JP2010112861A - 表面の修飾された希土類含有セラミックスナノ粒子 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】 表面の修飾された希土類含有セラミックスナノ粒子(RED−CNP)であって、該粒子表面に、式(I)
PEG−block−ポリ(carbo) (I)
式中、PEGはα−末端が修飾されていてもよいポリ(エチレングリコール)鎖を含むセグメントを表し、そしてポリ(carbo)は側鎖にカルボキシル基を有する反復単位を含むポリマー鎖セグメントを表す、
で示されるブロック共重合体、および任意に特定の生体物質に対する標的指向性を有する生体分子特定の生体物質を特異的が該カルボキシル基を有する反復単位を含むポリマー鎖を介して固定されている、上記表面の修飾されたRED−CNP。PEG鎖の立体反発により、生理条件下におけるナノ粒子同士の凝集を阻害し、さらに非標的生体物質の吸着も抑制することが可能となる。
【選択図】 なし
Description
PEG−block−ポリ(carbo) (I)
式中、PEGはα−末端が修飾されていてもよいポリ(エチレングリコール)鎖を含むセグメントを表し、そして
ポリ(carbo)は側鎖にカルボキシル基を有する反復単位を含むポリマー鎖セグメントを表す、
で示されるブロック共重合体が該カルボキシル基を有する反復単位を含むポリマー鎖を介して固定されている、上記表面の修飾されたRED−CNP、が提供される。
載されているような葉酸の如きリガンドを共有結合し、標的指向性を付与することもできる。一方、後者では、該生体分子の特定の生体物質に対する標的指向性を利用して、組織学的な標識として、また、各種のバインディングアッセイ等に使用できる。
本発明にいう、希土類含有セラミックナノ粒子(RED−CNP)は、本発明の目的に沿うものである限り、それらの構成元素種、調製方法の如何を問うことなく、近赤外光励起によるアップコンバージョンを伴う如何なる発光ナノ粒子であってもよい。また、ナノ粒子と称するのは、主として数ナノ(nm)ないし数100ナノ(nm)サイズにある粒子を意図しているが、数μmにある微粒子を排除することまで意図するものではない。このような、RED−CNPには、上記非特許文献1〜3、またはそこで引用された文献に記載されたナノ粒子も包含される。限定されるものでないが、元素組成で表すと、ドープする(または含有せしめる)希土類元素または希土類元素の組み合わせをXとしてY2O3:X,La2O3:X,Gd2O3:X,Y2O2S:X,Gd2O2S:X,La2O2S:X,YOF:X,Y3OCl7:X,YF3:X,GdF3:X,LaF3:X,LiYF3:X,NaYF4:X,BaYF5:X,BaY2F5:X,YGaO3:X,Y3Ga5O12:X,YSiO5:X,YSi3O7:X,LaOCl:X,LaOBr:X,YOCl:X,YOBr:X,LaPO4:X,YPO4:X,LaVO4:X,YVO4:X,Al2Y4O9:X,AlYO3:X,Y3Al5O12:Xをあげることができる。単独でドープする希土類元素Xとしては、Ce,Pr,Nd,Sm,Eu,Tb,Dy,Ho,Er,Tm,Ybをあげることができる。ドープする希土類元素の組み合わせはCe,Pr,Nd,Sm,Eu,Tb,Dy,Ho,Er,Tm,Ybの中から複数の組み合わせをあげることができるが、好ましくはYbとPr,Eu,Ho,ErまたはTmの組み合わせをあげることができる。
Aは水素原子または置換もしくは未置換の炭素原子12個までのアルキル基を表し、
Lは直接結合または二価の連結基を表し、
Tは水素原子、ヒドロキシル基または−ZR”であって、ここでZは単結合、CO、OもしくはNHを表し、R”は水素原子、置換もしくは未置換の炭素原子12個までの炭化水素基を表し、
Rは水素原子またはメチル基を表し、
mは4〜2500、好ましくは、10〜1000、より好ましくは100〜250の整数であり、
nは5〜1000、好ましくは、10〜1000、より好ましくは30〜50の整数であり、
x+yまたはzは5〜1000、好ましくは、10〜500、より好ましくは20〜70の整数であり、
そして各式中のカルボキシル基は、独立して30%までエステル(例えば、C1−C6アルキル、ベンジル、フェネチル、等のアルコール成分との)の形態にあることができる。Lは直接結合または二価の連結基、例えば、O、NH、COまたはX(CH2)pYであ
って、ここでXはOCO、OCONH、NHCO、NHCOO、NHCONH、CONHもしくはCOOを表し、YはNHもしくはCOを表し、pは1〜6の整数を表す。
硝酸イットリウム・6水和物(4.0mmol)、硝酸エルビウム・6水和物(0.3mmol)、尿素(0.4mol)を加えた水溶液200mlを100℃に加熱し、2時間
反応を行なった。得られた試料を遠心精製(20000g,15min,×3回)、溶媒置換(水)を行い、乾燥後に900℃で1時間熱処理することで、エルビウム含有イットリアナノ粒子(UNP1)を得た。
また、同様の方法で、硝酸イットリウム・6水和物(4mmol)、硝酸エルビウム・6水和物(0.3mmol)、硝酸イッテルビウム(0.3mmol)、尿素(0.4mol)を加えた水溶液200mlを100℃に加熱し、2時間反応させ、得られた試料を上記同様に遠心精製、溶媒置換を3回行い、乾燥後に900℃で1時間熱処理することで、イッテルビウム、エルビウム含有イットリアナノ粒子(UNP2)を得た。
UNP2 1.0mgとPEG−b−PAAc(ポリ(アクリル酸))(Mn=5000/3200、Polymer Souce 社、カナダから入手)5.0mgをTris−HCl buffer(10mM,pH7.0)10mL中で攪拌(24時間,4℃)、遠心精製(90000G,15min,×3)し、PEG化UNP1(PEG−UNP1)を調製した。この調製したPEG−UNP1のFT−IR測定より、PEG−b−PAAc由来と考えられるカルボニル基の存在を確認した。このPEG−UNP1のζ電位を測定したところ、ほぼ0mV付近を示しており、粒子表面にPEG−b−PAAcが吸着し、電位が遮蔽されているものと考察した。さらに熱重量分析(TGA)により吸着ポリマー量を定量し、PEG−UNP1表面のPEG密度を算出した結果、0.019chains/nm2となった。これらの結果より、PEG−b−PAAcによってUNP1が効果的に修飾されていることが確認された。
調製したPEG−UNP1の分散安定性をDLS測定によって検討した、この結果、PEG−UNP1(1.0mg)は生理条件下(10mM,Tris−HCl buffer,150mM NaCl)10mL中において1週間以上安定し、粒径分布にほとんど変化がないことが確認された。
UNP2 1.0mgとPEG−b−PAAc(Mn=5000/3200)5.0mg、ストレプトアビジン(SA)0.6mgをTris−HCl buffer(10mM,pH7.0)10mL中で攪拌(24h,4℃)、遠心精製(50000G,15min,×3)し、PEG/SA共固定UNP2(PEG/SA−UNP2)を調製した。この調製したPEG/SA−UNP2をビオチン標識抗体プレートに加えて蒸留水で洗浄した後、近赤外(NIR)励起光(980nm)を照射して観察したところ、近赤外光励起型発光の一種であるアップコンバージョン発光(550nm,660nm)、さらに近赤外領域の発光(1500nm)が見られた。
この抗体プレートの発光の明るさは、プレート上のビオチン標識抗体量に依存して増加することも確認され、PEG/SA−UNP2が特異的認識可能であることが示された。同様の手順でビオチン未標識抗体プレートにPEG/SA−UNP2を加えた際には、アップコンバージョン発光および近赤外発光は観察されず、非特異吸着が起きていないことも確認された。
UNP1 1.0mgとPEG−b−PAAc(Mn=5000/3200)5.0mg、ウシ血清アルブミン(BSA)5.0mgをTris−HCl buffer(10mM,pH7.0)10mL中で攪拌(24h,4℃)、遠心精製(90000G,15min,×3)し、PEG/BSA共固定UNP1(PEG/BSA−UNP1)を調製した。この調製したPEG/BSA−UNP1を抗BSA抗体プレートに加えて蒸留水で洗
浄した後、近赤外(NIR)励起光(980nm)を照射して観察したところ、近赤外光励起型発光の一種であるアップコンバージョン発光(550nm,660nm)が見られた。この抗体プレートの発光の明るさは、プレート上の抗BSA抗体量に依存して増加することも確認され、PEG/BSA−UNP1が特異的認識可能であることが示された。同様の手順で抗マウスIgG抗体プレートにPEG/BSA−UNP1を加えた際には、アップコンバージョン発光は観察されず、非特異吸着が起きていないことも確認された。
Claims (8)
- 表面の修飾された希土類含有セラミックスナノ粒子(RED−CNP)であって、該粒子表面に、式(I)
PEG−block−ポリ(carbo) (I)
式中、PEGはα−末端が修飾されていてもよいポリ(エチレングリコール)鎖を含むセグメントを表し、そして
ポリ(carbo)は側鎖にカルボキシル基を有する反復単位を含むポリマー鎖セグメントを表す、
で示されるブロック共重合体が該カルボキシル基を有する反復単位を含むポリマー鎖を介して固定されている、上記表面の修飾されたRED−CNP。 - 表面の修飾された希土類含有セラミックスナノ粒子(RED−CNP)であって、該粒子表面に、式(I)
PEG−block−ポリ(carbo) (I)
式中、PEGはα−末端が修飾されていてもよいポリ(エチレングリコール)鎖を含むセグメントを表し、そして
ポリ(carbo)は側鎖にカルボキシル基を有する反復単位を含むポリマー鎖セグメントを表す、
で示されるブロック共重合体が該カルボキシル基を有する反復単位を含むポリマー鎖を介して固定されており、かつ、
該共重合体の他に、さらに特定の生体物質に対する標的指向性を有する生体分子が共固定されている、上記表面の修飾されたRED−CNP。 - 式(I)におけるポリ(carbo)が、ポリ(アクリル酸)、ポリ(メタクリル酸)、ポリ(アスパラギン酸)、ポリ(グルタミン酸)、ポリ(リンゴ酸)よりなる群から選ばれるポリマー由来である、請求項1または2記載の表面の修飾されたRED−CNP。
- 式(I)で示されるブロック共重合体が、下記式(II)、(III−a)、(III−b)、(IV−a)
および(IV−b)で示されるブロック共重合体からなる群より選ばれる、請求項1または2記載の表面の修飾されたRED−CNP。
Aは水素原子または置換もしくは未置換の炭素原子12個までのアルキル基を表し、
Lは直接結合または二価の連結基を表し、
Tは水素原子、ヒドロキシル基または−ZR’であって、ここでZは単結合、CO、OもしくはNHを表し、R’は水素原子、置換もしくは未置換の炭素原子12個までの炭化水素基を表し、
Rは水素原子またはメチル基を表し、
mは4〜2500の整数であり、
nは5〜10000の整数であり、
X+Yまたはzは5〜1000の整数であり、そして
各式中のカルボキシル基は、独立して30%までエステルの形態であることができる。 - 水性媒体中で、RED−CNPおよびその表面に結合した側鎖にカルボキシル基を有する反復単位を含むポリマー鎖セグメントが主として内部に存在し、α−末端が修飾されていてもよいポリ(エチレングリコール)鎖を含むセグメントが主として外側に存在するようなコア−シェル構造を有する請求項1記載の表面の修飾されたRED−CNP。
- RED−CNPと
式(I)
PEG−block−ポリ(carbo) (I)
式中、PEGはα−末端が修飾されていてもよいポリ(エチレングリコール)鎖を含むセグメントを表し、そして
ポリ(carbo)は側鎖にカルボキシル基を有する反復単位を含むポリマー鎖セグメントを表す、
で示されるブロック共重合体と
任意に、特定の生体物質に対する標的指向性を有する生体分子と
を含む緩衝化された水溶液を攪拌する工程を含んでなる、請求項1または2記載の表面の修飾されたRED−CNPの製造方法。 - 請求項2記載の表面の修飾されたRED−CNPを含んでなる特定の生体物質を蛍光ラベリングするための試薬。
- 請求項2記載の表面の修飾されたRED−CNPを生物学的試料と接触させ、次いでRED−CNPの近赤外光励起による近赤外発光または可視発光を観察することとを含んでなる該試料中の特定生体物質の検出方法。
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