ES2856091T3 - Nanoconjugados capaces de atravesar la barrera hematoencefálica - Google Patents

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Abstract

Una composición para su uso en el tratamiento de un paciente que padece una enfermedad neurodegenerativa y en necesidad de una composición que es capaz de atravesar la barrera hematoencefálica, comprendiendo dicha composición un nanoconjungado funcionalizado que comprende una nanopartícula, comprendiendo el nanoconjugado un polinucleótido unido a la superficie que tiene una secuencia que es 75 % complementaria o más a un polinucleótido diana con el que se hibrida e inhibe la expresión del polinucleótido diana, en donde el nanoconjugado comprende 10 o más polinucleótidos sobre su superficie y tiene una masa de al menos 1 kilodalton.

Description

DESCRIPCIÓN
Nanoconjugados capaces de atravesar la barrera hematoencefálica
CAMPO DE LA INVENCIÓN
La presente divulgación se refiere a nanoconjugados que atraviesan la barrera hematoencefálica y a métodos de su uso terapéutico.
ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN
El cerebro es único al permitir solo un acceso selecto a las moléculas. Aunque esto es un mecanismo protector útil, también previene que agentes moleculares posiblemente beneficiosos accedan al sistema nervioso central (SNC) y, como tales, los agentes moleculares son incapaces de ejercer un efecto terapéutico en muchos trastornos neurológicos u otras afecciones del SNC.
La barrera hematoencefálica (BHE) realiza una función neuroprotectora controlando estrictamente el acceso al cerebro; por consiguiente, también impide al acceso de agentes farmacológicos a los tejidos cerebrales, que necesitan el uso de vectores para su tránsito. La permeabilidad de la barrera hematoencefálica (BHE) es frecuentemente un factor limitante de la velocidad para la penetración de fármacos o péptidos en el SNC [Pardridge, Neurovirol. 5: 556­ 569 (1999); Bickel et al., Adv. Drug Deliv. Rev. 46: 247-279 (2001)]. El cerebro se protege de sustancias posiblemente tóxicas por la BHE, que está formada por células endoteliales capilares del cerebro que están estrechamente selladas por zonas de oclusión. Además, los capilares del cerebro poseen algunas ventanas y algunas vesículas endocíticas, en comparación con los capilares de otros órganos [Pardridge, Neurovirol. 5: 556-569 (1999)]. Existe poco tránsito a través de la BHE de moléculas hidrófilas grandes, aparte de algunas proteínas específicas tales como transferrina, lactoferrina y lipoproteínas de baja densidad, que son captadas por transcitosis mediada por receptor (RMT) [Pardridge, Neurovirol. 5: 556-569 (1999); Tsuji et al., Adv. Drug Deliv. Rev. 36: 277-290 (1999); Kusuhara et al., Drug Discov. Today 6: 150-156 (2001); Dehouck et al. J. Cell. Biol. 138: 877-889 (1997); y Fillebeen et al., J. Biol. Chem.
274:7011-7017 (1999)].
El documento de patente US 2010/233084 A1 desvela composiciones y métodos útiles de administración de agentes a células o tejidos diana. Las composiciones y los métodos son útiles para administrar agentes a través de la barrera hematoencefálica. También se desvelan métodos de uso de las composiciones desveladas para administrar agentes, por ejemplo, agentes terapéuticos para el tratamiento de trastornos neurológicamente relacionados.
Ljubimova et al. Chem. Biol. Interact 171 (2):195-203 desvelan un sistema de administración de fármacos derivado de polímero, el nanoconjugado Polycefin, y su capacidad para dirigir la administración de oligonucleótidos antisentido de morfolino en ciertos tumores.
El documento de patente WO 2011/028847 A1 desvela composiciones y métodos de administración de un agente quimioterapéutico por una nanopartícula funcionalizada con polinucleótidos.
Bonoiu et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 106(4):5546-5550 desvela complejos de nanovarillas de oro-ARNip (nanoplejos) para el direccionamiento de la vía de señalización de dopaminérgicos en el cerebro para la terapia de toxicomanías.
El glioma maligno (GM) representa el cáncer primario más prevalente y letal del sistema nervioso central. Los pacientes diagnosticados con el GM de grado más alto, el glioblastoma multiforme (GBM) de grado IV, solo sobreviven 9-12 meses después del diagnóstico, a pesar de la extirpación quirúrgica y pautas de tratamiento agresivas. Enfoques multimodales que usan radiación con quimioterapia unida (temozolamida (TMZ)) solo produjeron aumentos mínimos en la supervivencia de los pacientes de hasta 14,6 meses. Además, la reaparición es casi universal y las terapias de rescate de dicha progresión siguen siendo ineficaces. El GBM sigue siendo una enfermedad altamente enigmática e incurable, particularmente debido a una población de células madre de cáncer altamente resistente a la terapia (célula madre de tumor cerebral, CMTC) y a un entendimiento incompleto de cómo las aberraciones genéticas catalogadas imponen distintivos fenotípicos de la enfermedad. Es altamente resistente incluso a una terapia intensa (apoptosis), a pesar de la florida necrogénesis intratumoral. La continua falta de éxito en el tratamiento de gliomas de gran malignidad con inhibidores de tirosina cinasas receptoras dirigidas, que se ha demostrado que son eficaces en otros tumores malignos, ha provocado una revaluación de todos los aspectos del desarrollo de fármacos para el glioma y subrayado la necesidad global de desarrollar una plataforma tecnológica innovadora y de refinar sistemas modelo basados en cultivo celular e in vivo para combatir la enfermedad.
SUMARIO DE LA INVENCIÓN
Los nanoconjugados polivalentes tratan los retos críticos descritos anteriormente en múltiples niveles. El terapéutico dirigido de entidad única es capaz de atravesar la barrera hematoencefálica (BHE) y así es eficaz en el tratamiento de los trastornos del sistema nervioso central (SNC). Además, a pesar de la captación celular enormemente alta de los nanoconjugados, no presentan toxicidad en los tipos de células probadas hasta la fecha (véase la Tabla 1, a continuación). Esta propiedad es crítica para aplicaciones de administración de agentes terapéuticos para reducir los efectos inespecíficos.
Tabla 1
Tipo de célula Designación o fuente
Mama SKBR3, MDA-MB-321, AU-565
Cerebro U87, LN229
Vejiga HT-1376, 5637, T24
Colon LS513
Cuello uterino HeLa, SiHa
Piel C166, KB, MCF, lOA
Riñón MDCK
Sangre Sup T1, Jurkat
Leucemia K562
Hígado HepG2
Riñón 293T
Ovario CHO
Macrófago RAW 264.7
Neuronas del hipocampo primaria, rata
Astrocitos primaria, rata
Células de la glía primaria, rata
Vejiga primaria, humana
Eritrocitos primaria, ratón
Célula mononuclear de sangre periférica primaria, ratón
Linfocitos T primaria, humana
Islotes beta primaria, ratón
Piel primaria, ratón
Aunque algunos de los tipos de células mostrados en la Tabla 1 son células del cerebro/sistema nervioso, los datos se recopilaron de experimentos in vitro.
La invención proporciona una composición para su uso en el tratamiento de un paciente que padece una enfermedad neurodegenerativa y en necesidad de una composición que es capaz de atravesar la barrera hematoencefálica, comprendiendo dicha composición un nanoconjugado funcionalizado que comprende una nanopartícula, comprendiendo el nanoconjugado un polinucleótido unido a la superficie que tiene una secuencia que es 75 % complementaria o superior a un polinucleótido diana con el que se hibrida e inhibe la expresión del polinucleótido diana, en donde el nanoconjugado comprende 10 o más polinucleótidos sobre su superficie y tiene una masa de al menos 1 kilodalton.
En un aspecto, la divulgación proporciona una composición que comprende un nanoconjugado, comprendiendo el nanoconjugado un polinucleótido que es suficientemente complementario a un polinucleótido diana que codifica un polipéptido específicamente expresado en un trastorno del sistema nervioso central (SNC), teniendo el nanoconjugado la capacidad de atravesar la barrera hematoencefálica (BHE). En algunas composiciones descritas en el presente documento, la composición comprende además un resto de direccionamiento. En diversas realizaciones, el trastorno se puede provocar por expresión génica aberrante. En algunas realizaciones, la composición comprende además un agente terapéutico, y en composiciones adicionales descritas en el presente documento, el agente terapéutico es temozolamida. En algunas realizaciones, el nanoconjugado comprende además un resto de direccionamiento y/o un agente terapéutico.
En realizaciones adicionales, se contempla que el trastorno es agudo y/o crónico.
En los ejemplos descritos en el presente documento, el trastorno agudo se selecciona del grupo que consiste en isquemia cerebral focal, isquemia cerebral global, traumatismo cerebral, lesión de la médula espinal, infecciones agudas, estado epiléptico, jaqueca, psicosis aguda, depresión suicida y ansiedad/fobia aguda, y enfermedades relacionadas con lesiones, que incluyen, pero no se limitan a, lesión cerebral traumática e hinchazón. En realizaciones adicionales, el trastorno crónico se selecciona del grupo que consiste en neurodegeneración crónica, degeneración retiniana, depresión, trastornos afectivos crónicos, trastornos del almacenamiento lisosómico, infecciones crónicas del cerebro, cáncer cerebral, rehabilitación de accidente cerebrovascular, enzimopatía congénita, autismo y retraso mental.
El nanoconjugado tiene una masa que es al menos aproximadamente 1000, o aproximadamente 1200 o más daltones. En algunas realizaciones, el nanoconjugado tiene una masa que es al menos aproximadamente 2, aproximadamente 3, aproximadamente 5, aproximadamente 10, aproximadamente 20, aproximadamente 30, aproximadamente 40, aproximadamente 50, aproximadamente 60, aproximadamente 70, aproximadamente 80, aproximadamente 90, aproximadamente 100, aproximadamente200, aproximadamente 500, aproximadamente 700, aproximadamente 900 o más kilodaltones.
En algunas realizaciones, un nanoconjugado de la divulgación posee una medición de potencial zeta (carga superficial) de desde aproximadamente -10 milivoltios (mV) hasta aproximadamente -50 milivoltios (mV). En realizaciones adicionales, el nanoconjugado posee una medición de potencial zeta de desde aproximadamente -10 mV hasta aproximadamente -40 mV, o desde aproximadamente -10 mV hasta aproximadamente -30 mV, o desde aproximadamente -20 mV hasta aproximadamente -50 mV, o desde aproximadamente -20 mV hasta aproximadamente -40 mV, o desde aproximadamente -30 mV hasta aproximadamente -45 mV, o desde aproximadamente -30 mV hasta aproximadamente -50 mV. En algunas realizaciones, el nanoconjugado posee una medición de potencial zeta de aproximadamente -10 mV, aproximadamente -15 mV, aproximadamente -20 mV, aproximadamente -25 mV, aproximadamente -30mV, aproximadamente -35 mV, aproximadamente -40 mV, aproximadamente -45 mV o aproximadamente -50 mV.
En un aspecto, la divulgación proporciona un método de tratamiento de un paciente en necesidad de una composición que es capaz de atravesar la barrera hematoencefálica, que comprende administrar al paciente una cantidad terapéuticamente eficaz de una composición que comprende un nanoconjugado funcionalizado, comprendiendo el nanoconjugado un polinucleótido que tiene una secuencia suficientemente complementaria a un polinucleótido diana con el que se hibrida e inhibe la expresión del polinucleótido diana. En algunas realizaciones de la invención, se contempla que el paciente es un ser humano.
También se describe en el presente documento un método de administración de una composición que comprende un nanoconjungado funcionalizado a un paciente, comprendiendo el método administrar al paciente una cantidad terapéuticamente eficaz de la composición; en donde el nanoconjugado comprende un polinucleótido que tiene una secuencia suficientemente complementaria a un polinucleótido diana con el que se hibrida e inhibe la expresión del polinucleótido diana, teniendo dicha composición la capacidad de atravesar la barrera hematoencefálica, y en donde el paciente está en necesidad de una composición que es capaz de atravesar la barrera hematoencefálica.
En algunas realizaciones, una composición como se describe en el presente documento comprende además un agente terapéutico. En cualquiera de los aspectos o realizaciones de la divulgación, el paciente padece un trastorno del sistema nervioso central (SNC). En cualquiera de los aspectos o realizaciones de la divulgación, el paciente padece un trastorno provocado por expresión génica aberrante.
En algunas realizaciones, el paciente padece un trastorno agudo y/o crónico. Donde el paciente padece un trastorno agudo, se contempla además que el trastorno agudo se puede seleccionar del grupo que consiste en isquemia cerebral focal, isquemia cerebral global, traumatismo cerebral, lesión de la médula espinal, infecciones agudas, estado epiléptico (EE), jaqueca, psicosis aguda, depresión suicida y ansiedad/fobia aguda, y enfermedades relacionadas con lesiones, que incluyen, pero no se limitan a, lesión cerebral traumática e hinchazón.
En realizaciones donde el paciente padece un trastorno crónico, se contempla además que el trastorno crónico se selecciona del grupo que consiste en neurodegeneración crónica, degeneración retiniana, depresión, trastornos afectivos crónicos, trastornos del almacenamiento lisosómico, infecciones crónicas del cerebro, cáncer cerebral, rehabilitación de accidente cerebrovascular, enzimopatía congénita, autismo y retraso mental.
En algunas realizaciones, una composición de la divulgación se administra solo una vez. En algunas realizaciones, una composición de la divulgación se administra a una frecuencia de no más de aproximadamente una vez por semana.
También se describe en el presente documento un paquete o kit que comprende (a) un nanoconjugado o composición que comprende un nanoconjugado, opcionalmente en un recipiente, (b) opcionalmente un agente terapéutico adicional; y (c) un prospecto, etiqueta del envase, instrucciones u otro etiquetado que se refiere a o que desvela cualquiera de los métodos o realizaciones desvelados en el presente documento.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS
La Figura 1 representa la expresión de Bcl2L12 (A) y el perfil de activación de RTK (B) en glioma seleccionado, líneas de BTSC y explantes.
La Figura 2 muestra que los nanoconjugados de ARN silencian eficazmente la expresión de Bcl2L12. (A y B) Se trataron líneas celulares de glioma y huBTSC_18 con las cantidades indicadas de nanoconjugados de ARN (nanoconjugado de control (Co)/secuencia de ARN mezclada-NP de ARN-Au-Co-ARN y nanoconjugados de ARN que se dirigen a Bcl2L12 - nanoconjugados de L12-1-ARN y L12-2-ARN) y se sometieron a qRT-PCR (A) y análisis de transferencia Western (B). Se indican las posiciones de migración de Bcl2L12 y Hsp70. La banda marcada con * representa Bcl2L12 postraduccionalmente modificado. (C) Se compararon las eficacias de inactivación con ARNip administrados por lipoplejos convencionales. (D) Para estudios de persistencia de la inactivación, se trataron células LN235 con nanoconjugados de L12-ARN (1 nM) durante 5 días, y se sometieron a análisis de transferencia Western anti-Bcl2L12. (E) La inactivación de Bcl2L12 mediada por nanoconjugados de ARN da como resultado la potenciada activación de caspasa. Se trataron células LN235 tratadas con nanoconjugados de Co, L12-1- y L12-2 con estaurosporina (STS, 500 nM) durante los periodos de tiempo indicados, se lisaron y se sometieron a análisis de transferencia Western para las caspasas 3 y 7 activas. Se indican las posiciones de migración de las subunidades activas (grande, LS; grande y grande péptido N, LS+N) y Hsp70 (control de carga). Los histogramas cuantifican la expresión de Bcl2L12 como se evalúa por análisis densitométricos de transferencias Western correspondientes.
La Figura 3 muestra que la neutralización de aB-cristalina en células LN235 da como resultado un potencial invasivo reducido y aumenta la susceptibilidad hacia la apoptosis instigada por STS. (A) Se trataron células LN235 con nanoconjugados que se dirigen a aB-cristalina o ARNip, se lisaron y se sometieron a análisis de transferencia Western usando aB-cristalina y anticuerpos específicos de Hsp70. (B) Se sometieron células tratadas con nanoconjugado de CRYAB-ARN y Co-ARN a ensayos de invasión en Matrigel y se cuantificaron los números de células invasoras por tinción con azul de tripano. (C) Se trataron células LN235 tratadas con nanoconjugado de Co-CRYAB-1-ARN y CRYAB-2-ARN y se analizaron como se describen en Figura 2E. LS, subunidad grande; LS+N, subunidad grande péptido N. Los histogramas cuantifican la expresión de Bcl2L12 como se evalúa por análisis densitométricos de transferencias Western correspondientes.
La Figura 4 muestra la captación intratumoral de nanoconjugados como se evalúa por inmunofluorescencia confocal de NP de Au marcadas con Cy5 (A), por ICP-EM (C) y por IRM (D) de nanoconjugados de ADN-Gd(III) localmente administrados en cerebro normal y estructuras de explante. (B) muestra la cuantificación de la dispersión con el tiempo usando imágenes de IF confocales de cortes frontales sucesivos.
La Figura 5 muestra la captación intratumoral de nanoconjugados - Administración intracraneal frente a intravenosa como se evalúa por ICP-EM (A) Administración intracraneal directa (LC) de nanoconjugados de Co-ARN (5 pL, 300 nM). Los nanoconjugados se administraron localmente una vez y luego se recogió el cerebro y los tejidos tumorales 48 horas después de la administración. (B) Inyección intravenosa (I.V.) sistémica de nanoconjugados de Co-ARN (100 pL, 300 nM). Cuatro inyecciones de nanoconjugados cada 48 horas. Los tejidos se recogieron 24 horas después de la cuarta inyección.
La Figura 6 muestra los efectos de nanoconjugados de ARN sobre la supervivencia de ratones con tumor. Se administraron nanoconjugados de Co-ARN, L12-1-ARN y L12-2-ARN a ratones por inyección en la vena de la cola (I.V.). Cada ratón recibió 5 inyecciones (1,4 mg/kg de ARN por inyección que asciende a 7 mg/kg de tratamiento, aproximadamente 150-200 pL de nanoconjugados de ARN a 500 nM). No se observó diferencia en los días de supervivencia entre los grupos de tratamiento con los nanoconjugados de Co-ARN y L12-1-ARN (p = 0,50). Sin embargo, se observó una diferencia significativa entre los grupos de tratamiento de nanoconjugados de Co-ARN y L12-2-ARN (p = 0,01).
DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN
La barrera hematoencefálica es un factor limitante en la administración de muchos agentes periféricamente administrados al sistema nervioso central. La presente divulgación proporciona nanoconjugados que son capaces de atravesar la BHE, y retienen su actividad una vez que atraviesan la BHE. Diversos aspectos de la invención tratan estos factores, proporcionando nanoconjugados que tienen una o más biomoléculas asociadas a ellos. En algunas realizaciones, el nanoconjugado se asocia o administra además conjuntamente con un agente terapéutico.
"Tratamiento" o "tratar", como se usa en el presente documento, incluye alcanzar un beneficio terapéutico y/o un beneficio profiláctico. Por beneficio terapéutico se indica la erradicación o mejora del trastorno o afección subyacente que está tratándose. Por ejemplo, en un individuo con un trastorno neurológico, el beneficio terapéutico incluye la parada parcial o completa de la progresión del trastorno, o la inversión parcial o completa del trastorno. Por tanto, se logra un beneficio terapéutico con la erradicación o mejora de uno o más de los síntomas fisiológicos o psicológicos asociados a la afección subyacente, de forma que se observa una mejora en el paciente, a pesar del hecho de que el paciente puede estar todavía afectado por la afección. Un beneficio profiláctico del tratamiento incluye la prevención de una afección, retraso del progreso de una afección (por ejemplo, ralentizamiento de la progresión de un trastorno neurológico), o disminución de la probabilidad de manifestación de una afección. Como se usa en el presente documento, "tratar" o "tratamiento" incluyen la profilaxis.
En algunas realizaciones, un nanoconjugado se "administra periféricamente". Como se usa en el presente documento, este término se refiere a cualquier forma de administración de un nanoconjugado, opcionalmente se administra simultáneamente con un agente terapéutico, a un individuo que no sea administración directa al SNC, es decir, que ponga el agente en contacto con el lado no cerebral de la barrera hematoencefálica. "Administración periférica", como se usa en el presente documento, incluye administración intravenosa, subcutánea, intramuscular, intraperitoneal, transdérmica, por inhalación, transbucal, intranasal, rectal y oral.
Como se usa en el presente documento, "hibridación" significa una interacción entre dos o tres cadenas de ácidos nucleicos por enlaces de hidrógeno según las reglas de complementariedad de ADN de Watson-Crick, unión de Hoogstein, u otra unión específica de secuencia conocida en la técnica. La hibridación se puede realizar en diferentes condiciones de rigurosidad conocidas en la técnica. "Hibridar específicamente", como se usa en el presente documento, es la hibridación que permite un dúplex estabilizado entre las cadenas de polinucleótido que son complementarias o sustancialmente complementarias. Por ejemplo, una cadena de polinucleótido que tiene 21 unidades de nucleótido puede emparejar bases con otro polinucleótido de 21 unidades de nucleótido, pero solo 19 bases en cada cadena son complementarias o suficientemente complementarias, de forma que el "dúplex" tiene 19 pares de bases. Las bases restantes pueden existir, por ejemplo, como nucleótidos protuberantes en 5' y/o 3'. Además, dentro del dúplex, no se requiere 100 % de complementariedad; es permisible complementariedad sustancial dentro de un dúplex. Complementariedad suficiente se refiere a 75 % o mayor complementariedad. Por ejemplo, un desapareamiento en un dúplex que consiste en 19 pares de bases produce 94,7 % de complementariedad, que hace que el dúplex sea suficientemente complementario.
Los términos "cantidad terapéuticamente eficaz", como se usa en el presente documento, se refiere a una cantidad de un compuesto suficiente para tratar, mejorar o prevenir la enfermedad o afección identificada, o para presentar un efecto terapéutico, profiláctico o inhibidor detectable. El efecto se puede detectar, por ejemplo, por una mejora en el estado clínico, o reducción en los síntomas. La cantidad eficaz precisa para un sujeto dependerá del peso corporal del sujeto, el tamaño y la salud; la naturaleza y el grado de la afección; y el terapéutico o la combinación de terapéuticos seleccionados para la administración. Si un fármaco ha sido autorizado por la Administración de Medicamentos y Alimentos de los EE.UU. (FDA), una "cantidad terapéuticamente eficaz" se refiere a la dosis autorizada por la FDA o su agencia extranjera homóloga para el tratamiento de la enfermedad o afección identificada.
Como se usa en el presente documento, un paciente "en necesidad de una composición que es capaz de atravesar la barrera hematoencefálica" es un paciente que se beneficiaría de una composición que es capaz de atravesar la barrera hematoencefálica. Puede ser que el paciente padezca alguna enfermedad o afección para la que la terapia con una composición que es capaz de atravesar la barrera hematoencefálica pueda ser útil en mejorar los síntomas.
Un "trastorno del SNC" o "trastorno de SNC", ya que esos términos se usan en el presente documento, engloba cualquier afección que afecte el cerebro y/o la médula espinal y que conduzca a una función inferior a la óptima. En algunos ejemplos descritos en el presente documento, el trastorno es un trastorno agudo. Los trastornos agudos del SNC incluyen isquemia cerebral focal, isquemia cerebral global, traumatismo cerebral, lesión de la médula espinal, infecciones agudas, estado epiléptico (EE), jaqueca, psicosis aguda, depresión suicida y ansiedad/fobia aguda. En algunas realizaciones, el trastorno es un trastorno crónico. Los trastornos crónicos del SNC incluyen neurodegeneración crónica, degeneración retiniana, depresión, trastornos afectivos crónicos, trastornos del almacenamiento lisosómico, infecciones crónicas del cerebro, cáncer cerebral, rehabilitación de accidente cerebrovascular, enzimopatía congénita, autismo, retraso mental. En algunas realizaciones, la enfermedad neurodegenerativa es enfermedad priónica, enfermedad de Alzheimer (EA), enfermedad de Parkinson (EP), enfermedad de Huntington (EH), esclerosis múltiple (EM), esclerosis lateral amiotrófica (ELA), mielitis transversa, enfermedad de las neuronas motoras, enfermedad de Pick, esclerosis tuberosa, trastornos de almacenamiento lisosómico, enfermedad de Canavan, síndrome de Rett, ataxias espinocerebelosas, ataxia de Friedreich, atrofia óptica y degeneración retiniana, o envejecimiento del SNC.
Como se usa en el presente documento, se entiende que "uso concomitante" es intercambiable con administración concurrente o administración simultánea. Así, se entiende que los términos engloban la administración simultáneamente, o en momentos diferentes, y por la misma vía o por vías diferentes, en tanto que los dos agentes se administren de un modo que permita que ambos agentes estén afectando el cuerpo al mismo tiempo. Por ejemplo, el uso concomitante se puede referir a una medicación concomitantemente administrada, si se receta por el mismo médico o un médico diferente, o para la misma indicación o una indicación diferente.
Se debe observar aquí que, como se usa en esta memoria descriptiva y las reivindicaciones adjuntas, las formas en singular "un", "una", "el" y "la" incluyen la referencia en plural, a menos que el contexto dicte claramente de otro modo.
También se observa que el término "alrededor de", como se usa en el presente documento, se entiende que significa aproximadamente.
Se observa además que los términos "unido", "conjugado" y "funcionalizado" se usan indistintamente en el presente documento y se refieren a la asociación de un polinucleótido, péptido, polipéptido, agente terapéutico, agente de contraste y una combinación de los mismos con un nanoconjugado.
LA BARRERA HEMATOENCEFÁLICA (BHE)
Como se usa en el presente documento, la "barrera hematoencefálica" (BHE) se refiere a la barrera entre la circulación periférica y el cerebro y la médula espinal que se forma por zonas de oclusión dentro de las membranas plasmáticas endoteliales capilares del cerebro, que crea una barrera altamente selectiva que restringe el transporte de moléculas en el cerebro. La barrera hematoencefálica dentro del cerebro, la barrera sangre-médula espinal dentro de la médula espinal y la barrera hematorretiniana dentro de la retina son barreras capilares contiguas dentro del sistema nervioso central (SNC), y se denominan conjuntamente la barrera hematoencefálica o BHE.
La BHE está formada por zonas de oclusión de alta resistencia de tipo epiteliales dentro del endotelio de capilares que perfunden el cerebro del vertebrado. A menos que una molécula terapéutica sea soluble en lípidos con un peso molecular de 400-600 daltones o menos, está limitada la penetración en el cerebro [Pardridge, Curr Opin Pharmacol 6: 494-500 (2006)]. Debido a la presencia de la BHE, las moléculas circulantes acceden a las células del cerebro solo por uno de dos procesos: (i) transporte mediado por lípidos de moléculas pequeñas a través de la BHE por difusión libre, o (ii) transporte catalizado. El último incluye procesos de transporte mediado por vehículo para nutrientes de bajo peso molecular y vitaminas solubles en agua o transporte mediado por receptor para péptidos circulantes (por ejemplo, insulina), proteínas del plasma (por ejemplo, transferrina) o virus. Aunque la permeabilidad de la BHE está, en sí, controlada por las propiedades bioquímicas de las membranas plasmáticas de las células endoteliales capilares, la biología microvascular general del cerebro es una función de las interacciones paracrinas entre el endotelio capilar y las otras dos células importantes que comprenden la microcirculación del cerebro, es decir, el pericito capilar, que comparte la membrana basal con la célula endotelial, y el podocito del astrocito, que invierte el 99 % de la superficie abluminal de la membrana basal capilar en el cerebro. Las funciones microvasculares atribuidas frecuentemente al endotelio capilar son en realidad realizadas por cualquiera del pericito capilar o el podocito del astrocito capilar [Pardridge, J. Neurovir. 5: 556-569 (1999)].
La BHE define en gran medida el entorno de operación del SNC, regulando el movimiento de sustancias entre la sangre y el LCR y el líquido intersticial del cerebro. La BHE se divide frecuentemente en la barrera vascular, o endotelial, y la barrera epitelial en el plexo coroideo (también denominada la barrera sangre-LCR). Las células endoteliales que comprenden los capilares y revisten las arteriolas y vénulas constituyen la función de barrera de la médula espinal y de la mayoría de las áreas del cerebro [Rapoport, Blood Brain Barrier in Physiology and Medicine, Raven Press, New York. (1976)]. Las células endoteliales se modifican en que los cinturones circunferenciales de las zonas de oclusión entre células endoteliales no fenestradas contiguas del SNC descartan la fuga encontrada en los lechos de capilares de los tejidos periféricos. Existen zonas de oclusión intracelulares comparables a las del endotelio cerebral entre células epiteliales contiguas en el plexo coroideo [Johanson, The choroid plexus-arachnoid membranecerebrospinal fluid system. En: Neuronal Microenvironment. Boulton AA, Baker GB, Walz W(eds). The Humana Press: Clifton, New Jersey, pp 33-104 (1988)] y entre las células de la aracnoides [Balin et al., J Comp Neurol 251: 260-280 (1986)]. Los endotelios cerebrales también tienen otras modificaciones. Participan en la endocitosis de macromoléculas de transmisión hemática y en el reciclaje de la membrana plasmática luminal, pero en menor grado que los endotelios periféricos y el plexo coroideo [Broadwell et al., Cell biological perspective for the transcytosis of peptides and proteins through the mammalian blood-brain fluid barriers. En: The Blood-Brain Barrier. Pardridge WM (ed). Raven Press Ltd: New York, pp 165-199 (1993)]. Los lisosomas secundarios hidrolizan muchas, pero no todas las macromoléculas que se someten a endocitosis dentro de los endotelios de la BHE [Broadwell et al., Proc Natl. Acad Sci. USA 78: 7820-7824 (1981); Broadwell et al., Cell biological perspective for the transcytosis of peptides and proteins through the mammalian blood-brain fluid barriers. En: The Blood-Brain Barrier. Pardridge WM (ed). Raven Press Ltd: New York, pp 165-199 (1993)]. Estas modificaciones de los endotelios eliminan eficazmente el ultrafiltrado del plasma característico de los lechos capilares en tejidos periféricos y sirven para definir la restrictiva permeabilidad de la BHE [Banks, J. Neurovir. 5: 538-555 (1999)].
Por tanto, la mayoría de las moléculas posiblemente terapéuticas, de diagnóstico o de investigación no atraviesan la BHE en cantidades farmacológicamente activas. De manera que para evitar la BHE, se usan estrategias de administración de fármacos transcraneales invasivas, tales como infusión intracerebro-ventricular (ICV), administración intracerebral (IC) y difusión potenciada por convección (CED). La administración de fármacos transcraneales al cerebro es cara, invasiva y en gran medida ineficaz. La vía ICV administra normalmente fármacos solo a la superficie ependimaria del cerebro, no al parénquima cerebral. La administración IC de una neurotrofina, tal como el factor de crecimiento nervioso (NGF), solo administra el fármaco al sitio de inyección local, debido a la baja eficiencia de difusión del fármaco dentro del cerebro. La CED de neurotrofina da como resultado el flujo de fluidos preferencial a través de las fibras de materia blanca del cerebro, que provoca desmielinación y astrogliosis.
La presente divulgación ofrece una alternativa a estos métodos altamente invasivos y, en general, poco satisfactorios para evitar la BHE, que permite que los nanoconjugados atraviesen la BHE desde la sangre periférica. Se basa en el uso de nanoconjugados que son capaces de transportar una sustancia deseada desde la sangre periférica hasta el SNC. Dado que está limitada la penetración del cerebro de un agente terapéutico que tiene una masa de 400-600 daltones o más, y además que la masa de una única base de ADN es aproximadamente 320 daltones, es inesperado que los datos presentados en el presente documento demuestren que un nanoconjugado que se funcionaliza con una multitud de polinucleótidos, cada uno que comprende una multitud de bases, es capaz de atravesar la BHE en cantidad apreciable.
En un aspecto, la divulgación proporciona composiciones y métodos que utilizan un nanoconjugado capaz de atravesar la BHE. Las composiciones y métodos son útiles en el transporte de nanoconjugados y, opcionalmente, un agente terapéutico, desde la sangre periférica y a través de la barrera hematoencefálica en el SNC.
NANOCONJUGADOS
Las composiciones de la divulgación comprenden un nanoconjugado. Un nanoconjugado comprende una nanopartícula, es decir, en ciertos aspectos, hueca. Los nanoconjugados comprenden, además, en diversas realizaciones, una biomolécula. Como se usa en el presente documento, se entiende que una "biomolécula" incluye un polinucleótido, péptido, polipéptido, molécula pequeña, agente terapéutico, agente de contraste y una combinación de los mismos. En diversos aspectos del nanoconjugado, todas las biomoléculas son idénticas, o alternativamente, al menos dos biomoléculas son diferentes.
Los nanoconjugados de la divulgación no son nanoconjugados basados en polímeros. Así, no se contemplan aspectos 0 realizaciones de la presente divulgación los nanoconjugados que comprenden, por ejemplo, nanoesferas de hexadecilcianoacrilato recubiertas con polietilenglicol (PEG); nanopartículas de poli(butilcianoacrilato); nanopartículas de poli(butilcianoacrilato) recubiertas con polisorbato 80; nanopartículas de lípido; nanopartículas de lípido que consisten en emulsiones de nanogotitas de aceite solidificado cargadas con, por ejemplo, óxido de hierro; o un nanogel que consiste en PEG reticulado y polietilenimina.
La divulgación proporciona nanoconjugados que tienen una masa que es al menos aproximadamente 1000, o aproximadamente 1200 o más daltones. En algunas realizaciones, el nanoconjugado tiene una masa que es al menos aproximadamente 2, aproximadamente 3, aproximadamente 5, aproximadamente 10, aproximadamente 20, aproximadamente 30, aproximadamente 40, aproximadamente 50, aproximadamente 60, aproximadamente 70, aproximadamente 80, aproximadamente 90, aproximadamente 100, aproximadamente 200, aproximadamente 500, aproximadamente 700, aproximadamente 900 o más kilodaltones. Como se usa en el presente documento, se entiende que la masa de un nanoconjugado incluye la masa de una nanopartícula (si está presente) más la masa de cualquier biomolécula y/o agente terapéutico que esté asociado con la nanopartícula.
Nanopartícula
Se proporcionan nanopartículas que están funcionalizadas, en algunos aspectos, que tienen una biomolécula unida a ellas. El tamaño, la forma y la composición química de las nanopartículas contribuyen a las propiedades de la nanopartícula funcionalizada resultante. Estas propiedades incluyen, por ejemplo, propiedades ópticas, propiedades optoelectrónicas, propiedades electroquímicas, propiedades electrónicas, estabilidad en diversas disoluciones, propiedades magnéticas, y variación el tamaño del poro y canal. Se contemplan mezclas de nanopartículas que tienen diferentes tamaños, formas y/o composiciones químicas, así como el uso de nanopartículas que tienen tamaños, formas y composición química uniformes y, por tanto, una mezcla de propiedades. Los ejemplos de partículas adecuadas incluyen, sin limitación, partículas agregadas, isotrópicas (tales como partículas esféricas), partículas anisotrópicas (tales como varillas no esféricas, tetraedros y/o prismas) y partículas de núcleo-corteza, tales como las descritas en la patente de EE. UU. N° 7.238.472 y la publicación internacional N° WO 2003/08539.
En una realización, la nanopartícula es metálica, y en diversos aspectos, la nanopartícula es un metal coloidal. Así, en diversas realizaciones, las nanopartículas de la invención incluyen materiales coloidales metálicos (incluyendo, por ejemplo y sin limitación, plata, oro, platino, aluminio, paladio, cobre, cobalto, indio, níquel, o cualquier otro metal susceptible de formación de nanopartículas), semiconductores (incluyendo, por ejemplo y sin limitación, CdSe, CdS, y CdS o CdSe recubierto con ZnS) y magnéticos (por ejemplo, ferromagnetita).
Por tanto, como se describe en la publicación de patente de EE. UU. N° 2003/0147966, las nanopartículas de la invención incluyen las que están disponibles comercialmente, así como las que se sintetizan, por ejemplo, se producen a partir de la nucleación progresiva en disolución (por ejemplo, por reacción de coloides) o por diversos procesos de deposición física y química de vapor, tales como deposición por pulverización. Véanse, por ejemplo, HaVashi, Vac. Sci. Technol. A5(4) :1375-84 (1987); Hayashi, Physics Today, 44-60 (1987); boletín de MRS, enero de 1990, 16-47. Como se describe además en la publicación de patente de EE. UU. N° 2003/0147966, las nanopartículas contempladas se producen alternativamente usando HAu Cl4 y un agente reductor de citrato, usando métodos conocidos en la técnica. Véase, por ejemplo, Marinakos et al., Adv. Mater. 11:34-37(1999); Marinakos et al., Chem. Mater. 10: 1214-19(1998); Enustun & Turkevich, J. Am. Chem. Soc. 85: 3317(1963).
Las nanopartículas pueden variar en tamaño desde aproximadamente 1 nm hasta aproximadamente 250 nm de diámetro medio, aproximadamente 1 nm a aproximadamente 240 nm de diámetro medio, aproximadamente 1 nm a aproximadamente 230 nm de diámetro medio, aproximadamente 1 nm a aproximadamente 220 nm de diámetro medio, aproximadamente 1 nm a aproximadamente 210 nm de diámetro medio, aproximadamente 1 nm a aproximadamente 200 nm de diámetro medio, aproximadamente 1 nm a aproximadamente 190 nm de diámetro medio, aproximadamente 1 nm a aproximadamente 180 nm de diámetro medio, aproximadamente 1 nm a aproximadamente 170 nm de diámetro medio, aproximadamente 1 nm a aproximadamente 160 nm de diámetro medio, aproximadamente 1 nm a aproximadamente 150 nm de diámetro medio, aproximadamente 1 nm a aproximadamente 140 nm de diámetro medio, aproximadamente 1 nm a aproximadamente 130 nm de diámetro medio, aproximadamente 1 nm a aproximadamente 120 nm de diámetro medio, aproximadamente 1 nm a aproximadamente 110 nm de diámetro medio, aproximadamente 1 nm a aproximadamente 100 nm de diámetro medio, aproximadamente 1 nm a aproximadamente 90 nm de diámetro medio, aproximadamente 1 nm a aproximadamente 80 nm de diámetro medio, aproximadamente 1 nm a aproximadamente 70 nm de diámetro medio, aproximadamente 1 nm a aproximadamente 60 nm de diámetro medio, aproximadamente 1 nm a aproximadamente 50 nm de diámetro medio, aproximadamente 1 nm a aproximadamente 40 nm de diámetro medio, aproximadamente 1 nm a aproximadamente 30 nm de diámetro medio, o aproximadamente 1 nm a aproximadamente 20 nm de diámetro medio, aproximadamente 1 nm a aproximadamente 10 nm de diámetro medio. En otros aspectos, el tamaño de las nanopartículas es desde aproximadamente 5 nm hasta aproximadamente 150 nm (diámetro medio), desde aproximadamente 5 hasta aproximadamente 50 nm, desde aproximadamente 10 hasta aproximadamente 30 nm, desde aproximadamente 10 hasta 150 nm, desde aproximadamente 10 hasta aproximadamente 100 nm, o aproximadamente 10 a aproximadamente 50 nm. El tamaño de las nanopartículas es desde aproximadamente 5 nm hasta aproximadamente 150 nm (diámetro medio), desde aproximadamente 30 hasta aproximadamente 100 nm, desde aproximadamente 40 hasta aproximadamente 80 nm. El tamaño de las nanopartículas usado en un método varía según se requiera por su uso o aplicación particular. La variación de tamaño se usa ventajosamente para optimizar ciertas características físicas de las nanopartículas, por ejemplo, propiedades ópticas o la cantidad de área superficial que se puede funcionalizar como se describe en el presente documento.
Se contempla, en algunos aspectos, que las nanopartículas de diámetro más grande se funcionalizan con un mayor número de biomoléculas [Hurst et al., Analytical Chemistry 78(24): 8313-8318 (2006)] durante la producción de nanoconjugados. En algunos aspectos, por tanto, el número de biomoléculas usado en la producción de un nanoconjugado es desde aproximadamente 10 hasta aproximadamente 25.000 biomoléculas por nanoconjugado. En aspectos adicionales, el número de biomoléculas usado en la producción de un nanoconjugado es desde aproximadamente 50 hasta aproximadamente 10.000 biomoléculas por nanoconjugado, o desde aproximadamente 200 hasta aproximadamente 5.000 biomoléculas por nanoconjugado, o desde aproximadamente 50 hasta aproximadamente 100 biomoléculas por nanoconjugado, o desde aproximadamente 20 hasta aproximadamente 100 biomoléculas por nanoconjugado, o desde aproximadamente 20 hasta aproximadamente 50 biomoléculas por nanoconjugado. Así, en diversas realizaciones, el número de biomoléculas usado en la producción de un nanoconjugado es aproximadamente 10, aproximadamente 15, aproximadamente 20, aproximadamente 25, aproximadamente 30, aproximadamente 35, aproximadamente 40, aproximadamente 45, aproximadamente 50, aproximadamente 55, aproximadamente 60, aproximadamente 65, aproximadamente 70, aproximadamente 75, aproximadamente 80, aproximadamente 85, aproximadamente 90, aproximadamente 95, aproximadamente 100, aproximadamente 150, aproximadamente 200, aproximadamente 250, aproximadamente 300, aproximadamente 350, aproximadamente 400, aproximadamente 500, aproximadamente 600, aproximadamente 700, aproximadamente 800, aproximadamente 900, aproximadamente 1.000, aproximadamente 2.000, aproximadamente 5000, aproximadamente 10.000, aproximadamente 15.000, aproximadamente 20.000, aproximadamente 25.000 o más por nanoconjugado.
Nanoconjugados huecos
Como se describe en el presente documento, en diversos aspectos, los nanoconjugados proporcionados por la divulgación pueden ser huecos. La porosidad y/o rigidez de un nanoconjugado hueco depende en parte de la densidad de biomoléculas que se reticulan sobre la superficie de una nanopartícula durante la producción del nanoconjugado. En general, una densidad más baja de biomoléculas reticuladas sobre la superficie de la nanopartícula da como resultado un nanoconjugado más poroso, mientras que una densidad más alta de biomoléculas reticuladas sobre la superficie de la nanopartícula da como resultado un nanoconjugado más rígido. La porosidad y la densidad de un nanoconjugado hueco también dependen del grado y tipo de reticulación entre las biomoléculas.
Se conocen en la técnica métodos de preparación de nanoconjugados huecos y se describen, en general, en la solicitud de patente internacional número PCT/US2010/055018 y Zhang et al. [J Am Chern Soc. 132(43): 15151 -15153 (2010)].
En algunas realizaciones, los nanoconjugados huecos se preparan por química de polialquinos [Zhang et al., J. Am Chem Soc. 132(43): 15151-15153 (2010)]. También se contemplan estrategias de reticulación adicionales, tales como mediante el uso de un reticulante homobifuncional (por ejemplo, sulfo-EGS) u otro grupo reactivo (por ejemplo y sin limitación, aminas, amidas, alcoholes, ésteres, aldehídos, cetonas, tioles, disulfuros, ácidos carboxílicos, fenoles, imidazoles, hidracinas, hidrazonas, azidas y alquinos).
Un método de preparación adicional de un nanoconjugado hueco, denominado reticulación asistida en la superficie (SAC), comprende una monocapa mixta de ácidos nucleicos modificados y moléculas tioladas reactivas que se ensamblan sobre la superficie de la nanopartícula y se reticulan juntos. Como se usa en el presente documento, una "monocapa" significa que solo un único estrato de biomoléculas se reticula en la superficie de un nanoconjugado. Una biomolécula como se usa en el presente documento incluye, sin limitación, un polinucleótido, péptido, polipéptido, molécula pequeña, agente terapéutico, agente de contraste y una combinación de los mismos.
Los expertos en la técnica conocen sustancias químicas que provocan la reticulación de las biomoléculas de interés e incluyen, sin limitación, glutarato de disuccinimidilo, suberato de disuccinimidilo, suberato de bis[sulfosuccinimidilo], aminotriacetato de tris-succinimidilo, succinimidil 4-hidrazinonicotinato acetona hidrazona, clorhidrato de 4-hidrazidotereftalato de succinimidilo, 4-formilbenzoato de succinimidilo, ditiobis[succinimidilpropionato], 3,3'-ditiobis[sulfosuccinimidilpropionato], tartrato de disuccinimidilo, bis[2-(succinimidooxicarboniloxi)etil]sulfona, bis[succinimidilsuccinato] de etilenglicol, bis[sulfosuccinimidilsuccinato] de etilenglicol, adipimidato de dimetilo^2 HCl, pimelimidato de dimetilo^2 HCl, suberimidato de dimetilo^2 HCl, 1,5-difluoro-2,4-dinitrobenceno, ácido p-[tris(hidroximetil)fosfino]propiónico, bismaleimidoetano, 1,4-bismaleimidobutano, bismaleimidohexano, Tris[2-maleimidoetil]amina, 1,8-bis-maleimido-dietilenglicol, 1,11 -bis-maleimido-trietilenglicol, 1,4-bismaleimidil-2,3-dihidroxibutano, ditio-bismaleimidoetano, 1,4-di-[3'-(2'-piridilditio)-propionamido]butano, 1,6-hexano-bis-vinilsulfona, bis-[b-(4-azidosalicilamido)etil]disulfuro, éster de N-(a-maleimidoacetoxi)succinimida, éster de N-[pmaleimidopropiloxi]succinimida, éster de N-[g-maleimidobutiriloxi]succinimida, éster de N-[gmaleimidobutiriloxi]sulfosuccinimida, éster de m-maleimidobenzoil-N-hidroxisuccinimida, éster de mmaleimidobenzoil-N-hidroxisulfosuccinimida, 4-[N-maleimidometil]ciclohexano-1-carboxilato de succinimidilo, 4-[N-maleimidometil]ciclohexano-1-carboxilato de sulfosuccinimidilo, éster de N-e-maleimidocaproiloxi]succinimida, éster de N-e-maleimidocaproiloxi]sulfosuccinimida, 4-[p-maleimidofenil]butirato de succinimidilo, 4-[p-maleimidofenil]butirato de sulfosuccinimidilo, 6-[p-maleimidopropionamido]hexanoato de succinimidilo, 4-[N-maleimidometil]ciclohexano-1-carboxi-[6-amidocaproato] de succinimidilo, éster de N-[k-maleimidoundecanoiloxi]sulfosuccinimida, 3-(2-piridilditio)-propionato de N-succinimidilo, 6-(3-[2-piridilditio]-propionamido)hexanoato de succinimidilo, 4-succinimidiloxicarbonilmetil-a-[2-piridilditio]tolueno, 4-sulfosuccinimidil-6-metil-a-(2-piridilditio)toluamido]hexanoato), yodoacetato de N-succinimidilo, 3-[bromoacetamido]propionato de succinimidilo, [4-yodoacetil]aminobenzoato de N-succinimidilo, [4-yodoacetil]aminobenzoato de N-sulfosuccinimidilo, ácido N-hidroxisuccinimidil-4-azidosalicílico, N-5-azido-2-nitrobenzoiloxisuccinimida, N-hidroxisulfosuccinimidil-4-azidobenzoato, [4-azidosalicilamido]-hexanoato de sulfosuccinimidilo, 6-(4'-azido-2'-nitrofenilamino)hexanoato de N-succinimidilo, N-sulfosuccinimidil-6-(4'-azido-2'-nitrofenilamino)hexanoato, sulfosuccinimidil-(perfluoroazidobenzamido)-etil-1,3'-ditioproprionato, sulfosuccinimidil-2-(m-azido-o-nitrobenzamido)-etil-1,3'-proprionato, 2-[7-amino-4-metilcoumarin-3-acetamido]etil-1,3'-ditiopropionato de sulfosuccinimidilo, 4,4'-azipentanoato de succinimidilo, 6-(4,4'-azipentanamido)hexanoato de succinimidilo, 2-([4,4'-azipentanamido]etil)-1,3'-ditioproprionato de succinimidilo, 4,4'-azipentanoato de sulfosuccinimidilo, 6-(4,4'-azipentanamido)hexanoato de sulfosuccinimidilo, 2-([4,4'-azipentanamido]etil)-1,3'-ditioproprionato de sulfosuccinimidilo, diciclohexilcarbodiimida, clorhidrato de 1-etil-3-[3-dimetilaminopropil]carbodiimida, N-[4-(pazidosalicilamido)butil]-3'-(2'-piridilditio)propionamida, hidrazida de ácido N-[p-maleimidopropiónico], sal de ácido trifluoroacético, hidrazida de ácido [N-e-maleimidocaproico], sal de ácido trifluoroacético, clorhidrato de hidrazida de ácido 4-(4-N-maleimidofenil)butírico, hidrazida de ácido N-[k-maleimidoundecanoico], hidrazida de 3-(2-piridilditio)propionilo, hidrazida de p-azidobenzoílo, N-[p-maleimidofenil]isocianato y succinimidil-[4-(psoralen-8-iloxi)]-butirato.
BIOMOLÉCULAS
Como se describe en el presente documento, una biomolécula incluye, sin limitación, un polinucleótido, péptido, polipéptido, molécula pequeña, agente terapéutico, agente de contraste y una combinación de los mismos. En diversos aspectos de la divulgación, una biomolécula como se describe en el presente documento se asocia covalentemente a la nanopartícula.
Polinucleótidos
Los polinucleótidos contemplados por la presente divulgación incluyen ADN, ARN, formas modificadas y combinaciones de los mismos, como se define en el presente documento. Por consiguiente, en algunos aspectos, el nanoconjugado comprende ADN. En algunas realizaciones, el ADN es bicatenario, y en realizaciones adicionales el ADN es monocatenario. En aspectos adicionales, el nanoconjugado comprende ARN, y en aspectos aún adicionales el nanoconjugado comprende ARN bicatenario, y en una realización específica, el agente de ARN bicatenario es un ARN interferente pequeño (ARNip). El término "ARN" incluye dúplex de dos cadenas separadas, así como estructuras monocatenarias. El ARN monocatenario también incluye ARN con estructura secundaria. En un aspecto, se contempla el ARN que tiene un bucle de horquilla.
Cuando un nanoconjugado comprende una pluralidad de polinucleótidos estructurales, el polinucleótido comprende, en algunos aspectos, una secuencia que es suficientemente complementaria a un secuencia diana de un polinucleótido de forma que tenga lugar la hibridación del polinucleótido que es parte del nanoconjugado y el polinucleótido diana. El polinucleótido en diversos aspectos es monocatenario o bicatenario, en tanto que la molécula bicatenaria también incluya una secuencia monocatenaria que se hibrida con una secuencia monocatenaria del polinucleótido diana. En algunos aspectos, la hibridación del polinucleótido que es parte del nanoconjugado puede formar una estructura de tríplex con un polinucleótido diana bicatenario. En otro aspecto, se puede formar una estructura de tríplex por hibridación de un polinucleótido bicatenario que es parte de un nanoconjugado con un polinucleótido diana monocatenario. La descripción adicional de complejos tríplex de polinucleótido se encuentra en el documento de patente PCT/US2006/40124.
En algunos aspectos, los polinucleótidos contienen un espaciador como se describe en el presente documento. El espaciador, en un aspecto, comprende uno o más restos de reticulación que facilitan la reticulación de un polinucleótido con otro polinucleótido.
Se entiende en la técnica que un "polinucleótido" comprende subunidades de nucleótidos individualmente polimerizadas. El término "nucleótido" o su plural, como se usa en el presente documento, es intercambiable con formas modificadas como se trata en el presente documento y se conocen de otro modo en la técnica. En ciertos casos, la técnica usa el término "nucleobase" que engloba nucleótidos que existen de forma natural, y nucleótidos que no existen de forma natural que incluyen nucleótidos modificados. Así, nucleótido o nucleobase significa las nucleobases que existen de forma natural adenina (A), guanina (G), citosina (C), timina (T) y uracilo (U). Las nucleobases que no existen de forma natural incluyen, por ejemplo y sin limitaciones, xantina, diaminopurina, 8-oxo-N6-metiladenina, 7-deazaxantina, 7-deazaguanina, N4,N4-etanocitosina, N',N'-etano-2,6-diaminopurina, 5-metilcitosina (mC), 5-alquinil (C3-C6)-citosina, 5-fluorouracilo, 5-bromouracilo, pseudoisocitosina, 2-hidroxi-5-metil-4-triazolopiridina, isocitosina, isoguanina, inosina y las nucleobases "que no existen de forma natural" descritas en Benner et al., patente de e E. UU. N° 5.432.272 y Susan M. Freier y Karl-Heinz Altmann, 1997, Nucleic Acids Research, vol. 25: pp 4429-4443. El término "nucleobase" también incluye no solo los heterociclos de purina y pirimidina conocidos, sino también análogos y tautómeros heterocíclicos de los mismos. Las nucleobases que existen de forma natural y que no existen de forma natural adicionales incluyen las desveladas en la patente de EE. UU. N° 3.687.808 (Merigan, et al.), en el Capítulo 15 por Sanghvi, en Antisense Research and Application, Ed. S. T. Crooke and B. Lebleu, CRC Press, 1993, en Englisch et al., 1991, Angewandte Chemie, International Edition, 30: 613-722 (véanse especialmente las páginas 622 y 623, y en The Concise Encyclopedia of Polymer Science and Engineering, J. I. Kroschwitz Ed., John Wiley & Sons, 1990, páginas 858-859, Cook, Anti-Cancer Drug Design 1991,6, 585-607).
En diversos aspectos, los polinucleótidos también incluyen una o más "bases nucleosídicas" o "unidades de base" que son una categoría de nucleótidos que no existen de forma natural que incluyen compuestos tales como compuestos heterocíclicos que pueden servir de nucleobases, que incluyen ciertas "bases universales" que no son bases nucleosídicas en el sentido más clásico, pero sirven de bases nucleosídicas. Las bases universales incluyen 3-nitropirrol, indoles opcionalmente sustituidos (por ejemplo, 5-nitroindol), y opcionalmente hipoxantina sustituida. Otras bases universales deseables incluyen derivados de pirrol, diazol o triazol, que incluyen las bases universales conocidas en la técnica.
Los nucleótidos modificados se describen en los documentos de patente EP 1072679 y WO97/12896. Los nucleótidos modificados incluyen, sin limitación, 5-metilcitosina (5-me-C), 5-hidroximetilcitosina, xantina, hipoxantina, 2-aminoadenina, 6-metilo y otros derivados de alquilo de adenina y guanina, 2-propilo y otros derivados de alquilo de adenina y guanina, 2-tiouracilo, 2-tiotimina y 2-tiocitosina, 5-halouracilo y citosina, 5-propiniluracilo y citosina y otros derivados de alquinilo de bases de pirimidina, 6-azouracilo, citosina y timina, 5-uracilo (pseudouracilo), 4-tiouracilo, 8-halógeno, 8-amino, 8-tiol, 8-tioalquilo, 8-hidroxilo y otras adeninas y guaninas sustituidas en 8, 5-halógeno, particularmente 5-bromo, 5-trifluorometilo y otros uracilos y citosinas sustituidos en 5, 7-metilguanina y 7-metiladenina, 2- F-adenina, 2-amino-adenina, 8-azaguanina y 8-azaadenina, 7-deazaguanina y 7-deazaadenina y 3-deazaguanina y 3- deazaadenina. La bases modificadas adicionales incluyen pirimidinas tricíclicas tales como fenoxazina citidina (1H-pirimido[5,4-b][1,4]benzoxazin-2(3H)-ona), fenotiazina citidina (1 H-pirimido[5,4-b][1,4]benzotiazin-2(3H)-ona), abrazaderas G tales como una fenoxazina citidina sustituida (por ejemplo, 9-(2-aminoetoxi)-H-pirimido[5,4-b][1,4]benzoxazin-2(3H)-ona), carbazol citidina (2H-pirimido[4,5-b]indol-2-ona), piridoindol citidina (H-pirido[3',2':4,5]pirrolo[2,3-d]pirimidin-2-ona). Las bases modificadas también pueden incluir aquellas en las que la base de purina o pirimidina se sustituye con otros heterociclos, por ejemplo 7-deazaadenina, 7-deazaguanosina, 2-aminopiridina y 2-piridona. Las nucleobases adicionales incluyen las desveladas en la patente de EE. UU. N° 3.687.808, las desveladas en The Concise Encyclopedia of Polymer Science And Engineering, páginas 858-859, Kroschwitz, J. I., ed. John Wiley & Sons, 1990, las desveladas por Englisch et al., 1991, Angewandte Chemie, International Edition, 30: 613, y las desveladas por Sanghvi, Y. S., Capítulo 15, Antisense Research and Application, páginas 289-302, Crooke, S. T. y Lebleu, B., ed., CRC Press, 1993. Ciertas de estas bases son útiles para aumentar la afinidad de unión e incluyen pirimidinas sustituidas en 5, 6-azapirimidinas y purinas sustituidas en N-2, N-6 y O-6, que incluyen 2-aminopropiladenina, 5-propiniluracilo y 5-propinilcitosina. Se ha mostrado que las sustituciones de 5-metilcitosina aumentan la estabilidad de los dúplex de ácido nucleico en 0,6-1,2 °C y se combinan, en ciertos aspectos, con modificaciones de 2'-O-metoxietil-azúcar. Véanse las patentes de EE. UU. N° 3.687.808, las patentes de EE. UU. N24.845.205; 5.130.302; 5.134.066; 5.175.273; 5.367.066; 5.432.272; 5.457.187; 5.459.255; 5.484.908; 5.502.177; 5.525.711; 5.552.540; 5.587.469; 5.594.121. 5.596.091; 5.614.617; 5.645.985; 5.830.653; 5.763.588; 6.005.096; 5.750.692 y 5.681.941.
Se conocen bien los métodos de preparación de polinucleótidos de una secuencia predeterminada. Véanse, por ejemplo, Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2a ed. 1989) y F. Eckstein (ed.) Oligonucleotides and Analogues, 1a Ed. (Oxford University Press, New York, 1991). Se prefieren los métodos de síntesis en fase sólida para tanto los polirribonucleótidos como los polidesoxirribonucleótidos (también son útiles para sintetizar ARN los métodos bien conocidos de síntesis de ADN). Los polirribonucleótidos también se pueden preparar enzimáticamente. También se pueden incorporar en el polinucleótido nucleobases que no existen de forma natural. Véanse, por ejemplo, la patente de EE. UU. N° 7.223.833; Katz, J. Am. Chem. Soc., 74:2238 (1951); Yamane, et al., J. Am. Chem. Soc., 83:2599 (1961); Kosturko, et al., Biochemistry, 13:3949 (1974); Thomas, J. Am. Chem. Soc., 76:6032 (1954); Zhang, et al., J. Am. Chem. Soc., 127:74-75 (2005); y Zimmermann, et al., J. Am. Chem. Soc., 124:13684-13685 (2002).
Un nanoconjugado de la divulgación comprende, en general, un polinucleótido de desde aproximadamente 5 nucleótidos hasta aproximadamente 100 nucleótidos de longitud. Más específicamente, los nanoconjugados comprenden polinucleótidos que tienen aproximadamente 5 a aproximadamente 90 nucleótidos de longitud, aproximadamente 5 a aproximadamente 80 nucleótidos de longitud, aproximadamente 5 a aproximadamente 70 nucleótidos de longitud, aproximadamente 5 a aproximadamente 60 nucleótidos de longitud, aproximadamente 5 a aproximadamente 50 nucleótidos de longitud, aproximadamente 5 a aproximadamente 45 nucleótidos de longitud, aproximadamente 5 a aproximadamente 40 nucleótidos de longitud, aproximadamente 5 a aproximadamente 35 nucleótidos de longitud, aproximadamente 5 a aproximadamente 30 nucleótidos de longitud, aproximadamente 5 a aproximadamente 25 nucleótidos de longitud, aproximadamente 5 a aproximadamente 20 nucleótidos de longitud, aproximadamente 5 a aproximadamente 15 nucleótidos de longitud, aproximadamente 5 a aproximadamente 10 nucleótidos de longitud, y todos los polinucleótidos de longitud intermedia de los tamaños específicamente desvelados hasta el punto de que el polinucleótido sea capaz de lograr el resultado deseado. Por consiguiente, se contemplan polinucleótidos de 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21,22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31,32,
33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41,42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71,72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91,92, 93, 94,
95, 96, 97, 98, 99, 100 o más nucleótidos de longitud.
En algunos aspectos, un polinucleótido como se describe en el presente documento comprende un alquino. En diversas realizaciones, están presentes desde 1 hasta 100 restos de alquino en un polinucleótido. En aspectos adicionales, están presentes desde aproximadamente 5 hasta aproximadamente 50 restos de alquino, o aproximadamente 10 a aproximadamente 20 restos de alquino en un polinucleótido. En un aspecto, están presentes
10 restos de alquino en el polinucleótido. En aspectos adicionales, están presentes 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12,
13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21,22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51,52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71,72, 73, 74,
75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100 o más restos de alquino en un polinucleótido.
En otra realización, los restos de alquino en un polinucleótido están en el extremo 5'. En una realización adicional, los restos de alquino en un polinucleótido están en el extremo 3’. Se contempla que en algunos aspectos los restos de alquino solo representan una porción de la longitud de un polinucleótido. A modo de ejemplo, si un polinucleótido tiene
20 nucleótidos de longitud, entonces se contempla que los 10 primeros nucleótidos (contando, en diversos aspectos, desde cualquiera del extremo 5' o 3’) comprendan un resto alquino. Así, 10 nucleótidos que comprenden un resto alquino de un total de 20 nucleótidos hacen que el 50 % de los nucleótidos en un polinucleótido estén asociados a un resto alquino. En diversos aspectos se contempla que desde aproximadamente 0,01 % hasta aproximadamente 100 % de los nucleótidos en un polinucleótido estén asociados con un resto alquino. En aspectos adicionales, aproximadamente 1 % a aproximadamente 70 %, o aproximadamente 2 % a aproximadamente 60 %, o aproximadamente 5 % a aproximadamente 50 %, o aproximadamente 10 % a aproximadamente 50 %, o aproximadamente 10 % a aproximadamente 40 %, o aproximadamente 20 % a aproximadamente 50 %, o aproximadamente 20 % a aproximadamente 40 % de nucleótidos en un polinucleótido están asociados con un resto alquino.
Los polinucleótidos, como se define en el presente documento, también incluyen aptámeros. Los expertos habituales en la técnica conocen la producción y el uso de aptámeros. En general, los aptámeros son especies que se unen a ácido nucleico o péptido capaces de unirse fuertemente a y distinguir discretamente ligandos diana [Yan et al., RNA
Biol. 6(3) 316-320 (2009).
Se pueden obtener aptámeros, en algunas realizaciones, por una técnica denominada el proceso de evolución sistemática de ligandos por enriquecimiento exponencial (SELEX) [Tuerk et al., Science 249:505-10 (1990), patente de EE. UU. número 5.270.163 y patente de EE. UU. número 5.637.459. Discusiones generales de aptámeros de ácido nucleico se encuentran en, por ejemplo y sin limitación, Nucleic Acid and Peptide Aptamers: Methods and Protocols (editado por Mayer, Humana Press, 2009) y Crawford et al., Briefings in Functional Genomics and Proteomics 2(1):
72-79 (2003). La discusión adicional de aptámeros que incluyen, pero no se limitan a, la selección de aptámeros de ARN, la selección de aptámeros de ADN, la selección de aptámeros capaces de unirse covalentemente a una proteína diana, el uso de bibliotecas de aptámeros modificados y el uso de aptámeros como agente de diagnóstico y un agente terapéutico se proporciona en Kopylov et al., Molecular Biology 34(6): 940-954 (2000), traducido de Molekulyamaya Biologiya, Vol. 34, N° 6, 2000, pp. 1097-1113. En diversas realizaciones, un aptámero puede tener entre aproximadamente 10 y aproximadamente 100 nucleótidos de longitud.
Espaciadores
En ciertas composiciones descritas en el presente documento, se contemplan nanoconjugados que incluyen aquellos en donde un nanoconjugado comprende un polinucleótido que comprende además un espaciador. El espaciador puede comprender uno o más restos de reticulación como se describe a continuación.
"Espaciador", como se usa en el presente documento, significa un resto que sirve para contener uno o más restos de reticulación o, en algunos aspectos en donde el nanoconjugado comprende una nanopartícula, aumentar la distancia entre la nanopartícula y el polinucleótido, o para aumentar la distancia entre polinucleótidos individuales cuando se
unen a la nanopartícula en múltiples copias. Si se usa un nanoconjugado para una actividad biológica, se contempla que el espaciador no participe directamente en la actividad del polinucleótido al que se une.
Así, en algunas composiciones descritas en el presente documento, se contempla que el espaciador facilite la reticulación por uno o más restos de reticulación. Los espaciadores se contemplan además por estar situados entre polinucleótidos individuales en tándem, tanto si los polinucleótidos tienen la misma secuencia como si tienen secuencias diferentes. En una composición descrita en el presente documento, el espaciador cuando está presente es un resto orgánico. En otra composición descrita en el presente documento, el espaciador es un polímero, que incluye, pero no se limita a, un polímero soluble en agua, un ácido nucleico, un polipéptido, un oligosacárido, un hidrato de carbono, un lípido, o combinaciones de los mismos.
En algunas composiciones descritas en el presente documento, el espaciador está funcionalizado con una nanopartícula, pero no se une a otra biomolécula. La función del espaciador es proteger el nanoconjugado in vivo. Así, en algunas composiciones descritas en el presente documento, un espaciador está funcionalizado con una nanopartícula. El espaciador puede ser polietilenglicol (PEG). Si el polímero soluble en agua es PEG, se contempla que el PEG esté funcionalizado con una nanopartícula por un enlace covalente. En algunas composiciones descritas en el presente documento, el PEG se une a la nanopartícula por un enlace tiol. Se contempla la PEGilación para proteger el nanoconjugado en circulación y mejorar sus perfiles farmacodinámicos y farmacocinéticos [Harris et al., Nat Rev Drug Discov. 2: 214-21 (2003)]. El proceso de PEGilación une unidades repetidas de etilenglicol (polietilenglicol (PEG)) a una nanopartícula. Las moléculas de PEG tienen un gran volumen hidrodinámico (5-10 veces el tamaño de las proteínas globulares), son altamente solubles en agua y están hidratadas, no son tóxicas, no son inmunogénicas y se eliminan rápidamente del cuerpo. La PEGilación de nanoconjugados conduce al aumento de la resistencia a la degradación enzimática, aumento de la semivida in vivo, frecuencia de administración reducida, inmunogenicidad reducida, elevada estabilidad física y térmica, elevada solubilidad, elevada estabilidad de líquidos y agregación reducida.
La longitud del espaciador en diversas composiciones descritas en el presente documento, al menos aproximadamente 5 nucleótidos, al menos aproximadamente 10 nucleótidos, 10-30 nucleótidos, o incluso más de 30 nucleótidos. El espaciador puede tener cualquier secuencia que no interfiera con la capacidad de los polinucleótidos para llegar a unirse a las nanopartículas o al polinucleótido diana. Los espaciadores no deben tener secuencias complementarias entre sí o a las de los polinucleótidos, pero puede ser todos o en parte complementarios al polinucleótido diana. En ciertas composiciones descritas en el presente documento, las bases del polinucleótido espaciador son todas adeninas, todas timinas, todas citidinas, todas guaninas, todas uracilos, o todas alguna otra base modificada.
Polinucleótidos modificados
Como se trata anteriormente, se contemplan polinucleótidos modificados para su uso en la producción de nanoconjugados. En diversos aspectos, un polinucleótido está completamente modificado o parcialmente modificado. Así, en diversos aspectos, uno o más, o todos, los enlaces de azúcar y/o uno o más o todos los enlaces internucleotídicos de las unidades de nucleótido en el polinucleótido se sustituyen por grupos "que no existen de forma natural".
En un aspecto, esta realización contempla un ácido nucleico peptídico (PNA). En compuestos de PNA, el esqueleto de azúcar de un polinucleótido se sustituye por un esqueleto que contiene amida. Véanse, por ejemplo, las patentes de EE. UU. N25.539.082; 5.714.331; y 5.719.262, y Nielsen et al., Science, 1991,254, 1497-1500.
Otros enlaces entre nucleótidos y nucleótidos no naturales contemplados para los polinucleótidos desvelados incluyen los descritos en las patentes de EE. UU. N24.981.957; 5.118.800; 5.319.080; 5.359.044; 5.393.878; 5.446.137; 5.466.786; 5.514.785; 5.519.134; 5.567.811; 5.576.427; 5.591.722; 5.597.909; 5.610.300; 5.627.053; 5.639.873; 5.646.265; 5.658.873; 5.670.633; 5.792.747; y 5.700.920; la publicación de patente de EE. UU. N220040219565; publicaciones de patente internacional N° w O 98/39352 y WO 99114226; Mesmaeker et. al., Current Opinion in Structural Biology 5:343-355 (1995) y Susan M. Freier y Karl-Heinz Altmann, Nucleic Acids Research, 25:4429-4443 (1997).
Los ejemplos específicos de polinucleótidos incluyen los que contiene esqueletos modificados o enlaces internucleosídicos no naturales. Los polinucleótidos que tienen esqueletos modificados incluyen los que retienen un átomo de fósforo en el esqueleto y los que no tienen un átomo de fósforo en el esqueleto. Se considera que los polinucleótidos modificados que no tienen un átomo de fósforo en su esqueleto internucleosídico están dentro del significado de "polinucleótido".
Los esqueletos de polinucleótidos modificados que contienen un átomo de fósforo incluyen, por ejemplo, fosforotioatos, fosforotioatos quirales, fosforoditioatos, fosfotriésteres, aminoalquilfosfotriésteres, fosfonatos de metilo y de otros alquilos que incluyen fosfonatos de 3'-alquileno, fosfonatos de 5'-alquileno y fosfonatos quirales, fosfinatos, fosforamidatos que incluyen 3'-aminofosforamidato y aminoalquilfosforamidatos, tionofosforamidatos, tionoalquilfosfonatos, tionoalquilfosfotriésteres, selenofosfatos y boranofosfatos que tienen enlaces 3'-5' normales, análogos unidos en 2'-5' de estos, y los que tienen polaridad invertida, en donde uno o más enlaces internucleotídicos es un enlace 3' con 3', 5' con 5' o 2' con 2'. También se contemplan polinucleótidos que tienen polaridad invertida que comprenden un enlace sencillo 3' con 3' en el enlace internucleotídico más 3', es decir, un resto nucleosídico invertido único que puede ser abásico (falta el nucleótido o tiene un grupo hidroxilo en su lugar). También se contemplan sales, sales mixtas y formas de ácido libre.
Las patentes de Estados Unidos representativas que enseñan la preparación de los enlaces que contienen fósforo anteriores incluyen las patentes de EE. UU. N23,687.808; 4.469.863; 4.476.301; 5.023.243; 5.177.196; 5.188.897; 5.264.423; 5.276.019; 5.278.302; 5.286.717; 5.321.131; 5.399.676; 5.405.939; 5.453.496; 5.455.233; 5.466.677; 5.476.925; 5.519.126; 5.536.821; 5.541.306; 5.550.111; 5.563.253; 5.571.799; 5.587.361; 5.194.599; 5.565.555; 5.527.899; 5.721.218; 5.672.697 y 5.625.050.
Los esqueletos de polinucleótido modificado que no incluyen un átomo de fósforo tienen esqueletos que están formados por enlaces internucleosídicos de alquilo o cicloalquilo de cadena corta, enlaces internucleosídicos de heteroátomo mixto y de alquilo o de cicloalquilo, o uno o más enlaces internucleosídicos heteroatómicos o heterocíclicos de cadena corta. Estos incluyen los que tienen enlaces de morfolino; esqueletos de siloxano; esqueletos de sulfuro, sulfóxido y sulfona; esqueletos de formacetilo y tioformacetilo; esqueletos de metilenformacetilo y tioformacetilo; esqueletos de riboacetilo; esqueletos que contienen alqueno; esqueletos de sulfamato; esqueletos de metilenimino y metilenhidrazino; esqueletos de sulfonato y sulfonamida; esqueletos de amida; y otros que tienen partes de componentes de N, O, S y CH2 mixtos. En otras realizaciones más, se proporcionan polinucleótidos con esqueletos de fosforotioato y oligonucleósidos con esqueletos de heteroátomo, y que incluyen -CH2-NH-O-CH2-, -CH2-N(CH3)-O-CH2-, -CH2-O-N(CH3)-CH2-, -CH2-N(CH3)-N(CH3)-CH2- y -O-N(CH3)-CH2-CH2- descritos en las patentes de EE. UU. N25.489.677 y 5.602.240. Véanse, por ejemplo, las patentes de EE. UU. N25.034.506; 5.166.315; 5.185.444; 5.214.134; 5.216.141; 5.235.033; 5.264.562; 5.264.564; 5.405.938; 5.434.257; 5.466.677; 5.470.967; 5.489.677; 5.541.307; 5.561.225; 5.596.086; 5.602.240; 5.610.289; 5.602.240; 5.608.046; 5.610.289; 5.618.704; 5.623.070; 5.663.312; 5.633.360; 5.677.437; 5.792.608; 5.646.269 y 5.677.439.
En diversas formas, el enlace entre dos monómeros sucesivos en el polinucleótido puede consistir en 2 a 4, deseablemente 3, grupos/átomos seleccionados de -CH2-, -O-, -S-, -NRH-, >C=O, >C=NRH, >C=S, -Si(R")2-, -SO-, -S(O)2-, -P(O)2-, -PO(BH3)-, -P(O,S) -, -P(S)2-, -PO(R")-, -PO(OCH3)- y -PO(NHRH)-, donde RH se selecciona de hidrógeno y alquilo C1 -4, y R" se selecciona de alquilo C1 -6 y fenilo. Los ejemplos ilustrativos de dichos enlaces son -CH2-CH2-CH2-, -CH2-CO-CH2-, -CH2-CHOH-CH2-, -O-CH2-O-, -O-CH2-CH2-, -O-CH2-CH= (incluyendo R5 cuando se usa como un enlace con un monómero sucesivo), -CH2-CH2-O-, -NRH-CH2-CH2-, -CH2-CH2-NRH-, -CH2-NRH-CH2-, -O-CH2-CH2-NRH-, -NRH-CO-O-, -NRH-CO-NRH-, -NRH-CS-NRH-, -NRH-C(=NRH)-NRH-, -NRH-CO-CH2-NRH-O-CO-O-, -O-CO-CH2-O-, -O-CH2-CO-O-, -CH2-CO-NRH-, -O-CO-NRH-, -NRH-CO-CH2-, -O-CH2-CO-NRH-, -O-CH2-CH2-NRH-, -CH=N-O-, -CH2-NRH-O-, -CH2-O-N= (incluyendo R5 cuando se usa como un enlace con un monómero sucesivo), -CH2-O-NRH-, -CO-NRH-CH2-, -CH2-NRH-O-, -CH2-NRH-CO-, -O-NRH-CH2-, -O-NRH, -O-CH2-S-, -S-CH2-O-, -CH2-CH2-S-, -O-CH2-CH2-S-, -S-CH2-CH= (incluyendo R5 cuando se usa como un enlace con un monómero sucesivo), -S-CH2-CH2-, -S-CH2-CH2-O-, -S-CH2-CH2-S-, -CH2-S-CH2-, -CH2-SO-CH2-, -CH2-SO2-CH2-, -O-SO-O-, -O-S(O)2-O-, -O-S(O)2-CH2-, -O-S(O)2-NRH-, -NRH-S(O)2-CH2-; -O-S(O)2-CH2-, -O-P(O)2-O-, -O-P(O,S)-O-, -O-P(S)2-O-, -S-P(O)2-O-, -S-P(O,S)-O-, -S-P(S)2-O-, -O-P(O)2-S-, -O-P(O,S)-S-, -O-P(S)2-S-, -S-P(O)2-S-, -S-P(O,S)-S-, -S-P(S)2-S-, -O-PO(R")-O-, -O-PO(OCH3)-O-, -O-PO(O CH2CH3)-O-, -O-PO(O CH2CH2S-R)-O-, -O-PO(BH3)-O-, -O-PO(NHRN)-O-, -O-P(O)2-NRH H-, -NRH-P(O)2-O-, -O-P(O,NRH)-O-, -CH2-P(O)2-O-, -O-P(O)2-CH2- y -O-Si(R")2-O-; entre los que -CH2-CO-NRH-, -CH2-NRH-O-, -S-CH2-O-, -O-P(O)2-O-O-P(-O,S)-O-, -O-P(S)2-O-, -NRH P(O)2-O-, -O-P(O,NRH)-O-, -O-PO(R")-O-, -O-PO(CH3)-O- y -O-PO(NHRN)-O-, donde RH se selecciona de hidrógeno y alquilo C1-4, y R" se selecciona de alquilo C1-6 y fenilo, se contemplan. Se dan ejemplos ilustrativos adicionales en Mesmaeker et. al., 1995, Current Opinion in Structural Biology, 5: 343-355 y Susan M. Freier y Karl-Heinz Altmann, 1997, Nucleic Acids Research, vol 25: pp 4429-4443.
Aún otras formas modificadas de polinucleótidos se describen con detalle en la solicitud de patente de EE. UU. N° 20040219565.
Los polinucleótidos modificados también pueden contener uno o más restos de azúcar sustituidos. En ciertos aspectos, los polinucleótidos comprenden uno de los siguientes en la posición 2': OH; F; O-, S- o N-alquilo; O-, S- o N-alquenilo; O-, S- o N-alquinilo; u O-alquil-O-alquilo, en donde el alquilo, alquenilo y alquinilo pueden ser alquilo C1 a C10 sustituido o sin sustituir o alquenilo y alquinilo C2 a C10. Otras realizaciones incluyen O[(CH2)nO]mCH3, O(CH2)nOCH3, O(CH2)nNH2, O(CH2)nCH3, O(CH2)nONH2 y O(CH2)nON[(CH2)nCH3]2, donde n y m son desde 1 hasta aproximadamente 10. Otros polinucleótidos comprenden uno de los siguientes en la posición 2': alquilo inferior C1 a C10, alquilo inferior sustituido, alquenilo, alquinilo, alcarilo, aralquilo, O-alcarilo u O-aralquilo, SH, SCH3, OCN, Cl, Br, Cn , CF3, OCF3, SOCH3, SO2CH3, ONO2, NO2, N3, NH2, heterocicloalquilo, heterocicloalcarilo, aminoalquilamino, polialquilamino, sililo sustituido, un grupo escisor de ARN, un grupo indicador, un intercalador, un grupo para mejorar las propiedades farmacocinéticas de un polinucleótido, o un grupo para mejorar las propiedades farmacodinámicas de un polinucleótido, y otros sustituyentes que tienen propiedades similares. En un aspecto, una modificación incluye 2'-metoxietoxi (2'-O-CH2CH2OCH3, también conocido como 2'-O-(2-metoxietilo) o 2'-MOE) (Martin et al., 1995, Helv. Chim. Acta, 78: 486-504), es decir, un grupo alcoxialcoxi. Otras modificaciones incluyen 2'-dimetilaminooxietoxi, es decir, un grupo O(CH2)2ON(CH3)2, también conocido como 2'-DMAOE, y 2'-dimetilaminoetoxietoxi (también conocido en la técnica como 2'-O-dimetil-amino-etoxi-etilo o 2'-DMAEOE), es decir, 2'-O-CH2-O-CH2-N(CH3)2.
Aún otras modificaciones incluyen 2'-metoxi (2'-O-CH3), 2'-aminopropoxi (2'-OCH2CH2CH2NH2), 2'-alilo (2'-CH2-CH=CH2), 2'-O-alilo (2'-O-CH2-CH=CH2) y 2'-flúor (2'-F). La modificación en 2' puede estar en la posición arabino (arriba) o la posición ribo (abajo). En un aspecto, una modificación de 2'-arabino es 2'-F. También se pueden hacer modificaciones similares en otras posiciones en el polinucleótido, por ejemplo, en la posición 3' del azúcar en el nucleótido del extremo 3' o en polinucleótidos unidos en 2'-5' y la posición 5' del nucleótido del extremo 5' terminal. Los polinucleótidos también pueden tener miméticos de azúcar, tales como restos ciclobutilo en lugar del azúcar de pentofuranosilo. Véanse, por ejemplo, las patentes de EE. UU. N° 4.981.957; 5.118.800; 5.319.080; 5.359.044; 5.393.878; 5.446.137; 5.466.786; 5.514.785; 5.519.134; 5.567.811; 5.576.427; 5.591.722; 5.597.909; 5.610.300; 5.627.053; 5.639.873; 5.646.265; 5.658.873; 5.670.633; 5.792.747; y 5.700.920.
En un aspecto, una modificación del azúcar incluye ácidos nucleicos bloqueados (LNA) en los que el grupo 2'-hidroxilo está unido al átomo de carbono 3' o 4' del anillo de azúcar, formando así un resto de azúcar bicíclico. El enlace es en ciertos aspectos un grupo metileno (-CH2-)n que puentea el átomo de oxígeno de 2' y el átomo de carbono de 4' en donde n es 1 o 2. Los LNA y la preparación de los mismos se describen en los documentos de patente WO 98/39352 y WO 99/14226.
Características de polinucleótidos
Un nanoconjugado de la divulgación, en diversos aspectos, comprende una pluralidad de polinucleótidos. Como resultado, cada nanoconjugado tiene la capacidad de unirse a una pluralidad de polinucleótidos diana que tienen una secuencia suficientemente complementaria. Por ejemplo, si se elige como diana un polinucleótido específico, un único nanoconjugado tiene la capacidad de unirse a múltiples copias de la misma molécula. En un aspecto, se proporcionan métodos en donde el nanoconjugado comprende polinucleótidos idénticos, es decir, cada polinucleótido tiene la misma longitud y la misma secuencia. En otros aspectos, el nanoconjugado comprende dos o más polinucleótidos que no son idénticos, es decir, al menos uno de los polinucleótidos del nanoconjugado se diferencia de al menos otro polinucleótido del nanoconjugado en que tiene una longitud diferente y/o una secuencia diferente. En aspectos en donde un nanoconjugado comprende polinucleótidos diferentes, estos polinucleótidos diferentes se unen al mismo polinucleótido diana individual, pero en diferentes localizaciones, o se unen a diferentes polinucleótidos diana que codifican diferentes productos génicos. Por consiguiente, en diversos aspectos, se puede usar un único nanoconjugado en un método para inhibir la expresión de más de un producto génico. Así, los polinucleótidos se usan para elegir como diana polinucleótidos específicos, tanto en una como en más regiones específicas en el polinucleótido diana, o a lo largo de la longitud entera del polinucleótido diana, ya que la necesidad puede ser efectuar un nivel deseado de inhibición de la expresión génica.
Por consiguiente, en un aspecto, los polinucleótidos se diseñan con conocimiento de la secuencia diana. Alternativamente, un polinucleótido en un nanoconjugado no se necesita hibridar con un polinucleótido diana para lograr un efecto deseado como se describe en el presente documento.
Los polinucleótidos contemplados para la producción de un nanoconjugado incluyen, en un aspecto, aquellos que modulan la expresión de un producto génico expresado a partir de un polinucleótido diana. Por consiguiente, se contemplan polinucleótidos antisentido que se hibridan con un polinucleótido diana e inhiben la traducción, polinucleótidos de ARNip que se hibridan con un polinucleótido diana e inician una actividad de RNAsa (por ejemplo, RNAsa H), polinucleótidos que forman una hélice triple que se hibridan con polinucleótidos bicatenarios e inhiben la transcripción y ribozimas que se hibridan con un polinucleótido diana e inhiben la traducción.
En algunos aspectos, un nanoconjugado basado en polinucleótido permite la eficiente captación del nanoconjugado. En diversos aspectos, el polinucleótido comprende una secuencia de nucleótidos que permite la elevada eficiencia de captación del nanoconjugado. Como se usa en el presente documento, "eficiencia" se refiere al número o a la tasa de captación de nanoconjugados en/por célula. Debido a que el proceso de nanoconjugados que entran y que salen de una célula es dinámico, se puede aumentar la eficiencia captando más nanoconjugados o reteniendo los nanoconjugados que entran en la célula durante un periodo de tiempo más largo. Similarmente, se puede disminuir la eficiencia captando menos nanoconjugados o reteniendo los nanoconjugados que entran en la célula durante un periodo de tiempo más corto.
Así, la secuencia de nucleótidos puede ser cualquier secuencia de nucleótidos que se desee que se pueda seleccionar para, en diversos aspectos, aumentar o disminuir la captación celular de un nanoconjugado o regulación génica. La secuencia de nucleótidos comprende, en algunos aspectos, una secuencia homopolimérica que afecta la eficiencia con la que la nanopartícula a la que se une el polinucleótido es captada por una célula. Por consiguiente, la secuencia homopolimérica aumenta o disminuye la eficiencia. También se contempla que, en diversos aspectos, la secuencia de nucleótidos es una combinación de nucleobases, de forma que no es estrictamente una secuencia homopolimérica. Por ejemplo y sin limitación, en diversos aspectos, la divulgación contempla que la secuencia de nucleótidos comprenda restos alternos de timidina y uridina, dos timidinas seguidas por dos uridinas o cualquier combinación que afecte la elevada captación. En algunos aspectos, la secuencia de nucleótidos que afecta la eficiencia de captación se incluye como un dominio en un polinucleótido que comprende una secuencia adicional. Este "dominio" serviría para funcionar como la característica que afecta la eficiencia de la captación, mientras que la secuencia de nucleótidos adicional serviría para funcionar como la característica que afecta la eficiencia de la captación, por ejemplo y sin limitación, para regular la expresión génica. En diversos aspectos, el dominio en el polinucleótido puede estar en cualquier localización proximal, distal o central con respecto al nanoconjugado. También se contempla que un polinucleótido comprenda más de un dominio.
La secuencia homopolimérica, en algunas realizaciones, aumenta la eficiencia de captación del nanoconjugado por una célula. En algunos aspectos, la secuencia homopolimérica comprende una secuencia de restos de timidina (poliT) o restos de uridina (poliU). En aspectos adicionales, la secuencia de poliT o poliU comprende dos timidinas o uridinas. En diversos aspectos, la secuencia de poliT o poliU comprende desde aproximadamente 3 hasta aproximadamente 500 restos de timidina o uridina. En realizaciones adicionales, la secuencia de poliT o poliU comprende desde aproximadamente 3 hasta aproximadamente 10, aproximadamente 20, aproximadamente 30, aproximadamente 40, aproximadamente 50, aproximadamente 60, aproximadamente 70, aproximadamente 80, aproximadamente 90, aproximadamente 100, aproximadamente 150, aproximadamente 200 o más restos de timidina o uridina. En algunas realizaciones, la secuencia de poliT o poliU comprende desde aproximadamente 10 hasta aproximadamente 50, aproximadamente 20 a aproximadamente 100, o aproximadamente 40 a aproximadamente 200 restos de timidina o uridina. Por consiguiente, en diversas realizaciones, la secuencia de poliT o poliU comprende 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20,21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41,42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, aproximadamente 55, aproximadamente 60, aproximadamente 65, aproximadamente 70, aproximadamente 75, aproximadamente 80, aproximadamente 85, aproximadamente 90, aproximadamente 95, aproximadamente 100, aproximadamente 125, aproximadamente 150, aproximadamente 175, aproximadamente 200, aproximadamente 250, aproximadamente 300, aproximadamente 350, aproximadamente 400, aproximadamente 450, aproximadamente 500 o más restos de timidina o uridina.
En algunas realizaciones, se contempla que un nanoconjugado que comprende un polinucleótido que comprende una secuencia homopolimérica sea captado por una célula con mayor eficiencia que un nanoconjugado que comprende el mismo polinucleótido, pero que carece de la secuencia homopolimérica. En diversos aspectos, un nanoconjugado que comprende un polinucleótido que comprende una secuencia homopolimérica es captado por una célula aproximadamente 2 veces, aproximadamente 3 veces, aproximadamente 4 veces, aproximadamente 5 veces, aproximadamente 6 veces, aproximadamente 7 veces, aproximadamente 8 veces, aproximadamente 9 veces, aproximadamente 10 veces, aproximadamente 20 veces, aproximadamente 30 veces, aproximadamente 40 veces, aproximadamente 50 veces, aproximadamente 100 veces o más, más eficientemente que un nanoconjugado que comprende el mismo polinucleótido, pero que carece de la secuencia homopolimérica.
En otros aspectos, el dominio es un polímero de fosfato (resto C3). En algunos aspectos, el dominio comprende un polímero de fosfato (resto C3) que comprende dos fosfatos. En algunas realizaciones, el resto C3 comprende desde aproximadamente 3 hasta aproximadamente 500, o desde aproximadamente 5 hasta aproximadamente 50 fosfatos, o desde aproximadamente 10 hasta aproximadamente 50 fosfatos, o desde aproximadamente 20 hasta aproximadamente 70 fosfatos, o desde aproximadamente 50 hasta aproximadamente 200 fosfatos. En diversos aspectos, el resto C3 comprende 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21,22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, aproximadamente 55, aproximadamente 60, aproximadamente 65, aproximadamente 70, aproximadamente 75, aproximadamente 80, aproximadamente 85, aproximadamente 90, aproximadamente 95, aproximadamente 100, aproximadamente125, aproximadamente150, aproximadamente 175, aproximadamente 200, aproximadamente 250, aproximadamente 300, aproximadamente 350, aproximadamente 400, aproximadamente 450, aproximadamente 500 o más fosfatos.
En algunas realizaciones, se contempla que un nanoconjugado que comprende un polinucleótido que comprende un dominio sea captado por una célula con menor eficiencia que un nanoconjugado que comprende el mismo polinucleótido, pero que carece del dominio. En diversos aspectos, un nanoconjugado que comprende un polinucleótido que comprende un dominio es captado por una célula aproximadamente 2 veces, aproximadamente 3 veces, aproximadamente 4 veces, aproximadamente 5 veces, aproximadamente 6 veces, aproximadamente 7 veces, aproximadamente 8 veces, aproximadamente 9 veces, aproximadamente 10 veces, aproximadamente 20 veces, aproximadamente 30 veces, aproximadamente 40 veces, aproximadamente 50 veces, aproximadamente 100 veces o más, menos eficientemente que un nanoconjugado que comprende el mismo polinucleótido, pero que carece del dominio.
Se puede determina empíricamente una densidad superficial adecuada para hacer estables los nanoconjugados y las condiciones necesarias para obtenerlos para una combinación deseada de nanoconjugados y polinucleótidos. En general, una densidad superficial de al menos 2 pmol/cm2 será adecuada para proporcionar composiciones estables de nanoconjugado-polinucleótido. En algunos aspectos, la densidad superficial es al menos 15 pmol/cm2. En aspectos adicionales, el polinucleótido se asocia con el nanoconjugado a una densidad superficial de aproximadamente 0,3 pmol/cm2 a aproximadamente 10 pmol/cm2, o desde aproximadamente 0,6 pmol/cm2 hasta aproximadamente 15 pmol/cm2, o desde aproximadamente 1 pmol/cm2 hasta aproximadamente 20 pmol/cm2, o desde aproximadamente 0,3 pmol/cm2 hasta aproximadamente 100 pmol/cm2. También se describen métodos en el presente documento en donde el polinucleótido se asocia con el nanoconjugado a una densidad superficial de al menos 2 pmol/cm2, al menos 3 pmol/cm2, al menos 4 pmol/cm2, al menos 5 pmol/cm2, al menos 6 pmol/cm2, al menos 7 pmol/cm2, al menos 8 pmol/cm2, al menos 9 pmol/cm2, al menos 10 pmol/cm2, al menos aproximadamente 15 pmol/cm2, al menos aproximadamente 19 pmol/cm2, al menos aproximadamente 20 pmol/cm2, al menos aproximadamente 25 pmol/cm2, al menos aproximadamente 30 pmol/cm2, al menos aproximadamente 35 pmol/cm2, al menos aproximadamente 40 pmol/cm2, al menos aproximadamente 45 pmol/cm2, al menos aproximadamente 50 pmol/cm2, al menos aproximadamente 55 pmol/cm2, al menos aproximadamente 60 pmol/cm2, al menos aproximadamente 65 pmol/cm2, al menos aproximadamente 70 pmol/cm2, al menos aproximadamente 75 pmol/cm2, al menos aproximadamente 80 pmol/cm2, al menos aproximadamente 85 pmol/cm2, al menos aproximadamente 90 pmol/cm2, al menos aproximadamente 95 pmol/cm2, al menos aproximadamente 100 pmol/cm2, al menos aproximadamente 125 pmol/cm2, al menos aproximadamente 150 pmol/cm2, al menos aproximadamente 175 pmol/cm2, al menos aproximadamente 200 pmol/cm2, al menos aproximadamente 250 pmol/cm2, al menos aproximadamente 300 pmol/cm2, al menos aproximadamente 350 pmol/cm2, al menos aproximadamente 400 pmol/cm2, al menos aproximadamente 450 pmol/cm2, al menos aproximadamente 500 pmol/cm2, al menos aproximadamente 550 pmol/cm2, al menos aproximadamente 600 pmol/cm2, al menos aproximadamente 650 pmol/cm2, al menos aproximadamente 700 pmol/cm2, al menos aproximadamente 750 pmol/cm2, al menos aproximadamente 800 pmol/cm2, al menos aproximadamente 850 pmol/cm2, al menos aproximadamente 900 pmol/cm2, al menos aproximadamente 950 pmol/cm2, al menos aproximadamente 1000 pmol/cm2 o más.
Como se usa en el presente documento, se entiende que un "sitio de conjugación" significa un sitio en un polinucleótido al que se une un agente de contraste. Se conocen en la técnica, en general, los métodos de unión de un agente de contraste a un polinucleótido [véase, por ejemplo, Song et al., Chem Ing Engl 48(48): 9143-9147 (2009)]. En ciertos aspectos, la divulgación también proporciona uno o más polinucleótidos que son parte del nanoconjugado que no comprenden un sitio de conjugación, mientras que uno o más polinucleótidos que son parte del mismo nanoconjugado comprenden un sitio de conjugación. La conjugación de un agente de contraste con un nanoconjugado mediante un sitio de conjugación se describe, en general, en el documento de patente PCT/US2010/44844.
La divulgación proporciona, en un aspecto, un nanoconjugado que comprende un polinucleótido en donde el polinucleótido comprende de uno a aproximadamente diez sitios de conjugación. En otro aspecto, el polinucleótido comprende cinco sitios de conjugación. En general, para un nucleótido se puede modificar tanto su esqueleto (grupo fosfato) como la nucleobase. Por consiguiente, la presente divulgación contempla que existen 2n sitios de conjugación, donde n=longitud del molde de polinucleótidos. En un aspecto relacionado, se contempla que la composición comprende un nanoconjugado que comprende una pluralidad de polinucleótidos. En algunos aspectos, la pluralidad de polinucleótidos comprende al menos un polinucleótido con el que se asocian los agentes de contraste mediante uno o más sitios de conjugación, así como al menos un polinucleótido que tiene actividad reguladora génica como se describe en el presente documento.
Por consiguiente, en algunas realizaciones, se contempla que uno o más polinucleótidos que son parte del nanoconjugado no están conjugados con un agente de contraste, mientras que uno o más polinucleótidos que son parte del mismo nanoconjugado están conjugados con un agente de contraste.
Marcador/marca de polinucleótido
Un polinucleótido como se describe en el presente documento, en diversos aspectos, comprende opcionalmente una marca detectable. Por consiguiente, la divulgación proporciona composiciones y métodos en donde la hibridación de polinucleótidos se detecta por un cambio detectable. En un aspecto, la hibridación da lugar a un cambio de color que se observa a simple vista o espectroscópicamente.
Los métodos de visualización del cambio detectable resultante de la hibridación de polinucleótidos también incluyen cualquier método de detección fluorescente que incluye, sin limitación, microscopía de fluorescencia, un lector de placas de microtitulación o citometría de flujo activada por fluorescencia (FACS).
Se entenderá que una marca contemplada por la divulgación incluye cualquiera de los fluoróforos descritos en el presente documento, así como otras marcas detectables conocidas en la técnica. Por ejemplo, las marcas también incluyen, pero no se limitan a, sondas activas para rédox, moléculas quimioluminiscentes, marcas radiactivas, colorantes, moléculas fluorescentes, moléculas fosforescentes, agentes de obtención de imágenes y/o de contraste como se describe más adelante, puntos cuánticos, así como cualquier marcador que se pueda detectar usando medios espectroscópicos, es decir, los marcadores detectables usando microscopía y citometría. En aspectos de la divulgación en donde se va a detectar una marca detectable, la divulgación proporciona que cualquier molécula o partícula luminiscente, fluorescente o fosforescente pueda ser eficientemente extinguida por superficies de metales nobles, o por una molécula extintora conocida en la técnica (las moléculas extintoras contempladas por la divulgación incluyen, pero no se limitan a, dabsilo (ácido dimetilaminoazobencenosulfónico), Black Hol Quenchers, extintores Qxl, Iowa black FQ, Iowa black RQ, IRDye QC-1 y una combinación de los mismos). Por consiguiente, se contempla cada tipo de molécula para su uso en las composiciones y los métodos desvelados.
Se conocen bien en la técnica los métodos de marcado de biomoléculas con moléculas fluorescentes y de medición de fluorescencia.
También se conocen bien en la técnica moléculas fluorescentes adecuadas e incluyen, sin limitación, 1,8-ANS (ácido 1-anilinonaftaleno-8-sulfónico), ácido 1-anilinonaftaleno-8-sulfónico (1,8-ANS), 5-(y 6)-carboxi-2',7'-diclorofluoresceína pH 9,0, 5-FAM pH 9,0, 5-Ro X (5-carboxi-X-rodamina, sal de trietilamonio), 5-r Ox pH 7,0, 5-TAMRA, 5-TAMRA pH 7,0, 5-TAMRA-MeOH, 6 JOE, 6,8-difluoro-7-hidroxi-4-metilcoumarina pH 9,0, 6-carboxirrodamina 6G pH 7,0, 6-carboxirhodamina 6G, clorhidrato, 6-HEX, SE pH 9,0, 6-TET, SE pH 9,0, 7-amino-4-metilcoumarina pH 7,0, 7-hidroxi4-metilcoumarina, 7-hidroxi-4-metilcoumarina pH 9,0, Alexa 350, Alexa 405, Alexa 430, Alexa 488, Alexa 532, Alexa 546, Alexa 555, Alexa 568, Alexa 594, Alexa 647, Alexa 660, Alexa 680, Alexa 700, conjugado de anticuerpo con Alexa Fluor 430 pH 7,2, conjugado de anticuerpo con Alexa Fluor 488 pH 8,0, Alexa Fluor 488 hidrazida-agua, conjugado de anticuerpo con Alexa Fluor 532 pH 7,2, conjugado de anticuerpo con Alexa Fluor 555 pH 7,2, conjugado de anticuerpo con Alexa Fluor 568 pH 7,2, Alexa Fluor 610 R-ficoeritrina estreptavidina pH 7,2, conjugado de anticuerpo con Alexa Fluor 647 pH 7,2, Alexa Fluor 647 R-ficoeritrina estreptavidina pH 7,2, conjugado de anticuerpo con Alexa Fluor 660 pH 7,2, conjugado de anticuerpo con Alexa Fluor 680 pH 7,2, conjugado de anticuerpo con Alexa Fluor 700 pH 7,2, aloficocianina pH 7,5, conjugado de AMCA, aminocoumarina, APC (aloficocianina), Atto 647, BCECF pH 5,5, BCECF pH 9,0, BFP (proteína azul fluorescente), BO-PRO-1-DNA, BO-PRO-3-DNA, BOBO-1-DNA, BOBO-3-DNA, BODIPY 650/665-X, MeOH, conjugado de BODIpY FL, BODIPY FL, MeOH, Bodipy R6G SE, BODIPY R6G, MeOH, conjugado de anticuerpo BODIPY TMR-X pH 7,2, conjugado de Bodipy TMR-X, BODIPY TMR-X, MeOH, BODIPY TMR-X, SE, BODIPY TR-X falacidina pH 7,0, BODIPY TR-X, MeOH, BODIPY TR-X, SE, BOPRO-1, BOPRO-3, calceína, calceína pH 9,0, Calcium Crimson, Calcium Crimson Ca2+, Calcium Green, Calcium Green-1 Ca2+, Calcium Orange, Calcium Orange Ca2+, carboxinaftofluoresceína pH 10,0, Cascade Blue, Cascade Blue BSA pH 7,0, Cascade Yellow, conjugado de anticuerpo Cascade Yellow pH 8,0, CFDA, CFP (proteína cian fluorescente), CI-NERF pH 2,5, CI-NERF pH 6.0, citrino, coumarina, Cy 2, Cy 3, Cy 3.5, Cy 5, Cy 5.5, CyQUANT GR-DNA, dansilcadaverina, dansilcadaverina, MeOH, DAPI, DAPI-DNA, Dapoxyl (2-aminoetil)sulfonamida, DDAO pH 9,0, Di-8 ANEPPS, Di-8-ANEPPS-lípido, DiI, DiO, DM-NERF pH 4,0, Dm -Ne RF pH 7,0, DsRed, DTAF, dTomato, eCFP (proteína cian fluorescente potenciada), eGFP (proteína verde fluorescente potenciada), eosina, conjugado de anticuerpo de eosina pH 8,0, eritrosin-5-isotiocianato pH 9,0, bromuro de etidio, homodímero de etidio, homodímero de etidio-1-ADN, eYFP (proteína amarilla fluorescente potenciada), FDA, FITC, conjugado de anticuerpo de FITC pH 8,0, FlAsH, Fluo-3, Fluo-3 Ca2+, Fluo-4, Fluor-Ruby, fluoresceína, fluoresceína NaOH 0,1 M, conjugado de anticuerpo de fluoresceína pH 8,0, fluoresceína dextrano pH 8,0, fluoresceína pH 9,0, Fluoro-Emerald, f M 1-43, lípido FM 1-43, FM 4-64, FM 4-64, 2 % de CHAPS, Fura Red Ca2+, Fura Red, alto en Ca, Fura Red, bajo en Ca, Fura-2 Ca2+, Fura-2, alto en Ca, Fura-2, sin Ca, GFP (S65T), HcRed, Hoechst 33258, Hoechst 33258-Dn A, Hoechst 33342, Indo-1 Ca2+, Indo-1, sin Ca, Indo-1, saturado en Ca, JC-1, JC-1 pH 8,2, rodamina Lissamine, LOLO-1-DNA, amarillo de lucifer, CH, LysoSensor Blue, LysoSensor Blue pH 5,0, LysoSensor Green, LysoSensor Green pH 5,0, LysoSensor Yellow pH 3,0, LysoSensor Yellow pH 9,0, LysoTracker Blue, LysoTracker Green, LysoTracker Red, Magnesium Green, Magnesium Green Mg2+, Magnesium Orange, Marina Blue, mBanana, mCherry, mHoneydew, MitoTracker Green, MitoTracker Green FM, MeOH, MitoTracker Orange, MitoTracker Orange, MeOH, MitoTracker Red, MitoTracker Red, MeOH, mOrange, mPlum, mRFP, mStrawberry, mTangerine, NBD-X, NBD-X, MeOH, NeuroTrace 500/525, tinción Nissl verde fluorescente-ARN, azul del Nilo, EtOH, rojo del Nilo, rojo del Nilo-lípido, Nissl, Oregon Green 488, conjugado de anticuerpo de Oregon Green 488 pH 8,0, Oregon Green 514, conjugado de anticuerpo de Oregon Green 514 pH 8,0, Pacific Blue, conjugado de anticuerpo de Pacific Blue pH 8,0, ficoeritrina, reactivo de cuantificación de ADNbc PicoGreen, PO-PRO-1, PO-PRO-1-DNA, PO-PRO-3, PO-PRO-3-Dn A, POPO-1, POPO-1-DNA, POPO-3, yoduro de propidio, yoduro de propidio-ADN, R-ficoeritrina pH 7,5, ReAsH, resorufina, resorufina pH 9,0, Rhod-2, Rhod-2 Ca2+, rodamina, rodamina 110, rodamina 110 pH 7,0, rodamina 123, MeOH, Rhodamine Green, rodamina-faloidina pH 7,0, conjugado de anticuerpo de Rhodamine Red-X pH 8,0, Rhodamine Green pH 7,0, conjugado de anticuerpo de Rhodol Green pH 8,0, Sapphire, SBFI-Na+, Sodium Green Na+, Sulforhodamine 101, EtOH, SYBR Green I, SYPRO Ruby, SYTO 13-Dn A, SYTO 45-DNA, SYTOX Blue-DNA, conjugado de anticuerpo de tetrametilrrodamina pH 8,0, tetrametilrrodamina dextrano pH 7,0, conjugado de anticuerpo de Texas Red-X pH 7,2, TO-PRO-1-DNA, TO-PRO-3-DNA, TOTO-1-DNA, TOTO-3-DNA, TRITC, X-Rhod-1 Ca2+, YO-PRO-1 -DNA, YO-PRO-3-DNA, YOYO-1 -DNA y YOYO-3-DNA
Polipéptidos
Los nanoconjugados pueden comprender un polipéptido. El polipéptido se puede asociar al nanoconjugado o se puede administrar en una composición con un nanoconjugado como agente terapéutico. Como se usa en el presente documento, un "polipéptido" se refiere a un polímero que comprende restos de aminoácidos. Los polipéptidos son entendidos en la técnica e incluyen, sin limitación, un anticuerpo, una enzima y una hormona. Los nanoconjugados que comprenden un polipéptido pueden reconocer y asociarse con una molécula diana y permitir la detección de la molécula diana.
Los polipéptidos pueden ser que existen de forma natural o que no existen de forma natural. Los polipéptidos incluyen opcionalmente un espaciador como se describe en el presente documento anteriormente.
Polipéptidos que existen de forma natural
Los polipéptidos que existen de forma natural incluyen, sin limitación, polipéptidos biológicamente activos (que incluyen anticuerpos) que existen en la naturaleza o se pueden producir en una forma que se encuentra en la naturaleza por, por ejemplo, síntesis química o técnicas de expresión recombinante. Los polipéptidos que existen de forma natural también incluyen lipoproteínas y proteínas postraduccionalmente modificadas, tales como, por ejemplo y sin limitación, proteínas glucosiladas.
Los anticuerpos contemplados para su uso en los métodos y las composiciones descritos en el presente documento incluyen, sin limitación, anticuerpos que reconocen y se asocian con una molécula diana ya sea in vivo o in vitro.
Polipéptidos que no existen de forma natural
Los polipéptidos que no existen de forma natural incluyen, pero no se limitan a, polipéptidos sintéticos, además de fragmentos, análogos y variantes de polipéptidos que existen de forma natural o que no existen de forma natural, como se define en el presente documento. Los polipéptidos que no existen de forma natural también incluyen proteínas o sustancias de proteína que tienen D-aminoácidos, modificados, derivatizados, o aminoácidos que no existen de forma natural en la configuración D o L y/o unidades de peptidomiméticos como parte de su estructura. El término "proteína" se refiere normalmente a polipéptidos grandes. El término "péptido" se refiere normalmente a polipéptidos cortos (es decir, iguales o inferiores a aproximadamente 50 aminoácidos).
Los polipéptidos que no existen de forma natural se preparan, por ejemplo, usando un sintetizador de polipéptidos automatizado o, alternativamente, usando técnicas de expresión recombinante usando un polinucleótido modificado que codifica el polipéptido deseado.
Como se usa en el presente documento, un "fragmento" de un polipéptido pretende referirse a cualquier porción de un polipéptido o proteína más pequeño que el producto de expresión de polipéptido o proteína de longitud completa.
Como se usa en el presente documento, un "análogo" se refiere a cualesquiera de dos o más polipéptidos sustancialmente similares en estructura y que tienen la misma actividad biológica, pero pueden tener grados variables de actividad, a cualquiera de la molécula completa, o a un fragmento de la misma. Los análogos se diferencian en la composición de sus secuencias de aminoácidos basándose en una o más mutaciones que implican sustitución, deleción, inserción y/o adición de uno o más aminoácidos a otros aminoácidos. Las sustituciones pueden ser conservativas o no conservativas basándose en la vinculación fisicoquímica o funcional del aminoácido que se sustituye y el aminoácido que lo sustituye.
Como se usa en el presente documento, una "variante" se refiere a un polipéptido, proteína o análogo del mismo que se modifica para comprender restos químicos adicionales que normalmente no son una parte de la molécula. Dichos restos pueden modular, por ejemplo y sin limitación, la solubilidad, absorción y/o semivida biológica de la molécula. Los restos capaces de mediar en dichos efectos se desvelan en Remington's Pharmaceutical Sciences (1980). Se conocen bien en la técnica los procedimientos de acoplamiento de dichos restos con una molécula. Los polipéptidos se pueden modificar por glucosilación, PEGilación y/o polisialilación.
También se contemplan proteínas de fusión, que incluyen proteínas de fusión en donde un componente de fusión es un fragmento o un mimético. Un "mimético", como se usa en el presente documento, significa un péptido o proteína que tiene una actividad biológica que es comparable a la proteína de la que es un mimético. A modo de ejemplo, un mimético del factor de crecimiento endotelial es un péptido o proteína que tiene una actividad biológica comparable a la del factor de crecimiento endotelial nativo. El término incluye además péptidos o proteínas que imitan indirectamente la actividad de una proteína de interés, tal como potenciando los efectos del ligando natural de la proteína de interés.
Los polipéptidos incluyen anticuerpos junto con fragmentos y derivados de los mismos, que incluyen, pero no se limitan a, fragmentos Fab', fragmentos F(ab)2, fragmentos Fv, fragmentos Fc, uno o más fragmentos de regiones determinantes de la complementariedad (CDR), cadenas pesadas individuales, cadena ligera individual, cadenas pesadas y ligeras diméricas (a diferencia de cadenas pesadas y ligeras heterotetrámeras encontradas en un anticuerpo intacto, anticuerpos monocatenarios (scAb), anticuerpos humanizados (así como anticuerpos modificados en el modo de anticuerpos humanizados, pero pareciéndose el anticuerpo resultante más estrechamente a un anticuerpo en una especie no humana), anticuerpos recombinantes quelantes (CRABs), anticuerpos biespecíficos y anticuerpos multiespecíficos, y otros derivados o fragmentos de anticuerpo conocidos en la técnica.
Agentes de contraste
En el presente documento se desvelan, en diversos aspectos, métodos y composiciones que comprenden un nanoconjugado, en donde una biomolécula se conjuga con un agente de contraste mediante un sitio de conjugación. En diversos aspectos, un agente de contraste se conjuga con un polinucleótido y/o un polipéptido. Como se usa en el presente documento, un "agente de contraste" es un compuesto u otra sustancia introducida en una célula para crear una diferencia en la densidad aparente de diversos órganos y tejidos, que facilita ver los tejidos y órganos del cuerpo adyacentes delineados. Se entenderá que la conjugación de un agente de contraste con un polinucleótido o polipéptido descrito en el presente documento es útil en las composiciones y los métodos de la divulgación.
Los métodos descritos en el presente documento incluyen aquellos en donde la relaxividad del agente de contraste en asociación con un nanoconjugado aumenta con respecto a la relaxividad del agente de contraste en ausencia de estar asociado a un nanoconjugado. En algunos aspectos, el aumento es de aproximadamente 1 vez a aproximadamente 20 veces. En aspectos adicionales, el aumento es de aproximadamente 2 veces a aproximadamente 10 veces, y en aspectos aún adicionales el aumento es aproximadamente 3 veces.
En algunas realizaciones, el agente de contraste se selecciona del grupo que consiste en gadolinio, xenón, óxido de hierro, un quelato de manganeso (Mn-DPDP) y cobre. Así, en algunas realizaciones, el agente de contraste es un compuesto paramagnético, y en algunos aspectos, el compuesto paramagnético es gadolinio.
La presente divulgación también contempla agentes de contraste que son útiles para la tomografía por emisión de positrones (TEP). En algunos aspectos, el agente de contraste de t Ep es un radionúclido. En ciertas realizaciones, el agente de contraste comprende un agente de contraste de TEP que comprende una marca seleccionada del grupo que consiste en 11C, 13N, 18F, 64Cu, 68Ge, 99mTc y 82Ru. En realizaciones particulares, el agente de contraste es un agente de contraste de TEP seleccionado del grupo que consiste en [11C]colina, [18F]fluorodesoxiglucosa (FDG), [11C]metionina, [11C]colina, [11C]acetato, [18F]fluorocolina, quelatos de 64Cu, quelatos de 99mTc y [18F]polietilenglicolestilbenos.
También se describen en el presente documento métodos en donde un agente de contraste de TEP se introduce en un polinucleótido durante el proceso de síntesis de polinucleótidos o se conjuga con un nucleótido tras la síntesis de polinucleótidos. Por ejemplo y sin limitación, se pueden sintetizar nucleótidos en los que uno de los átomos de fósforo se sustituye por 32P o 33P, uno de los átomos de oxígeno en el grupo fosfato se sustituye por 35S, o uno o más de los átomos de hidrógeno se sustituye por 3H. También se puede conjugar un grupo funcional que contiene un radionúclido con un nucleótido mediante sitios de conjugación.
En ciertas realizaciones, el agente de contraste de IRM conjugado con un polinucleótido es hierro o radiotrazadores y/o complejos paramagnéticos, que incluyen, pero no se limitan a, gadolinio, xenón, óxido de hierro y cobre. Los agentes de contraste de IRM pueden incluir, pero no se limitan a, agentes de contraste positivos y/o agentes de contraste negativos. Los agentes de contraste positivos provocan una reducción en el tiempo de relajación T1 (aumento de la intensidad de señal en las imágenes ponderadas en T1). Ellos (que aparecen brillantes en IRM) normalmente son compuestos de peso molecular pequeño que contienen como elemento activo gadolinio, manganeso o hierro. Todos estos elementos tienen espines electrónicos desapareados en sus envolturas externas y relaxividades largas. Un grupo especial de agentes de contraste negativos (que aparecen oscuros en IRM) incluye perfluorocarbonos (sustancias perfluoroquímicas), debido a que su presencia excluye los átomos de hidrógeno responsables de la señal en la obtención de imágenes de RM.
Se contempla que la composición de la divulgación, en diversos aspectos, comprende un nanoconjugado que comprende aproximadamente 50 a aproximadamente 2,5 X 106 agentes de contraste. En algunas realizaciones, el nanoconjugado comprende aproximadamente 500 a aproximadamente 1 X 106 agentes de contraste.
Resto de direccionamiento
El término "resto de direccionamiento", como se usa en el presente documento, se refiere a cualquier estructura molecular que ayuda a un compuesto u otra molécula en la unión o localización de otro modo en una diana particular, un área diana, célula(s) diana de entrada o unión a un receptor diana. Por ejemplo y sin limitación, los restos de direccionamiento pueden incluir proteínas, que incluyen anticuerpos y fragmentos de proteínas capaces de unirse a un sitio diana deseado in vivo o in vitro, péptidos, moléculas pequeñas, agentes antineoplásicos, aglutinantes de polinucleótidos, hidratos de carbono, ligando para receptores de la superficie celular, aptámeros, lípidos (que incluyen lípidos catiónicos, neutros y esteroideos, virosomas y liposomas), anticuerpos y hormonas pueden servir de restos de direccionamiento. Los restos de direccionamiento son útiles para la administración del nanoconjugado a tipos específicos de células, además de a localizaciones subcelulares.
Los mecanismos de transporte mediados por receptor están presentes en la BHE, y estos implican el sistema de tráfico vesicular del endotelio cerebral [Jones et al., Pharm Res. 24(9): 1759-1771 (2007)]. La entrada en el cerebro de nutrientes tales como el hierro [Jefferies et al., Nature 312: 162-163 (1984)], la insulina [Duffy et al., Brain Res 420: 32-38 (1987)] y la leptina [Golden et al., J Clin Invest 99: 14-18 (1997)] ocurre por un mecanismo de transporte transcelular mediado por receptor conocido como transcitosis.
En algunas composiciones descritas en el presente documento, el resto de direccionamiento es una proteína. La porción de proteína de la composición puede ser una proteína capaz de dirigir la composición a una célula diana. La proteína de direccionamiento se puede unir a un receptor, sustrato, determinante antigénico, u otro sitio de unión sobre una célula diana u otro sitio diana.
Los anticuerpos útiles como proteínas de direccionamiento pueden ser policlonales o monoclonales. Se han desarrollado varios anticuerpos monoclonales (mAb) que se unen a un tipo específico de célula. También se pueden usar anticuerpos derivados por ingeniería genética o manipulación de proteínas (por ejemplo, anticuerpos IgG, IgA, IgM, IgD, IgE).
Un anticuerpo empleado como agente de direccionamiento puede ser una molécula intacta, un fragmento de la misma, o un equivalente funcional de la misma. Los ejemplos de fragmentos de anticuerpos útiles en las composiciones descritas en el presente documento son fragmentos F(ab')2, Fab' Fab y Fv, que se pueden producir por métodos convencionales o por manipulación genética o de proteínas.
Los restos de direccionamiento pueden incluir, pero no se limitan a, azúcares (por ejemplo, manosa, manosa-6-fosfato, galactosa). En composiciones adicionales descritas en el presente documento, el resto se dirige a uno cualquiera o una combinación del receptor de transferrina (TfR), que se expresa altamente por capilares del cerebro para mediar en la administración de hierro al cerebro [Jefferies et al., Nature 312: 162-163 (1984)]; el receptor de insulina y el factor de crecimiento similar al receptor de insulina [Duffy et al., Brain Res 420:32-38 (1987)]; la proteína 1 relacionada con el receptor de lipoproteínas de baja densidad y la proteína 2 relacionada con el receptor de lipoproteínas de baja densidad [Gaillard et al., Expert Opin Drug Deliv 2:299-309 (2005)]; y el factor de crecimiento de tipo factor de crecimiento epidérmico que se une al receptor de toxina diftérica/heparina [Gaillard et al., Int Congres Series 1277:185-198 (2005)]. Restos adicionales contemplados que son capaces de efectuar la transcitosis mediada por receptor (RMT) incluyen, pero no se limitan a, los desvelados en Feng et al. [en: Drug Delivery to the Central Nervous System, Kewal K. Jain (Editor), vol. 45: 15-34 (2010)].
La porción de polinucleótido del nanoconjugado puede servir de resto de direccionamiento adicional o auxiliar. La porción de polinucleótido se puede seleccionar o diseñar para ayudar en el direccionamiento extracelular, o para actuar de resto de direccionamiento intracelular. Es decir, la porción de polinucleótido puede actuar de sonda de ADN que trata de buscar células diana. Esta capacidad de direccionamiento adicional servirá para mejorar la especificidad en la administración de la composición a las células diana. El polinucleótido se puede seleccionar o diseñar adicionalmente o alternativamente para dirigir la composición dentro de las células diana, mientras que la proteína de direccionamiento elige como diana el conjugado extracelularmente.
Se contempla que el resto de direccionamiento se puede asociar a un nanoconjugado. Si el nanoconjugado comprende una nanopartícula (es decir, no está hueco), se contempla que el resto de direccionamiento se puede unir a cualquiera de la nanopartícula, el polinucleótido/polipéptido, o ambos. En ejemplos adicionales, el resto de direccionamiento se asocia con la composición de nanoconjugado, y en otros ejemplos el resto de direccionamiento se administra antes, simultáneamente con, o después de la administración de una composición descrita en el presente documento.
Agentes terapéuticos
En cualquiera de los aspectos o realizaciones de la divulgación, se contempla que un agente terapéutico se administra con un nanoconjugado. Dicha administración se puede facilitar, en diversas realizaciones, asociando el agente terapéutico con un nanoconjugado, o la administración se puede facilitar administrando simultáneamente el agente terapéutico con un nanoconjugado. Se conocen en la técnica métodos de asociación de un agente terapéutico con un nanoconjugado y se describen, por ejemplo y sin limitación, en la solicitud de patente internacional número PCT/US2010/055018. En algunas realizaciones, el agente terapéutico es un factor neurotrófico.
Neurotrofinas
Muchos factores neurotróficos son neuroprotectores en el cerebro, pero no atraviesan la barrera hematoencefálica. En algunas realizaciones de la invención, el agente terapéutico es el factor neurotrófico derivado del cerebro (BDNF), factor de crecimiento nervioso (NGF), neurotrofina-4/5, factor de crecimiento de fibroblastos (FGF)-2 y otros FGF, neurotrofina (NT)-3, eritropoyetina (EPO), factor de crecimiento de hepatocitos (HGF), factor de crecimiento epidérmico (EGF), factor de crecimiento transformante (TGF)-a, TGF-p, factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF), antagonista del receptor de interleucina-1 (IL-1 ra), factor neurotrófico ciliar (CNTF), factor neurotrófico derivado de la glía (GDNF), neurturina, factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF), heregulina, neuregulina, artemina, persefina, interleucinas, factor estimulante de colonias (CSF) de granulocitos, CSF de granulocitos-macrófagos, netrinas, cardiotrofina-1, hedgehogs, factor inhibidor de la leucemia (LIP), midkina, pleiotrofina, proteínas morfogenéticas óseas (BMP), netrinas, saposinas, semaforinas o factor de células madre (SCF).
Agente antineoplásico
Algunas composiciones descritas en el presente documento pueden comprender un agente antineoplásico. Los agentes antineoplásicos adecuados incluyen, pero no se limitan a, actinomicina D, alemtuzumab, alopurinol sodio, amifostina, amsacrina, anastrozol, Ara-CMP, asparaginasa, azacitadina, bendamustina, bevacizumab, bicalutimida, bleomicina (por ejemplo, bleomicina A2 y B2), bortezomib, busulfán, sal de sodio de camptotecina, capecitabina, carboplatino, carmustina, cetuximab, clorambucilo, cisplatino, cladribina, clofarabina, ciclofosfamida, citarabina, dacarbazina, dactinomicina, daunorubicina, daunorubicina liposómica, dacarbazina, decitabina, docetaxel, doxorubicina, doxorubicina liposómica, epirubicina, estramustina, etopósido, fosfato de etopósido, exemestano, floxuridina, fludarabina, fosfato de fludarabina, 5-fluorouracilo, fotemustina, fulvestrant, gemcitabina, goserelina, hexametilmelamina, hidroxiurea, idarubicina, ifosfamida, imatinib, irinotecán, ixabepilona, lapatinib, letrozol, acetato de leuprolida, lomustina, mecloretamina, melfalán, 6-mercaptopurina, metotrexato, mitramicina, mitomicina C, mitotano, mitoxantrona, nimustina, ofatumumab, oxaliplatino, paclitaxel, panitumumab, pegaspargasa, pemetrexed, pentostatina, pertuzumab, picoplatino, pipobromano, plerixafor, procarbazina, raltitrexed, rituximab, estreptozocina, temozolomida, tenipósido, 6-tioguanina, tiotepa, topotecán, trastuzumab, treosulfán, trietilenmelamina, trimetrexato, mostaza nitrogenada de uracilo, valrubicina, vinblastina, vincristina, vindesina, vinorelbina, y análogos, precursores, derivados y profármacos de los mismos. Se observa que dos o más de los compuestos anteriores se pueden usar en combinación en las composiciones de la divulgación.
Molécula pequeña
El término "molécula pequeña", como se usa en el presente documento, se refiere a un compuesto químico, por ejemplo, un peptidomético que se puede derivatizar opcionalmente, o cualquier otro compuesto orgánico de bajo peso molecular, ya sea natural o sintético. Dichas moléculas pequeñas pueden ser una sustancia terapéuticamente suministrable o se puede derivatizar aún más para facilitar la administración.
Por "bajo peso molecular" se indican compuestos que tienen un peso molecular inferior a 1000 daltones, normalmente entre 300 y 700 daltones. Los compuestos de bajo peso molecular, en diversos aspectos, tienen aproximadamente 100, aproximadamente 150, aproximadamente 200, aproximadamente 250, aproximadamente 300, aproximadamente 350, aproximadamente 400, aproximadamente 450, aproximadamente 500, aproximadamente 550, aproximadamente 600, aproximadamente 650, aproximadamente 700, aproximadamente 750, aproximadamente 800, aproximadamente 850, aproximadamente 900, o aproximadamente 1000 daltones.
MÉTODOS
La divulgación proporciona composiciones que comprenden un nanoconjugado que es capaz de atravesar la BHE. Dichas composiciones son útiles, en diversos aspectos, para el tratamiento de trastornos agudos y crónicos del SNC. Por ejemplo y sin limitación, las composiciones de la divulgación son útiles en el tratamiento de afecciones cerebrales y de médula espinal agudas, tales como isquemia cerebral focal, isquemia cerebral global y lesión de la médula espinal, y tratamiento crónico de enfermedad neurodegenerativa, que incluye enfermedades priónicas, enfermedad de Alzheimer (EA), enfermedad de Parkinson (EP), enfermedad de Huntington (EH), ELA, esclerosis múltiple, mielitis transversa, enfermedad de las neuronas motoras, enfermedad de Pick, esclerosis tuberosa, trastornos de almacenamiento lisosómico, enfermedad de Canavan, síndrome de Rett, ataxias espinocerebelosas, ataxia de Friedreich, atrofia óptica y degeneración retiniana. También se contemplan para el tratamiento enfermedades de las neuronas motoras inferiores tales como AME y ELA, así como enfermedad de Pompe, trastornos de almacenamiento lisosómico, glioblastoma multiforme y enfermedad de Parkinson. Los trastornos de almacenamiento lisosómico incluyen, pero no se limitan a, deficiencia de activadores/gangliosidosis GM2, alfa-manosidosis, aspartilglucosaminuria, enfermedad por almacenamiento de éster de colesterilo, deficiencia crónica de hexosaminidasa A, cistinosis, enfermedad de Danon, enfermedad de Fabry, enfermedad de Farber, fucosidosis, galactosialidosis, enfermedad de Gaucher (tipo I, tipo II, tipo III), gangliosidosis GM1 (infantil, infantil tardía/juvenil, adulta/crónica), enfermedad de células I/mucolipidosis II, enfermedad por almacenamiento de ácido siálico libre infantil/EAAS, deficiencia de hexosaminidasa A juvenil, enfermedad de Krabbe (aparición infantil, aparición tardía), leucodistrofia metacromática, trastornos de la mucopolisacaridosis (pseudopolidistrofia de Hurler/mucolipidosis IlIA, MPS I síndrome de Hurler, MPS I síndrome de Scheie, MPS I síndrome de Hurler-Scheie, MPS II síndrome de Hunter, síndrome de Sanfilipo tipo A/MPS III A, síndrome de Sanfilipo tipo B/MPS III B, síndrome de Sanfilipo tipo C/MPS III C, síndrome de Sanfilipo tipo D/MPS III D, Morquio tipo A/MPS IV A, Morquio tipo B/MPS IV B, MPS IX deficiencia de hialuronidasa, MPS VI Maroteaux-Lamy, MPS VII síndrome de Sly, mucolipidosis 1/sialidosis, mucolipidosis IIIC, mucolipidosis tipo IV), deficiencia de múltiples sulfatasas, enfermedad de Niemann-Pick (tipo A, tipo B, tipo C), lipofuscinosis ceroide neuronal (enfermedad CLN6 (infantil tardía atípica, variante de aparición tardía, juvenil temprana), Batten-Spielmeyer-Vogt/NCL juvenil/enfermedad de CLN3, CLN5 infantil tardía variante finlandesa, enfermedad de Jansky-Bielschowsky/CLN2 infantil tardía/enfermedad de TPP1, Kufs/NCL de aparición en la edad adulta/enfermedad de CLN4, epilepsia del norte/CLN8 infantil tardía de variante, Santavuori-Haltia/CLN1 infantil/enfermedad de PPT, beta-manosidosis, enfermedad de Pompe/enfermedad por almacenamiento de glucógeno tipo II, picnodisostosis, enfermedad de Sandhoff/aparición en la edad adulta/gangliosidosis GM2, enfermedad de Sandhoff/gangliosidosis GM2-infantil, enfermedad de Sandhoff/gangliosidosis GM2 juvenil, enfermedad de Schindler, enfermedad de Salla/enfermedad por almacenamiento de ácido siálico, Tay-Sachs/gangliosidosis GM2 y/o enfermedad de Wolman. En otros métodos descritos en el presente documento, se indica el uso de los métodos y materiales para el tratamiento de enfermedad del sistema nervioso, tal como síndrome de Rett, junto con lesión del sistema nervioso, que incluye traumatismo/lesión de la médula espinal y cerebral, accidente cerebrovascular y cánceres cerebrales.
En algunos aspectos, una composición de la divulgación comprende un polipéptido que es un factor trófico o protector. En algunas realizaciones, el factor trófico o protector se administra simultáneamente con un nanoconjugado de la divulgación. En diversas realizaciones, el uso de un factor trófico o protector se indica para los trastornos neurodegenerativos contemplados en el presente documento, que incluyen, pero no se limitan a, enfermedad de Alzheimer, enfermedad de Parkinson, enfermedad de Huntington, junto con lesión del sistema nervioso que incluye traumatismo/lesión de la médula espinal y cerebral, accidente cerebrovascular y cánceres cerebrales. Los ejemplos no limitantes de factores de crecimiento del sistema nervioso conocidos incluyen factor de crecimiento nervioso (NGF), factor neurotrófico derivado del cerebro (BDNF), neurotrofina-3 (NT-3), neurotrofina-4/5 (NT-4/5), neurotrofina-6 (NT-6), factor neurotrófico ciliar (CNTF), factor neurotrófico derivado de la línea celular de la glía (GDNF), la familia del factor de crecimiento de fibroblastos (por ejemplo, FGF 1-15), factor inhibidor de la leucemia (LIF), ciertos miembros de la familia del factor de crecimiento similar a la insulina (por ejemplo, IGF-1), las neurturinas, persefina, las proteínas morfogénicas óseas (BMP), las inmunofilinas, la familia del factor de crecimiento transformante (TGF) de factores de crecimiento, las neuregulinas, factor de crecimiento epidérmico (EGF), factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF), familia del factor de crecimiento endotelial vascular (por ejemplo, VEGF 165), folistatina y Hifl. También se contemplan, en general, factores de transcripción de dedos de cinc que regulan cada uno de los factores tróficos o protectores contemplados en el presente documento. En realizaciones adicionales, se contemplan métodos de modulación de la función neuroinmunitaria, que incluyen, pero no se limitan a, inhibición de la activación de la microglía y la astroglía mediante, por ejemplo, inhibición de n FkB, o NFkB para la neuroprotección (acción dual de NFkB y vías asociadas en diferentes tipos de células) por ARNip, ARNhp, antisentido o miARN. Como entiende un experto en la técnica, uno cualquiera o más de los ARN inhibidores anteriormente mencionados se asocia, en diversas realizaciones, a un nanoconjugado como se describe en el presente documento.
En los ejemplos descritos en el presente documento, el nanoconjugado comprende un polinucleótido que se híbrida específicamente con e inhibe un miembro de la familia Bcl-2. En algunos ejemplos descritos en el presente documento, el miembro de la familia Bcl-2 es Bcl2L12.
En algunas realizaciones, el uso de materiales y métodos de la divulgación se indica para trastornos neurodegenerativos, tales como enfermedad de Parkinson. En diversas realizaciones, el nanoconjugado se administra conjuntamente con dopa descarboxilasa de ácido aromático (AADC), tirosina hidroxilasa, GTP-ciclohidrolasa 1 (gtpch1), un inhibidor apoptósico (por ejemplo, bcl2, bclxL), factor neurotrófico derivado de la línea celular de la glía (GDNF), el neurotransmisor inhibidor - ácido aminobutírico (GABA) y enzimas que participan en la biosíntesis de la dopamina. En realizaciones adicionales, el nanoconjugado se administra simultáneamente con un modificador de Parkin y/o sinucleína.
En algunas realizaciones, el uso de materiales y métodos de la divulgación se indica para trastornos neurodegenerativos, tales como la enfermedad de Alzheimer. En realizaciones adicionales, se contemplan métodos de aumento de la producción de acetilcolina. En realizaciones aún adicionales, se contemplan métodos de aumento del nivel de una colina acetiltransferasa (ChAT) o de inhibición de la actividad de una acetilcolina esterasa (AchE).
En algunas realizaciones, el nanoconjugado comprende un polinucleótido que inhibe la expresión de la proteína Huntington mutante (htt) mediante ARNip, ARNhp, antisentido y/o miARN para tratar un trastorno neurodegenerativo, tal como enfermedad de Huntington.
En algunas realizaciones, se indica el uso de materiales y métodos de la divulgación para trastornos neurodegenerativos, tales como ELA. En algunos aspectos, el tratamiento con las realizaciones contempladas por la divulgación da como resultado una disminución en la expresión de marcadores moleculares de enfermedad, tales como TNFa, óxido nítrico, peroxinitrito y/o óxido nítrico sintasa (NOS).
En otros aspectos, el nanoconjugado comprende un ARN de horquilla corta que apunta a proteínas mutadas tales como superóxido dismutasa para ELA.
En algunas realizaciones, se indica el uso de materiales y métodos de la divulgación para prevenir o tratar trastornos del desarrollo neurológico, tales como síndrome de Rett. Para las realizaciones que se refieren al síndrome de Rett, el nanoconjugado se administra simultáneamente con la proteína 2 de unión a metilcitosina (MeCP2).
Métodos de inhibición de la expresión génica
Los métodos adicionales proporcionados por la divulgación incluyen métodos de inhibición de la expresión de un producto génico expresado a partir de un polinucleótido diana que comprenden poner en contacto el polinucleótido diana con una composición como se describe en el presente documento, en donde la puesta en contacto es suficiente para inhibir la expresión del producto génico. La inhibición del producto génico resulta de la hibridación de un polinucleótido diana con una composición de la divulgación.
Se entiende en la técnica que la secuencia de un polinucleótido que es parte de un nanoconjugado no necesita ser 100 % complementaria a la de su polinucleótido diana para hibridarse específicamente con el polinucleótido diana. Además, un polinucleótido que es parte de un nanoconjugado se puede hibridar con un polinucleótido diana a lo largo de uno o más segmentos de forma que segmentos intermedios o adyacentes no participen en el acontecimiento de hibridación (por ejemplo y sin limitación, una estructura de bucle o estructura de horquilla). El porcentaje de complementariedad se determina a lo largo de la longitud del polinucleótido que es parte del nanoconjugado. Por ejemplo, dado un nanoconjugado que comprende un polinucleótido en el que 18 de 20 nucleótidos del polinucleótido son complementarios a una región de 20 nucleótidos en un polinucleótido diana de 100 nucleótidos de longitud total, el polinucleótido que es parte del nanoconjugado sería 90 por ciento complementario. En este ejemplo, los nucleótidos no complementarios restantes se pueden agrupar o intercalar con nucleótidos complementarios y no necesitan ser contiguos entre sí o con nucleótidos complementarios. El porcentaje de complementariedad de un polinucleótido que es parte de un nanoconjugado con una región de un polinucleótido diana se puede determinar rutinariamente usando programas BLAST (herramientas de búsqueda de alineamientos locales básicos) y programas PowerBLAST conocidos en la técnica (Altschul et al., J. Mol. Biol., 1990, 215, 403-410; Zhang y Madden, Genome Res., 1997, 7, 649-656).
Los métodos de inhibición de la expresión de productos génicos proporcionados incluyen aquellos en donde la expresión del producto génico diana se inhibe en al menos aproximadamente 5 %, al menos aproximadamente 10 %, al menos aproximadamente 15 %, al menos aproximadamente 20 %, al menos aproximadamente 25 %, al menos aproximadamente 30 %, al menos aproximadamente 35 %, al menos aproximadamente 40 %, al menos aproximadamente 45 %, al menos aproximadamente 50 %, al menos aproximadamente 55 %, al menos aproximadamente 60 %, al menos aproximadamente 65 %, al menos aproximadamente 70 %, al menos aproximadamente 75 %, al menos aproximadamente 80 %, al menos aproximadamente 85 %, al menos aproximadamente 90 %, al menos aproximadamente 95 %, al menos aproximadamente 96 %, al menos aproximadamente 97 %, al menos aproximadamente 98 %, al menos aproximadamente 99 %, o 100 % en comparación con la expresión de productos génicos en ausencia de un nanoconjugado que comprende un polinucleótido. En otras palabras, los métodos proporcionados engloban los que dan como resultado esencialmente cualquier grado de inhibición de la expresión de un producto génico diana.
El grado de inhibición se determina in vivo a partir de una muestra de líquido corporal o de una muestra de biopsia o por técnicas de obtención de imágenes bien conocidas en la técnica. Alternativamente, el grado de inhibición se determina in vitro en un ensayo de cultivo celular, en general, como una medida predecible de un grado de inhibición que se puede esperar in vivo resultante del uso de una composición como se describe en el presente documento. Se contempla por la divulgación que la inhibición de un polinucleótido diana se usa para evaluar los efectos de la inhibición sobre una célula dada. A modo de ejemplo no limitante, se puede estudiar el efecto de la inhibición de un producto génico en donde el producto génico es parte de una vía de transducción de señales. Alternativamente, se puede estudiar la inhibición de un producto génico en donde se supone que el producto génico participa en una vía apoptósica.
Se entenderá que se puede usar en combinación cualquiera de los métodos descritos en el presente documento para lograr un resultado deseado. Por ejemplo y sin limitación, los métodos descritos en el presente documento se pueden combinar para permitir tanto la detección de un polinucleótido diana, así como la regulación de su expresión. En algunas realizaciones, esta combinación se puede usar para cuantificar la inhibición de la expresión del polinucleótido diana con el tiempo, ya sea in vitro o in vivo. La cuantificación con el tiempo se logra, en un aspecto, retirando las células de un cultivo en momentos de tiempo especificados y evaluando el nivel de expresión relativo de un polinucleótido diana en cada momento de tiempo. Una disminución en la cantidad de polinucleótido diana como se evalúa, en un aspecto, mediante la visualización de una marca detectable, con el tiempo indica la tasa de inhibición del polinucleótido diana.
Así, la determinación de la eficacia de un polinucleótido dado con el que se hibrida e inhibe la expresión de un polinucleótido diana, así como la determinación del efecto de inhibición de un polinucleótido dado en una célula, son aspectos que se contemplan.
Uso de un nanoconjugado como sonda
Los nanoconjugados se usan, en un aspecto, como sondas en ensayos de diagnóstico para detectar un ácido nucleico o una célula.
Algunas realizaciones del método de detección de un ácido nucleico diana utilizan un sustrato. Se puede usar cualquier sustrato que permita la observación del cambio detectable. Los sustratos adecuados incluyen superficies sólidas transparentes (por ejemplo, vidrio, cuarzo, plástico y otros polímeros), superficie sólida opaca (por ejemplo, superficies sólidas blancas, tales como placas de sílice de CCF, papel de filtro, filtros de fibra de vidrio, membranas de nitrato de celulosa, membranas de nailon) y superficie sólidas conductoras (por ejemplo, óxido de indio y estaño (ITO)). El sustrato puede estar en cualquier forma o espesor, pero, en general, será plano y delgado. Se prefieren sustratos transparentes tales como vidrio (por ejemplo, portaobjetos de vidrio) o plásticos (por ejemplo, pocillos de placas de microtitulación). Los métodos de unión de polinucleótidos a un sustrato y los usos de los mismos con respecto a los nanoconjugados se desvelan en la solicitud de patente de EE. UU. 20020172953.
Empleando un sustrato, se puede amplificar el cambio detectable y aumentar la sensibilidad del ensayo. En un aspecto, el método comprende las etapas de poner en contacto un polinucleótido diana con un sustrato que tiene un polinucleótido unido al mismo, teniendo el polinucleótido (i) una secuencia complementaria a una primera porción de la secuencia del ácido nucleico diana, la etapa de poner en contacto se realiza en condiciones eficaces para permitir la hibridación del polinucleótido sobre el sustrato con el ácido nucleico diana, y (ii) poner en contacto el ácido nucleico diana unido al sustrato con un primer tipo de nanoconjugado que tiene un polinucleótido unido al mismo, teniendo el polinucleótido una secuencia complementaria a una segunda porción de la secuencia del ácido nucleico diana, la etapa de poner en contacto se realiza en condiciones eficaces para permitir la hibridación del polinucleótido que es parte del nanoconjugado con el ácido nucleico diana. A continuación, el primer tipo de nanoconjugado unido al sustrato se pone en contacto con un segundo tipo de nanoconjugado que comprende un polinucleótido, teniendo el polinucleótido en el segundo tipo de nanoconjugado una secuencia complementaria a al menos una porción de la secuencia del polinucleótido usada para producir el primer tipo de nanoconjugado, teniendo lugar la etapa de poner en contacto en condiciones eficaces para permitir la hibridación de los polinucleótidos en el primer y segundo tipos de nanoconjugados. Finalmente, se observa un cambio detectable producido por estas hibridaciones.
El cambio detectable que ocurre tras la hibridación de los polinucleótidos en los nanoconjugados con el ácido nucleico puede ser un cambio de color, formación de agregados de los nanoconjugados, detección de un marcador radiológico, o la precipitación de los nanoconjugados agregados. Los cambios de color se pueden observar a simple vista o espectroscópicamente. La formación de agregados de los nanoconjugados se puede observar por microscopía electrónica o por nefelometría. La precipitación de los nanoconjugados agregados se puede observar a simple vista o microscópicamente. Se prefieren cambios observables a simple vista. Particularmente se prefiere un cambio de color observable a simple vista.
Los métodos de detección de la hibridación de ácidos nucleicos diana basados en observar un cambio de color a simple vista son baratos, rápidos, simples, robustos (los reactivos son estables), no requieren equipo especializado o caro, y se requiere poca o ninguna instrumentación. Estas ventajas hacen que sean particularmente adecuados para su uso en, por ejemplo, laboratorios de investigación y analíticos en la secuenciación de ADN, en el campo de la detección de la presencia de patógenos específicos, en el consultorio médico para la rápida identificación de una infección para ayudar a recetar un fármaco para el tratamiento, y en residencias y centros de salud para un cribado de primera línea asequible.
Se puede usar un nanoconjugado que comprende un polinucleótido en un ensayo para identificar una molécula diana de interés. Así, el nanoconjugado que comprende un polinucleótido se puede usar en un ensayo tal como un ensayo de código de barras biológico. Véanse, por ejemplo, las patentes de EE. UU. N° 6.361.944; 6.417.340; 6.495.324; 6.506.564; 6.582.921; 6.602.669; 6.610.491; 6.678.548; 6.677.122; 6682.895; 6.709.825; 6.720.147; 6.720.411; 6.750.016; 6.759.199; 6.767.702; 6.773.884; 6.777.186; 6.812.334; 6.818.753; 6.828.432; 6.827.979; 6.861.221; y 6.878.814.
En algunas realizaciones, las composiciones de la divulgación son útiles en la tecnología de nano-destellos. Se ha descrito previamente el nano-destello en el contexto de nanopartículas funcionalizadas con polinucleótidos que se pueden aprovechar de una arquitectura de sicPN para la detección fluorescente de niveles de polinucleótidos dentro de una célula viva [se describe en el documento de patente WO 2008/098248 y la publicación de solicitud de patente de EE. UU. número U.S. 2011/0111974].
En este sistema, sicPN actúa de "destello" y se marca detectablemente y se desplaza o libera de la superficie por un polinucleótido diana entrante. Así, se contempla que la tecnología de nano-destellos es útil en el contexto de los nanoconjugados descritos en el presente documento.
ADMINISTRACIÓN Y COMPOSICIONES FARMACÉUTICAS
Se apreciará que cualquiera de las composiciones descritas en el presente documento se puede administrar a un mamífero en una cantidad terapéuticamente eficaz para lograr un efecto terapéutico deseado.
Las composiciones descritas en el presente documento se pueden formular en composiciones farmacéuticas con un excipiente, vehículo o diluyente farmacéuticamente aceptable. El compuesto o composición se puede administrar por cualquier vía que permita el tratamiento de, por ejemplo y sin limitación, una enfermedad, trastorno o infección como se describe en el presente documento. Dependiendo de las circunstancias, una composición farmacéutica se aplica o instila en cavidades corporales, se absorbe a través de la piel o membranas mucosas, se ingiere, inhala y/o se introduce en circulación. En algunas realizaciones, una composición que comprende un nanoconjugado se administra por vía intravenosa, por vía intrarterial o por vía intraperitoneal, para introducir la composición en la circulación. También es apropiada la administración no intravenosa, particularmente con respecto a terapéuticos de bajo peso molecular. En ciertas circunstancias, se desea administrar una composición farmacéutica que comprende el nanoconjugado periféricamente, por vía oral, por vía tópica, por vía sublingual, por vía vaginal, por vía rectal; por inyección por medios intracerebrales (intraparenquimales), intracerebroventriculares, intramusculares, intraoculares, intraportales, intralesionales, intramedulares, intratecales, intraventriculares, transdérmicos, subcutáneos, intranasales, uretrales o enterales; por sistemas de liberación sostenida; o por dispositivos de implantación.
La administración puede tomar la forma de administración de dosis única, o el compuesto de las realizaciones se puede administrar durante un periodo de tiempo, ya sea en dosis divididas o en una dosis única. Sin embargo, los compuestos de las realizaciones se administran al sujeto, las cantidades de compuesto administradas y la vía de administración elegida se deben seleccionar para permitir el tratamiento eficaz de la patología. También se contempla la administración de combinaciones de agentes terapéuticos (es decir, terapia de combinación), y en algunas de estas realizaciones, al menos uno de los agentes terapéuticos está en asociación con un nanoconjugado como se describe en el presente documento.
En realizaciones en donde un nanoconjugado se va a estudiar en una línea celular de glioma y/o neuroesferas tumorales (TNS) derivadas de paciente, se contempla que se administre aproximadamente 0,1 nM a aproximadamente 10 nM, o aproximadamente 0,5 nM a aproximadamente 8 nM, o aproximadamente 1 nM a aproximadamente 10 nM, o aproximadamente 0,1 nM a aproximadamente 0,5 nM, o aproximadamente 0,1 nM a aproximadamente 5 nM. En realizaciones específicas, se contempla que se administre aproximadamente 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 nM o más del nanoconjugado a una línea celular de glioma y/o TNS derivadas de paciente. En algunas realizaciones, la administración del nanoconjugado continúa durante aproximadamente 24-48, o aproximadamente 24-36, o aproximadamente 24-40, o aproximadamente 36-48, o aproximadamente 24, aproximadamente 30, aproximadamente 36, aproximadamente 40, o aproximadamente 48 horas o más.
En realizaciones adicionales, la administración de una composición de nanoconjugado como se describe en el presente documento es desde aproximadamente 1 mg/kg hasta aproximadamente 50 mg/kg, o aproximadamente 5 mg/kg a aproximadamente 50 mg/kg, o desde aproximadamente 5 mg/kg hasta aproximadamente 30 mg/kg, o desde aproximadamente 5 mg/kg hasta aproximadamente 20 mg/kg, o desde aproximadamente 5 mg/kg hasta aproximadamente 10 mg/kg. En una realización, la administración es administración intravenosa y la cantidad de la composición de nanoconjugado que se administra es 7 mg/kg. En realizaciones adicionales, la composición de nanoconjugado se administra diariamente, semanalmente o mensualmente. En algunas realizaciones, se administra una única administración al día. En realizaciones adicionales, se administran 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 o más administraciones de una composición de nanoconjugado y/o agente terapéutico al día, o cada dos días, o cada semana, o cada mes.
Se contempla la administración de una composición de nanoconjugado con un agente terapéutico como se describe en el presente documento, en diversas realizaciones, empezará al mismo tiempo, o el agente terapéutico se administrará 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 o más días después de la composición de nanoconjugado. En realizaciones alternativas, el agente terapéutico se administra 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 o más días antes de administrar la composición de nanoconjugado. Se pueden determinar cantidades terapéuticamente y profilácticamente eficaces de una composición para una situación dada por experimentación rutinaria que está dentro de la experiencia y el criterio del profesional clínico. Por ejemplo y sin limitación, la cantidad de temozolamida que se administra es aproximadamente 10 mg/kg, o aproximadamente 20 mg/kg, o aproximadamente 30 mg/kg, o aproximadamente 40 mg/kg, o aproximadamente 50 mg/kg o más.
En una realización, las composiciones farmacéuticas se pueden formular con excipientes farmacéuticamente aceptables tales como vehículos, disolventes, estabilizadores, adyuvantes y/o diluyentes, dependiendo del modo particular de administración y la forma farmacéutica. Las composiciones farmacéuticas se deben formular, en general, para lograr un pH fisiológicamente compatible, y puede variar de un pH de aproximadamente 3 a un pH de aproximadamente 11, preferentemente aproximadamente pH 3 a aproximadamente pH 7, dependiendo de la formulación y la vía de administración. En realizaciones alternativas, se puede preferir que el pH se ajuste hasta un intervalo desde aproximadamente pH 5,0 hasta aproximadamente pH 8. Más particularmente, las composiciones farmacéuticas comprenden en diversos aspectos una cantidad terapéuticamente o profilácticamente eficaz de la al menos un composición como se describe en el presente documento, junto con uno o más excipientes farmacéuticamente aceptables. Como se describe en el presente documento, las composiciones farmacéuticas pueden comprender opcionalmente una combinación de los compuestos descritos en el presente documento.
El término "excipiente farmacéuticamente aceptable" se refiere a un excipiente para administración de un agente farmacéutico, tal como los compuestos descritos en el presente documento. El término se refiere a cualquier excipiente farmacéutico que se pueda administrar sin excesiva toxicidad.
Los excipientes farmacéuticamente aceptables se determinan en parte por la composición particular que se administra, así como por el método particular usado para administrar la composición. Por consiguiente, existe una amplia variedad de formulaciones adecuadas de composiciones farmacéuticas (véase, por ejemplo, Remington's Pharmaceutical Sciences).
Los excipientes adecuados pueden ser moléculas de vehículo que incluyen macromoléculas grandes, lentamente metabolizadas, tales como proteínas, polisacáridos, ácidos polilácticos, ácidos poliglicólicos, aminoácidos poliméricos, copolímeros de aminoácidos y partículas de virus inactivos. Otros excipientes a de modo de ejemplo incluyen antioxidantes (por ejemplo, ácido ascórbico), agentes quelantes (por ejemplo, EDTA), hidratos de carbono (por ejemplo, dextrina, hidroxialquilcelulosa y/o hidroxialquilmetilcelulosa), ácido esteárico, líquidos (por ejemplo, aceites, agua, solución salina, glicerol y/o etanol), agentes humectantes o emulsionantes, sustancias de tamponamiento del pH y similares.
Además, las composiciones farmacéuticas pueden estar en forma de una preparación inyectable estéril, tal como una emulsión acuosa inyectable estéril o suspensión oleaginosa. Esta emulsión o suspensión se puede formular por un experto habitual en la técnica usando dispersantes o humectantes y agentes de suspensión adecuados. La preparación inyectable estéril también puede ser una disolución o suspensión inyectable estéril en un diluyente o disolvente aceptable no tóxico por vía parenteral, tal como una disolución en 1,2-propano-diol.
La preparación inyectable estéril también se puede preparar como un polvo liofilizado. Además, se pueden emplear aceites no volátiles estériles como disolvente o medio de suspensión. Para este fin, se puede emplear cualquier aceite no volátil suave que incluye mono- o diglicéridos sintéticos. Además, asimismo se pueden usar ácidos grasos (por ejemplo, ácido oleico) en la preparación de inyectables.
KITS
En el presente documento también se describen kits que comprenden una composición de la invención. El kit puede comprender al menos un recipiente, conteniendo el recipiente al menos un tipo de nanoconjugado como se describe en el presente documento que comprende una o más biomoléculas como se describe en el presente documento. Si la biomolécula es un polinucleótido, se contempla que los polinucleótidos que son parte del primer tipo de nanoconjugado puedan tener una o más secuencias complementarias (o suficientemente complementarias como se desvela en el presente documento) con una o más secuencias de una primera porción de un polinucleótido diana. El recipiente incluye opcionalmente uno o más tipos adicionales de nanoconjugados que comprenden un polinucleótido con una secuencia complementaria a una o más secuencias de una segunda porción del polinucleótido diana.
En otro ejemplo, el kit comprende al menos dos receptores. El primer recipiente contiene uno o más nanoconjugados como se desvela en el presente documento que comprende uno o más polinucleótidos como se describe en el presente documento que se pueden asociar con una o más porciones de un polinucleótido diana. El segundo recipiente contiene uno o más nanoconjugados que comprenden uno o más polinucleótidos que se pueden asociar con una o más secuencias de la misma porción o una porción diferente del polinucleótido diana.
En otro ejemplo, los kits tienen polinucleótidos y nanopartículas en recipientes separados, y los nanoconjugados se producen antes de uso por un método descrito en el presente documento. En un ejemplo, los polinucleótidos y/o las nanopartículas se funcionalizan de manera que se puedan producir los nanoconjugados. Alternativamente, los polinucleótidos y/o las nanopartículas se pueden proporcionar en el kit sin grupos funcionales, en cuyo caso se deben funcionalizar antes de realizar el ensayo.
En diversos ejemplos de los kits proporcionados, los polinucleótidos incluyen una marca o el kit incluye una marca que se puede fijar a los polinucleótidos. Alternativamente, los kits pueden incluir nanopartículas marcadas o marcas que se pueden fijar a las nanopartículas. En cada ejemplo, el kit incluye opcionalmente instrucciones, cada recipiente contiene una etiqueta, el kit en sí incluye una etiqueta, el kit incluye opcionalmente uno o más no polinucleótidos específicos (para su uso como controles).
EJEMPLOS
Ejemplo 1
Se evaluó la expresión de la proteína 12 de tipo Bcl-2 (Bcl2L12), y el compendio de tirosina cinasas receptoras activadas (RTK) en células madre de tumor cerebral humano (BTSC) y xenoinjertos ortotópicos derivados (Figura 1). En línea con estudios previos en especímenes de tumor primario de GBM [Stegh et al., Genes Dev. 21: 98-111 (2007)], se identificó la robusta expresión de Bcl2L12 en la mayoría de las BTSC probadas y se seleccionó la línea 18 de BTSC (huBTSC_18) con alta expresión de Bcl2L12 para estudios funcionales iniciales (Figura 1A). Además, se estableció que múltiples RTK se activan simultáneamente en células de glioma y en sus explantes ortotópicos correspondientes (Figura 1B). En particular, el perfil de activación de RTK en líneas celulares de glioma in vitro se mantiene en gran medida en el tumor explantado - injertos derivados de BTSC presentan una marca de RTK más distintiva cuando se comparan con los cultivos correspondientes, que sugiere que el microentorno del tumor afecta significativamente el estado de activación intratumoral de RTK de tumores iniciados por BTSC.
Ejemplo 2
Para el desarrollo terapéutico, se generaron nanopartículas de iARN que se dirige a Bcl2L12-oro (NP ARN-Au; nanoconjugados como se describe en el presente documento) y se cribaron para su capacidad para inactivar Bcl2L12 endógeno en líneas celulares de glioma y huBTSC_18. Se identificaron nanoconjugados de Bcl2L12-ARN que fueron capaces de reducir los niveles de ARNm de Bcl2L12 en 40 % (Figura 2A) y la abundancia de proteína Bcl2L12 en 60­ 95 % (Figura 2B) - nanoconjugados de L12-1 -ARN y L12-2-ARN. Posteriormente, se determinó una concentración de nanoconjugado (0,1 nM) para neutralizar robustamente la expresión de proteínas Bcl2L12 en células LN235 (Figura 2B), que se comparó con 100 nM de oligonucleótidos convencionales de ARNip suministrado del lipoplejo (Figura 2C) requeridos para lograr un efecto similar, que indica que los nanoconjugados funcionalizados con iARN son significativamente más eficaces en silenciar la expresión génica que los métodos convencionales. Y, lo que es más importante, se establecieron eficacias de KD similares, altamente robustas, en BTSC y persistencia confirmada de la inactivación de la proteína Bcl2L12 hasta 5 días después del tratamiento con los nanoconjugados (Figura 2D). Finalmente, y como se muestra con el ARNip que se dirige a Bcl2L12 y ARNhp [Stegh et al., Genes Dev. 21: 98-111 (2007)], la inactivación mediada por nanoconjugados de Bcl2L12 produjo una activación potenciada de la caspasa efectora como se demuestra por análisis de transferencia Western para la caspasa-3 y -7 activa (Figura 2E), que confirma la funcionalidad de la inactivación de Bcl2L12 impulsada por los nanoconjugados.
Demostración de la inactivación de una segunda diana: Para demostrar aún más la capacidad de los nanoconjugados de ARN para silenciar eficazmente la expresión génica en células, se seleccionó la aB-cristalina efectora aguas abajo de Bcl2L12 (CRYAB) como segunda diana gliomagénico prototípica. Bcl2L12 induce transcripcionalmente a la aB-cristalina y sirve para promover la migración/invasión de células tumorales e inhibir la activación de caspasa-3 efectora. La Figura 3 muestra la inactivación mediada por nanoconjugados de ARN de aB­ cristalina endógena (Figura 3A; comparación de nanoconjugado de ARN (10 nM) e inactivación mediada por ARNip/lipoplejo (100 nM)), propiedades invasivas reducidas (Figura 3B) y activación potenciada de la caspasa-3 de células de glioma tras la eliminación de aB-cristalina (Figura 3C). Estos estudios demostraron la potente inactivación de dos oncoproteínas de glioma prototípicas con eficacias y efecto sobre la señalización aguas abajo (es decir, activación de caspasa e invasión celular) similar a los ARNhp/ip suministrados retroviralmente/por lipoplejo [Stegh et al., Genes Dev. 21: 98-111 (2007); Stegh et al., Proc Natl Acad Sci U.S.A. 105: 10703-8 (2008)].
Ejemplo 3
Habiendo establecido las amplias actividades proapoptósicas de los nanoconjugados de Bcl2L12-ARN y CRYAB-ARN en cultivo celular, se validó in vivo la funcionalidad de los nanoconjugados de ARN en explante ortotópico y ratones genéticamente manipulados. Estos estudios probaron la regresión tumoral en un modelo de ratón con glioma genéticamente manipulado. Ampliando las propiedades conocidas de captación celular y tisular de estos nanoconjugados, se documentó la penetración de nanoconjugados de ARN en tejidos normales e intracraneales cancerosos y se evaluó su captación en xenoinjertos de BTSC (Figura 4) tras la inyección IC. Después de la inoculación de BTSC y la administración de NP Cy5-Au, se diseccionaron los cerebros, y los cortes coronales se sometieron a microscopía de fluorescencia confocal. La Figura 4A (panel inferior) muestra la robusta dispersión de los nanoconjugados de ARN dentro del explante de tumor ortotópico de BTSC similar a injertos de U87MG y la Figura 4B muestra la cuantificación de la dispersión intracraneal de la señal de fluorescencia. Se verificó la captación de nanoconjugados intracraneales y elementos no tumorales por espectrometría de masas por plasma inductivamente acoplado (ICP-EM; Figura 4C), y también por obtención de imágenes de resonancia magnética (RM) usando un conjugado multimodal de nanopartículas de ADN-oro polivalentes enriquecidas con gadolinio (Gd(III)) (NP ADN-Gd(III)-Au) (Figura 4D).
La acumulación predominante de nanoconjugados de ADN-Gd(III) dentro del xenoinjerto intracraneal de U87MG se demuestra por RM e imágenes correspondientes de hematoxilina y eosina (H&E) (Figura 4D, panel izquierdo). Es importante observar que las células tumorales y los nanoconjugados de ADN-Gd(III) se inyectaron muy próximos al bregma; sin embargo, la formación de tumor y la acumulación (intratumoral) de nanoconjugados de ADN-Gd(III) fueron más destacadas en las estructuras del prosencéfalo. Esto indica que los nanoconjugados migraron a lo largo del eje anteroposterior para enriquecer selectivamente los elementos tumorales. Aprovechando la amplia dispersión intratumoral de los nanoconjugados (véase el panel derecho de la Figura 4D para la reconstrucción 3D de imágenes de RM para evaluar cuantificablemente el espacio intracraneal ocupado por los nanoconjugados de ADN-Gd(III)), los presentes inventores compararon la distribución de nanoconjugados de ARN en el cerebro de ratón usando inyección intracraneal (I.C.) directamente al cerebro con inyección intravenosa (I.V.) sistemática por la vena de la cola. Se encontró una cantidad significativamente más alta de nanoconjugados en el tumor xenoinjertado que en el resto del cerebro, reconfirmando la potenciada acumulación intratumoral de los nanoconjugados (Figura 5).
Finalmente, se probó el impacto de los nanoconjugados de ARN que se dirigen a Bcl2L12 sobre la regresión tumoral en injertos xenogénicos de la línea celular de glioma U87 in vivo usando inyección sistémica. Se encontró que, en paralelo con los resultados in vitro (véase la Figura 2B, panel izquierdo, U87MG), los ratones tratados con nanoconjugado de L12-2 mostraron una duración significativamente prolongada (valor de p = 0,01), explicada por la reducida actividad de la proteína Bcl2L12 (Figura 6). Los nanoconjugados de L12-1 no tuvieron un efecto significativo (valor de p = 0,50) sobre la duración y no fueron eficaces en la inactivación de Bcl2L12 in vitro en la línea celular U87.

Claims (13)

REIVINDICACIONES
1. Una composición para su uso en el tratamiento de un paciente que padece una enfermedad neurodegenerativa y en necesidad de una composición que es capaz de atravesar la barrera hematoencefálica, comprendiendo dicha composición un nanoconjungado funcionalizado que comprende una nanopartícula, comprendiendo el nanoconjugado un polinucleótido unido a la superficie que tiene una secuencia que es 75 % complementaria o más a un polinucleótido diana con el que se hibrida e inhibe la expresión del polinucleótido diana, en donde el nanoconjugado comprende 10 o más polinucleótidos sobre su superficie y tiene una masa de al menos 1 kilodalton.
2. La composición para su uso según la reivindicación 1, en donde la composición comprende además un agente terapéutico.
3. La composición para su uso según la reivindicación 1 o la reivindicación 2, en donde la enfermedad neurodegenerativa es enfermedad priónica, enfermedad de Alzheimer (EA), enfermedad de Parkinson (EP), enfermedad de Huntington (EH), esclerosis múltiple (EM), esclerosis lateral amiotrófica (ELA), mielitis transversa, enfermedad de las neuronas motoras, enfermedad de Pick, esclerosis tuberosa, trastornos de almacenamiento lisosómico, enfermedad de Canavan, síndrome de Rett, ataxias espinocerebelosas, ataxia de Friedreich, atrofia óptica, degeneración retiniana o envejecimiento del SNC.
4. La composición para su uso según una cualquiera de las reivindicaciones 1-3, en donde la composición se administra solo una vez.
5. La composición para su uso según una cualquiera de las reivindicaciones 1-3, en donde la composición se administra a una frecuencia de no más de una vez por semana.
6. La composición para su uso según una cualquiera de las reivindicaciones 1-5, en donde el paciente es un ser humano.
7. La composición para su uso según cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde el agente terapéutico es el factor neurotrófico derivado del cerebro (BDNF), factor de crecimiento nervioso (NGF), neurotrofina-4/5, un factor de crecimiento de fibroblastos (FGF), neurotrofina (NT)-3, eritropoyetina (EPO), factor de crecimiento de hepatocitos (HGF), factor de crecimiento epidérmico (EGF), factor de crecimiento transformante (TGF)-a, TGF-p, factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF), antagonista del receptor de interleucina-1 (IL-1 ra), factor neurotrófico ciliar (CNTF), factor neurotrófico derivado de la glía (GDNF), neurturina, factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF), heregulina, neuregulina, artemina, persefina, una interleucina, factor estimulante de colonias (CSF) de granulocitos, CSF de granulocitos-macrófagos, cardiotrofina-1, hedgehog, factor inhibidor de la leucemia (LIF), midkina, pleiotrofina, una proteína morfogenética ósea (BMP), netrina, saposina, semaforina o factor de células madre (SCF).
8. La composición para su uso según una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde el nanoconjugado tiene una masa que es 2, 3, 5, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 200, 500, 700, 900 o más kilodaltones.
9. La composición para su uso según una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde el nanoconjugado tiene una medición de potencial zeta de desde -10 milivoltios (mV) hasta -50 milivoltios (mV).
10. La composición para su uso según cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde la nanopartícula es metálica.
11. La composición para su uso según la reivindicación 10, en donde la nanopartícula es oro.
12. La composición para su uso según una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde la nanopartícula es desde 5 nm hasta 150 nm de diámetro medio, o desde 30 nanómetros (nm) hasta 100 nm de diámetro medio, o desde 40 nm hasta 80 nm de diámetro medio.
13. La composición para su uso según una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde el nanoconjugado comprende desde 20 hasta 50 polinucleótidos sobre su superficie.
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