ITUA20164610A1 - Metodo per l'analisi di rna - Google Patents

Metodo per l'analisi di rna

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Italy
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rna
smartflare
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Marina Camera
Chiara Zara
Elena Tremoli
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Centro Cardiologico Monzino Spa
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Description

Titolo: “Metodo per l’analisi di RNA”
Descrizione
Forma oggetto della presente invenzione un metodo per la marcatura e l’analisi di RNA su singola cellula, idoneo per piastrine e cellule a breve emivita che comprende i seguenti passaggi:
a) Messa a disposizione di una popolazione di piastrine e/o cellule di interesse;
b) Incubazione di dette piastrine e/o cellule per un tempo compreso tra 10 minuti e 3 ore, o tra 30 minuti e 2 ore, a temperatura compresa tra circa 20 e circa 37°C, in terreno di coltura addizionato di un reagente per lipofezione e una sonda di interesse SmartFlare<TM>;
c) Fissazione con un fissativo;
d) Visualizzazione ed analisi dell’RNA di interesse. Stato dell’arte
Le piastrine sono elementi corpuscolati del sangue che svolgono un ruolo fondamentale nella coagulazione. Il ruolo cruciale svolto dalle piastrine nella coagulazione rende le stesse attori fondamentali nei fenomeni trombotici. Recentemente sono state ascritte alle piastrine altre funzioni quali il controllo della integrità vascolare, il coinvolgimento in processi infiammatori e immunitari, nella metastasi tumorale, nell’angiogenesi e, non ultima, nella insorgenza e progressione della patologia aterotrombotica. La caratteristica che contraddistingue le piastrine è quella di essere prive di nucleo. Viceversa, le piastrine posseggono granuli, organuli citoplasmatici ed RNA.
Considerato il poliedrico ruolo svolto dalle piastrine e la presenza nelle stesse di RNA, è fortemente avvertita la necessità di poter marcare ed analizzare l’RNA contenuto nelle stesse.
La tecnologia SmartFlare<TM>RNA detection probes (Merck Millipore, Germania) permette l’analisi su singola cellula viva dell’espressione di RNA intracellulare. La metodica SmartFlare<TM>prevede di piastrare le cellule, preferibilmente in piastre da 96 pozzetti, ad una confluenza del 60 - 80%. La sonda SmartFlare<TM>viene aggiunta alla cultura e lasciata incubare per un tempo di circa 16 ore, così da permettere l’ingresso per endocitosi della stessa nelle cellule. Una volta all’interno della cellula, la sonda, riconoscendo un target specifico, si lega allo stesso e una successiva analisi in fluorescenza ne rivela la presenza. Le piastrine, così come altre cellule a breve emivita, quali ad esempio monociti, linfociti, granulociti, non potendo essere mantenute in coltura per un tempo così lungo come quello richiesto dalla metodica, non risultano adatte ad essere analizzate con la metodica di cui sopra.
I primi tentativi di introduzione di acidi nucleici in piastrine sono stati descritti da Hong W. et al. Transfection of Human Platelets with Short Interfering RNA Clin Transl Sci. 2011; 4(3): 180–182, raggiungendo però un’efficienza molto bassa, pari a circa il 9%. Miglioramenti della metodica sono descritti in WO 2014118817, con lo scopo di utilizzare siRNA in piastrine. Nessun tentativo è tuttavia descritto circa la marcatura di RNA piastrinico, in particolare di mRNA e miRNA, marcatura che non risulta pertanto facilmente ottenibile con le tecnologie ad oggi disponibili. In particolare, è fortemente avvertita l’esigenza di poter marcare specie di RNA modulate in situazioni acute di patologia. E’ pertanto fortemente avvertita una metodica che, superando i limiti imposti dalle caratteristiche delle piastrine stesse, permetta di marcare l’RNA piastrinico e l’RNA di cellule con breve emivita in vitro.
Descrizione dell’invenzione
La presente invenzione descrive un metodo che permette sorprendentemente di superare i limiti imposti dalla particolare natura delle piastrine e di cellule a breve emivita portando ad ottenere un’efficiente marcatura dell’RNA piastrinico e di cellule a breve emivita in vitro.
Descrizione delle figure
Figura 1: analisi della integrità piastrinica effettuata al citofluorimetro dopo trattamento secondo il metodo Smartflare<TM>(comparativo).
Figura 2: analisi della integrità piastrinica effettuata al citofluorimetro dopo trattamento secondo il metodo della presente invenzione.
Figura 3: analisi comparativa di diversi reagenti di lipofezione per l’incorporazione di sonda Smartflare<TM>controllo negativo (unflare) e controllo positivo (uptake) in piastrine.
Figura 4: livelli di espressione di mRNA esemplificativi (18S e TF) ottenuti secondo il metodo della presente invenzione.
Descrizione dettagliata dell’invenzione:
E’ qui descritto un metodo innovativo per la marcatura e l’analisi di RNA su singola cellula, idoneo per piastrine e cellule a breve emivita.
Detto metodo comprende i seguenti passaggi:
a) Messa a disposizione della popolazione di piastrine e/o cellule di interesse;
b) Incubazione di dette piastrine e/o cellule per un tempo compreso tra 10 minuti e 3 ore, o tra 30 minuti e 2 ore, a temperatura compresa tra circa 20 e circa 37°C, in terreno di coltura addizionato di un reagente per lipofezione e una sonda di interesse SmartFlare<TM>;
c) Fissazione con un fissativo;
d) Visualizzazione ed analisi dell’RNA di interesse. In una forma preferita di realizzazione, detto RNA è mRNA o miRNA.
Con sonde SmartFlare<TM>si intendono, per lo scopo della presente invenzione, le sonde messe a disposizione dalla Merck Millipore che riconoscono target chiave mRNA o miRNA. Dette sonde sono marcate Cy5 o Cy3. E’ tuttavia possibile sintetizzare, con metodiche note all’esperto del settore, sonde ulteriori per specifici scopi, ovvero sonde che riconoscono target di specifico interesse. Per lo scopo della presente invenzione, con sonda SmartFlare<TM>sono pertanto da intendersi sonde in grado di entrare in una cellula, riconoscere un RNA target di interesse e rendere lo stesso visibile secondo la metodica SmartFlare<TM>; a titolo esemplificativo ma non limitativo rientrano le sonde SmartFlare<TM>presenti in catalogo Merck Millipore. Rientrano anche quelle ulteriori sonde che l’esperto del settore è in grado di sintetizzare per target ulteriori e di interesse, in particolare sequenze oligonucleotidiche in grado di appaiarsi con RNA target, a titolo di esempio sequenze di DNA, marcate con un fluoroforo visualizzabile in citofluorimetria e microscopia.
In una forma preferita di realizzazione, detta metodica è operata su piastrine. Preferibilmente, detta incubazione avviene per circa 1 ora a temperatura ambiente, o a circa 37°C. Preferibilmente, detto terreno di coltura è RPMI1640 addizionato di glutamina o GlutaMAX<TM>.
In una forma ancor più preferita, vengono messe a disposizione circa 500.000 piastrine risospese in circa 100 �l di terreno di coltura. Preferibilmente, detto reagente per la lipofezione è selezionato tra: TransIT-LT1 (Mirus), Turbofect transfection reagent (Invitrogen), RiboJuiceTM siRNA Transfection Reagent (Merck Millipore), NanoJuice® Transfection Kit (Merck Millipore), GeneJuice® Transfection Reagent (Merck Millipore) e altri reagenti trasfettanti noti all’esperto del settore. I dati sperimentali ottenuti e riportati in seguito, hanno mostrato che, nonostante le grandi difficoltà, ben note nello stato dell’arte, legate all’introduzione di acidi nucleici in piastrine, sorprendentemente è stato possibile raggiungere livelli più che soddisfacenti di trasfezione utilizzando TransIT-LT1 (Mirus), Gene Juice, Nano Juice, Ribo Juice (Merck Millipore) e Turbofect transfection reagent (Invitrogen). Da un’analisi morfologica, si è osservato che a seguito della trasfezione le piastrine non mostrano alterazioni di rilievo.
1,5 �l di detti reagenti per la lipofezione, diluito 1:10 sono addizionati a 100 �l di terreno di coltura. Preferibilmente, detto terreno di coltura contiene 300 pM di detta sonda SmartFlare<TM>.
Preferibilmente, detto fissativo usato in detto passaggio c) è paraformaldeide (PFA) 1%.
Opzionalmente, al termine dell’incubazione di cui al passaggio b) e prima di detto passaggio di fissazione c), dette piastrine vengono marcate con un anticorpo specifico, ad esempio antiCD41 marcato FITC. Così facendo, si rende possibile evidenziare le piastrine che contengono l’RNA di interesse.
Le figure 1 e 2 riportano i dati di integrità piastrinica utilizzando il metodo così come proposto dalla tecnologia SmartFlare<TM>e il metodo secondo la presente invenzione, rispettivamente. E’ evidente come una marcata alterazione morfologica piastrinica si verifichi applicando il metodo noto nello stato dell’arte, rendendo la metodica non applicabile alle piastrine e come la metodica qui descritta sia in grado sorprendentemente di ovviare a tale alterazione morfologica e di mantenere le piastrine integre e pertanto suscettibili di marcatura.
Risulta particolarmente efficiente, per gli scopi della presente invenzione, isolare le piastrine dal sangue intero con la metodica qui di seguito descritta. Il sangue viene raccolto mediante prelievo venoso della vena cefalica di donatori che hanno dato il loro consenso informato a partecipare nello studio. Sangue intero (WB) è stato prelevato con un ago 19-gauge, senza stasi venosa e messo in un tubo contenente citrato (1/10 volume di sodio citrato 0,129 M) e inibitore della tripsina di mais (50 μg/ml) (Vacutainer, Becton Dickinson) scartando i primi 4 ml. Per la preparazione piastrinica, WB è stato centrifugato a temperatura ambiente, in assenza di freno, preferibilmente a 100 g per 15’. Per lo scopo della presente invenzione viene utilizzato il preparato piastrinico totale analizzato con il Sysmex XE-2100 Automated Hematology Analyzer per determinare il recupero delle piastrine, il volume medio piastrinico (MPV), la Frazione Immatura piastrinica (IPF), e la larghezza di distribuzione piastrinica (PDW).
Vengono riportati qui di seguito alcuni esempi di risultati ottenuti con la metodica secondo la presente invenzione. Detti esempi non intendono in alcun modo limitare la portata della presente invenzione a quanto specificatamente qui esemplificato. In particolare, si descrivono qui i risultati ottenuti utilizzando sonde per Fattore Tissutale (TF mRNA) e il 18S in piastrine. E’ tuttavia possibile sintetizzare e utilizzare sonde per ulteriori RNA di specifico interesse secondo metodiche note all’esperto del settore.
ESEMPI
Esempio 1: comparazione dell’efficienza di incorporazione della sonda SmartFlare<TM>
Un preparato piastrinico è stato incubato con una sonda SmartFlare<TM>per il controllo dell’uptake. Ciascun campione è stato incubato in presenza di uno dei reagenti di lipofezione indicati nella Figura 3 e di 300 pM della sonda Uptake Cy5 e controllo negativo (Scramble Cy5) per 1 ora a temperatura ambiente in terreno di coltura RPMI1640 addizionato di glutamina. Tramite software di analisi di immagine Kaluza è stato quantizzato il grado di fluorescenza e sono stati ottenuti i valori percentuali di piastrine esprimenti il segnale del controllo positivo, sottraendo il segnale dato dal controllo negativo così da togliere il segnale aspecifico.
I risultati sono riportati in Figura 3. I dati riportati dimostrano come sorprendentemente la soluzione della presente invenzione sia in grado di introdurre acidi nucleici in piastrine, più specificatamente sonde per il riconoscimento di RNA marcate, permettendo così sorprendentemente un’analisi dell’RNA piastrinico su singola cellula viva. Da notare, l’elevata efficienza ottenuta, come riportato alla destra della figura 3, con ciascuno dei reagenti di lipofezione riportati.
Esempio 2: Marcatura ed analisi di TF e 18S mRNA in piastrine.
E’ noto che una sottopopolazione di piastrine umane esprimono TF mRNA. Le sonde usate includono:
- Sonde controllo: Smartflare™ 18S-Hu-Cy5 (Cat. No.
SF-142); controllo negativo: SmartFlare™ Scramble-Cy5 (Cat. No. SF-102) che lega sequenze mRNA non senso non presenti nel campione; controllo positivo: SmartFlare™ Uptake-Cy5 (Cat. No. SF-137) che ha un fluoroforo costitutivamente fluorescente. - Sonde specifiche sono state disegnate per gli mRNA di interesse, in particolare una sonda marcata Cy5 per TF mRNA, SEQ ID NO. 1 (GTTTCACACCTTACCTGGAGACAAACC).
Piastrine sono state isolate da sangue intero di volontari sani previa sottoscrizione di consenso informato, secondo metodi noti all’esperto del settore. Per ognuna delle sonde di cui sopra, 500.000 piastrine sono state incubate 1 ora a temperatura ambiente in terreno di coltura RPMI1640 addizionato di glutamina con 1,5 �l di reagente di trasfezione TransIT-LT1 diluito 1:10 e 300 pM di una delle sonde SmartFlare<TM>di cui sopra.
Dopo detta incubazione, le piastrine sono state marcate con anticorpo anti CD41 marcato FITC e fissate con PFA 1%. Tramite citofluorimetria, la fluorescenza Cy5 delle sonde è stata analizzata nelle piastrine CD41 positive. Dopo aver escluso aggregati piastrinici, è stato valutato il segnale emesso dal controllo positivo (Uptake Cy5) e controllo negativo (Scramble Cy5). Tramite software di analisi Kaluza è stata quantizzata la mediana di fluorescenza (MFI) delle sonde che riconoscono rispettivamente gli mRNA di 18S e TF tra gli eventi CD41 e Cy5 positivi, usando come controllo negativo lo Scramble Cy5 per sottrarre il segnale aspecifico. I dati sono espressi come MFI e i risultati sono riportati in Figura 4. In particolare, TF è risultato essere espresso a bassi livelli nelle piastrine rispetto al 18S che è molto abbondante.

Claims (7)

  1. RIVENDICAZIONI 1. Un metodo per la marcatura e l’analisi di RNA su singola cellula, idoneo per piastrine e cellule a breve emivita, che comprende i seguenti passaggi: a) Messa a disposizione di una popolazione di cellule di interesse; b) Incubazione di dette piastrine e/o cellule per un tempo compreso tra 10 minuti e 3 ore, o tra 30 minuti e 2 ore, a temperatura compresa tra circa 20°C e circa 37°C, in terreno di coltura addizionato di un reagente per lipofezione e una sonda di interesse SmartFlare<TM>; c) Fissazione con un fissativo; d) Visualizzazione ed analisi dell’RNA di interesse.
  2. 2. Il metodo secondo la rivendicazione 1, dove detta popolazione di cellule è una popolazione di piastrine umane.
  3. 3. Il metodo secondo una delle rivendicazioni 1 o 2, dove detto RNA è mRNA e miRNA.
  4. 4. Il metodo secondo una delle rivendicazioni da 1 a 3, dove detta incubazione avviene per circa 1 ora a temperatura ambiente in terreno di coltura RPMI1640.
  5. 5. Il metodo secondo una delle rivendicazioni da 1 a 4, dove vengono messe a disposizione circa 500.000 piastrine risospese in circa 100 �l di terreno di coltura.
  6. 6. Il metodo secondo la rivendicazione 6, dove 1,5 �l di reagente per la lipofezione diluito 1:10 sono addizionati a 100 �l di detto terreno di coltura che contiene 300 pM di detta sonda SmartFlare<TM>.
  7. 7. Il metodo secondo una delle rivendicazioni da 2 a 7, dove al termine dell’incubazione di cui al passaggio b) e prima di detto passaggio di fissazione c), dette piastrine vengono marcate con un anticorpo piastrinospecifico.
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