WO2021145796A2 - Метод определения содержания аналита в образце с помощью агента на основе наночастицы и распознающего олигонуклеотида - Google Patents

Метод определения содержания аналита в образце с помощью агента на основе наночастицы и распознающего олигонуклеотида Download PDF

Info

Publication number
WO2021145796A2
WO2021145796A2 PCT/RU2021/050005 RU2021050005W WO2021145796A2 WO 2021145796 A2 WO2021145796 A2 WO 2021145796A2 RU 2021050005 W RU2021050005 W RU 2021050005W WO 2021145796 A2 WO2021145796 A2 WO 2021145796A2
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
analyte
recognition oligonucleotide
signaling
nanoparticle
receptor
Prior art date
Application number
PCT/RU2021/050005
Other languages
English (en)
French (fr)
Other versions
WO2021145796A3 (ru
Inventor
Максим Петрович НИКИТИН
Original Assignee
Максим Петрович НИКИТИН
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Максим Петрович НИКИТИН filed Critical Максим Петрович НИКИТИН
Publication of WO2021145796A2 publication Critical patent/WO2021145796A2/ru
Publication of WO2021145796A3 publication Critical patent/WO2021145796A3/ru

Links

Classifications

    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B82—NANOTECHNOLOGY
    • B82Y—SPECIFIC USES OR APPLICATIONS OF NANOSTRUCTURES; MEASUREMENT OR ANALYSIS OF NANOSTRUCTURES; MANUFACTURE OR TREATMENT OF NANOSTRUCTURES
    • B82Y15/00—Nanotechnology for interacting, sensing or actuating, e.g. quantum dots as markers in protein assays or molecular motors
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C01—INORGANIC CHEMISTRY
    • C01G—COMPOUNDS CONTAINING METALS NOT COVERED BY SUBCLASSES C01D OR C01F
    • C01G7/00—Compounds of gold
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
    • C07H21/00—Compounds containing two or more mononucleotide units having separate phosphate or polyphosphate groups linked by saccharide radicals of nucleoside groups, e.g. nucleic acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing

Definitions

  • the invention relates to the field of analyte detection, in vitro diagnostics, detection of molecular analytes in a sample, express analyzes, including for the detection of nucleic acids.
  • the invention consists in methods (methods) for detecting anlytes in a sample, and also discloses analytical agents associated with these methods. Indexes of the heading of the current edition of the International Patent Classification (MIC) to which the invention belongs: G01N33 / 50.
  • NK nucleic acids
  • nucleotide sequences are associated with time-consuming methods, such as, for example, restriction analysis with appropriate enzymes, followed by gel electrophoresis and staining of the resulting fragments.
  • time-consuming methods such as, for example, restriction analysis with appropriate enzymes, followed by gel electrophoresis and staining of the resulting fragments.
  • thermostable enzymes ligase, transferase, polymerase, etc.
  • PCR polymerase chain reaction
  • LCR ligase chain reaction
  • SDA strand displacement amplification
  • NDT analysis is still quite expensive and is the lot of large diagnostic institutions equipped with specialized equipment and qualified personnel (Carter DJ, et al. Nucleic Acids Res. 2007; 35 (10): e74-e74).
  • the development of methods for express diagnostics of nucleic acids with a total analysis time of 5-25 minutes is of undoubted interest.
  • LAMP loop mediated isothermal amplification
  • NASBA nucleic acid sequence based amplification
  • HDA helicase dependent amplification
  • RCA rolling amplification rolling circle amplification
  • the second direction in the development of NK tests is to eliminate the amplification stage by using a more sensitive system for detecting NK target.
  • the NK assay should have a limit of detection (LOD) of the order of 10 18 mol (1 amol) of the target nucleotide sequence (Aveyard J, et al. Chem Commun. 2007; (41): 4251).
  • LOD limit of detection
  • NC detection methods capable of achieving this sensitivity, such as optical fiber fluorescence sensors (Kleinjung F, et al. Anal Chim Acta. 1997; 350 (l-2): 51-58 ), visualization of individual molecules with CCD cameras (Anazawa T, et al. Anal Chem.
  • oligonucleotide sequences to the opposite ends of which fluorochrome molecules are chemically stitched and quenched a fluorescence quencher (quencher).
  • quencher fluorescence quencher
  • oligonucleotides spontaneously form secondary structures (the so-called “hairpins” or hairpins) due to the interaction of mutually complementary regions, due to which the fluorochrome and quencher molecules are in close proximity to each other and fluorescence is quenched.
  • the fluorescent signal from the "beacon” is absent, but when it is attached to a molecular target (complementary to a DNA or RNA sequence), the "hairpin” is destroyed, its ends diverge, the fluorochrome is activated and resumes its fluorophore activity, which allows for a quantitative (or qualitative - depending on the analysis format) assessment of the concentration of targets in the sample under study in real time.
  • ICA rapid analyzes based on "molecular beacons” have reached a sensitivity of units of pM (Mao X, et al. Commun. 2009; (21): 3065; He Y, et al. Biosens Bioelectron.
  • nanoparticles Systems based on nanoparticles are extremely interesting for creating express methods for DNA detection (both with the use of amplification methods and without them).
  • systems are being actively developed in which nanoparticles carry sensory oligonucleotides on their surface that can interact with detectable DNA / RNA, which ultimately leads to the binding of the nanoparticle to the solid phase or other particles or molecules.
  • said nanoparticle as a rule is itself a reporter, i. E.
  • Methods for detecting nucleic acids are also described, including immobilization on a membrane and requiring fewer steps of washing from unbound reagents.
  • a method for detecting DNA by hybridizing the test DNA with a probe, previously labeled with digoxigenin, on disposable filters. The method includes preliminary wetting of the filter with a buffer solution, followed by the addition of the analyzed DNA, a blocking reagent and a solution for hybridization, and, finally, the addition of digoxigenin-labeled DNA under conditions favorable for hybridization.
  • Detection of the binding of digoxigenin-labeled DNA is carried out using a conjugate of alkaline phosphatase with antibodies against digoxigenin and chromogenic substrates. Note that, although this method is applicable for the detection of labeled DNA fragments, it is complicated by long-term sequential addition of reagents. More preferable would be a method that does not require multiple purifications and additions of reagents.
  • the closest prototype to the proposed invention is a method for determining the intracellular concentration of polypeptides or small molecules (US Patent 9,890,427) and its analogue for the determination of polynucleotides (US Patent 8,507,200) based on noble metal nanoparticles and operating on the basis of molecular beacon technology.
  • the method consists in incubation under suitable conditions of the target polypeptide or small molecule with a nanoparticle, which includes aptamer molecules, in turn labeled with a marker.
  • the association of the target polypeptide or small molecule with the nanoparticle causes a detectable change in the marker, and this change is proportional to the intracellular concentration of the specified target polypeptide or small molecule
  • the specified aptamer is a single-stranded polynucleotide covalently linked to the specified nanoparticle
  • the specified marker is a fluorescent label, attached to the polynucleotide hybridized with the specified aptamer.
  • said polynucleotide hybridized with said aptamer is not attached to the nanoparticle, and association of said aptamer with said target polypeptide or small molecule releases said hybridized polynucleotide and said marker is detected after this release.
  • the main disadvantage of this solution should be considered the presence of an obligatory stage of preliminary formation of the molecular aptamer / polynucleotide complex, followed by its destruction in the presence of the target polypeptide or small molecule.
  • a fundamental limitation of this approach is also a relatively low rate (k ⁇ 10 5 M _1 s _1 ) and a high energy barrier (ca.30 kcal / mol) of the interaction of the molecular complex with the target analyte (Gao Y. Nucleic Acids Res.
  • the required technical result is to accelerate the detection and identification of nucleic acids and other molecules, improve the sensitivity of the detection / registration method, and simplify the methodology for use in the field.
  • a method for determining the analyte content in a sample using an analytical agent comprising the step of contacting said sample with said analytical agent containing a nanoparticle under conditions that allow the analyte to bind to a single-stranded recognition oligonucleotide bound to said nanoparticle, and said nanoparticle connected to the first end of said recognizing oligonucleotide, said recognition oligonucleotide is capable of specifically binding to an analyte, the second end of said recognition oligonucleotide is covalently linked to a signaling receptor, said signaling receptor is not capable of specifically binding to said analyte, said signaling receptor is capable of specifically binding to a signaling ligand, further bringing said analytic agent into contact with a signaling ligand, detecting the amount of bound nanoparticles of said analytical agent with said signaling ligand as a measure of the analyte content in said sample,
  • a method for determining the content of an analyte in a sample using an analytical agent comprising the step of contacting said sample with said analytical agent containing a nanoparticle under conditions that allow the analyte to bind to a single-stranded recognition oligonucleotide bound to said nanoparticle, said nanoparticle being bound to the first end said recognition oligonucleotide, said recognition oligonucleotide is capable of specifically binding to an analyte, the second end of said recognition oligonucleotide is covalently linked to a signal receptor, said signal receptor is not capable of specifically binding to said analyte, said signal receptor is capable of specific binding to a signal ligand, further description into contact with a signaling ligand, detecting the amount of bound nanoparticles of said analytical agent with said signaling league nd as a measure of the analyte content in said sample, characterized in that said recognition oligonucleotide on said analytical agent does
  • a method for determining the content of an analyte in a sample using an analytical agent comprising the step of contacting said sample with said analytical agent containing a nanoparticle under conditions that allow the analyte to bind to a single-stranded recognition oligonucleotide bound to said nanoparticle, said nanoparticle being bound to the first end said recognition oligonucleotide, said recognition oligonucleotide is capable of specifically binding to an analyte, the second end of said recognition oligonucleotide is covalently linked to a signal receptor, said signal receptor is not capable of specifically binding to said analyte, said signal receptor is capable of specific binding to a signal ligand, further description into contact with a signaling ligand, detecting the amount of bound nanoparticles of said analytical agent with said signaling league as a measure of the analyte content in said sample, characterized in that all hairpins on said recognition oligonucleotide are located
  • test strip - a chromatographic medium in which the analysis can be carried out.
  • the test strip contains an "application area” for applying the sample and a "binding area” containing an immobilized binding reagent or a binding nucleotide sequence capable of binding and immobilizing the detected nucleotide sequence.
  • the binding zone typically has a substantially smaller surface area than the test strip and contains an immobilized binding reagent or an immobilized binding nucleotide sequence.
  • the binding area can be in the form of a point, line, curve, strip, or a pattern of points, lines, curves, stripes, or a combination of these. Typically, the direction of movement of the sample along the test strip crosses the binding zone.
  • the binding zone may be in the form of an abbreviation for the name or names of the analyte or analytes in the test sample.
  • complementarity or “complementary” is used in relation to nucleic acids (eg, nucleotide sequences) and refers to the known rule for the formation of paired complexes of nitrogenous bases adenine thymine and cytosine guanine.
  • nucleic acids eg, nucleotide sequences
  • the complementary sequence is 3'-AGCC-5'. If in the sequences all nucleotides correspond to the principle of complementarity, then they speak of complete complementarity, as in the example given. In the case when only a part of the nucleotides agree with the principle, then the complementarity is called partial.
  • sequence 5'-GGCCAATCG-3 ' is partially complementary to the sequence 3'-CGGCTAACC-5'.
  • the number of nucleotides corresponding to the principle of complementarity in the sequences determines the degree of their complementarity, which affects the efficiency of nucleic acid hybridization.
  • the term "significant complementarity" refers to a sample that can hybridize to one or more strands of the target nucleic acid under conditions of increased stringency (see below), or, for example, in PT buffer]) 3 heated to 95 ° C and cooled to room temperature.
  • binding partner refers to a pair of molecules and / or particles capable of recognizing each other (in whole or in part) and forming both covalent and non-covalent bonds. There are a number of commonly used bond pairs as well as structures based on such pairs.
  • binding partners form covalent bonds due to the presence of amino-reactive groups in such partners, such as succinimidyl ethers, isothiocyanate, sulfonyl halides, or sulfhydryl reactive groups, including derivatives of haloacetates and maleimides.
  • Other binding partners include halogens, steroids and 2,4-dinitrophenyls.
  • nucleic acid means a polymer or oligomer composed of nucleotides, or compounds that mimic them. Also, the term refers to oligonucleotides having non-naturally occurring portions of the chain, but exhibiting the same properties as naturally occurring oligonucleotides. It should be obvious to those skilled in the art that a wide variety of assays can be performed in accordance with the present invention to detect target nucleic acid sequences.
  • nucleotide herein refers to ribonucleotides, deoxyribonucleotides, or nucleotide analogs having a chemical modification in one or more of the building blocks of a nucleotide (nitrogenous bases - purine or pyrimidine, sugar, phosphates). Modifications can, for example, be carried out in the fifth position of pyrimidine, or the eighth position of purine, in the exocyclic amino group of cytosine, by replacing uracil with 5-bromo-uracil, replacing the hydroxy group in the 2'-position of the sugar with a halo group (or by R, OR, SH , H, SR, NR2, Nth, NHR, CN).
  • ribonucleic acids found in living organisms, either with a base substituted (xanthine, ionosine, etc.) or sugar (2'-methoxyribose, etc.). Modification of the phosphodiester bond is also possible, for example, chain formation with phosphorothionates, methylphosphonates and peptides.
  • Nucleic acid can mean a single- or double-stranded molecule composed of monomers (nucleotides) containing fragments of sugars, phosphates and purines or pyrimidines.
  • ribonucleic acid RNA
  • RNA performs translation functions, i.e. serves as a transmitter of genetic information stored in "deoxyribonucleic acid” (DNA).
  • fragment refers to a specific part of a DNA sequence.
  • sample refers to any liquid potentially containing analytes.
  • the sample can be obtained from human or other animal tissues or fluids (blood / serum, urine, saliva, tears, sputum, sweat, mucus, stools), from tissue culture samples, histological samples, biopsy samples, etc.
  • the sample can also be obtained from agricultural products, bacteria, viruses, or their waste products and processing. Also, various garbage and waste, their processed products, drinking and waste water, processed or raw food, air, etc. can serve as a sample.
  • the implementation of the present invention for the detection of the desired nucleic acid sequences it can be used for the analysis of genetic abnormalities and many other diseases, serve to monitor the course of treatment of infectious diseases, as well as for many other applications.
  • recognition oligonucleotide refers to NK containing a sequence complementary to the analyzed (target) nucleic acid (analyte).
  • signal-generating substrate refers to a substance capable of interacting with a signaling receptor and generating a detectable signal.
  • ABTS / TMB for peroxidase
  • BCIP / MBT for alkaline phosphatase
  • light for fluorescent compounds for fluorescent compounds.
  • signal receptor means a substance capable of detecting the desired analyte through the release of energy or by enzymatic activity, for example, fluorescent and chemiluminescent fragments, particles, enzymes, radioactive labels, light-emitting domains or molecules.
  • porous material or "chromatographic material” means a material having pores of at least 0.1 ⁇ m, preferably at least 10.0 ⁇ m, of sufficient size for liquid media to move through it by capillary forces.
  • signal-producing system refers to a set of reagents required to generate a detectable signal under the influence of external influences.
  • such systems generate a signal that can be detected by external means - for example, by measuring electromagnetic radiation, or by visual observation.
  • external means for example, by measuring electromagnetic radiation, or by visual observation.
  • such systems consist of a chromophore substrate and an enzyme that converts the substrate into a dye that absorbs electromagnetic radiation of a certain range, phosphorescent or fluorescent substances.
  • the location of the hairpin from the first or second end of the recognition oligonucleotide at a distance of X nucleotide bases implies the following.
  • the site of binding of a nanoparticle or a signaling receptor with a recognition oligonucleotide should be considered the nucleotide with which their bond is formed (preferably covalent).
  • this nucleotide is the first in the hairpin (i.e., forms a non-covalent bond with another nucleotide)
  • the nucleotide base of the recognition oligonucleotide corresponding to the binding site of the signaling receptor or nanoparticle is preferably located at the edge of the oligonucleotide, but may not be the extreme base in the oligonucleotide.
  • the nucleotide base of a recognition oligonucleotide corresponding to the binding site of a signaling receptor (or nanoparticle) means a nucleic acid monomer, a nucleotide (including a nucleoside, a saccharide, and a phosphoric acid residue) to which the signaling receptor (or nanoparticle) is bound.
  • receptor and “ligand” are interchangeable and can be used to refer to individual molecules in the above concept of “binding partners”. So, for example, if often in the literature in pairs streptavidin-biotin, antibody-antigen, a receptor means streptavidin and an antibody, and a ligand means biotin and an antigen, then in the description of the present invention, a receptor can mean both streptavidin with an antibody, and biotin with antigen (in this case, the ligand will be, respectively, biotin with antigen and streptavidin with antibody, respectively).
  • Nanoparticle - means a particle in a wide range from 1nm to 10Omkm, preferably from 1nm to Yumkm, more preferably from 1nm to 1um, more preferably from 1nm to 100nm.
  • nanoparticles can be metallic, polymeric, core-shell structures, etc.
  • nanoparticles means supramolecular structures that are composed of more than one molecule.
  • objects up to 10Onm are often denoted by nanoparticles, objects larger than 100 nm are also meant within the framework of the description of this invention - preferably up to 5 ⁇ m, but in some cases the size is acceptable up to YOmkm.
  • nanoparticles mean both nanoparticles and microparticles, microspheres, etc.
  • particles with the mentioned dimensions are meant, both in all dimensions, and in at least one.
  • Therapeutic agents / molecules / agents can be understood as substances, substances, molecules, supramolecular agents, nanoparticles, microparticles, nanoagents, microagents, formulations, dosage forms, etc., which are used both for therapy and diagnosis of various diseases or conditions of the body. or a patient, incl. include labels, contrast agents, controlled release components, paramagnetic and magnetic agents, cytotoxic agents, and the like.
  • a “label” or “detectable element” is a composition detectable by spectroscopic, photochemical, biochemical, immunochemical, chemical or other physical means.
  • labels include 32P, fluorescent dyes, electron dense reagents, enzymes (for example, as commonly used in ELISA), biotin, digoxigenin or haptens, and proteins or other entities that can be detected, for example, by incorporating radioactive peptide or antibody tags that specifically react with the target peptide. Any method known in the art for conjugating a tagged antibody can be used, for example, using the methods described in (Hermanson, G. T., Academic press, 2013).
  • the term "pharmaceutical” refers to a composition that is useful in treating a disease or symptom of a disease.
  • treatment refers to any indication of success in the treatment or improvement of a disease, injury, pathology or condition, including any objective or subjective parameters such as reduction; remission; reducing symptoms or slowing down the deterioration of the patient's condition, pathology or patient's condition; slowing down the rate of degeneration; what makes the final stage of the disease less painful; improving the physical or mental well-being of the patient.
  • Treatment or improvement of symptoms can be based on objective or subjective parameters; including results of physical examination, neuropsychiatric examinations, and / or psychiatric evaluation. For example, certain methods presented here can successfully treat cancer by reducing the incidence of cancer and inducing cancer remission.
  • treatment and its continuation includes the prevention of injury, pathology, condition or disease.
  • Disease or “condition” refers to the state of health of a patient or subject to be treated with various drugs, dispersions, or other methods provided herein.
  • contrast agent refers to a composition that, when administered to a subject, improves the detection limit or detection capability of a physical method, technique or medical imaging device (e.g., X-ray instrument, X-ray, CT, PET, MPT (MRI), ultrasound and other methods).
  • the contrast agent can enhance the magnitude of signals associated with various structures or fluids within a subject.
  • Patient refers to a living organism suffering from or (possibly) prone to a disease or condition that can be treated by administering a drug, pharmaceutical composition, or agent as defined herein.
  • Non-limiting examples include people, others mammals, bulls, rats, mice, dogs, monkeys, goats, sheep, cows, deer and other non-mammalian animals.
  • the patient can be human.
  • controlled release component As used herein, the term "controlled release component" or
  • an “externally activated agent” refers to a compound that, when combined with a composition described herein (including embodiments), releases, under the conditions of use (in a patient), the composition at a controlled rate.
  • Such compounds include high molecular weight, anionic mucomimetic polymers, gelling polysaccharides and fine drug carrier substrates, and others. These components are discussed in more detail in US patents 4911920; 5403841; 5212162; and 4,861,760. The entire contents of these patents are incorporated herein by reference in their entirety for all purposes.
  • the implementation of the "controlled release component” can be a sustained release, sustained release, sustained release, time release, timed release, controlled release, modified release, or sustained release compound.
  • the compound is degraded at the site of administration (eg, subcutaneous, intravenous) or within the digestive tract (eg, stomach, intestines) if the compound and composition are administered orally.
  • the controlled release component is a polymer and may be referred to as a “controlled release polymer”.
  • an agent activated by an external effect can be activated (for example, release a therapeutic agent or bind to a target) as a result of exposure to an external magnetic / electric field, ultrasound, light, an electron beam, as a result of the radioactive decay of any atoms, as a result of interaction with chemical microenvironment, etc.
  • the term "paramagnetic agent” / "paramagnetic agent” refers to a paramagnetic compound useful in diagnostic imaging techniques (eg, magnetic resonance imaging) as a contrast agent.
  • the paramagnetic agent includes gadolinium, iron oxide, iron platinum, or manganese.
  • cytotoxic agents include, but are not limited to, the following substances: ricin, doxorubicin, daunorubicin, taxol, ethidium bromide, mitomycin, etoposide, tenoposide, vincristine, vinblastine, colchicine, dihydroxyanthracycin dione D, actinphinom Pseudomonas (PE) A, PE40, abrin and glucocorticoid and other chemotherapeutic agents as well as radioisotopes.
  • Suitable detectable markers include, but are not limited to, the following substances, a radioisotope, a fluorescent compound, a bioluminescent compound, a chemiluminescent compound, a metal chelator, or an enzyme.
  • a partial list of immunoassays includes: competitive and non-competitive formats, enzyme-linked immunosorbent assays (ELISA), microscopic assays, Western blots, gel filtration and chromatography, immunochromatography, immunohistochemistry, flow cytometry or cell sorting of cells labeled with FACS ), microchips, etc.
  • ELISA enzyme-linked immunosorbent assays
  • microscopic assays Western blots
  • gel filtration and chromatography immunochromatography
  • immunohistochemistry flow cytometry or cell sorting of cells labeled with FACS
  • microchips etc.
  • Such methods can also be used in situ, ex vivo, in vitro or in vivo, for example, for diagnostic imaging.
  • each position of a therapeutic agent may contain more than one candidate therapeutic agent.
  • each member of the Markush group should be considered separately, thus containing a different embodiment, and the Markush group should not be read as a whole.
  • This invention is widely applicable for the rapid detection of nucleic acids and their fragments, as well as for the detection of other analytes that can be a partner for binding to a recognition oligonucleotide.
  • This method is especially applicable for the detection of etiological factors such as bacteria and viruses, for the screening of resistant bacteria and for the detection of malignant cells.
  • This invention is based on a discovered phenomenon that allows the detection of DNA and other analytes, removing the above limitations and completely abandoning the complex design of molecular beacons or painstaking selection of conditions for the operation of fluorescent labels.
  • the proposed method for registering specific interactions is largely devoid of the above disadvantages and in one of its embodiments is applicable for rapid analysis of both relatively long and short (up to 10 base pairs) oligonucleotide sequences.
  • the method is universal, simple, predictable in development and can be applied to solve a wide range of diagnostic tasks in the fields of medicine, environmental protection, food control, biosafety, etc.
  • the proposed method can be used to identify short specific nucleic acid sequences, which is of considerable interest in connection with the study of the physiological functions of microRNA, early diagnosis of malignant tumors, detection of point mutations, etc. Moreover, the role and physiological functions of such compounds are currently undergoing a stage of intensive study, which guarantees a further significant increase in interest in methods of their detection.
  • PCR The gold standard for solving such problems, PCR, has a unique sensitivity due to the specific amplification of the desired NK fragment, followed by its quantitative or qualitative determination using relatively simple analytical instruments. Nevertheless, the method is of little use for express diagnostics and field analyzes, since it requires qualified personnel and special equipment, makes increased demands on the frequency of laboratory premises, and takes at least 2 hours.
  • the length of the "recognition" sequence should not be less than 15 and. O.
  • This limitation is due to a sharp drop in both the specificity (i.e., the increased likelihood that a given sequence will not be unique) and sensitivity (the shorter the length of the overlapping region, the lower the affinity of this interaction) of the assay.
  • the analyzed sequence should be at least 24 and. O. (Cai S, et al. Anal Chem. 2010; 82 (17): 7178-7184), while the detection of noticeably shorter sequences (up to 18 and less) is of undoubted scientific and practical interest, for example, for cancer diagnosis and microRNA analysis.
  • the proposed invention is based on the discovered effect of "masking" of the terminal fragments of NCs on the surface of nanoparticles. Being immobilized on nanoparticles, in the initial state such a molecule (hereinafter referred to as the recognizing oligonucleotide) turns out to be twisted and its terminal fragment labeled, for example, with affinity or indicator labels (hereinafter referred to as the signal receptor), is inaccessible for reactions with the corresponding ligand (hereinafter referred to as the signaling ligand receptor).
  • affinity or indicator labels hereinafter referred to as the signal receptor
  • the signaling ligand receptor affinity or indicator labels
  • biotin it is not available for reaction with streptavidin or biotin-specific antibodies.
  • the activity of the label can be restored under the influence of some external factors, including due to specific interactions with complementary oligonucleotides (hereinafter referred to as the analyte).
  • the analyte complementary oligonucleotides
  • the resulting DNA duplex forms a much more rigid structure (Turberfield AJ, et al. Nature. 2000; 406 (6796): 605-608) and "straightens" the original capture DNA.
  • the end tag of the biomolecule restores its activity and can be used as an indicator of the presence of a specific analyte or serve as a trigger for triggering related biochemical processes.
  • This effect is of interest both for solving fundamental scientific problems (for example, studying the interaction of immobilized biomolecules and their functionalized nanoparticles with each other), and for analytical and biomedical applications (in field or point-of-use diagnostic systems, targeted drug delivery systems, etc. etc.). Since the described system is extremely sensitive with respect to the "straightening" oligonucleotide, it can be used for the detection of NA. This method is simple and versatile, applicable for the analysis of both long and short (up to 10 bp) oligonucleotide sequences in various formats, incl. in the formats of homogeneous and immunochromatographic analyzes.
  • the method made it possible to achieve a record LOD of 2 amol in a sample volume of 20 ⁇ L (100 fM) with an analysis time of 15 min, which is suitable for rapid tests on NC in the PoC format and does not require a complex stage of sample amplification.
  • the NC detection method is based on a fundamentally new agent developed, which is essentially a new generation of smart materials - with controlled affinity for specific targets, with ultra-high (up to 10 18 moles) sensitivity to input molecules (analyte).
  • a specially designed flexible polymer chain with a structure capable of changing its properties under the influence of external factors and regulating the availability of the terminal functional receptor is immobilized on the nanoparticle.
  • an UM agent is created that allows the binding of the terminal signaling receptor to the ligand target as a result of recognition of a specific input oligonucleotide (analyte).
  • the examples for this invention show the work of the developed materials in the ICA format, which allow reaching a record limit for the rapid methods of detection of femtomolar DNA concentrations with an analysis time of only 10-20 minutes, which, together with the fundamental simplicity of the design, demonstrates the promise of the proposed approach for creating theranostic agents. new generation and nanosensors.
  • these SMs undergo a number of transformations and thus carry out pre-programmed actions aimed at their theranostic use, such as binding to cancer cells and initiating drug release.
  • Some of them are already so “smart” that they really remotely resemble living structures in their ability to change functionality depending on a complex set of external factors (IL Sokolov, et al. Biochim. Biophys. Acta - Gen. Subj. 2017; 1861 (6) : 1530-1544).
  • these systems are built in such a way that the agent has two or more states, for example, activated and inert (ON and OFF states, respectively), switching between which occurs due to the transfer of information from the input to the system components through internal structural reorganization.
  • the ability of a receptor to bind to its target can be controlled by its reversible shielding inside an origami 1 DNA container or under a self-assembled layer of nanoparticles (Nikitin MP et al. Nat Nanotechnol. 2014; 9: 716-722; Lovchinsky I, et al Science 2016; 351 (6275): 836-841).
  • typical smart material with switchable affinity for targets consists of: i) an “exit” (targeting) receptor, which is responsible for binding to the target; ii) a structure capable of switching between alternative states, one of which makes the exit receptor available for target binding (ON), and the other inhibits, for example, due to steric shielding of the exit receptor (OFF); iii) a "lock” that keeps the structure in one of the states, but can be “unlocked” by a certain control signal; iv) a unit that is sensitive to an activating (input) signal, capable of selectively recognizing a chemical (real) input signal (hereinafter referred to as an input signal) and generating a control signal to "switch" the "lock”.
  • an activating input
  • the "lock” and the input-sensitive block are the same object.
  • the "lock” can be implemented by linking the "input” receptor (that is, responsible for recognizing the input signal) with a molecular analogue of the input signal itself. Then, upon contact of the input signal with the aforementioned analogue, the latter is displaced from the complex with the input receptor.
  • FIG. 1 shows some examples of such systems, including, for example, "locks” based on antibodies or enzymes, in which a low molecular weight input signal displaces the conjugate of the input analogue with a carrier protein from the complex with the input receptor (antibody or enzyme) (Fig. 1a, b) ...
  • a low molecular weight input signal displaces the conjugate of the input analogue with a carrier protein from the complex with the input receptor (antibody or enzyme)
  • Fig. 1a, b ...
  • the DNA "lock” the action of which is based on the displacement (replacement) of the polynucleotide chain of the analogue of the input signal by the chain of the input signal from its complex with the input DNA receptor (which has the same or a similar DNA sequence as the input signal) ( Fig. 1c).
  • Such displacement is only possible when the concentration of the input signal is high enough to effectively compete with the analogue input circuit.
  • the “lock” marked in green
  • the entry receptor red dotted line
  • This sequence simultaneously controls the stability of the complex in the absence of an input signal, as well as the energy barrier that determines the sensitivity to the input signal in the polynucleotide chain substitution reaction.
  • fine-tuning this sequence inevitably leads to a decrease in the stability or sensitivity of the entire system. This compromise is a fundamental limitation of the sensitivity of such SMs to external chemical signals.
  • the input receptor should be essentially completely free of any specific interactions before it interacts with the input signal.
  • this masking effect is reversible, since the specified functional group becomes again available for interactions if the agent comes into contact with a complementary sequence that hybridizes with the receptor to form a rigid duplex.
  • a nanoagent resembles molecular beacons (which also control the position of the end fragments of the polynucleotide chain due to their secondary hairpin structure), there is a fundamental difference between them.
  • the detected phenomenon does not have an energetically unfavorable stage of destruction of the DNA complex (as seen in Fig. 1d).
  • this use of this effect makes it possible to independently control the strength of the molecular "lock” (that is, the tendency of the output receptor to "hide” its end fragment) and the ability of the input signal to bind to its receptor. Therefore, to achieve the highest possible sensitivity, this approach offers two independent parameters for fine tuning nanoagents.
  • the present invention proposes the concept of constructing a CM, which, by analogy with molecular beacons, is called “nanoparticle beacon".
  • the exit receptor attaches to the nanoparticle through a flexible polymer chain, which determines the ability of the exit receptor to mask and remain inactive either inside or under the globule of the polymer chain on the nanoparticle surface due to any of the known molecular interactions (hydrophobic, electrostatic, between hydrogen bonds and etc.).
  • this flexible polymer must carry an input receptor that, when coupled to the input signal, causes mechanical stress in the polymer.
  • the flexible properties of polymer molecules are used.
  • a molecule that tends to curl up into a ball in solution fix one end of it on the nanoparticle, and modify the other with a targeting receptor, which would have little effect on the folding of the coil and would sterically block it from binding to the target (ligand).
  • the interaction of the polymer molecule with the input is such that as a result of it the "hidden" receptor is exposed to interact with its ligand, then the resulting system will exhibit the required property - input-controlled affinity for a specific target.
  • a DNA oligonucleotide is used as said flexible polymer. It is known that in a single-stranded state such a molecule has high flexibility, characterized by a persistent length of approx. 1 nm (approx. 3 bp), while the DNA duplex has a 50 times more rigid structure (the persistent length is on the order of ⁇ 50 nm or - 150 base pairs) (Wang Y, et al. J Phys Condens Matter. 2009; 21 (33): 335103).
  • the sensitive element (recognizing the oligonucleotide) of the proposed nanoagent-UM is an oligonucleotide, one end of which is covalently attached to the nanoparticle, and the second, modified by a signaling receptor, is hidden in its coil.
  • the large difference in the flexibility of DNA in the off (single-stranded DNA) and on (duplex with an input oligonucleotide) state of the system creates the basis for the functioning of the material.
  • the rate of this multistage process is relatively low (about 10 5 M -1 s -1 ) (Gao Y. Nucleic Acids Res. 2006; 34 (11) 3370-3377) and is determined mainly the speed of its slowest stage - the destruction of old and the formation of new base pairs.
  • the overall process rate can decrease by two or more orders of magnitude (Gao Y. Nucleic Acids Res. 2006; 34 (11) 3370-3377).
  • the practice of raising the temperature to 45-52 ° C to increase the rate of the direct reaction (Stobiecka M, et al.
  • the sensitivity of the molecular beacon method is limited by the high-energy nature of the duplex "lock".
  • the idea we propose allows us to bypass this limitation by implementing “nano-beacons,” in which, to fix the system in the off state, it is sufficient to use nonspecific and much less energetic interactions of the NC with the nanoparticle surface. Due to the lower energy barrier of the "lock”, such a design is able to exhibit a higher sensitivity to the input (input signal), and at the same time, steric shielding of the receptor by the polymer "ball” prevents nonspecific "inclusion” of the material.
  • the method is universal, simple and predictable in development, does not require the stage of painstaking selection of the length and oligomeric composition of secondary structures typical for molecular beacon technology - all randomly selected sequences of recognition oligonucleotides studied by us to one degree or another exhibited a masking effect and, therefore, were suitable for designing an analytical system of the required specificity.
  • an additional source of interaction forces between the recognition oligonucleotide and the nanoparticle may be the known effect of increased affinity of adenosine for the gold surface.
  • a high local content of adenosine - the strength of this interaction is so high that it can significantly affect the hybridization properties of the entire biomolecule, up to their complete blocking (Herne TM, et al. J Am Chem Soc. 1997; 7863 (13) : 8916-8920).
  • one, two or more adenosine groups at the end of the recognition oligonucleotide of the proposed UM can be used, which reliably hold it in a twisted state and fix the OFF state of the system.
  • the method allows the analyte to be detected in a homogeneous format: (format description). It is known that gold nanoparticles (GN) can be easily conjugated to thiolated DNA through the interaction between gold and sulfur. We have chosen biotin as a model of the target-binding exit receptor because of its high affinity for streptavidin and its wide application in various analytical analyzes and drug delivery concepts.
  • a CM with controlled affinity for streptavidin is created, which is controlled by the presence of an analyte (eg, oligonucleotide) in solution.
  • analyte eg, oligonucleotide
  • the proposed Mirkin et al. was used. a simple method of homogeneous analysis based on visual registration of specific aggregation of gold nanoparticles under the action of immobilized biomolecules (C. A. Mirkin, et al. Nature 1996, 382: 607).
  • the CM is a gold nanoparticle (ZN or GNP - from the English gold nanoparticle) with molecules of the recognition oligonucleotide (B1S - see all sequences of oligonucleotides in Fig. 8 and information about their secondary structure in Fig. 9; in addition , the data can be obtained using standard algorithms NUPACK, mFold, UNAFOLD, etc.), attached to it with both their ends and forming a folded structure, which lacked pronounced secondary structures (hairpins) (Fig. 10).
  • NUPACK NUPACK
  • mFold mFold
  • UNAFOLD UNAFOLD
  • Fig. 10 To provide the necessary flexibility of the chain and taking into account its dependence on the packing density of molecules on the surface of nanoparticles (A. B. Steel, et al. Biophys.
  • the terminal biotin In the absence of an analyte, the terminal biotin is sterically hidden from interactions with its ligand (Str-streptavidin), which corresponds to an inactive OFF state.
  • the presence of such shielding is judged by the absence of interaction of the CM (GNP: B1S) with the GNP-streptavidin conjugate (GNP: Str), which is visually manifested in the absence of a change in the color of the solution.
  • the invention allows the detection of the analyte in other formats, not only homogeneous, but also heterogeneous - for example, in the format of immunochromatographic analysis (ICA) or enzyme-linked immunosorbent assay (in microtiter plates), as well as using other solid phases on which the sinal ligand is immobilized.
  • ICA immunochromatographic analysis
  • enzyme-linked immunosorbent assay in microtiter plates
  • ICA analysis was performed as follows. After a short (10 min) pre-incubation of the CM with specific or nonspecific input DNA (analyte), a previously prepared ICA strip with streptavidin applied as a thin line in the center of the membrane was immersed in the mixture. Switching the system to the active state (ON) was assessed by optical recording of the color intensity of the test line caused by the formation of the MN layer (Fig. 12).
  • FIG. 13 compares the sensitivity of three sets of ICA test strips for the detection of fully complementary sequences using CM based on BIS, B2S and B3S.
  • the proposed SM design concept retains its functionality for randomly constructed sequences, although the sensitivity varies.
  • the differences in LOD may be related to changes in the elasticity of the molecular DNA spring.
  • the recognition oligonucleotide B4S even though it contains a low-energy (-1.44 kcal mol-1) structure resembling a molecular beacon hairpin, cannot be regarded as a functional beacon.
  • the fluorescent analogue of this DNA (5'-Cy3, 3'-BHQ2) showed a sensitivity at least 4 orders of magnitude lower than that of a beacon based on nanoparticles with the same sequence (Fig. 14).
  • the nanoparticle beacon had at least 5 orders of magnitude greater linear concentration dynamic range (FIG. 16).
  • ICA ionic strength (0.1-1.5 MNaCl); ii) pH 4-9; iii) protein content (0-5% BSA or 0-50% pooled mouse serum); iv) the presence of high concentrations of nonspecific DNA (10 mg / l lambda phage DNA, cleaved with endonucleases Alu I, HpySE526 I, Fai I with the formation of DNA of various lengths).
  • FIG. 4-7 and FIG. 18 shows the results of ICA for CM based on B4S binding DNA in different media in the absence and presence of specific input DNA.
  • the “lock” remained functional, although the biotin “masking” effect gradually decreased with decreasing salt concentration due to an increase in the electrostatic repulsion of DNA from the particle surface in solutions with low ionic strength.
  • the range of operating conditions can be increased by using more positively charged particles or using binding DNA with a higher content of terminal adenosines.
  • a slight decrease in the signal from the SM in the case of a reaction with a specific input DNA in the presence of lambda phage DNA cleaved with endonucleases is associated with the screening of the surface of nanoparticles by large DNA molecules.
  • the invention makes it possible to implement agents with other signaling receptors.
  • FAM 6-fluoresceinamidite
  • the masking effect significantly decreased: even in the absence of input DNA, the 3H: F4S particles were captured by antibodies against (fluorescein isothiocyanate) and settled on the test line of the ICA test strip (Fig. 19).
  • the affinity of the CM to its target depends to a large extent on the spatial organization and the availability of target epitopes (see above for a comparison of the binding efficiency of the low molecular weight Str-HRP target in comparison with the large-sized FH-Str: HRP nanoconstruction based on ferrohydrite nanoparticles). Therefore, to increase the sensitivity of the ICA test, the invention was implemented using another signaling ligand on the ICA test line of strips. Although streptavidin has an exceptionally high affinity for biotin, it has a peculiar and suboptimal molecular structure.
  • biotin-binding compartments are located within the protein molecule and, therefore, require a linker of a certain length for better binding of biotin.
  • FIG. 20 demonstrates that when using ICA test strips coated with monoclonal anti-biotin antibodies (Mab strips), we managed to achieve a sensitivity of 40 fM (about 0.8 attomoles of input DNA in a 20 ⁇ L sample).
  • CM complementary metal-oxide-semiconductor
  • ICA format based on strips coated with antibiotic antibodies to test the response of the 3HB4S system to the appearance of input DNAs of various lengths, which can be classified into the following five groups: i) completely non-complementary; II) partially complementary (of different structure and degree of complementarity); iii) fully complementary; iv) single nucleotide mismatches (SNP); v) genomic DNA of phage l, cleaved with three different endonucleases.
  • nanoagents were able to differentiate non-complementary, partially complementary and fully complementary DNA at equal concentrations, as shown in Fig. 15.
  • nonspecific (non-complementary) DNA does not generate any significant signal over the entire range of investigated concentrations (up to 100 nM), as shown in FIG. twenty.
  • a theranostic agent is created that implements ligand-dependent cell targeting (ie, induced or controlled by an analyte (input signal)) for targeted drug delivery.
  • the target is HER2 / neu, the second human epidermal growth factor receptor, which is a clinically important marker overexpressed by mammary, ovarian, and other cells.
  • Agents were created to selectively label HEK2 / neu-positive human breast cancer cell line SK-BR-3 (HEK2 / neu-negative CHO cells of Chinese hamster ovary were used as a cell control).
  • B4S F4S was performed in two stages. Cells were first targeted with streptavidin-conjugated antibodies against HER2 / neu (trastuzumab). Then, after washing from unbound conjugate molecules, the cells were incubated with GNP: B4S: F4S in the presence or absence of a specific analyte (input oligonucleotide). The effectiveness of targeting (targeting) was confirmed using imaging flow cytometry.
  • Figure 21 presents data confirming the high efficiency and specificity of cell targeting using a constructed nanoagent using a streptavidin-trastuzumab conjugate.
  • Imaging flow cytometry and scanning electron microscopy have demonstrated reliable and specific activation / deactivation of agents by a specific analyte (input DNA). While the agents practically did not bind to nonspecific CHO cells in the presence or absence of input DNA, interaction with line SK-BR-3 occurred only in the presence of specific input DNA. The agents also retained their selectivity for the input DNA sequence.
  • FIG. 22 shows a good correlation between targeting SK-BR-3 cells and the theoretically predicted affinity of binding DNA for the input oligonucleotides tested (with varying degrees of complementarity, length and structure).
  • test and control binding receptors are applied to the membrane in parallel lines at a distance from each other. Solutions with the required substances in the appropriate buffers are applied to the test strips using automated dispensers. After air drying for the required time, block the membrane in a suitable buffer and store in a desiccator before assembling the test strip.
  • the speed of analysis using the proposed invention is significantly higher than standard methods of analysis while maintaining the accuracy and reliability of the results.
  • the measurement in this case takes from 10 to 300 seconds on average. However, it is possible to increase the sensitivity if a longer analysis time is used.
  • the principle of the present invention allows direct measurement of a detectable nucleic acid as aealite without the need for its amplification, provided that its concentration is above the detection limit and the associated signal can be detected, for example, with the naked eye.
  • Measurements using the method within the scope of this invention can be carried out under both hard and soft conditions.
  • stringent conditions are meant such values of temperature, ionic strength, as well as the presence of other compounds at which hybridization of nucleic acids occurs.
  • high stringency hybridization will occur only for nucleic acids with a high content of complementary nitrogenous bases.
  • mild conditions are required when hybridization or annealing of incompletely complementary nucleic acids is required.
  • a number of methods for creating mild conditions for hybridization are known to those skilled in the art.
  • Hybridization under stringent conditions is possible only in the case of complete complementarity of the sequences.
  • Hybridization under less stringent conditions is possible for sequences with less than 100% identity. Changes in environmental conditions, such as a decrease in salt concentration or an increase in temperature, can reduce the stringency of the hybridization conditions.
  • Stricter hybridization conditions can be achieved by lowering the ionic strength or increasing the hybridization temperature.
  • the present invention enables direct determination of NK without the need for their amplification and provides a method for their rapid detection.
  • the invention is applicable to the detection of NCs under conditions of elevated temperature, which expands the scope of its use in various fields, for example, for forensic medical examination.
  • the described method is a simple method for detecting nucleic acids and does not require serious training in this area, which can facilitate the penetration of rapid genomic analysis methods into the field of diagnosis at the patient's bed and at the point of care.
  • the present invention makes it possible to detect NC in different formats, both homogeneous and heterogeneous and heterophase.
  • examples of homogeneous assay readings are as follows. A method in which a signaling ligand (signal receptor ligand) is immobilized (bound) to a carrier, which is another nanoparticle.
  • association of an analytical agent with a carrier of a signaling ligand can be recorded using methods that determine the change in the size of nanoparticles in a solution (dynamic light scattering, the NTA method - nanoparticle tracking analysis, etc.), optical methods based on the method of surface plasma resonance (for example, if both the analytical agent and the carrier of the signaling ligand contain gold nanoparticles or particles with a gold surface, for example, magnetic gold core-shell structures).
  • heterophase analysis options can be chromatographic methods (for example, in the format of thin-layer chromatography (lateral flow test strips), microchip and microfluidic methods (in which the amount of analytical agents bound to the solid phase that can be detected by optical, magnetic or other methods) are detected. ).
  • detecting the amount of bound nanoparticles of said analytic agent with said signaling ligand as a measure of the analyte content in said sample is meant that the agent (including nanoparticles) receives in the analysis in a statistical sense, i. E. the analysis involves many (suspension, colloidal solution) nanoparticles of the agent (or many agents). Those.
  • the agent including nanoparticles
  • the analysis involves many (suspension, colloidal solution) nanoparticles of the agent (or many agents).
  • the agent including nanoparticles
  • the recognition oligonucleodite is associated with an analytical solid phase.
  • the analytical solid phase serves primarily as a carrier with which various detectable labels - fluorescent, luminescent, magnetic, radioactive, and producing singlet oxygen can bind by interacting with a signaling receptor. (which can cause the luminescence of molecules immobilized on the solid phase), and other known labels that allow their detection by one method or another.
  • This implementation of the invention has great advantages from the point of view of creating multiplex systems - for example, with the simultaneous use of different recognition oligonucleotides with the same signaling receptor.
  • the released (exposed, accessible) signal receptors of the same type are able to bind to the same signal-producing label (system), in incl. any of the above.
  • system signal-producing label
  • in this embodiment of the invention only one tag is needed. This results in a decrease in nonspecificity, an increase in the specificity and selectivity of the assay, and also improves the sensitivity parameters of the system.
  • the present invention allows the detection of a wide range of molecular analytes, including nucleic acids and polynucleotide sequences, including fragments and whole DNA molecules, as well as transport, template, ribosomal, microRNA; synthetic nucleic acid analogs such as peptide NA, morpholine, gated, glycolic and threose NA; and also, due to the use of special recognition oligonucleotides (for example, aptamers), also molecules of non-nucleotide composition, for example, proteins and peptides, hormones, low molecular weight physiological regulators, other haptens, metal ions, etc.
  • nucleic acids and polynucleotide sequences including fragments and whole DNA molecules, as well as transport, template, ribosomal, microRNA
  • synthetic nucleic acid analogs such as peptide NA, morpholine, gated, glycolic and threose NA
  • special recognition oligonucleotides for example
  • test strip can be divided into separate strips, where separate binding zones will be applied to detect different analytes.
  • separate binding zones can be applied to one membrane, but in different areas.
  • various specific receptor / ligand pairs can be used to create signal (reporter) conjugates and receptors that bind them, as well as recognition oligonucleotides with their analyte.
  • the components of such pairs useful in the present invention can be of either the immune or non-immune type.
  • immune binding can be systems based on antigen / antibody or hapten / antihapten interactions.
  • Polyclonal, monoclonal antibodies, or immunoactive fragments thereof can be prepared by standard methods known to those skilled in the art.
  • the terms "immunoactive antibody fragment” or “immunoactive fragment” refer to portions of antibody molecules that contain a specific binding region.
  • Such fragments can be Fab fragments, which are defined as fragments lacking the Fc part, for example Fab, Fab 'and F (ab) 2 fragments, or can be so-called "semi-molecular" fragments obtained by reductive cleavage of disulfide bonds connecting the heavy chains of the parent antibody. If the antigen included in the binding pair is not immunogenic, such as a hapten, it can be covalently linked to an additional carrier protein to render it immunogenic.
  • Non-immune specific pairs include systems in which two components exhibit natural affinity for each other, without being an antibody and an antigen.
  • Known examples of non-immune couples include biotin and avidin, biotin and streptavidin, folic acid and folate binding proteins, complementary nucleic acids, protein A, GH immunoglobulins, etc. They can also include pairs that form covalent bonds with each other: for example, pairs of sulfhydryl groups / maleimides and haloacetyl derivatives) and amino groups / isothiocyanates, succinimide esters and sulfonyl halides, etc. (M. N. Bobrow, et al., J. Immunol. Methods, 1989,125: 279).
  • the function of the signal formation system (signal or reporter system) on the surface of the nanoparticle is to produce a certain product that is capable of producing a detectable signal when interacting with the analyte (analyte), proportional to the amount of analyte in the sample under study.
  • the signal conditioning system includes a reporter conjugate consisting of an antibody or any part of a specific receptor / ligand pair and attached radioactive and enzyme labels, an indicator particle or a fluorophore.
  • the indicator label is covalently linked to a recognition oligonucleotide that is immobilized on the surface of the gold nanoparticle.
  • Enzymes of various classes can be used as enzyme labels suitable for use in a reporter.
  • Alkaline phosphatase, lipase, beta-galactosidase, horseradish peroxidase and porcine liver esterase may also be mentioned as examples of specific compounds.
  • the enzyme can be covalently linked to the antibody according to known techniques (D. G. Williams, J. Immun, Methods, 1984, 79: 261).
  • detecttable nucleic acid refers to any NK that can be found in one of the implementations of the present invention.
  • Target NK can be isolated from any source, including various bacterial or viral pathogens, from biological material of humans and animals in the diagnosis of genetic diseases, etc.
  • the target NC can be DNA, RNA, or their synthetic analogs.
  • the detected NK can be amplified before analysis (see below). In the general case, the detected NC can be isolated from any source that adequately reflects its content in the sample under study.
  • the length of the target NC can vary from 10 to 5000 bases.
  • the preferred length is from 30 to 1000 bases and from 100 to 500 bases when amplified with the ligase chain reaction (LCR) method.
  • LCR ligase chain reaction
  • the determined NK can be double-stranded or single-stranded.
  • the proposed method is applicable to the detection of both amplified and non-amplified NCs.
  • the proposed method is simpler and more convenient than the previously mentioned detection methods based on fluorescence, since they involve the use of dry reagents, practically eliminating the problem of storage and sample preparation, which is characteristic of optical methods for recording a fluorescent signal.
  • Amplification will mean a process that allows you to increase the number of copies, and, consequently, the concentration, of the original nucleotide sequence.
  • Amplification methods useful in the context of this invention include, for example, polymerase chain reaction, ligase chain reaction, NASBA methods (from the English “nucleic acid sequence-based amplification”; US Patent 5,130,238), SDA (from the English “strand displacement amplification” ; Walker, et al, PNAS 1992, 89: 392), LAMP (for loop mediated isothermal amplification; US Patent 6,410,278), CRCA (for cascade rolling circle amplification; US Patents 5,854,033 and 5,942,391), RAM ( from the English "ramification amplification”; US Patents 5,876,924 and 5,942,391), RAPD (from the English “Random Amplified Polymorphic DNA”) as well as methods using QP-replicase (PCT publication WO 87/06270).
  • Polymerase chain reaction and ligase chain reaction are highly sensitive and specific, allowing the amplification of the target nucleic acid in complex mixtures of nucleic acids and proteins. These methods have at least two extremely important characteristics. First, it is the specificity of the replication process, as a result of which information from even one sequence can be specifically replicated into millions of copies despite the presence of a complex mixture of other NK and protein molecules in high concentration. Secondly, these processes are characterized by high sensitivity. For example, with the help of repeated amplification cycles, it is possible to increase the number of copies of the target NK by 10 6 or more times
  • An example of such a positive control would be a lambda DNA sequence.
  • methods of direct detection of target pathogen sequences in a sample can detect approximately 10 3 cells / ml, while the logarithmic amplification of the given sequences reduces this detection threshold to 1-5 cells per 100 ml (Bej et al., App. Environ. Microbiol., 19906 56: 307).
  • composition of the recognition oligonucleotide on the surface of nanoparticles it is possible to include low-molecular-weight receptor compounds that provide specific binding to appropriate molecular or biological targets.
  • receptors with a molecular weight of not more than 2000 Da are preferred, and most preferred are receptors with a molecular weight of not more than 1000 Da.
  • Receptors can be incorporated into one or both strands of a duplex nucleic acid, both from the 5 'and from the 3' end, and it is also possible to bind to non-terminal bases. It is possible to include any number of receptors, however, to ensure maximum sensitivity of the assay, it is preferable to bind to the receptor about 10-30% of nucleotides.
  • receptors into nucleotide sequences can be achieved using either chemical or enzymatic methods, or by direct insertion of labeled nucleotide bases into a selected sequence.
  • receptor-linked sequences can be obtained by incorporating receptor-linked nucleotide bases or primers into the sequence during the polymerase chain reaction. Incorporation of the receptor into the sequence can be achieved either through the inclusion of modified receptor (s) primers or through the use of receptor-labeled dioxyribose-containing triforsphates (dNTP).
  • Receptor (s) labeled primers can be prepared using standard oligonucleotide labeling methods with cyanoethyl phosphoramidite by replacing selected nucleotide bases with receptor labeled phosphoramidite bases during primer synthesis.
  • modified nucleotide bases containing an interacting molecular spacer and receptors can be chemically attached thereto after primer synthesis can be used to prepare the primers.
  • Another method involves the use of dNTP-coupled receptors or amino-modified dNTPs, which can be incorporated into the target nucleotide sequence during amplification.
  • the ICA test strip is the environment in which the assay of the present invention takes place.
  • the test strip usually consists of a chromatographic porous material and includes a sample application area and a binding area as described above.
  • the chromatographic porous materials that make up the strip are generally hydrophilic and / or can in principle be converted to such, and include the following materials, either alone or in combination with other materials - granules of inorganic nature, for example silicon, magnesium sulfate, aluminum; natural polymers, in particular cellulose and materials based on it (for example, fibrous polymers - filter paper, paper for chromatography, etc.); synthetic or modified natural polymers such as nitrocellulose, cellulose acetate, polyvinyl chloride, polyacrylamide, cross-linked dextran, agarose, polyacrylates, etc .; ceramic materials; glass; and similar materials.
  • the preferred material is nitrocellulose.
  • the membrane can be as a separate structure in the form of a sheet cut into test strips, or can be fixed to a support or solid surface, such as in thin layer chromatography.
  • Binding of receptors to the membrane surface can be achieved using well known methods described in the literature. See, for example, Immobilized Enzymes, Inchiro Chibata, Halsted Press, New York (1978) and Cuatrecasas, J. Bio. Chem. 1970, 245: 3059.
  • the required reagents are first applied, and then the test strip is incubated in the required buffer solutions.
  • Buffers and solvents used for the described invention are known (see, for example, Weng et al. (US Patent 4,740,468).
  • the pH of the buffer for immunochromatographic analysis is in the range of 4-11, more often 5-10, for the present invention preferably 6 -9.
  • the pH values are chosen to maintain the desired level of affinity between the interacting pairs of molecules and to be optimal for signal generation by the corresponding system.
  • Various buffers can be used to achieve the desired pH value and maintain it during the analysis. phosphate, carbonate, Tris, diethylbarbituric, etc.
  • the use of a specific buffer solution is not significant for the invention as a whole, however, when conducting specific studies, the use of a specific buffer solution may be preferable.
  • a constant temperature value is usually used.
  • temperature values are used in the range of 4-50 ° C., Usually in the range of 10-40 ° C., And even more often - temperatures close to the ambient temperature, i.e. 15-25 ° C.
  • the recognition oligonucleotide and its binding (hybridization) with the target nucleotide sequence requires conditions conducive to the hybridization of the NA.
  • Hybridization is usually carried out in Ficoll's buffer solution, which may also contain polyvinylpyrrolidine, BSA, yeast tRNA, non-specific DNA, dextran sulfate, dithiothreitol, and formamide.
  • Hybridization can occur both in solution and on a solid phase, with one nucleotide chain being immobilized on the test strip in the binding zone.
  • both single-stranded NCs and double-stranded NCs consisting of two complementary NC fragments, antiparallel to each other, can be used to carry out an analysis to determine NK.
  • NK a single-stranded NC sequence
  • it is necessary to unweave the double-stranded sequence by applying the necessary temperature (melting point of NC, characteristic of a particular nucleotide sequence) or other methods known in the literature.
  • the NC is cooled under controlled conditions to the temperature of subsequent analysis, including migration along the solid phase or another method of contact with it.
  • micro / nanoparticles are coated with a recognition oligonucleotide specific to its analyte, and which is conjugated or in a complex with a signaling receptor capable of binding to its ligand.
  • a recognition oligonucleotide specific to its analyte and which is conjugated or in a complex with a signaling receptor capable of binding to its ligand.
  • Methods for binding the receptor and / or recognition oligonucleotide to colloidal particles are well known in the art.
  • the particles have charged sulfate groups on their surface that can be modified by introducing functional groups such as hydroxyl, carboxyl, amino and carboxylate groups.
  • Functional groups can be used to bind a wide variety of compounds to nano and microparticles and are selected based on their ability to bind the selected ligand or receptor. Conjugation of the ligand to the particles is achieved by covalent binding or, if applicable, by adsorption of the ligand to the surface of the particle. Methods for adsorption or covalent binding of receptors to particles are well known and need not be further described. The preferred method for immobilizing the ligand on the surface of the particles is covalent bonding.
  • the present invention allows the detection of various analytes of nucleotide and non-nucleotide nature in different formats, including but not limited to the following.
  • immobilization of the signal ligand on nanoparticles it is possible to perform homogeneous analysis with instrumental recording of the signal using surface plasmon resonance (SIR), dynamic light scattering (DLS), the effect of Förster energy transfer (FRET), chemiluminescence (CL).
  • SIR surface plasmon resonance
  • DLS dynamic light scattering
  • FRET Förster energy transfer
  • CL chemiluminescence
  • a possible option for detecting the fact of specific binding of the analytical agent itself to the solid phase can be the use of enzyme labels or by the optical signal of the analytical agent itself, for example, by using specially introduced optical (chromogenic, fluorescent, luminescent, plasmonic), magnetic, radionuclide, etc. .d. marks, as well as by direct microscopic examination by dark field or phase contrast methods.
  • One of the advantages of the proposed invention is the ability to fine-tune the sensitivity and specificity of the created analytical agent by adjusting its individual parameters and properties of its constituent components.
  • composition of the recognition oligonucleotide By changing the composition of the recognition oligonucleotide, i. E. the ratio and sequence of its constituent nucleotide residues, it is possible to change the rigidity of the polymer chain of the oligonucleotide and, therefore, its ability to straighten under the influence of external specific (the presence of a complementary analyte) or nonspecific (temperature, ionic strength of the solution) factors.
  • a change in the composition of the recognition oligonucleotide also leads to a change in the nature and strength of the interaction of the polymer chain itself with the surface of the nanoparticle on which it is immobilized, which will contribute to the ability of the "molecular lock" to hold the recognition oligonucleotide in its original twisted position and, ultimately, influence the sensitivity and specificity of the entire analytical agent.
  • Another option for changing the properties of the recognition oligonucleotide is to change its length, which affects the rigidity of the polymer chain and, as noted above, affects its sensitivity and specificity.
  • the length of the recognition oligonucleotide should not be less than its persistent length, i.e. the length at which the polymer molecule acquires the necessary flexibility and is capable of acquiring a twisted state. Since the persistent length of a polymer chain depends in a complex way on the composition and the number of its constituent monomer units, this limitation on the length of the recognition oligonucleotide must be established in each specific case. For example, it is known that for DNA sequences the minimum polymer chain length should not exceed 24 nucleotide residues (Steel, A. V., et al. Biophysical journal 79.2 (2000): 975-981).
  • Another possible way to regulate the sensitivity and specificity of the analytic agent is the choice of the terminal signaling receptor, which, according to the present invention, also participates in the formation of the "molecular lock" and contributes to the retention of the recognition oligoncleotide in the initial twisted position.
  • One of the possible examples is the use of biotin, which, in addition to the known high affinity for its ligand - streptavidin (or avidin and neutravidin), is capable of interacting with the surface of gold nanoparticles (T.M. Herne, M. J. Tarlov, J. Am. Chem. Soc. 1997, 7863, 8916) and thus additionally influence the strength of the "molecular lock” and therefore contribute to the regulation of the sensitivity and specificity of the entire analytic agent.
  • adenosine nucleotide residues directly at the recognition ligand at the end of the polymer chain it is also possible to regulate the sensitivity and specificity of the analytical agent by changing the amount of adenosine nucleotide residues directly at the recognition ligand at the end of the polymer chain.
  • adenosine has an increased affinity for a number of surfaces of nanoparticles, for example, based on gold (T. M. Herne, M. J. Tarlov, J. Am. Chem. Soc. 1997, 7863, 8916).
  • an increase in the number of terminal adenosine residues will lead to "hardening" of the molecular lock, which will make it possible to more accurately adjust the properties of the analytical agent.
  • This method of controlling the properties of an agent is a particular case of the above-described variants, however, it has a more preferable application, since it provides higher efficiency and is easier to predict than a change in the composition of the entire polymer chain of the recognition oligonucleotide.
  • the conditions of the detection reaction in particular, the pH and ionic strength of the reaction medium, its composition, etc., are important factors that determine the specificity and sensitivity of the proposed analytical agent.
  • the action of these factors can affect both the rigidity of the polymer chain of the recognizing oligonucleotide and the strength of the "molecular lock" - that is, the strength of the interaction of the terminal signaling receptor or individual fragments of the recognition oligonucleotide with the surface of the nanoparticle on which they are immobilized.
  • the optimal conditions for the functioning of the analytical agent will differ.
  • the discovered phenomenon of the switchable configuration of DNA molecules on the surface of nanoparticles, which allows masking and presentation of terminal receptors in response to specific external stimuli, is very attractive for the development of supersensitive intelligent nanoagents for various biomedical applications.
  • the achieved detection limit of 40 fM is at the level of typical yields of target DNA from biopsy samples (0.5 attomole or 3 s 10 L 5 copies).
  • the present invention can be used to detect DNA without using an amplification step.
  • the invention makes it possible to take advantage of the speed, availability and simplicity of the immunochromatographic assay format, which, together with glucose sensors, has practically become synonymous with point-of-care diagnostics. Hence, these CMs can be used to develop routine devices for DNA analysis in the field, for food control, etc.
  • the present invention is of particular interest in the field of theranostics, drug delivery, and the like.
  • in vitro DNA detection has many solutions with different pros and cons, targeted drug delivery, an important biomedical area, lags far behind due to the lack of methods that allow such delivery based on comprehensive analysis of disease markers in vivo.
  • a complex disease such as cancer can hardly be correctly diagnosed based on the results of one test alone.
  • conventional drug delivery vehicles will be able to identify pathogenic cells (eg, in tumors) with just a single marker on the cell surface.
  • a single specific ligand e.g., an antibody
  • passive targeting with non-functionalized carriers due to the effect of improved permeability and retention.
  • This invention makes it possible to take a significant step towards solving this increasingly biomedical problem.
  • the proposed agents capable of identifying targets using several factors (in our case, a target-specific ligand and a soluble DNA marker from its microenvironment), achieve hypersensitivity to input signals.
  • Smart materials that can switch between different states under the influence of chemical signals are in great demand in biomedicine, where specific sensitivity to biomarkers is required for accurate diagnosis and therapy.
  • Excellent selectivity of drug delivery to malignant cells can be achieved with nanoagents that remain “inert” (inactive) until they are “activated” by a characteristic combination of signals microenvironment (eg, tumor metabolites, angiogenesis factors, microRNA / DNA, etc.).
  • signals microenvironment eg, tumor metabolites, angiogenesis factors, microRNA / DNA, etc.
  • This invention implements supersensitive smart nanoagents with ON / OFF switchable affinity for biomedical targets under the action of input signals based on a combination of nanoparticles with polymer structures with low values of the internal energy of the secondary structure.
  • a layer is created of a specially designed polymer with flexible chains that have a switchable structure and thus regulate the availability of their terminal receptor for binding to a target.
  • the implementation of the concept using DNA as such a polymer chain made it possible to obtain nanoagents that have the ability to specifically bind to cells (cell targeting) under the influence of analytes (input signals) and are sensitive to extremely low (40 fM) DNA concentration in the express format (15 minutes) immunochromatographic analysis.
  • the invention proves that surface phenomena can provide affinity switchable nanoagents without compromising their sensitivity to input signals.
  • the invention is important for biosensorics, theranostics, targeted drug delivery, in vitro diagnostics, point-of-care diagnostics, creation of express analyzes, diagnostics in the field, nanosensors for diagnostics at the point of care.
  • the present study demonstrates a non-standard way of signaling between the input biochemical stimulus and the targeting (signaling) receptor of the nanoagent through the interaction of the polymer with the surface.
  • the detected phenomenon allows you to independently configure the input and output functions of smart materials for different applications.
  • the invention provides new generation biosensors and agents for ultra-precise drug delivery.
  • Nanoparticles in the agent can be such as gold nanoparticles, magnetic nanoparticles, other crystalline particles, polymer nanoparticles and microparticles, amorphous nanoparticles, metal-organic framework polymers, dendrimers, liposomes, quantum dots, nanodiamonds, nanophosphors, nanorubins.
  • they can carry various molecules, small molecules (rhodamine, fluorescein, etc.), photosensitizers, cytostatics and cytotoxic substances (doxorubicin, paclitaxel, daunorubicin, and others).
  • any means including, for example, therapeutic (for example, anti-cancer), diagnostic (for example, contrast, radionuclides and fluorescent, luminescent and magnetic substances), prophylactic agents (for example, vaccines) and / or nutritional substances (eg vitamins, minerals, etc.) can be delivered by the agents of this invention.
  • Typical payloads that can be delivered in accordance with the present invention include, but are not limited to: small molecules (e.g. cytotoxic agents), nucleic acids (e.g. siRNA, RNAi and mircoRNA, cDNA), proteins (e.g.
  • the agent to be delivered is useful for the treatment of cancer (eg, prostate cancer).
  • cancer eg, prostate cancer
  • the agents obtained allow a drug or diagnostic agent to cross the blood-brain barrier to achieve one or more advantages: substances that do not themselves cross the blood-brain barrier can be transported across the blood-brain barrier by means of nanoparticles, the dose of a drug or diagnostic agent is reduced sufficient to achieve therapeutic or detectable concentrations, thereby leading to a decrease in side effects.
  • Examples of pharmacologically active compounds that can be delivered to cellular targets by these agents include the substantially water insoluble compounds listed in the Therapeutic Categories and Biological Activity Index section of the Merck Index (12th Ed'n, 1996), all relevant included here by link.
  • diagnostic agents proposed for use with the present invention are ultrasound contrast agents, radiocontrast agents (for example, iodine-octanes, halogen carbons, renografin, and the like), magnetic contrast agents (for example, fluorine carbons, lipid-soluble paramagnetic compounds, etc).
  • radiocontrast agents for example, iodine-octanes, halogen carbons, renografin, and the like
  • magnetic contrast agents for example, fluorine carbons, lipid-soluble paramagnetic compounds, etc.
  • the present invention provides a method (method, technology, technique) for determining the content (presence and / or amount) of an analyte in a sample using an analytical agent, including the step of contacting said sample with said analytical agent containing a nanoparticle under conditions that allow the analyte to bind to a single-stranded recognition oligonucleotide bound to said nanoparticle, wherein said nanoparticle is bound to the first end of said recognition oligonucleotide, said recognition oligonucleotide is able to specifically bind to the analyte, the second end of said recognition oligonucleotide is covalently linked to a signaling receptor, not mentioned specifically with said analyte, said signaling receptor is capable of specifically binding to a signaling ligand, further bringing said analytic agent into contact with a signaling ligand, e detecting the amount of bound nanoparticles of said analytical agent with said signaling ligand as a measure of the an an
  • a method for determining the content (presence and / or amount) of an analyte in a sample using an analytical agent comprising the step of contacting said sample with said analytical agent containing a nanoparticle under conditions that allow the analyte to bind to a single-stranded recognition oligonucleotide bound to said nanoparticle, wherein said nanoparticle is linked to a first end of said recognition oligonucleotide, said recognition oligonucleotide is capable of specifically binding to an analyte, the second end of said recognition oligonucleotide is covalently linked to a signaling receptor, said signaling receptor is not capable of specifically binding to said analyte, said signaling receptor is capable of specifically binding to an analyte ligand, further bringing said analytical agent into contact with a signaling ligand, detecting the amount of bound nanoparticles of said analytical agent that with said signaling ligand as a measure of the analyte
  • a method for determining the content (presence and / or amount) of an analyte in a sample using an analytical agent comprising the step of contacting said sample with said analytical agent containing a nanoparticle under conditions that allow the analyte to bind to a single-stranded recognition oligonucleotide bound to said nanoparticle, wherein said nanoparticle is linked to a first end of said recognition oligonucleotide, said recognition oligonucleotide is capable of specifically binding to an analyte, the second end of said recognition oligonucleotide is covalently linked to a signaling receptor, said signaling receptor is not capable of specifically binding to said analyte, said signaling receptor is capable of specifically binding to an analyte ligand, further bringing said analytical agent into contact with a signaling ligand, detecting the amount of bound nanoparticles of said analytical agent that with said signal ligand as a measure of the analyte content
  • a method for determining the content (presence and / or amount) of an analyte in a sample using an analytical agent characterized in that all hairpins on said recognition oligonucleotide in molecular form are located at a distance of at least 3 nucleotide bases from said second end of said recognition oligonucleotide oligonucleotide.
  • a method for determining the content (presence or amount) of an analyte in a sample using an analytical agent comprising the step of contacting said sample with said analytical agent containing a nanoparticle under conditions that allow the analyte to bind to a single-stranded recognition oligonucleotide bound to said nanoparticle, said a nanoparticle is linked to the first end of said recognition oligonucleotide, said recognition oligonucleotide is capable of specifically binding to an analyte, the second end of said recognition oligonucleotide is covalently linked with a signaling receptor, said signaling receptor is not capable of specifically binding to said analyte, said signaling receptor is capable of specifically binding to a signaling ligand, further bringing said analytic agent into contact with a signaling ligand, detecting the amount of bound nanoparticles of said analytic agent with said signaling ligand as a measure of content analyte in said sample
  • a method for determining the presence or amount of an analyte in a sample using an analytical agent comprising the step of contacting said sample with said analytical agent containing a nanoparticle under conditions that allow the analyte to bind to a recognition oligonucleotide bound to the nanoparticle, said nanoparticle being bound to the first end single-stranded recognition oligonucleotide, said recognition oligonucleotide is capable of specifically binding to an analyte, the second end of said single-stranded recognition oligonucleotide is covalently linked to a signaling receptor, said signal receptor is not capable of specifically binding to said analyte, said signal receptor is capable of specifically binding to a signaling ligand the oligonucleotide on the said analytical agent either does not have hairpins, or the hairpins are located at a distance of at least 5 nucleotide bases from of said second end of said recognition oligonucleotide, further
  • a method in which said recognition oligonucleotide on said analytic agent does not have hairpins including more than 6 pairs of complementary nucleotides (preferably 5 pairs of complementary nucleotides; more preferably 4 pairs of complementary nucleotides; more preferably 3 pairs of complementary nucleotides; more preferably 2 pairs complementary nucleotides; 1 pair of complementary nucleotides is preferred).
  • each hairpin in the secondary structure of said recognition oligonucleotide has less than 8 pairs of complementary oligonucleotides.
  • each hairpin in the secondary structure of said recognition oligonucleotide has less than 7 pairs (preferably 6 pairs, more preferably 5 pairs, more preferably 4 pairs, more preferably 3 pairs, more preferably 2 pairs, preferably 1 pairs) complementary oligonucleotides.
  • said analyte is a water-soluble substance.
  • said (cellular) target is a cancer cell (the signaling ligand is located or associated with the cell, or is part of the cell).
  • a method in which said recognition oligonucleotide has a structure with a formation energy less than -7 kcal / mol (preferably less than -6 kcal / mol; less than -5 kcal / mol; less than -4 kcal / mol; less than -3 kcal / mol; less than -2 kcal / mol; less than -1 kcal / mol; less than 0 kcal / mol; less than +1 kcal / mol).
  • Less energetic means more in a mathematical sense.
  • a method in which said nanoparticle is linked to the first end of said recognition oligonucleotide due to the thiol group of said recognition oligonucleotide, and the binding of said particle to said single-stranded recognition oligonucleotide occurs (produced, carried out) from a solution that does not contain substances having SH groups , except for the mentioned single-stranded recognition oligonucleotide.
  • a method in which said nanoparticle has a gold surface and the last nucleotides at the said second end of said single-stranded recognition oligonucleotide are at least 3 adenosines (at least 4 adenosines; at least 5 adenosines; at least 6 adenosines), which, due to their affinity the said signal receptor is brought closer to the surface of the said nanoparticle in the absence of the analyte, which reduces the binding of the signal receptor to the signal ligand, and the binding of the analyte to the said single-stranded recognition oligonucleotide causes spatial straightening of the said single-stranded recognition oligonucleotide and the distance of the said signal receptor from the surface of the said nanoparticle, binding of a signaling receptor to a signaling ligand.
  • a method in which said signal receptor is linked at said second end of said recognition oligonucleotide to adenosine which, due to its affinity for gold, brings said signal receptor closer to the surface of said nanoparticle in the absence of an analyte, wherein binding of the analyte to said single-stranded recognition oligonucleotide causes spatial straightening of said single-stranded recognition oligonucleotide and distance of said signaling receptor from the surface of said nanoparticle, which increases the binding of the signaling receptor to the signaling ligand.
  • a method in which said signal receptor is linked at said second end of said recognition oligonucleotide to polyadenosine which, due to its affinity for gold, brings said signal receptor closer to the surface of said nanoparticle in the absence of an analyte, wherein binding of the analyte to said single-stranded recognition oligonucleotide causes spatial straightening of said single-stranded recognition oligonucleotide and distance of said signaling receptor from the surface of said nanoparticle, which increases the binding of the signaling receptor to the signaling ligand.
  • polyadenosine contains at least 2 adenosines.
  • a method in which said polyadenosine contains at least 3 adenosines; at least 4 adenosines; at least 5 adenosines; at least 6 adenosines.
  • the method in which the said nanoparticle has the structure of a magnetic material core with a gold shell.
  • a method in which the detection of the number of bound nanoparticles having a core structure made of a magnetic material with a shell of gold is carried out by nonlinear magnetization reversal at two frequencies of an alternating magnetic field with registration of a response at frequencies that are a linear combination of these frequencies.
  • a method for determining the presence or amount of an analyte in a sample using an analytical solid phase comprising the step of contacting said sample with said analytical solid phase under conditions that allow the analyte to bind to a recognition oligonucleotide bound to said analytical solid phase, said analytical solid phase is linked to the first end of a single-stranded recognition oligonucleotide, said recognition oligonucleotide is capable of specifically binding to an analyte, the second end of said single-stranded recognition oligonucleotide is covalently linked to a signaling receptor, said signal receptor is not capable of specifically binding to said analyte, said signal receptor is capable of specifically binding to a signal , wherein said recognition oligonucleotide on said analytical solid phase either does not have hairpins, or the hairpins are located at a distance of at least e, than 5 nucleotide bases from said second end of said recognition oligonucleotide,
  • an analytical agent designed to determine the presence or amount of an analyte in a sample and comprising a nanoparticle bound to the first end of a single-stranded recognition oligonucleotide, said recognition oligonucleotide is capable of specifically binding to an analyte, the second end of said single-stranded recognition oligonucleotide is covalently linked to a signal receptor, moreover, said signal receptor is not capable of specifically binding to said analyte, said signal receptor is capable of specifically binding to a signal ligand, and the fact of binding of said signal receptor and said signal ligand makes it possible to estimate the amount of nanoparticles of said analytical agent bound to the carrier of said signal ligand, which is used to determine the presence or amount of an analyte in a sample, characterized in that said recognition oligonucleotide on said analytical agent or does not have hairpins, or the hairpins are located at a distance of at least 5 nucleotide bases from
  • an analytical agent designed to determine the presence or amount of an analyte in a sample and comprising a nanoparticle bound to the first end of a single-stranded recognition oligonucleotide, said recognition oligonucleotide is capable of specifically binding to an analyte, the second end of said single-stranded recognition oligonucleotide is covalently linked to a signal receptor, moreover, said signal receptor is not capable of specifically binding to said analyte, said signal receptor is capable of specifically binding to a signal ligand, characterized in that said recognition oligonucleotide on said analytical agent either does not have hairpins, or the hairpins are located at a distance of at least 5 nucleotide bases from said first and / or second end of said recognition oligonucleotide.
  • an analytical agent designed to determine the presence or amount of an analyte in a sample and comprising a nanoparticle bound to the first end of a single-stranded recognition oligonucleotide, said recognition oligonucleotide is capable of specifically binding to an analyte, the second end of said single-stranded recognition oligonucleotide is covalently linked to a signal receptor, moreover, said signal receptor is not capable of specifically binding to said analyte, said signal receptor is capable of specifically binding to a signal ligand, and the fact of binding of said signal receptor and said signal ligand makes it possible to estimate the amount of nanoparticles of said analytical agent bound to the carrier of said signal ligand, which is used to determine the presence or amount of an analyte in a sample, characterized in that said recognition oligonucleotide on said analytical agent, or does not have hairpins, or the hairpins are located at a distance of at least 5 nucleotide bases
  • a method for determining the presence or amount of an analyte in a sample using said analytical agent comprising the following steps: i) contacting the sample with said analytical agent under conditions that allow the analyte to bind to said recognition oligonucleotide of said nanoparticle of said analytical agent, ii) further contacting said analytical agent with a signaling ligand, under conditions that allow said signaling receptor of said analytical agent to bind to said signaling ligand, iii) detecting the amount of bound nanoparticles of said analytical agent to said signaling ligand as a measure of the analyte content in said sample.
  • a smart (analytical) nanoagent comprising a gold nanoparticle functionalized with a recognition oligonucleotide that is capable of specifically binding to an analyte and which is covalently linked to a signaling receptor, wherein the signaling receptor is not capable of specifically binding to said analyte, such that: binding of the analyte to the said recognition receptor increases the ability of the nanoagent to bind to the ligand of the signaling receptor, characterized in that: the recognition oligonucleotide either does not have hairpins, or the hairpins are located at a distance of no less than 2, more preferably 3, more preferably 4, more preferably 5, more preferably 6, more preferably 7, more preferably 8, more preferably 9, more preferably 10, more preferably 12, more preferably 15, more preferably 20, more preferably 25, more preferably 30 free nucleotide bases from the nucleotide base of the recognition oligonucleotide to which the signaling receptor is linked.
  • a method for detecting the content (presence or amount) of an analyte in a sample using said smart nanoagent comprising the following steps: i) bringing the sample into contact with a smart nanoagent, and) further bringing said smart nanoagent into contact with the ligand of the signaling receptor, w) detecting the amount of bound nanoparticles of a smart nanoagent with said signal receptor ligand as a measure of the analyte content in said sample.
  • a method for detecting the presence or amount of an analyte in a sample comprising the following steps: i) contacting the sample with a smart nanoagent comprising a gold nanoparticle functionalized with a recognition oligonucleotide that is capable of specifically binding to the analyte and which is covalently linked to a signaling receptor, moreover, the signaling receptor is not able to specifically bind to the analyte, i) further bringing the said smart nanoagent into contact with the ligand of the signaling receptor, iii) detecting the amount of bound nanoparticles of the smart nanoagent with the said ligand of the signaling receptor as a measure of the analyte content in the said sample, characterized in that recognizing the oligonucleotide either has no hairpins, or the hairpins are spaced at least 2, more preferably 3, more preferably 4, more preferably 5, more preferably 6, more preferably 7, more preferably 8, more preferably 9, more preferably
  • a method for determining the presence or amount of an analyte in a sample using an analytical agent comprising the step of contacting said sample with said analytically agent containing a nanoparticle, under conditions that allow the analyte to bind to a recognition oligonucleotide bound to the nanoparticle, said nanoparticle being bound to the first end of a single-stranded recognition oligonucleotide, said recognition oligonucleotide is capable of specifically binding to the analyte, the second end of said single-stranded recognition oligonucleotide signal receptor, and said signal receptor is not able to specifically bind to said analyte, said signal receptor is capable of specifically binding to a signal ligand, wherein said recognition oligonucleotide of said analytical agent does not form a molecular beacon structure, further bringing said analytical agent into contact with signaling ligand, detecting the amount of bound nanoparticles of said analytical agent with said signaling ligand
  • a method for determining the presence or amount of an analyte in a sample using an analytical agent comprising the step of contacting said sample with said analytical agent containing a nanoparticle under conditions that allow the analyte to bind to a recognition oligonucleotide bound to the nanoparticle, said nanoparticle being bound to the first end single-stranded recognition oligonucleotide, said recognition oligonucleotide is capable of specifically binding to an analyte, the second end of said single-stranded recognition oligonucleotide is covalently linked to a signaling receptor, said signal receptor is not capable of specifically binding to said analyte, said signal receptor is capable of specifically binding to a signaling ligand the oligonucleotide of the said analytical agent does not have a hairpin locating the signal receptor close to the attachment point of the recognition oligonucle approaching said nanoparticle (or approaching a recognizing signaling receptor to the surface of the particle), further
  • a method, an analytical agent and an analytical solid phase in which the specified hairpin and the nucleotide base to which the signaling receptor is bound are at a distance of at least 2, more preferably 3, more preferably 4, more preferably 5, more preferably 6, more preferably 7, more preferably 8 , more preferably 9, more preferably 10, more preferably 12, more preferably 15, more preferably 20, more preferably 25, more preferably 30 free nucleotide bases.
  • a method and analytical agent wherein said recognition oligonucleotide is at least 7, more preferably 8, more preferably 9, more preferably 10, more preferably 12, more preferably 15, more preferably 20, more preferably 25, more preferably 27, more preferably 30, more preferably 35, more preferably 40 nucleotides.
  • said analyte is DNA or RNA and is less than 30, more preferably 25, more preferably 20, more preferably 17, more preferably 15, more preferably 13, more preferably 12, more preferably 11, more preferably 10 nucleotides in length.
  • a method and an analytical agent in which said hairpins are spaced at least 6, more preferably 7, more preferably 8, more preferably 9, more preferably 10, more preferably 12, more preferably 15, more preferably 20, more preferably 25, more preferably 30 free nucleotide bases from the nucleotide base of the recognition oligonucleotide to which the signaling receptor is bound.
  • nanoparticle is made as one or more magnetic particles are conjugated to one gold nanoparticle.
  • a method and an analytical agent in which the said nanoparticle is made as several gold nanoparticles conjugated to one magnetic particle.
  • a method in which the specified hairpin and the nucleotide base to which the signaling receptor is bound are at a distance of at least 10 free nucleotide bases. In addition, a method in which the specified hairpin and the nucleotide base to which the signaling receptor is associated are at a distance of at least 12 free nucleotide bases.
  • the specified hairpin and the nucleotide base to which the signaling receptor is associated are at a distance of at least 15 free nucleotide bases.
  • the said analyte is micro DNA or micro RNA.
  • analyte is DNA or RNA and is less than 25 nucleotides in length.
  • analyte is DNA or RNA and is less than 20 nucleotides in length.
  • analyte is DNA or RNA and is less than 17 nucleotides in length.
  • analyte is DNA or RNA and is less than 15 nucleotides in length.
  • analyte is DNA or RNA and is less than 12 nucleotides in length.
  • a method in which said signaling ligand is immobilized on a separate signaling nanoparticle in addition, the method in which the signal nanoparticle is a gold nanoparticle, and the detection of the binding of the signal ligand on the signal nanoparticle and the nanoparticle to the immobilized signal receptor is carried out using the plasma resonance method (i.e., a shift in the absorption peak spectrum is detected due to the phenomenon of localized surface plasmon resonance).
  • the method in which said signal nanoparticle is a gold nanoparticle, and the detection of binding of a signal ligand on a signal nanoparticle and a signal receptor of said nanoparticle of said analytical agent is carried out optically by detecting a shift in the plasmon resonance spectrum.
  • the mentioned compound serves to reduce the surface concentration of the recognition oligonucleotide and, at the same time, to colloidal stabilization of the nanoparticle.
  • the said signaling receptor is a low-molecular-weight receptor.
  • a method in which all hairpins on said recognition oligonucleotide are located at a distance of no less than 5 preferably no less than 6; no less than 7; no less than 8; no less than 9; no less than 10; no less than 11; not less than 12; not less than 13; not less than 14; not less than 15; not less than 16; not less than 17; not less than 18; not less than 19; not less than 20
  • nucleotides from a nucleotide of said recognition oligonucleotide to which said signal receptor is associated.
  • kits, compositions, chromatographic tests including the mentioned agents.
  • Example 1 Creation of agents based on gold nanoparticles.
  • Gold nanoparticles (GN) 30 ⁇ 3 nm, 40 ⁇ 3.5 nm, 50 ⁇ 5 nm in size, synthesized by the Turkevich method by citrate reduction of a solution of chloroauric acid, are conjugated with a recognition oligonucleotide by gradually increasing the ionic strength of the buffer (salting out) as described in the literature.
  • the interaction of the thiol group at the 3 'end of the oligonucleotide with the GNP surface was used.
  • the thiolated oligonucleotides shown in FIG. 8 are used as recognition oligonucleotides.
  • Biotin or fluorescein is used as signaling receptors (as indicated in Fig. 8), which bind (conjugate) to the end of the oligonucleotide directly during synthesis.
  • Example 2 Creation of agents based on magnetic particles with a gold surface.
  • Nanoparticles of the core-shell type with a magnetic core (magnetite) and a gold surface with a diameter of 40 nm (according to transmission electron microscopy) are conjugated with thiolated recognition oligonucleotides (sequences are shown in Fig. 8) as described in Example 1.
  • Example 3 Conducting analysis (oligonucleotide detection) in a homogeneous format using analytical agents based on gold nanoparticles (GNP).
  • GNP gold nanoparticles
  • GNP agent B1S (here and everywhere - designation of the particle type: designation of the recognition oligonucleotide) is mixed with a sample (containing or not containing an analyte), incubated for 0-10 min and then mixed with a nanoparticle conjugated with a signaling ligand - streptavidin (due to electrostatic sorption protein as described in the literature). Observe the color of the mixture (or transparency) visually or with a spectrophotometer. If the analyte is present in the mixture, which is completely complementary (to the recognizing oligonucleotide) lsp oligonucleotide, the color of the mixture changes after the first hour (Fig. 11). After incubation for 10 hours or overnight, almost complete precipitation and discoloration of the solution was observed due to aggregation of GNP (Fig. 11). In the control experiments (Fig. 11), the color of the system did not change during the entire time of the experiment.
  • Example 4 Verification of particle size increase using the Nanoparticle Tracking Analysis (NTA) method.
  • NTA Nanoparticle Tracking Analysis
  • NTA Nanoparticle Tracking Analysis
  • Example 5 Conducting analysis in immunochromatographic format using GNP and test strips.
  • test strips sheets of cellulose filter (HF075MC100) and absorbent membrane (CFSP203000), Merck Millipore (France) were glued. Then, solutions of antibiotic antibodies or streptavidin (signaling ligand) in phosphate-buffered saline were applied to a cellulose filter using a BioDot XYZ3060 system at a density of 4 ⁇ l cm-1 and dried for 16 hours. Then, 2mm wide dough strips were cut with a BioDot CM4000 cutter to form a strip with the dough zone in the center.
  • conjugates of GNPs with detecting DNA were diluted in a buffer (1% BSA in 10 mM phosphate buffer, 1 M NaCl) to the required concentration. Then, 2 ⁇ l of the solution was added to a solution of a specific or nonspecific oligonucleotide of a certain concentration in a final volume of buffer (20 ⁇ l, 0.1% BSA, 1 M NaCl, 0.5% skim milk powder).
  • a test strip was immersed in the mixture. After 15 minutes of the total time of the immunological test, the specific interaction of the analyte with the GNP: B1S conjugate was visually detected by the appearance of a brightly colored band on the test strip. The presence of a specific interaction was assessed visually by the color intensity of the test strip due to the deposition of GNP on it (Fig. 12) or by computer processing of the digitized (Epson V750 Pro scanner with a resolution of 1200 dpi) test strip image (to calculate the strip intensity, scanned images in TIFF format were processed using ImageJ software).
  • the detection limits of complementary analytes for recognizing oligonucleotides B2S, B3S, B4S were 5 pM, 30 fM, and 40 fM, respectively, which, in combination with a short detection time (10 minutes), is one of the best indicators achieved with the current state of the art for express analyzes.
  • Example 6 The effect of adenosine recognition oligonucleotide near the signaling receptor on masking efficiency.
  • agents based on GNP were created with the B4S oligonucleotide, but with a different number (0, 1, 2, 3) of terminal adenosine bases at the 5'-end (Fig. 8-10), to which in this case, a signaling receptor, biotin, was attached.
  • a previously prepared test strip coated with streptavidin in the form of a thin strip in the center of the immunochromatographic membrane was immersed in the suspension with the agent. After 15 minutes of total ICA time, a result was detected as described in Example 5. The results are shown in FIG. 25. It can be seen that the masking effect of biotin almost completely disappears in the absence of terminal adenosine, but restores it with one or more terminal groups.
  • Example 7 Influence of temperature and biochemical parameters of the environment on the analysis result.
  • ICA analysis English - lateral flow assay
  • buffers ionic strength (0.1M-1.5M NaCl); different pH - citrate buffer pH 4, MES pH 5, HEPES pH 6, borate buffer pH 9.5; in addition pH 5-7 - 10 tM phosphate buffer; pH 4 - 0.1 M phosphate-citrate; pH 8-9 - 10 bM borate buffers; protein content: BSA (0-5%), blood serum (0-50%); content of genomic DNA (lambda phage).
  • Example 8 Detection of small oligonucleotides.
  • FIG. 26 shows the results of the detection of various analyte concentrations - up to a length of 5 nuclotides.
  • Example 9 Leveling the masking effect of the signaling receptor upon incubation of an analytical agent with disulfide bond reducing agents, for example, with mercaptoenol and 11-mercaptoindecanol.
  • Example 11 Synthesis of additional signaling paramagnetic particles FeH.
  • Paramagnetic ferrihydrite nanoparticles (FeH) coated with carboxymethyldic acid (CMD) were synthesized by precipitation of FeCb 6H 2 O with NH 4 OH (30%), peptization with HNO 3 , washing and subsequent heating in a CMD solution.
  • Example 12 Creation of an agent based on a polymer magnetic microsphere.
  • Example 13 Analysis with an analytical agent based on a magnetic microsphere.
  • Example 12 The agent created in Example 12 was mixed with the sample (containing or not containing the analyte) and with the additional signal particles created in Example 11 with the signal ligand (streptavidin) immobilized thereon.
  • the PMM: B4N conjugate (5 ⁇ l, 10 ⁇ g) was incubated for 15 min at room temperature with a specific or nonspecific oligonucleotide (2 ⁇ l, 10 ⁇ M) in the final buffer solution (20 ⁇ l, 0 , 5 MNaCl, 2% Tween-20).
  • the conjugate was besieged on magnet, washed in phosphate buffered saline () and resuspended in 40 ⁇ l, 1% BSA in phosphate buffered saline (PBS) with FeH-Str: HRP or Str-HRP conjugates and incubated for another 15 minutes under the same conditions.
  • the solution was also besieged on magnet and washed in PBS, then the TMB substrate (60 ⁇ l) was added to the sediment and incubated for 5 minutes. Then, the solution was besieged on magnet, the supernatant (50 ⁇ l) was transferred to a 96-well enzyme linked immunosorbent assay plate, and H2SO4 (50 ⁇ l, 2M) was added to stop the reaction. Light absorption was measured at 450 nm using a CLARIOstar® microplate photometer (BMGLabtech, Germany).
  • FIG. 17 shows the increase in detectable signal in the presence of an analyte specific for the recognition oligonucleotide.
  • the effect had a specific character, since the signal in the presence of a nonspecific oligonucleotide and after preliminary binding of biotin active sites with free streptavidin was also low and statistically indistinguishable from the control.
  • HRP nanoparticles average diameter of about 200 nm
  • HRP and streptavidin HRP: Str
  • Example 14 Sensitivity of a molecular beacon analogue - recognition oligonucleotide B4S.
  • an analogue of the B4S molecular beacon (5'-Cy3, 3'-BHQ2, 2 x 10-8M) was incubated in a buffer (100 ⁇ l, 1 M NaCl, 0.5% skimmed milk powder) with specific or nonspecific oligonucleotides at different concentrations ... After a 10 minute incubation at room temperature, the fluorescence signal was quantified using a CLARIOstar® microplate photometer at 530/580 nm for excitation and emission, respectively.
  • the result of the analysis with the molecular beacon (significantly weaker sensitivity and dynamic range) compared to the GNP-B4S agent is shown in FIG. fourteen.
  • a hybrid monoclonal antibody of human and mouse against the cell surface receptor HER2 / neu - (HER-Str) - Trastuzumab (Herticad, Biocad, Russia) was conjugated with streptavidin by the thiolation of Traut's reagent (2-iminothiolane) using a heterobifunctional linker 3 maleimidobenzoic acid (MBS) according to the instructions of the linker manufacturer (Thermo Fisher Scientific, USA).
  • Example 16 Targeting specific cells depending on the content of the analyte (oligonucleotide) in the medium.
  • SK-BR-3 HER2 / pei - positive control
  • CHO negative control
  • Gold nanoparticles conjugated to DNA strands that are 3'-thiolated and 5'-EAM-modified (F4S - as a fluorescent marker) and 5'-biotinylated (B4S) at a final concentration of 0.6 nM (GNP: B4S: F4S) was mixed with a solution of 1% BSA and 1M NaCl, containing or not containing a specific oligonucleotide (lsp) at a concentration of 0.01 - 1 ⁇ M. After 15 min incubation, the prepared solution (5 ⁇ l) was added to the cell suspension and incubated for 15 min, then the samples were washed in 1% BSA in PBS.
  • Cytometric analysis of cell targeting was performed on an Amnis ImageStream X Mark II flow imaging cytometer (Luminex Corporation, USA) using a 40x objective, a 488 nm laser (200 mW) to excite fluorescence, and a 785 nm laser to measure side scatter (0, 5 mW). Focused images of single cells were filtered during data collection with Amnis INSPIRE software: i) with RMS Brightfield Gradient (35-100); ii) brightfield area (240-900) versus aspect ratio (0.75-1.0) ( Figure S12). For each sample, 3000 filtered images were collected.
  • Example 17 Selectivity of theranostic agents to the analyte when targeting specific cells.
  • Example 18 Hyperthermia of cells.
  • Agents based on gold particles as well as gold nanorods conjugated to recognition oligonucleotides were incubated with SK-BR-3 or CHO cells in the presence or absence of the analyte oligonucleotide (as described in Examples 16-17). Then, the imposed agents were washed off and the cells were irradiated with light at a wavelength of 530 nm or 810 nm, 1-2 W / cm L 2. Then, after 12-24 hours, the cells were studied using flow cytometry with propidium iodide / FITC-annexin V staining.
  • the test showed that the percentage of dead cells and cells in apoptosis (total) SK-BR-3 in the presence of a specific analyte in the sample was 1.5-3.2 times higher than without the analyte or in the presence of analytes non-complementary to the oligonucleotide recognition; and not less than 4 times higher than for CHO cells.
  • Fig. 1 Schematic comparison of the functioning of the agent of the present invention (D) and the known concepts of creating agents with ligand-dependent affinity for the target.
  • 1-2 output receptor in inactive (OFF) and activated (ON) states, respectively; 3) target for targeting; 4) analyte; 5-6) input and output domains of the allosteric enzyme, respectively; 7) binding sites of the entry receptor; 8) components of a molecular lock.
  • Fig. 2 Nanoagent state switching circuit. Designations: 1) single-stranded recognition oligonucleotide; 2) duplex of binding DNA with a complementary analyte; 3) terminal signaling receptor (biotin); 4) gold nanoparticle.
  • Fig. Z The effect of mercaptoethanol (MCE) on the functioning of the CM in the ICA format (antibiotic antibodies are immobilized on the test line of the test strip; no analyte added) for GNP conjugated to three different recognition oligonucleotides (BIS; B2S; B3S).
  • MCE mercaptoethanol
  • FIG. 4 Influence of ionic strength (NaCl concentration) of the medium on the functioning of the GNP: B4S agent in the ICA format (anti-biotin antibodies on the test line).
  • B4S agent in the ICA format anti-biotin antibodies on the test line.
  • Asterisks indicate statistical significance (* P ⁇ 0.05, ** P ⁇ 0.01). Hatching horizontally - no added analyte, oblique shading - concentration of a specific analyte tsDNA 4-lsp - YunM.
  • FIG. 5 Influence of the pH of the medium on the functioning of the GNP: B4S agent in the ICA format (antibiotin antibodies for the test line). Ionic strength - 1 5M NaCl. pH 5-7 - 10 mM phosphate buffer; pH 4 - 0.1 M phosphate-citrate; pH 8-9 - 10 mM borate buffers. Hatching horizontally - no added analyte, oblique shading - concentration of a specific analyte tsDNA 4-lsp - YunM.
  • FIG. 6 Influence of a high concentration of protein (bovine serum albumin - BSA) in the medium on the functioning of the GNP: B4S agent in the ICA format (anti-biotin antibodies for the test line).
  • FIG. 7 Influence of high concentration of blood serum protein in the medium on the functioning of the agent GNP: B4S in IHA format (anti-biotin antibodies for the test line). Buffer HumM phosphate buffer, 1.5 M NaCl. Hatching horizontally - no added analyte, oblique shading - concentration of a specific analyte tsDNA 4-lsp - YunM.
  • FIG. 8 Sequences of oligonucleotides.
  • FIG. 9 Gibbs free energy of the secondary structure of recognition oligonucleotides (calculated using NUPACK at 1 M NaCl, 25 OC). Information on the most high-energy structure (with the most negative dG) is given.
  • Fig. 10 Secondary structures of recognition oligonucleotides (calculation in NUPACK and UNAFold for lMNaCl, 25 OC).
  • Fig. 11 Demonstration of the masking effect of biotin at the end of DNA immobilized on the surface of gold nanoparticles.
  • Efficiency of agents in homogeneous analysis based on specific aggregation of MN photographs of tubes after (top) 1-hour and (bottom) 10-hour incubation. Noteworthy is the change in color (from red to discolored light blue) in case of interaction with a specific input signal (highlighted by a rectangle).
  • FIG. 12 Photo of test strips coated with streptavidin on the test line.
  • the results of the migration of GNP agents: B1S for the detection of a specific analyte in the medium are shown (the concentration of the analyte on the doublets of strips from left to right: YONM, YunM, 1nM, YOpM, YupM, 1nM, YOfM, without analyte).
  • Fig. 13 The response (signal) in chromatographic analysis for a specific analyte (solid line) and non-specific analyte (dashed line), for agents with a recognition oligonucleotide: B1S (circle), B2S (square), or B3S (triangle).
  • FIG. 14 Comparison of the effectiveness of the GNP agent: B4S and a molecular beacon based on the same recognition oligonucleotide, but conjugated at the ends with Cy3 and BHQ2 instead of biotin and thiol.
  • Optical signal GNP: B4S in ICA format (solid line - black circle) corresponds to the number of agents (gold nanoparticles) bound to the test line of the test strip.
  • the molecular beacon fluorescence signal (dashed line - black triangle) corresponds to the amount of analyte-induced beacon deployment to prevent analyte-unquenched fluorescence.
  • FIG. 15 Specificity of the agent with the recognition oligonucleotide B4S to various analytes (oligonucleotides).
  • the calculated proportion in the complex was obtained using NUPACK at 25 Maurice ⁇ , lMNa +, and a concentration of the components of 1 nM.
  • Fig. 16 The efficiency of a molecular beacon based on the same recognition oligonucleotide B4S, but conjugated at the ends with Cy3 and BHQ2 instead of biotin and thiol.
  • the fluorescence signal of the molecular beacon corresponds to the amount of analyte-induced beacon deployment to prevent analyte-unquenched fluorescence.
  • Fig. 17 The functionality of an agent based on magnetic microspheres (PMM) with a polystyrene coating.
  • PMM magnetic microspheres
  • An asterisk indicates statistical significance (* P ⁇ 0.05, two-tailed unpaired Student t-test) within each group between signal and control (PMM: B4N without analyte).
  • Fig. 18 Effect of the functioning of the GNP agent: B4S in 10 mM phosphate buffer, pH 7.4, 1 M NaCl (shading from bottom to top to the right) and in the same buffer, but in the presence of lambda phage DNA (10 mg / L, 31.5 MDa), cleaved with endonucleases: Alu I (hatch from bottom to top left), HpySE5261 (hatch horizontal), and Fai I (hatch vertical).
  • ICA format anti-biotin antibodies on the test line, with the addition of 1 nM specific analyte 4-lsp (rare shading) and without the addition of the analyte (frequent shading).
  • FIG. 19 Response (signal) in chromatographic analysis for agents with a recognition oligonucleotide F4S (anti-FITC antibodies on the test line) or B4S (streptavidin on the test line): no analyte (bar from bottom left to top right); with a nonspecific analyte - 1 nM oligonucleotide Ins (bar from bottom right to top left), with a specific analyte - 1 nM oligonucleotide 4-lsp (horizontal bar). Buffers: phosphate pH 7.4; phosphate citrate pH 4.0.
  • Fig. 20 Improved detection limit of the analyte by the GNP: B4S agent for the ICA test when using anti-biotin antibodies on the test line (instead of streptavidin).
  • Specific analyte - 4-lsp solid line - black circles); nonspecific - tsDNA # 3 and tsDNA # 4 (broken lines, empty diamond and square, see sequences in Fig. 15).
  • Fig. 21 Application of the developed CM for cell targeting controlled by an external signal (analyte).
  • B4S F4S agents with HEK2 / neu-positive (SK-BR-3) and HEK2 / neu-negative (CHO) cell lines using streptavidin-trastuzumab conjugate (anti-HER2 / neu antibodies) in response to the presence of specific analyte (input) tsDNA # 1 (see data on selectivity of agents for different input DNA in Fig. 22).
  • Fig. 22 Specificity of the GNP: B4S: F4S agent for analytes when targeting cancer cells. Histograms of FAM channel intensity show the binding of agents to HER2 / neu-positive SK-BR-3 cells via streptavidin-trastuzumab conjugate (anti-HER2 / neu antibody) in response to different oligonucleotides with different lengths and complementarity to the recognition oligonucleotide (see sequences at Fig. 15).
  • FIG. 23 Verification of the specificity of agents to the analyte. Binding of the agent GNP: B4S to the signaling ligand streptavidin on the test line. Analytes: specific 1c - 4-lsp; nonspecific - In - Ins; 2n - 2ns (see Fig. 8).
  • FIG. 24 Verification of the target specificity of agents. Binding of the GNP agent: B4S with signaling ligands on the test line - streptavidin, streptavidin inhibited by an excess of biotinylated bovine serum albumin (bioBSA) and anti-FITC antibodies. No shading - no analyte; Vertical shading - 0.1 ⁇ M nonspecific analyte (Ins); Oblique shading to the right - 0.1 ⁇ M specific analyte (4-lsp).
  • bioBSA biotinylated bovine serum albumin
  • Fig. 25 Response (signal) in the absence of analytes in chromatographic analysis for agents with recognition oligonucleotides containing different amounts of adenosines at the end to which the signaling receptor biotin is bound: Solid line and black circles - B (0A) 4S (without terminal adenosines), dashed line and empty squares - B4S (one adenosine), dotted line and empty triangles - B (3A) 4S (three adenosines). The sequences of the recognition oligonucleotides are indicated in FIG. eight.
  • Fig. 26 The response (signal) of agents to oligonucleotides-analytes of various lengths in ICA format with anti-biotin antibodies on a test line. Analytes: 5'-
  • TCCGCAATACTCCCC-3 bottom to top right
  • 5'- ⁇ -3 from bottom to top to the left
  • 5'-ASTSSSS-3 cross-hatching
  • 5'-TSSSS-3 horizontal shading

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Nanotechnology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Crystallography & Structural Chemistry (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Inorganic Chemistry (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

Изобретение относится к области детекции аналитов. Сущность изобретения заключается в методе определения содержания аналита в образце с помощью аналитического агента, содержащего наночастицу и связанным с ней одноцепочечным распознающим олигонуклеотидом, причем конец упомянутого распознающего олигонуклеотида ковалентно связан с сигнальным рецептором, который способен специфически связываться с сигнальным лигандом, причем упомянутый распознающий олигонуклеотид способен специфически связываться с аналитом, и детектирование количества связавшихся наночастиц упомянутого аналитического агента с упомянутым сигнальным лигандом как меры содержания аналита в упомянутом образце, отличающийся тем, что упомянутый распознающий олигонуклеотид на упомянутом аналитическом агенте не имеет шпилек, включающих в себя более, чем 7 пар комплементарных нуклеотидов. Технический результат при использовании изобретения состоит в ускорении детекции и идентификации нуклеиновых кислот и других молекул, улучшения чувствительности метода детекции/регистрации, а также упрощения методологии для применения в полевых условиях.

Description

Метод определения содержания аналита в образце с помощью агента на основе наночастицы и распознающего олигонуклеотида
Описание изобретения
Область техники, к которой относится изобретение
Изобретение относится к области детекции аналитов, ин витро диагностики, детекции молекулярных аналитов в образце, экспресс анализов, в том числе для детекции нуклеиновых кислот. Изобретение заключается в методах (способах) детекции анлитов в образце, а также раскрывает свяязанные с данными методами аналитические агенты. Индексы рубрики действующей редакции Международной патентной классификации (МИК), к которой относится изобретение: G01N33/50.
Уровень техники
Разработка высокочувствительных методов экспресс-диагностики является одним из ключевых факторов глобальной тенденции перехода к персонифицированной медицине (Huckle D. Expert Rev Mol Diagn. 2008;8(6):679-688). Такие методы должны сочетать в себе простоту и доступность и призваны постепенно переместить «линию фронта» непосредственно к очагам возникновения угрозы. В то время как в области иммуноанализа эта тенденция привела к появлению целого семейства коммерчески доступных диагностических устройств, в области ДНК-анализа внедрение аналогичных систем идет с явным отставанием.
Качественная и количественная диагностика нуклеиновых кислот (далее НК) - является одним из ключевых элементов современного здравоохранения, в частности в борьбе с онкозаболеваниями. По мере открытия все новых диагностических маркеров, общего прогресса в области молекулярной биологии и понимания чрезвычайно сложной и важной роли ДНК/РНК в выполнении физиологических процессов живого организма (например, функций малых молекул РНК), значение точного и быстрого анализа их содержания в организме неуклонно растет. Это выдвигает на передний план задачу экспресс-диагностики НК, которая, в идеале, должна проводится максимально быстро, без использования сложного оборудования и специализированных помещений неквалифицированным персоналом.
Уже в настоящее время методы для быстрой и чувствительной детекции НК находят применение как в качестве рутинных тестов, например, в медицинской и пищевой индустрии, так и для проведения генетических тестов в криминалистике. Высокая специфичность в определении нуклеиновых последовательностей, характерная для данного вида тестов, позволяет применять подобные методы не только для диагностики заболеваний, но и для выявления конкретных видов вредоносных микроорганизмов.
Обычно, идентификация нуклеотидных последовательностей сопряжена с продолжительными по времени методами, такими, например, как рестрикционный анализ соответствующими ферментами с последующим гель-электрофорезом и окрашиванием образовавшихся фрагментов. Подобные методы не обладают высокой чувствительностью и не могут быть адаптированы для быстрой детекции в условиях внелабораторного применения.
С развитием методов быстрой амплификации НК, основанных на применении термостабильных ферментов (лигазы, трансферазы, полимеразы и т.д.) - полимеразной цепной реакции (PCR/ПЦР), лигазной цепной реакции (LCR/ЛЦР), амплификации с перемещением цепи (SDA) - появилась возможность создавать многочисленные копии нуклеиновых кислот, исходная концентрация которых лежит ниже порога детекции современных диагностических методов. Дальнейшая модификации подобных подходов позволила создать меченные лигандами НК, которые, в свою очередь, способствовали развитию новых высокочувствительных методов их детекции.
В тоже время, несмотря на достигнутый прогресс в области разработки методов экспресс-диагностики НК, остается насущная необходимость в методах и устройствах, которые могли бы обеспечить быструю и точную детекцию последовательностей нуклеиновых кислот, и в то же время исключали бы перекрестное загрязнение образцов и были бы доступными и простыми в применении.
Проведение НК анализа пока остается достаточно дорогим и является уделом крупных диагностических учреждений, оснащенных специализированным оборудованием и квалифицированным персоналом (Carter DJ, et al. Nucleic Acids Res. 2007;35(10):e74-e74). В этой связи разработка методов экспресс-диагностики нуклеиновых кислот с общим временем проведения анализа 5-25 минут вызывает безусловный интерес.
Первые работы по данной тематике декларировали относительно низкую чувствительность и, скорее, ставили своей целью замену традиционных методов визуализации результатов ПЦР-амплификации, чем разработку самостоятельных НК- тестов (Glynou К, et all. Anal Chem. 2003;75(16):4155-4160; Aveyard J, et al. Chem Commun. 2007;(41):4251). Дальнейшее совершенствование экспресс-методов определения НК было направлено на увеличение их чувствительности и развивалось в двух основных направлениях - 1) совершенствование методов НК-амплификации и их интеграция с НК- тестами; 2) улучшение самих методов детектирования за счет использования продвинутых меток и методов их регистрации.
Цель первой стратегии состояла в замене традиционного метода ПЦР на более простой и быстрый, но столь же эффективный и специфичный метод амплификации (Jauset- Rubio М, et al. Sci Rep. 2016;6:37732). В частности, усилия были направлены на устранение необходимости термического циклирования как мало совместимого с существующими форматами экспресс-анализа, диагностикой у постели больного (альтернативные названия - point-of-use, РОС - point-of-care) и полевыми тестами (field testing). Предложенная Notomi (Notomi Т. Nucleic Acids Res. 2000;28(12):63e-63) концепция изотермической амплификации дала толчок к появлению целой серии технологий экспресс-анализов - например, изотермическая амплификация (loop mediated isothermal amplification, LAMP) (Piepenburg O, et al. PLoS Biol. 2006;4(7):e204), амплификация, основанная на последовательности нуклеиновых кислот (nucleic acid sequence based amplification, NASBA) (Malek L, et al .Protocols for Nucleic Acid Analysis by Nonradioactive Probes. New Jersey: Humana Press; :253-260), геликаза-зависимая изотермическая амплификация (helicase dependent amplification, HDA) (Vincent M, et al. EMBO Rep. 2004;5(8):795-800), амплификация no принципу «катящегося кольца» (rolling circle amplification, RCA) (Fire A, et al. Proc Natl Acad Sci USA. 1995;92(10):4641-4645) и рекомбиназная полимеразная амплификация (recombinase polymerase amplification, RPA) (Jaroenram W, et al. J Virol Methods. 2014;208:144-151). Многие из перечисленных технологий находятся на стадии коммерциализации и демонстрируют сравнимую или даже превосходящую классическую ПЦР функциональность, высокую специфичность и чувствительность (Craw Р, et al. Lab Chip. 2012;12(14):2469-2486). В тоже же время, ввиду относительной сложности систем амплификации НК, основной проблемой на пути внедрения данных технологий в широкую медицинскую практику является обеспечение их тесной интеграции с существующими форматами пробоподготовки и регистрации сигнала в единое надежное устройство для point-of-use применения.
Второе направление развития НК-тестов заключается в исключении стадии амплификации за счёт использования более чувствительной системы детекции НК-мишени. В этом случае НК-анализ должен обладать пределом детекции (LOD) порядка 10 18 моль (1 амоль) целевой нуклеотидной последовательности (Aveyard J, et al. Chem Commun. 2007;(41):4251). К сожалению, большинство известных методов детекции НК, способных достичь подобной чувствительности, такие как опто-волоконные флуоресцентные сенсоры (optical fiber fluorescence sensor) (Kleinjung F, et al. Anal Chim Acta. 1997;350(l-2):51-58), визуализация отдельных молекул при помощи CCD-камер (Anazawa Т, et al. Anal Chem. 2002;74(19):5033-5038), метод генетических отпечатков пальцев на основе рамановской спектросопии (Raman spectroscopic fingerprint technique) (Cao YC. Science. 2002;297(5586): 1536-1540), химические- (Ishii JK, et al. Bioconjug Chem. 4(1):34-41), биологические- (Chiu NHL, et al. Anal Chem. 1996;68(14):2304-2308) или электрохимические- (Zhang Y, et al. Anal Chem. 2003;75(13):3267-3269) люминисцентные сенсоры трудно реализуемы в экспресс-форматах, пригодных для диагностики у постели больного, вследствие сложности и требовательности к специализированному оборудованию или общей длительности проведения анализа.
Появление новых методов регистрации на основе оптических свойств некоторых флуоресцентных красителей (Tyagi S, etal. Nat Biotechnol. 1996;14(3):303-308) и наночастиц (Elghanian R. Science. 1997;277(5329):1078-1081) дало мощный толчок исследованиям в области НК экспресс-диагностики и привело к появлению ряда высокочувствительных технологий в относительно простых форматах гомогенного ((Elghanian R. Science. 1997;277(5329): 1078- 1081; Dubertret В, et al. Nat Biotechnol. 2001;19(4):365-370) и иммунохроматографического (ИХА) (Мао X, et al. Chem Commun. 2009;(21):3065; Мао X, et al. Anal Chem. 2009;81(4): 1660-1668; Gao X, et al. Biosens Bioelectron. 2014;54:578-584) анализов. Так, значительного прогресса в увеличении чувствительности ИХА экспресс- анализов удалось достичь при использовании технологии так называемых «молекулярных маяков» (англ. - molecular beacon) - коротких олигонуклеотидных последовательностей, к противоположным концам которых химически пришиты молекулы флуорохрома и гасителя (тушителя) флуоресценции. В исходном состоянии такие олигонуклеотиды самопроизвольно образуют вторичные структуры (так называемые «шпильки» или hairpins) вследствие взаимодействия между собой взаимокомплементарных участков, благодаря чему молекулы флуорохрома и гасителя оказываются в непосредственной близости друг от друга и происходит гашение флуоресценции. Таким образом, в состоянии покоя флуоресцентный сигнал от «маяка» отсутствует, однако при его присоединении к молекулярной мишени (комплементарной последовательности ДНК либо РНК) происходит разрушение «шпильки», ее концы расходятся, флуорохром активируется и возобновляет свою флуорофорную активность, что позволяет проводить количественную (или качественную - в зависимости от формата анализа) оценку концентрации мишеней в исследуемом образце в режиме реального времени. В настоящее время некоторые варианты реализации ИХА экспресс-анализов на основе «молекулярных маяков» достигли чувствительности в единицы пМ (Мао X, et al. Commun. 2009;(21):3065; Не Y, et al. Biosens Bioelectron. 2012;34(l):37-43), практически приблизившись к LOD, необходимому для детекции НК в биологических образцах без предварительной амплификации. Однако дальнейшее повышение чувствительности данных методов сдерживается рядом принципиальных ограничений, свойственных технологии молекулярных маяков (Stobiecka М, et al. J Phys Chem В. 2016;120(21):4782-4790). Во-первых, дизайн и синтез таких конструкций пока остается нетривиальной задачей, требующей соблюдения баланса между их стабильностью и лёгкостью разборки в присутствии специфического олигонуклеотида. Это часто выражается в высокой стоимости разработки и высоком уровне фонового сигнала (Не Y, et al. Biosens Bioelectron. 2012;34(l):37-43; Goel G, et al. J Appl Microbiol. 2005;99(3):435-442; Kim Y, et al. Int J Clin Exp Pathol. 2008;1(2): 105-116). Во-вторых, фундаментальным ограничением технологии является относительно низкая скорость (к << 105 М_1с_1) и высокий энергетический барьер (са. 30 ккал/моль) взаимодействия молекулярных маяков с целевым аналитом (Gao Y. Nucleic Acids Res. 2006;34(11):3370- 3377), что делает данный многостадийный процесс кинетически ограниченным скоростью самой медленной стадии - разрушением старых и образованием новых пар оснований. Таким образом, при среднем времени проведения экспресс-анализа 15-20 минут, прореагировать успевает лишь небольшая (порядка 10%) доля исходных олигонуклеотидов, что неизбежно сказывается на чувствительности экспресс-тестов (Мао X, et al. Chem Commun. 2009;(21):3065).
Для создания экспресс-методов детекции ДНК (как с использованием методов амплифицикации, так и без них) чрезвычайно интересны системы на основе наночастиц. На данный момент активно разрабатываются системы, в которых наночастицы несут на своей поверхности сенсорные олигонуклеотиды, способные взаимодействовать с детектируемой ДНК/РНК, что в итоге приводит к связыванию наночастицы с твердой фазой или другими частицами или молекулами. В случае связывания с твердой фазой, упомянутая наночастица как правило сама является репортером, т.е. определяя количество связавшихся с твердой фазой наночастиц можно определить количество детектируемой НК в образце (как правило, используя калибровочную кривую); в других случаях в качестве репортеров используют различные индикаторные частицы и молекулы - меченные ферментами, флуорофорами, магнитными метками и т.п.
Например, для детекции интересующих молекул был разработан целый ряд подходов, реализующих проведение экспресс-тестов непосредственно по месту оказания медицинской помощи. Два таких устройства функционируют в формате иммунохроматографического анализа на тест-полосках и на основе проточной схемы анализа. В тестах на тест-полосках образец двигается по пористой мембране до области с иммобилизованным специфическим биореагентом. Интересующий аналит обычно определяется прямой визуализацией индикаторных реагентов, специфически связавшихся с упомянутым участком тест-полоски. ИХА тесты используются для обнаружения многих аналитов, в том числе антигенов различных микроорганизмов, антител, онкомаркеров и наркотиков. Однако, очень немногие из описанных в литературе методов иммунохроматографического анализа направлены на обнаружение нуклеиновых кислот. Например, см. патенты США N° 5,869,252, N° 6,037,127, и заявку США на изобретение N° 2001/0036634 А1.
Также описаны методы детекции нуклеиновых кислот, включающие иммобилизацию на мембране и требующие меньшее число стадий отмывки от несвязавшихся реагентов. Например, (Corti et al. Nuc. Acids Res., 1991:19, 1351) раскрыт метод детекции ДНК с помощью гибридизации исследуемой ДНК с зондом, предварительно меченной дигоксигенином, на одноразовых фильтрах. Метод включает предварительное смачивание фильтра буферным раствором с последующим добавлением исследуемой ДНК, блокирующего реагента и раствора для гибридизации, и, наконец, добавление дигоксигенин-меченной ДНК в благоприятных для гибридизации условиях. Детекция связывания дигоксигенин-меченной ДНК осуществляется с помощью конъюгата щелочной фосфатазы с антителами против дигоксигенина и хромогенных субстратов. Отметим, что данный метод хотя и применим для детекции меченных фрагментов ДНК, но осложнён длительным последовательным добавлением реагентов. Более предпочтительным был бы метод, не нуждающийся в многократных очистках и добавлениях реагентов.
Относительная высокая скорость выполнения и специфичность иммунохроматографических тестов привела к появлению наборов для иммунологической экспресс-диагностики. Некоторые из таких тестов реализованы за счёт капиллярного движения аналита по пористой мембране на упомянутых выше тест-полосках.
Описан метод (Патент США 20110160090А1) детекции одноцепочечных ДНК в жидких образцах в формате сэндвич-ИХА на тест-полосках с использованием полупроводниковых наночастиц в качестве репортерных меток. Несмотря на заявленные пониженное потребление реагентов, высокую (фемтомолярную) чувствительность, широкий динамический интервал и высокую скорость проведения анализа, данному методу присущи недостатки проведения сэндвич-анализа в приложении к детекции НК. Так, метод ограничен детекцией только больших олигонуклеотидов, способных образовывать одновременно связь с двумя последовательностями - связывающей и детектирующей НК, иммобилизованными на тест-полоске и наночастице, соответственно. Кроме того, для проведения анализа используется два типа сенсорных олигонуклеотидов, что является потенциальной причиной увеличенного уровня неспецифических взаимодействий с компонентами образца и требуют более тщательного дизайна всех компонентов анализа. Наконец, протекание реакции гибридизации с двумя фрагментами детектируемой последовательности требует времени и в динамических и сильно ограниченных по времени контакта условиях проведения ИХА неизбежно приведет к необходимости компромисса между временем анализа и его чувствительностью.
Наиболее близким прототипом к предлагаемому изобретению является метод определения внутриклеточной концентрации полипептидов или малых молекул (Патент США 9,890,427) и его аналог для определения полинуклеотидов (Патент США 8,507,200) на основе наночастиц благородных металлов и функционирующий на базе технологии молекулярных маяков. Согласно формуле изобретения, метод заключается в инкубации в подходящих условиях целевого полипептида или малой молекулы с нанаочастицей, которая включают в свой состав молекулы аптамера, в свою очередь меченые маркером. При этом ассоциация целевого полипептида или малой молекулы с наночастицей вызывает детектируемое изменение маркера, причем это изменение пропорционально внутриклеточной концентрации указанного целевого полипептида или малой молекулы, а указанный аптамер представляет собой одноцепочечный полинуклеотид, ковалентно связанный с указанной наночастицей, и указанный маркер представляет собой флуоресцентную метку, присоединенную к полинуклеотиду, гибридизованному с указанным аптамером. Кроме того, указанный полинуклеотид, гибридизованный с указанным аптамером не присоединен к наночастице, а ассоциация упомянутого аптамера с указанным целевым полипептидом или малой молекулой высвобождает указанный гибридизированный полинуклеотид и указанный маркер обнаруживается после этого высвобождения.
В данном случае удалось решить большинство недостатков предыдущих методов. Тем не менее, главным недостатком данного решения следует считать наличие обязательной стадии предварительного формирования молекулярного комплекса аптамер/полинуклеотид с последующим его разрушением в присутствии целевого полипептида или малой молекулы. Фундаментальным ограничением такого подхода также является относительно низкая скорость (k « 105 М_1с_1) и высокий энергетический барьер (са. 30 ккал/моль) взаимодействия молекулярного комплекса с целевым аналитом (Gao Y. Nucleic Acids Res. 2006;34(ll):3370-3377), что делает данный многостадийный процесс кинетически ограниченным скоростью самой медленной стадии - разрушением старых и образованием новых пар оснований. Таким образом, при среднем времени проведения экспресс-анализа 15-20 минут, прореагировать успевает лишь небольшая (порядка 10%) доля исходных олигонуклеотидов, что неизбежно сказывается на чувствительности экспресс-тестов (Мао X, et al. Chem Соттип. 2009;(21):3065). Кроме того, следует отметить сложность дизайна подобных систем, доставшейся «по наследству» от технологии молекулярных маяков. В частности, при разработке подобных систем необходимо тщательно проектировать строение и нуклеотидный состав молекулярного маяка с учетом известной проблемы баланса между стабильностью получаемой вторичной структуры НК («шпильки» - отвечающей за специфичность системы, т.е. за ее способность противостоять воздействию внешних неспецифических факторов) и легкостью ее раскрывания в результате специфической гибридизации с молекулярной мишенью (отвечающей за чувствительн ость детектирования) .
Очевидно, что необходимость соблюдения баланса между двумя этими взаимоисключающими требованиями и учета целого ряда дополнительных факторов (включая обеспечение существенного различия между сигналами от связавшихся и не связавшихся меток, минимизацию влияния эндогенных материалов, обеспечение возможности различать концентрации аналита во всём диапазоне интересующих концентраций, простота подготовки реагентов, их стабильность при хранении, квалификация персонала), не только значительно усложняет и удлиняет этап разработки подобных систем, но и накладывает неизбежные ограничения на структуру, чувствительность и специфичность будущей диагностической системы.
Таким образом, требуемый технический результат состоит в ускорении детекции и идентификации нуклеиновых кислот и других молекул, улучшения чувствительности метода детекции/регистрации, а также упрощения методологии для применения в полевых условиях.
Краткое описание изобретения
Для достижения указанного технического результата предложен: метод определения содержания аналита в образце с помощью аналитического агента, включающий стадию контактирования упомянутого образца с упомянутым аналитическим агентом, содержащим наночастицу, в условиях, которые позволяют связываться аналиту со связанным с упомянутой наночастицей одноцепочечным распознающим олигонуклеотидом, причем упомянутая наночастица связана с первым концом упомянутого распознающего олигонуклеотида, упомянутый распознающий олигонуклеотид способен специфически связываться с аналитом, второй конец упомянутого распознающего олигонуклеотида ковалентно связан с сигнальным рецептором, упомянутый сигнальный рецептор не способен специфически связываться с упомянутым аналитом, упомянутый сигнальный рецептор способен специфически связываться с сигнальным лигандом, дальнейшее приведение упомянутого аналитического агента в контакт с сигнальным лигандом, детектирование количества связавшихся наночастиц упомянутого аналитического агента с упомянутым сигнальным лигандом как меры содержания аналита в упомянутом образце, отличающийся тем, что упомянутый распознающий олигонуклеотид на упомянутом аналитическом агенте не имеет шпилек, включающих в себя более, чем 7 пар комплементарных нуклеотидов.
Кроме того, метод определения содержания аналита в образце с помощью аналитического агента, включающий стадию контактирования упомянутого образца с упомянутым аналитическим агентом, содержащим наночастицу, в условиях, которые позволяют связываться аналиту со связанным с упомянутой наночастицей одноцепочечным распознающим олигонуклеотидом, причем упомянутая наночастица связана с первым концом упомянутого распознающего олигонуклеотида, упомянутый распознающий олигонуклеотид способен специфически связываться с аналитом, второй конец упомянутого распознающего олигонуклеотида ковалентно связан с сигнальным рецептором, упомянутый сигнальный рецептор не способен специфически связываться с упомянутым аналитом, упомянутый сигнальный рецептор способен специфически связываться с сигнальным лигандом, дальнейшее приведение упомянутого аналитического агента в контакт с сигнальным лигандом, детектирование количества связавшихся наночастиц упомянутого аналитического агента с упомянутым сигнальным лигандом как меры содержания аналита в упомянутом образце, отличающийся тем, что упомянутый распознающий олигонуклеотид на упомянутом аналитическом агенте не имеет шпилек.
Кроме того, метод определения содержания аналита в образце с помощью аналитического агента, включающий стадию контактирования упомянутого образца с упомянутым аналитическим агентом, содержащим наночастицу, в условиях, которые позволяют связываться аналиту со связанным с упомянутой наночастицей одноцепочечным распознающим олигонуклеотидом, причем упомянутая наночастица связана с первым концом упомянутого распознающего олигонуклеотида, упомянутый распознающий олигонуклеотид способен специфически связываться с аналитом, второй конец упомянутого распознающего олигонуклеотида ковалентно связан с сигнальным рецептором, упомянутый сигнальный рецептор не способен специфически связываться с упомянутым аналитом, упомянутый сигнальный рецептор способен специфически связываться с сигнальным лигандом, дальнейшее приведение упомянутого аналитического агента в контакт с сигнальным лигандом, детектирование количества связавшихся наночастиц упомянутого аналитического агента с упомянутым сигнальным лигандом как меры содержания аналита в упомянутом образце, отличающийся тем, что все шпильки на упомянутом распознающем олигонуклеотиде расположены на расстоянии не менее, чем 3 нуклеотидов от нуклеотида упомянутого распознающего олигонуклеотида, с которым связан упомянутый сигнальный рецептор. Словарь
Если иное не определено, нижеследующие термины имеют следующие значения при интерпретации формулы и описания изобретения:
1) «иммунохроматографический тест» - помещение образца, в котором может находиться целевая нуклеотидная последовательность, на тест-полоску из хроматографичского материала с последующим латеральным перемещением образца по тест-полоске за счет капиллярных сил и его связывание с различными реагентами, размещенными на тест- полоске.
2) "тест-полоска" - хроматографическая среда, в которой может быть проведен анализ. Тест-полоска содержит «зону нанесения» для нанесения образца и «зону связывания», содержащую иммобилизованный связывающий реагент или же связывающую нуклеотидный последовательность, способные к связыванию и иммобилизации детектируемой нуклеотидной последовательности. Зона связывания, как правило, обладает существенно меньшей площадью поверхности, чем тест-полоска и содержит иммобилизованный связывающий реагент или же иммобилизованную связывающую нуклеотидную последовательность. Зона связывания может иметь форму точки, линии, кривой, полосы или же паттерна из точек, линий, кривых, полос или же их комбинации. Как правило, направление перемещения образца по тест-полоске пересекает зону связывания. Для данного изобретения предпочтительным является формирование сигнала в зоне связывания в форме четко-очерченного паттерна, резко отличающегося от сигнала, формируемого в других частях тест-полоски. Например, зона связывания может иметь форму аббревиатуры названия или названий аналита или аналитов в исследуемом образце.
3) «комплементарность» или «комплементарный» используется в отношении нуклеиновых кислот (например, нуклеотидных последовательностей) и относится к известному правилу формирования парных комплексов азотистых оснований аденин- тимин и цитозин-гуанин. Например, для последовательности 5'-T-C-G-G-3', комплементарной является последовательность 3'-A-G-C-C-5'. Если в последовательностях все нуклеотиды соответствуют принципу комплементарности, то говорят о полной комплементарности, как в приведенном примере. В случае, когда с принципом согласуются лишь часть нуклеотидов, то комплементарность называется частичной. Так, например, последовательность 5'-G-G-C-C-A-A-T-C-G-3' частична комплементарна последовательности 3'-C-G-G-C-T-A-A-C-C-5'. Количество соответствующих принципу комплементарности нуклеотидов в последовательностях определяет степень их комплементарности, которая влияет на эффективность гибридизации нуклеиновых кислот. Термин «значительная комплементарность» относится к образцу, который может гибридизоваться с одной или более цепями целевой нуклеиновой кислоты в условиях повышенной жесткости (см. ниже), или, например, в буфере для ПТ])3 нагретом до 95 °С и охлажденном до комнатной температуры.
4) Термин «партнер для связывания» относится к паре молекул и/или частиц, способным распознавать друг друга (целиком или частично) и образовывать как ковалентные, так и нековалентные связи. Существует ряд часто используемых пар для связывания, а также структур на основе таких пар. Среди них можно выделить системы, основанные на взаимодействии антиген/антитело, гаптен/антигаптен, диоксигенин/антидиоксигенин F(ab’)2, фолиевая кислота/фолат-связывающий белок, биотин/стрептавидин, биотин/авидин, протеин А(С)/иммуноглобулины, комплементарные сегменты нуклеиновых кислот, вирус/клеточный рецептор, лектин/карбогидрат, фермент/ингибитор, фермент/субстрат. Также, известны системы, в которых партеры по связыванию образовывают ковалентные связи за счет наличия у таких партнеров аминореакционных групп, таких как сукцинимидиловые эфиры, изотиоционат, сульфонил галиды, или сульфгидрильные реакционные группы, включая производные галоацетатов и малеимидов. Другими партнерами для связывания могут быть галогены, стероиды и 2,4 - динитрофенилы.
5) Термин «нуклеиновая кислота» обозначает полимер или олигомер, состоящий из нуклеотидов, или соединений, имитирующих их. Также термин относится к олигонуклеотидам, имеющим не встречающееся в природе участки цепи, но проявляющими такие же свойства, как и олигонуклеотиды природного происхождения. Для специалистов должно быть очевидно, что в соответствии с данным изобретением может быть осуществлено большое разнообразие анализов по детекции целевых последовательностей нуклеиновых кислот. Термин «нуклеотид» здесь относится к рибонуклеотидам, дезоксирибонуклеотидам, или аналогам нуклеотидов, имеющих химическую модификацию в одном или нескольких из строительных блоков нуклеотида (азотистых оснований - пурина или пиримидина, сахара, фосфатов). Модификации могут быть, например, проведены в пятой позиции пиримидина, или восьмой позиции пурина, в экзоциклической аминогруппе цитозина, путем замены урацила на 5-бром-урацил, замена гидроксигруппы в 2'-позиции сахара на галогруппу (либо на R, OR, SH, Н, SR, NR2, Nth, NHR, CN). Термин также относится к рибонуклеиновым кислотам, встречающимся в живых организмах, либо с замененным основанием (ксантин, ионозин и т.д.) или сахаром (2'-метоксирибоза и т.п.). Также возможна модификация фосфодиэфирной связи, например, образование цепи с помощью фосфоротионатов, метилфосфонатов и пептидов. «Нуклеиновая кислота» может обозначать одно- или двуцепочечную молекулу, состоящую из мономеров (нуклеотидов), включающих в свой состав фрагменты сахаров, фосфатов и пуринов или пиримидинов. В растениях, животных, низших эукариотах и бактериях «рибонуклеиновая кислота» (РНК) выполняет функции трансляции, т.е. служит передатчиком хранящейся в «дезоксирибонуклеиновой кислоте» (ДНК) генетической информации. Термин «фрагмент» обозначает определенную часть последовательности ДНК.
6) Метод анализа и его аппаратурная реализация, относящийся к данному изобретению, может детектировать целевую нуклеиновую кислоту или другие вещества (собирательный термин - аналит), содержащиеся в различных образцах. Термин «образец» здесь относится к любой жидкости, потенциально содержащей аналиты. Образец может быть получен из человеческих или других животных тканей или жидкостей (кровь/сыворотка крови, моча, слюна, слеза, мокрота, пот, слизь, стул), из образцов культивирования клеток тканей, гистологических образцов, образцов биопсии и т.д. Образец также может быть получен из продуктов сельского хозяйства, бактерий, вирусов, либо их продуктов жизнедеятельности и обработки. Также образцом может служить различный мусор и отходы, продукты их переработки, питьевая и сточные воды, продукты питания в обработанном или сыром виде, воздух и т.д. В случае реализации данного изобретения для детектирования искомых последовательностей нуклеиновых кислот, оно может быть применено для анализа генетических отклонений и множества других заболеваний, служить для контроля протекания лечения инфекционных болезней, а также для множества других применений.
7) Термин «распознающий олигонуклеотид» обозначает НК, содержащую последовательность, комплементарную анализируемой (целевой) нуклеиновой кислоте (аналиту).
8) Термин «сигнал-ген ерирующий субстрат» обозначает вещество, способное взаимодействовать с сигнальным рецептором и генерировать детектируемый сигнал. Например, ABTS/TMB для пероксидазы, BCIP/MBT для щелочной фосфотазы, свет для флуоресцирующих соединений.
9) Термин «сигнальный рецептор», «сигнал-продуцируемый репортер», «репортер» обозначает вещество, способное детектировать искомый аналит через выделение энергии или путем ферментативной активности, например, флуоресцентные и хемилюминесцентные фрагменты, частицы, ферменты, радиоактивные метки, светоиспускающие домены или молекулы.
10) Термин «пористый материал» или «хроматографический материал» обозначает материал, имеющий поры не менее 0,1 мкм, предпочтительно не менее 10,0 мкм, достаточного размера для движения по нему жидкостных сред за счет капиллярных сил.
11) Термин «сигнал-продуцирующая система» обозначает совокупность реагентов необходимых для генерации детектируемого сигнала под действием внешнего воздействия. Как правило, такие системы генерируют сигнал, который может быть детектирован внешними средствами - например, путем измерения электромагнитного излучения, или путем визуального наблюдения. В основном, такие системы состоят из хромофорного субстрата и фермента, который превращает субстрат в краситель, поглощающий электромагнитное излучение определенного диапазона, фосфоресцирующие или флуоресцирующие вещества.
12) Расположение шпильки от первого или второго конца распознающего олигонуклеотида на расстоянии X нуклеотидных оснований подразумевает собой, следующее. Местом связывания наночастицы или сигнального рецептора с распознающим олигонуклеотидом следует считать нуклеотид, с которым образована их связь (предпочтительно ковалентная). При этом, если этот нуклеотид является первым в шпильке (т.е. образовывает нековалентную связь с другим нуклеотидом), то расстояние Х=0. Если шпилька начинается с соседнего нуклеотида, то Х=1, и т.д.
13) Под первым/вторым концом одноцепочечного распознающего олигонуклеотида - имеется в виду не фактический конец молекулы, а одна или вторая его сторона. Т.е. нуклеотидное основание распознающего олигонуклеотида, соответствующее месту связи сигнального рецептора или наночастицы предпочтительно находится с краю олигонуклеотида, но может быть и не крайним основанием в олигонуклеотиде. Под нуклеотидным основанием распознающего олигонуклеотида, соответствующем месту связи сигнального рецептора (или наночастицы), подразумевается мономер нуклеиновой кислоты нуклеотид (в т.ч. нуклеозид, сахарид и остаток фосфорной кислоты), с которым связан сигнальный рецептор (или наночастица).
14) В данном описании, понятия «рецептор» и «лиганд» взаимозаменяемы и могут быть использованы для обозначения индивидуальных молекул в вышеописанном понятии «партнеров для связывания». Так, например, если часто в литературе в парах стрептавидин- биотин, антитело-антиген, под рецептором подразумевается стрептавидин и антитело, а под лигандом - биотин и антиген, то в описании данного изобретения под рецептором может подразумеваться и стрептавидин с антителом, и биотин с антигеном (при этом лигандом будет соответственно - биотин с антигеном и стрептавидин с антителом, соответственно).
15) Наночастица - подразумевает собой частицу в широком диапазоне - от 1нм до ЮОмкм, предпочтительнее от 1нм до Юмкм, предпочтительнее - от 1 нм до 1 мкм, предпочтительнее от 1 нм до 100-нм. При этом наночастицы могут быть металлическими, полимерными, структуры ядро-оболочка и т.п.
16) Термин «наночастицы» подразумевает надмолекулярные структуры, которые состоят из более, чем одной молекулы. При этом, хотя часто наночастицами обозначают объекты до ЮОнм, в рамках описания данного изобретения подразумеваются и объекты большие чем 100 нм - предпочтительно до 5мкм, но в некоторых случаях допустим размер и до ЮОмкм. Таким образом, под наночастицами подразумевают как наночастицы, так и микрочастицы, микросферы и т.п. Кроме того, подразумеваются частицы с упомянутыми размерами, как по всем измерениям, так и по хотя бы одному.
17) Терапевтические средства/молекулы/агенты. Под терапевтическими молекулами/агентами могут пониматься как вещества, субстанции, молекулы, надмолекулярные агенты, наночастицы, микрочастицы, наноагенты, микроагенты, формуляции, лекарственные формы, и т.п., которые используются как для терапии, так и диагностики различных заболеваний или состояний организма или пациента, в т.ч. включают в себя метки, контрастные агенты, компоненты с контролируемым высвобождением, парамагнитные и магнитные агенты, цитотоксические агенты, и т.п.
18) «Меткой» или «детектируемым элементом» является композиция, детектируемая спектроскопическими, фотохимическими, биохимическими, иммунохимическими, химическими или другими физическими средствами. Например, широко используемые метки включают в себя 32Р, флуоресцентные красители, электронно-плотные реагенты, ферменты (например, как обычно используются в ELISA), биотин, дигоксигенин или гаптены и белки или другие сущности, которые могут быть обнаружены, например, путем включения радиоактивной метки в пептид или антитело, специфически реагирующие с целевым пептидом. Любой метод, известный в данной области для конъюгирования антитела с меткой, может быть использован, например, с использованием методов, описанных в (Hermanson, G. Т., Academic press, 2013).
19) Используемый здесь термин «фармацевтический» относится к композиции, которая полезна при лечении заболевания или симптома заболевания.
20) Термин «лечение» или «терапия» (treating, treatment, therapy) относятся к любым признакам успеха при лечении или улучшении заболевания, травм, патологии или состояния, включая любые объективные или субъективные параметры, такие как уменьшение; ремиссия; уменьшение симптомов или замедление ухудшения состояния больного, патологии или состояния пациента; замедление темпов дегенерации; что делает финальную стадию заболевания менее мучительной; улучшение физического или психического благополучия пациента. Лечение или улучшение симптомов могут основываться на объективных или субъективных параметрах; включая результаты физического обследования, нейропсихиатрических экзаменов и / или психиатрической оценки. Например, определенные методы, представленные здесь, могут успешно лечить рак, уменьшая заболеваемость раком и вызывая ремиссию рака. Термин «лечение» и его продолжения включают профилактику травмы, патологии, состояния или заболевания.
21) «Болезнь» или «состояние» относятся к состоянию здоровья пациента или субъекта, подлежащему лечению различными лекарственными средствами, дисперсиями, или другими методами представленными в настоящем документе.
22) Используемый здесь термин «контрастный агент»/«контрастное средство» относится к композиции, которая при введении субъекту улучшает предел обнаружения или способность обнаружения физического метода, техники или устройства для медицинской визуализации (например, рентгенографический инструмент, рентген, КТ, ПЭТ, MPT (MRI), ультразвук и другие методы). Контрастный агент может усилить величину сигналов, связанных с различными структурами или жидкостями внутри субъекта.
23) «Пациент» или «нуждающийся в этом субъект» относится к живому организму, страдающему или (возможно) склонному к заболеванию или состоянию, которое можно лечить путем введения лекартва, фармацевтической композиции или агента, как указано в настоящем документе. Неограничивающие примеры включают людей, других млекопитающих, быков, крыс, мышей, собак, обезьян, коз, овец, коров, оленей и других животных, не относящихся к млекопитающим. В частности, пациент может быть человеком.
24) Используемый здесь термин «компонент с контролируемым высвобождением» или
«агент активируемый внешним воздействием» относится к соединению, которое в сочетании с композицией, описанной здесь (включая варианты осуществления), высвобождает в условиях применения (в пациенте) композицию с контролируемой скоростью. Такие соединения включают высокомолекулярные, анионные мукомиметические полимеры, гелеобразующие полисахариды и тонкодисперсные субстраты носителя лекарственного средства и другие. Эти компоненты более подробно обсуждаются в патентах США 4911920; 5403841; 5212162; и 4861760. Все содержание этих патентов включено в настоящее описание посредством ссылки во всей их полноте для всех целей. В некоторых вариантах осуществление «компонента с контролируемым высвобождением» может представлять собой замедленное высвобождение, продолжительное действие, продолжительное высвобождение, высвобождение во времени, синхронизированное высвобождение, контролируемое высвобождение, модифицированное высвобождение или соединение с непрерывным высвобождением. В некоторых вариантах осуществления, соединение распадается в месте введения (например, подкожного, внутривенного) или внутри пищеварительного тракта (например, желудка, кишечника), если соединение и композицию вводят перорально. В некоторых вариантах осуществления компонент с контролируемым высвобождением является полимером и может называться «полимер с контролируемым высвобождением». Кроме того, агент, активируемые внешним воздействием может активироваться (например, высвобождать терапевтический агент или связываться с мишенью) в результате воздействия внешним магнитным/электрическим полем, ультразвуком, светом, электронным пучком, в результате радиоактивного распада каких-либо атомов, в результате взаимодействия с химическими микроокружением и т.п.
25) Используемый здесь термин «парамагнитный агент»/«парамагнитное средство» относится к парамагнитному соединению, полезному в диагностических методах визуализации (например, магнитно-резонансная томография) в качестве контрастного агента. В некоторых вариантах осуществления парамагнитный агент включает гадолиний, оксид железа, платину железа или марганец.
26) Варианты цитотоксических средств (агентов, токсинов) включают, но не ограничиваются следующими веществами: рицин, доксорубицин, даунорубицин, таксол, бромид этидия, митомицин, этопозид, тенопозид, винкристин, винбластин, колхицин, дигидроксиантрациндион, актиномицин D, дифтерийный токсин, экзотоксин Pseudomonas (РЕ) А, РЕ40, абрин и глюкокортикоид и другие химиотерапевтические агенты, а также радиоизотопы. Подходящие детектируемые маркеры включают, но не ограничиваются следующими веществами, радиоизотоп, флуоресцентное соединение, биолюминесцентное соединение, хемилюминесцентное соединение, хелатор металла или фермент.
27) Неполный список иммунологических анализов включает в себя: конкурентные и неконкурентные форматы, иммуноферментные анализы в плашке (ELISA), микроточечные анализы, вестерн-блоты, гель-фильтрацию и хроматографию, иммунохроматографию, иммуногистохимию, проточную цитометрию или сортировку клеток помеченных флуоресцентной меткой (FACS), микрочипов и т. д. Такие методы также могут быть использованы in situ, ex vivo, in vitro или in vivo, например, для диагностической визуализации.
Следует отметить, что во всей заявке альтернативы записаны в группах Маркуша, например, каждое положение терапевтического агента, может содержать более одного возможного терапевтического агента. В частности, предполагается, что каждый член группы Маркуша следует рассматривать отдельно, тем самым, содержащий другой вариант осуществления, и группа Маркуша не должна читаться как единое целое.
Осуществление изобретения. Подробное описание воплощений изобретения.
Характеристики и преимущества агентов согласно изобретению будут далее проиллюстрированы в следующем подробном описании. Хотя изготовление и использование различных вариантов настоящего изобретения подробно обсуждается ниже, следует понимать, что настоящее изобретение обеспечивает множество применимых изобретательских концепций, которые могут быть воплощены в широком спектре конкретных контекстов. Конкретные варианты осуществления, обсуждаемые здесь, просто иллюстрируют различные способы создания и использования изобретения и не ограничивают объем изобретения. Все содержание приведенных здесь (ранее и далее) включено в настоящее описание посредством ссылки во всей их полноте для всех целей.
Данное изобретение широко применимо для быстрого детектирования нуклеиновых кислот и их фрагментов, а также для детектции иных аналитов, которые могут являться партнером для связывания с распознающим олигонуклеотидом. Среди возможных его приложений можно выделить медицину, ветеринарию, агротехнологии, пищевую промышленность. В особенности данный метод применим для обнаружения факторов этиологического характера, таких как бактерии и вирусы, для скрининга резистентных бактерий и для обнаружения злокачественных клеток.
Если не указано иное, все технические и научные термины, используемые здесь, имеют то же значение, которое обычно понимается специалистом в данной области техники, к которому относится настоящее изобретение. Хотя способы и материалы, аналогичные или эквивалентные описанным здесь, могут быть использованы в практике или испытаниях настоящего изобретения, некоторые из подходящих способов и материалов описаны ниже. Все публикации, патентные заявки, патенты и другие ссылки, упомянутые здесь, включены в качестве ссылки в полном объеме. В случае конфликта настоящая спецификация, включая определения, будет контролироваться. Кроме того, материалы, методы и примеры являются иллюстративными и не ограничивают данное изобретение.
Данное изобретение основано на обнаруженном феномене, который позволяет детектировать ДНК и другие аналиты, сняв вышеуказанные ограничения и полностью отказаться от сложного дизайна молекулярных маяков или кропотливого подбора условий для работы флуоресцентных меток. Предлагаемый способ регистрации специфических взаимодействий в значительной степени лишен указанных выше недостатков и в одном из своих воплощений применим для экспресс-анализа как относительно длинных, так и коротких (до 10 пар оснований) олигонуклеотидных последовательностей. Метод универсален, прост, предсказуем в разработке и может быть применим для решения широкого круга диагностических задач в областях медицины, охраны окружающей среды, контроля пищевой продукции, биобезопасности и т.д.
В частности, предлагаемый способ может быть использован для идентификация коротких специфических последовательностей нуклеиновых кислот, что представляет значительный интерес в связи с исследованием физиологических функций микроРНК, ранней диагностики злокачественных образований, выявления точечных мутаций и т.д. Причем роль и физиологически функции таких соединений в настоящее время переживает этап интенсивного изучения, что гарантирует дальнейшее значительное увеличение интереса к методам их детектирования.
Золотой стандарт для решения подобных задач - ПЦР, имеет уникальную чувствительность за счет специфической амплификации искомого фрагмента НК с последующим количественным или качественным его определением с использованием относительно простых аналитических инструментов. Тем не менее, метод мало применим для экспресс-диагностики и полевых анализов, поскольку нуждается в квалифицированном персонале и специальном оборудовании, предъявляет повышенные требования к частоте лабораторных помещений и занимает по крайней мере 2 часа. Новые методы детекции, появившихся на волне растущего спроса на системы регистрации коротких ДНК и РНК последовательностей - биочипы и секвенирование нового поколения (Next Generation Sequence, NGS), электрохимические методы, системы ферментативной амплификации и модуляции флуоресцентного сигнала, биосенсоры на основе квантовых точек и эффекта поверхностного плазмонного резонанса - не смотря на чрезвычайно высокую чувствительность, сложны в обращении, требуют многостадийных операций промывки и амплификации и предполагают централизованное использование в больших специализированных учреждениях, что создает трудности для их рутинного применения. Наконец, малый размер исследуемых последовательностей (до 15 и. о.) создает принципиальные трудности для использования более простых аналитических методов (например, иммунохроматографии) вследствие невозможности использования классического сэндвич-анализа ввиду малой длины «узнающих» последовательностей и, как следствие, низкой специфичности и слабой аффинности образующихся молекулярных комплексов.
Действительно, для надежного специфического анализа нуклеотидных последовательностей классическим сэндвич-методом, длина «узнающей» последовательности не должна быть меньше 15 и. о. Такое ограничение обусловлено резким падением как специфичности (т.е. повышенной вероятностью того, что данная последовательность окажется не уникальной), так и чувствительности (чем меньше длина перекрывающегося участка, тем ниже аффинность такого взаимодействия) анализа. Таким образом, для сохранения специфичности и чувствительности сэндвич-анализа, анализируемая последовательность должна быть не менее 24 и. о. (Cai S, et al. Anal Chem. 2010;82(17):7178-7184), в то время как детектирование заметно более коротких последовательностей (до 18 и. о. и менее) представляет безусловный научный и практический интерес, например, для диагностики рака и анализа microRNA.
В основу предлагаемого изобретения положен обнаруженный эффект «маскирования» концевых фрагментов НК на поверхности наночастиц. Будучи иммобилизованной на наночастицы, в исходном состоянии такая молекула (далее - распознающий олигонуклеотид) оказывается скрученной и ее концевой фрагмент, меченный, например, аффинной или индикаторной метками (далее - сигнальный рецептор), оказывается недосягаем для реакций с соответствующим лигандом (далее - лиганд сигнального рецептора). Например, в случае использования биотина, он оказывается недоступным для реакции со стрептавидином или биотин-специфичными антителами. В то же время активность метки может быть восстановлена под действием некоторых внешних факторов, в том числе вследствие специфических взаимодействий с комплементарными олигонуклеотидами (далее - аналит). В результате такого взаимодействия образующийся ДНК-дуплекс формирует намного более жесткую структуру (Turberfield AJ, et al. Nature. 2000;406(6796):605-608) и «спрямляет» исходную capture ДНК. В результате этого концевая метка биомолекулы восстанавливает свою активность и может быть использована в качестве индикатора присутствия специфичного аналита или служить триггером для запуска связанных биохимических процессов.
Данный эффект представляет интерес как для решения фундаментальных научных задач (например, изучения взаимодействия иммобилизованных биомолекул и функционализированных ими наночастиц друг с другом), так и для аналитического и биомедицинского применения (in field или point-of-use диагностических систем, систем адресной доставки лекарств и т.д.). Поскольку описанная система чрезвычайно чувствительна по отношению к «спрямляющему» олигонуклеотиду, её можно использовать для детекции НК. Данный метод прост и универсален, применим для анализа как длинных, так и коротких (до 10 Ьр) олигонуклеотидных последовательностей в различных форматах, в т.ч. в форматах гомогенного и иммунохроматографического анализов. В частности, для детекции НК в формате ИХА метод позволил достигнуть рекордного LOD в 2 амоль в объеме образца 20 мкл (100 фМ) при времени анализа 15 мин, что подходит для экспресс- тестов на НК в РоС формате и не требует сложной стадии амплификации образца.
Кроме того, отметим, что синтетические материалы, способные в ответ на внешние стимулы (триггеры) переключаться между определенными физико -механическими состояниями, получили название «умных материалов» (УМ, или СМ - смарт- сатериал от англ smart material) и становятся все более популярными в ряде областей настоящей и будущей деятельности человека (J. Liu, et al. Adv. Mater. 2006, 18:1667). В частности, УМ, способные к переключению между активным и пассивным (ВКЛ и ВЫКЛ) состояниями под действием химических триггеров, оказались очень востребованными в биомедицине, где умение распознавать молекулярные стимулы важно для улучшения точности доставки лекарств и диагностики (W. Cui, et al. Adv. Mater. 2016, 28:1302). Некоторые из них уже настолько сложны, что способны вести себя как молекулярные автоматы, то есть воспринимать входные химические сигналы и производить ответные, заранее запрограммированные терапевтические или диагностические действия через сложную систему белковых (М. A. McEvoy, et al. Science 2015, 347:1261689) или ДНК (К. Liu, Adv. Mater. 2013, 25:5530) интерфейсов. В последнем случае ВКЛ/ВЫКЛ переключаемые системы могут реализоваться при помощи технологий ДНК-оригами или ДНК-биконов, однако использование высокоэнергетических реакций замещения лигандов в ДНК- комплексах (strand displacement) обуславливает низкую по меркам живых систем чувствительность (A. S. Hoffman, Adv. DrugDeliv. Rev. 2013, 65:10), что является серьезным препятствием к их практическому применению.
В данном изобретении, метод детекции НК основан на разработанном принципиально новом агенте, который является по сути новым поколением умных материалов - с контролируемой аффинностью к специфическим мишеням, обладающим ультравысокой (до 10 18 молей) чувствительностью к входным молекулам (аналиту).
Согласно одному из вариантов изобретения на наночастице производится иммобилизация специально сконструированной гибкой полимерной цепи со структурой, способной менять свои свойства под действием внешних факторов и регулировать доступность концевого функционального рецептора. Используя данный подход, создается агент-УМ, разрешающий связывание концевого сигнального рецептора с лигандом- мишенью в результате узнавания специфического входного олигонуклеотида (аналита). В примерах к данному изобретению показана работа разработанных материалов в формате ИХА, которые позволяют достичь рекордный для экспресс-методов предел детекции фемтомолярных концентраций ДНК при времени анализа всего 10-20 минут, что в совокупности с принципиальной простотой дизайна демонстрирует перспективность предлагаемого подхода для создания тераностических агентов нового поколения и наносенсоров.
Вдохновлённый элегантной сложностью природных живых структур и их способностью тонко регулировать свое поведение в зависимости от изменений состава и свойств окружающей среды, человек пробует создавать свои, похожие на них, «умные» материалы, действующих как in vitro, так и in vivo (McEvoy МА, et al. Science. 2015;347(6228): 1261689-1261689). Вместе с традиционными CM на основе полимеров, реагирующих на такие примитивные стимулы, как pH и температура, в настоящее время наблюдается появление нового поколения таких материалов, которые по своей способности изменять функциональность в зависимости от комплексного анализа множества биомаркеров уже могут немного напоминать живые структуры. Новейшие достижения в этой области уже привели к созданию СМ, которые ведут себя как молекулярные автоматы. В частности, в ответ на входные молекулярные сигналы эти СМ претерпевают ряд трансформаций и таким образом осуществляют заранее запрограммированные действия, ориентированные на их тераностическое применение, такие как связывание с раковыми клетками и инициирование высвобождения лекарств. Некоторые из них уже настолько «умны», что действительно отдаленно напоминают живые структуры по своей способности менять функционал в зависимости от сложной совокупности внешних факторов (I. L. Sokolov, et al. Biochim. Biophys. Acta - Gen. Subj. 2017;1861(6): 1530-1544). Как правило, эти системы строятся таким образом, что у агента есть два или несколько состояний, например активированное и инертное (ВКЛ и ВЫКЛ состояния, соответственно), переключение между которыми происходит за счет передачи информации от инпута к компонентам системы путем внутренней структурной реорганизации. Так, например, способностью рецептора связываться со своей мишенью можно управлять за счет его обратимого экранирования внутри контейнера из ДНК оригами1 или под самособранным слоем наночастиц (Nikitin МР et al. Nat Nanotechnol. 2014;9:716-722; Lovchinsky I, et al. Science. 2016;351(6275):836-841).
Однако, несмотря на явный прогресс в усложнении функционала УМ, ряд ключевых практических проблем остаётся пока нерешенным, в частности их чувствительность к разнообразным сигнальным молекулярным факторам на порядки отстает от природных аналогов и редко лучше 1 нМ. Между тем, именно сверхчувствительность (вплоть до единичных молекул) живых систем к факторам среды определяет удивительную эффективность и слаженность их поведения и, в конечном счете, является основой их физиологической активности (Kuriyan J, et al. Garland Science; 2012). Кроме того, сложное строение УМ, как правило, влечёт за собой проблемы с дизайном систем, в частности, снижает надёжность и предсказуемость работы. В результате реализации данного изобретения удается максимально повысить чувствительность и в то же время упростить дизайн УМ для решения первостепенной задачи доставки лекарств и диагностики - создания наночастиц с регулируемой аффинностью целевых рецепторов.
Согласно различным опубликованным данным, типичный умный материал с переключаемой аффинностью к мишеням состоит из: i) «выходного» (нацеливающего) рецептора, который отвечает за связывание с мишенью; ii) структуры, способной переключаться между альтернативными состояниями, одно из которых обеспечивает доступность выходного рецептора для связывания с мишенью (ВКЛ), а другое - запрещает, например, из-за стерического экранирования выходного рецептора (ВЫКЛ); iii) «замка», который удерживает структуру в одном из состояний, но может быть «разблокирован» по определенному управляющему сигналу; iv) блока, чувствительного к активирующему (входному) сигналу, способного избирательно распознавать химический (вещественный) входной сигнал (далее - входной сигнал) и формировать управляющий сигнал на «переключение» «замка».
В большинстве переключаемых умных материалов «замок» и блок, чувствительный к входному сигналу, являются одним и тем же объектом. В частности, «замок» может быть реализован путем связывания «входного» рецептора (то есть ответственного за распознавание входного сигнала) с молекулярным аналогом самого входного сигнала. Затем, при контакте входного сигнала с упомянутым аналогом происходит вытеснение последнего из комплекса с входным рецептором.
На Фиг. 1 показаны некоторые примеры таких систем, включающих, например, «замки» на основе антител или ферментов, в которых низкомолекулярный входной сигнал вытесняет конъюгат входного аналога с белком-носителем из комплекса с входным рецептором (антителом или ферментом) (Фиг. 1а, б). Другим примером является ДНК- «замок», действие которого основано на вытеснении (замещении) полинуклеотидной цепи аналога входного сигнала на цепь входного сигнала из его комплекса с входным ДНК- рецептором (который имеет ту же или аналогичную последовательность ДНК, что и входной сигнал) (Фиг. 1в). Такое вымещение возможно только тогда, когда концентрация входного сигнала достаточно высока, чтобы обеспечить эффективную конкуренцию с цепью аналога входного сигнала.
Например, в системе «молекулярных маяков» (molecular beacons), показанной на Фиг. 1в, «замок» (отмечен зеленым цветом) и входной рецептор (красная пунктирная линия) имеют одну и ту же последовательность ДНК. Эта последовательность одновременно контролирует стабильность комплекса в отсутствие входного сигнала, а также энергетический барьер, определяющий чувствительность к входному сигналу в реакции замещения полинуклеотидной цепи. К сожалению, точная настройка этой последовательности неизбежно приводит к снижению стабильности или чувствительности всей системы. Этот компромисс представляет собой фундаментальное ограничение чувствительности таких СМ к внешним химическим сигналам.
Чтобы преодолеть эту проблему и повысить чувствительность системы, мы попытались разработать агент, в котором «замок» был бы полностью независимым, как химически, так и пространственно, от чувствительного к входному сигналу элемента системы. Еще более важно, в предлагаемой концепции входной рецептор должен быть, по существу, полностью свободным от каких-либо специфических взаимодействий до его взаимодействия с входным сигналом.
Изучив несколько СМ с различной природой и длиной полимерных цепей, мы обнаружили явление, которое, как мы покажем ниже, позволяет получать сверхчувствительные СМ. В частности, мы обнаружили, что в случае использования одноцепочечной ДНК даже без выраженных вторичных структур (шпилек), которая несет с одного конца определенную функциональную группу (например, биотин), а другим концом связана с наночастицей, то указанная функциональная группа предпочитает «маскироваться» внутри цепи и становится недоступной для связывания с ее лигандами (например, стрептавидином). Причем, что особенно важно для конструкции СМ, этот эффект маскирования обратим, поскольку указанная функциональная группа становится снова доступной к взаимодействиям если агент вступает в контакт с комплементарной последовательностью, которая гибридизуется с рецептором с образованием жесткого дуплекса. Хотя такой наноагент напоминает молекулярные маяки (которые также контролируют положение концевых фрагментов полинуклеотидной цепи благодаря их вторичной структуре со шпильками), между ними существует фундаментальное различие. В частности, у обнаруженного феномена отсутствует энергетически невыгодная стадия разрушения комплекса ДНК (как видно на Фиг. 1г). В отличие от молекулярных маяков, это использование этого эффекта позволяет независимо контролировать величину прочности молекулярного «замка» (то есть стремление выходного рецептора «прятать» свой концевой фрагмент)) и способность входного сигнала связываться со своим рецептором. Следовательно, для достижения максимально возможной чувствительности данный подход предлагает два независимых параметра для точной настройки наноагентов.
Используя обнаруженный феномен в качестве базового подхода, данное изобретение предлагать концепцию построения СМ, которая, по аналогии с молекулярными маяками, названа «маяками на основе наночастиц (nanoparticle beacon)». Согласно данной концепции, выходной рецептор прикрепляется к наночастице через гибкую полимерную цепь, которая определяет способность выходного рецептора маскироваться и оставаться в неактивном состоянии либо внутри, либо под глобулой полимерной цепи на поверхности наночастицы благодаря любому из известных молекулярных взаимодействий (гидрофобному, электростатическому, между водородными связями и др.). Кроме того, этот гибкий полимер должен нести входной рецептор, который при связывании с входным сигналом вызывает механическое напряжение в полимере. Это, в свою очередь, должно вызвать изменения конформации цепи, которые «разблокируют» выходной рецептор, выведут его из «маскированного» состояния и обеспечат его связывание с мишенью. Возвращаясь к аналогии с живыми существами, такой СМ будет вести себя подобно языку хамелеона: в неактивном состоянии он скручивается, чтобы скрыть липкий кончик, но при наличии раздражителя он разворачивается, и кончик языка способен захватывать цель. Этот принцип показан на Фиг. 1 г.
В рамках данного изобретения используют гибкие свойства полимерных молекул, регулируемые внешними стимулами. К примеру, согласно одному из вариантов изобретения рассмотрим молекулу, склонную в растворе сворачиваться в клубок; закрепим один её конец на наночастице, а второй модифицируем таргетирующим рецептором, который бы слабо влиял на сворачивание клубка и стерически блокировался в нём от связывания с мишенью (лигандом). Если взаимодействие полимерной молекулы с инпутом таково, что в результате него «спрятанный» рецептор экспонируется для взаимодействия со своим лигандом, то полученная система будет проявлять требуемое свойство - инпут- контролируемую аффинность к специфической мишени.
В одном из вариантов реализации данного изобретения в качестве упомянутого гибкого полимера используется ДНК-олигонуклеотид. Известно, что в однонитевом состоянии такая молекула обладает высокой гибкостью, характеризующейся персистентной длиной ок. 1 нм (ок. 3 Ьр), в то же время ДНК дуплекс имеет в 50 раз более жесткую структуру (персистентная длина составляет порядка ~50 нм или — 150 пар оснований) (Wang Y, et al. J Phys Condens Matter. 2009;21(33):335103). Таким образом специфическое узнавание комплементарных фрагментов однонитевых ДНК приводит в быстрому повышению «механической жесткости» (увеличению персистентной длины) молекулы, которая распрямляется подобно молекулярной пружине и создает основу для придания ей лиганд-чувствительных свойств. Кроме того, огромный экспериментальный материал, описывающий аффинность и селективность нуклеиновых кислот к широкому спектру соединений - от ионов и гаптенов до полноразмерных белков и нуклеиновых кислот,6 также говорит в пользу использования олигонуклеотидов для подобных УМ.
Таким образом, согласно одному из воплощений данного изобретения, чувствительный элемент (распознающий олигонуклеотид) предлагаемого наноагента-УМ представляет собой олигонуклеотид, один конец которого ковалентно закреплён на наночастице, а второй, модифицированный сигнальным рецептором, спрятан в его клубке. Большое различие в гибкости ДНК в выключенном (одноцепочечная ДНК) и включённом (дуплекс с инпутным олигонуклеотидом) состоянии системы создаёт основу для функционирования материала. Однако для фиксирования ДНК -клубка в исходном скрученном состоянии и для противодействия внешним неспецифическим факторам (например, флуктуациям температуры или pH среды), необходимо ввести некие дополнительные силы, стабилизирующие систему в выключенном состоянии. Роль такого «фиксатора» или «замка» могут выполнять силы межмолекулярного взаимодействия между молекулой ДНК и материалом наночастицы. При наличии такого эффекта отдельным фрагментам ДНК будет энергетически выгодно «прилипать» к поверхности наночастицы и тем самым удерживать молекулярный клубок в свернутом состоянии, а при его «распутывании» вследствие образования дуплекса - позволять ДНК беспрепятственно и быстро распрямляться (Фиг.2).
Важно отметить, что правильный баланс между упругой силой распрямления ДНК- дуплекса и противодействующей ей силой сцепления «замка» с опорной наночастицей является решающим фактором обеспечения высокой чувствительности всей системы. Слишком сильный «замок» снизит чувствительность системы, а слишком слабый не сможет предотвратить ложное «включение» материала в отсутствие входного сигнала.
Аналогичная проблема существует в технологии молекулярных маяков (Mastronardi Е, et al. Sensors. 2014; 14(2):3156-3171), где в качестве «замка» используется образование нуклеиновыми кислотами внутренних дуплексов, или «шпилек» (hairpin structures), а формирование выходного сигнала происходит вследствие разрушения дуплекса специфическим олигонуклеотидным зондом (аналитом) по механизму strand displacement (Stobiecka М, et al . J Phys Chem B. 2016;120(21):4782-4790).
При всей элегантности данного подхода, скорость этого многостадийного процесса даже в случае гомогенной реакции относительно невелика (порядка 105 М-1с-1) (Gao Y. Nucleic Acids Res. 2006;34(11)3370-3377) и определяется в основном скоростью самой медленной его стадии - разрушением старых и образованием новых пар оснований. В более же типичном для экспресс-методов гетерогенном формате и использовании стабильных шпилек общая скорость процесса может уменьшаться на два и более порядков (Gao Y. Nucleic Acids Res. 2006;34(11)3370-3377). Практика повышения температуры до 45-52° С для увеличения скорости прямой реакции (Stobiecka М, et al. Anal Chem. 2012;84(11):4970- 4978), применима только для in vitro and post vivo applications и не всегда приводит к успеху, поскольку нередко вызывает ускорение обратных процессов и приводит к общему падению эффективности гибридизации (Stobiecka М, et al. J Phys Chem В. 2016;120(21):4782-4790; Ouldridge ТЕ, et al. Nucleic Acids Res. 2013;41(19):8886-8895). Таким образом, при среднем времени проведения экспресс-анализа 15-20 минут прореагировать успевает лишь небольшая (порядка 10%) доля исходных олигонуклеотидов. Это обуславливает фундаментальное ограничение на использование molecular beacons для создания высокочувствительных экспресс-тестов и определяет относительно низкую чувствительность существующих методов (с пределами детекции порядка 100 пМ) (Мао X, et al. Chem Соттип. 2009 ;(21)3065), несмотря на высокий потенциал используемых оптических (флуоресцентных) методов регистрации. Ситуация еще более усложняется при использовании конъюгатов с высокой поверхностной плотностью сорбции олигонуклеотидов, например, на поверхности золотых наночастиц (Steel АВ, et al. Anal Chem. 1998;70(22):4670-4677). В этом случае кооперативные межмолекулярные взаимодействия приводят к еще большему увеличению энергетического барьера, и, как следствие, дальнейшему уменьшению эффективности гибридизационных процессов (Steel АВ, et al. Biophys J. 2000;79(2):975-981).
Таким образом чувствительность метода молекулярных маяков ограничена высокоэнергетичной природой дуплексного «замка». Предлагаемая нами идея позволяет обойти это ограничение путем реализации “нано-маяков”, в котором для фиксации системы в выключенном состоянии достаточно использовать неспецифические и намного менее энергетические взаимодействия НК с поверхностью наночастицы. Благодаря более низкому энергетическому барьеру «замка» такая конструкция способна проявлять более высокую чувствительность к инпуту (входному сигналу), и в то же время стерическое экранирование рецептора полимерным «клубком» не допускает неспецифического «включения» материала. Метод универсален, прост и предсказуем в разработке, не требует этапа кропотливого подбора длины и олигомерного состава вторичных структур, характерного для технологии молекулярных маяков - все исследованные нами произвольно выбранные последовательности распознающих олигонуклеотидов в той или иной мере проявляли эффект маскирования и, следовательно, были пригодны для конструирования аналитической системы требуемой специфичности.
Кроме того, в одном из вариантов реализации данного изобретения, дополнительным источником сил взаимодействия распознающего олигонуклеотида с наночастицей может быть известный эффект повышенного сродства аденозина к поверхности золота. При определенных условиях - например, высоком локальным содержании аденозина - сила этого взаимодействия столь высока, что способна существенно влиять на гибридизационные свойства всей биомолекулы, вплоть до полного их блокирования (Herne ТМ, et al. J Am Chem Soc. 1997;7863(13):8916-8920). В различных вариантах реализации данного изобретения могут быть использованы одна, две и более аденозиновые группы на конце распознающего олигонуклеотида предлагаемого УМ, которые надежно удерживают ее в скрученном состоянии и фиксируют ВЫКЛ состояние системы.
Кроме того, метод позволяет проводить детекцию аналита в гомогенном формате: (описание формата). Известно, что золотые наночастицы (ЗН) могут быть легко конъюгированы с тиолированными ДНК посредством взаимодействия между золотом и серой. В качестве модели выходного рецептора, связывающего мишень, мы выбрали биотин из-за его высокого сродства к стрептавидину и широкого применения в различных аналитических анализах и концепциях доставки лекарств.
Одной из наиболее привлекательных черт предлагаемого подхода также является крайне высокая чувствительность метода (вплоть до аттомолей целевой НК), что связано с устранением проблемы высокого энергетического барьера разрушения предварительно сформированного НК-комплекса, являющегося необходимым элементом других подходов, использующих strand displacement.
Маскирование концевой группы распознающего олигонуклеотида обусловлено по крайней мере одним из следующих описанных в литературе эффектов или их комбинацией - (i) гибкость и, следовательно, «скрученность» олигомерной последовательности и (ii) нековалентное взаимодействие отдельных ее фрагментов с поверхностью золотой наночастицы. Очевидно, что относительный вклад обеих систем может варьироваться в зависимости от природы поверхности наночастиц, длины и состава нуклеотида. Так, влияние вклада гибкости полинуклеотидной цепи будет доминировать в отсутствие взаимодействия с поверхностью золота в описанном выше случае использования полимерных магнитных частиц (Фиг.2). Полученные данные указывают на то, что величина данного эффекта относительно небольшая и определяется персистентной длиной цепи молекулы НК.
Наоборот, при использовании золотых наночастиц вклад нековалентного взаимодействия отдельных фрагментов цепи с поверхностью частицы становится преобладающим. Известно, что аденозин, находящийся на конце исследуемых нами фрагментов распознающего олигонуклеотида, имеет столь высокое сродство к поверхности золота, что способен существенно влиять на гибридизационные свойства всей биомолекулы. В пользу доминирования данного эффекта, в частности, свидетельствует исчезновение маскирования концевого биотина после обработки алкантиолами (меркаптоэтанолом или меркаптогексанолом) (Фиг.З), которая приводит к удалению нековалентно связанных фрагментов НК с поверхности коллоидного золота (Levicky R, et al. J Am Chem Soc. 1998;120(38):9787-9792). В то же время, влияние таких факторов, как температура, pH, ионная сила раствора или присутствие белков и геномной ДНК, хотя оказывают некоторый эффект, но не приводят к заметному восстановлению доступности биотина на конце цепи (Фиг.4-7).
В одной из реализаций изобретения создается УМ с регулируемой аффинностью к стрептавидину, которая контролируется наличием аналита (например, олигонуклеотида) в растворе. В качестве формата для функционирования УМ был использован предложенный Mirkin et al. простой метод гомогенного анализа, основанный на визуальной регистрации специфической агрегации золотых наночастиц под действием иммобилизованных биомолекул (С. A. Mirkin, et al. Nature 1996, 382:607). Далее, согласно варианту изобретения, УМ представляет собой золотую наночастицу (ЗН или GNP - от англ gold nanoparticle) с молекулами распознающего олигонуклеотида (B1S - см. все последовательности олигонуклеотидов на Фиг.8 и информацию об их вторичной структуре на Фиг.9; кроме того, данные могут быть получены с помощью стандартных алгоритмов NUPACK, mFold, UNAFOLD, и др.), прикрепленными к ней обоими своими концами и образующий свернутую структуру, у которой отсутствовали выраженные вторичные структуры (шпильки) (Фиг.10). Для обеспечения необходимой гибкости цепи и с учетом ее зависимости от плотности упаковки молекул на поверхности наночастиц (А. В. Steel, et al. Biophys. J. 2000, 79:975), в качестве одного из вариантов реализации изобретения в качестве длины распознающего олигонуклеотида была использована величина 29 н.о. (нуклеотидных оснований). При этом один из концов ДНК - «опорный» - был скреплен с GNP прочной связью при помощи концевой тиольной группы. На другом конце распознающего олигонуклеотида находился «замок», роль которого выполняла одна концевая аденозиновая группа. Кроме того, дополнительным источником сил, «фиксирующих» молекулярный клубок, являлся сам биотин, имеющий заметное сродство к золотой поверхности (Н. М. Laborde, et al. Thin Solid Films 2013, 540:221).
В отсутствие аналита концевой биотин оказывается стерически скрыт от взаимодействий со своим лигандом (Str-стрептавидином), что соответствует неактивному состоянию ВЫКЛ. В гомогенном формате анализа о наличии такого экранирования судят по отсутствию взаимодействия УМ (GNP:B1S) с конъюгатом GNP со стрептавидином (GNP:Str), что визуально проявляется в отсутствии изменения цвета раствора.
Для созданной системы не наблюдали изменения цвета по крайней мере в течение 24 часов (Фиг.11), в то время как введение специфического «распрямляющего» аналита (lsp) приводило к переходу системы в состояние ВКЛ и появлению синего окрашивания уже в течение первого часа проведения реакции (Фиг.11), а после инкубации в течение ночи - к практически полному обесцвечиванию раствора вследствие агрегации и седиментации GNP (Фиг.11). При этом, судя по неизменности цвета в контрольных экспериментах (при полном отсутствии аналита или в присутствие неспецифичной ДНК последовательности Ins), переключение между состояниями УМ имело высокоспецифичный характер.
Исследование изменения гидродинамического диаметра структуры 3HB4S до и после взаимодействия со специфической и неспецифической входной ДНК с помощью метода анализа траектории наночастиц (NTA) подтвердило нашу гипотезу о «скрученном» состоянии полимерных молекул на поверхности СМ и их «распрямлении» при специфической гибридизации, которая принципиально отличается от механизма работы молекулярных маяков. Только взаимодействие со специфической входной ДНК (комплементарная к B4S) привело к статистически значимому увеличению диаметра частиц от ок. 45 ± 3,5 до 60 ± 4,5 нм. Это хорошо согласуется с теоретическими расчетами. В самом деле, такое изменение радиуса в 7,5 нм кажется разумной разницей между размерами ДНК в скрученном и развернутым состояниями (ДНК-дуплекс 29 и. о. ~ 9,6 нм + 2,5 нм, максимальная длина гибких линкеров концевых групп тиола и биотина).
Изобретение позволяет детекцию аналита в других форматах, не только гомогенных, но и гетерогенных - например в формате иммунохроматографического анализа (ИХА) или иммуноферментного анализа (в микротитрационных планшетах), а также с использованием иных твердых фаз, на которых иммобилизован синальный лиганд. Рассмотрим одно из воплощений метода в формате ИХА. Данный анализ является хорошо известным и клинически-проверенным подходом к проведению диагностики in vitro. Хотя в настоящее время ИХА в основном используется для обнаружения белков и малых молекул, высокая скорость анализа, доступность и простота использования делают его чрезвычайно привлекательным для быстро развивающейся области экспресс-анализа ДНК.
Для изучения универсальности изобретения, мы убедились, что эффект переключения аффинности у СМ быть достигнут для различных: i) распознающих олигонуклеотидов и разлиных аналитов; ii) наночастиц; iii) сигнальных рецепторов; iv) сигнальных лигандов.
ИХА анализ проводили следующим образом. После короткой (10 мин) предварительной инкубации СМ со специфической или неспецифической входной ДНК (аналитом) в смесь погружали предварительно изготовленную полоску ИХА со стрептавидином, нанесенным в виде тонкой линии в центре мембраны. Переключение системы в активное состояние (ВКЛ) оценивалось при помощи оптической регистрации интенсивности окрашивания тестовой линии, вызванной образованием слоя ЗН (Фиг.12).
Используя формат ИХА, мы доказали высокую специфичность метода и агентов. Для этого мы использовали распознающие олигонуклеотиды с тремя произвольными последовательностями: в дополнение к B1S, вторая «случайная» (B2S) последовательность имела тот же размер, что и исходная B1S (29 нт) с одиночными аденозинами на обоих концах. Третья (B3S) последовательность представляла собой фрагмент гена бактериальной устойчивости к антибиотику ванкомицину, VanB (34 нт) (Фиг. 8-9).
На Фиг. 13 приведено сравнение чувствительности трех наборов ИХА тест-полосок для обнаружения полностью комплементарных последовательностей при помощи СМ на основе BIS, B2S и B3S. Как видно из полученных данных, предложенная концепция дизайна СМ сохраняет свой функционал и для случайно построенных последовательностей, хотя чувствительность варьируется. Различия в LOD могут быть связаны с изменениями эластичности «пружины» молекулярной ДНК.
С другой стороны, тот факт, что наилучшая чувствительность (LOD = 5 пМ) была достигнута для связывающей ДНК, имеющей вторичную структуру с промежуточным значением свободной энергии (около -0,9 ккал моль-1), является весьма интересным. Данное значение косвенно отражает гибкость полимерной цепи и может быть использовано в качестве критерия для дальнейшей оптимизации ее структуры. В результате были реализованы агенты, которые были максимально приближены к исходной структуре B1S и имели энергию в диапазоне от -1,0 до 1,5 ккал/моль. Оказалось, что даже замена единственного нуклеотида GHa С (B4S) на конце полимерной цепи помогла улучшить LOD ИХА до очень хороших показателей 110 фМ входного олигонуклеотида (Фиг. 14). Результаты анализа имели высокую воспроизводимость и специфичность (Фиг. 15).
Важно отметить, что при этом распознающий олигонуклеотид B4S даже несмотря на присутствие в ней низкоэнергетической (-1,44 ккал моль-1) структуры, напоминающей шпильку молекулярного маяка, нельзя рассматривать как функциональный маяк. Так, флуоресцентный аналог данной ДНК (5’- СуЗ, 3’- BHQ2) показал чувствительность, по крайней мере, на 4 порядка меньшую, чем у маяка на основе наночастиц с той же последовательностью (Фиг. 14). Кроме того, у маяка на основе наночастиц был как минимум на 5 порядков больший линейный динамический диапазон концентрации (Фиг. 16).
Чтобы показать универсальность метода с точки зрения используемых частиц, мы изучили поведение аналогичной ДНК системы с магнитными микросферами (РММ) с полистирольным покрытием вместо ЗН. Был разработан иной подход к количественной оценке степени доступности биотина. Для этого мы использовали немагнитные индикаторные частицы ферригидрита 200 нм, конъюгированные одновременно со стрептавидином и пероксидазой хрена (FeH-Str:HRP). В приведении в непосредственный контакт, биотин на поверхности РММ мог связывался со стрептавидином индикаторных частиц, а ферментативная метка HRP позволяла бы количественно оценить степень такого связывания.
Агенты на основе РММ, конъюгированные с связывающей ДНК B4N (5'-биотин, 3'- амино-модифицированная версия того же ДНК зонда, что и использованный выше), показали существенный, но значительно меньший по амплитуде эффект маскирования выходного рецептора по сравнению с эффектом, полученным с ЗН (Фиг. 17). Это доказывает, что «закручивание» связывающей ДНК достигается не посредством внутримолекулярных взаимодействий (из-за неучтенных вторичных структур), а посредством взаимодействия связывающей ДНК и / или выходного рецептора с поверхностью наночастиц. Поэтому важно отметить, что это явление не ограничивается наночастицами золота и может быть настроено под другие типы поверхностей.
При замене относительно крупных индикаторных частиц FeH-STR:HRP размером 200 нм на небольшой 15-нм молекулярный конъюгат стрептавидина с HRP, эффект «маскировки» биотина был еще менее выраженным (Фиг. 17). Следовательно, хотя наш подход позволяет контролировать связывание СМ с большими мишенями, молекулярные входы (даже большой молекулярной массы) имеют беспрепятственный доступ к входным ДНК рецепторам, что делает такой СМ такого дизайна очень перспективным для диагностики in vitro и направленной доставки лекарств.
Вклад другого компонента «замка», а именно взаимодействия терминального аденозина с ЗН, был изучен с помощью СМ, созданного на основе той же связывающей ДНК B4S, но с различным числом (0, 1, 2, 3) терминальных оснований аденозина на 5'-конце (Фиг. 8-10). Мы обнаружили, что эффект маскировки биотина практически полностью исчезал в отсутствие терминального аденозина, но восстанавливался при одной и более концевой группе (Фиг. 25).
Ключевая роль «замка» в проявлении эффекта маскирования была дополнительно подтверждена инкубацией СМ с меркаптоспиртами (2-меркаптоэтанолом и 6- меркаптогексанолом), которые должны вытеснять слабо связанную с поверхностью наночастиц фрагмент связывающей ДНК с концевым «замком» с поверхности золота. Действительно, даже короткая предварительная инкубация конъюгата 3HB4S с обоими меркаптоспиртами необратимо переводила агент в состояние ВКЛ, тем самым заставляя биотин связываться со стрептавидином на тест-линии и снижала СМ способности к переключению аффинности (Фиг. 3).
В то же время, молекулярный «замок» продемонстрировал заметную устойчивость к влиянию неспецифических биохимических сигналов в различных средах. В частности, мы использовали ИХА для тестирования характеристик СМ в следующих условиях: i) ионная сила (0,1-1, 5 MNaCl); ii) pH 4-9; iii) содержание белка (0-5% БСА или 0-50% пулированной сыворотки крови мыши); iv) наличие высоких концентраций неспецифической ДНК (10 мг/л фага лямбда ДНК, расщепленной эндонуклеазами Alu I, HpySE526 I, Fai I c образованием ДНК различной длины). На Фиг. 4-7 и Фиг. 18 показаны результаты ИХА для СМ на основе связывающей B4S ДНК в разных средах в отсутствие и в присутствии специфической входной ДНК.
Во всех тестируемых условиях, кроме pH = 4, «замок» оставался функциональным, хотя эффект «маскирования» биотина постепенно уменьшался с уменьшением концентрации соли из-за увеличения электростатического отталкивания ДНК от поверхности частицы в растворах с низкой ионной силой. В тоже время, диапазон рабочих условий, может быть увеличен путем использования более положительно заряженных частиц или использования связывающей ДНК с более высоким содержанием концевых аденозинов. Небольшое уменьшение сигнала от СМ в случае реакции со специфической входной ДНК в присутствии расщепленной эндонуклеазами ДНК фага лямбда связано с экранированием поверхности наночастиц большими молекулами ДНК.
Изобретение позволяет реализовывать агенты с другими сигнальными рецепторами. В частности, мы заменили гидрофобный незаряженный биотин на конце связывающего ДНК более гидрофильным и заряженным 6-флуоресцеинамидитом (FAM), чтобы в результате получить конъюгат 3H:F4S. Мы ожидали, что отрицательный заряд и отсутствие выраженного взаимодействия с поверхностью золота сделает СМ на основе FAM менее эффективным в условиях, оптимизированных для материала, меченного биотином. Как и предполагалось, в ранее использованных экспериментальных условиях (pH = 7,4, 1 М NaCl) эффект маскирования существенно снизился: даже в отсутствие входной ДНК частицы 3H:F4S захватывались антителами против (флуоресцеин изотиоцианата) и оседали на тестовой линии ИХА тест-полоски (Фиг. 19). Причиной исчезновения маскирующего эффекта является наличие у FAM большого отрицательного заряда в физиологическом диапазоне pH и, как следствие, его отталкивание от одноименно заряженной поверхности ЗН. При этом, видно, что влияниет pH рабочего буфера на значения сигнала при фиксированной концентрации аналита (комплементарной ДНК). При кислотных значениях pH (фосфатно-цитратный буфер, pH = 4,0) диссоциация карбоксильной группы FAM была почти полностью подавлена (рКа ~ 3,5), а способность СМ переключаться между активным и неактивным состояниями восстанавливалась почти полностью.
Наконец, рассмотрим вопросы, касающиеся свойств самой мишени для СМ, а именно: i) настройка молекулярных свойств мишени привести для повышения чувствительности СМ для диагностических применений in vitro, и ii) нацеливание агентов для специфичного таргетинга эукариотических клеток для целей направленной доставки лекарств.
Касательно вопроса чувствительности, как было показано выше, сродство СМ к его мишени в значительной степени зависит от пространственной организации и доступности эпитопов мишени (см. выше - сравнение эффективности связывания низкомолекулярной мишени Str-HRP в сравнении с большой по размеру наноконструкции FH-Str:HRP на основе наночастиц феррогидрита). Поэтому для повышения чуствительности теста ИХА, реализовали изобретение с использованием другого сигнального лиганда на тестовой линии ИХА полосок. Хотя стрептавидин обладает исключительно высоким сродством к биотину, он имеет своеобразную и не оптимальную молекулярную структуру. А именно, биотин - связывающие компартменты расположены внутри белковой молекулы и, следовательно, для лучшего связывания биотина требуют линкера определенной длины. Фиг. 20 демонстрирует, что при использовании ИХА тест-полосок с нанесенными на них моноклональным анти-биотиновыми антителами (Mab-полоски), нам удалось достичь чувствительности 40 фМ (около 0,8 аттомолей входной ДНК в образце объемом 20 мкл).
Важно отметить, что такая высокая чувствительность СМ сочетается с хорошей избирательностью. Чтобы доказать последнее, мы использовали формат ИХА на основе полосок с нанесенными антибиотиновыми антителами для проверки ответа системы 3HB4S на появление входных ДНК различной длины, которые можно классифицировать по следующим пяти группам: i) полностью не комплементарные; II) частично комплементарные (различной структуры и степени комплементарности); iii) полностью комплементарные; iv) единичные нуклеотидные несоответствия (SNP); v) геномная ДНК фага l, расщепленная тремя разными эндонуклеазами. Мы наблюдали хорошую корреляцию полученного сигнала с теоретическим прогнозом сродства входной одноцепочечной и связывающей ДНК: наноагенты были способны дифференцировать некомплементарную, частично комплементарную и полностью комплементарную ДНК при равных концентрациях, как показано на Фиг. 15. Мы также убедились, что неспецифическая (некомплементарная) ДНК не генерирует какого-либо значимого сигнала во всем диапазоне исследованных концентраций (до 100 нМ), как показано на Фиг. 20.
Кроме того, в одном воплощении метода создают тераностический агент, реализующий лиганд-зависимый клеточный таргетинг (т.е. индуцированный или контролируемый аналитом (входным сигналом)) для направленной доставки лекарств. В одном воплощении, в качестве мишени для таргетинга выбирают HER2/neu, второй рецептор фактора роста эпидермиса человека, который является клинически важным маркером, гиперэкспрессируемым клетками молочной железы, яичников и других клеток. Были созданы агенты для селективного мечения НЕК2/пеи-позитивной клеточной линии рака молочной железы человека SK-BR-3 (в качестве клеточного контроля были использованы НЕК2/пеи-негативные клетки СНО яичника китайского хомячка).
Чтобы обеспечить флуоресцентную оптическую детекцию связанных с клетками агентов, их распознающий олигонуклеотид B4S была сконъюгирован с наночастицами золота вместе с индикаторной ДНК F4S (олигонуклеотид с той же последовательностью, что и B4S, но с БАМ вместо биотина на 3 '-конце). Поскольку, как описано выше, в условиях эксперимента индикаторная ДНК была полностью развернута, ее флуоресценция была постоянной в течение всего эксперимента.
Клеточный таргетинг агентом 3H:B4S:F4S выполнялся в два этапа. Сначала клетки таргетировали антителами против HER2/neu (трастузумаб), конъюгированными со стрептавидином. Затем после отмывания от несвязавшихся молекул конъюгата, клетки инкубировали с GNP:B4S:F4S в присутствии или в отсутствии специфического аналита (входного олигонуклеотида). Эффективность таргетинга (нацеливания) подтверждали при помощи визуализирующей проточной цитометрии.
На фиг.21 представлены данные, подтверждающие высокую эффективность и специфичность клеточного таргетинга при помощи сконструированного наноагента с использованием конъюгата стрептавидин -трастузумаб. Визуализирующая проточная цитометрия и сканирующая электронная микроскопия продемонстрировали надежное и специфичное включение/выключение агентов под действием специфичного аналита (входной ДНК). В то время как агенты практически не связывались с неспецифическими клетками СНО как в присутствии, так и в отсутствие входной ДНК, взаимодействие с линией SK-BR-3 происходило только в присутствии специфичной входной ДНК. Агенты также сохранили свою селективность по отношению к входной ДНК последовательности. На Фиг. 22 показана хорошая корреляция между таргетингом клеток SK-BR-3 и теоретически предсказанной аффинностью связывающей ДНК по отношению к протестированным входным олигонуклеотидам (с различной степенью комплементарности, длиной и структурой).
Более того, при облучении клеток светом на длине волны максимум поглощения золотых наночастиц (за счет эффекта локализованного поверхностного плазмонного резонанса), золотые частицы оказывали гипертермический эффект на клетки, в результате чего погибали только лишь специфичные клетки (SK-BR-3) в присутствии специфичного аналита по результатам цитометрии (окрашивание пропидий йодид-аннексии V) и МТТ- теста.
Различные аспекты
Методы иммобилизации связывающих рецепторов на мембране хорошо известны. Как правило, тестовый и контрольный связывающие рецепторы наносятся на мембрану параллельными линиями на расстоянии друг от друга. Растворы с необходимыми веществами в соответствующих буферах наносятся на тестовые полоски с помощью автоматизированных дозаторов. После высушивания на воздухе в течение необходимого времени, проводят блокировку мембраны в подходящем буфере и хранят в эксикаторе перед сборкой тест-полоски в единое целое.
Скорость проведения анализа с помощью предлагаемого изобретения значительно выше стандартных методов анализа при сохранении точности и достоверности результатов. На измерение в данном случае в среднем уходит от 10 до 300 сек. Тем не менее, возможно увеличить чувствительность, если использовать большее время проведения анализа. Кроме того, принцип данного изобретения позволяет проводить прямое измерение определяемого нуклеиновой кислоты в качестве аеалита без необходимости её амплификации при условии, что ее концентрация выше предела детекции, и связанный с ней сигнал может быть зафиксирован, например, невооруженным глазом.
Измерения с использованием метода в рамках данного изобретения могут проходить как в жестких, так и в мягких условиях. Под «жесткими» условиями подразумеваются такие значения температуры, ионной силы, а также наличие других соединений, при которых происходит гибридизация нуклеиновых кислот. В условиях «высокой жёсткости» гибридизация будет происходить только для нуклеиновых кислот, имеющих высокое содержание комплементарных азотистых оснований. Таким образом, мягкие условия требуются в том случае, когда необходима гибридизация или отжиг не полностью комплементарных нуклеиновых кислот. Специалистам известен целый ряд методов создания мягких условий для протекания гибридизации. Гибридизация же в жёстких условиях возможна только в случае полной комплементарности последовательностей. Гибридизация в менее жёстких условиях возможна для последовательностей с менее чем 100% идентичностью. Изменения условий среды, такие как снижение концентрации соли или повышение температуры, могут позволить уменьшить жёсткость условий гибридизации. Ужесточение условий гибридизации можно добиться за счет снижения ионной силы или повышения температуры гибридизации.
Таким образом, в одном из вариантов реализации данного изобретения возможно проводить одностадийное, полнофункциональное определение специфических молекул ДНК или РНК в иммунохроматографическом формате анализа, при котором все необходимые реактивы находятся на тест-полоске в безводном виде. С другой стороны, данное изобретение дает возможность прямого определения НК без необходимости их амплификации и предоставляет метод их быстрого обнаружения.
Кроме того, в своих альтернативных вариантах реализации изобретение применимо и для обнаружения НК в условиях повышенной температуры, что расширяет область его использования в различных областях, например, для проведения судебно-медицинской экспертизы. В дополнении к этим преимуществам описанный метод является простым способом детекции нуклеиновых кислот и не требует серьёзных подготовки в этой области, что может облегчить проникновение методов геномного экспресс-анализа в область диагностики у постели больного и по месту оказания медицинской помощи.
Формат анализа / Носители сигнального лиганда
Настоящее изобретение позволяет детектировать НК в разных форматах - как гомогенных, так и гетерогенных и гетерофазных. В частности, примерами гомогенных вариантов считывания анализа могут быть следующие. Метод, в котором сигнальный лиганд (лиганд сигнального рецептора) иммобилизован (связан) с носителем, которым является другая наночастица. При этом, ассоциацию аналитического агента с носителем сигнального лиганда можно регистрировать за счет методов определяющих изменение размера наночастиц в растворе (динамического светорассеяние, метод NTA - nanoparticle tracking analysis и т.п.), оптическими методами основанными на метода поверхностного плазм онного резонанса (например, если и аналитический агент, и носитель сигнального лиганда содержат золотые наночастицы или частицы с золотой поверхностью, например, магнитно-золотые кор-шелл структуры). Кроме того, гетерофазными вариантами проведения анализа могут быть хроматографические методы (например, в формате тонкослойной хроматографии (lateral flow test strips), микрочиповые и микрофлюидные методы (в которых детектируют количество связавшихся с твердой фазой аналитических агентов, способных быть детектируемыми оптическими, магнитными или иными методами).
Отметим, что под «детектированием количества связавшихся наночастиц упомянутого аналитического агента с упомянутым сигнальным лигандом как меры содержания аналита в упомянутом образце» подразумевается, что в анализе принимает агент (включающий в себя наночастицы) в статистическом смысле, т.е. в анализе участвует множество (суспензия, коллоидный раствор) наночастиц агента (или многих агентов). Т.е. при определении количества связавшихся частиц для опредлеения содержания аналита смотрят на связывание агентов (частиц) в статистическом смысле - чем больше частиц свяжется, тем больше присутствовало аналита. При этом количественное трактование содержания аналита как правило производят на основе сравнения с калибровочной кривой. Данное изобретение также позволяет производить анализы без калибровочной кривой, например, в формате ДА/НЕТ.
Аналитическая твердая фаза
Кроме того, в одном воплощении изобретения, распознающий олигонуклеодит связан с аналитической твердой фазой. В этом, случае аналитическая твердая фаза служит в первую очередь носителем, с которым могут связываться посредством взаимодействия с сигнальным рецептором различные регистрируемые метки - флуоресцентные, люминестцентные, магнитные, радиоактивные, продуцирующие синглетный кислород (которые может вызывать свечение молекул, иммобилизованных на твердой фазе), и другие известные метки, допускающие их детекцию теми или иными методами. Такая реализация изобретения имеет большие преимущества с точки зрения создания мультиплексных систем - например, при одновременном использовании различных распознающих олигонуклеотидов с одним и тем же сигнальным рецептором. В этом случае, после связывания аналитов, например, в пространственно различных участках аналитической твердой фазы различными распознающими олигонуклеотидами, высвобожденные (обнаженные, доступные) сигнальные рецепторы одного и того же типа способны связываться с одной и той же сигнал-продуцирующей меткой (системой), в т.ч. любой из перечисленных выше. Таким, образом, в отличии от сэндвич форматов (в которых каждый распознающий элемент нуждается в специфической «проявочной» системе), в данном воплощении изобретения нужна только одна метка. Это дает снижение неспецифики, повышение специфичности и селективности анализа, а также улучшает параметры чувствительности системы.
Аналиты
Настоящее изобретение позволяет детектировать широкий круг молекулярных аналитов, включая нуклеиновые кислоты и полинуклеотидные последовательности, в том числе фрагменты и целые молекулы ДНК, а также транспортные, матричные, рибосомальные, микро РНК; синтетические аналоги нуклеиновых кислот, такие как пептидные НК, морфолиновые, закрытые, гликолевые и треозо-НК; а также, за счет использования особенных распознающих олигонуклеотидов (например, аптамеров) также молекулы ненуклеотидного состава, например, белки и пептиды, гормоны, низкомолекулярные физиологические регуляторы, иные гаптены, ионы металлов, и т.д.
Мул ът иплексност ь
Данный метод применим и для определения нескольких аналитов на одной мембране. В простейшем формате тестовая полоска может быть разделена на отдельные полоски, где будут нанесены отдельные зоны связывания для обнаружения различных аналитов. Кроме того, также возможно реализовать одновременную детекцию разных аналитов в одном образце. Для этого, например, отдельные зоны связывания могут быть нанесены на одну мембрану, но в её разных участках.
Специфические пары рецептор/лиганд
В рамках данного изобретения могут быть использованы различные специфические пары типа «рецептор/лиганд», применимые для создания сигнальных (репортерных) конъюгатов и связывающих их рецепторов, а также распознающих олигонуклеотидов с их аналитом. Компоненты таких пар, применимые в данном изобретении, могут быть как иммунного, так и неиммунного типа. Примерами иммунного связывания могут быть системы, основанные на взаимодействии антиген/антитело или гаптен/антигаптен. Поликлональные, моноклональные антитела или их иммуно-активные фрагменты могут быть подготовлены стандартными методами, известные специалистам в данной области. Термины "иммуно-активный фрагмент антитела" или "иммуно-активный фрагмент" относятся к частям молекул антител, которые содержат область специфического связывания. Такие фрагменты могут быть фрагментами Fab, которые определяются как фрагменты, лишенные части Fc, например Fab, Fab' и F(ab)2 фрагменты, или могут быть так называемыми "полумолекулярными" фрагментами, полученными восстановительным расщеплением дисульфидных связей, соединяющих тяжелые цепи исходного антитела. Если антиген, входящий в состав связывающейся пары, не является иммуногенным, например, гаптен, он может быть ковалентно связан с дополнительным белком-носителем, чтобы сделать его иммуногенным.
К неиммунным специфическим парам относятся системы, в которых два компонента проявляют естественную аффинность друг к другу, не являясь при этом антителом и антигеном. Среди известных примеров неиммунных пар можно назвать биотин и авидин, биотин и стрептавидин, фолиевая кислота и белки, связывающие фолаты, комплементарные нуклеиновые кислоты, белки A, GH иммуноглобулины и т.д. К ним также могут быть причислены пары, образующие ковалентные связи друг с другом: например, пары сульфгидрильные группы/ малеимиды и галоацетильные производные) и амино- группы/изотиоционаты, эфиры сукцинимида и сульфонилгалогениды и т.д. (М. N. Bobrow, et al., J. Immunol. Methods, 1989,125:279).
Репортеры и репоптерные (сигнальные) конъюгаты
Функцией системы формирования сигнала (сигнальной или репортерной системы) на поверхности наночастицы является продуцирование некоторого продукта, который способен производить детектируемый сигнал при взаимодействии с анализируемым веществом (аналитом), пропорциональный количеству аналита в исследуемом образце. Как правило, система формирования сигнала включает репортерный конъюгат, состоящий из антитела или какой-либо части специфической пары «рецептор/лиганд» и присоединённых к ним радиоактивной и ферментной меток, индикаторной частицы или флуорофора. Например, в одном из вариантов реализации данного изобретения индикаторная метка ковалентно связана с распознающим олигонуклеотидом, который иммобилизован на поверхности золотой наночастицы.
В качестве ферментных меток, подходящих для использования в составе репортера, можно использовать ферменты различных классов (оксидоредуктазы, трансферазы, гидролазы, лиазы, изомеразы, лигазы), а также пероксидазу, глюкозооксидазу, фосфатазу, эстеразу, гликозидазу. В качестве примеров конкретных соединений можно также назвать щелочную фосфатазу, липазу, бета-галактозидазу, пероксидазу хрена и эстеразу печени свиньи. Для получения дополнительных функциональных возможностей фермент можно ковалентно связать с антителом согласно известным методикам (D.G. Williams, J. Immun, Methods, 1984, 79:261). В большинстве примеров использования ферментов, их применение основано на изменении окраски растворов продуктами их активности, что позволяет получать детектируемый сигнал. Типичными примерами подобных пар фермент/субстрат, используемых в современных биологических приложениях, являются бета-галактозидаза с ферроцианидом калия или феррицианидом калия, пероксидаза хрена с 3,3'- диаминобензидином (ТМБ) и др. (Р. Tijssen, eds., R.H. Burton and P.H. Van Knippenberg, 1988).
Детектируемая нуклеиновая кислота (аналит)
Термин «детектируемая нуклеиновая кислота» обозначает любые НК, которые могут быть обнаружены в одной из реализаций данного изобретения. Целевые НК могут быть выделены из любого источника, включая различные бактериальные или вирусные патогены, из биологического материала людей и животных при диагностике генетических заболеваний и т.д. В качестве целевой НК могут выступать ДНК, РНК или их синтетические аналоги. Кроме того, перед проведением анализа детектируемая НК может подвергаться амплификации (см. ниже). В общем случае детектируемая НК может быть выделена из любого источника, который адекватно отражает ее содержание в исследуемом образце.
Длина целевой НК может варьироваться от 10 до 5000 оснований. При амплификации при помощи полимеразной цепной реакции (ПЦР), предпочтительна длина от 30 до 1000 оснований и от 100 до 500 оснований при амплификации метолом лигазная цепная реакция (ЛЦР). Определяемая НК может быть двуцепочечной или одноцепочечной.
Методы амплификации нуклеиновых кислот
Как отмечалось выше, в одной из реализаций метода согласно данного изобретения, предлагаемый метод применим для детектирования как аплифицированных, так и неамплифицированных НК. При этом независимо от наличия данного этапа предлагаемый метод проще и удобнее ранее упомянутых методов детекции на основе флуоресценции, поскольку предполагают использование сухих реактивов, практически снимая проблему хранения и пробоподготовки, характерную для оптических метолов регистрации флуоресцентного сигнала.
В дальнейшем под термином «амплификация» будет подразумевается процесс, позволяющий увеличить количество копий, а, следовательно, и концентрацию, исходной нуклеотидной последовательности. К методам амплификации, применимых в контексте данного изобретения, относятся, например, полимеразная цепная реакция, лигазная цепная реакция, методы NASBA (от англ «nucleic acid sequence-based amplification»; Патент США 5,130,238), SDA (от англ «strand displacement amplification»; Walker, et al, PNAS 1992, 89: 392), LAMP (от англ «loop mediated isothermal amplification»; Патент США 6,410,278), CRCA (от англ «cascade rolling circle amplification»; Патент США 5,854,033 и 5,942,391), RAM (от англ «ramification amplification»; Патент США 5,876,924 и 5,942,391), RAPD (от англ. «Random Amplified Polymorphic DNA») а также методы, использующие QP-репликазу (РСТ публикация WO 87/06270). Кроме того, применимы и другие модификации приведенных выше методов или их комбинация.
Полимеразная цепная реакция и лигазная цепная реакция отличаются высокой чувствительностью и специфичностью, позволяя проводить амплификацию целевой нуклеиновой кислоты в сложных смесях нуклеиновых кислот и белков. Такие метолы обладают по крайней мере двумя крайне важными особенностями. Во-первых, это специфичность процесса репликации, в результате которой информация даже от одной последовательности может быть специфически растиражирована в миллионы копий несмотря на присутствие комплексной смеси других НК и белковых молекул в высокой концентрации. Во-вторых, данные процессы характеризуются высокой чувствительностью. Например, при помощи повторных циклов амплификации возможно увеличение числа копий целевой НК в 106 и более раз
Некоторые образцы могут ингибировать реакцию амплификации и тем самым вызывать ложноотрицательные результаты. Поэтому в подобных методах зачастую необходимо проводить положительные контроли, амплифицируя не только интересующий исследователя образец, но и контрольную НК известной последовательности, которую по окончании анализа экстрагируют. Примером такого позитивного контроля может быть лямбда последовательность ДНК. В настоящее время методами прямого детектирования целевых последовательностей патогенов в образце можно обнаружить примерно 103 клеток/мл, в то время как логарифмическая амплификация заданных последовательностей снижает этот порог детекции до 1-5 клеток на 100 мл (Bej et al., Арр. Environ. Microbiol., 19906 56:307).
Введение сигнального рецептора в состав распознающего олигонуклеотида
В состав распознающего олигонуклеотида на поверхности наночастиц, согласно данного изобретения, можно включать низкомолекулярные соединения-рецепторы, обеспечивающие специфическое связывание с соответствующими молекулярными или биологическими мишенями.
Для целей настоящего изобретения предпочтительными являются рецепторы с молекулярной массой не более 2000 Да, а наиболее предпочтительными - рецепторы с молекулярной массой не более 1000 Да. Рецепторы могут быть включены как в одну, так и в обе нити дуплексной нуклеиновой кислоты, как с 5'-, так и с 3 '-конца, а также возможно связывание с неконцевыми основаниями. Возможно включение любого количества рецепторов, однако для обеспечения максимальной чувствительности анализа предпочтительно связать с рецептором около 10-30% нуклеотидов.
Введение рецепторов в нуклеотидные последовательности может быть достигнуто как при помощи химических или ферментативных методов, так и путем прямого включения меченных нуклеотидных оснований в выбранную последовательность. В предпочтительном варианте связанные с рецептором последовательности могут быть получены путем включения связанных с рецептором нуклеотидных оснований или праймеров в последовательность в ходе полимеразной цепной реакции. Включение рецептора в последовательность может быть достигнуто либо за счет включения модифицированных рецептором (-ами) праймеров или за счет использования меченных рецептором нуклеотид трифорсфатов, содержащих диоксирибозу (dNTP). Меченные рецептором (-ами) праймеры могут быть получены с использованием стандартных методов мечения олигонуклеотидов при помощи цианоэтил фофсфорамидита путем замены выбранных нуклеотидных оснований меченными рецептором фосфорамидитовыми основаниями в ходе синтеза праймеров. В качестве альтернативного варианта для получения праймеров могут использоваться модифицированные нуклеотидные основания, содержащие способный к взаимодействию молекулярный спейсер и рецепторы могут быть химически присоединены к нему после синтеза праймера. Еще один метод предполагает использование связанных с dNTP рецепторов или же амино-модифицированные dNTP, которые могут быть включены в целевую нуклеотидную последовательность в ходе амплификации.
Иммунохроматографические (ИХА) тест-полоски
ИХА тест-полоска представляет собой окружение, в котором происходит анализ с помощью настоящего изобретения. Тест-полоска, как правило, состоит из хроматографического пористого материала и включает зону нанесения образца и зону связывания, как указано выше.
Хроматографические пористые материалы, из которых состоит полоска, как правило гидрофильны и/или принципиально могут быть превращены в таковые, и включают в себя следующие материалы, используемые либо по отдельности либо в сочетании с другими материалами - гранулы неорганической природы, например кремния, сульфата магния, алюминия; природные полимеры, в частности целлюлоза и материалы на ее основе (например, волокнистые полимеры - фильтровальная бумага, бумага для хроматографии и пр.); синтетические или модифицированные природные полимеры, такие как нитроцеллюлоза, ацетилцеллюлоза, поливинилхлорид, полиакриламид, кросс-сшитый декстран, агароза, полиакрилаты и др.; керамические материалы; стекло; и подобные материалы. Для описываемого изобретения предпочитаемым материалом является нитроцеллюлоза.
В предпочтительном варианте мембрана может быть как отдельной структурой в виде листа, нарезаемого на тест-полоски, либо может быть зафиксирована на подложке или твердой поверхности, как, например, при тонкослойной хроматографии.
Связывание рецепторов с поверхностью мембраны может достигаться при помощи хорошо известных методов, описанных в литературе. См. например Immobilized Enzymes, Inchiro Chibata, Halsted Press, New York (1978) и Cuatrecasas, J. Bio. Chem., 1970, 245:3059.
Подготовка тест -полоски
При подготовке тест-полоски для проведения анализа сначала наносятся необходимые реагенты, а затем тест-полоска инкубируется в необходимых буферных растворах.
Буферные растворы и растворители, используемые для описываемого изобретения известны (см. например Weng et al. (Патент США 4,740,468). Как правило значения pH буфера для проведения иммунохроматографического анализа находятся в интервале 4-11, чаще 5-10, для настоящего изобретения предпочтительно 6-9. Значения pH выбираются так, чтобы поддерживать необходимый уровень аффинности между взаимодействующими парами молекул и быть оптимальным для формирования сигнала соответствующей системой. Для достижения желаемого значения pH и его поддержания во время анализа могут использоваться различные буферы. В качестве иллюстрации могут быть приведены боратный, фосфатный, карбонатный, Tris, диэтилбарбитуровый и др. Применение определённого буферного раствора не является значимым для изобретения в целом, однако, при проведении конкретных исследований использование специфичного буферного раствора может быть предпочтительным.
Для проведения анализа в рамках данного изобретения обычно используется постоянное значение температуры. Как правило, для проведения исследования и получения детектируемого сигнала используются значения температуры в интервале 4-50°С., обычно в промежутке 10-40° С., а еще чаще - температуры, близкие к температуре окружающей среды, т.е. 15-25° С.
При использовании в одном из вариантов данного изобретения распознающего олигонуклеотида и ее связывания (гибридизации) с целевой нуклеотидной последовательностью требует условий, способствующих протеканию гибридизации НК. Гибридизация как правило проводится в буферном растворе Фиколла, который также может содержать поливинилпирролидин, БСА, дрожжевую тРНК, неспецифичную ДНК, сульфат декстрана, дитиотреитол и формамид. Гибридизация может происходить как в растворе, так и на твердой фазе, при этом одна нуклеотидная цепь иммобилизуется на тест- полоске в зоне связывания.
Детекция двуцепочечной или одноцепочечной ДНК
Согласно одному из вариантов реализации данного изобретения, для проведения анализа по определению НК можно использовать как одноцепочечные НК, так и двухцепочечные, состоящие из двух комплементарных фрагментов НК, антипараллельных друг другу. В последнем случае непосредственно перед проведением анализа необходимо провести расплетение двухцепоченой последовательности путем воздействия необходимой температуры (температуры плавления НК, характерной для конкретной последовательности нуклеотидов) или другими известными в литературе методами. После расплетения НК проводят ее охлаждение в контролируемых условиях до температуры проведения последующего анализа, включающего миграцию вдоль твердой фазы или иного способа контакта с ней.
Конъюгация с наночастицами
В соответствие с описанием изобретения, микро/нано частицы (далее - частицы) покрываются специфичным к своему аналиту распознающим олигонуклеотидом, и который конъюгирован или находится в комплексе с сигнальным рецептором, способным связываться со своим лигандом. Методы связывания рецептора и/или распознающего олигонуклеотида с коллоидными частицами хорошо известны. Например, в одном из вариантов осуществления настоящего изобретения, частицы обладают заряженными сульфатными группами на их поверхности, которые могут быть модифицированы за счет введения функциональных групп таких как гидроксильные, карбоксильные, амино- и карбоксилатные группы. Функциональные группы могут быть использованы для связывания широкого спектра соединений с нано- и микрочастицами и выбираются на основе их способности связывать выбранный лиганд или рецептор. Конъюгация лиганда с частицами достигается ковалентным связыванием или, если применимо, за счет адсорбции лиганда на поверхность частицы. Методы адсорбции или ковалентного связывания рецепторов с частицами хорошо известные и не требуют дальнейшего описания. Предпочтительным методом иммобилизации лиганда на поверхности частиц является ковалентное связывание.
Форматы Носители сигнального лиганда
Настоящее изобретение позволяет детектировать различные аналиты нуклеотидной и ненуклеотидной природы в разных форматах, включая, но не исчерпываясь, нижеследующими. В случае иммобилизации сигнального лиганда на наночастицах возможно проведение гомогенного анализа с аппаратурной регистрацией сигнала при помощи поверхностного плазмонного резонанса (НИР), динамического светорассеивания (ДЛС), эффекта фёрстеровского переноса энергии (ФРЕТ), хемилюминесценции (ХЛ). При использовании сигнального лиганда в виде отдельных молекул также возможно проведение детектирования в гомогенном формате с использованием ФРЕТ. В варианте реализации данного изобретения с использованием сигнального лиганда в виде твердой фазы возможно использование как безметочных форматов регистрации сигнала на основе эффекта ПНР (например, технология Biacore, GE Healthcare, США), методом спектральной интерферометрии - технология Пикоскоп (Nikitin P.I., et al. Sensors and Actuators B: Chemical 111 (2005): 500-504), так и меточных форматов - иммунохроматографического (ИХА), иммуноферментного (ИФА) анализов и твердофазного анализа на трехмерных пористых структурах. Кроме того, возможным вариантом детектирования факта специфического связывания самого аналитического агента с твердой фазой может быть использование ферментных меток или по оптическому сигналу самого аналитического агента, например, путем применения специально введенных оптических (хромогенных, флуоресцентных, люминисцентных, плазмонных), магнитных, радионуклидных и т.д. меток, а также путем прямых микроскопических исследований методами темного поля или фазового контраста.
Регуляция чувствительности и специфичности
Одним из преимуществ предлагаемого изобретения является возможность тонкой настройки чувствительности и специфичности создаваемого аналитического агента путем регулирования отдельных его параметров и свойств входящих в его состав компонентов. В частности, путем изменения жесткости полимерной цепи распознающего олигонуклеотида или усиливая/ослабляя сродство отдельных ее фрагментов к поверхности наночастицы возможно регулирование силы удерживания распознающего олигонуклеотида в скрученном состоянии («молекулярного замка») и тем самым добиться баланса между специфичностью аналитического агента (т.е. способностью распознающего олигонуклеотида распрямляться исключительно под действием специфических аналитов, но не под действием, например, pH или температуры) и его чувствительностью (т.е. способностью распознающего олигонуклеотида распрямляться при максимального низких концентрациях аналита). К числу таких параметров можно отнести следующие.
Состав распознающего олигонуклеотида. Благодаря изменению состава распознающего олигонуклеотида, т.е. соотношения и порядка следования слагающих его нуклеотидных остатков, возможно изменение жесткости полимерной цепи олигонуклеотида и, следовательно, ее способности распрямляться под действием внешних специфических (наличие комплементарного аналита) или неспецифических (температуры, ионной силы раствора) факторов. Кроме того, изменение состава распознающего олигонуклеотида также приводит к изменению характера и силы взаимодействия самой полимерной цепи с поверхностью наночастицы, на которой она иммобилизована, что будет вносить вклад в способность «молекулярного замка» удерживать распознающий олигонуклеотид в исходном скрученном положении и, в конечном счете, влиять на чувствительность и специфичность всего аналитического агента.
Еще одним вариантом изменения свойств распознающего олигонуклеотида является изменение его длины, что сказывается на жесткости полимерной цепи и, как отмечалось выше, влияет на его чувствительность и специфичность. В тоже время, длина распознающего олигонуклеотида не должна быть меньше ее персистентной длины, т.е. длины, на которой полимерная молекула приобретает необходимую гибкость и способна к приобретению скрученного состояния. Поскольку персистентная длина полимерной цепи зависит сложным образом от состава и количества слагающих ее мономерных звеньев, данное ограничение по длине распознающего олигонуклеотида должно быть установлено в каждом конкретном случае. Например, известно, что для ДНК последовательностей минимальная длина полимерной цепи не должна превышать 24 нуклеотидных остатков (Steel, А. В., et al. Biophysical journal 79.2 (2000): 975-981).
Другим возможным способом регулирования чувствительности и специфичности аналитического агента является выбор концевого сигнального рецептора, который, согласно данному изобретению, также принимает участие в формировании «молекулярного замка» и вносит вклад в удерживание распознающего олигонкклеотида в начальном скрученном положении. В качестве одного из возможных примеров можно привести использование биотина, который, кроме известного высокого сродства к своему лиганду - стрептавидину (или авидину и нейтравидину), способен взаимодействовать с поверхностью наночастиц золота (Т. М. Herne, М. J. Tarlov, J. Am. Chem. Soc. 1997, 7863, 8916) и таким образом дополнительно влиять на прочность «молекулярного замка» и, следовательно, вносить вклад в регулирование чувствительности и специфичности всего аналитического агента.
Далее, согласно одному из вариантов данного изобретения возможно также регулирование чувствительности и специфичности аналитического агента путем изменения количества аденозиновых нуклеотидных остатков непосредственно у распознающего лиганда на конце полимерной цепи. Известно, что аденозин обладает повышенным сродством к ряду поверхностей наночастиц, например, на основе золота (Т. М. Herne, М. J. Tarlov, J. Am. Chem. Soc. 1997, 7863, 8916). Таким образом увеличение количества концевых аденозиновых остатков приведет к «упрочнению» молекулярного замка, что позволит более точно настроить свойства аналитического агента. Данный способ регулирования свойств агента является частным случаем описанных выше вариантов, однако имеет более предпочтительное применение, поскольку обеспечивает более высокую эффективность и легче поддается прогнозированию, чем изменение состава всей полимерной цепи распознающего олигонуклеотида.
Наконец, важными факторами, определяющим специфичность и чувствительность предлагаемого аналитического агента являются условия проведения реакции детектирования, в частности, pH и ионная сила реакционной среды, ее состав и т.д. Действие указанных факторов может влиять как на жесткость полимерной цепи распознающего олигонуклеотида, так и на прочность «молекулярного замка» - т. е. на силу взаимодействия концевого сигнального рецептора или отдельных фрагментов распознающего олигонуклеотида с поверхностью наночастицы, на которой они иммобилизованы. Например, при использовании в качестве сигнальных рецепторов таких относительно гидрофобных и гидрофильных молекул как, соответственно, биотин и флуоресцеин, оптимальные условия функционирования аналитического агента будут различаться. В то время как для не имеющего в своем составе сильно заряженных групп биотина оптимальными будут нейтральные значения pH (7-7.5), относительно сильно отрицательно заряженная при этих значениях pH молекула флуоресцеина будет сильнее отталкиваться от поверхности наночастицы и тем самым условия образования свернутой «молекулярной пружины» и наличия «молекулярного замка» будут нарушены. В последнем случае условием функционирования аналитического агента будет смещение pH среды в сторону меньших значений (около 4-4,5), приводящих к подавлению диссоциации карбоксильных групп флуоресцеина и тем самым восстановлению функции «молекулярного замка» и всего аналитического агента в целом.
Обнаруженный феномен переключаемой конфигурации молекул ДНК на поверхности наночастиц, который позволяет маскировать и презентировать концевые рецепторы в ответ на специфические внешние стимулы, очень привлекателен для разработки сверхчувствительных интеллектуальных наноагентов для различных биомедицинских применений. Достигнутый предел обнаружения 40 фМ находится на уровне типичных выходов целевой ДНК из биопсийных образцов (0,5 аттомоль или 3 c 10л5 копий). Таким образом, данное изобретение может быть использовано для детектирования ДНК без использования стадии амплификации.
Изобретение позволяет воспользоваться преимуществами скорости, доступности и простоты иммунохроматографического формата анализа, который вместе с датчиками глюкозы практически стал синонимом диагностики по месту оказания медицинской помощи. Следовательно, эти СМ могут быть использованы для разработки рутинных устройств для анализа ДНК в полевых условиях, для контроля пищевых продуктов и т. д.
В тоже время, данное изобретение представляет особый интерес в области тераностики, доставке лекарств и т.п. В то время как обнаружение ДНК in vitro имеет много решений с различными плюсами и минусами, такое важное биомедицинское направление как направленная доставка лекарств сильно отстает из-за отсутствия методов, позволяющих осуществлять такую доставку на основе всестороннего анализа маркеров заболевания in vivo. Действительно, такое комплексное заболевание как, например, рак, вряд ли можно правильно диагностировать, основываясь только на результатах одного теста. Между тем, в настоящее время ожидается, что обычные носители для доставки лекарств смогут идентифицировать патогенные клетки (например, в опухолях) всего лишь по единственному маркеру на клеточной поверхности. Неудивительно, что многие исследователи сомневаются в том, что активное нацеливание на опухоли при помощи единственного специфического лиганда (например, антитела) может быть более эффективным, чем пассивный таргетинг нефункционализированными носителями (за счет эффекта улучшенной проницаемости и удержания).
Данное изобретение позволяет осуществить значительный шаг в решении данной грандиозной биомедицинской задачи. Предложенные агенты, способные идентифицировать мишени с помощью нескольких факторов (в нашем случае специфического для мишени лиганда и растворимого ДНК маркера из ее микроокружения), достигают сверхчувствительности к входным сигналам.
Наконец, обнаруженное нами явление переключаемого сворачивания гибких полимерных цепей в результате взаимодействия с твердой фазой также может проявляться и в живых системах. Такое же поведение возможно для углеводов и белков без жесткой третичной структуры на природных твердых фазах, таких как различные мембраны: клеточных ядер, эндоплазматической сети, бактериальных клеточных стенках и т.д. Данное изобретение позволяет идентифицировать моделировать и выявлять такие механизмы для исследования передачи сигналов и метаболизма клеток, а также предоставить возможности для разработки передовых антибиотиков и лекарств.
«Умные» материалы, которые могут переключаться между различными состояниями под воздействием химических сигналов, очень востребованы в биомедицине, где специфическая чувствительность к биомаркерам необходима для точной диагностики и терапии. Превосходная селективность доставки лекарственных средств в злокачественные клетки может быть достигнута с помощью наноагентов, которые остаются «инертными» (неактивными) до момента их «активации» с помощью характерного сочетания сигналов микроокружения (например, метаболитов опухоли, факторов ангиогенеза, микроРНК / ДНК и т. Д.). Тем не менее, несмотря на большое разнообразие и функциональную сложность конструкций умных материалов, их применение в реальных условиях затруднено очень ограниченной чувствительностью к входным (т.е. активирующим) сигналам. Данное изобретение реализует сверхчувствительные умные наноагенты с переключаемой ВКЛ / ВЫКЛ аффинностью к биомедицинским мишеням под действием входных сигналов на основе комбинации наночастиц с полимерными структурами с низкими значениями внутренней энергии вторичной структуры. В изобретении на поверхности агента на основе наночастиц (наноагента) создается слой из специально созданного полимера с гибкими цепями, которые имеют переключаемую структуру и таким образом регулируют доступность своего концевого рецептора для связывания с мишенью. Реализация концепции с использованием ДНК в качестве такой полимерной цепи позволила получить наноагенты, которые обладают способностями к специфическому связыванию с клетками (клеточному таргетингу) под влиянием аналитов (входных сигналов) и оказываются чувствительны к крайне низкой (40 фМ) концентрации ДНК в формате экспресс (15 минут) иммунохроматографического анализа. Таким образом, изобретение доказывает, что поверхностные явления могут обеспечить создание наноагентов с переключаемой аффинностью без ухудшения их чувствительности к входным сигналам. Изобретение важно для биосенсорики, тераностики, направленной доставки лекарств, ин витро диагностики, point-of-care диагностики, создания экспресс-анализов, диагностикумов в полевых условиях, наносенсоров для диагностики по месту оказания медицинской помощи.
Настоящее исследование демонстрирует нестандартный способ передачи сигналов между входным биохимическим стимулом и таргетирующим (сигнальным) рецептором наноагента посредством взаимодействий полимера с поверхностью. Обнаруженное явление позволяет независимо настроить входных и выходных функций умных материалов для различных применений. Изобретение предлагает биосенсоры нового поколения и агенты для сверхточной доставки лекарств.
Наночастицы в составе агента могут быть такими как золотые наночастицы, магнитные наночастицы, другие кристаллические частицы, полимерные наночастицы и микрочастицы, аморфные наночастицы, металл-органические каркасные полимеры, дендримеры, липосомы, квантовые точки, наноалмазы, нанофосфоры, нанорубины. Кроме того, они могут нести в себе различные молекулы, малые молекулы (родамин, флуоресцеин и т.п.), фотосенсибилизаторы , цитостатики и цитотоксические вещества(доксорубицин, паклитаксел, даунорубицин, и другие).
В соответствии с настоящим изобретением, любые средства (вещества), включающие, например, терапевтические (например, противораковые), диагностические (например, контрастные, радионуклиды и флуоресцентные, люминесцентные и магнитные вещества), профилактические средства (например, вакцины) и / или питательные вещества (например, витамины, минералы и т. д.) могут быть доставлены агентами по данному изобретению. Типичный груз для агентов (payloads), который может быть доставлен в соответствии с настоящим изобретением, включают, но не ограничиваются следующими: малые молекулы (например, цитотоксические агенты), нуклеиновые кислоты (например, siRNA, RNAi и mircoRNA, cDNA), белки (например, антитела или ферменты), пептиды, липиды , углеводы, гормоны, металлы, радиоактивные элементы и соединения, лекарства, вакцины, фотосенсибилизаторы, иммунологические агенты и т. д. и / или их комбинации. В некоторых вариантах осуществления изобретения, агент, который должен быть доставлен, полезен для лечения рака (например, рака предстательной железы).
В одном воплощении изобретения, получаемые агенты (в частности на основе золотых наночастиц) позволяют лекарственному или диагностическому средству переходить через гематоэнцефалический барьер для достижения одного или нескольких преимуществ: вещества которые сами по себе не переходят гематоэнцефалический барьер, могут быть перенесены через гематоэнцефалический барьер посредством наночастиц, снижается доза лекарственного или диагностического средства достаточная для достижения терапевтических или детектируемых концентраций, тем самым приводя к уменьшению побочных эффектов.
Примеры фармакологически активных соединений, которые могут быть доставлены к клеточным мишеням с помощью данных агентов, включают соединения по существу нерастворимые в воде перечисленные в разделе «Индекс терапевтических категорий и биологической активности» индекса Merck (12th Ed'n, 1996), все соответствующее содержание которого включено здесь по ссылке.
Примерами диагностических агентов, предлагаемых для использования с помощью настоящего изобретения, являются ультразвуковые контрастные вещества, радиоконтрастные агенты (например, йод-октаны, галоген углероды, ренографин и тому подобное), магнитные контрастные агенты (например, фтор углероды, липид-растворимые парамагнитные соединения, и тому подобное).
Различные аспекты воплощения изобретения
Таким образом, в настоящем изобретении предложен метод (способ, технология, методика) определения содержания содержания (присутствия и/или количества) аналита в образце с помощью аналитического агента, включающий стадию контактирования упомянутого образца с упомянутым аналитическим агентом, содержащим наночастицу, в условиях, которые позволяют связываться аналиту со связанным с упомянутой наночастицей одноцепочечным распознающим олигонуклеотидом, причем упомянутая наночастица связана с первым концом упомянутого распознающего олигонуклеотида, упомянутый распознающий олигонуклеотид способен специфически связываться с аналитом, второй конец упомянутого распознающего олигонуклеотида ковалентно связан с сигнальным рецептором, упомянутый сигнальный рецептор не способен специфически связываться с упомянутым аналитом, упомянутый сигнальный рецептор способен специфически связываться с сигнальным лигандом, дальнейшее приведение упомянутого аналитического агента в контакт с сигнальным лигандом, детектирование количества связавшихся наночастиц упомянутого аналитического агента с упомянутым сигнальным лигандом как меры содержания аналита в упомянутом образце, отличающийся тем, что упомянутый распознающий олигонуклеотид на упомянутом аналитическом агенте в молекулярной форме (здесь и далее, при обсуждении шпилек и особенностей вторичной структуры олигонуклеотида как правило имеется в виду в свободной молекулярной форме) не имеет шпилек, включающих в себя более, чем 7 пар комплементарных нуклеотидов. Кроме того, метод определения содержания (присутствия и/или количества) аналита в образце с помощью аналитического агента, включающий стадию контактирования упомянутого образца с упомянутым аналитическим агентом, содержащим наночастицу, в условиях, которые позволяют связываться аналиту со связанным с упомянутой наночастицей одноцепочечным распознающим олигонуклеотидом, причем упомянутая наночастица связана с первым концом упомянутого распознающего олигонуклеотида, упомянутый распознающий олигонуклеотид способен специфически связываться с аналитом, второй конец упомянутого распознающего олигонуклеотида ковалентно связан с сигнальным рецептором, упомянутый сигнальный рецептор не способен специфически связываться с упомянутым аналитом, упомянутый сигнальный рецептор способен специфически связываться с сигнальным лигандом, дальнейшее приведение упомянутого аналитического агента в контакт с сигнальным лигандом, детектирование количества связавшихся наночастиц упомянутого аналитического агента с упомянутым сигнальным лигандом как меры содержания аналита в упомянутом образце, отличающийся тем, что упомянутый распознающий олигонуклеотид на упомянутом аналитическом агенте в молекулярной форме не имеет шпилек.
Кроме того, метод определения содержания (присутствия и/или количества) аналита в образце с помощью аналитического агента, включающий стадию контактирования упомянутого образца с упомянутым аналитическим агентом, содержащим наночастицу, в условиях, которые позволяют связываться аналиту со связанным с упомянутой наночастицей одноцепочечным распознающим олигонуклеотидом, причем упомянутая наночастица связана с первым концом упомянутого распознающего олигонуклеотида, упомянутый распознающий олигонуклеотид способен специфически связываться с аналитом, второй конец упомянутого распознающего олигонуклеотида ковалентно связан с сигнальным рецептором, упомянутый сигнальный рецептор не способен специфически связываться с упомянутым аналитом, упомянутый сигнальный рецептор способен специфически связываться с сигнальным лигандом, дальнейшее приведение упомянутого аналитического агента в контакт с сигнальным лигандом, детектирование количества связавшихся наночастиц упомянутого аналитического агента с упомянутым сигнальным лигандом как меры содержания аналита в упомянутом образце, отличающийся тем, что все шпильки на упомянутом распознающем олигонуклеотиде в молекулярной форме расположены на расстоянии не менее, чем 3 нуклеотидов от нуклеотида упомянутого распознающего олигонуклеотида, с которым связан упомянутый сигнальный рецептор.
Кроме того, метод определения содержания (присутствия и/или количества) аналита в образце с помощью аналитического агента, отличающийся тем, что все шпильки на упомянутом распознающим олигонуклеотиде в молекулярной форме расположены на расстоянии не менее, чем 3 нуклеотидных оснований от упомянутого второго конца упомянутого распознающего олигонуклеотида.
Кроме того, метод определения содержания (присутствия или количества) аналита в образце с помощью аналитического агента, включающий стадию контактирования упомянутого образца с упомянутым аналитическим агентом, содержащим наночастицу, в условиях, которые позволяют связываться аналиту со связанным с упомянутой наночастицей одноцепочечным распознающим олигонуклеотидом, причем упомянутая наночастица связана с первым концом упомянутого распознающего олигонуклеотида, упомянутый распознающий олигонуклеотид способен специфически связываться с аналитом, второй конец упомянутого распознающего олигонуклеотида ковалентно связан с сигнальным рецептором, упомянутый сигнальный рецептор не способен специфически связываться с упомянутым аналитом, упомянутый сигнальный рецептор способен специфически связываться с сигнальным лигандом, дальнейшее приведение упомянутого аналитического агента в контакт с сигнальным лигандом, детектирование количества связавшихся наночастиц упомянутого аналитического агента с упомянутым сигнальным лигандом как меры содержания аналита в упомянутом образце, отличающийся тем, что упомянутый распознающий олигонуклеотид на упомянутом аналитическом агенте либо не имеет шпилек, либо шпильки расположены на расстоянии не менее, чем 5 нуклеотидных оснований от упомянутого второго конца упомянутого распознающего олигонуклеотида.
Кроме того, метод определения присутствия или количества аналита в образце с помощью аналитического агента, включающий стадию контактирования упомянутого образца с упомянутым аналитически агентом, содержащим наночастицу, в условиях, которые позволяют связываться аналиту со связанным с наночастицей распознающим олигонуклеотидом, причем упомянутая наночастица связана с первым концом одноцепочечного распознающего олигонуклеотида, упомянутый распознающий олигонуклеотид способен специфически связываться с аналитом, второй конец упомянутого одноцепочечного распознающего олигонуклеотида ковалентно связан с сигнальным рецептором, причем упомянутый сигнальный рецептор не способен специфически связываться с упомянутым аналитом, упомянутый сигнальный рецептор способен специфически связываться с сигнальным лигандом, причем упомянутый распознающий олигонуклеотид на упомянутом аналитическом агенте либо не имеет шпилек, либо шпильки расположены на расстоянии не менее, чем 5 нуклеотидных оснований от упомянутого второго конца упомянутого распознающего олигонуклеотида, дальнейшее приведение упомянутого аналитического агента в контакт с сигнальным лигандом, детектирование количества связавшихся наночастиц упомянутого аналитического агента с упомянутым сигнальным лигандом как меры содержания аналита в упомянутом образце.
Кроме того, метод, в котором упомянутый распознающий олигонуклеотид на упомянутом аналитическом агенте не имеет шпилек, включающих в себя более, чем 6 пар комплементарных нуклеотидов (предпочтительнее 5 пар комплементарных нуклеотидов; предпочтительнее 4 пар комплементарных нуклеотидов; предпочтительнее 3 пар комплементарных нуклеотидов; предпочтительнее 2 пар комплементарных нуклеотидов; предпочтительнее 1 пары комплементарных нуклеотидов).
Кроме того, метод, в котором упомянутый распознающий олигонуклеотид имеет вторичную структуру без шпилек.
Кроме того, метод, в котором что упомянутый распознающий олигонуклеотид выбирают таким, что каждая шпилька во вторичной структуре упомянутого распознающего олигонуклеотида имеет менее 8 пар комплементарных олигонуклеотидов.
Кроме того, метод, в котором что упомянутый распознающий олигонуклеотид выбирают таким, что каждая шпилька во вторичной структуре упомянутого распознающего олигонуклеотида имеет менее 7 пар (предпочтительнее 6 пар, предпочтительнее 5 пар, предпочтительнее 4 пар, предпочтительнее 3 пар, предпочтительнее 2 пар, предпочтительнее 1 пары) комплементарных олигонуклеотидов. Кроме того, метод, в котором упомянутый аналит является водорастворимым веществом.
Кроме того, метод, в котором присутствие упомянутого аналита увеличивает связывание наноагента с мишенью.
Кроме того, метод, в котором упомянутая (клеточная) мишень - клетка.
Кроме того, метод, в котором упомянутая (клеточная) мишень - раковая клетка (сигнальный лиганд расположен или связан с клеткой, или является частью клетки).
Кроме того, метод, в котором упомянутый распознающий олигонуклеотид не имеет шпилек.
Кроме того, метод, в котором упомянутый аналит является водорастворимым веществом.
Кроме того, метод, в котором упомянутый распознающий олигонуклеотид имеет структуру с энергией образования менее энергетическую, чем -8 ккал/моль.
Кроме того, метод, в котором упомянутый распознающий олигонуклеотид имеет структуру с энергией образования менее энергетическую, чем -7 ккал/моль (предпочтительнее - менее -6 ккал/моль; менее -5 ккал/моль; менее -4ккал/моль; менее -3 ккал/моль; менее -2 ккал/моль; менее -1 ккал/моль; менее 0 ккал/моль; менее +1 ккал/моль). Менее энергетическую значит большее число в математическом смысле.
Кроме того, метод, в котором упомянутая наночастица связана с первым концом упомянутого распознающего олигонуклеотида за счет SH-группы упомянутого распознающего олигонуклеотида, причем связывание упомянутой частицы с упомянутым одноцепочечным распознающим олигонуклеотидом происходит (производят, осуществляют) из раствора, не содержащего веществ, имеющих SH-группы, кроме олигонуклеотидов.
Кроме того, метод, в котором упомянутая наночастица связана с первым концом упомянутого распознающего олигонуклеотида за счет SH-группы упомянутого распознающего олигонуклеотида, причем связывание упомянутой частицы с упомянутым одноцепочечным распознающим олигонуклеотидом происходит(производят, осуществляют) из раствора, не содержащего меркапто-углеводородов (тиолов).
Кроме того, метод, в котором упомянутая наночастица связана с первым концом упомянутого распознающего олигонуклеотида за счет тиольной группы упомянутого распознающего олигонуклеотида, причем связывание упомянутой частицы с упомянутым одноцепочечным распознающим олигонуклеотидом происходит (производят, осуществляют) из раствора, не содержащего веществ, имеющих SH-группы, кроме упомянутого одноцепочечного распознающего олигонуклеотида.
Кроме того, метод, в котором упомянутая наночастица имеет золотую поверхность, а последним нуклеотидом на упомянутом втором конце упомянутого одноцепочечного распознающего олигонуклеотида является аденозин, который за счет сродства к золоту приближает упомянутый сигнальный рецептор к поверхности упомянутой наночастицы в отсутствие аналита и тем самым снижает связывание сигнального рецептора с сигнальным лигандом, причем связывание аналита с упомянутым одноцепочечным распознающим олигонуклеотидом вызывает пространственное распрямление упомянутого одноцепочечного распознающего олигонуклеотида и отдаление упомянутого сигнального рецептора от поверхности упомянутой наночастицы и тем самым увеличивает связывание сигнального рецептора с сигнальным лигандом.
Кроме того, метод, в котором упомянутая наночастица имеет золотую поверхность, а последними нуклеотидами на упомянутом втором конце упомянутого одноцепочечного распознающего олигонуклеотида является не менее 2 аденозинов, которые за счет сродства к золоту приближают упомянутый сигнальный рецептор к поверхности упомянутой наночастицы в отсутствие аналита, что снижает связывание сигнального рецептора с сигнальным лигандом, причем связывание аналита с упомянутым одноцепочечным распознающим олигонуклеотидом вызывает пространственное распрямление упомянутого одноцепочечного распознающего олигонуклеотида и отдаление упомянутого сигнального рецептора от поверхности упомянутой наночастицы, что увеличивает связывание сигнального рецептора с сигнальным лигандом.
Кроме того, метод, в котором упомянутая наночастица имеет золотую поверхность, а последними нуклеотидами на упомянутом втором конце упомянутого одноцепочечного распознающего олигонуклеотида является не менее 3 аденозинов (не менее 4 аденозинов; не менее 5 аденозинов; не менее 6 аденозинов), которые за счет сродства к золоту приближают упомянутый сигнальный рецептор к поверхности упомянутой наночастицы в отсутствие аналита, что снижает связывание сигнального рецептора с сигнальным лигандом, причем связывание аналита с упомянутым одноцепочечным распознающим олигонуклеотидом вызывает пространственное распрямление упомянутого одноцепочечного распознающего олигонуклеотида и отдаление упомянутого сигнального рецептора от поверхности упомянутой наночастицы, что увеличивает связывание сигнального рецептора с сигнальным лигандом.
Кроме того, метод, в котором упомянутый сигнальный рецептор связан на упомянутом втором конце упомянутого распознающего олигонуклеотида с аденозином, который за счет сродства к золоту приближает упомянутый сигнальный рецептор к поверхности упомянутой наночастицы в отсутствие аналита, причем связывание аналита с упомянутым одноцепочечным распознающим олигонуклеотидом вызывает пространственное распрямление упомянутого одноцепочечного распознающего олигонуклеотида и отдаление упомянутого сигнального рецептора от поверхности упомянутой наночастицы, что увеличивает связывание сигнального рецептора с сигнальным лигандом.
Кроме того, метод, в котором упомянутый сигнальный рецептор связан на упомянутом втором конце упомянутого распознающего олигонуклеотида с полиаденозином, который за счет сродства к золоту приближает упомянутый сигнальный рецептор к поверхности упомянутой наночастицы в отсутствие аналита, причем связывание аналита с упомянутым одноцепочечным распознающим олигонуклеотидом вызывает пространственное распрямление упомянутого одноцепочечного распознающего олигонуклеотида и отдаление упомянутого сигнального рецептора от поверхности упомянутой наночастицы, что увеличивает связывание сигнального рецептора с сигнальным лигандом.
Кроме того, метод, в котором упомянутый полиаденозин содержит не менее 2 аденозинов. Кроме того, метод, в котором упомянутый полиаденозин содержит не менее 3 аденозинов; не менее 4 аденозинов; не менее 5 аденозинов; не менее 6 аденозинов.
Кроме того, метод, в котором упомянутая наночастица выполнена из золота.
Кроме того, метод, в котором упомянутая наночастица имеет структуру ядра из магнитного материала с оболочной из золота.
Кроме того, метод, в котором упомянутая наночастица выполнена из магнитного материала.
Кроме того, метод, в котором детектирование количества связавшихся наночастиц, имеющих структуру ядра из магнитного материала с оболочной из золота, осуществляют по нелинейному перемагничиванию на двух частотах переменного магнитного поля с регистрацией оклика на частотах, которые являются линейной комбинацией этих частот.
Кроме того, метод определения присутствия или количества аналита в образце с помощью аналитической твердой фазы, включающий стадию контактирования упомянутого образца с упомянутой аналитической твердой фазой, в условиях, которые позволяют связываться аналиту со связанным с упомянутой аналитической твердой фазой распознающим олигонуклеотидом, причем упомянутая аналитическая твердая фаза связана с первым концом одноцепочечного распознающего олигонуклеотида, упомянутый распознающий олигонуклеотид способен специфически связываться с аналитом, второй конец упомянутого одноцепочечного распознающего олигонуклеотида ковалентно связан с сигнальным рецептором, причем упомянутый сигнальный рецептор не способен специфически связываться с упомянутым аналитом, упомянутый сигнальный рецептор способен специфически связываться с сигнальным лигандом, причем упомянутый распознающий олигонуклеотид на упомянутой аналитической твердой фазе либо не имеет шпилек, либо шпильки расположены на расстоянии не менее, чем 5 нуклеотидных оснований от упомянутого второго конца упомянутого распознающего олигонуклеотида, дальнейшее приведение упомянутой аналитической твердой фазы в контакт с сигнальным лигандом, детектирование количества связавшегося упомянутого сигнального лиганда с упомянутой аналитической твердой фазой как меры содержания аналита в упомянутом образце.
Кроме того, аналитический агент, предназначенный для определения присутствия или количества аналита в образце и включающий в себя наночастицу, связанную с первым концом одноцепочечного распознающего олигонуклеотида, упомянутый распознающий олигонуклеотид способен специфически связываться с аналитом, второй конец упомянутого одноцепочечного распознающего олигонуклеотида ковалентно связан с сигнальным рецептором, причем упомянутый сигнальный рецептор не способен специфически связываться с упомянутым аналитом, упомянутый сигнальный рецептор способен специфически связываться с сигнальным лигандом, причем факт связывания упомянутого сигнального рецептора и упомянутого сигнального лиганда позволяет оценить количество связанных наночастиц упомянутого аналитического агента с носителем упомянутого сигнального лиганда, что используется для определения присутствия или количества аналита в образце, отличающийся тем, что упомянутый распознающий олигонуклеотид на упомянутом аналитическом агенте либо не имеет шпилек, либо шпильки расположены на расстоянии не менее, чем 5 нуклеотидных оснований от упомянутых первого и/или второго конца (т.е. либо первого, либо второго, либо и первого и второго) упомянутого распознающего олигонуклеотида. Кроме того, аналитический агент, предназначенный для определения присутствия или количества аналита в образце и включающий в себя наночастицу, связанную с первым концом одноцепочечного распознающего олигонуклеотида, упомянутый распознающий олигонуклеотид способен специфически связываться с аналитом, второй конец упомянутого одноцепочечного распознающего олигонуклеотида ковалентно связан с сигнальным рецептором, причем упомянутый сигнальный рецептор не способен специфически связываться с упомянутым аналитом, упомянутый сигнальный рецептор способен специфически связываться с сигнальным лигандом, отличающийся тем, что упомянутый распознающий олигонуклеотид на упомянутом аналитическом агенте либо не имеет шпилек, либо шпильки расположены на расстоянии не менее, чем 5 нуклеотидных оснований от упомянутых первого и/или второго конца упомянутого распознающего олигонуклеотида.
Кроме того, аналитический агент, предназначенный для определения присутствия или количества аналита в образце и включающий в себя наночастицу, связанную с первым концом одноцепочечного распознающего олигонуклеотида, упомянутый распознающий олигонуклеотид способен специфически связываться с аналитом, второй конец упомянутого одноцепочечного распознающего олигонуклеотида ковалентно связан с сигнальным рецептором, причем упомянутый сигнальный рецептор не способен специфически связываться с упомянутым аналитом, упомянутый сигнальный рецептор способен специфически связываться с сигнальным лигандом, причем факт связывания упомянутого сигнального рецептора и упомянутого сигнального лиганда позволяет оценить количество связанных наночастиц упомянутого аналитического агента с носителем упомянутого сигнального лиганда, что используется для определения присутствия или количества аналита в образце, отличающийся тем, что упомянутый распознающий олигонуклеотид на упомянутом аналитическом агенте либо не имеет шпилек, либо шпильки расположены на расстоянии не менее, чем 5 нуклеотидных оснований от упомянутых первого или второго конца упомянутого распознающего олигонуклеотида.
Кроме того, метод определения присутствия или количества аналита в образце с помощью упомянутого аналитического агента, содержащий следующие шаги: i) приведение в контакт образца с упомянутым аналитическим агентом в условиях, которые позволяют связываться аналиту с упомянутым распознающим олигонуклеотидом упомянутой наночастицы упомянутого аналитического агента, ii) дальнейшее приведение упомянутого аналитического агента в контакт с сигнальным лигандом, в условиях, которые позволяют связываться упомянутому сигнальному рецептору упомянутого аналитического агента с упомянутым сигнальным лигандом, iii) детектирование количества связавшихся наночастиц упомянутого аналитического агента с упомянутым сигнальным лигандом как меры содержания аналита в упомянутом образце.
Кроме того, умный (аналитический) наноагент, включающий в себя золотую наночастицу, функционализированную распознающим олигонуклеотидом, который способен специфически связываться с аналитом и который ковалентно связан с сигнальным рецептором, причем сигнальный рецептор не способен специфически связываться с упомянутым аналитом, такой что: связывание аналита с упомянутым распознающим рецептором увеличивает способность наноагента связываться с лигандом сигнального рецептора, отличающийся тем, что: распознающий олигонуклеотид либо не имеет шпилек, либо шпильки расположены на расстоянии не менее, чем 2, предпочтительнее 3, предпочтительнее 4, предпочтительнее 5, предпочтительнее 6, предпочтительнее 7, предпочтительнее 8, предпочтительнее 9, предпочтительнее 10, предпочтительнее 12, предпочтительнее 15, предпочтительнее 20, предпочтительнее 25, предпочтительнее 30 свободных нуклеотидных оснований от нуклеотидного основания распознающего олигонуклеотида, с которым связан сигнальный рецептор.
Кроме того, метод детекции содержания (присутствия или количества) аналита в образце с помощью упомянутого умного наноагента, содержащий следующие шаги: i) приведение в контакт образца с умным наноагентом, и) дальнейшее приведение упомянутого умного наноагента в контакт с лигандом сигнального рецептора, ш) детектирование количества связавшихся наночастиц умного наноагента с упомянутым лигандом сигнального рецептора как меры содержания аналита в упомянутом образце.
Кроме того, метод детекции присутствия или количества аналита в образце, содержащий следующие шаги: i) приведение в контакт образца с умным наноагентом, включающим в себя золотую наночастицу, функционализированную распознающим олигонуклеотидом, который способен специфически связываться с аналитом и который ковалентно связан с сигнальным рецептором, причем сигнальный рецептор не способен специфически связываться с аналитом, и) дальнейшее приведение упомянутого умного наноагента в контакт с лигандом сигнального рецептора, ш) детектирование количества связавшихся наночастиц умного наноагента с упомянутым лигандом сигнального рецептора как меры содержания аналита в упомянутом образце, отличающийся тем, что распознающий олигонуклеотид либо не имеет шпилек, либо шпильки расположены на расстоянии не менее, чем 2, предпочтительнее 3, предпочтительнее 4, предпочтительнее 5, предпочтительнее 6, предпочтительнее 7, предпочтительнее 8, предпочтительнее 9, предпочтительнее 10, предпочтительнее 12, предпочтительнее 15, предпочтительнее 20, предпочтительнее 25, предпочтительнее 30 свободных нуклеотидных оснований от нуклеотидного основания, с которым связан сигнальный рецептор.
Кроме того, метод определения присутствия или количества аналита в образце с помощью аналитического агента, включающий стадию контактирования упомянутого образца с упомянутым аналитически агентом, содержащим наночастицу, в условиях, которые позволяют связываться аналиту со связанным с наночастицей распознающим олигонуклеотидом, причем упомянутая наночастица связана с первым концом одноцепочечного распознающего олигонуклеотида, упомянутый распознающий олигонуклеотид способен специфически связываться с аналитом, второй конец упомянутого одноцепочечного распознающего олигонуклеотида ковалентно связан с сигнальным рецептором, причем упомянутый сигнальный рецептор не способен специфически связываться с упомянутым аналитом, упомянутый сигнальный рецептор способен специфически связываться с сигнальным лигандом, причем упомянутый распознающий олигонуклеотид упомянутого аналитического агента не образует структуры молекулярного маяка (molecular beacon), дальнейшее приведение упомянутого аналитического агента в контакт с сигнальным лигандом, детектирование количества связавшихся наночастиц упомянутого аналитического агента с упомянутым сигнальным лигандом как меры содержания аналита в упомянутом образце.
Кроме того, метод определения присутствия или количества аналита в образце с помощью аналитического агента, включающий стадию контактирования упомянутого образца с упомянутым аналитически агентом, содержащим наночастицу, в условиях, которые позволяют связываться аналиту со связанным с наночастицей распознающим олигонуклеотидом, причем упомянутая наночастица связана с первым концом одноцепочечного распознающего олигонуклеотида, упомянутый распознающий олигонуклеотид способен специфически связываться с аналитом, второй конец упомянутого одноцепочечного распознающего олигонуклеотида ковалентно связан с сигнальным рецептором, причем упомянутый сигнальный рецептор не способен специфически связываться с упомянутым аналитом, упомянутый сигнальный рецептор способен специфически связываться с сигнальным лигандом, причем упомянутый распознающий олигонуклеотид упомянутого аналитического агента не имеет шпильки располагающей сигнальный рецептор близко к месту присоединения распознающего олигонуклеотида к упомянутой наночастице (или приближающей распознающий сигнальный рецептор к поверхности частицы) , дальнейшее приведение упомянутого аналитического агента в контакт с сигнальным лигандом, детектирование количества связавшихся наночастиц упомянутого аналитического агента с упомянутым сигнальным лигандом как меры содержания аналита в упомянутом образце.
Кроме того, метод, аналитический агент и аналитическая твердая фаза, в которых указанная шпилька и нуклеотидное основание, с которым связан сигнальный рецептор, находятся на расстоянии не менее 2, предпочтительнее 3, предпочтительнее 4, предпочтительнее 5, предпочтительнее 6, предпочтительнее 7, предпочтительнее 8, предпочтительнее 9, предпочтительнее 10, предпочтительнее 12, предпочтительнее 15, предпочтительнее 20, предпочтительнее 25, предпочтительнее 30 свободных нуклеотидных оснований.
Кроме того, метод и аналитический агент, в котором упомянутый распознающий олигонуклеотид имеет длину не менее 7, предпочтительнее 8, предпочтительнее 9, предпочтительнее 10, предпочтительнее 12, предпочтительнее 15, предпочтительнее 20, предпочтительнее 25, предпочтительнее 27, предпочтительнее 30, предпочтительнее 35, предпочтительнее 40 нуклеотидов. Кроме того, метод и аналитический агент, в котором упомянутый аналит является ДНК или РНК и имеет длину менее 30, предпочтительнее 25, предпочтительнее 20, предпочтительнее 17, предпочтительнее 15, предпочтительнее 13, предпочтительнее 12, предпочтительнее 11, предпочтительнее 10 нуклеотидов.
Кроме того, метод и аналитический агент, в котором упомянутые шпильки расположены на расстоянии не менее, чем 6, предпочтительнее 7, предпочтительнее 8, предпочтительнее 9, предпочтительнее 10, предпочтительнее 12, предпочтительнее 15, предпочтительнее 20, предпочтительнее 25, предпочтительнее 30 свободных нуклеотидных оснований от нуклеотидного основания распознающего олигонуклеотида, с которым связан сигнальный рецептор.
Кроме того, метод и аналитический агент, в котором упомянутая наночастица - золотая наночастица.
Кроме того, метод и аналитический агент, в котором упомянутая золотая наночастица комбинируется с одной или несколькими магнитными наночастицами.
Кроме того, метод и аналитический агент, в котором упомянутые золотая и магнитные наночастицы образуют структуру типа «ядро-оболочка».
Кроме того, метод и аналитический агент, в котором упомянутая наночастица - выполнена как одна иили несколько магнитных частиц конъюгированы с одной золотой наночастицей.
Кроме того, метод и аналитический агент, в котором упомянутая наночастица - выполнена как несколько золотых наночастиц, конъюгированных с одной магнитной частицей.
Кроме того, метод и аналитический агент, в котором упомянутый распознающий олигонуклеотид не имеет шпилек с внутренней энергией более чем 5 ккал/моль, предпочтительнее 4 ккал/моль, предпочтительнее, предпочтительнее 3 ккал/моль, предпочтительнее 2.5 ккал/моль, предпочтительнее 2 ккал/моль, предпочтительнее 1.8 ккал/моль, предпочтительнее 1.7 ккал/моль, предпочтительнее 1.6 ккал/моль, предпочтительнее 1.5 ккал/моль, предпочтительнее 1.4 ккал/моль, предпочтительнее 1.3 ккал/моль, предпочтительнее 1.2 ккал/моль, предпочтительнее 1.1 ккал/моль, предпочтительнее 1 ккал/моль, предпочтительнее 0.9 ккал/моль, предпочтительнее 0.8 ккал/моль, предпочтительнее 0.7 ккал/моль, предпочтительнее 0.6 ккал/моль, предпочтительнее 0.5 ккал/моль.
Кроме того, метод и аналитический агент, в котором доля аденозиновых остатков в структуре упомянутого распознающего олигонуклеотида не превышает 30%, предпочтительнее 25%, предпочтительнее 20%, предпочтительнее 15%.
Кроме того, метод и аналитический агент, в котором упомянутый распознающий олигонуклеотид не образует структуры молекулярного маяка (molecular beacon).
Кроме того, метод, в котором указанная шпилька и нуклеотидное основание, с которым связан сигнальный рецептор, находятся на расстоянии не менее 7 свободных нуклеотидных оснований.
Кроме того, метод, в котором указанная шпилька и нуклеотидное основание, с которым связан сигнальный рецептор, находятся на расстоянии не менее 10 свободных нуклеотидных оснований. Кроме того, метод, в котором указанная шпилька и нуклеотидное основание, с которым связан сигнальный рецептор, находятся на расстоянии не менее 12 свободных нуклеотидных оснований.
Кроме того, метод, в котором указанная шпилька и нуклеотидное основание, с которым связан сигнальный рецептор, находятся на расстоянии не менее 15 свободных нуклеотидных оснований.
Кроме того, метод, в котором упомянутый аналит является нуклеиновой кислотой.
Кроме того, метод, в котором упомянутый аналит является малой молекулой.
Кроме того, метод, в котором упомянутый аналит является белковым соединением.
Кроме того, метод, в котором упомянутый распознающий олигонуклеотид является аптамером.
Кроме того, метод, в котором упомянутый распознающий олигонуклеотид имеет длину не менее 15 нуклеотидов.
Кроме того, метод, в котором упомянутый распознающий олигонуклеотид имеет длину не менее 20 нуклеотидов.
Кроме того, метод, в котором упомянутый распознающий олигонуклеотид имеет длину не менее 25 нуклеотидов.
Кроме того, метод, в котором упомянутый распознающий олигонуклеотид имеет длину не менее 27 нуклеотидов.
Кроме того, метод, в котором упомянутый аналит является малой ДНК или малой РНК.
Кроме того, метод, в котором упомянутый аналит является микро ДНК или микро РНК.
Кроме того, метод, в котором упомянутый аналит является ДНК или РНК и имеет длину менее 25 нуклеотидов.
Кроме того, метод, в котором упомянутый аналит является ДНК или РНК и имеет длину менее 20 нуклеотидов.
Кроме того, метод, в котором упомянутый аналит является ДНК или РНК и имеет длину менее 17 нуклеотидов.
Кроме того, метод, в котором упомянутый аналит является ДНК или РНК и имеет длину менее 15 нуклеотидов.
Кроме того, метод, в котором упомянутый аналит является ДНК или РНК и имеет длину менее 12 нуклеотидов.
Кроме того, метод, в котором упомянутый сигнальный лиганд иммобилизован на твердой фазе.
Кроме того, метод, в котором упомянутая твердая фаза является поверхностью иммунохроматографической мембраны.
Кроме того, метод, в котором упомянутая твердая фаза является поверхностью микротитрационного планшета.
Кроме того, метод, в котором упомянутый сигнальный лиганд иммобилизован на отдельной сигнальной наночастице. Кроме того, метод, в котором сигнальная наночастица представляет собой наночастицу золота, а детекция связывания сигнального лиганда на сигнальной наночастице и наночастицы с иммобилизованным сигнальным рецептором осуществляется при помощи метода плазм онного резонанса (т.е. детектируется сдвиг спектра пика поглощения за счет феномена локализованного поверхностного плазмонного резонанса).
Кроме того, метод, в котором упомянутая сигнальная наночастица представляет собой наночастицу золота, а детекция связывания сигнального лиганда на сигнальной наночастице и сигнального рецептора упомянутой наночастицы упомянутого аналитического агента осуществляется оптически за счет детекции сдвига спектра плазмонного резонанса.
Кроме того, метод, который осуществляется в гомогенном формате.
Кроме того, метод, в котором детектирование количества связавшихся наночастиц с упомянутым сигнальным лигандом осуществляют визуально.
Кроме того, метод, в котором детектирование количества связавшихся наночастиц с упомянутым сигнальным лигандом осуществляют визуально без оптических приборов.
Кроме того, метод, в котором детектирование количества связавшихся наночастиц с упомянутым сигнальным лигандом осуществляют при помощи оптических методов регистрации.
Кроме того, метод, в котором детектирование количества связавшихся наночастиц с упомянутым сигнальным лигандом сигнального рецептора осуществляют при помощи магнитометрических методов регистрации.
Кроме того, метод, в котором помимо упомянутого распознающего олигонуклеотида, на наночастице иммобилизуют дополнительное соединение (олигонуклеотид, полимер, или малая молекула), не способное к специфическому связыванию с аналитом. Упомянутое соединение служит для снижения поверхностной концентрации распознающего олигонуклеотида и одновременно для коллоидной стабилизации наночастицы.
Кроме того, метод, в котором в качестве упомянутого дополнительного соединения используют тиолированные спирты.
Кроме того, метод, в котором в качестве упомянутого дополнительного соединения используют молекулы тиолированных олигонуклеотидов.
Кроме того, метод, в котором детектирование количества связавшихся упомянутых наночастиц аналитического агента с упомянутым сигнальным лигандом рецептора осуществляют в течении менее чем 20 минут после начала анализа.
Кроме того, метод, в котором детектирование количества связавшихся упомянутых наночастиц аналитического агента с упомянутым сигнальным лигандом рецептора осуществляют в течении менее чем 15 минут после начала анализа.
Кроме того, метод, в котором детектирование количества связавшихся упомянутых наночастиц аналитического агента с упомянутым сигнальным лигандом рецептора осуществляют в течении менее чем 10 минут после начала анализа.
Кроме того, метод, в котором упомянутым сигнальным рецептором является низкомолекулярный рецептор.
Кроме того, метод, в котором упомянутым низкомолекулярным сигнальным рецептором является биотин. Кроме того, метод, в котором упомянутым низкомолекулярным сигнальным рецептором является флуоресцеин.
Кроме того, метод, в котором упомянутым лигандом сигнального рецептора является авидин, стрептавидин или нейтравидин.
Кроме того, метод, в котором упомянутым лигандом сигнального рецептора является антитело.
Кроме того, метод, в котором упомянутое антитело специфично взаимодействует с упомянутым сигнальным рецептором.
Кроме того, метод, в котором упомянутое антитело специфично связывается с биотином.
Кроме того, метод, в котором упомянутое антитело специфично связывается с флуоресцеином.
Кроме того, метод, в котором упомянутый распознающий олигонуклеотид не имеет шпилек с внутренней энергией более чем 2 ккал/моль.
Кроме того, метод, в котором упомянутый распознающий олигонуклеотид не имеет шпилек с внутренней энергией более чем 1.5 ккал/моль.
Кроме того, метод, в котором доля аденозиновых остатков в структуре упомянутого распознающего олигонуклеотида не превышает 15%.
Кроме того, метод, в котором доля аденозиновых остатков в структуре упомянутого распознающего олигонуклеотида не превышает 20%.
Кроме того, метод, в котором доля аденозиновых остатков в структуре упомянутого распознающего олигонуклеотида не превышает 25%.
Кроме того, метод, в котором доля аденозиновых остатков в структуре упомянутого распознающего олигонуклеотида превышает 30%.
Кроме того, метод, в котором доля аденозиновых остатков в структуре упомянутого распознающего олигонуклеотида превышает 40%.
Кроме того, метод, в котором доля аденозиновых остатков в структуре упомянутого распознающего олигонуклеотида превышает 50%.
Кроме того, метод, в котором упомянутый распознающий олигонуклеотид крепится на поверхности упомянутой наночастицы (преимущественно с золотой поверхностью) за счет тиольной группы.
Кроме того, метод, в котором упомянутый распознающий олигонуклеотид крепится на поверхности упомянутой наночастицы (преимущественно с золотой поверхностью) за свой 3’ -конец, а сигнальный рецептор - за 5’- конец.
Кроме того, метод, в котором упомянутый распознающий олигонуклеотид крепится на поверхности упомянутой наночастицы (преимущественно с золотой поверхностью) за свой 5 ’-конец, а сигнальный рецептор - за 3’- конец.
Кроме того, метод, в котором упомянутый сигнальный рецептор крепится на распознающем олигонуклеотиде в любом месте цепи, за исключением крайнего нуклеотида.
Кроме того, метод, в котором все шпильки на упомянутом распознающем олигонуклеотиде расположены на расстоянии не менее, чем 5 (предпочтительнее - не менее чем 6; не менее чем 7; не менее чем 8; не менее чем 9; не менее чем 10; не менее чем 11; не менее чем 12; не менее чем 13; не менее чем 14; не менее чем 15; не менее чем 16; не менее чем 17; не менее чем 18; не менее чем 19; не менее чем 20) нуклеотидов от нуклеотида упомянутого распознающего олигонуклеотида, с которым связан упомянутый сигнальный рецептор.
Кроме того, упомянутые агенты.
Кроме того, наборы, композиции, хроматографические тесты (lateral flow kits, test-strips), включающие упомянутые агенты.
Примеры
Следующие примеры служат для объяснения и иллюстрации настоящего изобретения. Примеры ни при каких обстоятельствах не должны толковаться как ограничение изобретения. В рамках изобретения возможны различные модификации.
Пример 1. Создание агентов на основе золотых наночастиц.
Наночастицы золота (ЗН) размером 30±3нм, 40±3.5нм, 50±5нм, синтезированные по методу Туркевича путем цитратного восстановления раствора золотохлористоводородной кислоты, конъюгируют с распознающим олигонуклеотидом методом постепенного повышения ионной силы буфера (высаливанием) как описано в литературе. Для модификации использовалась взаимодействие тиольной группы на 3’ -конце олигонуклеотида с поверхностью GNP. В качестве распознающих олигонуклеотидов используют тиолированные олигонуклеотиды, представленные на Фиг.8. В качестве сигнальных рецепторов используют биотин или флуоресцеин (как указано на Фиг.8), которые связывают (конъюгируют) с концом олигонуклеотида непосредственно во время синтеза.
Пример 2. Создание агентов на основе магнитных частиц с золотой поверхностью.
Наночастицы типа ядро-оболочка с магнитным ядром (магнетит) и золотой поверхностью диаметром 40 нм (по данным просвечивающей электронной микроскопии) конъюгируют с тиолированными распознающими олигонуклеотидами (последовательности приведены на Фиг.8) как описано в Примере 1.
Пример 3. Проведение анализа (детекция олигонуклеотида) в гомогенном формате с помощью аналитических агентов на основе золотых наночастиц (GNP).
Агент GNP:B1S (здесь и всюду - обозначение типа частицы: обозначение распознающего олигонуклеотида) смешивают с образцом (содержащем или не содержащем аналит), инкубируют 0-10 мин и далее смешивают с наночастицей, сконъюгированной с сигнальным лигандом - стрептавидином (за счет электростатической сорбции белка как описано в литературе). Наблюдают цвет смеси (или прозрачность) визуально или с помощью спектрофотометра. В случае присутствия в смеси аналита - полностью комплементарного (распознающему олигонуклеотиду) олигонуклеотида lsp, цвет смеси изменяется уже после первого часа (Фиг.11). После инкубации в течение 10 часов или ночи наблюдают практическое полное выпадение и обесцвечивание раствора вследствие агрегации GNP (Фиг.11). В контрольных экспериментах (Фиг.11) цвет системы не изменялся в течение всего времени эксперимента.
Более подробно: Гомогенные реакции в пяти 0,6 мл пробирках проводили в общем объеме 40 мкл lMNaCl фосфатного буфера (pH = 7,4). Использовались исходные растворы из 0,6 нМ частиц и 10 мкМ олигонуклеотидов. Были исследованы следующие образцы: 1) 4 мкл GNP:B1S; 2) 4 мкл GNP:B1S; 3) 2 мкл GNP:B1S и 2 мкл GNP:Str; 4) 2 мкл GNP:B1S, 2 мкл GNP:Str и 2 мкл специфического олигонуклеотида lsp; 5) 2 мкл GNP:B1S, 2 мкл GNP:Str и 2 мкл неспецифического олигонуклеотида 1 ис. Растворы инкубировали в течение 10 часов при комнатной температуре с визуальным обнаружением сигнала в моменты времени 1, 2, 5 и 10 часов.
Пример 4. Верификация увеличения размера частицы с помощью метода Nanoparticle Tracking Analysis (NTA).
Факт свернутости цепи и ее распрямления под действием специфической гибридизации подтверждается изучением гидродинамических размеров коньюгата GNP:0L-B1S до и после взаимодействия с комплементарным и некомплементарным аналитом при помощи Nanoparticle Tracking Analysis (NTA). Данный метод демонстрирует, что статистически достоверное увеличение размера наночастиц коньюгата происходит только в результате специфического взаимодействия. Обнаруженное увеличение радиуса частиц составило около 7,5 нм, что приблизительно соответствует около 60% от общей длины полностью вытянутой молекулы распознающего олигонуклеотида.
Пример 5. Проведение анализа в иммунохроматографическом формате с помощью GNP и тест-полосок.
Для производства тест-полосок склеивались листы целлюлозного фильтра (HF075MC100) и впитывающей мембраны (CFSP203000), Merck Millipore (Франция). Затем, растворы антибиотиновых антител или стрептавидина (сигнальным лигандом) в фосфатно-солевом буфере наносили на целлюлозный фильтр с использованием системы BioDot XYZ3060 с плотностью 4 мкл см-1 и высушивали в течение 16 часов. Затем, тестовые полоски шириной 2мм нарезали с помощью режущего модуля BioDot СМ4000 так, чтобы получалась полоска с тестовой зоной в центре.
Для хроматографического анализа, конъюгаты ЗНЧ с детектирующей ДНК (B1S, B2S, B3S, B4S) разбавляли в буфере (1% БСА в 10 мМ фосфатном буфере, 1 М NaCl) до необходимой концентрации. Затем, 2 мкл раствора добавляли к раствору специфического или неспецифического олигонуклеотида определенной концентрации в конечном объеме буфера (20 мкл, 0,1% БСА, 1 М NaCl, 0,5% обезжиренного сухого молока).
После короткого (0-10 мин) прединкубирования агента GNP:B1S со специфичными или неспецифичными аналитами (см. Фиг.15), в смесь погружали тест-полоску. После 15 минут общего времени проведения иммунологического теста визуально детектировали специфическое взаимодействие аналита с конъюгатом GNP:B1S по появлению ярко окрашенной полосы на тест-полоске. Наличие специфического взаимодействия оценивали визуально по интенсивности окрашивания тестовой полосы вследствие осаждения на ней GNP (Фиг.12) или с помощью компьютерной обработки оцифрованного (Epson V750 Pro сканер с разрешением 1200 точек на дюйм) изображения тест полоски (для расчета интенсивности полос, сканированные изображения в формате TIFF обрабатывались с использованием программного обеспечения ImageJ). Результаты анализа представлены на Фиг. 3-7, 13-15, 18-19. В частности, пределы детекции комплементарных аналитов для распознающих олигонуклеотидов B2S, B3S, B4S составили, соответственно, 5 пМ, ЗОпМ и 40 фМ, что в сочетании с коротким временем детекции (10 минут) является одним из лучших показателей, достигнутых при современном уровне техники для экспресс-анализов.
Пример 6. Влияние аденозинов распознающего олигонуклеотида вблизи сигнального рецептора на эффективность маскирования. Для проверки вклада аденозинов в эффект маскирования сигнального рецептора были созданы агенты на основе GNP с олигонуклеотидом B4S, но с различным числом (0, 1, 2, 3) терминальных оснований аденозина на 5'-конце (Фиг. 8-10), к которому в данном случае присоединяли сигнальный рецептор - биотин. В суспензию с агентом погружали ранее подготовленную тест-полоску с нанесенным стрептавидином в виде тонкой полосы в центре иммунохроматографической мембраны. После 15 минут общего времени проведения ИХА детектировали результат, как описано в Примере 5. Результаты представлены на Фиг.25. Видно, что эффект маскировки биотина практически полностью пропадает в отсутствие терминального аденозина, но восстанавливает при одной и более концевой группе.
Пример 7. Влияние температуры и биохимических параметров среды на результат анализа.
Был проведён анализ влияния температуры на регистрируемый сигнал. После короткого (10 мин) прединкубирования конъюгата GNP:B4S со специфичными или неспецифичными аналитами, образцы помещались в разные температурные условия: при комнате, при 37 °С, при +4 °С. Далее проводился анализ согласно Примерам 4-5. Согласно полученным данным, результаты анализа не зависели от температуры: при значениях концентрации аналита вплоть до 109 М, разница в величине сигналов лежала в пределах ± 15% и статистически не различались.
Проводят ИХА анализ (англ - lateral flow assay) как в примере 5 с использованием различных составов буферов: ионная сила (0.1М-1.5М NaCl); различный pH - цитратный буфер pH 4, MES pH 5, HEPES pH 6, боратный буфер pH 9,5; кроме того pH 5-7 - 10 тМ фосфатный буфер; pH 4 - 0.1 М фосфат-цитратный; pH 8-9 - 10 шМ боратный буферы; содержание белка: БСА (0-5%), сыворотки крови (0-50%); содержание геномной ДНК (фага лямбда).
После короткого (10 мин) прединкубирования конъюгата GNP:B1S со специфичными или неспецифичными аналитами в разных буферах, проводился анализ согласно Примеру 5. Измерения показали (см. результаты на Фиг.4-7, Фиг.18), что ИХА с агентами на основе изобретения сохраняет свою работоспособность в широком диапазоне составов реакционной среды.
Пример 8. Детектирование малых олигонуклеотидов.
Проводят анализ как описано в Примере 5, по детекции по детекции аналита - коротких и сверхкоротких (ultrashort, ultrasmall) олигонуклеотидов - частей последовательности специфического аналита 4-lsp. Фиг. 26 показывает результаты детекции различных концентраций аналитов - вплоть до длины 5 нуклотидов.
Пример 9. Нивелирование эффекта маскирования сигнального рецептора при инкубации аналитического агента с восстановителями дисульфидных связей, например, с меркаптоэнолом и 11-меркаптоиндеканолом.
В растворы с конъюгатами золотых наночастиц с распознающими олигонуклеотидами BIS, B2S, B3S (Фиг.8) добавляли меркаптоэтанол. После короткого (10 мин) прединкубирования, в смесь погружали ранее подготовленную тест-полоску с нанесенным стрептавидином в виде тонкой полосы в центре иммунохроматографической мембраны (как описано в Примере 5). Результаты представлены на Фиг. 3. Видно, что меркаптоэтанол существенно ухудшает (вплоть до полного исчезновения) эффект маскирования сигнального рецептора. Такой же эффект наблюдали и при инкубации агентов с 11-меркаптоиндеканолом. Пример 10. Использование FAM в качестве сигнального рецептора.
Для проверки универсальности подхода GNP были сконъюгированы с олигонуклеотидами, модифицированными FAM (вместо биотина в предыдущих примерах - см. последовательности на Фиг. 8.). После короткого (10 мин) прединкубирования конъюгата GNP:F4S со специфичными или неспецифичными олигонуклеотидом, в смесь погружали ранее подготовленную тест-полоску с нанесенными моноклональными антителами к FAM в виде тонкой полосы в центре иммунохроматографической мембраны.
После 15 минут общего времени проведения ИХА детектировали результат, как описано в Примере 5 (Фиг.19).
Пример 11. Синтез дополнительных сигнальных парамагнитных частиц FeH. Парамагнитные ферригидритные наночастицы (FeH) покрытые карбоксиметилд стран ом (КМД), синтезировали путем осаждения FeCb · 6Н2О с помощью NH4OH (30%), пептизацией HNO3, отмывкой и последующим нагреванием в растворе КМД.
Пример 12. Создание агента на основе полимерной магнитной микросферы.
На магнитные микросферы Dynabeads М-280, 2,8 мкм (РММ) с полистирольной оболочкой, функционализированной тозилатными группами, по протоколу рекомендованному производителем иммобилизовали 5 ’-биотин, З’-амино- модифицированный распознающий олигонуклеотиды с последовательностями, указанными в Фиг.8 за через взаимодействия тозилатной группы на частицах и амино- группы на олигонуклеотиде.
Пример 13. Проведение анализа с помощью аналитического агента на основе магнитной микросферы.
Агент, созданный в Примере 12 смешивали с образцом (содержащим или несодержащим аналит) и с созданными в Примере 11 дополнительными сигнальными частицами с иммобилизованным на них сигнальным лигандом (стрептавидином).
Для проведения биохимического анализа для исследования SM-PMM, конъюгат РММ: B4N (5 мкл, 10 мкг) инкубировали в течение 15 мин при комнатной температуре со специфическим или неспецифическим олигонуклеотидом (2 мкл, 10 мкМ) в финальном буферном растворе (20 мкл, 0,5 MNaCl, 2% Твин-20).
Затем, конъюгат осаждали на магните, промывали в фосфатно-солевом буфере () и ресуспендировали в 40 мкл, 1% БСА в фосфатно - солевом буфере (ФСБ) с конъюгатами FeH-Str: HRP или Str-HRP и инкубировали в течение еще 15 минут в тех же условиях. Раствор также осаждали на магните и промывали в ФСБ, затем, к осадку добавляли субстрат ТМВ (60 мкл) и инкубировали в течение 5 минут. Затем, раствор осаждали на магните, супернатант (50 мкл) переносили в 96-луночный планшет для иммуноферментного анализа, связанный с ферментом, и, чтобы остановить реакцию, добавляли H2S04 (50 мкл, 2М). Абсорбция света измерялась при 450 нм с помощью микропланшетного фотометра CLARIOstar® (BMGLabtech, Германия).
В результате взаимодействия между стрептавидином на наночастицах и биотином на свободном конце распознающего олигонуклеотида происходило образование комплекса РММ-наночастицы (нанокомлекс). После магнитной отмывки нанокомплекса от несвязавшихся наночастиц, детектировали активность пероксидазы с ТМВ субстратом, пропорциональную количеству сигнальных наночастиц связавшихся с агентами.
Фиг. 17 показывает увеличение детектируемого сигнала в присутствие аналита, специфичного к распознающему олигонуклеотиду. При этом, эффект имел специфический характер, поскольку сигнал в присутствии неспецифического олигонуклеотида и после предварительного связывания активных центров биотина свободным стрептавидином был также низок и статистически неотличим от контроля. При замене «объемного» корпускулярного проявляющего агента на основе наночастиц FeH-Str:HRP (ср. диаметр ок.200 нм) на конъюгат HRP и стрептавидина (HRP:Str) с меньшим (ок.15 нм) размером молекулы, эффект маскирования проявлялся в заметно меньшей степени (Фиг. 17).
Пример 14. Чувствительность молекулярного маяка аналога - распознающего олигонуклеотида B4S.
Для флуоресцентного анализа аналог молекулярного маяка B4S (5'-СуЗ, 3'-BHQ2, 2 х 10-8М) инкубировали в буфере (100 мкл, 1М NaCl, 0,5% обезжиренного сухого молока) со специфическими или неспецифическими олигонуклеотидами в разных концентрациях. После 10-минутной инкубации при комнатной температуре, сигнал флуоресценции количественно определяли с помощью микропланшетного фотометра CLARIOstar® при 530/580 нм для возбуждения и испускания, соответственно. Результат анализа с помощью молекулярного маяка (существенно более слабая чувствительность и динамический диапазон) по сравнению с агентом GNP-B4S показан на Фиг. 14.
Пример 15. Конъюгация антител со стрептавидином.
Гибридное моноклональное антитело человека и мыши против рецептора клеточной поверхности HER2 / neu - (HER-Str) - Трастузумаб (Herticad, Biocad, Россия) коньюгировали со стрептавидином тиолированиым реагентом Траута (2-иминотиоланом), с использованием гетеробифункционального линкера N-гидроксисукцинимидного эфира 3- малеимидобензойной кислоты (MBS) в соответствии с инструкцией производителя линкера (Thermo Fisher Scientific, USA).
Пример 16. Таргетинг специфических клеток в зависимости от содержания аналита (олигонуклеотида) в среде.
Для экспериментов по нацеливанию на клетки, 0,25 миллиона SK-BR-3 (HER2 / пей - положительный контроль) и СНО (отрицательный контроль) инкубировали с HER-Str (5 мкл, 20 мкг мл-1) в 25 мкл 1% БСА в ФСБ в течение 15 минут и промывали средой DMEM / F12 (1 : 1) с 10% эмбриональной бычьей сыворотки.
Золотые наночастицы, конъюгированные с цепочками ДНК которые З'-тиолированны и 5'-ЕАМ-модифицрованы (F4S - в качестве флуоресцентного маркера) и 5'- биотинилировны- (B4S) в конечной концентрации 0,6 нМ (GNP:B4S:F4S), смешивали с раствором 1% BSA и 1М NaCl, содержащим или несодержащим специфический олигонуклеотид (lsp) в концентрации 0,01 - 1 мкМ. После 15 мин инкубации, приготовленный раствор (5 мкл) добавляли к суспензии клеток и инкубировали в течение 15 мин, затем образцы промывали в 1% БСА в ФСБ. Цитометрический анализ таргентинга клеток проводили на проточном визуализирующем цитометре Amnis ImageStream X Mark II (Luminex Corporation, США) с использованием 40-кратного объектива, 488-нм лазера (200 мВт) для возбуждения флуоресценции и 785-нм лазера для измерения бокового рассеяния (0,5 мВт). Сфокусированные изображения отдельных клеток были отфильтрованы во время сбора данных с помощью программного обеспечения Amnis INSPIRE: i) с помощью RMS Brightfield Gradient (35-100); ii) по площади светлого поля (240-900) в зависимости от соотношения сторон (0,75-1,0) (рисунок S12). Для каждого образца было собрано 3000 отфильтрованных изображений. Анализ специфичности GNP: B4S SM с использованием различных вводимых тестируемых ДНК проводили на проточном цитометре Amnis CellStream (Luminex Corporation, США). 5000 событий были собраны для каждого образца. Результаты представлены на Фиг. 21 (для концентрации аналита 1 мкМ, однако, сдвиг пика гистограммы наблюдали для всех тестированных концентраций).
Пример 17. Селективность тераностических агентов к аналиту при таргетинге специфических клеток.
Проводили исследование связывания агентов с клетками как описано в Примере 16, но в присутствии аналитов-олигонуклеотидов различных размеров и комплементарности к распознающему олигонуклеотиду. Результаты представлены на Фиг. 22 (последовательности аналитов - тсДНК представлены на Фиг. 15. Видно, что агенты хорошо различают как аналиты разных размеров, аналиты с единичными и множественными точечными полиморфизмами. Эффективность связывания с кдетками хорошо коррелирует с теоретически рассчитанной констатой ассоциации аналита с распознающим олигонуклеотидом (см Фиг. 15).
Пример 18. Гипертермия клеток.
Агенты на основе золотых частиц, а также золотых наностержней, конъюгированные с распознающими олигонуклеотидами (описаны в Примере 16), инкубировали с клетками SK-BR-3 или СНО в присутствии или отсутствии аналита-олигонуклеотида (как описано Примерах 16-17). Затем, отмывали навязавшиеся агенты и облучали клетки светом на длине волны 530нм или 810нм, 1-2 Вт/смл2. Затем, через 12-24 часа клетки изучали с помощью проточной цитометрии с окрашианием пропидий йодидом/ФИТЦ-аннексином V. Тест показал, что процент мертвых клеток и клеток в апоптозе (суммарно) SK-BR-3 в присутствии специфического аналита в образце был в 1.5-3.2 раза выше, чем без аналита или в присутствии некомплементарных распознающему олигонуклеотиду аналитов; и не менее чем в 4 раза выше, чем для СНО клеток.
Работа предлагаемого способа иллюстрируется чертежами фиг. 1-26.
Фиг.1. Схематическое сравнение функционирования агента данного изобретения (Г) и известных концепций создания агентов с лиганд-зависимой аффинностью к мишени. Обозначения: 1-2) выходной рецептор в неактивном (ВЫКЛ) и активированном (ВКЛ) состояниях, соответственно; 3) мишень для таргетинга; 4) аналит; 5-6) входной и выходной домены аллостерического фермента, соответственно; 7) сайты связывания входного рецептора; 8) компоненты молекулярного замка.
Фиг.2. Схема переключения состояния наноагента. Обозначения: 1) одноцепочечная распознающий олигонуклеотид; 2) дуплекс связывающей ДНК с комплементарным аналитом; 3) концевой сигнальный рецептор (биотин); 4) золотая наночастица.
Фиг.З. Влияние меркаптоэтанола (MCE) на функционирование УМ в формате ИХА (антибиотиновые антитела иммобилизованы на тестовой линии тест-полоски; без добавления аналита) для GNP, конъюгированных с тремя различными распознающими олигонуклеотидами (BIS; B2S; B3S).
Фиг. 4. Влияние ионной силы (концентрация NaCl) среды на функционирование агента GNP:B4S в ИХА формате (анти-биотиновые антитела на тест линии). ЮмМ фосфатный буфер, pH 7.4. Звездочки показывают статистическую значимость (*Р < 0.05, **Р < 0.01). Штриховка горизонтально - без добавления аналита, косая штриховка - концентрация специфического аналита тсДНК 4-lsp - ЮнМ.
Фиг. 5 Влияние pH среды на функционирование агента GNP:B4S в ИХА формате (анти- биотиновые антитела на тест линии). Ионная сила - 1 5М NaCl. pH 5-7 - 10 mM фосфатный буфер; pH 4 - 0.1 М фосфат-цитратный; pH 8-9 - 10 mM боратный буферы. Штриховка горизонтально - без добавления аналита, косая штриховка - концентрация специфического аналита тсДНК 4-lsp - ЮнМ.
Фиг. 6 Влияние высокой концентрации белка (бычий сывороточный альбумин - БСА) в среде на функционирование агента GNP:B4S в ИХА формате (анти-биотиновые антитела на тест линии). Буфер 1 ОмМ фосфатный буфер, 1.5MNaCl. Штриховка горизонтально - без добавления аналита, косая штриховка - концентрация специфического аналита тсДНК 4- lsp - ЮнМ.
Фиг. 7 Влияние высокой концентрации белка сыворотки крови в среде на функционирование агента GNP:B4S в ИХА формате (анти-биотиновые антитела на тест линии). Буфер ЮмМ фосфатный буфер, 1.5М NaCl. Штриховка горизонтально - без добавления аналита, косая штриховка - концентрация специфического аналита тсДНК 4- lsp - ЮнМ.
Фиг. 8. Последовательности олигонуклеотидов.
Фиг. 9. Свободная энергия Гиббса вторичной структуры распознающих олигонуклеотидов (вычисленные с помощью NUPACK при 1 М NaCl, 25 ОС). Приведена информация о наиболее высокоэнергичной структуре (с наиболее отрицательным dG).
Фиг.10. Вторичные структуры распознающих олигонуклеотидов (расчёт в NUPACK и UNAFold для lMNaCl, 25 ОС).
Фиг.11. Демонстрация эффекта маскирования биотина на конце ДНК, иммобилизованной на поверхность наночастиц золота. Эффективность агентов в гомогенном анализе, основанном на специфической агрегации ЗН: фотографии пробирок после (сверху) 1- часовой и (снизу) 10-часовой инкубации. Обращает внимание изменение цвета (от красного до обесцвеченного светло-голубого) в случае взаимодействия со специфическим входным сигналом (выделено прямоугольником). Обозначения: 1) наноагент GNP:B1S; 2) конъюгат GNP:Str; 3) GNP:B1S + GNP:Str; 4) GNP:B1S + GNP:Str + аналит; 5) GNP:B1S + GNP:Str + некомплементарная ДНК.
Фиг.12. Фотография тест-полосок с нанесенным стрептавидином на тест-линии. Показаны результаты миграции агентов GNP:B1S для детекции специфического аналита в среде (концентрация аналита на дуплетах полосок слева направо: ЮОнМ, ЮнМ, 1нМ, ЮОпМ, ЮпМ, 1пМ, ЮОфМ, без аналита).
Фиг.13. Отклик (сигнал) в хроматографическом анализе на специфический аналит (сплошная линия) и неспецифический аналит (прерывистая линия), для агентов с распознающим олигонуклеотидом: B1S (круг), B2S (квадрат), или B3S (треугольник).
Фиг. 14. Сравнение эффективности агента GNP:B4S и молекулярного маяка, основанного на том же распознающем олигонуклеотиде, но сконъюгированном на концах с СуЗ и BHQ2 вместо биотина и тиола. Отклик системы на полностью комплементарный аналит (4-lsp). Оптический сигнал GNP:B4S в ИХА формате (сплошная линия - черный круг) соответствует количеству агентов (золотых наночастиц), связавшихся с тест -линией тест- полоски. Флуоресцентный сигнал молекулярного маяка (прерывистая линия - черный треугольник) соответствует количеству аналит-индуцированному раскрытию маяка для предотвращения тушения флуоресценции (analyte-unquenched) fluorescence.
Фиг. 15. Специфичность агента с распознающим олигонуклеотидом B4S к различным аналитам (олигонуклеотидам). Расчётная доля в комплексе получена с помощью NUPACK при 25оС, lMNa+, и концентрации компонент 1 нМ.
Фиг.16. Эффективность работы молекулярного маяка, основанного на том же распознающем олигонуклеотиде B4S, но сконъюгированном на концах с СуЗ и BHQ2 вместо биотина и тиола. Отклик системы на полностью комплементарный аналит (сплошная линия - черный круг) и неспецифичный полностью некомплементарный аналит (прерывистая линия - черный треугольник). Флуоресцентный сигнал молекулярного маяка соответствует количеству аналит-индуцированному раскрытию маяка для предотвращения тушения флуоресценции (analyte-unquenched) fluorescence.
Фиг.17. Функциональность агента на основе магнитных микросфер (РММ) с полистирольным покрытием. Эффективность взаимодействия PMM:B4N с различными мишенями (наночастицы FeH-HRP:Str или молекулярные конъюгаты HRP-Str) без и с преинкубацией с молекулярным стрепатвидином (как дополнительный контроль специфичности): без аналитов (штриховка снизу слева наверх вправо); в присутствии специфического аналита 4-lsp (штриховка снизу справа наверх влево); в присутствии неспецифического аналита Ins (штриховка вертикальная). Звездочка показывает статистическую значимость (*Р < 0.05, two-tailed unpaired Student t-test) внутри каждой группы между сигналом и контролем (PMM:B4N без аналита).
Фиг.18. Влияние функционирования агента GNP:B4S в 10 мМ фосфатном буфере, pH 7.4, 1 М NaCl (штриховка снизу вверх направо) и в том же буфере, но в присутствии ДНК фага лямбда (10 мг/л, 31.5 МДа), расщепленной эндонуклеазами: Alu I (штриховка снизу вверх налево), HpySE5261 (штриховка горизонтальная), and Fai I (штриховка вертикальная). ИХА формат, анти-биотиновые антитела на тест-линии, с добавлением 1нМ специфического аналита 4-lsp (редкая штриховка) и без добавления аналита (частая штриховка).
Фиг. 19. Отклик (сигнал) в хроматографическом анализе для агентов с распознающим олигонуклеотидом F4S (анти-ФИТЦ антитела на тест линии) или B4S (стрептавидин на тест-линии): без аналита (штрих снизу слева наверх вправо); с неспецифичным аналитом - 1нМ олигонуклеотидом Ins (штрих снизу справа наверх влево), со специфичным аналитом - 1 нМ олигонуклеотидом 4-lsp (горизонтальный штрих). Буферы: фосфатный pH 7.4; фостфат-цитратный pH 4.0.
Фиг.20. Улучшенный предел детекции аналита агентом GNP:B4S для ИХА теста при использовании анти-биотиновых антител на тест-линии (вместо стрептавидина). Специфичный аналит - 4-lsp (сплошная линия - черные круги); неспецифичный - тсДНК#3 and тсДНК#4 (прерывистые линии, пустые ромб и квадрат, см. последовательности на Фиг. 15). Фиг.21. Применение разработанного СМ для клеточного таргетинга, управляемого внешним сигналом (аналитом). Исследование эффективности связывания агентов 3H:B4S:F4S с НЕК2/пеи-позитивными (SK-BR-3) и НЕК2/пеи-негативными (СНО) линиями клеток при помощи конъюгата стрептавидин-трастузумаб (антител против HER2/neu) в ответ на присутствие специфического аналита (входной) тсДНК#1 (см. данные по селективности агентов в отношении различных входных ДНК на Фиг.22).
Фиг.22. Специфифичность GNP:B4S:F4S агента к аналитам при таргетинге раковых клеток. Гистограмы интенсивности ФАМ канала показывают связывание агентов с HER2/neu- положительными клетками SK-BR-3 через конъюгат стрептавидин-трастузумаб (анти- HER2/neu антитело) в ответ на различные олигонуклеотиды с разной длиной и комплементарностью к распознающему олигонуклеотиду (см. последовательности на Фиг.15).
Фиг. 23. Верификация специфичности агентов к аналиту. Связывание агента GNP:B4S с сигнальным лигандом стрептавидином на тест линии. Аналиты: специфичный 1с - 4-lsp; неспецифичные - In - Ins; 2n - 2ns (см. Фиг. 8).
Фиг. 24. Верификация специфичности агентов к мишени. Связывание агента GNP:B4S с сигнальными лигандами на тест-линии - стрептавидином, стрептавидином заигнгибированном избытком биотинилированного бычьего сывороточного альбумина (биоБСА) и анти-ФИТЦ антителами. Отсутствие штриховки - нет аналита; Вертикальная штриховка - 0.1 мкМ неспецифичный аналит (Ins); Косая штриховка вправо - 0.1 мкМ специфичный аналит (4-lsp).
Фиг.25. Отклик (сигнал) в отсутствии аналитов в хроматографическом анализе для агентов с распознающими олигонуклеотидами, содежащим различное количество аденозинов на конце, с которым связан сигнальный рецептор биотин: Сплошная линия и черные круги - B(0A)4S (без терминальных аденозинов), прерывистая линия и пустые квадраты - B4S (один аденозин), точечная линия и пустые треугольники - B(3A)4S (три аденозина). Последовательности распознающих олигонуклеотидов указаны на Фиг. 8.
Фиг.26. Отклик (сигнал) агентов на олигонуклеотиды-аналиты различных длина в ИХА формате с анти-биотиновыми антителами на тест-линии. Аналиты: 5'-
TCACCTCCCTCCGCAATACTCCCCCAGGT-3’ (без штриховки); 5'-
TCCGCAATACTCCCC-3’ (снизу вверх направо); 5'-ААТАСТСССС-3’ (снизу вверх налево); 5'-АСТСССС-3’ (перекрестная штриховка); 5'-ТСССС-3’ (горизонтальная штриховка).

Claims

Формула
1) Метод определения содержания аналита в образце с помощью аналитического агента, включающий стадию контактирования упомянутого образца с упомянутым аналитическим агентом, содержащим наночастицу, в условиях, которые позволяют связываться аналиту со связанным с упомянутой наночастицей одноцепочечным распознающим олигонуклеотидом, причем упомянутая наночастица связана с первым концом упомянутого распознающего олигонуклеотида, упомянутый распознающий олигонуклеотид способен специфически связываться с аналитом, второй конец упомянутого распознающего олигонуклеотида ковалентно связан с сигнальным рецептором, упомянутый сигнальный рецептор не способен специфически связываться с упомянутым аналитом, упомянутый сигнальный рецептор способен специфически связываться с сигнальным лигандом, дальнейшее приведение упомянутого аналитического агента в контакт с сигнальным лигандом, детектирование количества связавшихся наночастиц упомянутого аналитического агента с упомянутым сигнальным лигандом как меры содержания аналита в упомянутом образце, отличающийся тем, что упомянутый распознающий олигонуклеотид на упомянутом аналитическом агенте не имеет шпилек, включающих в себя более, чем 7 пар комплементарных нуклеотидов.
2) Метод по п.1, в котором упомянутый распознающий олигонуклеотид на упомянутом аналитическом агенте не имеет шпилек, включающих в себя более, чем 5 пар комплементарных нуклеотидов.
3) Метод по п.1, в котором упомянутый распознающий олигонуклеотид на упомянутом аналитическом агенте не имеет шпилек, включающих в себя более, чем 3 пары комплементарных нуклеотидов. 4) Метод по п.1, в котором упомянутый распознающий олигонуклеотид на упомянутом аналитическом агенте не имеет шпилек, включающих в себя более, чем 2 пары комплементарных нуклеотидов.
5) Метод по п.1, в котором упомянутый распознающий олигонуклеотид не имеет шпилек.
6) Метод по п.1, в котором упомянутый распознающий олигонуклеотид имеет структуру с энергией образования менее энергетическую, чем -8 ккал/моль.
7) Метод по п.1, в котором упомянутый распознающий олигонуклеотид имеет структуру с энергией образования менее энергетическую, чем -5 ккал/моль.
8) Метод по п.1, в котором упомянутый распознающий олигонуклеотид имеет структуру с энергией образования менее энергетическую, чем -3 ккал/моль.
9) Метод по п.1, в котором упомянутый распознающий олигонуклеотид имеет структуру с энергией образования менее энергетическую, чем -1 ккал/моль.
10) Метод по и.1, в котором упомянутая наночастица связана с первым концом упомянутого распознающего олигонуклеотида за счет SH-группы упомянутого распознающего олигонуклеотида, причем связывание упомянутой частицы с упомянутым одноцепочечным распознающим олигонуклеотидом производят из раствора, не содержащего веществ, имеющих SH-группы, кроме олигонуклеотидов.
11) Метод по и.1, в котором упомянутая наночастица связана с первым концом упомянутого распознающего олигонуклеотида за счет SH-группы упомянутого распознающего олигонуклеотида, причем связывание упомянутой частицы с упомянутым одноцепочечным распознающим олигонуклеотидом производят из раствора, не содержащего меркапто- углеводородов (тиолов).
12) Метод по п.1, в котором упомянутая наночастица связана с первым концом упомянутого распознающего олигонуклеотида за счет тиольной группы упомянутого распознающего олигонуклеотида, причем связывание упомянутой частицы с упомянутым одноцепочечным распознающим олигонуклеотидом производят из раствора, не содержащего веществ, имеющих SH-группы, кроме упомянутого одноцепочечного распознающего олигонуклеотида.
13) Метод по п.1, в котором упомянутая наночастица имеет золотую поверхность, а последним нуклеотидом на упомянутом втором конце упомянутого одноцепочечного распознающего олигонуклеотида является аденозин, который за счет сродства к золоту приближает упомянутый сигнальный рецептор к поверхности упомянутой наночастицы в отсутствие аналита и тем самым снижает связывание сигнального рецептора с сигнальным лигандом, причем связывание аналита с упомянутым одноцепочечным распознающим олигонуклеотидом вызывает пространственное распрямление упомянутого одноцепочечного распознающего олигонуклеотида и отдаление упомянутого сигнального рецептора от поверхности упомянутой наночастицы и тем самым увеличивает связывание сигнального рецептора с сигнальным лигандом. 14) Метод по п.1, в котором упомянутая наночастица имеет золотую поверхность, а последними нуклеотидами на упомянутом втором конце упомянутого одноцепочечного распознающего олигонуклеотида является не менее 2 аденозинов, которые за счет сродства к золоту приближают упомянутый сигнальный рецептор к поверхности упомянутой наночастицы в отсутствие аналита, что снижает связывание сигнального рецептора с сигнальным лигандом, причем связывание аналита с упомянутым одноцепочечным распознающим олигонуклеотидом вызывает пространственное распрямление упомянутого одноцепочечного распознающего олигонуклеотида и отдаление упомянутого сигнального рецептора от поверхности упомянутой наночастицы, что увеличивает связывание сигнального рецептора с сигнальным лигандом.
15) Метод по п.1, в котором упомянутая наночастица имеет золотую поверхность, а последними нуклеотидами на упомянутом втором конце упомянутого одноцепочечного распознающего олигонуклеотида является не менее 3 аденозинов, которые за счет сродства к золоту приближают упомянутый сигнальный рецептор к поверхности упомянутой наночастицы в отсутствие аналита, что снижает связывание сигнального рецептора с сигнальным лигандом, причем связывание аналита с упомянутым одноцепочечным распознающим олигонуклеотидом вызывает пространственное распрямление упомянутого одноцепочечного распознающего олигонуклеотида и отдаление упомянутого сигнального рецептора от поверхности упомянутой наночастицы, что увеличивает связывание сигнального рецептора с сигнальным лигандом.
16) Метод по п.1, в котором упомянутый сигнальный рецептор связан на упомянутом втором конце упомянутого распознающего олигонуклеотида с аденозином, который за счет сродства к золоту приближает упомянутый сигнальный рецептор к поверхности упомянутой наночастицы в отсутствие аналита, причем связывание аналита с упомянутым одноцепочечным распознающим олигонуклеотидом вызывает пространственное распрямление упомянутого одноцепочечного распознающего олигонуклеотида и отдаление упомянутого сигнального рецептора от поверхности упомянутой наночастицы, что увеличивает связывание сигнального рецептора с сигнальным лигандом.
17) Метод по п.1, в котором упомянутый сигнальный рецептор связан на упомянутом втором конце упомянутого распознающего олигонуклеотида с полиаденозином, который за счет сродства к золоту приближает упомянутый сигнальный рецептор к поверхности упомянутой наночастицы в отсутствие аналита, причем связывание аналита с упомянутым одноцепочечным распознающим олигонуклеотидом вызывает пространственное распрямление упомянутого одноцепочечного распознающего олигонуклеотида и отдаление упомянутого сигнального рецептора от поверхности упомянутой наночастицы, что увеличивает связывание сигнального рецептора с сигнальным лигандом.
18) Метод по п.17, в котором упомянутый полиаденозин содержит не менее 2 аденозинов.
19) Метод по п.17, в котором упомянутый полиаденозин содержит не менее 3 аденозинов. 20) Метод по п.1, в котором упомянутая наночастица выполнена из золота.
21) Метод по п.1, в котором упомянутая наночастица имеет структуру ядра из магнитного материала с оболочной из золота.
22) Метод по п.1, в котором, упомянутая наночастица выполнена из магнитного материала.
23) Метод по пп.21-22, в котором детектирование количества связавшихся наночастиц, имеющих структуру ядра из магнитного материала с оболочной из золота, осуществляют по нелинейному перемагничиванию на двух частотах переменного магнитного поля с регистрацией оклика на частотах, которые являются линейной комбинацией этих частот.
24) Метод по п.1, в котором упомянутый аналит является нуклеиновой кислотой.
25) Метод по п.1, в котором упомянутый аналит является малой молекулой.
26) Метод по п.1, в котором упомянутый аналит является белковым соединением.
27) Метод по п.1, в котором упомянутый распознающий олигонуклеотид является аптамером.
28) Метод по п.1, в котором упомянутый распознающий олигонуклеотид имеет длину не менее 15 нуклеотидов.
29) Метод по и.1 , в котором упомянутый распознающий олигонуклеотид имеет длину не менее 20 нуклеотидов.
30) Метод по п.1, в котором упомянутый распознающий олигонуклеотид имеет длину не менее 25 нуклеотидов.
31) Метод по п.1, в котором упомянутый распознающий олигонуклеотид имеет длину не менее 27 нуклеотидов.
32) Метод по п.1, в котором упомянутый аналит является малой ДНК или малой РНК.
33) Метод по п.1, в котором упомянутый аналит является микро ДНК или микро РНК.
34) Метод по п.1, в котором упомянутый аналит является ДНК или РНК и имеет длину менее 25 нуклеотидов.
35) Метод по п.1, в котором упомянутый аналит является ДНК или РНК и имеет длину менее 20 нуклеотидов.
36) Метод по п.1, в котором упомянутый аналит является ДНК или РНК и имеет длину менее 17 нуклеотидов.
37) Метод по п.1, в котором упомянутый аналит является ДНК или РНК и имеет длину менее 15 нуклеотидов.
38) Метод по п.1, в котором упомянутый аналит является ДНК или РНК и имеет длину менее 12 нуклеотидов.
39) Метод по п.1, в котором упомянутый сигнальный лиганд иммобилизован на твердой фазе.
40) Метод по п.39, в котором упомянутая твердая фаза является поверхностью иммунохроматографической мембраны, поверхностью носителя тонкослойной или аффинной хроматографии. 41) Метод по п.39, в котором упомянутая твердая фаза является поверхностью микротитрационного планшета.
42) Метод по п.1, в котором упомянутый сигнальный лиганд иммобилизован на сигнальной наночастице.
43) Метод по п.42, в котором упомянутая сигнальная наночастица представляет собой наночастицу золота, а детекция связывания сигнального лиганда на сигнальной наночастице и сигнального рецептора упомянутой наночастицы упомянутого аналитического агента осуществляется оптически за счет детекции сдвига спектра плазмонного резонанса.
44) Метод по п.43, который осуществляется в гомогенном формате.
45) Метод по п.1, в котором детектирование количества связавшихся наночастиц с упомянутым сигнальным лигандом осуществляют при помощи оптических методов регистрации.
46) Метод по п.1, в котором детектирование количества связавшихся наночастиц с упомянутым сигнальным лигандом осуществляют при помощи магнитометрических методов регистрации.
47) Метод по п.1, в котором помимо упомянутого распознающего олигонуклеотида, на наночастице иммобилизуют дополнительное соединение, не способное к специфическому связыванию с аналитом.
48) Метод по п.47, в котором в качестве упомянутого дополнительного соединения используют тиолированные олигонуклеотиды.
49) Метод по п.47, в котором в качестве упомянутого дополнительного соединения используют молекулы тиолированных ДНК-олигонуклеотидов.
50) Метод по п.1, в котором детектирование количества связавшихся упомянутых наночастиц аналитического агента с упомянутым сигнальным лигандом осуществляют в течении менее чем 20 минут после начала анализа.
51) Метод по п.1, в котором детектирование количества связавшихся упомянутый наночастиц аналитического агента с упомянутым сигнальным лигандом осуществляют в течении менее чем 10 минут после начала анализа.
52) Метод по п.1, в котором упомянутым сигнальным рецептором является низкомолекулярный рецептор.
53) Метод по п.52, в котором упомянутым низкомолекулярным сигнальным рецептором является биотин.
54) Метод по п.52, в котором упомянутым низкомолекулярным сигнальным рецептором является флуоресцеин.
55) Метод по и.1 , в котором упомянутым лигандом сигнального рецептора является авидин, стрептавидин или нейтравидин.
56) Метод по п.1, в котором упомянутым лигандом сигнального рецептора является антитело. 57) Метод по п.56, в котором упомянутое антитело специфично взаимодействует с упомянутым сигнальным рецептором.
58) Метод по и.57, в котором упомянутое антитело специфично связывается с биотином.
59) Метод по п.57, в котором упомянутое антитело специфично связывается с флуоресцеином.
60) Метод по п.1, в котором доля аденозиновых остатков в структуре упомянутого распознающего олигонуклеотида не превышает 25%.
61) Метод по п.1, в котором упомянутый распознающий олигонуклеотид крепится на поверхности упомянутой наночастицы за свой 3 ’-конец, а сигнальный рецептор - за 5’- конец.
62) Метод по п.1, в котором упомянутый распознающий олигонуклеотид крепится на поверхности упомянутой наночастицы за свой 5 ’-конец, а сигнальный рецептор - за 3’- конец.
63) Метод по п.1, в котором упомянутый сигнальный рецептор крепится на упомянутом распознающем олигонуклеотиде в любом месте цепи, за исключением крайнего нуклеотида.
64) Метод определения содержания аналита в образце с помощью аналитического агента, включающий стадию контактирования упомянутого образца с упомянутым аналитическим агентом, содержащим наночастицу, в условиях, которые позволяют связываться аналиту со связанным с упомянутой наночастицей одноцепочечным распознающим олигонуклеотидом, причем упомянутая наночастица связана с первым концом упомянутого распознающего олигонуклеотида, упомянутый распознающий олигонуклеотид способен специфически связываться с аналитом, второй конец упомянутого распознающего олигонуклеотида ковалентно связан с сигнальным рецептором, упомянутый сигнальный рецептор не способен специфически связываться с упомянутым аналитом, упомянутый сигнальный рецептор способен специфически связываться с сигнальным лигандом, дальнейшее приведение упомянутого аналитического агента в контакт с сигнальным лигандом, детектирование количества связавшихся наночастиц упомянутого аналитического агента с упомянутым сигнальным лигандом как меры содержания аналита в упомянутом образце, отличающийся тем, что упомянутый распознающий олигонуклеотид на упомянутом аналитическом агенте не имеет шпилек.
65) Метод определения содержания аналита в образце с помощью аналитического агента, включающий стадию контактирования упомянутого образца с упомянутым аналитическим агентом, содержащим наночастицу, в условиях, которые позволяют связываться аналиту со связанным с упомянутой наночастицей одноцепочечным распознающим олигонуклеотидом, причем упомянутая наночастица связана с первым концом упомянутого распознающего олигонуклеотида, упомянутый распознающий олигонуклеотид способен специфически связываться с аналитом, второй конец упомянутого распознающего олигонуклеотида ковалентно связан с сигнальным рецептором, упомянутый сигнальный рецептор не способен специфически связываться с упомянутым аналитом, упомянутый сигнальный рецептор способен специфически связываться с сигнальным лигандом, дальнейшее приведение упомянутого аналитического агента в контакт с сигнальным лигандом, детектирование количества связавшихся наночастиц упомянутого аналитического агента с упомянутым сигнальным лигандом как меры содержания аналита в упомянутом образце, отличающийся тем, что все шпильки на упомянутом распознающем олигонуклеотиде расположены на расстоянии не менее, чем 3 нуклеотидов от нуклеотида упомянутого распознающего олигонуклеотида, с которым связан упомянутый сигнальный рецептор.
66) Метод по п.65, отличающийся тем, что все шпильки на упомянутом распознающем олигонуклеотиде расположены на расстоянии не менее, чем 5 нуклеотидов от нуклеотида упомянутого распознающего олигонуклеотида, с которым связан упомянутый сигнальный рецептор. 67) Метод по п.65, отличающийся тем, что все шпильки на упомянутом распознающем олигонуклеотиде расположены на расстоянии не менее, чем 7 нуклеотидов от нуклеотида упомянутого распознающего олигонуклеотида, с которым связан упомянутый сигнальный рецептор.
68) Метод по п.65, отличающийся тем, что все шпильки на упомянутом распознающем олигонуклеотиде расположены на расстоянии не менее, чем 10 нуклеотидов от нуклеотида упомянутого распознающего олигонуклеотида, с которым связан упомянутый сигнальный рецептор.
69) Метод по п.65, отличающийся тем, что все шпильки на упомянутом распознающем олигонуклеотиде расположены на расстоянии не менее, чем 12 нуклеотидов от нуклеотида упомянутого распознающего олигонуклеотида, с которым связан упомянутый сигнальный рецептор.
70) Метод по п.65, отличающийся тем, что все шпильки на упомянутом распознающем олигонуклеотиде расположены на расстоянии не менее, чем 15 нуклеотидов от нуклеотида упомянутого распознающего олигонуклеотида, с которым связан упомянутый сигнальный рецептор.
PCT/RU2021/050005 2020-01-14 2021-01-13 Метод определения содержания аналита в образце с помощью агента на основе наночастицы и распознающего олигонуклеотида WO2021145796A2 (ru)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
RU2020100862 2020-01-14
RU2020100862 2020-01-14

Publications (2)

Publication Number Publication Date
WO2021145796A2 true WO2021145796A2 (ru) 2021-07-22
WO2021145796A3 WO2021145796A3 (ru) 2021-09-10

Family

ID=76864755

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/RU2021/050005 WO2021145796A2 (ru) 2020-01-14 2021-01-13 Метод определения содержания аналита в образце с помощью агента на основе наночастицы и распознающего олигонуклеотида

Country Status (1)

Country Link
WO (1) WO2021145796A2 (ru)

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN115452787A (zh) * 2022-09-22 2022-12-09 山东理工大学 银纳米簇和金钯纳米粒子构建荧光传感器测牛奶中链霉素
CN115856297A (zh) * 2023-01-04 2023-03-28 吉林大学 一种检测鼠伤寒沙门氏菌的试剂盒的制备方法及试剂盒

Family Cites Families (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
AU2001243487A1 (en) * 2000-03-08 2001-09-17 Imagene Technology, Inc Lateral flow pcr with amplicon concentration and detection
KR101488800B1 (ko) * 2007-02-09 2015-02-04 노오쓰웨스턴 유니버시티 세포내 타겟 검출용 입자
US20110160090A1 (en) * 2008-05-05 2011-06-30 Los Alamos National Laboratory Nanocrystal-Based Lateral Flow Microarrays and Low-Voltage Signal Detection Systems

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN115452787A (zh) * 2022-09-22 2022-12-09 山东理工大学 银纳米簇和金钯纳米粒子构建荧光传感器测牛奶中链霉素
CN115856297A (zh) * 2023-01-04 2023-03-28 吉林大学 一种检测鼠伤寒沙门氏菌的试剂盒的制备方法及试剂盒
CN115856297B (zh) * 2023-01-04 2024-05-28 吉林大学 一种检测鼠伤寒沙门氏菌的试剂盒的制备方法及试剂盒

Also Published As

Publication number Publication date
WO2021145796A3 (ru) 2021-09-10

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Wang et al. Development of nucleic acid aptamer-based lateral flow assays: A robust platform for cost-effective point-of-care diagnosis
Cherkasov et al. Nanoparticle beacons: supersensitive smart materials with on/off-switchable affinity to biomedical targets
Atapour et al. Gold nanoparticle-based aptasensors: A promising perspective for early-stage detection of cancer biomarkers
Zhou et al. Aptamer-based biosensors for biomedical diagnostics
JP5860922B2 (ja) ビーズまたは他の捕捉物を用いた分子または粒子の超高感度検出
Zhang et al. Aptamer-conjugated gold nanoparticles for bioanalysis
Howes et al. Plasmonic nanomaterials for biodiagnostics
Dorraj et al. Selection of DNA aptamers against Human Cardiac Troponin I for colorimetric sensor based dot blot application
US20170159113A1 (en) Methods and compositions for detection of analytes
US8354231B2 (en) Methods and systems for detecting and/or sorting targets
JP2017079634A (ja) 生体試料中の目的とする細胞を検出する方法
JP2007537450A (ja) バイオバーコードに基づく標的検体の検出
Jaisankar et al. Recent developments of aptamer-based lateral flow assays for point-of-care (POC) diagnostics
Li et al. Nanomaterial-based biosensors using dual transducing elements for solution phase detection
WO2021145796A2 (ru) Метод определения содержания аналита в образце с помощью агента на основе наночастицы и распознающего олигонуклеотида
WO2007095279A2 (en) Dual nanoparticle assay for detection and separation of biological species
Lores-Padín et al. Nanoparticles as labels of specific-recognition reactions for the determination of biomolecules by inductively coupled plasma-mass spectrometry
Zhong et al. Expanding the scope of chemiluminescence in bioanalysis with functional nanomaterials
Hu et al. The sandwich-type aptasensor based on gold nanoparticles/DNA/magnetic beads for detection of cancer biomarker protein AGR2
Shi et al. Biointerface engineering with nucleic acid materials for biosensing applications
Shen et al. A novel sandwich-like cytosensor based on aptamers-modified magnetic beads and carbon dots/cobalt oxyhydroxide nanosheets for circulating tumor cells detection
US20120088232A1 (en) Aptamer-Based Device For Detection Of Cancer Markers And Methods Of Use
Zhu et al. Microfluidics-based technologies for the analysis of extracellular vesicles at the single-cell level and single-vesicle level
Liao et al. Sensitive fluorescent sensor for the fuzzy exosomes in serum based on the exosome imprinted polymer sandwiched with aggregation induced emission
Li et al. An exceptional and universal DNA walker amplified “one-to-many” CRISPR/Cas12a-mediated fluorescent biosensor for ultrasensitive detection of non-DNA biomarkers

Legal Events

Date Code Title Description
121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application

Ref document number: 21741448

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A2

NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: DE

122 Ep: pct application non-entry in european phase

Ref document number: 21741448

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A2