킬렌 포스포네이트, 5'-알킬렌 포스포네이트 및 키랄 포스포네이트, 포스피네이트, 포스포르아미데이트, 예컨대 3'-아미노포스포르아미데이트 및 아미노알킬포스포르아미데이트, 티오노포스포르아미데이트, 티오노알킬포스포네이트, 티오노알킬포스포트리에스테르, 정상적인 3'-5' 연결, 이의 2'-5' 연결 유사체를 가진 셀레노포스페이트 및 보라노포스페이트, 및 하나 이상의 뉴클레오티드 연결이 3' -> 3', 5' -> 5' 또는 2' -> 2' 연결인, 역극성 물질을 포함한다. 또한, 3'-최대 뉴클레오티드간 연결에서 하나의 3' -> 3' 연결, 즉 어베이직(abasic)일 수 있는 하나의 역위된 뉴클레오시드 잔기(뉴클레오티드가 생략되거나 또는 그 위치에 하이드록시기가 있음)를 포함하는 역극성의 올리고뉴클레오티드도 고려된다. 또한, 염, 혼성 염 및 유리 산 형태도 고려된다. 상기 P 함유 연결의 제조 방법을 기술한 대표적인 미국 특허로는, 미국특허 3,687,808; 4,469,863; 4,476,301; 5,023,243; 5,177,196; 5,188,897; 5,264,423; 5,276,019; 5,278,302; 5,286,717; 5,321,131; 5,399,676; 5,405,939; 5,453,496; 5,455,233; 5,466,677; 5,476,925; 5,519,126; 5,536,821; 5,541,306; 5,550,111; 5,563,253; 5,571,799; 5,587,361; 5,194,599; 5,565,555; 5,527,899; 5,721,218; 5,672,697 및 5,625,050이 있으며, 이들은 원용에 의해 본 명세서에 그 내용이 포함된다.
벡본에 P 원자를 포함하지 않는 변형된 올리고뉴클레오티드 벡본은 단쇄 알킬 또는 사이클로알킬 뉴클레오시드간 연결, 혼성 이종원자 및 알킬 또는 사이클로알킬 뉴클레오시드간 연결, 또는 하나 이상의 단쇄 이종원자의 뉴클레오시드 연결 또는 헤테로사이클릭 뉴클레오시드 연결에 의해 형성된 벡본을 가진다. 이들은, 모르폴리노 연결을 가진 벡본; 실록산 벡본; 설파이드, 설폭사이드 및 설폰 벡본; 포름아세틸 및 티오포름아세틸 벡본; 메틸렌 포름아세틸 및 티오포름아세틸 벡본; 리보아세틸 벡본; 알켄 함유성 벡본; 설파메이트 벡본; 메틸렌이미노 및 메틸렌하이드라지노 벡본; 설포네이트 및 설폰아미드 벡본; 아미드 벡본; 및 그외 혼성 N, O, S 및 CH2 구성 파트를 가진 벡본을 포함한다. 예로, 미국특허 5,034,506; 5,166,315; 5,185,444; 5,214,134; 5,216,141; 5,235,033; 5,264,562; 5,264,564; 5,405,938; 5,434,257; 5,466,677; 5,470,967; 5,489,677; 5,541,307; 5,561,225; 5,596,086; 5,602,240; 5,610,289; 5,602,240; 5,608,046; 5,610,289; 5,618,704; 5,623,070; 5,663,312; 5,633,360; 5,677,437; 5,792,608; 5,646,269 및 5,677,439를 참조하며, 이들은 원용에 의해 본 명세서에 그 내용이 포함된다.
다른 예로, 하나 이상의 당 및/또는 뉴클레오티드 유닛의 하나 이상의 뉴클레오티드간 연결이 "비-천연" 기로 치환된, 올리고뉴클레오티드 모방체도 고려된다. 일 측면에서, 이러한 예는, 펩타이드 핵산(PNA)을 포함한다. PNA 화합물에서, 올리고뉴클레오티드의 당-벡본은 아미드 함유성 벡본으로 치환되어 있다. 예컨대, 미국특허 5,539,082; 5,714,331; 및 5,719,262, 및 Nielsen et al ., 1991, Science,, 254: 1497-1500을 참조하며, 이들은 원용에 의해 본 명세서에 그 내용이 포함된다.
또다른 예에서, 포스포로티오에이트 벡본을 구비한 올리고뉴클레오티드 및 이종원자 벡본을 구비한 올리고뉴클레오시드가 있으며, 미국특허 5,489,677 및 5,602,240에 기술된 -CH2-NH-O-CH2-, -CH2-N(CH3)-O-CH2-, -CH2-O-N(CH3)-CH2-, -CH2-N(CH3)-N(CH3)-CH2- 및 -O-N(CH3)-CH2-CH2-가 있다. 또한, 미국특허 5,034,506에 기술된 모르폴리노 벡본 구조를 가진 올리고뉴클레오티드도 고려된다.
다양한 예로, 올리고에서 2개의 연속되는 모노머 사이의 연결은, -CH2-, -O-, -S-, -NRH-, >C=O, >C=NRH, >C=S, -Si(R'')2-, -SO-, -S(O)2-, -P(O)2-, -PO(BH3) -, -P(O,S) -, -P(S)2-, -PO(R'')-, -PO(OCH3) - 및 -PO(NHRH)- 중에서 선택되는 2-4개의 기/원자, 바람직하기로는 3개의 기/원자로 이루어지며, 상기 RH는 수소 및 C1 -4-알킬 중에서 선택되며, R''은 C1 -6-알킬 및 페닐 중에서 선택된다. 이러한 연결의 예로는, -CH2-CH2-CH2-, -CH2-CO-CH2-, -CH2-CHOH-CH2-, -O-CH2-O-, -O-CH2-CH2-, -O-CH2-CH=(연속되는 모노머에 연결로서 사용될 때 R5 포함), -CH2-CH2-O-, -NRH-CH2-CH2-, -CH2-CH2-NRH-, -CH2-NRH-CH2- -, -O-CH2-CH2-NRH-, -NRH-CO-O-, -NRH-CO-NRH-, -NRH-CS-NRH-, -NRH-C(=NRH)-NRH-, -NRH-CO-CH2-NRH-O-CO-O-, -O-CO-CH2-O-, -O-CH2-CO-O-, -CH2-CO-NRH-, -O-CO-NRH-, -NRH-CO-CH2 -, -O-CH2-CO-NRH-, -O-CH2-CH2-NRH-, -CH=N-O-, -CH2-NRH-O-, -CH2-O-N=(연속되는 모노머에 연결로서 사용될 때 R5 포함), -CH2-O-NRH-, -CO-NRH- CH2-, - CH2-NRH-O-, - CH2-NRH-CO-, -O-NRH- CH2-, -O-NRH, -O- CH2-S-, -S- CH2-O-, - CH2- CH2-S-, -O- CH2- CH2-S-, -S- CH2-CH=(연속되는 모노머에 연결로서 사용될 때 R5 포함), -S- CH2- CH2-, -S- CH2- CH2-- O-, -S- CH2- CH2-S-, - CH2-S- CH2-, - CH2-SO- CH2-, - CH2-SO2- CH2-, -O-SO-O-, -O-S(O)2-O-, -O-S(O)2- CH2-, -O-S(O)2-NRH-, -NRH-S(O)2- CH2-; -O-S(O)2- CH2-, -O-P(O)2-O-, -O-P(O,S)-O-, -O-P(S)2-O-, -S-P(O)2-O-, -S-P(O,S)-O-, -S-P(S)2-O-, -O-P(O)2-S-, -O-P(O,S)-S-, -O-P(S)2-S-, -S-P(O)2-S-, -S-P(O,S)-S-, -S-P(S)2-S-, -O-PO(R'')-O-, -O-PO(OCH3)-O-, -O-PO(O CH2CH3)-O-, -O-PO(O CH2CH2S-R)-O-, -O-PO(BH3)-O-, -O-PO(NHRN)-O-, -O-P(O)2-NRH H-, -NRH-P(O)2-O-, -O-P(O,NRH)-O-, - CH2-P(O)2-O-, -O-P(O)2- CH2-, 및 -O-Si(R'')2-O-; 특히 -CH2-CO-NRH-, - CH2-NRH-O-, -S- CH2-O-, -O-P(O)2-O-O-P(-O, S)-O-, -O-P(S)2-O-, -NRH P(O)2-O-, -O-P(O,NRH)-O-, -O-PO(R'')-O-, -O-PO(CH3)-O-, 및 -O-PO(NHRN)-O-이며, RH는 수소 및 C1 -4-알킬 중에서 선택되고, R''는 C1 -6-알킬 및 페닐 중에서 선택된다. 다른 예들은, Mesmaeker et . al ., 1995, Current Opinion in Structural Biology, 5: 343-355 및 Susan M. Freier and Karl-Heinz Altmann, 1997, Nucleic Acids Research, vol 25: pp 4429-4443에 기재되어 있다.
올리고뉴클레오티드의 또다른 변형된 형태는 미국 특허 출원 20040219565에 상세히 기재되어 있으며, 그 내용은 원용에 의해 그 전체가 본 발명에 포함된다.
또한, 변형된 올리고뉴클레오티드는 하나 이상의 치환된 당 모이어티를 포함할 수 있다. 특정 예로, 폴리뉴클레오티드는 2' 위치에, OH; F; O-, S-, 또는 N-알킬; O-, S-, 또는 N-알케닐; O-, S- 또는 N-알키닐; 또는 O-알킬-O-알킬 중 하나를 포함하며, 여기에서 알킬, 알케닐 및 알키닐은 치환되거나 치환되지 않은 C1 - C10 알킬 또는 C2 - C10 알케닐 및 알키닐일 수 있다. 다른 예로, O[(CH2)nO]mCH3, O(CH2)nOCH3, O(CH2)nNH2, O(CH2)nCH3, O(CH2)nONH2, 및 O(CH2)nON[(CH2)nCH3]2가 있으며, 상기에서 n 및 m은 약 1 내지 10이다. 그외 올리고뉴클레오티드로는, 2' 위치에, C1 - C10 저급 알킬, 치환된 저급 알킬, 알케닐, 알키닐, 알크아릴, 아르알킬, O-알크아릴 또는 O-아르알킬, SH, SCH3, OCN, Cl, Br, CN, CF3, OCF3, SOCH3, SO2CH3, ONO2, NO2, N3, NH2, 헤테로사이클로알킬, 헤테로사이클로알크아릴, 아미노알킬아미노, 폴리알킬아미노, 치환된 실릴, RNA 절단기(cleaving group), 리포터기, 인터칼레이터, 올리고뉴클레오티드의 약동학적 특성을 향상시키는 기, 또는 올리고뉴클레오티드의 약력학적 특성을 향상시키는 기, 및 그외 유사한 특성을 가진 치환기 중 하나를 포함한다. 일측면에서, 변형 형태는 2'-메톡시에톡시(2'-O-CH2CH2OCH3, 또한 2'-O-(2-메톡시에틸) 또는 2'-MOE라 함)(Martin et al ., 1995, Helv . Chim . Acta, 78: 486-504), 즉, 알콕시알콕시기를 포함한다. 다른 변형은, 2'-디메틸아미노옥시에톡시, 즉, 하기 실시예에 기재된 2'-DMAOE라고도 하는 O(CH2)2ON(CH3)2 기와 2'-디메틸아미노에톡시에톡시(또한, 당업계에서는 2'-O-디메틸-아미노-에톡시-에틸 또는 2'-DMAEOE라 함), 즉, 하기 실시예에 기재된 2'-O-CH2-O-CH2-N(CH3)2를 포함한다.
또다른 변형으로는, 2'-메톡시(2'-O-CH3), 2'-아미노프로폭시(2'-OCH2CH2CH2NH2), 2'-알릴(2'-CH2-CH=CH2), 2'-O-알릴(2'-O-CH2-CH=CH2) 및 2'-플루오로(2'-F)가 있다. 2'-변형은 아라비노(up) 위치나 리보(down) 위치에 있을 수 있다. 일 측면으로, 2'-아라비노 변형은 2'-F이다. 유사 변형은 또한 올리고뉴클레오티드 상의 다른 위치에, 예컨대 3' 말단 뉴클레오티드 상의 당의 3' 위치나 또는 2'-5' 연결된 올리고뉴클레오티드 및 5' 말단 뉴클레오티드의 5' 위치에 있을 수 있다. 또한, 올리고뉴클레오티드는 사이클로부틸 모이어티와 같은 당 모방체를 펜토퓨라노실 당 위치에 가질 수 있다. 예로, 미국특허 4,981,957; 5,118,800; 5,319,080; 5,359,044; 5,393,878; 5,446,137; 5,466,786; 5,514,785; 5,519,134; 5,567,811; 5,576,427; 5,591,722; 5,597,909; 5,610,300; 5,627,053; 5,639,873; 5,646,265; 5,658,873; 5,670,633; 5,792,747; 및 5,700,920을 참조하며, 이들은 원용에 의해 본 명세서에 그 내용이 포함된다.
일 측면에 있어서, 당의 변형은 2'-하이드록시기가 당 고리의 3' 또는 4' 탄소 원자에 연결되어, 이환식 당 모이어티를 형성하는, LNA(Locked Nucleic Acid)를 포함한다. 특정 측면에서, 연결은 메틸렌(-CH2-)n 기가 2' 산소 원자와 4' 탄소 원자를 연결하는 연결이며, 여기에서 n은 1 또는 2이다. LNA 및 이의 제조 방법은 WO 98/39352 및 WO 99/14226에 기술되어 있다.
또한, 올리고뉴클레오티드는 염기 변형 또는 치환을 포함할 수 있다. 본원에서, "비변형된" 또는 "천연" 염기는 퓨린 염기인 아데닌(A) 및 구아닌(G)과 피리미딘 염기인 티민(T), 사이토신(C) 및 우라실(U)을 포함한다. 변형된 염기는 5-메틸사이토신(5-me-C), 5-하이드록시메틸 사이토신, 크산틴, 하이폭산틴, 2-아미노아데닌, 아데닌 및 구아닌의 6-메틸 및 그외 알킬 유도체, 아데닌 및 구아닌의 2-프로필 및 그외 알킬 유도체, 2-티오우라실, 2-티오티민 및 2-티오사이토신, 5-할로우라실 및 사이토신, 피리미딘 염기의 5-프로피닐 우라실 및 사이토신 및 그외 알키닐 유도체, 6-아조 우라실, 사이토신 및 티민, 5-우라실 (슈도우라실), 4-티오우라실, 8-할로, 8-아미노, 8-티올, 8-티오알킬, 8-하이드록실 및 그외 8-치환된 아데닌 및 구아닌, 5-할로 특히 5-브로모, 5-트리플루오로메틸 및 그외 5-치환된 우라실 및 사이토신, 7-메틸구아닌 및 7-메틸아데닌, 2-F-아데닌, 2-아미노-아데닌, 8-아자구아닌 및 8-아자아데닌, 7-데아자구아닌 및 7-데아자아데닌 및 3-데아자구아닌 및 3-데아자아데닌 등의 그외 합성 및 천연 염기를 포함한다. 다른 변형된 염기로는, 3환식 피리미딘, 예컨대 페녹사진 시티딘(1H-피리미도[5,4-b][1,4]벤조옥사진-2(3H)-온), 페노티아진 시티딘(1H-피리미도[5,4-b][1,4]벤조티아진-2(3H)-온), 치환된 페녹사진 시티딘(예, 9-(2-아미노에톡시)-H-피리미도[5,4-b][1,4]벤조옥사진-2(3H)-온)과 같은 G-clamp, 카르바졸 시티딘 (2H-피리미도[4,5-b]인돌-2-온), 피리도인돌 시티딘(H-피리도[3',2':4,5]피롤로[2,3-d]피리미딘-2-온)을 포함한다. 변형된 염기는, 또한, 퓨린 또는 피리미딘 염기가 다른 헤테로사이클, 예컨대 7-데아자-아데닌, 7-데아자구아노신, 2-아미노피리딘 및 2-피리돈으로 치환된 염기를 포함할 수 있다. 추가적인 염기들은 미국 특허 3,687,808에 기술된 염기를 포함하며, 이들 염기는 The Concise Encyclopedia Of Polymer Science And Engineering, pages 858-859, Kroschwitz, J. I., ed. John Wiley & Sons, 1990, Englisch et al ., 1991, Angewandte Chemie, International Edition, 30: 613, Sanghvi, Y. S., Chapter 15, Antisense Research and Applications, pages 289-302, Crooke, S. T. and Lebleu, B., ed., CRC Press, 1993에 기재되어 있다. 이들 염기 중 일부는 결합 친화력을 증가시키는데 유용하며, 그 예로는 5-치환된 피리미딘, 6-아자피리미딘 및 N-2, N-6 및 O-6 치환된 퓨린, 예컨대 2-아미노프로필아데닌, 5-프로피닐우라실 및 5-프로피닐사이토신이 있다. 5-메틸사이토신 치환이 핵산 이중나선의 안정성을 0.6-1.2℃ 증가시킨다는 것은 입증되어 있으며, 이는 2'-O-메톡시에틸 당 변형이 조합된 특정 예이다. 미국특허 3,687,808, 미국특허 4,845,205; 5,130,302; 5,134,066; 5,175,273; 5,367,066; 5,432,272; 5,457,187; 5,459,255; 5,484,908; 5,502,177; 5,525,711; 5,552,540; 5,587,469; 5,594,121, 5,596,091; 5,614,617; 5,645,985; 5,830,653; 5,763,588; 6,005,096; 5,750,692 및 5,681,941을 참조하며, 이들 문헌은 원용에 의해 본 발명에 포함된다.
"변형된 염기" 또는 그외 유사 용어는 천연 염기(예, 아데닌, 구아닌, 사이토신, 우라실, 및/또는 티민)와 쌍을 이룰 수 있거나 및/또는 비천연 염기와 쌍을 이룰 수 있는 구성을 의미한다. 특정 측면에서, 변형된 염기는 15, 12, 10, 8, 6, 4 또는 2℃나 그 미만의 Tm 차이를 제공한다. 변형된 염기의 예는 EP 1 072 679 및 WO 97/12896에 기재되어 있다.
"뉴클레오베이스"는 천연 뉴클레오베이스인 아데닌(A), 구아닌(G), 사이토신(C), 티민(T) 및 우라실(U)과, 크산틴, 디아미노퓨린, 8-옥소-N6-메틸아데닌, 7-데아자크산틴, 7-데아자구아닌, N4,N4-에타노사이토신, N',N'-에타노-2,6-디아미노퓨린, 5-메틸사이토신(mC), 5-(C3-C6)-알키닐-사이토신, 5-플루오로우라실, 5-브로모우라실, 슈도이소사이토신, 2-하이드록시-5-메틸-4-트리아졸로피리딘, 이소사이토신, 이소구아닌, 이노신 및 Benner et al ., 미국 특허. 5,432,272와 Susan M. Freier and Karl-Heinz Altmann, 1997, Nucleic Acids Research, vol. 25: pp 4429-4443에 기재된 비천연 뉴클레베이스 등의 비천연 뉴클레오베이스를 의미한다. 용어 "뉴클레오베이스"는 따라서 공지된 퓨린 및 피리미딘 헤테로사이클 뿐만 아니라 이의 헤테로사이클릭 유사체와 호변이성체를 포함한다. 이외의 천연 및 비천연 뉴클레오베이스로는, 미국 특허 3,687,808 (Merigan, et al .), Chapter 15 by Sanghvi, in Antisense Research and Application, Ed. S. T. Crooke and B. Lebleu, CRC Press, 1993, in Englisch et al ., 1991, Angewandte Chemie, International Edition, 30: 613-722(특히 페이지 622 및 623 참조, 및 in the Concise Encyclopedia of Polymer Science and Engineering, J. I. Kroschwitz Ed., John Wiley & Sons, 1990, pages 858-859, Cook, Anti-Cancer Drug Design 1991, 6, 585-607, 상기 문헌들은 원용에 의해 그 전체가 본 명세서에 포함됨)에 언급된 것을 포함한다. 용어 "뉴클레오시딕 염기(nucleosidic base)" 또는 "염기 유닛(base unit)"은 가장 고전적인 의미로는 뉴클레오시딕 염기가 아니지만 뉴클레오시딕 염기로서 제공되는 "보편적인 염기(universal bases)" 등의, 유사 뉴클레오베이스를 제공할 수 있는 헤테로사이클릭 화합물과 같은 화합물을 포함하는 것으로 의도된다. 특히 보편적인 염기로, 3-니트로피롤, 선택적으로 치환된 인돌(예, 5-니트로인돌) 및 선택적으로 치환된 하이폭산틴이 언급된다. 그외 바람직한 보편적인 염기로는, 피롤, 디아졸 또는 트리아졸 유도체, 예컨대 당업계에 공지된 보편적인 염기가 있다.
폴리펩타이드
본원에서, 용어 "폴리펩타이드"는 펩타이드, 단백질, 아미노산의 폴리머, 호르몬, 바이러스 및 천연 유래의, 합성 제조한 또는 재조합 제조한 항체를 의미한다. 또한, 폴리펩타이드는 지단백질과, 예컨대 당화된 단백질과 같이 번역후 변형될 단백질 뿐만 아니라 D-아미노산, D- 또는 L- 배위의 변형된, 유도체화된 또는 비천연 아미노산, 및/또는 그것의 구조의 일부분으로서 펩티드모방체인, 단백질 또는 단백질 기질을 포함한다.
본원에 제공된 방법에 사용이 고려되는 펩타이드는 시판되는 소스 유래의 펩타이드를 포함한다. 라이브러리는, 각 라이브러리에서 개별 펩타이드 구조체의 수가 전형적으로 10억개 이상이며 6개 내지 12개의 아미노산 크기의 소형, 이황화결합의 사이클릭 펩타이드를 포함하는 구조화된 펩타이드 라이브러리; (ii) 20-mer 펩타이드에서 각 위치에 모두 19개의 아미노산(시스테인 제외)으로 100억개의 펩타이드로 구성된 라이브러리를 만들 수 있는 선형 펩타이드 라이브러리; (iii) 13-mer 펩타이드에서 각 위치에 19개의 아미노산(시스테인 제외)으로 약 1억개의 펩타이드로 구성된 라이브러리를 제조할 수 있는 기질 파지(substrate phage) 펩타이드 라이브러리를 포함한다.
시판되는 펩타이드 라이브러리로는 Peptide libraries Eurogentec s.a. (Belgium), Dyax Corp.(Cambridge, MA) 및 Cambridge Peptide(Cambridge, UK)사의 제품이 있다.
본 방법의 실시에 이용가능한 펩타이드 라이브러리의 제조 방법은, Jung (ed) Combinatorial Peptide and Nonpeptide Libraries : A Handbook 및 Devlin et al., 1990, Science, Vol 249, Issue 4967: 404-406에 기술된 바와 같이, 당업계에 잘 공지되어 있을 뿐만 아니라, 예컨대 Sigma-Genosys 사의 시판되는 합성 키트를 사용하여 제조할 수 있다.
본원의 방법에 사용이 고려되는 단백질은, Matsuura, et al ., 2002, Protein Science 11: 2631-2643, Ohuchi et al ., 1998, Nucleic Acids Res . October 1; 26(19): 4339-346, WO/1999/011655, WO/1998/047343, 미국특허 6844161 및 미국특허 6403312에 언급된 바와 같이 합성 단백질 라이브러리 유래의 것을 포함한다. 또한, 단백질 라이브러리 제조를 위한 시판되는 키트도 당업계에 공지되어 있으며, 예컨대 BioCat GmbH (Heidelberg) 사의 것을 이용할 수 있다.
방법의 실시에 이용가능한 단백질 라이브러리는 또한 예컨대 Dyax Corp. (Cambridge, MA) 사로부터 상업적으로 구입할 수 있다.
검출가능한 마커 /표지
본원에서 "마커"는 "표지"와 상호 호환적이며, 식별되는 화합물의 상호작용 타입과 상관없이, 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩타이드 복합체의 형성이 관찰가능한 변화로 검출되는 방법을 제공한다. 일 측면에 있어서, 복합체 형성은 육안이나 분광기로 관찰되는 색 변화를 일으킨다. 금 나노 입자를 이용하였을 때, 종종 육안으로 검출되는, 나노 입자의 응집(nanoparticle aggregation)과 함께 붉은색에서의 파란색으로의 색 변화가 이루어진다. 본 발명에서, 응집은 각각이 타겟 분자의 특이적이고 상이한 부위에 대한 결합 모이어티를 가지고 있는 개별 나노 입자가 동일한 타겟 분자에 결합함으로써 이루어지는 것으로 생각된다.
다른 측면에 있어서, 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩타이드 복합체 형성은 전자 현미경 또는 네펠로법(nephelometry)으로 관찰되는 응집 형성을 발생시킨다. 일반적으로 나노 입자의 응집은 플라스몬 공명의 감소를 일으킨다. 또다른 측면에 있어서, 복합체 형성은 육안이나 현미경으로 관찰되는 응집된 나노 입자의 침전을 유발한다.
육안으로의 색 변화 관찰은, 일 측면에 있어서, 대비 색의 백그라운드에 반하여 이루어진다. 예컨대, 금 나노 입자를 사용하였을 때, 색 변화의 관찰은 고형 백색 표면(예, 비제한적으로 실리카 또는 알루미나 TLC 플레이트, 필터지, 셀룰로스 나이트레이트막, 나일론막 또는 C-18 실리카 TLC 플레이트) 상에서 혼성 용액 샘플을 점적하고, 스팟을 건조시켜, 수행된다. 처음에, 스팟은 혼성화가 이루어지지 않은 경우에는 분홍색/붉은색이고, 혼성화된 경우에는 보라빛의 붉은색/보라색인, 혼성화 용액의 색을 띈다. 실온이나 80 ℃(온도는 중요하지 않음)에서 건조시, 나노 입자-올리고뉴클레오티드 접합체가 점적하기 전에 혼성화에 의해 연결되었다면 파란색 스팟으로 발색된다. 혼성화가 이루어지지 않은 경우에는, 스팟은 분홍색이다. 파란색 스팟과 분홍색 스팟은 안정적이며, 이후의 냉각이나 열처리나 또는 시간 경과에 따라 색이 변화지 않아, 테스트 결과를 쉽고 영구적으로 기록할 수 있다. 색 변화를 관찰하기 위한 다른 단계(혼성화된 및 비혼성화된 나노 입자-올리고뉴클레오티드 접합체의 분리 등의 단계)는 필요하지 않다.
본 발명의 방법의 실시 결과를 가시화하는 또다른 방법은, 유리 섬유 필터 상에 액체를 필터를 통해 끌어 올리면서 나노 입자 프로브 샘플을 점적하는 방법이다(예, Borosilicate Microfiber Filter, 포어 크기 0.7 ㎛, grade FG75, 13nm의 금 나노 입자와 이용). 이후, 과잉의 비혼성화된 프로브는 필터를 통해 헹구어 내면, 나노 입자 프로브의 혼성화에 의해 형성된 응집체를 포함하는 관찰가능한 스팟만 남게된다(이들 응집체들은 필터의 크기보다 커서 체류됨). 이러한 기법으로, 과량의 나노 입자 프로브를 사용할 수 있기 때문에, 민감성을 높일 수 있다.
고려되는 마커는 본원에 기술된 임의의 플루오로포어와 당업계에 공지된 그외 검출가능한 마커를 포함하는 것으로 이해될 것이다. 예컨대, 또한 마커는 비제한적으로 레독스 활성 프로브(redox active probe), 그외 나노 입자 및 퀀텀 도트(quantum dot), 뿐만 아니라 분광 수단을 이용하여 검출할 수 있는 모든 마커, 즉 현미경 및 세포분석기(cytometry)를 이용하여 검출할 수 있는 마커를 포함한다.
올리고뉴클레오티드의 표지 방법
형광 분자로 올리고뉴클레오티드를 표지하는 방법과 형광을 측정하는 방법은 당업계에 잘 알려져 있다. 적합한 형광 분자도 당업계에 잘 알려져 있으며, 그 예로는 1,8-ANS(1-아닐리노나프탈렌-8-설폰산), 1-아닐리노나프탈렌-8-설폰산(1,8-ANS), 5-(및 -6)-카르복시-2',7'-디클로로플루오레세인 pH 9.0, 5-FAM pH 9.0, 5-ROX(5-카르복시-X-로다민, 트리에틸암모늄염), 5-ROX pH 7.0, 5-TAMRA, 5-TAMRA pH 7.0, 5-TAMRA-MeOH, 6 JOE, 6,8-디플루오로-7-하이드록시-4-메틸쿠마린(coumarin) pH 9.0, 6-카르복시로다민 6G pH 7.0, 6-카르복시로다민 6G, 하이드로클로라이드, 6-HEX, SE pH 9.0, 6-TET, SE pH 9.0, 7-아미노-4-메틸쿠마린 pH 7.0, 7-하이드록시-4-메틸쿠마린, 7-하이드록시-4-메틸쿠마린 pH 9.0, Alexa 350, Alexa 405, Alexa 430, Alexa 488, Alexa 532, Alexa 546, Alexa 555, Alexa 568, Alexa 594, Alexa 647, Alexa 660, Alexa 680, Alexa 700, Alexa Fluor 430 항체 접합체 pH 7.2, Alexa Fluor 488 항체 접합체 pH 8.0, Alexa Fluor 488 하이드라지드-물(hydrazide-water), Alexa Fluor 532 항체 접합체 pH 7.2, Alexa Fluor 555 항체 접합체 pH 7.2, Alexa Fluor 568 항체 접합체 pH 7.2, Alexa Fluor 610 R-피코에리트린 스트렙타비딘 pH 7.2, Alexa Fluor 647 항체 접합체 pH 7.2, Alexa Fluor 647 R-피코에리트린 스트렙타비딘 pH 7.2, Alexa Fluor 660 항체 접합체 pH 7.2, Alexa Fluor 680 항체 접합체 pH 7.2, Alexa Fluor 700 항체 접합체 pH 7.2, 알로피코시아닌(Allophycocyanin) pH 7.5, AMCA 접합체, 아미노 쿠마린, APC(allophycocyanin), Atto 647, BCECF pH 5.5, BCECF pH 9.0, BFP(Blue Fluorescent Protein), BO-PRO-1-DNA, BO-PRO-3-DNA, BOBO-1-DNA, BOBO-3-DNA, BODIPY 650/665-X, MeOH, BODIPY FL conjugate, BODIPY FL, MeOH, Bodipy R6G SE, BODIPY R6G, MeOH, BODIPY TMR-X 항체 접합체 pH 7.2, Bodipy TMR-X conjugate, BODIPY TMR-X, MeOH, BODIPY TMR-X, SE, BODIPY TR-X 팔라시딘(phallacidin) pH 7.0, BODIPY TR-X, MeOH, BODIPY TR-X, SE, BOPRO-1, BOPRO-3, 칼세인(Calcein), 칼세인 pH 9.0, 칼슘 크림선(Calcium Crimson, 칼슘 크림선 Ca2+, 칼슘 그린, 칼슘 그린-1 Ca2+, 칼슘 오렌지, 칼슘 오렌지 Ca2 +, 카르복시나프토플루오레세인 pH 10.0, 케스케이드 블루(Cascade Blue), 케스케이드 블루 BSA pH 7.0, 케스케이드 옐로우, 케스케이드 옐로우 항체 접합체 pH 8.0, CFDA, CFP(Cyan Fluorescent Protein), CI-NERF pH 2.5, CI-NERF pH 6.0, 시트린(Citrine), 쿠마린, Cy2, Cy3, Cy3.5, Cy5, Cy5.5, CyQUANT GR-DNA, 단실 카다베린(Dansyl Cadaverine), 단실 카다베린, MeOH, DAPI, DAPI-DNA, 다폭실(2-아미노에틸)설폰아미드, DDAO pH 9.0, Di-8 ANEPPS, Di-8-ANEPPS-리피드, DiI, DiO, DM-NERF pH 4.0, DM-NERF pH 7.0, DsRed, DTAF, dTomato, eCFP(Enhanced Cyan Fluorescent Protein), eGFP(Enhanced Green Fluorescent Protein), 에오신, 에오신 항체 접합체 pH 8.0, 에리트로신-5-이소티오시아네이트 pH 9.0, 에티듐 브로마이드, 에티듐 호모다이머, 에티듐 호모다이머-1-DNA, eYFP(Enhanced Yellow Fluorescent Protein), FDA, FITC, FITC 항체 접합체 pH 8.0, FlAsH, Fluo-3, Fluo-3 Ca2+, Fluo-4, Fluor-Ruby, 플루오레세인, 플루오레세인 0.1 M NaOH, 플루오레세인 항체 접합체 pH 8.0, 플루오레세인 덱스트란 pH 8.0, 플루오레세인 pH 9.0, 플루오로-Emerald, FM 1-43, FM 1-43 lipid, FM 4-64, FM 4-64, 2% CHAPS, Fura Red Ca2+, Fura Red, high Ca, Fura Red, low Ca, Fura-2 Ca2+, Fura-2, high Ca, Fura-2, no Ca, GFP (S65T), HcRed, Hoechst 33258, Hoechst 33258-DNA, Hoechst 33342, Indo-1 Ca2+, Indo-1, Ca free, Indo-1, Ca saturated, JC-1, JC-1 pH 8.2, 리스아민(Lissamine) 로다민, LOLO-1-DNA, Lucifer Yellow, CH, LysoSensor Blue, LysoSensor Blue pH 5.0, LysoSensor Green, LysoSensor Green pH 5.0, LysoSensor Yellow pH 3.0, LysoSensor Yellow pH 9.0, LysoTracker Blue, LysoTracker Green, LysoTracker Red, 마그네슘 그린, 마그네슘 그린 Mg2+, 마그네슘 오렌지, 마리나(Marina) 블루, mBanana, mCherry, mHoneydew, MitoTracker Green, MitoTracker Green FM, MeOH, MitoTracker Orange, MitoTracker Orange, MeOH, MitoTracker Red, MitoTracker Red, MeOH, mOrange, mPlum, mRFP, mStrawberry, mTangerine, NBD-X, NBD-X, MeOH, NeuroTrace 500/525, 그린 플루오레센트 니슬 염색(Nissl stain)-RNA, 나일 블루(Nile Blue), EtOH, 나일 레드, 나일-레드-리피드, 니슬, 오레곤 그린 488, 오레곤 그린 488 항체 접합체 pH 8.0, 오레곤 그린 514, 오레곤 그린 514 항체 접합체 pH 8.0, 퍼시픽 블루(Pacific Blue), 퍼시픽 블루 항체 접합체 pH 8.0, 피코에리트린, PicoGreen dsDNA 정량 시약, PO-PRO-1, PO-PRO-1-DNA, PO-PRO-3, PO-PRO-3-DNA, POPO-1, POPO-1-DNA, POPO-3, 프로피듐 요오드화물, 프로피듐 요오드화물-DNA, R-피코에리트린 pH 7.5, ReAsH, 레소루핀(Resorufin), 레소루핀 pH 9.0, Rhod-2, Rhod-2 Ca2+, 로다민, 로다민 110, 로다민 110 pH 7.0, 로다민 123, MeOH, 로다민 그린, 로다민 팔로이딘(phalloidin) pH 7.0, 로다민 레드-X 항체 접합체 pH 8.0, 로다민 그린 pH 7.0, 로돌 그린(Rhodol Green) 항체 접합체 pH 8.0, 사피르(Sapphire), SBFI-Na+, 소듐 그린 Na+, 설포로다민 101, EtOH, SYBR 그린 I, SYPRO Ruby, SYTO 13-DNA, SYTO 45-DNA, SYTOX Blue-DNA, 테트라메틸로다민 항체 접합체 pH 8.0, 테트라메틸로다민 덱스트란 pH 7.0, 텍사스 레드-X 항체 접합체 pH 7.2, TO-PRO-1-DNA, TO-PRO-3-DNA, TOTO-1-DNA, TOTO-3-DNA, TRITC, X-Rhod-1 Ca2 +, YO-PRO-1-DNA, YO-PRO-3-DNA, YOYO-1-DNA, 및 YOYO-3-DNA가 있으나, 이들로 한정되는 것은 아니다.
또다른 예로, 나노 입자가 이용하는 검출가능한 마커를 소광시키는 능력을 가지는 한, 2개의 상이한 입자에 부착된 2가지 타입의 형광-표지된 올리고뉴클레오티드를 사용할 수 있다. 적합한 입자로는, 폴리머성 입자(예, 폴리스티렌 입자, 폴리비닐 입자, 아크릴레이트 및 메타크릴레이트 입자가 있으나, 이들로 한정되지 않음), 유리 입자, 라텍스 입자, 세파로스 비드 및 그외 당업계에 잘 알려져 있는 것 등이 있다. 이러한 입자에 올리고뉴클레오티드를 부착시키는 방법은 당업계에 잘 알려져 있으며, 일상적으로 당업계에서 수행되고 있다. Chrisey et al ., 1996, Nucleic Acids Research, 24: 3031-3039 (glass) and Charreyre et al ., 1997 Langmuir, 13: 3103-3110, Fahy et al ., 1993, Nucleic Acids Research, 21: 1819-1826, Elaissari et al ., 1998, J. Colloid Interface Sci ., 202: 251-260, Kolarova et al ., 1996, Biotechniques, 20: 196-198 및 Wolf et al ., 1987, Nucleic Acids Research, 15: 2911-2926 (polymer/latex)을 참조한다.
화학발광 분자와 같은, 형광 분자 이외의, 혼성화시 검출가능한 신호나 검출가능한 신호의 변화를 제공하는, 다른 표지 물질도 사용할 수 있다.
나노 입자
본원에서, "나노 입자"는 어느 한쪽의 크기가 10 ㎛ 미만, 바람직하게는 5 ㎛ 미만인 소형 구조를 의미한다. 일반적으로, 본 발명의 나노 입자는 본원에 기술된 올리고뉴클레오티드에 대한 높은 하중력(loading capacity)을 가진 모든 화합물 또는 물질을 포함한다. 본 발명의 실시에 유용한 나노 입자로는, 나노 입자가 검출가능한 마커를 소광시키는 능력을 가지는, 금(예, 금, 은, 구리 및 백금), 반도체(예, CdSe, CdS, 및 ZnS로 코팅된 CdSe 또는 CdS) 및 마그네틱(예, 페로마그네틱) 콜로이달 물질을 포함한다. 본 발명의 실시에 유용한 그외 나노 입자로는 ZnS, ZnO, TiO2, AgI, AgBr, HgI2, PbS, PbSe, ZnTe, CdTe, In2S3, In2Se3, Cd3P2, Cd3As2, InAs, 및 GaAs가 있다. 나노 입자의 크기는 바람직하기로는 약 5 nm 내지 약 150 nm(평균 직경), 더 바람직하기로는 약 5 내지 약 50 nm, 가장 바람직하기로는 약 10 내지 약 30 nm이다. 나노 입자의 크기는, 약 5 내지 약 10 nm, 또는 약 5 내지 약 20 nm, 또는 약 5 내지 약 30 nm, 또는 약 5 내지 약 40 nm, 또는 약 5 내지 약 60 nm, 또는 약 5 내지 약 70 nm, 또는 약 5 내지 약 80 nm, 또는 약 5 내지 약 90 nm, 또는 약 5 내지 약 100 nm, 또는 약 5 내지 약 110 nm, 또는 약 5 내지 약 120 nm, 또는 약 5 내지 약 130 nm, 또는 약 5 내지 약 140 nm, 또는 약 10 내지 약 20 nm, 또는 약 10 내지 약 40 nm, 또는 약 10 내지 약 50 nm, 또는 약 10 내지 약 60 nm, 또는 약 10 내지 약 70 nm, 또는 약 10 내지 약 80 nm, 또는 약 10 내지 약 90 nm, 또는 약 10 내지 약 100 nm, 또는 약 10 내지 약 110 nm, 또는 약 10 내지 약 120 nm, 또는 약 10 내지 약 130 nm, 또는 약 10 내지 약 140 nm, 또는 약 10 내지 약 150 nm일 수 있다. 또한, 나노 입자는 막대, 프리즘 또는 사면체일 수 있다.
따라서, 비제한적으로 금속, 반도체 물질 또는 미국 특허 출원번호 20030147966에 언급된 세라믹 등의 다양한 무기 물질을 포함하는 나노 입자가, 본 발명의 이용되는 것을 고려한다. 예컨대, 금속 기반의 나노 입자는 본원에 개시된 것을 포함한다. 세라믹 나노 입자 물질로는, 브러사이트(brushite), 트리칼슘 포스페이트, 알루미나, 실리카 및 지르코니아 등이 있으나, 이들로 한정되는 것은 아니다. 나노 입자로 제조되는 유기 물질로는 탄소가 있다. 나노 입자 폴리머로는 폴리스피렌, 실리콘 고무, 폴리카보네이트, 폴리우레탄, 폴리프로필렌, 폴리메틸메타크릴레이트, 폴리비닐 클로라이드, 폴리에스테르, 폴리에테르 및 폴리에틸렌을 포함한다. 생분해성의 바이오폴리머(예, 폴리펩타이드, 예컨대 BSA, 다당류 등), 그외 생물 물질(예, 탄수화물) 및/또는 폴리머성 화합물도 나노 입자 제조에 이용되는 것으로 생각된다.
실제, 당업계에 공지된 검출 분석에 이용하기에 일반적으로 어느 정도 적합하고, 폴리뉴클레오티드 복합체 형성, 즉 이중 가닥 또는 삼중 가닥 복합체를 형성하기 위한 혼성화를 방해하지 않는, 나노 입자에 부착된 분자를 가지고 있는 모든 적합한 나노 입자를 이용하는 방법을 제공한다. 입자의 크기, 형태 및 화학 조성은 제조되는 올리고뉴클레오티드-관능화된 나노 입자의 특성에 기여한다. 이러한 특성은, 예컨대 광학 특성, 광전자 특성, 전기화학적 특성, 전기적 특성, 다양한 용액에서의 안정성, 마그네틱 특성 및 포어(pore)와 채널 크기 다양성을 포함한다. 크기, 형태 및/또는 화학 조성이 다양한 입자들의 혼합물의 이용 뿐만 아니라 크기, 형태 및 화학 조성이 일정한 나노 입자의 이용도 고려된다. 적합한 입자의 예로는, 나노 입자, 응집 입자(aggregate particle), 등방성(예 구형 입자) 입자, 이방성 입자(예, 비구형 막대, 사면체, 프리즘), 2002년 12월 28일자 미국 특허 출원번호 10/034,451과 2002년 12월 28일자 PCT/US01/50825에 기재된 입자와 같은 코어-셸 입자를 비제한적으로 포함하며, 상기 문헌들은 그 전체가 원용에 의해 본 명세서에 포함된다.
금속, 반도체 및 마그네틱 나노 입자의 제조 방법은 당업계에 잘 알려져 있다. 예컨대, Schmid, G. (ed.) Clusters and Colloids (VCH, Weinheim, 1994); Hayat, M. A. (ed.) Colloidal Gold: Principles, Methods, and Applications (Academic Press, San Diego, 1991); Massart, R., IEEE Transactions On Magnetics, 17, 1247 (1981); Ahmadi, T. S. et al ., Science, 272, 1924 (1996); Henglein, A. et al ., J. Phys . Chem ., 99, 14129 (1995); Curtis, A. C. et al ., Angew. Chem . Int . Ed . Engl ., 27, 1530 (1988)을 참조한다. 폴리알킬시아노아크릴레이트 나노 입자의 제조 방법은 Fattal, et al ., J. Controlled Release (1998) 53: 137-143 및 미국특허 4,489,055에 기술되어 있다. 폴리(D-글루카르아미도아민)을 포함하는 나노 입자의 제조 방법은 Liu, et al ., J. Am . Chem . Soc . (2004) 126:7422-7423에 기술되어 있다. 중합된 메틸메타크릴레이트(MMA)를 포함하는 나노 입자의 제조 방법은 Tondelli, et al ., Nucl . Acids Res . (1998) 26:5425-5431에 기술되어 있으며, 덴드리머 나노 입자의 제조 방법은 예컨대 Kukowska-Latallo, et al., Proc . Natl . Acad . Sci . USA (1996) 93:4897-4902 (Starburst polyamidoamine dendrimers)에 기술되어 있다.
또한, 적합한 나노 입자들은 상업적으로 구입, 예컨대 Ted Pella, Inc. (gold), Amersham Corporation (gold) 및 Nanoprobes, Inc. (gold) 사로부터 구입가능하다.
또한, 미국 특허 20030147966에 기술된 바와 같이, 본원에 기술된 물질을 포함하는 나노 입자는 상업적으로 구입하거나, 또는 용액 중에서 진행성 핵형성(progressive nucleation)(예, 콜로이드 반응에 의해), 또는 스푸터 증착(sputter deposition)과 같은 다양한 물리적 및 화학적 기상 증착 과정에 의해 제조할 수 있다. 예로, HaVashi, (1987) Vac. Sci. Technol. July/August 1987, A5(4):1375-84; Hayashi, (1987) Physics Today, December 1987, pp. 44-60; MRS Bulletin, January 1990, pgs. 16-47을 참조한다.
미국 특허 20030147966에 추가적으로 기술된 바와 같이, 본 발명의 나노 입자는 HAuCl4 및 시트레이트-환원제를 이용하여 당업계에 공지된 방법으로 제조한다. 그 예로, Marinakos et al ., (1999) Adv . Mater . 11: 34-37; Marinakos et al ., (1998) Chem . Mater . 10: 1214-19; Enustun & Turkevich, (1963) J. Am . Chem . Soc. 85: 3317을 참조한다. 약 140 nm 크기의 분산성 응집 입자(dispersed aggregate particle)를 갖는 주석 산화물 나노 입자는 Vacuum Metallurgical Co., Ltd.(Chiba, Japan) 사로부터 구입가능하다. 그 외에도 다양한 조성 및 크기의 시판되는 나노 입자를, 예컨대 Vector Laboratories, Inc.(Burlingame, Calif) 사로부터 구입할 수 있다.
구조-스위칭( structure - switching ) 인지 서열로 관능화된 나노 입자
다른 예에서, 검출가능한 변화는 나노 입자 상의 올리고뉴클레오티드가 혼성화되면 검출가능한 변화를 발생시키는 분자(예, 비제한적으로 형광 분자 및 염료)를 올리고뉴클레오티드에 표지함으로써 이룬다. 일 측면에 있어서, 예컨대, 나노 입자 상에 관능화된 올리고뉴클레오티드 또는 폴리펩타이드는, 나노 입자 부착 말단으로부터 멀리 떨어진(원위) 말단에 부착되어 있는 마커를 가지며, 타겟 조합되지 않았을 경우, 마커가 있는 원위 말단은 마커의 형광을 소광시키기에 충분하게 가까울 정도로 나노 입자의 근위에 위치된다. 일 측면에 있어서, 금속 및 반도체 나노 입자는 공지된 형광 소광체이며, 이의 소광력의 정도는 나노 입자와 형광 분자간의 거리에 따라 결정된다. 따라서, 단일 가닥 상태일 때, 나노 입자에 부착된 올리고뉴클레오티드는, 예컨대 이차 구조 형성을 통해 올리고뉴클레오타이드에 의해 형성된 헤어핀 구조를 통해 나노 입자와 상호작용하며, 이로써 형광 분자가 나노 입자 근처로 오게 되어, 현저한 소광 효과가 발휘된다. 이와 마찬가지로, 결합되지 않은 상태에서, 나노 입자에 부착된 폴리펩타이드는 마커를 나노 입자 근처로 오게 하여 마커가 소광되게 하는 구조를 취할 것이다. 인지 서열을 통해 타겟 분자와 결합함으로써 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩타이드 복합체가 형성되면, 형광 분자는 나노 입자로부터 멀리 떨어지게 되고, 형광의 소광 효과도 사라지게 된다(도 1). 올리고뉴클레오티드의 유용 길이는 경험을 통해 결정할 수 있다. 따라서, 다양한 측면에 있어서, 형광-표지된 올리고뉴클레오티드 또는 폴리펩타이드가 부착된 금속 및 반도체 나노 입자는 본원에 기술된 분석 방식들 중 임의의 방식에 이용된다.
나노 입자에 올리고뉴클레오티드의 부착
본 발명의 방법에 이용되는 나노 입자는 약 5 내지 약 100개의 뉴클레오티드 길이의 올리고뉴클레오티드, 또는 이의 변형 형태로 관능화된다. 또한, 방법은 올리고뉴클레오티드가 약 5 내지 약 90개의 뉴클레오티드 길이, 약 5 내지 약 80개의 뉴클레오티드 길이, 약 5 내지 약 70개의 뉴클레오티드 길이, 약 5 내지 약 60개의 뉴클레오티드 길이, 약 5 내지 약 50개의 뉴클레오티드 길이 약 5 내지 약 45개의 뉴클레오티드 길이, 약 5 내지 약 40개의 뉴클레오티드 길이, 약 5 내지 약 35개의 뉴클레오티드 길이, 약 5 내지 약 30개의 뉴클레오티드 길이, 약 5 내지 약 25개의 뉴클레오티드 길이, 약 5 내지 약 20개의 뉴클레오티드 길이, 약 5 내지 약 15개의 뉴클레오티드 길이, 약 5 내지 약 10개의 뉴클레오티드 길이 및 올리고뉴클레오티드가 바람직한 결과를 달성할 수 있는 수준으로 구체적으로 개시된 크기의 모든 올리고뉴클레오티드 중간체인, 방법을 포함한다. 따라서, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24,25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 및 100개의 뉴클레오티드 길이의 올리고뉴클레오티드를 포함한다.
또다른 측면에서, 올리고뉴클레오티드는 약 8 내지 80개의 뉴클레오티드(즉, 약 8 내지 약 80개의 뉴클레오시드가 연결됨)를 포함한다. 당업자는, 상기 방법에서 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24,25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79 또는 80개의 뉴클레오티드 길이의 화합물을 이용함을 인지할 것이다.
올리고뉴클레오티드를 나노 입자에 부착하기 위해, 나노 입자, 올리고뉴클레오티드 또는 이들 2가지 모두는 관능화된다. 이러한 방법은 당업계에 공지되어 있다. 예로, 이의 3'-말단 또는 5'-말단이 알칸티올로 관능화된 올리고뉴클레오티드를 금 나노 입자에 부착시킨다. 이는 Whitesides, 1995, Proceedings of the Robert A. Welch Foundation 39th Conference On Chemical Research Nanophase Chemistry, Houston, Tex., pages 109-121을 참조한다. 또한, Mucic et al ., 1996, Chem . Commun . 555-557 (편평한 금 표면에 3' 티올 DNA를 부착하는 방법이 개시되어 있음; 이 방법을 이용하여 올리고뉴클레오티드를 나노 입자에 부착시킬 수 있음)을 참조한다. 또한, 알칸티올 방법을 이용하여, 올리고뉴클레오티드를 그외 금속, 반도체 및 마그네틱 콜로이드과 전술한 다른 나노 입자에 부착시킬 수 있다. 고형 표면에 올리고뉴클레오티드를 부착시키기 위한 다른 관능기로는, 포스포로티오에이트기(예, 미국 특허 5,472,881, 금 표면에 올리고뉴클레오티드-포스포로티오에이트 결합 관련), 치환된 알킬 실록산(예, 실리카 및 유리 표면에 올리고뉴클레오티드를 결합시키는 내용에 대한 Burwell, 1974, Chemical Technology, 4: 370-377 및 Matteucci and Caruthers, 1981, J. Am . Chem . Soc ., 103: 3185-3191, 아미노알킬실록산의 결합 및 머캅토알킬실록산의 유사 결합에 관한 Grabar et al ., 1995, Anal . Chem ., 67: 735-743을 참조함)을 포함한다. 또한, 고형 표면에 올리고뉴클레오티드를 부착시키기 위해 말단이 5' 티오뉴클레오시드 또는 3' 티오뉴클레오시드인 올리고뉴클레오티드를 사용할 수 있다. 하기 참조 문헌들에, 올리고뉴클레오티드를 나노 입자에 부착시키기 위해 사용할 수 있는 다른 방법들이 언급되어 있다: Nuzzo et al ., 1987, J. Am . Chem . Soc ., 109: 2358 (금에 이황화물); Allara and Nuzzo, 1985, Langmuir, 1: 45 (알루미늄 상의 카르복시산); Allara and Tompkins, 1974, J. Colloid Interface Sci ., 49: 410-421 (구리 상의 카르복시산); Iler, The Chemistry Of Silica, Chapter 6, (Wiley 1979) (실리카 상의 카르복시산); Timmons and Zisman, 1965, J. Phys . Chem ., 69: 984-990 (백금 상의 카르복시산); Soriaga and Hubbard, 1982, J. Am . Chem . Soc ., 104: 3937 (백금 상의 방향족 고리 화합물); Hubbard, 1980, Acc . Chem . Res ., 13: 177 (백금 상의 설폴란(sulfolane), 설폭사이드 및 그외 관능화된 용매); Hickman et al ., 1989, J. Am . Chem . Soc ., 111: 7271 (백금 상의 이소니트릴); Maoz and Sagiv, 1987, Langmuir, 3: 1045 (실리카 상의 실란); Maoz and Sagiv, 1987, Langmuir, 3: 1034 (실리카 상의 실란); Wasserman et al ., 1989, Langmuir, 5: 1074 (실리카 상의 실란); Eltekova and Eltekov, 1987, Langmuir, 3: 951 (티타늄 이산화물 및 실리카 상의 방향족 카르복시산, 알데하이드, 알코올 및 메톡시기); Lec et al ., 1988, J. Phys. Chem ., 92: 2597 (금속 상의 견고한 포스페이트). 부가적으로, 나노 입자 표면 상에 올리고뉴클레오티드를 부착시키는데 적절한 임의 방법을 사용할 수 있다. 올리고뉴클레오티드를 표면상에 부착시키기 위한 특히 바람직한 방법은 1999년 6월 25일자 미국 특허 09/344,667; 2000년 6월 26일자 09/603,830; 2001년 1월 12일자 09/760,500; 2001년 3월 28일자 09/820,279; 2001년 8월 10일자 09/927,777; 1997년 7월 21일자 PCT/US97/12783; 2000년 6월 26일자 PCT/US00/17507; 2001년 1월 12일자 PCT/US01/01190; 2001년 3월 28일자 PCT/US01/10071에 기술되어 있는 에이징 프로세스(aging process)를 기초로 하며, 상기 문헌들은 그 전체가 원용에 의해 본 명세서에 포함된다. 에이징 프로세스는 예기치 않게도 안정성 및 선택성이 강화된 나노 입자-올리고뉴클레오티드 접합체를 제공한다. 본 방법은 바람직하게는 나노 입자에 결합할 수 있는 관능기를 포함하는, 모이어티가 공유결합으로 결합되어 있는, 올리고뉴클레오티드를 제공하는 단계를 포함한다. 모이어티와 관능기는 올리고뉴클레오티드를 나노 입자에 (화학흡착 또는 공유 결합에 의해) 결합시킨다. 예컨대, 5' 또는 3' 말단에 공유결합으로 알칸티올, 알칸디설파이드 또는 사이클릭 이설파이드가 결합되어 있는 올리고뉴클레오티드를 이용하여, 올리고뉴클레오티드를 금 나노 입자 등의 다양한 나노 입자에 결합시킬 수 있다.
올리고뉴클레오티드는 관능기에 의해 올리고뉴클레오티드의 일정 부분 이상을 나노 입자에 결합시키기에 충분한 시간 동안, 수 중에서 나노 입자와 접촉시킨다. 상기 시간은 경험을 통해 결정할 수 있다. 예로, 약 12-24시간으로 우수한 결과를 수득할 수 있는 것으로 확인되었다. 올리고뉴클레오티드 결합에 적합한 그외 조건들 역시 경험을 통해 결정할 수 있다. 예로, 나노 입자의 농도 약 10-20 nM 및 실온에서의 인큐베이션으로 우수한 결과를 달성할 수 있다.
다음으로, 1종 이상의 염을 물에 첨가하여 염 용액을 만든다. 염은 임의의 적합한 수용성 염일 수 있다. 예로, 염은 소듐 클로라이드, 마그네슘 클로라이드, 포타슘 클로라이드, 암모늄 클로라이드, 소듐 아세테이트, 암모늄 아세테이트, 이들 염 2종 이상의 조합, 또는 인산염 완충액 중의 이들 염 용액일 수 있다. 바람직하기로는, 염은 농축 용액으로서 첨가되지만, 고형으로도 첨가될 수 있다. 염은 물에 한꺼번에 첨가하거나, 또는 시간 경과에 따라 서서히 첨가할 수 있다. "시간 경과에 따라 서서히"는 염을 일정 시간 간격으로 2회 이상으로 나누어 첨가하는 것을 의미한다. 적절한 시간 간격은 경험을 통해 결정할 수 있다.
염 용액의 이온 세기는 올리고뉴클레오티드 서로 간의 정전기적 반발과, 양으로 하전된 나노 입자의 경우 음으로 하전된 올리고뉴클레오티드의 정전기적 인력을, 또는 음으로 하전된 나노 입자의 경우 음으로 하전된 올리고뉴클레오티드의 정전기적 반발을 일정 부분 이상으로 해결하기에 충분하여야 한다. 염을 시간 경과에 따라 서서히 첨가함으로써 정전기적 인력 및 반발을 서서히 감소시키면, 나노 입자 상에 올리고뉴클레오티드가 최고 표면 밀도로 구비되는 것으로 확인되었다. 적절한 이온 세기는 각 염 또는 염의 조합을 경험을 통해 결정할 수 있다. 인산 완충액 중의 소듐 클로라이드 최종 농도 약 0.1 M 내지 약 1.0 M가, 바람직하기로는 시간 경과에 따라 소듐 클로라이드의 농도를 증가시키는 경우, 우수한 결과를 달성하는 것으로 확인되었다.
염을 첨가한 후, 올리고뉴클레오티드 및 나노 입자를, 충분한 양으로 첨가된 올리고뉴클레오티드가 나노 입자에 결합하기에 충분한 추가적인 시간 동안 염 용액 중에서 인큐베이션하여, 안정적인 나노 입자-올리고뉴클레오티드 접합체를 만든다. 하기에 상세하게 기술된 바와 같이, 나노 입자 상의 올리고뉴클레오티드의 표면 밀도 증가가, 접합체를 안정화시키는 것으로 확인되었다. 이의 인큐베이션 시간은 경험으로 결정할 수 있다. 총 배양 시간 약 24-48 시간, 바람직하기로는 40 시간의 조건에서 우수한 결과를 달성할 수 있는 것으로 확인되었다(이는 총 배양 시간이며, 전술한 바와 같이, 염 농도는 전체 시간 동안 서서히 증가될 수 있음). 염 용액 중의 이러한 2차 배양 기간은 본원에서 "에이징" 단계로 언급되어 있다. 또한, 이러한 "에이징" 단계에 적합한 그외 조건들은 경험으로 결정할 수 있다. 예로, 실온 및 pH 7.0에서의 인큐베이션으로 우수한 결과를 달성한다.
"에이징" 단계로 만들어지는 접합체는, "에이징" 단계 없이 제조한 산물에 비해 꽤 안정적인 것으로 확인되었다. 전술한 바와 같이, 이러한 안정성 증가는 "에이징" 단계에 의해 달성되는 나노 입자 표면 상의 올리고뉴클레오티드의 밀도 증가로 인한 것이다. 다른 "신속 염 에이징(fast salt aging)" 프로세스도 유사한 DNA 밀도 및 안정성을 가진 입자를 만든다. 계면활성제, 예컨대 약 0.01% 소듐 도데실설페이트(SDS), 트윈 또는 폴리에틸렌 글리콜(PEG)의 존재 하에 염을 첨가함으로써, 염 에이징 프로세스를 약 1시간 수행할 수 있다.
"에이징" 단계에 의해 달성되는 표면 밀도는, 나노 입자의 크기와 타입, 그리고 올리고뉴클레오티드의 길이, 서열 및 농도에 따라 결정될 것이다. 바람직한 나노 입자 및 올리고뉴클레오티드의 조합을 위해, 이를 수득하는데 필수적인 조건과 안정적인 나노 입자를 제조하는데 적합한 표면 밀도는, 경험으로 결정할 수 있다. 일반적으로, 표면 밀도 10 picomoles/cm2 이상이 안정적인 나노 입자-올리고뉴클레오티드 접합체를 제공하는데 적합할 것이다. 바람직하기로는, 표면 밀도는 15 picomoles/cm2 이상이다. 핵산과 올리고뉴클레오티드 타겟과 혼성화하는, 접합체의 올리고뉴클레오티드의 능력은, 표면 밀도가 너무 높으면 소실될 수 있기 때문에, 표면 밀도는 바람직하기로는 약 35-40 picomoles/cm2 보다 높지 않다. 또한, 올리고뉴클레오티드가 나노 입자에 표면 밀도 적어도 10 pmol/cm2, 적어도 15 pmol/cm2, 적어도 20 pmol/cm2, 적어도 25 pmol/cm2, 적어도 30 pmol/cm2, 적어도 35 pmol/cm2, 적어도 40 pmol/cm2, 적어도 45 pmol/cm2, 적어도 50 pmol/cm2, 또는 50 pmol/cm2 이상으로 결합되어 있는 방법을 제공한다.
용어 "복합체 형성"과 상호 호환적으로 사용되는 "혼성화"는 왓슨-크릭 DNA 상보성, 호그스타인(Hoogstein) 결합 또는 그외 당업계에 공지된 서열-특이적인 결합 규칙에 따라, 2 또는 3개 이상의 핵산 가닥 간의 수소 결합에 의한 상호작용을 의미한다. 또는, 이는 당업계에 공지된 서열-특이적인 결합 특성에 따른 본원에 기술된 폴리펩타이드 간의 상호작용을 의미할 수 있다. 혼성화는 당업계에 공지된 여러 엄격한 조건 하에서 수행할 수 있다. 적절한 엄격 조건 하에서, 2개의 상보적인 가닥 또는 2개의 폴리펩타이드 간의 상호작용은 반응에서 약 60% 또는 그 이상, 약 70% 또는 그 이상, 약 80% 또는 그 이상, 약 90% 또는 그 이상, 약 95% 또는 그 이상, 약 96% 또는 그 이상, 약 97% 또는 그 이상, 약 98% 또는 그 이상, 또는 약 99% 또는 그 이상일 수 있다.
다양한 측면에서, 방법은 서로 상보성이 100%인, 즉 완벽하게 매치되는 2 또는 3개 이상의 올리고뉴클레오티드 또는 폴리펩타이드의 이용을 포함하며, 다른 측면에서, 각각의 올리고뉴클레오티드는 각 올리고뉴클레오티드의 전체 또는 일부분이 서로 약 적어도(이는 그 보다 높거나 동일함을 의미함) 95%, 서로 적어도 약 90%, 적어도 약 85%, 적어도 약 80%, 적어도 약 75%, 적어도 약 70%, 적어도 약 65%, 적어도 약 60%, 적어도 약 55%, 적어도 약 50%, 적어도 약 45%, 적어도 약 40%, 적어도 약 35%, 적어도 약 30%, 적어도 약 25%, 적어도 약 20%로 상보적이다.
본 발명에 사용되는 올리고뉴클레오티드의 서열이 특이적으로 혼성화가능하기 위해 서로 100% 상보적일 필요는 없다는 것은, 당업계에서 자명한 사실이다. 또한, 올리고뉴클레오티드는 사이에 끼어 있거나 인접한 단편들이 혼성화 형성에 참여하지 않도록 하나 이상의 단편을 지나 서로 혼성화할 수 있다(예, 루프 구조 또는 헤어핀 구조). 임의의 주어진 올리고뉴클레오티드 간의 상보율%은 당업계에 공지된 BLAST 프로그램(Basic Local Alignment Search Tools) 및 PowerBLAST 프로그램을 이용하여 일상적으로 결정할 수 있다(Altschul et al., 1990, J. Mol . Biol ., 215: 403-410; Zhang and Madden, 1997, Genome Res ., 7: 649-656).
일 측면에서, 나노 입자 표면 상의 올리고뉴클레오티드의 팩킹 밀도가 나노 입자들 간과 단일 나노 입자 상의 폴리뉴클레오티드 가닥들간의 협동적인 행태를 형성하기에 충분한, 방법을 제공한다. 다른 측면에 있어서, 나노 입자들간의 협동적인 행태는 올리고뉴클레오티드의 분해 내성을 증가시킨다.
본원에서, "안정적인"은 접합체를 만든 후 6달 이상의 기간 동안 대부분의 올리고뉴클레오티드가 나노 입자에 부착된 상태로 남아있으며, 핵산 검출 방법 및 나노제조 방법에서 직면하는 표준 조건하에서, 올리고뉴클레오티드가 핵산 및 올리고뉴클레오티드 타겟과 혼성화할 수 있는 것을 의미한다.
본 발명에 제공되는 방법에서 이용되는 각 나노 입자는 여기에 부착된 복수개의 올리고뉴클레오티드를 가진다. 그 결과로, 각 나노 입자-올리고뉴클레오티드 접합체는, 제1 나노 입자-올리고뉴클레오티드 접합체 상에 존재하는 플루오로포어와 구별되게 검출가능한 플루오로포어가 접합되어 있고 제2 나노 입자 상에 관능화된 제2 올리고뉴클레오티드와 혼성화할 수 있는 능력을 가지며, 필요에 따라 충분한 서열 상보성을 가진 유리 올리고뉴클레오티드를 가진다. 일 측면에 있어서, 각 나노 입자가 동일한 올리고뉴클레오티드로 관능화된, 즉, 나노 입자에 부착된 각 올리고뉴클레오티드가 동일한 길이와 동일한 서열을 가진, 방법을 제공한다. 다른 측면으로, 각 나노 입자는 동일하지 않은 2종 이상의 올리고뉴클레오티드로 관능화되며, 즉 부착된 올리고뉴클레오티드들 중 하나 이상은 상이한 길이 및/또는 상이한 서열을 가진다는 점에서 부착되어 있는 다른 하나 이상의 올리고뉴클레오티드와 상이하다.
용어 "올리고뉴클레오티드" 또는 "폴리뉴클레오티드"는, 하나의 서열이 나노 입자에 부착되어 있거나, 또는 하나의 서열의 복수 카피가 부착되어 있는 것을 포함한다. 예컨대, 다양한 측면에서, 올리고뉴클레오티드는 직렬로 복수 카피로, 예컨대 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 또는 10개 이상의 직렬 반복으로 존재한다.
또는, 나노 입자는 상이한 서열을 가진 2종 이상의 올리고뉴클레오티드를 포함하도록 관능화되며, 단, 각 올리고뉴클레오티드는 구별되게 검출가능한 마커로 표지된다. 전술한 바와 같이, 상이한 올리고뉴클레오티드 서열은 다양한 측면에서 직렬로 및/또는 복수의 카피로 정렬되어 있다. 또한, 상이한 서열을 가지는 올리고뉴클레오티드는 나노 입자에 직접 부착된다. 상이한 서열을 가지는 올리고뉴클레오티드를 나노 입자에 부착하는 방법에 있어서, 방법의 측면들은 상이한 올리고뉴클레오티드 서열이 동일한 폴리뉴클레오티드 상의 다른 영역들에 혼성화하는 방법을 포함한다.
나노 입자 상의 올리고뉴클레오티드는 모두 동일한 서열을 가질 수 있거나, 또는 다른 나노 입자에 부착된 폴리뉴클레오티드의 다른 부분들과 혼성화하는 상이한 서열을 가질 수 있다. 상이한 서열을 가지는 올리고뉴클레오티드를 사용하는 경우, 각 나노 입자는 상이한 올리고뉴클레오티드 전체를 나노 입자에 부착시킬 수 있으며, 또는 상이한 올리고뉴클레오티드들은 상이한 나노 입자들에 부착된다. 또는, 각 나노 입자 상의 올리고뉴클레오티드는 복수개의 상이한 서열을 가질 수 있으며, 이들 중 적어도 하나는 제2 나노 입자 상의 폴리뉴클레오티드의 일부와 혼성하여야 한다.
나노-플레어 기법
본 발명의 일 측면에서, 결합 모이어티에 인지 서열을 포함하는 올리고뉴클레오티드 또는 폴리펩타이드는 본원에 기술된 바와 같이 나노 입자에 부착된다. "인지 서열"은 본원에는 대상 타겟 분자와 부분적으로 또는 완전히 상보적인 서열을 의미하는 것으로 이해된다.
인지 서열을 포함하는 올리고뉴클레오티드 결합 모이어티가 부착된 나노 입자는 먼저 리포터 서열과 조합된다. 본원에서, "리포터 서열"은 부분적으로 또는 완전히 상보적인 서열을 의미하며, 따라서 결합 모이어티와 그 인지 서열에 혼성화할 수 있다. 리포터 서열은 본원에서와 같이 표지되며, 또한 나노-플레어라고도 한다. 아울러, 리포터 서열은, 다양한 측면에 있어서, 결합 모이어티내 인지 서열이 이의 타겟 분자와 결합하고 혼성화된 리포터 서열의 분리를 초래하여, 결과적으로 리포터 서열에 부착된 표지의 검출가능하고 측정가능한 변화를 발생시키도록, 인지 서열에 비해 더 적거나, 동일하거나 또는 더 많은 수의 염기로 구성된다(도 2).
일 특정 측면에 있어서, 특이적인 타겟 mRNA에 대한 인지 서열로 관능화된 나노 입자는 리포터 서열을 가진 Cy5로 표지된 짧은 상포적인 리포터 폴리뉴클레오티드와 혼성화하며, Cy5 부분의 형광은 나노 입자 상의 인지 서열에 혼성화되었을 때 소광된다. 또한, 이러한 리포터 서열은 타겟 mRNA로 대체될 수 있다. 대체되면, Cy5 부분은 더 이상 소광되지 않아 형광을 발하여, 형광 신호의 검출과 정량화를 할 수 있으며, 이는 리포터 서열의 대체를 수반하는 인지 서열과 혼성화된 타겟 서열의 양과 상호 관련있다.
나노-플레어를 금 나노 입자(Au NP)의 독특한 광학 특성의 이점을 가진다. Au NP는 분자 소광체에 비해 보다 우수한 효율로 형광을 소광시키며(Dubertret et al ., 2001, Nat . Biotechnol . 19: 365-370), 보다 먼 거리를 소광시킨다(Dulkeith et al ., 2005, Nano Lett . 5: 585-589). 이처럼, 본원에 기술된 그외 모든 타입의 나노 입자들은 이것이 부착된 결합 모이어티의 검출가능한 마커를 소광시킬 수 있는 한 사용될 수 있다.
당업자는 과도한 실험 없이도 시험관내 연구를 통해 타겟 분자의 부재시 인지 서열에 리포터의 결합을 촉진시킬 수 있으며, 한편으로는 타겟 분자의 존재시 상기 리포터 서열의 대체를 발생시킬 수 있는, 상대적인 용융 온도 및/또는 혼성화 조건을 결정할 수 있다.
본 발명은 하기 실시예를 들어 설명되지만, 어떠한 방식으로도 한정되는 것은 아니다.
도 1은 세포내 타겟을 검출할 수 있는 올리고뉴클레오티드를 포함하고 있으며, 플루오로포어로 변형된 금 나노 입자의 개략도를 나타낸 것이다.
도 2는 mRNA 검출 및 정량화를 위한 나노-플레어(nano-flare)를 나타낸 것이다.
도 3은 나노-플레어를 이용한 서르비빈 낫다운을 정량한 것이다. (a) siRNA 처리한 SKBR3 세포 상에서 수집한 유세포 측정 데이타. (b) siRNA 농도에 따른 평균 형광(●) 및 서비빈 발현(회색 막대 그래프) 그래프.
실시예 1
본 실시예는, 형광 표지된 올리고뉴클레오티드-변형된 금 나노 입자 제제를 사용하여 세포내 분자 타겟을 검출할 수 있음을 입증한다. 개념 증명으로서, 2가지 세포 타입에서 형광 표지된 올리고뉴클레오티드-변형된 금 나노 입자를 이용하여 mRNA 타겟을 세포내에서 검출하는 것은 매우 효율적임을 입증한다. 상기 제제는 쉽게 세포에 들어가, 형광 현미경 및 유세포 측정기를 이용하여 쉽게 검출할 수 있는 형광 신호를 발생시킨다.
구체적으로, 13 nm의 금 나노 입자를 한쪽 말단은 티올 모이어티이고 다른 쪽 말단은 형광 다이가 있으며, 구조-스위칭 인지 서열을 포함하는, 수종의 상이한 서열로 변형시켰다. 타겟이 없을 땐, 다이 분자가 금 나노 입자 표면과 근접하게 있게 되어, 소광되어 형광 신호가 나타나지 않는다. 타겟이 존재하는 경우에는, 다이 분자가 금 나노 입자 표면으로부터 떨어지게 되어, 형광 신호가 관찰된다(도 1).
Au NP를, 금 티올 결합 형성(Love et al ., 2005, Chem . Rev . 105: 1103-1169)을 통해, 특이적인 RNA 전사체(도 1)에 대한 18개의 염기로 이루어진 인지 요소를 포함하는 티올화된 올리고뉴클레오티드로 관능화하였다. 그러면, 올리고뉴클레오티드로 관능화된 AU NP는, 보다 긴 타겟 또는 타겟 부분으로 치환되었을 때 "플레어"로서 작용할 수 있는, 짧은 시아닌(Cy5) 다이-말단 리포터 서열과 혼성화가능해진다(도 1). 결합된 상태에서, 리포터 가닥의 Cy5 형광은 Au NP 표면에 근접하게 되어 소광된다. 타겟이 존재하는 경우, 타겟과 올리고뉴클레오티드-변형된 Au NP 간에 보다 길고 더욱 안정적인 이중 가닥이 형성됨으로써, 플레어 가닥은 교체되어 Au NP로부터 분리된다.
실시예 2
세포에 도입되어 세포내 타겟 분자를 검출하는 금 나노 입자의 능력을 이용하는 것을 추가적으로 설명하기 위해, 시험관내 세포 배양 실험을 수행하였다.
안정적으로 강화된 그린 형광(EGFP) 단백질을 발현하는 C166 포유류 세포를 10% 혈청이 첨가된 DMEM(Dulbecco's Modified Eagles Medium) 내에서 37 ℃, 5% CO2 조건 하에서 유지시키고, 상기 강화된 그린 형광 단백질 mRNA를 타겟으로 하는 형광 표지된 올리고뉴클레오티드-변형된 금 나노 입자를 투입하였다. SKBR3 인간 유 방암(하기 참조) 및 C166 마우스 내피 세포를, ATCC(American Tissue Culture Collection)로부터 입수하여, 10% 열에 의해 불활성화된 소 태아 혈청이 첨가된, 맥코이 5A 배지 및 DMEM(Dulbecco's Modified Eagles Medium)에서 각각 37 ℃, 5% CO2 조건 하에서 배양하였다. 세포를 6 또는 24 웰 플레이트에 접종하여, 처리하기 전에 1-2일간 배양하였다. 처리한 당일, 세포는 약 50% 컨플루언시였다. 배지는 관능화된 Au NP가 첨가된 신선한 배지로 교체하였다.
대조군 실험은, 포유류 세포에는 존재하지 않는 탄저균 RNA에 대한 타겟 영역을 포함하는 입자로 수행하였다. 16시간 형질감염 후, 이들 EGFP-발현 세포를, 대조군 입자에서 관찰되는 신호 보다 훨씬 강하게 밝은 형광 신호를 보이는 EGFP 타겟팅 프로브로 처리하였다. 추가적인 대조군 실험으로, 입자를 EGFP를 발현하지 않아 EGFP mRNA 타겟을 가지고 있지 않은 C166 세포에서 테스트하였다. 이러한 실험들에서, 어떤 프로브들도 일단 세포 내부에서 신호가 검출되지 않았으므로, 형광 표지된 올리고뉴클레오티드-변형된 금 나노 입자 제제를 사용하여 특이적인 세포내 분자 타겟을 검출할 수 있음을 확실히 하였다.
유입(uptake)을 정량하고 또한 임의의 서열 의존적인 유입 효과를 배제하기 위해, 세포내 프로브 도입을, 유도 결합형 플라즈마 질량 분광기를 이용하여 확인하였다. 이러한 데이타는, 전형적인 실험 후, 세포에 약 100,000개의 금 나노 입자가 포함되어 있으며, C166 세포가 올리고뉴클레오티드에 포함된 인지 서열과 무관하게 비슷한 갯수의 금 나노 입자를 받아들인다는 것을 뒷받침한다.
실시예 3
형광 표지된 올리고뉴클레오티드-변형된 금 나노 입자 제제를, 이의 올리고뉴클레오티드 하중 및 형광 시그널링 능력에 대하 추가적으로 평가하였다. 이러한 실험들의 결과는, 각 금 나노 입자가 인지 서열을 포함하는 약 60개의 형광 올리고뉴클레오티드로 관능화되어 있음을 뒷받침하였다. 추가로, 다양한 올리고뉴클레오티드-변형된 금 나노 입자 제제 1 nM 용액을 KCN 용액 중에서 분해시켰을 때, 이들 모두 거의 동일한 형광을 나타내었다. 이러한 특정화 데이타를 종합하면, 타겟의 부재시에는, 형광 표지된 올리고뉴클레오티드-변형된 금 나노 입자 제제가 동일한 형광 신호를 나타낸다는 것을 의미하며, 관찰되는 세포내 시그널링은 특이적인 세포내 결합 현상으로 초래됨을 재입증한다.
내인성 유전자의 검출은 약물 발견 및 유전자 연구에서 매우 중요하다. 따라서, 암 유전자 서르비빈의 존재를 감지하기 위해 사용할 수 있는 금 나노 입자를 준비하였다. 이러한 입자들은, 대조군 서열에 비해, 내부에서 서르비빈을 발현하는 A549 폐암 세포로부터 밝은 형광 신호가 다시 나타났다. 이러한 결과는, 언급한 형광 표지된 올리고뉴클레오티드-변형된 금 나노 입자 제제를 사용하여 천연 mRNA 타겟의 존재를 직접적으로 판독할 수 있음을 시사한다.
관찰할 수 있는 형광 신호는 다른 예로 단순한 벤치-탑 유세포측정 장치(bench-top flow cytometer instrument)를 이용하여 처리한 세포의 거대 집단에서 검출할 수 있다. 이러한 실험들은, 이들 형광 표지된 올리고뉴클레오티드-변형된 금 나노 입자들에서 관찰되는 매우 효율적인 유입 효과를 재차 강조하며, 또한 주어진 샘플내 거의 모든 세포들이 강한 신호를 보이는데 이는 세포내 mRNA 타겟이 존재함을 의미한다는 것을 다시금 부각시킨다. 본원에서, Guava 이지 사이트 유세포측정 및 장치 소프트웨어를 이용하여 1000개의 세포 대한 이의 형광 강도를 그래프로 그렸다. 이러한 실험들에서, 서르비빈을 타겟팅하는 형광 표지된 올리고뉴클레오티드-변형된 금 나노 입자 제제로 처리하였을 때, 대조군 탄저균 타겟팅 제제를 처리한 세포에 비해, 서르비빈을 발현하는 A549 세포 집단의 현격한 변동(shift)이 나타나는 것으로 관찰되었다. 이러한 결과는, 유세포측정과 조합되었을 때, 형광 표지된 올리고뉴클레오티드-변형된 금 나노 입자 제제로 세포의 거대 집단을 분류하는데 매우 적합함을 시사한다.
또한, 입자의 유효성을, 리포펙타민 2000 제형을 이용하여 세포에 형질감염시킨 일반적인 소광체-플루오로포어 올리고뉴클레오티드 서열과 비교하였다. 본 발명의 입자가 놀라운 시그널링 능력을 보였을 때와 유사한 조건에서, 이들 제형들은 미미한 시그널링 능력을 보였다. 이의 농도를 10배 증가시켰지만, 신호는 약하거나 나타나지 않아, 이러한 조건 하에서는 나노 입자가 기존의 소광체-플루오로포어 올리고뉴클레오티드 프로브보다 성능이 우수하다는 것을 보여주었다.
종합적으로, 전술한 예들은 하기의 결과를 나타낸다:
1) 금 나노 입자는 타겟을 검출할 수 있는 올리고뉴클레오티드를 포함하고 있는 플루오로포어의 세포내 전달을 돕는다.
2) 이들 형광 표지된 올리고뉴클레오티드-변형된 금 나노 입자 제제를 사용하여 내인성 및 외인성 세포내 타겟을 검출할 수 있다.
3) 특이적인 mRNA 타겟의 존재를 나타내는 형광 신호는 형광 현미경이나 유세포 측정으로 판독할 수 있다.
4) 이들 제제의 효과적인 유입과 이의 우수한 시그널링 능력으로 인해, 거대 세포 집단을 분류하는데 매우 적합하다.
5) 이들 제제의 효과적인 유입과 이의 우수한 시그널링 능력은 연구한 조건에서는 기존의 소광체-플루오로포어 올리고뉴클레오티드 프로브 보다 성능이 우수하다.
6) 원리를 핵산 앱타머 및 펩타이드와 같은 구조-스위칭 인지 서열로 확장시킬 수 있다.
분자 아데노신 트리포스페이트(ATP)를 타겟으로 하는 부가적인 형광 표지된 앱타머-함유 입자 프로브도 본 발명에 포함된다.
또한, 본 발명은 동시에 복수의 세포내 타겟을 검출하고 이의 세포내 농도를 실시간으로 정량할 수 있는 능력을 감안한다. 이러한 원리는 고등 유기체에서 실시간으로 세포 기능을 모니터링하는데 적용할 수 있다.
실시예 4
13 nm 크기의 입자가 효과적인 소광체이기 때문에 13 nm Au NP를 이용하여 나노-플레어를 제조한 다음, 올리고뉴클레오티드로 밀도 높게 관능화(Mirkin et al., 1996, Nature 382: 607-609)하였고, 이는 가시광을 효과적으로 분산시키지 않는데, 이런 점은 간섭이 최소화된 광학 프로브 제작에 중요하다.
Au NP를, 금 티올 결합 형성(Love et al ., 2005, Chem . Rev . 105: 1103- 1169)을 통해, 특이적인 RNA 전사체에 대한 18개의 염기로 이루어진 인지 요소를 포함하는 티올화된 올리고뉴클레오티드로 관능화하였다(도 2). 올리고뉴클레오티드는 표준 고상 포스포르아미디트 방법을 이용하여 Expedite 8909 뉴클레오티드 합성 시스템(ABI)에서 합성하였다. 베이스와 시약은 Glen Research 사로부터 구입하였다. 올리고뉴클레오티드는 역상 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC)로 정제하였다. 나노-플레어 프로브를 제조하기 위해, 사이트레이트-안정화된 금 나노 입자(13 ± 1 nm)를 공개된 공정으로 제조하였다(Frens, G., 1973, Nature - Physical Science 241: 20-22). 티올-변형된 올리고뉴클레오티드를 13 ±1 nm 금 콜로이드에 10 nM 콜로이달 1 mL 당 올리고뉴클레오티드 3 nmol 농도로 첨가하고, 밤새 교반하였다. 12시간 후, 소듐 도데실설페이트(SDS) 용액(10%)를 이 혼합물에 첨가하여 0.1 % SDS 농도로 만들었다. 인산 완충액(0.1 M; pH 7.4)을 혼합물에 첨가하여 0.01 M 인산염 농도로 만들고, 소듐 클로라이드 용액(2.0 M) 분액 6을 혼합물에 8시간 동안 첨가하여, 최종 0.15 M의 소듐 클로라이드 용액을 만들었다. 이 혼합물을 밤새 교반하여 관능화 과정을 완료하였다. 관능화된 입자를 포함하고 있는 용액을 원심분리하고, 인산 PBS(phosphate buffered saline: 137 mM NaCl, 10 mM 포스페이트, 2.7 mM KCl, pH 7.4, Hyclone)에 3번 재현탁하여, 이후의 실험들에 사용할 정제된 Au NP을 제조하였다. 입자의 농도는 524 nm (e = 2.7 x 108 L mol-1 cm-1)에서의 여기를 측정하여 결정하였다. 정제된, 올리고뉴클레오티드 관능화된 Au NP를 Cy5로 표지된 상보적인 리포터 서열 100 nM이 포함된 PBS(PBS; 137 mM NaCl, 10 mM Phosphate, 2.7 mM KCl, pH 7.4, Hyclone)에 10 nM 농도로 현탁하였다. 혼합물을 70 ℃로 가열한 다음 실온으로 서서히 냉각시킨 후 12시간 이상 암 조건에서 조장하여 혼성화가 이루어지게 하였다. 이후, 입자를 0.2 ㎛ 아세테이트 시린지 필터(GE Healthcare)로 여과 멸균화하였다. 사용한 올리고뉴클레오티드 서열은 다음과 같다:
인지 서열: 5'-CTT GAG AAA GGG CTG CCA AAA AA-SH-3'(서열번호 1)
리포터 서열: 3'-CCC GAC GGT T-Cy5-5'(서열번호 2)
타겟 영역: 3'-GAA CTC TTT CCC GAC GGT-5'(서열번호 3)
나노-플레어 프로브 또는 분자 비컨을 0.1 % Tween 20 (Sigma)이 포함된 PBS에 1 nM 농도로 희석하고, 상보적인 타겟을 처리하였다(타겟 농도: 1 μM). 형광 스펙트럼을 633 nm에서 Jobin Yvon Fluorolog FL3-22 여기로 기록하였고, 650에서 750 nm 까지 1 nm 씩 증가시키면서 방출을 측정하였다. 그러면, 올리고뉴클레오티드 관능화된 Au NP는 좀더 긴 타겟이나 타겟 영역으로 치환되었을 때 "플레어"로서 작용할 수 있는 짧은 시아닌(Cy5) 다이-말단 리포터 서열과 혼성화가능해진다. 결합된 상태에서, 리포터 가닥의 Cy5 형광은 Au NP 표면에 근접하게 되어 소광된다. 타겟이 존재하는 경우, 타겟과 올리고뉴클레오티드-변형된 Au NP 간에 보다 길고 더욱 안정적인 이중 가닥이 형성됨으로써, 플레어 가닥은 대체되어 Au NP로부터 분리된다.
상보적인 합성 타겟을 이용하여 나노-플레어 디자인을 테스트함으로써, 프로브가 반응하여 타겟 인지 및 결합 시 형광 신호가 3.8배 증가하는 것으로 나타났 다. 이와는 대조적으로, 신호는 비-상보적인 타겟의 존재시에는 변화가 없었으며, 백그라운드 형광 수준에 상응하는 크기를 보였다. 이러한 결과들은, 나노-플레어가 특이적인 타겟의 존재를 시그널링하는데 유효함을 입증한다.
실시예 5
합성 타겟을 이용한 나노-플레어 프로브의 시그널링 능력을 확립하여, 이의 살아있는 세포로의 도입, 가시화 및 RNA 전사체 검출 능력을 조사하였다. 나노-플레어는, 암 치료제 및 진단제로서의 잠재적인 이용성(Altieri et al ., 2003, Oncogene 22: 8581-8589)으로 인해 많은 관심을 받고 있는 타겟인 서르비빈 전사체의 상보적인 영역에 결합하도록 제작하였다. 서르비빈 전사체를 다량 발현하는 SKBR3 세포주(인간 유방암주)(Peng et al ., 2005, Cancer Res . 65: 1909-1917)를, 서르비빈-타겟팅 나노-플레어를 테스트하기 위한 모델로서 사용하였다. 서르비빈 인지 및 리포터 서열은 상기에 나타내었다(서열번호 1 및 2). 대조군으로서, 비-상보적인 서열을 포함하는 제2 프로브를 제작하였다. 비-상보적인 프로브를 설계하고, 유사한 백그라운드 형광, 용융 특성 및 서르비빈 프로브로서의 시그널링 능력을 결정하였다. 서르비빈 대조군 프로브 올리고뉴클레오티드 서열은 다음과 같다:
대조군 입자 인지 서열: 5'-CTA TCG CGT ACA ATC TGC AAA AA-SH-3' (서열번호 4)
대조군 입자 리포터 서열: 3'-GCA TGT TAG ACG T-Cy5-5'(서열번호 5)
서르비빈 분자 비컨: 5'-Cy5-CGA CGG AGA AAG GGC TGC CAC GTC G dabcyl- 3'(서열번호 6)
대조군 분자 비컨: 5'-Cy5-CGA CGT CGC GTA CAA TCT GCC GTC G-dabcyl-3'(서열번호 7)
세포를 현미경 유리 커버 슬립 상에서 배양하고, 나노-플레어와 인큐베이션한 다음 스캐닝 컨포컬 현미경으로 영상화하였다. 구체적으로, 세포를 6웰 조직 배양 플레이트 바탁에 둔 유리 커버슬립 상에 배양하였다. 1일 후, 배지를 나노-플레어(입자 농도, 125 pM)가 포함된 배지로 교체하였다. 6시간 처리한 후, 배지를 교체하고, 세포를 다시 12시간 배양하였다. 커버슬릿을 제거하고, PBS로 세정한 다음, 유리 슬라이드 상에 둔 PBS가 충진된 챔버에 고정시켰다. 이미지는 모두 633 nm HeNe 레이저 여기 소스를 이용한 63x 배율에서 Zeiss 510 LSM으로 수득하였다.
서르비빈 나노-플레어를 처리한 SKBR3 세포는, 비-상보적인 대조군을 처리한 세포에 비해 높은 형광을 나타내었다. 이 신호가 서르비빈의 존재와 일치되는지를 더욱 확인하기 위해, C166 세포주(마우스 내피세포)는 인간 서르비빈 전사체가 함유되어 있지 않기 때문에, 이를 대조군으로 사용하였다. C166 세포를 서르비빈 프로브 및 대조군 프로브로 처리하였다. 이 경우, 처리한 후 세포 형광에 구별가능한 차이가 관찰되지 않았다. 이러한 이미지 결과는 역전사효소 PCR(RT-PCR) 측정과 일치하였다(하기 참조).
나노-플레어의 세포내 시그널링을 정량하기 위해, 프로브 처리한 세포를 분석용 유세포 측정으로 조사하였다. 부가적으로, 유세포 측정으로 세포 거대 집단 에서 형광 데이타를 수집할 수 있다. 이는, 적은 세포 샘플로만 평가할 수 있는 형광 이미지화와 같은 기법으로 검출할 수 있는, 편차 및 실험 인공물을 무시한다. 세포를 전술한 나노-플레어(입자 농도, 10 nM)로 처리하였다. 분자 비컨 프로브(서열번호 6 및 7)을 리포펙타민 2000(Invitrogen)을 이용하여 세포로 전달하였다. 처리한 후, 세포를 트립신으로 배양 플라스크에서 탈착시켰다. 유세포 측정을 635 nm에서 여기하는 DakoCytomation CyAn을 이용하여 수행하였다.
나노-플레어가 형질감염된 세포주는, 일정한 형광 세포 단일 집단을 보였는데, 이는 안티센스 입자를 형질감염시켰을 때 관찰되는 세포 침투율 99% 이상과 일치되었다(Rosi et al., Science 312: 1027-1030). 유세포 측정시, 서르비빈 나노-플레어를 처리한 SKBR3 세포에서 형광 강도가 강하였고, 비-상보적인 대조군을 처리한 집단에 비해 형광 강도가 2.5배 높은 것으로 나타났다. 비교로, C166 세포 모델에서, 2가지 프로브는 유사하게 낮은 형광 신호를 나타내었다. 이러한 유세포 측정 실험은 컨포컬 이미지화 결과와 매우 일치되었으며, 이는 나노-플레어의 일관된 세포 내재화 및 세포내 시그널링을 나타낸다.
이후, 세포내 검출 실험 측면에서 이들 프로브의 독특한 성질을 이해하기 위한 실험을 설계하였다. 먼저, 나노-플레어의 세포내 성능을 시판되는 형질감염제인 리포펙타민을 이용하여 전달한 분자 비컨과 비교하였다(Peng et al ., 2005, Cancer Res . 65: 1909-1917; Nitin et al ., 2004, Nucleic Acids Res . 32: e58). 분자 비컨과 나노-플레어를 SKBR3 세포(형질감염 농도, 10 pM)에 도입하고, 이의 시그널링 능력을 유세포 측정으로 조사하였다. 서르비빈 나노-플레어를 처리한 세 포에서는 동일 농도로 형질감염시킨 서르비빈 분자 비컨 프로브를 처리한 세포에 비해 형광 신호가 55배 높게 나타났다. 세포 배양물 이외에서의 형광 측정으로, 각 나노-플레어 프로브가 약 10개의 플루오로포어를 포함하는 것으로 나타났고, 따라서 동일한 프로브 농도에서 분자 비컨 보다 10배 높을 것으로 예상할 수 있었다. 예상한 세포내 형광 강도 보다 높은 것은, 나노-플레어가 분자 비컨 프로브 보다 신속하게 또는 보다 많이 내재화됨을 의미한다.
다음으로, 나노-플레어에서 관찰되는 세포내 형광 신호를 달성하기 위해, 분자 비컨을 고농도(0.5 nM)로 형질감염시켰다. 비-상보적인 프로브에 의한 백그라운드 형광을 비교하였다(분자 비컨 및 나노-플레어 둘다). 비-상보적인 분자 비컨 프로브의 형광은 비-상보적인 나노-플레어 보다 현저하게 높았다. 백그라운드와 신호 간의 차이는 정확한 타겟 검출에 중요하기 때문에, 나노-플레어의 백그라운드가 더 낮은 것이, 세포내 타겟을 검출할 때 매우 좋다.
효소 분해가 비-특이 시그널링을 어떻게 유도하는지는 입증하기 위해, 나노-플레어를 엔도뉴클레아제 DNAse I(0.38 mg/L, 농도는 세포 환경에서 확인되는 농도 보다 훨씬 높음)과 인큐베이션한 다음, 시간 함수로서 형광 신호 증가를 모니터링함으로써 분해율을 측정하였다. 나노-플레어 프로브를 PBS (pH 7.0), 0.25 mM MgCl2 및 50 mg/L 소 혈청 알부민(Fischer Scientific)에 2.5 nM 농도로 희석하였다. 소 췌장 DNase I(United States Biochemical)을 판독하기 바로 전에 첨가하였다(농도, 0.38 mg/L). 모든 실험은 620 nm 여기 및 665 nm 방출로 Photal Otsuka Electronics FluoDia T70에서 수행하였다. 분자 비컨을 25 nM 농도에서 유사한 방식으로 테스트하였다. 이러한 실험 조건에서의 대략적인 분해율을 분해 곡선의 선형 영역의 기울기로 결정하였다(Rizzo et al ., 2002 Molecular and Cellular Probes 16: 277-283).
분석 결과로, 나노-플레어가 이러한 조건 하에서 표준화된 속도 0.275 nmol min-1로 분해되는 것으로 나타났다. 비교로, 분자 비컨은 표준화된 속도 1.25 nmol min-1로 분해되어, 이는 나노-플레어 보다 대략 4.5배 더 빨랐다. 뉴클레아제 활성은 기존 프로브에서 백그라운드 형광을 증가 유도하기 때문에, 나노-플레어에서의 뉴클레아제 감소는 시스템에서 백그라운드 신호를 감소시킨다.
실시예 6
나노-플레어의 세포 도입, 시그널링 증가 및 낮은 백그라운드를 RNA의 세포내 양 변화에 대한 고 민감도로 전환시키는 적용을 입증하기 위해, siRNA 낫다운 실험을 수행하여 SKBR3 세포 모델에서 서르비빈 RNA 전사체의 수준을 감소시켰다. 세포가 약 50% 컨플루언트가 되었을 때(siRNA 농도, 20, 40 및 80 nM), 인간 서르비빈(Santa Cruz)에 대한 siRNA를 리포펙타민 2000(Invitrogen)을 이용하여 세포에 전달하였다. 24시간 후, 배지를 나노-플레어 프로브(입자 농도, 50 pM)가 포함된 배지로 바꾸었다. 6시간 후, 세포를 헹구로 신선한 배지를 첨가하였다. 세포를 12시간 더 배양하고, 유세포 측정으로 분석하였다.
먼저, 세포에 서르비빈에 대한 siRNA를 처리하고, 세포내 RNA 수준을 나노- 플레어 및 유세포 측정으로 정량하였다. 세포 집단의 siRNA 농도-의존적인 형광 이동을 세포 배양물에 첨가한 siRNA의 농도 함수로서 관찰하였다(도 3a). siRNA 농도는 히스토그램의 좌측에 나타내었다. 무처리 샘플의 경우, 집단의 절반에서는 평균 이상의 형광을 나타내었으며, 이를 회색으로 나타내었다. 처리한 샘플에서는 평균적인 형광을 나타내는 세포 집단이 보다 적은 분획으로 나타났다(회색 부분은 감소, 검정 부분은 증가). 이러한 변동이 서르비빈 전사체의 수 감소와 비례하는지를 확인하기 위해, siRNA를 동일 농도로 처리한 샘플에서 RT-PCR을 수행하였다. Guava EasyCyte Mini (Guava Technologies)로 세포 수를 측정하였다. RNeasy Plus Kit (Qiagen)를 이용하고 제조사의 프로토콜에 따라 세포에서 총 RNA를 분리하였다. 세포 용혈 단계 동안에, EGFPRNeasy Plus Kit (Qiagen) 5x107 카피를 각 샘플에 첨가하여, 분리 및 정제 기간 동안에 RNA 소실을 계산하였다. qRT-PCR의 RNA 표준 그래프를 구하기 위해, 정량할 RNA 단편들을 적절한 세포 RNA로부터 제조하였다. PCR 및 T7 프로모터 부분이 포함된 프라이머를 이용하여, 상기 단편들을 전사에 적합한 서열로 변환(DNA -> RNA)시켰다. MEGAclear kit(Ambion)와 제조사의 프로토콜을 이용하여 전사체를 정제하였다. RNA 농도를 리보그린 RNA 정량 키트(Invitrogen)를 이용하여 측정하고, 스톡 RNA의 연속 희석물로 표준 그래프를 그렸다. 프라이머는 다음과 같다:
EGFP 정방향: 5'-TCT TCT TCA AGG ACG ACG GCA ACT-3'(서열번호 8)
EGFP 역방향: 5'- TGT GGC GGA TCT TGA AGT TCA CCT -3'(서열번호 9)
T7 EGFP 정방향: 5'-TGC ATA ATA CGA CTC ACT ATA GGG AGA TCT TCT TCA AGG ACG ACG GGC AAC T - 3'(서열번호 10)
서르비빈 정방향: 5'-ATG GGT GCC CCG ACG TTG-3'(서열번호 11)
서르비빈 역방향: 5'- AGA GGC CTC AAT CCA TGG -3'(서열번호 12)
T7 서르비빈 정방향: 5'-TGC ATA ATA CGA CTC ACT ATA GGG AGA TGG GTG CCC CGA CGT TG-3'(서열번호 13).
정량 PCR 및 분석을 LightCycler RNA 마스터 SYBR 그린 키트(Roche Applied Sciences)를 제조사의 추천 방법에 따라 수행하였다. 역전사는 61℃에서 20분 진행한 후, 45회 증폭 사이클(95℃, 5초; 54℃, 15초; 72℃, 20초)로 수행하였고, 타겟 유전자 RNA를 제조한 표준 그래프로 정규화하였다.
세포 집단내 형광 신호의 선형 감소는, RT-PCR 측정에 의해 결정된 서르비빈 RNA 카피 수 감소와 일치하였다(도 3b). 종합하면, 이러한 결과는, 나노-플레어가 세포내 전사체ㄹ,; 수 변화에 민감함을 시사한다. RT-PCR은 3번 수행하였고, 나타낸 오차 막대는 각 측정의 표준 편차이다.
본 발명에서는 "나노-플레어"라고 하는 새로운 세포내 프로브 유형을 개발하였다. 나노-플레어는, 세포 형질감염, 효소에 대한 방어, RNA 검출 및 정량화를 조합하는 단순한 프로브이기 때문에 새롭고 잠재적으로 매우 유용하다. siRNA 낫다운 실험에서 증명된 이의 용도 이외에도, 나노-플레어는 세포 분류, 유전자 파일링 및 실시간 약물 테스트와 같은 다른 분야에도 사용가능한 것으로 생각된다. 마지막으로, 또한 이들의 유전자 조절 제제로서 작용하는 능력을 고려하면(Rosi et al., 2006, Science 312: 1027-1030; Seferos et al ., 2007, ChemBioChem 8: 1230-1232), 이들 프로브는 실시간으로 동시에 형질감염, 유전자 발현 조절 및 가시화하도록 쉽게 개조되는 것도 고려된다.
요약하면, 이러한 결과들은 하기를 나타낸다:
1) 금 나노 입자는 타겟을 검출할 수 있는 플루오로포어-함유 올리고뉴클레오티드의 세포내 전달을 돕는다.
2) 이들 형광 표지된 올리고뉴클레오티드-변형된 금 나노 입자 제제를 사용하여 세포내 타겟을 검출, 가시화 및 정량할 수 있다.
3) 특이적인 mRNA 타겟의 존재 및 양을 나타내는 형광 신호를 판독가능한 측정치로 변환시킬 수 있다.
4) 이러한 제제들의 효과적인 유입 및 이의 높은 시그널링 능력 및 저독성으로 세포 집단 구별에 매우 적합하다.
5) 이러한 제제의 효과적인 유입 및 이의 높은 시그널링 능력은, 실험한 조건하에서 기존의 소광체-플루오로포어 올리고뉴클레오티드 프로브를 능가한다.
6) 원리를 핵산 앱타머 및 펩타이드와 같은 구조-스위칭 인지 서열로 확장시킬 수 있다.
본 발명에서는, 프로브의 사용이 세포내 복수의 신호를 검출하고 이의 세포내 농도를 동시에 실시간으로 정량하는 능력으로 이어질 것으로 생각한다. 또한, 이러한 원리는, 고등 유기체에서 실시간으로 세포 기능을 모니터링하는데 적용할 수 있으며, 치료제를 동시에 전달하면서 동시에 그 효과를 모니터링하기 위해 이용 될 수 있을 것으로, 생각된다.
SEQUENCE LISTING <110> Mirkin, et al. <120> Particles for Detecting Intracellular Targets <130> 30938/27022R <150> 60/900,648 <151> 2007-02-09 <160> 13 <170> PatentIn version 3.4 <210> 1 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic polynucleotide <220> <221> Misc_feature <222> (23)..(23) <223> nucleotide at position 23 is thiolated <400> 1 cttgagaaag ggctgccaaa aaa 23 <210> 2 <211> 10 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic polynucleotide <220> <221> Misc_feature <222> (1)..(1) <223> nucleotide at position 1 is tagged with Cy5 <400> 2 ttggcagccc 10 <210> 3 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic polynucleotide <400> 3 tggcagccct ttctcaag 18 <210> 4 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic polynucleotide <220> <221> Misc_feature <222> (23)..(23) <223> nucleotide at position 23 is thiolated <400> 4 ctatcgcgta caatctgcaa aaa 23 <210> 5 <211> 13 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic polynucleotide <220> <221> Misc_feature <222> (1)..(1) <223> nucleotide at position 1 is tagged with Cy5 <400> 5 tgcagattgt acg 13 <210> 6 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic polynucleotide <400> 6 tcttcttcaa ggacgacggc aact 24 <210> 7 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic polynucleotide <400> 7 tgtggcggat cttgaagttc acct 24 <210> 8 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic polynucleotide <400> 8 tcttcttcaa ggacgacggc aact 24 <210> 9 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic polynucleotide <400> 9 tgtggcggat cttgaagttc acct 24 <210> 10 <211> 52 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic polynucleotide <400> 10 tgcataatac gactcactat agggagatct tcttcaagga cgacgggcaa ct 52 <210> 11 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic polynucleotide <400> 11 atgggtgccc cgacgttg 18 <210> 12 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic polynucleotide <400> 12 agaggcctca atccatgg 18 <210> 13 <211> 44 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic polynucleotide <400> 13 tgcataatac gactcactat agggagatgg gtgccccgac gttg 44

Claims (14)

  1. 타겟 분자의 세포내 농도를 검출하는 방법으로서,
    타겟 분자와, 상기 타겟 분자에 특이적이며 마커로 표지된 결합 모이어티를 포함하고 있는 나노 입자와의 조합이 허용되는 조건 하에서, 상기 타겟 분자를 상기 나노 입자와 접촉시키는 단계를 포함하며,
    상기 타겟 분자와 상기 나노 입자가 조합하면 상기 마커에 검출가능한 변화가 이루어지고, 이러한 검출가능한 마커의 변화는 상기 타겟 분자의 세포내 농도에 비례하는 것을 특징으로 하는, 타겟 분자의 세포내 농도를 검출하는 방법.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 결합 모이어티가 폴리뉴클레오티드 및 폴리펩타이드로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는, 타겟 분자의 세포내 농도를 검출하는 방법.
  3. 제2항에 있어서,
    상기 결합 모이어티가 DNA인 것을 특징으로 하는, 타겟 분자의 세포내 농도를 검출하는 방법.
  4. 제2항에 있어서,
    상기 결합 모이어티가 RNA인 것을 특징으로 하는, 타겟 분자의 세포내 농도 를 검출하는 방법.
  5. 제1항에 있어서,
    상기 타겟 분자가 폴리뉴클레오티드 및 폴리펩타이드로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는, 타겟 분자의 세포내 농도를 검출하는 방법.
  6. 제2항에 있어서,
    상기 결합 모이어티가 상기 나노 입자에 공유 결합으로 부착되어 있는 폴리뉴클레오티드이고,
    상기 마커가 상기 결합 모이어티 폴리뉴클레오티드에 혼성화된 폴리뉴클레오티드에 부착되어 있는 표지이고,
    상기 결합 모이어티 폴리뉴클레오티드가 상기 타겟 분자와 조합되면, 상기 혼성화된 폴리뉴클레오티드는 분리되고, 상기 마커는 분리된 후 검출가능해지는 것을 특징으로 하는, 타겟 분자의 세포내 농도를 검출하는 방법.
  7. 제6항에 있어서,
    상기 표지를 가진 상기 폴리뉴클레오티드가 상기 결합 모이어티에 혼성화되면, 상기 폴리뉴클레오티드에 부착되어 있는 상기 표지는 소광(quench)되는 것을 특징으로 하는, 타겟 분자의 세포내 농도를 검출하는 방법.
  8. 제2항에 있어서,
    상기 결합 모이어티는, 검출가능한 표지인 마커를 포함하는 폴리뉴클레오티드이고,
    상기 마커는, 상기 폴리뉴클레오티드가 타겟 분자와 조합된 경우에만 검출되는 것을 특징으로 하는, 타겟 분자의 세포내 농도를 검출하는 방법.
  9. 제8항에 있어서,
    상기 결합 모이어티가 상기 타겟 분자와 조합되지 않으면, 상기 마커는 소광되는 것을 특징으로 하는, 타겟 분자의 세포내 농도를 검출하는 방법.
  10. 제2항에 있어서,
    상기 결합 모이어티는 폴리펩타이드이고
    상기 마커는 상기 폴리펩타이드 결합 모이어티와 조합된 표지이고,
    상기 결합 모이어티가 상기 타겟 분자와 조합되면, 상기 표지가 분리되어, 상기 마커가 분리된 후 검출가능해지는 것을 특징으로 하는, 타겟 분자의 세포내 농도를 검출하는 방법.
  11. 제10항에 있어서,
    상기 표지는 상기 결합 모이어티가 조합되면 소광되는 것을 특징으로 하는, 타겟 분자의 세포내 농도를 검출하는 방법.
  12. 제1항에 있어서,
    상기 나노 입자가 복수의 결합 모이어티들을 포함하는 것을 특징으로 하는, 타겟 분자의 세포내 농도를 검출하는 방법.
  13. 제12항에 있어서,
    상기 결합 모이어티들은 하나의 타겟 분자와 특이적으로 조합되는 것을 특징으로 하는, 타겟 분자의 세포내 농도를 검출하는 방법.
  14. 제12항에 있어서,
    상기 결합 모이어티들은 2종 이상의 타겟 분자와 특이적으로 조합되는 것을 특징으로 하는, 타겟 분자의 세포내 농도를 검출하는 방법.
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