CN104023749B - 能穿过血脑屏障的纳米缀合物 - Google Patents

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Abstract

多价纳米缀合物解决治疗用途中的关键性挑战。单实体靶向的治疗剂能够穿过血脑屏障(BBB)并因此可有效治疗中枢神经系统(CNS)病症。此外，尽管纳米缀合物的细胞吸收极其高，但它们在所测试的细胞类型中不显毒性。这种性质对减少脱靶效应的治疗剂递送应用是关键的。

Description

能穿过血脑屏障的纳米缀合物
相关申请的交叉引用
本申请根据美国法典第35篇第119条(e)款要求2011年9月14日提交的美国临时申请No.61/534,853的优先权权益，该临时申请的公开内容在此通过引用整体并入本文。
政府利益声明
本发明是在由美国国家卫生研究院/国家癌症研究院颁发的第U54CA151880号拨款下借助政府资助进行的。政府对本发明具有一定的权利。
技术领域
本公开涉及穿过血脑屏障的纳米缀合物及其治疗用途的方法。
背景技术
在仅允许选择进入分子中脑是独特的。尽管这是有用的保护机制，它还防止潜在地有益分子试剂进入中枢神经系统(CNS)，这样在许多神经病症或其它CNS病状中分子试剂不能发挥治疗作用。
血脑屏障(BBB)通过紧密控制进入脑而执行神经保护功能，因此它还阻碍药理学试剂进入大脑组织，其传输有必要使用载体。血脑屏障(BBB)通透性经常是药物或肽渗透进入CNS的比率限制因素[Pardridge,Neurovirol.5:556-569(1999)；Bickel等，Adv.DrugDeliv.Rev.46:247-279(2001)]。通过BBB将脑屏蔽在潜在毒性物质之外，其由通过紧密连接而严密密封的脑毛细血管内皮细胞形成。另外，相比于其它器官的毛细血管，脑毛细血管具有很少的窗孔(fenestrae)和很少的内吞囊泡[Pardridge,Neurovirol.5:556-569(1999)]。几乎没有大的、亲水分子传输穿过BBB，除了一些特定蛋白，诸如转铁蛋白、乳铁蛋白和低密度脂蛋白，它们被受体介导的细胞转运(RMT)占据[Pardridge,Neurovirol.5:556-569(1999)；Tsuji等，Adv.Drug Deliv.Rev.36:277-290(1999)；Kusuhara等，DrugDiscov.Today6:150-156(2001)；Dehouck等，J.Cell.Biol.138:877-889(1997)；和Fillebeen等，J.Biol.Chem.274:7011-7017(1999)]。
恶性神经胶质瘤(MG)表示中枢神经系统最普遍和致死的原发性癌症。尽管进行手术切除和积极的治疗方案，被诊断为最高等级的MG即IV级多形性成胶质细胞瘤(GBM)的患者在诊断后仅能存活9-12个月。使用辐射与联合化疗(替莫唑胺(TMZ))的多峰的方法仅导致患者存活的边际增加高达14.6个月。此外，复发几乎是普遍的并且对此类过程抢救治疗保持无效。GBM保持为高度神秘和不可治愈的疾病，特别是由于对治疗有高度抗性的癌干细胞群(脑肿瘤干细胞，BTSC)和对分类的遗传畸变如何表示疾病的表型标志的不完全理解。它甚至对强度治疗(凋亡)有高度抗性，尽管红色乳头状瘤内神经形成。用靶向受体酪氨酸激酶抑制剂治疗高级神经胶质瘤的持续缺乏成功，其已被证明在其它恶性肿瘤中有效，已经促进对神经胶质瘤药物开发的所有方面的重新评价并强调首先需要开发创新技术平台和改进基于细胞培养物和体内模型系统以对抗疾病。
发明内容
多价纳米缀合物在多个水平上解决上述关键挑战。单实体、靶向治疗能穿过血脑屏障(BBB)并因此可有效地治疗中枢神经系统(CNS)病症。此外、尽管纳米缀合物的极高细胞摄取，它们在迄今测试的细胞类型中未呈现毒性(见表1，下文)。这个性质对于降低脱靶向作用的治疗剂的递送应用是关键的。
表1
尽管在表1中所示的一些细胞类型是脑/神经系统的细胞，但数据从体外实验收集。
一方面，本公开提供了一种包含纳米缀合物的组合物，该纳米缀合物包含与靶多核苷酸足够互补的编码在中枢神经系统(CNS)病症中特异表达的多肽的多核苷酸，该纳米缀合物能够穿过血脑屏障(BBB)。在一些实施方案中，该组合物进一步包含靶向部分。在各种实施方案中，所述病症由异常基因表达而引起。在一些实施方案中，所述组合物进一步包含一种治疗剂，并且在其它实施方案中，所述治疗剂是替莫唑胺。在一些实施方案中，纳米缀合物进一步包含靶向部分和/或治疗剂。
在进一步的实施方案中，预期所述病症是急性和/或慢性的。
在一些实施方案中，急性病症选自灶性脑局部缺血、全脑局部缺血、脑损伤、脊髓损伤、急性感染、癫痫持续状态、偏头痛、急性精神病、自杀性抑郁和急性焦虑/恐怖症和损伤相关的疾病，包括但不限于创伤性脑损伤和肿胀。在进一步的实施方案中，慢性病症选自慢性神经变性、视网膜变性、抑郁症、慢性情感障碍、溶酶体贮积失调、脑慢性感染、脑癌、中风康复、先天性代谢缺陷、孤独症和精神发育迟缓。
在进一步的实施方案中，纳米缀合物的质量至少为约400、约600、约800、约1000、约1200或更大道尔顿。在一些实施方案中，纳米缀合物的质量至少为约1、约2、约3、约5、约10、约20、约30、约40、约50、约60、约70、约80、约90、约100、约200、约500、约700、约900或更大千道尔顿。
在一些实施方案中，本公开的纳米缀合物具有ζ电位(表面电荷)测量值为约-10毫伏(mV)至约-50毫伏(mV)。在进一步的实施方案中，纳米缀合物具有ζ电位测量值为约-10mV至约-40mV、或约-10mV至约-30mV、或约-20mV至约-50mV、或约-20mV至约-40mV、或约-30mV至约-45mV、或约-30mV至约-50mV。在一些实施方案中，纳米缀合物具有ζ电位测量值为约-10mV、约-15mV、约-20mV、约-25mV、约-30mV、约-35mV、约-40mV、约-45mV、约-50mV或约-60mV。
一方面，本公开提供了治疗需要能穿过血脑屏障的组合物的患者的方法，其包括给所述患者施用治疗有效量的包含官能化纳米缀合物的组合物，该纳米缀合物包含具有与杂交的靶多核苷酸足够互补并抑制靶多核苷酸表达的序列的多核苷酸。在本公开的实施方案的任何方面，预期该患者是人。
另一方面，本公开提供给患者施用包含官能化纳米缀合物的组合物的方法，所述方法包括给所述患者施用治疗有效量的组合物；其中所述纳米缀合物包含具有与杂交的靶多核苷酸足够互补并抑制靶多核苷酸表达的序列的多核苷酸，所述组合物能穿过血脑屏障，并且其中所述患者需要能穿过血脑屏障的组合物。
在本公开的实施方案的任何方面，如本文所述的组合物进一步包含治疗剂。在本公开的实施方案的任何方面，所述患者患有中枢神经系统(CNS)病症。在本公开的实施方案的任何方面，所述患者患有由异常基因表达引起的疾病。
在一些实施方案中，所述患者患有急性和/或慢性病症。在患者患有急性病症的实施方案中，进一步预期急性病症选自灶性脑局部缺血、全脑局部缺血、脑损伤、脊髓损伤、急性感染、癫痫持续状态(SE)、偏头痛、急性精神病、自杀性抑郁和急性焦虑/恐怖症和损伤相关的疾病，包括但不限于创伤性脑损伤和肿胀。
在患者患有慢性病症的实施方案中，进一步预期慢性病症选自慢性神经变性、视网膜变性、抑郁症、慢性情感障碍、溶酶体贮积失调、脑慢性感染、脑癌、中风康复、先天性代谢缺陷、孤独症和精神发育迟缓。
在一些实施方案中，本公开的组合物仅施用一次。在一些实施方案中，本公开的组合物的施用频率不大于约每周一次。
另一方面，本公开提供了包装或试剂盒，其包括(a)一种纳米缀合物或包含纳米缀合物的组合物，任选地在容器中，(b)任选地其它治疗剂；和(c)包装插入物、包装标签、说明书或其它引导或公开本文公开的任何方法或实施方案的标记。
附图描述
图1描述了在选择的神经胶质瘤、BTSC系和外植体中的Bcl2L12表达(A)和RTK活化曲线(B)。
图2显示了RNA纳米缀合物有效地使Bcl2L12表达沉默。(A和B)神经胶质瘤细胞系和huBTSC_18用所示量的RNA纳米缀合物处理(对照(Co)/乱序-RNA序列-RNA-Au NPs-Co-RNA-纳米缀合物和Bcl2L12靶向RNA-纳米缀合物—L12-1-和L12-2-RNA-纳米缀合物)并进行qRT-PCR(A)和蛋白质印迹(B)分析。示出了Bcl2L12和Hsp70的移动位置。*标记的条带表示翻译后修饰的Bc12L12。(C)敲除效果与传统脂质体复合物(lipoplex)-递送siRNA比较。(D)为研究敲除持久性，LN235细胞用L12-RNA-纳米缀合物(1nM)处理5天，并进行抗Bcl2L12蛋白质印迹分析。(E)RNA-纳米缀合物介导的Bcl2L12的敲除导致半胱天冬酶活化增强。Co-、L12-1-和L12-2-纳米缀合物处理的LN235细胞用星形孢菌素(STS,500nM)处理所示时间、溶解并进行活性半胱天冬酶3和7的蛋白质印迹分析。示出了活性亚单位(大，LS；大和大+N肽，LS+N)和Hsp70(上样对照)的迁移位置。如通过对相应蛋白质印迹的密度计分析评估，用直方图定量Bcl2L12的表达。
图3显示aB-晶体蛋白在LN235细胞中的中和导致侵入潜力降低和对STS-启动的凋亡的敏感性增加。(A)LN235细胞用aB-晶体蛋白-靶向的纳米缀合物或siRNA处理、溶解并使用aB-晶体蛋白和Hsp70-特异性抗体进行蛋白质印迹分析。(B)CRYAB-和Co-RNA-纳米缀合物处理的细胞进行基质胶(Matrigel)侵入试验并且侵入细胞的数目通过台盼蓝染色进行定量。(C)Co-CRYAB-1-和CRYAB-2-RNA-纳米缀合物处理的LN235细胞如图2E所述进行处理和分析。LS，大亚基；LS+N，大亚基+N肽。如通过对相应蛋白质印迹的密度计分析评估，用直方图定量Bcl2L12的表达。
图4显示肿瘤内摄取纳米缀合物如通过对Cy5-标记的Au-NP(A)的共聚焦免疫荧光评估，通过对在正常脑和外植体结构中局部递送的DNA-Gd(III)-纳米缀合物的ICP-MS(C)和MRI(D)。(B)显示分散随时间的定量，参见使用连续冠状切片的共聚焦IF图像。
图5表示肿瘤内摄取纳米缀合物—颅内对静脉内施用，如通过ICP-MS(A)直接颅内(LC.)递送Co-RNA-纳米缀合物(5μl,300nM)来评价。纳米缀合物局部递送一次，然后施用后48小时收获脑和肿瘤组织。(B)系统性静脉内(I.V.)注射Co-RNA-纳米缀合物(100μl,300nM)。每48小时对纳米缀合物进行四次注射。在第四次注射后24小时收获组织。
图6显示了RNA-纳米缀合物对肿瘤小鼠存活的作用。Co-、L12-1-和L12-2-RNA-纳米缀合物通过尾静脉注射(I.V.)施用于小鼠。每只小鼠接受5次注射(每次注射1.4mg/kgRNA总共7mg/kg处理，大约150-200μl的500nM的RNA-纳米缀合物)。在Co-和L12-1-RNA纳米缀合物治疗组之间未见到存活天数的差异(p＝0.50)。然而，在Co-和L12-2-RNA纳米缀合物治疗组之间观察到显著的差异(p＝0.01)。
具体实施方式
在许多外周施用的试剂向中枢神经系统的递送中血脑屏障是限制因素。本公开提供能穿过BBB并且一旦穿过BBB保留其活性的纳米缀合物。通过提供具有一种或多种与之相连的生物分子的纳米缀合物，本发明的各方面解决这些因素。在一些实施方案中，纳米缀合物进一步关联治疗剂或与治疗剂共同施用。
如本文所用，“治疗”或“治疗”包括取得治疗益处和/或预防益处。治疗益处意指消除或改善潜在的病症或正在治疗的病状。例如，在患有神经病症的个体中，治疗益处包括部分或完全阻止病症的发展，或部分或完全逆转病症。而且，实现治疗益处可通过消除或改善与潜在症状相关的一个或多个生理或心理症状以致在患者中观察到改善，尽管事实上患者可能仍受到病状的影响。治疗的预防益处包括预防病状、延缓病状发展(例如，减缓神经病学病症的进程)，或减少病状发生的可能性。如本文所用，“治疗”或“治疗”包括预防。
在一些实施方案中，纳米缀合物是“外周施用”或“外周施用的”。如本文所用，这些术语是指向个体以任何形式施用纳米缀合物、任选地与治疗剂共同施用，其不直接施用于CNS，即，使试剂接触血脑屏障的非脑侧。如本文所用，“外周施用”包括静脉内、皮下、肌内、腹膜内、透皮、吸入、舌下、鼻内、直肠和口服施用。
如本文所用，“杂交”意指根据沃森-克里克(Watson-Crick)DNA互补性、Hoogstein结合或其它本领域已知的序列特异性结合规则，使核酸的两条或三条链之间通过氢键相互作用。杂交可在本领域已知的不同严格条件下进行。如本文所用，“特异性杂交”是在互补或基本上互补的多核苷酸链之间允许形成稳定双链体的杂交。例如，具有21个核苷酸单位的多核苷酸链可以与另一种21个核苷酸单位的多核苷酸碱基配对，但每条链上仅有19个碱基互补或足够互补，以致“双链体”具有19个碱基对。剩余的碱基可以，例如，5’和/或3’突出端存在。此外，在双链体内，100％互补是不需要的；在双链体内基本互补是允许的。足够的互补性是指75％或更高的互补性。例如，由19个碱基对组成的双链体中的错配导致94.7％的互补性，使该双链体足够互补。
如本文所用，术语“治疗有效量”是指足以治疗、改善或预防鉴定的疾病或病状，或表现出可检测的治疗、预防或抑制作用的化合物的用量。该作用可通过，例如，临床病状的改善或症状的减少被检测。对受试者的精确的有效量取决于受试者的体重、大小和健康状态；病状的性质和程度；和施用选择的治疗的治疗剂或组合。当药物已被美国食品与药品管理局(FDA)批准，“治疗有效量”是指被FDA或其相应的用于治疗鉴定的疾病或病状的外国机构批准的剂量。
如本文所用，“需要能穿过血脑屏障的组合物”的患者是将从能穿过血脑屏障的组合物获得益处的患者。患者可能患有任何疾病或病状，其中具有能穿过血脑屏障的组合物的治疗可用于缓解症状。
如本文中使用的那些术语，“CNS的病症”或“CNS病症”涵盖影响脑和脊髓并导致次最优的功能的任何病状。在一些实施方案中，所述病症是急性病症。CNS的急性病症包括灶性脑局部缺血、全脑局部缺血、脑损伤、脊髓损伤、急性感染、癫痫持续状态(SE)、偏头痛、急性精神病、自杀性抑郁和急性焦虑/恐怖症。在一些实施方案中，所述病症是慢性病症。CNS的慢性病症包括慢性神经变性、视网膜变性、抑郁症、慢性情感障碍、溶酶体贮积失调、脑慢性感染、脑癌、中风康复、先天性代谢缺陷、孤独症和精神发育迟缓。慢性神经变性包括神经变性疾病诸如朊病毒疾病、阿尔茨海默病(AD)、帕金森病(PD)、亨廷顿舞蹈病(HD)、多发性硬化(MS)、肌萎缩性侧索硬化(ALS)、横贯性脊髓炎、运动神经元病、皮克病(Pick'sdisease)、结节性硬化症、溶酶体贮积失调、卡纳万氏病(Canavan's disease)、雷特综合征(Rett's syndrome)、脊髓小脑性共济失调、弗里德赖希共济失调(Friedreich's ataxia)、视萎缩、和视网膜变性、和CNS的老化。
如本文所用，“伴随使用”应理解为与同时施用或共同施用是可互换的。因此，术语被理解为涵盖同时或在不同的时间施用，并且通过相同途径或通过不同途径，只要两种试剂以允许试剂同时影响身体的方式给出。例如，伴随使用可以指药物伴随施用，是否是由相同或不同的从业者开处方，或用于相同或不同的适应症。
在此应指出，如本说明书和所附权利要求中所用，除非上下文中另外明确指示，否则单数形式“一种/一个(a)”、“一种/一个(an)”和“该(the)”包括复数指示物。
还应指出，如本文所用，术语“约”被理解为意指大约。
还应进一步指出，术语“连接”、“缀合”和“官能化”在本文中可互换使用，并且是指多核苷酸、肽、多肽、治疗剂、造影剂和其组合与纳米缀合物的关联。
血脑屏障(BBB)
如本文所用，“血脑屏障”(BBB)是指在外周循环和脑和脊髓之间的屏障，它在脑毛细血管内皮质膜内通过紧密连接而形成，它生成了高度选择性的限制分子转运到脑的屏障。脑中的血脑屏障、脊髓中的血脊髓屏障和视网膜中的血视网膜屏障是中枢神经系统(CNS)内连续的毛细血管屏障，并且共同称为血脑屏障或BBB。
在灌注所述脊椎动物脑毛细血管的内皮内，BBB由上皮样高抵抗性紧密连接而形成。除非治疗分子是分子量为400-600道尔顿或更小的脂溶性的，脑渗透是受限制的[Pardridge,Curr Opin Pharmacol6:494–500(2006)]。由于BBB的存在，循环分子进入脑细胞仅通过两种方法之一：(i)通过BBB通过自由扩散的小分子的脂质介导的转运，或(ii)催化的转运。后者包括低分子量营养物和水溶性维生素的载体介导的转运过程或者循环肽(例如胰岛素)、血浆蛋白(例如转铁蛋白)或病毒的受体介导的转运。尽管BBB通透性本身受毛细血管内皮细胞的质膜的生物化学性质的控制，总脑微脉管生物学是毛细血管内皮和其它两种主要细胞之间的旁分泌相互作用的函数，其包含脑部微循环，即与内皮细胞共享基底膜的毛细血管周皮细胞，和星形胶质细胞足突，其投入99％的脑中毛细血管基底膜的远离管腔(abluminal)的表面。通常归因于毛细血管内皮的微血管功能实际上通过毛细血管周皮细胞或毛细血管星形胶质细胞足突来执行[Pardridge,J.Neurovir.5:556-569(1999)]。
通过调节血液和CSF和脑间质流体之间的物质的运动，BBB很大程度上限定了CNS的操作环境。该BBB在脉络丛中通常被分为血管或内皮、屏障和上皮屏障(也称为血液-CSF屏障)。包含毛细血管和使小动脉和小静脉成线的内皮细胞构成脊髓和脑中的大部分区域的屏障功能[Rapoport,Blood Brain Barrier in Physiology and Medicine,RavenPress,New York.(1976)]。内皮细胞是修饰的，因为CNS的连续的非网状内皮细胞之间的紧密连接的圆周带阻止了在外周组织的毛细血管床中发现的泄漏。与脑内皮的那些比较的细胞内紧密连接存在于在脉络丛的连续的上皮细胞之间[Johanson,The choroid plexus-arachnoid membrane-cerebrospinal fluid system.在：NeuronalMicroenvironment.Boulton AA,Baker GB,Walz W(编辑)。The Humana Press:Clifton,New Jersey,第33–104页(1988)]和蛛网膜细胞之间[Balin等，J Comp Neurol251:260-280(1986)]。脑内皮也具有其它修饰。它们参与血液-携带的大分子的内吞作用和回收腔质膜，但程度小于外周内皮和脉络丛[Broadwell等，Cell biological perspective for thetranscytosis of peptides and proteins through the mammalian blood-brain fluidbarriers.在：The Blood-Brain Barrier.Pardridge WM(编)。Raven Press Ltd:NewYork，第165-199页(1993)]。次级溶酶体水解在BBB内皮内进行内吞作用的许多但非所有大分子[Broadwell等，Proc Natl.Acad Sci.USA78:7820-7824(1981)；Broadwell等，Cellbiological perspective for the transcytosis of peptides and proteins throughthe mammalian blood-brain fluid barriers.在：The Blood-Brain Barrier.PardridgeWM(编)。Raven Press Ltd:New York，第165-199页(1993)]。内皮的这些修饰有效地消除在外周组织中作为毛细血管床的特征的血浆超滤液并用于限定BBB的限制性渗透[Banks,J.Neurovir.5:538-555(1999)]。
因此，最潜在地治疗性、诊断性或研究分子不会以药理学活性的量穿过BBB。为了绕过BBB，使用侵入性经颅药物递送策略，诸如脑内室性(ICV)输注、脑内(IC)施用和对流增强扩散(CED)。经颅药物递送至脑是昂贵的、侵入性的和很大程度上是无效的。ICV途径通常仅将药物递送至脑室管膜表面，不进入脑实质。由于脑内药物扩散的低效率，神经营养蛋白，诸如神经生长因子(NGF)的IC施用仅将药物递送至局部注射部位。神经营养蛋白的CED导致优先流体流过脑白质束，这导致脱髓鞘和星形细胞胶质化。
本公开提供了这些高侵入性的和通常并不令人满意的绕过BBB的方法的替代选择，允许纳米缀合物从外周血穿过BBB。它是基于使用能将所需物质从外周血运输至CNS中的纳米缀合物。鉴于具有质量为400-600道尔顿或更高的治疗剂的脑渗透是受限制的，并且进一步地DNA的单个碱基的质量大约320道尔顿，出人意料的是本文所示的数据表明用大量多核苷酸官能化的纳米缀合物，每个包含大量碱基，能以任何明显的量穿过BBB。
一方面，本公开提供利用能穿过BBB的纳米缀合物的组合物和方法。该组合物和方法可用于将纳米缀合物以及任选地治疗剂从外周血并穿过血脑屏障运输进入CNS。
纳米缀合物
本公开的组合物包括纳米缀合物。在某些方面，纳米缀合物包含中空的纳米粒子。在各种实施方案中，纳米缀合物进一步包含生物分子。如本文所用，“生物分子”被理解为包括多核苷酸、肽、多肽、小分子、治疗剂、造影剂和其组合。在纳米缀合物的各方面，所有生物分子是相同的，或作为选择，至少两种生物分子是不同的。
本公开的纳米缀合物不是基于聚合物的纳米缀合物。因此，纳米缀合物包含，例如，聚乙二醇(PEG)涂覆的十六烷基氰基丙烯酸酯纳米球；聚(氰基丙烯酸丁酯)纳米颗粒；用聚山梨醇酯80涂覆的聚(氰基丙烯酸丁酯)纳米颗粒；脂质纳米颗粒；由装载例如氧化铁的固化油纳米液滴的乳剂组成的脂质纳米颗粒；或由交叉连接的PEG和聚乙烯亚胺组成的纳米凝胶不是本公开的各方面或实施方案预期的。
在各种实施方案中，本公开提供了具有质量至少为约400、约600、约800、约1000、约1200或更大道尔顿的纳米缀合物。在进一步的实施方案中，纳米缀合物具有质量至少为约1、约2、约3、约5、约10、约20、约30、约40、约50、约60、约70、约80、约90、约100、约200、约500、约700、约900或更大的千道尔顿。如本文所用，纳米缀合物的质量应被理解为包括纳米颗粒(如果存在)的质量加上任何生物分子和/或与纳米颗粒相关联的治疗剂的质量。
纳米颗粒
提供了官能化的纳米颗粒，在某些方面，其具有连接到其上的生物分子。纳米颗粒的尺寸、形状和化学组合物有助于形成所得官能化纳米颗粒的性质。这些性质包括例如，光学性质、光电子性质、电化学性质、电子性质、在各种溶液中的稳定性、磁性质和孔和通道尺寸变化。还预期具有不同尺寸、形状和/或化学组合物的纳米颗粒的混合物，以及具有均匀尺寸、形状和化学组合物的纳米颗粒的用途，和因此这些性质的混合物。合适的颗粒的实例包括但不限于，聚集颗粒、各向同性(诸如球形颗粒)、各向异性颗粒(诸如非球形杆、四面体和/或棱柱)和核壳颗粒，诸如在美国专利No.7,238,472和国际公开No.WO2003/08539中描述的那些，其公开内容通过引用整体并入。
在一个实施方案中，纳米颗粒是金属的，并且在不同的方面，纳米颗粒是胶体金属。因此，在各种实施方案中，本发明的纳米颗粒包括金属(包括例如但不限于，银、金、铂、铝、钯、铜、钴、铟、镍或适于纳米颗粒形成的任何其它金属)、半导体(包括例如但不限于，CdSe、CdS和用ZnS涂覆的CdS或CdSe)和磁性(例如铁磁体)胶体材料。
另外，如美国专利公开No2003/0147966所述，本发明的纳米颗粒包括那些可商购的，以及可被合成的那些，例如，从溶液中的进行性核中产生(例如，通过胶体反应)或通过各种物理和化学气相沉积工艺，诸如溅射沉积。参见，例如，HaVashi,Vac.Sci.Technol.A5(4):1375-84(1987)；Hayashi,Physics Today,44-60(1987)；MRS Bulletin,January1990,16-47。如在美国专利公开No2003/0147966中进一步所述，使用本领域已知的方法，使用HAuCl4和柠檬酸盐还原剂交替地生产预期的纳米颗粒。参见，例如，Marinakos等，Adv.Mater.11:34-37(1999)；Marinakos等，Chem.Mater.10:1214-19(1998)；Enustun&Turkevich,J.Am.Chem.Soc.85:3317(1963)。
纳米颗粒的尺寸范围可为平均直径约1nm至约250nm、平均直径约1nm至约240nm、平均直径约1nm至约230nm、平均直径约1nm至约220nm、平均直径约1nm至约210nm、平均直径约1nm至约200nm、平均直径约1nm至约190nm、平均直径约1nm至约180nm、平均直径约1nm至约170nm、平均直径约1nm至约160nm、平均直径约1nm至约150nm、平均直径约1nm至约140nm、平均直径约1nm至约130nm、平均直径约1nm至约120nm、平均直径约1nm至约110nm、平均直径约1nm至约100nm、平均直径约1nm至约90nm、平均直径约1nm至约80nm、平均直径约1nm至约70nm、平均直径约1nm至约60nm、平均直径约1nm至约50nm、平均直径约1nm至约40nm、平均直径约1nm至约30nm、或平均直径约1nm至约20nm、平均直径约1nm至约10nm。在其它方面，纳米颗粒的尺寸为约5nm至约150nm(平均直径)、约5至约50nm、约10至约30nm、约10至150nm、约10至约100nm、或约10至约50nm。纳米颗粒的尺寸为约5nm至约150nm(平均直径)、约30至约100nm、约40至约80nm。方法中使用的纳米颗粒的尺寸按需要根据其特殊用途或应用而变化。尺寸的变化有利地用于优化纳米颗粒的某些物理特征，例如，如本文所述的光学性质或能被官能化的表面积的数量。
较大直径的纳米颗粒，在一些方面，预期用更多数量的生物分子官能化[Hurst等，Analytical Chemistry78(24):8313-8318(2006)]在纳米缀合物生产期间。在一些方面，因此，用于生产纳米缀合物的生物分子的数量为约10至约25,000个生物分子/纳米缀合物。在进一步的方面，用于生产纳米缀合物的生物分子的数量为约50至约10,000个生物分子/纳米缀合物、或约200至约5,000个生物分子/纳米缀合物、或约50至约100个生物分子/纳米缀合物、或约20至约100个生物分子/纳米缀合物、或约20至约50个生物分子/纳米缀合物。因此，在各种实施方案中，用于生产纳米缀合物的生物分子的数量为约10、约15、约20、约25、约30、约35、约40、约45、约50、约55、约60、约65、约70、约75、约80、约85、约90、约95、约100、约150、约200、约250、约300、约350、约400、约500、约600、约700、约800、约900、约1,000、约2,000、约5000、约10,000、约15,000、约20,000、约25,000或更多/纳米缀合物。
中空纳米缀合物
如本文所述，在各种方面由本公开提供的纳米缀合物是中空的。中空纳米缀合物的孔隙度和/或刚性部分取决于在纳米缀合物生产期间交联在纳米颗粒表面上的生物分子的密度。通常，交联在纳米颗粒表面上的生物分子的更低密度导致更多孔隙的纳米缀合物，交联在纳米颗粒表面上的生物分子的更高密度导致更坚硬的纳米缀合物。中空纳米缀合物的孔隙度和密度也取决于生物分子之间交联的程度和类型。
制备中空纳米缀合物的方法是本领域已知的，并且通常描述于国际专利申请号PCT/US2010/055018和Zhang等，[J Am Chem Soc.132(43):15151–15153(2010)]，其各自通过引用整体并入本文。
在一些实施方案中，中空纳米缀合物通过聚炔烃化学制备[Zhang等，J Am ChemSoc.132(43):15151–15153(2010)]。其它交联策略，诸如通过使用同双功能交联剂(例如，硫代-EGS)或其它反应性基团(例如但不限于，胺、酰胺、醇、酯、醛、酮、巯基、二硫化物、羧酸、酚、咪唑、肼、腙、叠氮化物和炔烃)也被预期。
制备中空纳米缀合物的其它方法，称为表面辅助交联(SAC)，包括修饰的核酸分子的混合单层和装配在纳米颗粒的表面并交联在一起的反应性巯基化分子。如本文所用，“单层”意指生物分子的单层交联到纳米缀合物的表面上。如本文所用，生物分子包括但不限于，多核苷酸、肽、多肽、小分子、治疗剂、造影剂和其组合。
引起目标生物分子交联的化学物质是本领域技术人员已知的，包括但不限于：双琥珀酰亚胺戊二酸酯、双琥珀酰亚胺辛二酸酯、双[硫代琥珀酰亚胺]辛二酸酯、三-琥珀酰亚胺氨基三醋酸酯、琥珀酰亚胺基4-肼基烟酸酯丙酮腙、琥珀酰亚胺4-肼酰基对苯二甲酸酯盐酸盐、琥珀酰亚胺4-甲酰基苯甲酸酯、二硫双[琥珀酰亚胺丙酸酯]、3,3′-二硫双[琥珀酰亚胺丙酸酯]、二琥珀酰亚胺酒石酸酯、双[2-(琥珀酰亚胺基氧基羰基氧基)乙基]砜、乙二醇双[琥珀酰亚胺琥珀酸酯]、乙二醇双[硫代琥珀酰亚胺琥珀酸酯]、二亚胺代己二酸二甲酯·2HCl、庚二亚氨酸二甲酯·2HCl、辛二亚胺酸二甲酯·2HCl、1,5-二氟-2,4-二硝基苯、β-[三(羟甲基)膦基]丙酸、双-马来酰亚胺基乙烷(Bis-Maleimidoethane)、1,4-双马来酰亚胺基丁烷(1,4-bismaleimidobutane)、双马来酰亚胺基己烷(Bismaleimidohexane)、三[2-马来酰亚胺乙基]胺、1,8-双-马来酰亚胺-二甘醇、1,11-双-马来酰亚胺-三甘醇、1,4双马来酰亚胺基-2,3-二羟基丁烷、二硫-双马来酰亚胺基乙烷、1,4-二-[3′-(2′-吡啶基二硫)-丙酰胺基]丁烷、1,6-己烷-二乙烯砜、双-[b-(4-叠氮基水杨酰氨基)乙基]二硫化物、N-(a-马来酰亚胺乙酸氧基)琥珀酰亚胺酯、N-[β-马来酰亚胺丙基氧基]琥珀酰亚胺酯、N-[g-马来酰亚胺丁酰氧基]琥珀酰亚胺酯、N-[g-马来酰亚胺丁酰氧基]硫代琥珀酰亚胺酯、间马来酰亚胺苯甲酰基-N-羟基琥珀酰亚胺酯、间马来酸亚胺苯甲酸基-N-琥珀酰亚胺酯、琥珀酰亚胺4-[N-马来酰亚胺基甲基]环己烷-1-羧酸酯、硫代琥珀酰亚胺4-[N-马来酰亚胺基甲基]环己烷-1-羧酸酯、N-e-马来酰亚胺己酰氧基]琥珀酰亚胺酯、N-e-马来酰亚胺己酰氧基]硫代琥珀酰亚胺酯、琥珀酰亚胺基4-[对-马来酰亚胺苯基氨基]丁酸酯、硫代琥珀酰亚胺4-[对-马来酰亚胺苯基)丁酸酯、琥珀酰亚胺-6-[β-马来酰亚胺丙酸氨基]己酸酯、琥珀酰亚胺-4-[N-马来酰亚胺甲基]环己烷-1-羧基-[6-酰氨基己酸酯]、N-[k-马来酰亚胺十一酸氧基硫代琥拍酰亚胺酯]、N-琥珀酰亚胺-3-(2-吡啶基二硫基)-丙酸酯、琥珀酰亚胺6-(3-[2-吡啶基联硫基]-丙酰氨基)己酸酯、4-琥珀酰亚胺基氧基羰基-甲基-a-[2-吡啶基联硫基]甲苯、4-硫代琥珀酰亚胺-6甲基-a-(2-吡啶基二硫基)甲苯酰胺]己酸酯)、N-琥珀酰亚胺碘乙酸酯、琥珀酰亚胺3-[溴乙酰氨基]丙酸酯、N-琥珀酰亚胺[4-碘乙酰基]氨基苯甲酸酯、N-硫代琥珀酰亚胺[4-碘乙酰基]氨基苯甲酸酯、N-羟基琥珀酰亚胺-4-重氮水杨酸、N-5-叠氮基-2-硝基苯甲酰氧基琥珀酰亚胺、N-羟基硫代琥珀酰亚胺-4-叠氮基苯甲酸酯、硫代琥珀酰亚胺[4-叠氮基水杨酰氨基]-己酸酯、N-琥珀酰亚胺-6-(4'-叠氮基-2'-硝基苯基氨基)己酸酯、N-硫代琥珀酰亚胺-6-(4'-叠氮基-2'-硝基苯基氨基)己酸酯、硫代琥珀酰亚胺-(全氟叠氮基苯甲酰胺基)-乙基-1,3'-二硫丙酸酯、硫代琥珀酰亚胺-2-(间-叠氮基-邻-硝基苯甲酰氨基)-乙基-1,3'-丙酸酯、硫代琥珀酰亚胺基2-[7-氨基-4甲基香豆素-3-乙酰氨基]乙基-1,3′二硫丙酸酯、琥珀酰亚胺4,4'-叠氮戊酸酯、琥珀酰亚胺6-(4,4'-叠氮戊烷氨基)己酸酯、琥珀酰亚胺基2-([4,4'-叠氮戊烷氨基]乙基)-1,3'-二硫丙酸酯、硫代琥珀酰亚胺4,4'-叠氮戊酸酯、硫代琥珀酰亚胺基6-(4,4'-叠氮戊烷氨基)己酸酯、硫代琥珀酰亚胺2-([4,4'-叠氮戊烷氨基]乙基)-1,3'-二硫丙酸酯、二环己基碳二亚胺、1-乙基-3-[3-二甲基氨基丙基]碳二亚胺盐酸盐、N-[4-(对-叠氮基水杨基氨基)丁基]-3′-(2′-吡啶二硫基)丙酰胺、N-[β-马来酰亚胺基丙酸]酰肼、三氟乙酸盐、[N-e-马来酰亚胺基己酸]酰肼、三氟乙酸盐、4-(4-N-马来酰亚胺基苯基)丁酸酰肼盐酸盐、N-[k-马来酰亚胺基十一烷酸]酰肼、3-(2-吡啶二硫基)丙酰肼、对-叠氮基苯甲酰酰肼、N-[对-马来酰亚胺基苯基]异氰酸酯和琥珀酰亚胺-[4-(补骨脂素-8-基氧基)]-丁酸酯。
生物分子
如本文所述，生物分子包括但不限于多核苷酸、肽、多肽、小分子、治疗剂、造影剂和其组合。在本公开的各方面，如本文所述的生物分子与纳米颗粒共价连接。
多核苷酸
本公开预期的多核苷酸包括DNA、RNA、其修饰形式和其组合，如本文所定义。因此，在一些方面，纳米缀合物包含DNA。在一些实施方案中，DNA是双链的，在进一步的实施方案中，DNA是单链的。在进一步的方面，纳米缀合物包含RNA，并且在又进一步的方面，纳米缀合物包含双链RNA，并且在特定的实施方案中，双链RNA试剂是小干扰RNA(siRNA)。术语“RNA”包括两条分离的链的双链体，以及单链结构。单链RNA也包括RNA的二级结构。一方面，具有发夹环的RNA是被预期的。
当纳米缀合物包含多个结构多核苷酸，所述多核苷酸，在一些方面，包含与多核苷酸的靶向序列足够互补的序列，以致作为纳米缀合物的一部分的多核苷酸与靶多核苷酸的杂交发生。在各方面，多核苷酸是单链或双链的，只要该双链分子还包括与靶多核苷酸的单链序列杂交的单链序列。在一些方面，作为纳米缀合物的一部分的多核苷酸与双链靶多核苷酸的杂交能形成三链体结构。另一方面，通过使作为纳米缀合物的一部分的双链多核苷酸与单链靶多核苷酸杂交能形成三链体结构。三链体多核苷酸复合物的进一步描述参见PCT/US2006/40124，其通过引用整体并入本文。
在一些方面，多核苷酸包含如本文所述的间隔基。间隔基，一方面，包含促进一个多核苷酸与另一个多核苷酸交联的一个或多个交联部分。
本领域已知“多核苷酸”包含独立聚合的核苷酸亚单位。术语“核苷酸”或其如本文所用的复数可与如本文所讨论的修饰形式和本领域已知的另外形式交换。在某些情况下，该领域使用术语“核碱基”，其包含天然存在的核苷酸和包括修饰的核苷酸的非天然存在的核苷酸。因此，核苷酸或核碱基意指天然存在的碱基腺嘌呤(A)、鸟嘌呤(G)、胞嘧啶(C)、胸腺嘧啶(T)和尿嘧啶(U)。非天然存在的核碱基包括，例如但不限于，黄嘌呤、二氨基嘌呤、8-氧代-N6-甲基腺嘌呤、7-脱氮黄嘌呤、7-脱氮鸟嘌呤、N4,N4-桥亚乙基胞嘧啶、N',N'-桥亚乙基-2,6-二氨基嘌呤、5-甲基胞嘧啶(mC)、5-(C3-C6)-炔基-胞嘧啶、5-氟尿嘧啶、5-溴尿嘧啶、假异胞嘧啶、2-羟基-5-甲基-4-三唑并吡啶、异胞嘧啶、异鸟嘌呤、次黄嘌呤和“非天然存在的”核碱基，描述于Benner等，美国专利No.5,432,272和Susan M.Freier和Karl-Heinz Altmann,1997,Nucleic Acids Research,第25卷：第4429-4443页。术语“核碱基”还包括不但已知的嘌呤和嘧啶杂环，而且杂环类似物及其互变异构体。进一步天然和非天然存在的核碱基包括那些描述于美国专利No.3,687,808(Merigan,等)，第15章，由Sanghvi，在Antisense Research and Application,编辑S.T.Crooke和B.Lebleu,CRC Press,1993,在Englisch等，1991,Angewandte Chemie,International Edition,30:613-722(特别参见第622和623页，和在Concise Encyclopedia of Polymer Science and Engineering,J.I.Kroschwitz编，John Wiley&Sons,1990，第858-859页，Cook，Anti-Cancer DrugDesign1991,6,585-607，其每个在此通过引用整体并入)。在各方面，多核苷酸也包括非天然存在的核苷酸种类的一个或多个“核苷碱基”或“碱基单位”，其包括化合物诸如能充当核碱基的杂环化合物，包括在最传统意义上不是核苷碱基但可充当核苷碱基的某些通用碱基。通用碱基包括3-硝基吡咯，任选地取代的吲哚(例如5-硝基吲哚)和任选地取代的次黄嘌呤。其它理想的通用碱基包括，吡咯、二唑或三唑衍生物，包括那些本领域已知的通用碱基。
修饰的核苷酸描述于EP1072679和WO97/12896，其公开内容通过引用并入本文。修饰的核苷酸包括但不限于5-甲基胞嘧啶(5-me-C)、5-羟甲基胞嘧啶、黄嘌呤、次黄嘌呤、2-氨基腺嘌呤、腺嘌呤和鸟嘌呤的6-甲基和其它烷基衍生物、腺嘌呤和鸟嘌呤的2-丙基和其它烷基衍生物、2-硫尿嘧啶、2-硫胸腺嘧啶和2-硫胞嘧啶、5-卤代尿嘧啶和胞嘧啶、5-丙炔基尿嘧啶和胞嘧啶和嘧啶碱基的其它炔基衍生物、6-偶氮尿嘧啶、胞嘧啶和胸腺嘧啶、5-尿嘧啶(假尿嘧啶)、4-硫尿嘧啶、8-卤代、8-氨基、8-巯基、8-硫烷基、8-羟基和其它8-取代的腺嘌呤和鸟嘌呤、5-卤代尤其是5-溴、5-三氟甲基和其它5-取代的尿嘧啶和胞嘧啶、7-甲基鸟嘌呤和7-甲基腺嘌呤、2-F-腺嘌呤、2-氨基-腺嘌呤、8-氮杂鸟嘌呤和8-氮杂腺嘌呤、7-脱氮鸟嘌呤和7-脱氮腺嘌呤和3-脱氮鸟嘌呤和3-脱氮腺嘌呤。进一步的修饰的碱基包括三环嘧啶诸如吩噁嗪胞苷(1H-嘧啶并[5,4-b][1,4]苯并噁嗪-2(3H)-酮)、吩噻嗪胞苷(1H-嘧啶并[5,4-b][1,4]苯并噻嗪-2(3H)-酮)、G-夹诸如取代的吩噁嗪胞苷(例如9-(2-氨基乙氧基)-H-嘧啶并[5,4-b][1,4]苯并噁嗪-2(3H)-酮)、咔唑胞苷(2H-嘧啶并[4,5-b]吲哚-2-酮)、吡啶并吲哚胞苷(H-吡啶并[3',2':4,5]吡咯并[2,3-d]嘧啶-2-酮)。修饰的碱基还可包括其中嘌呤或嘧啶碱基用其它杂环取代，例如7-氮杂-腺嘌呤、7-脱氮鸟苷、2-氨基吡啶和2-吡啶酮的那些。其它核碱基包括在美国专利No.3,687,808公开的那些，在The ConciseEncyclopedia Of Polymer Science And Engineering，第858-859页，Kroschwitz,J.I.,ed.John Wiley&Sons,1990公开的那些、由Englisch等，1991,Angewandte Chemie,International Edition,30:613公开的那些，和由Sanghvi,Y.S.，第15章，AntisenseResearch and Applications,第289-302页，Crooke,S.T.和Lebleu,B.,编，CRC Press,1993公开的那些。这些碱的某些可用于提高结合亲和力并包括5-取代的嘧啶、6-氮杂嘧啶和N-2、N-6和O-6取代的嘌呤，包括2-氨丙基腺嘌呤、5-丙炔基尿嘧啶和5-丙炔基胞嘧啶。5-甲基胞嘧啶取代基已显示出增加核酸双链体的稳定性0.6-1.2℃，并且在某些方面与2'-O-甲氧乙基糖修饰结合。参见美国专利No.3,687,808、美国专利No.4,845,205；5,130,302；5,134,066；5,175,273；5,367,066；5,432,272；5,457,187；5,459,255；5,484,908；5,502,177；5,525,711；5,552,540；5,587,469；5,594,121；5,596,091；5,614,617；5,645,985；5,830,653；5,763,588；6,005,096；5,750,692和5,681,941，其公开内容通过引用并入本文。
制备预定序列的多核苷酸的方法是熟知的。参见，例如，Sambrook等，MolecularCloning:A Laboratory Manual(第二版1989)和F.Eckstein(编)Oligonucleotides andAnalogues，第一版。(Oxford University Press,New York,1991)。固相合成方法对于多核糖核苷酸和多脱氧核糖核苷酸是优选的(合成DNA的熟知的方法也可用于合成RNA)。多核糖核苷酸也能酶促制备。非天然存在的核碱基也可并入多核苷酸中。参见，例如，美国专利No.7,223,833；Katz,J.Am.Chem.Soc.,74:2238(1951)；Yamane,等，J.Am.Chem.Soc.,83:2599(1961)；Kosturko,等，Biochemistry,13:3949(1974)；Thomas,J.Am.Chem.Soc.,76:6032(1954)；Zhang,等，J.Am.Chem.Soc.,127:74-75(2005)；和Zimmermann,等，J.Am.Chem.Soc.,124:13684-13685(2002)。
本公开的纳米缀合物通常包含约5个至约100个核苷酸长度的多核苷酸。更具体地，纳米缀合物包含约5至约90个核苷酸长度、约5至约80个核苷酸长度、约5至约70个核苷酸长度、约5至约60个核苷酸长度、约5至约50个核苷酸的长度、约5至约45个核苷酸长度、约5至约40个核苷酸长度、约5至约35个核苷酸长度、约5至约30个核苷酸长度、约5至约25个核苷酸长度、约5至约20个核苷酸长度、约5至约15个核苷酸长度、约5至约10个核苷酸长度的多核苷酸，以及所有长度尺寸的中间体，特别是公开的多核苷酸能够获得所需的结果的程度。因此，5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100或更多个核苷酸长度的多核苷酸是预期的。
在一些方面，如本文所述的多核苷酸包含炔烃。在各种实施方案中，从1至100个炔烃部分存在于多核苷酸上。在进一步的方面，约5至约50个炔烃部分或约10至约20个炔烃部分存在于多核苷酸上。一方面，10个炔烃部分存在于多核苷酸上。在进一步的方面，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100或更多个炔烃部分存在于多核苷酸上。
在另一个实施方案中，在多核苷酸上的炔烃部分在5'端。在进一步的实施方案中，在多核苷酸上的炔烃部分在3'端。预期在一些方面，炔烃部分只表示多核苷酸的一部分长度。以举例的方式，如果多核苷酸是20个核苷酸长度，则预期该头10个核苷酸(在各方面从5'或3'端计数)包含炔烃部分。因此，包含炔烃部分总共20个核苷酸的10个核苷酸导致多核苷酸中的50％的核苷酸与炔烃部分相关联。在不同方面，预期多核苷酸中的约0.01％至约100％的核苷酸与炔烃部分相关联。在进一步的方面，多核苷酸中的约1％至约70％、或约2％至约60％、或约5％至约50％、或约10％至约50％、或约10％至约40％、或约20％至约50％、或约20％至约40％的核苷酸与炔烃部分相关联。
如本文所定义，多核苷酸也包括适体。适体的制备和用途对本领域的普通技术人员是已知的。通常，适体是能够紧密结合并小心区分靶向配体的核酸或肽结合物质[Yan等，RNA Biol.6(3)316-320(2009)，其通过引用整体并入本文)。适体，在一些实施方案中，可通过称为配体的系统进化的技术通过指数富集(SELEX)过程而获得[Tuerk等，Science249:505–10(1990)，美国专利号5,270,163和美国专利号5,637,459，其各自通过引用整体并入本文]。核酸适体的一般讨论见于，例如但不限于，Nucleic Acid and Peptide Aptamers:Methods and Protocols(由Mayer编辑，Humana Press,2009)和Crawford等，Briefings inFunctional Genomics and Proteomics2(1):72–79(2003)。适体的其它讨论，包括但不限于RNA适体的选择、DNA适体的选择、能与靶蛋白共价连接的适体的选择、修饰的适体文库的用途，和作为诊断剂和治疗剂的适体的用途，提供于Kopylov等，Molecular Biology34(6):940-954(2000)，翻译自Molekulyarnaya Biologiya第34卷、No.6,2000,第1097-1113页，其通过引用整体并入本文。在各种实施方案中，适体为约10至约100个核苷酸的长度。
间隔基
在某些方面，纳米缀合物被预期，其包括那些其中纳米缀合物包含进一步包含间隔基的多核苷酸。间隔基，在各方面，包含如下所述的一个或多个交联部分。
如本文所用，“间隔基”意指用于容纳一个或多个交联部分的部分，或在纳米缀合物包含纳米颗粒的一些方面，增加纳米颗粒和多核苷酸之间的距离，或当连接到纳米颗粒的多个拷贝时增加单个多核苷酸之间的距离。在纳米缀合物用于生物学活性的本公开的方面，预期该间隔基不直接参与它所连接的多核苷酸的活性。
因此，在一些方面，本文预期间隔基通过一个或多个交联部分能促进交联。在各个方面，间隔基被另外预期为串联位于单个多核苷酸之间，无论所述多核苷酸是否具有相同的序列或具有不同的序列。一方面，间隔基(如果存在)是有机部分。另一方面，所述间隔基是聚合物，包括但不限于水溶性聚合物、核酸、多肽、寡糖、糖、脂质或其组合。
在一些实施方案中，所述间隔基被官能化至纳米颗粒，但不连接到另一个生物分子。在这些实施方案中间隔基的功能是保护体内的纳米缀合物。因此，在一些实施方案中，间隔基被官能化至纳米颗粒。在进一步的实施方案中，间隔基是聚乙二醇(PEG)。在水溶性聚合物是PEG的实施方案中，预期PEG通过共价键被官能化至纳米颗粒。在一些实施方案中，PEG通过巯基键连接至纳米颗粒。预期PEG化是保护循环中的纳米缀合物并改善其药效学和药物动力学曲线[Harris等，Nat Rev Drug Discov.2:214-21(2003)]。PEG化过程将乙二醇(聚乙二醇(PEG))的重复单位连接至纳米颗粒。PEG分子具有大的流体力学体积(为球蛋白尺寸的5-10倍)，是高度水溶性和水合、非毒性、非免疫原性的并能快速地从体内清除。在各种实施方案中，纳米缀合物的PEG化导致对酶降解的抵抗性增加、体内半衰期增加、剂量频率减少、免疫原性降低、物理和热的稳定性增加、溶解度增加、液体的稳定性增加和聚集降低。
在各个实施方案中，该间隔基的长度至少约5个核苷酸、至少约10个核苷酸、10-30个核苷酸、甚至大于30个核苷酸。间隔基可具有任何序列，该序列不影响多核苷酸结合至纳米颗粒或靶多核苷酸的能力。间隔基不应该具有彼此互补或与多核苷酸的序列互补的序列，但可以与靶多核苷酸全部或部分互补。在某些方面，所述多核苷酸间隔基的碱基都是腺嘌呤、都是胸腺嘧啶、都是胞嘧啶、都是鸟嘌呤、都是尿嘧啶或都是其它修饰的碱基。
修饰的多核苷酸
如上所讨论，修饰的多核苷酸被预期可用于生产纳米缀合物。在不同方面，多核苷酸被完全修饰或被部分修饰。因此，在各方面，多核苷酸中的核苷酸单位的一个或多个或全部糖和/或一个或多个或全部核苷酸间连接可被替换为“非天然存在的”基团。
一方面，本实施方案预期肽核酸(PNA)。在PNA化合物中，多核苷酸的糖主链可被替换为包含酰胺的主链。参见，例如，美国专利No.5,539,082；No.5,714,331；和No.5,719,262，和Nielsen等，Science,1991,254,1497-1500，其公开内容通过引用并入本文。
预期用于公开的多核苷酸的核苷酸和非天然核苷酸之间的其它连接包括那些描述于美国专利No.4,981,957；5,118,800；5,319,080；5,359,044；5,393,878；5,446,137；5,466,786；5,514,785；5,519,134；5,567,811；5,576,427；5,591,722；5,597,909；5,610,300；5,627,053；5,639,873；5,646,265；5,658,873；5,670,633；5,792,747；和5,700,920；美国专利公开No.20040219565；国际专利公开No.WO98/39352和WO99/14226；Mesmaeker等，Current Opinion in Structural Biology5:343-355(1995)和Susan M.Freier和Karl-Heinz Altmann,Nucleic Acids Research,25:4429-4443(1997)，其公开内容通过引用并入本文。
多核苷酸的具体实例包括含有修饰的主链或非天然的核苷间连接的那些。具有修饰主链的多核苷酸包括主链中保留磷原子的那些，和主链中不具有磷原子的那些。在其核苷间主链中不具有磷原子的修饰的多核苷酸被认为在“多核苷酸”的含义内。
包含磷原子的修饰的多核苷酸主链，包括，例如，硫代磷酸酯、手性硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、磷酸三酯、氨烷基磷酸三酯、膦酸甲基酯和其它膦酸烷基酯(包括膦酸3'亚烷基酯、膦酸5'亚烷基酯和手性膦酸酯)、亚膦酸酯、氨基磷酸酯(包括3'-氨基氨基磷酸酯和氨烷基氨基磷酸酯)、硫羰氨基磷酸酯、硫羰磷酸烷基酯、硫羰烷基磷酸三酯、具有正常3'-5'连接的硒磷酸酯和硼磷酸酯、这些的2'-5'连接的类似物、和具有反向极性的那些，其中一个或多个核苷酸间连接是3'至3'、5'至5'或2'至2'连接。还预期的是具有反向极性(包含在3'-端的核苷酸间连接有单个3'至3'连接)的多核苷酸，即单个反向核苷残基，其可以是脱碱基(核苷酸缺失或被一个羟基基团代替)。还预期多种盐、混合盐和游离酸形式。
教导制备上述含有磷连接的典型的美国专利包括美国专利No.3,687,808；4,469,863；4,476,301；5,023,243；5,177,196；5,188,897；5,264,423；5,276,019；5,278,302；5,286,717；5,321,131；5,399,676；5,405,939；5,453,496；5,455,233；5,466,677；5,476,925；5,519,126；5,536,821；5,541,306；5,550,111；5,563,253；5,571,799；5,587,361；5,194,599；5,565,555；5,527,899；5,721,218；5,672,697和5,625,050，其公开内容通过引用并入本文。
不包含磷原子的修饰的多核苷酸主链具有由短链烷基或环烷基核苷间连接、混合的杂原子和烷基或环烷基核苷间连接、或一种或多种短链杂原子或杂环核苷间连接形成的主链。这些包括具有吗啉代连接；硅氧烷主链；硫化物、亚砜和砜主链；甲酰基(formacetyl)和硫代甲酰基主链；亚甲基甲酰基和硫代甲酰基主链；核糖乙酰基(riboacetyl)主链；含烯烃的主链；氨基磺酸酯主链；亚甲基亚胺基和亚甲基肼基主链；磺酸酯和磺胺主链；酰胺主链；和具有混合的N、O、S和CH2组成部分的其余主链的那些。在又其它的实施方案中，具有硫代磷酸酯主链的多核苷酸和具有杂原子主链的寡核苷酸被提供，并包括—CH2—NH—O—CH2—、—CH2—N(CH3)—O—CH2—、—CH2—O—N(CH3)—CH2—、—CH2—N(CH3)—N(CH3)—CH2—和—O—N(CH3)—CH2—CH2—，描述于美国专利No.5,489,677和5,602,240。参见，例如，美国专利No.5,034,506；5,166,315；5,185,444；5,214,134；5,216,141；5,235,033；5,264,562；5,264,564；5,405,938；5,434,257；5,466,677；5,470,967；5,489,677；5,541,307；5,561,225；5,596,086；5,602,240；5,610,289；5,602,240；5,608,046；5,610,289；5,618,704；5,623,070；5,663,312；5,633,360；5,677,437；5,792,608；5,646,269和5,677,439，其公开内容通过引用整体并入本文。
在各种形式中，在多核苷酸中的两个连续单体之间的连接由选自—CH2—、—O—、—S—、—NRH—、>C＝O、>C＝NRH、>C＝S、—Si(R")2—、—SO—、—S(O)2—、—P(O)2—、—PO(BH3)—、—P(O,S)—、—P(S)2—、—PO(R")—、—PO(OCH3)—和—PO(NHRH)—的2至4个，优选3个的基团/原子组成，其中RH选自氢和C1-4烷基，并且R"选自C1-6烷基和苯基。此类连接的说明性实施是—CH2—CH2—CH2—、—CH2—CO—CH2—、—CH2—CHOH—CH2—、—O—CH2—O—、—O—CH2—CH2—、—O—CH2—CH＝(当用作随后单体的连接时包括R5)、—CH2—CH2—O—、—NRH—CH2—CH2—、—CH2—CH2—NRH—、—CH2—NRH—CH2—-、—O—CH2—CH2—NRH—、—NRH—CO—O—、—NRH—CO—NRH—、—NRH—CS—NRH—、—NRH—C(＝NRH)—NRH—、—NRH—CO—CH2—NRH—O—CO—O—、—O—CO—CH2—O—、—O—CH2—CO—O—、—CH2—CO—NRH—、—O—CO—NRH—、—NRH—CO—CH2—、—O—CH2—CO—NRH—、—O—CH2—CH2—NRH—、—CH＝N—O—、—CH2—NRH—O—、—CH2—O—N＝(当用作随后单体的连接时包括R5)、—CH2—O—NRH—、—CO—NRH—CH2—、—CH2—NRH—O—、—CH2—NRH—CO—、—O—NRH—CH2—、—O—NRH、—O—CH2—S—、—S—CH2—O—、—CH2—CH2—S—、—O—CH2—CH2—S—、—S—CH2—CH＝(当用作随后单体的连接时包括R5)、—S—CH2—CH2—、—S—CH2—CH2—-O—、—S—CH2—CH2—S—、—CH2—S—CH2—、—CH2—SO—CH2—、—CH2—SO2—CH2—、—O—SO—O—、—O—S(O)2—O—、—O—S(O)2—CH2—、—O—S(O)2—NRH—、—NRH—S(O)2—CH2—、—O—S(O)2—CH2—、—O—P(O)2—O—、—O—P(O,S)—O—、—O—P(S)2—O—、—S—P(O)2—O—、—S—P(O,S)—O—、—S—P(S)2—O—、—O—P(O)2—S—、—O—P(O,S)—S—、—O—P(S)2—S—、—S—P(O)2—S—、—S—P(O,S)—S—、—S—P(S)2—S—、—O—PO(R")—O—、—O—PO(OCH3)—O—、—O—PO(OCH2CH3)—O—、—O—PO(O CH2CH2S—R)—O—、—O—PO(BH3)—O—、—O—PO(NHRN)—O—、—O—P(O)2—NRH H—、—NRH—P(O)2—O—、—O—P(O,NRH)—O—、—CH2—P(O)2—O—、—O—P(O)2—CH2—和—O—Si(R")2—O—；其中—CH2—CO—NRH—、—CH2—NRH—O—、—S—CH2—O—、—O—P(O)2—O—O—P(-O,S)—O—、—O—P(S)2—O—、—NRH P(O)2—O—、—O—P(O,NRH)—O—、—O—PO(R")—O—、—O—PO(CH3)—O—和—O—PO(NHRN)—O—，其中预期RH选自氢和C1-4烷基，并且R"选自C1-6烷基和苯基。进一步的说明性实例见Mesmaeker等，1995,Current Opinion in Structural Biology,5:343-355以及SusanM.Freier和Karl-Heinz Altmann,1997,Nucleic Acids Research,第25卷：第4429-4443页。
多核苷酸的又其它修饰的形式详细描述于美国专利申请No.20040219565，其公开内容通过引用整体并入本文。
修饰的寡核苷酸还可包含一个或多个取代的糖部分。在某些方面，多核苷酸在2'位置包括以下之一：OH；F；O-、S-或N-烷基；O-、S-或N-烯基；O-、S-或N-炔基；或O-烷基-O-烷基，其中所述烷基、烯基和炔基可以是取代或未取代的C1至C10烷基或C2至C10烯基和炔基。其它实施方案包括O[(CH2)nO]mCH3、O(CH2)nOCH3、O(CH2)nNH2、O(CH2)nCH3、O(CH2)nONH2和O(CH2)nON[(CH2)nCH3]2，其中n和m为1至约10。其它的多核苷酸在2'位置包括以下之一：C1至C10低级烷基、取代的低级烷基、烯基、炔基、烷芳基、芳烷基、O-烷芳基或O-芳烷基、SH、SCH3、OCN、Cl、Br、CN、CF3、OCF3、SOCH3、SO2CH3、ONO2、NO2、N3、NH2、杂环烷基、杂环烷芳基、氨基烷基氨基、聚烷基氨基、取代的甲硅烷基、RNA裂解基团、报告基团、嵌入剂、用于改善多核苷酸药代动力学性质的基团、或用于改善多核苷酸药效学性质的基团，和具有类似性质的其它取代基。一方面，修饰包括2'-甲氧基乙氧基(2'-O-CH2CH2OCH3，也称为2'-O-(2-甲氧基乙基)或2'-MOE)(Martin等，1995,Helv.Chim.Acta,78:486-504)即，烷氧基烷氧基基团。其它修饰包括2'-二甲基氨基氧基乙氧基，即，O(CH2)2ON(CH3)2基团，也称为2'-DMAOE，和2'-二甲基氨基乙氧基乙氧基(在本领域也称为2'-O-二甲基-氨基-乙氧基-乙基或2'-DMAEOE)，即，2'-O—CH2—O—CH2—N(CH3)2。
又其它修饰包括2'-甲氧基(2'-O—CH3)、2'-氨基丙氧基(2'-OCH2CH2CH2NH2)、2'-烯丙基(2'-CH2—CH＝CH2)、2'-O-烯丙基(2'-O—CH2—CH＝CH2)和2'-氟(2'-F)。所述2'-修饰可以在阿拉伯糖(上)位置或核糖(下)位置。一方面，2'-阿拉伯糖修饰是2'-F。还可在多核苷酸上的其它位置进行类似修饰，例如，3'末端核苷酸或2'-5'连接的多核苷酸上糖的3'位置和5'末端核苷酸的5'位置。多核苷酸还可具有糖模拟物诸如环丁基部分来代替戊呋喃糖基糖。参见，例如，美国专利No.4,981,957；5,118,800；5,319,080；5,359,044；5,393,878；5,446,137；5,466,786；5,514,785；5,519,134；5,567,811；5,576,427；5,591,722；5,597,909；5,610,300；5,627,053；5,639,873；5,646,265；5,658,873；5,670,633；5,792,747；和5,700,920，其公开内容通过引用整体并入本文。
一方面，糖的修饰包括锁核酸(LNA)，其中2'-羟基基团与糖环的3'或4'碳原子连接，从而形成双环糖部分。在某些方面，该连接是桥接2'氧原子和4'碳原子的亚甲基(—CH2—)n基团，其中n是1或2。LNA及其制备描述于WO98/39352和WO99/14226，其公开内容通过引用并入本文。
多核苷酸特征
在各方面，本公开的纳米缀合物包含多个多核苷酸。结果，每个纳米缀合物能结合至多个具有足够互补序列的靶多核苷酸。例如，如果特定多核苷酸被靶向，单个纳米缀合物能结合至相同分子的多个拷贝。一方面，提供了其中纳米缀合物包含相同多核苷酸的方法，即，每个多核苷酸具有相同的长度和相同的序列。在其它方面，纳米缀合物包含两个或多个不同的多核苷酸，即，该纳米缀合物的多核苷酸的至少一个不同于纳米缀合物的其它多核苷酸的至少一个，因为它具有不同的长度和/或不同的序列。在其中纳米缀合物包含不同多核苷酸的方面，这些不同的多核苷酸结合至相同的但在不同位置的单个靶多核苷酸，或结合至编码不同基因产物的不同的靶多核苷酸。因此，在各个方面，单个纳米缀合物可用于抑制不止一种基因产物表达的方法。因此多核苷酸用于靶向特定多核苷酸，无论是否在靶多核苷酸的一个或多个特定区域，或者在靶多核苷酸的整个长度，可以根据需要影响基因表达抑制的所需水平。
因此，一方面，设计多核苷酸需具有靶向序列的知识。可选地，在纳米缀合物中的多核苷酸不需要与靶多核苷酸杂交以获得如本文所述的所需效果。
预期用于纳米缀合物生产的多核苷酸包括，一方面，可调节由靶多核苷酸表达的基因产物的表达的那些。因此，与靶多核苷酸杂交并抑制翻译的反义多核苷酸、与靶多核苷酸杂交并启动RNA酶活性(例如RNA酶H)的siRNA多核苷酸、与双链多核苷酸杂交形成的并抑制转录的三螺旋多核苷酸，和与靶多核苷酸杂交并抑制翻译的核酶是被预期的。
在一些方面，基于多核苷酸的纳米缀合物允许对纳米缀合物的有效摄取。在各方面，多核苷酸包含使对纳米缀合物的摄取效率增加的核苷酸序列。如本文所用，“效率”是指在细胞内或通过细胞摄取纳米缀合物的数量或速率。因为纳米缀合物进入和退出细胞是一个动态的过程，通过摄取更多的纳米缀合物或通过保留那些经历较长的时间能进入细胞的纳米缀合物可以提高效率。类似地，通过摄取较少的纳米缀合物或通过保留那些经历较短的时间能进入细胞的纳米缀合物可以降低效率。
因此，核苷酸序列可以是所需的任何核苷酸序列，在各方面，可被用于增加或降低纳米缀合物的细胞摄取或基因调节。在一些方面，该核苷酸序列包含影响效率的均聚物序列，该效率是多核苷酸连接至的纳米颗粒被细胞摄取的效率。因此，均聚物序列增加或降低效率。还预期在各方面，核苷酸序列是核碱基的组合，以致它不是严格同聚的序列。例如但不限于，在各方面，核苷酸序列包含交替的胸苷和尿苷残基、两个胸苷然后两个尿苷或影响摄取增加的任何组合通过本公开被预期。在一些方面，影响摄取效率的核苷酸序列作为结构域被包括在包含另外序列的多核苷酸中。该“结构域”可作为影响摄取效率的特征而起作用，同时另外的核苷酸序列可起作用，例如但不限于，调节基因表达。在各方面，多核苷酸中的结构域可以在近端、远端或相对于纳米缀合物的中心位置。还预期多核苷酸包含多于一个域。
均聚序列，在一些实施方案中，增加细胞对纳米缀合物的摄取效率。在一些方面，均聚序列包含胸苷残基(聚T)或尿苷残基(聚U)的序列。在进一步的方面，聚T或聚U序列包含两个胸苷或尿苷。在各方面，聚T或聚U序列包含约3至约500个胸苷或尿苷残基。在进一步的实施方案中，聚T或聚U序列包含约3至约10、约20、约30、约40、约50、约60、约70、约80、约90、约100、约150、约200或更多个胸苷或尿苷残基。在一些实施方案中，聚T或聚U序列包含约10至约50、约20至约100、或约40至约200个胸苷或尿苷残基。因此，在各种实施方案中，聚T或聚U序列包含3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、约55、约60、约65、约70、约75、约80、约85、约90、约95、约100、约125、约150、约175、约200、约250、约300、约350、约400、约450、约500或更多个胸苷或尿苷残基。
在一些实施方案中，预期包含包含均聚序列的多核苷酸的纳米缀合物被细胞摄取的效率高于包含相同的多核苷酸但缺少该均聚序列的纳米缀合物。在各方面，包含包含均聚序列的多核苷酸的纳米缀合物由细胞摄取的效率是包含相同的多核苷酸但缺少该均聚序列的纳米缀合物的约2倍、约3倍、约4倍、约5倍、约6倍、约7倍、约8倍、约9倍、约10倍、约20倍、约30倍、约40倍、约50倍、约100倍或更高。
在其它方面，该结构域为磷酸酯聚合物(C3残基)。在一些方面，该结构域包含由两个磷酸酯组成的磷酸酯聚合物(C3残基)。在一些实施方案中，C3残基包含约3至约500、或约5至约50个磷酸酯、或约10至约50个磷酸酯、或约20至约70个磷酸酯、或约50至约200个磷酸酯。在各方面，C3残基包含3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、约55、约60、约65、约70、约75、约80、约85、约90、约95、约100、约125、约150、约175、约200、约250、约300、约350、约400、约450、约500或更多个磷酸酯。
在一些实施方案中，预期包含包含结构域的多核苷酸的纳米缀合物被细胞摄取的效率低于包含相同的多核苷酸但缺少该结构域的纳米缀合物。在各方面，包含包含结构域的多核苷酸的纳米缀合物被细胞摄取的效率是包含相同的多核苷酸但缺少该结构域的纳米缀合物的约2倍、约3倍、约4倍、约5倍、约6倍、约7倍、约8倍、约9倍、约10倍、约20倍、约30倍、约40倍、约50倍、约100倍或更低。
足以使纳米缀合物稳定的表面密度和获得纳米缀合物和多核苷酸的组合所需的必要条件可以凭经验确定。通常，至少2pmol/cm2的表面密度将足以提供稳定的纳米缀合物-多核苷酸的组合物。在一些方面，表面密度是至少15pmol/cm2。在另外的方面，多核苷酸以表面密度约0.3pmol/cm2至约10pmol/cm2、或约0.6pmol/cm2至约15pmol/cm2、或约1pmol/cm2至约20pmol/cm2、或约0.3pmol/cm2至约100pmol/cm2与纳米缀合物相关联。还提供了方法，其中所述多核苷酸以表面密度至少2pmol/cm2、至少3pmol/cm2、至少4pmol/cm2、至少5pmol/cm2、至少6pmol/cm2、至少7pmol/cm2、至少8pmol/cm2、至少9pmol/cm2、至少10pmol/cm2、至少约15pmol/cm2、至少约19pmol/cm2、至少约20pmol/cm2、至少约25pmol/cm2、至少约30pmol/cm2、至少约35pmol/cm2、至少约40pmol/cm2、至少约45pmol/cm2、至少约50pmol/cm2、至少约55pmol/cm2、至少约60pmol/cm2、至少约65pmol/cm2、至少约70pmol/cm2、至少约75pmol/cm2、至少约80pmol/cm2、至少约85pmol/cm2、至少约90pmol/cm2、至少约95pmol/cm2、至少约100pmol/cm2、至少约125pmol/cm2、至少约150pmol/cm2、至少约175pmol/cm2、至少约200pmol/cm2、至少约250pmol/cm2、至少约300pmol/cm2、至少约350pmol/cm2、至少约400pmol/cm2、至少约450pmol/cm2、至少约500pmol/cm2、至少约550pmol/cm2、至少约600pmol/cm2、至少约650pmol/cm2、至少约700pmol/cm2、至少约750pmol/cm2、至少约800pmol/cm2、至少约850pmol/cm2、至少约900pmol/cm2、至少约950pmol/cm2、至少约1000pmol/cm2或更大与纳米缀合物相关联。
如本文所用，“缀合位点”被理解意指造影剂连接至的多核苷酸上的位点。将造影剂连接至多核苷酸的方法对本领域是通常已知的[参见，例如，Song等，Chem Ing Engl48(48):9143-9147(2009)]。在某些方面，本公开还提供不包含缀合位点的纳米缀合物的一部分的一个或多个多核苷酸的，同时提供包含缀合位点的相同纳米缀合物的一部分的一个或多个多核苷酸。造影剂通过缀合位点缀合至纳米缀合物上通常描述于PCT/US2010/44844，其通过引用整体并入本文。本公开一方面提供了包含多核苷酸的纳米缀合物，其中该多聚核苷酸包含一个至约十个缀合位点。另一方面，多核苷酸包含五个缀合位点。通常，对于核苷酸，其主链(磷酸酯基团)和核碱基可被修饰。因此，本公开预期有2n个缀合位点，其中n＝多核苷酸模板的长度。在相关方面，预期该组合物包含纳米缀合物，该纳米缀合物包含多个多核苷酸。在一些方面，多个多核苷酸包含造影剂可通过一个或多个缀合位点与之关联的至少一个多核苷酸，以及至少一个如本文所述具有基因调控活性的多核苷酸。
因此，在一些实施方案中，预期作为纳米缀合物的一部分的一个或多个多核苷酸未与造影剂缀合，同时作为相同纳米缀合物的一部分的一个或多个多核苷酸与造影剂缀合。
多核苷酸标记/标签
本文所述的多核苷酸，在各方面，任选地包含可检测的标签。因此，本公开提供了组合物和方法，其中多核苷酸杂交通过可检测的变化被检测。一方面，杂交产生用肉眼或频谱观察到的颜色变化。
多核苷酸杂交产生的可检测的变化的可视化方法也包括任何荧光检测方法，包括但不限于荧光显微镜、微量滴定板读数仪或荧光激活的细胞分选(FACS)。
将理解，本公开预期的标签包括本文所述的任何荧光团以及本领域已知的其它可检测标签。例如，标签还包括，但不限于，氧化还原活性探针、化学发光分子、放射性标记、染料、荧光分子、磷光分子、如下所述的成像和/或造影剂、量子点，以及使用光谱方法可被检测的任何标记，即，使用显微术和流式细胞可检测的那些标记。在可检测的标记是待检测的本公开的方面，本公开提供了任何发光、荧光或磷光分子或颗粒可通过贵金属表面或通过本领域已知的猝灭剂分子被有效地猝灭(本公开预期的淬灭剂分子包括但不限于Dabsyl(二甲基氨基偶氮苯磺酸)、黑洞猝灭剂、Qxl猝灭剂、Iowa黑FQ、Iowa黑RQ、IRDye QC-1和其组合)。因此，分子的每种类型预期用于公开的组合物和方法。
用荧光分子标记生物分子和测量荧光的方法在本领域是熟知的。
合适的荧光分子是本领域熟知的，并且包括但不限于1,8-ANS(1-苯胺基萘-8-磺酸)、1-苯胺基萘-8-磺酸(1,8-ANS)、5-(和-6)-羧基-2',7'-二氯荧光素pH9.0、5-FAMpH9.0、5-ROX(5-羧基-X-罗丹明、三乙基铵盐)、5-ROX pH7.0、5-TAMRA、5-TAMRA pH7.0、5-TAMRA-MeOH、6JOE、6,8-二氟-7-羟基-4甲基香豆素pH9.0、6-羧基罗丹明6G pH7.0、6-羧基罗丹明6G,盐酸盐、6-HEX、SE pH9.0、6-TET、SE pH9.0、7-氨基-4甲基香豆素pH7.0、7-羟基4-甲基香豆素、7-羟基-4-甲基香豆素pH9.0、Alexa350、Alexa405、Alexa430、Alexa488、Alexa532、Alexa546、Alexa555、Alexa568、Alexa594、Alexa647、Alexa660、Alexa680、Alexa700、Alexa Fluor430抗体缀合物pH7.2、Alexa Fluor488抗体缀合物pH8.0、AlexaFluor488酰肼-水、Alexa Fluor532抗体缀合物pH7.2、Alexa Fluor555抗体缀合物pH7.2、Alexa Fluor568抗体缀合物pH7.2、Alexa Fluor610R-藻红蛋白链霉抗生物素蛋白pH7.2、Alexa Fluor647抗体缀合物pH7.2、Alexa Fluor647R-藻红蛋白链霉抗生物素蛋白pH7.2、Alexa Fluor660抗体缀合物pH7.2、Alexa Fluor680抗体缀合物pH7.2、Alexa Fluor700抗体缀合物pH7.2、别藻蓝蛋白pH7.5、AMCA缀合物、氨基香豆素、APC(别藻蓝蛋白)、Atto647、BCECF pH5.5、BCECF pH9.0、BFP(蓝荧光蛋白)、BO-PRO-1-DNA、BO-PRO-3-DNA、BOBO-1-DNA、BOBO-3-DNA、BODIPY650/665-X、MeOH、BODIPY FL缀合物、BODIPY FL、MeOH、Bodipy R6G SE、BODIPY R6G、MeOH、BODIPY TMR-X抗体缀合物pH7.2、Bodipy TMR-X缀合物、BODIPY TMR-X、MeOH、BODIPY TMR-X、SE、BODIPY TR-X类鬼笔毒环肽pH7.0、BODIPY TR-X、MeOH、BODIPY TR-X、SE、BOPRO-1、BOPRO-3、钙黄绿素、钙黄绿素pH9.0、钙深红(calcium crimson)、钙深红Ca2+、钙绿、钙绿-1Ca2+、钙橙、钙橙Ca2+、羧基萘荧光素pH10.0、级联蓝(Cascade Blue)、级联蓝BSA pH7.0、级联黄、级联黄抗体缀合物pH8.0、CFDA、CFP(青色荧光蛋白)、CI-NERFpH2.5、CI-NERF pH6.0、柠檬黄(Citrine)、香豆素、Cy2、Cy3、Cy3.5、Cy5、Cy5.5、CyQUANTGR-DNA、丹磺酰尸胺、丹磺酰尸胺、MeOH、DAPI、DAPI-DNA、Dapoxyl(2-氨乙基)磺酰胺、DDAOpH9.0、二-8ANEPPS、二-8-ANEPPS-脂质、DiI、DiO、DM-NERF pH4.0、DM-NERF pH7.0、DsRed、DTAF、dTomato、eCFP(增强的青色荧光蛋白)、eGFP(增强的绿色荧光蛋白)、曙红、曙红抗体缀合物pH8.0、赤藓红-5-异硫氰酸盐pH9.0、溴化乙锭、乙锭同源二聚体、乙锭同源二聚体-1-DNA、eYFP(增强的黄色荧光蛋白)、FDA、FITC、FITC抗体缀合物pH8.0、FlAsH、Fluo-3、Fluo-3Ca2+、Fluo-4、Fluor-Ruby、荧光素、荧光素0.1M NaOH、荧光素抗体缀合物pH8.0、荧光素葡聚糖pH8.0、荧光素pH9.0、Fluoro-Emerald、FM1-43、FM1-43脂质、FM4-64、FM4-64、2％CHAPS、Fura Red Ca2+、Fura Red、高Ca、Fura Red、低Ca、Fura-2Ca2+、Fura-2、高Ca、Fura-2、无Ca、GFP(S65T)、HcRed、Hoechst33258、Hoechst33258-DNA、Hoechst33342、Indo-1Ca2+、Indo-1、无Ca、Indo-1、Ca饱和、JC-1、JC-1pH8.2、丽丝胺若丹明、LOLO-1-DNA、荧光黄、CH、LysoSensor蓝、LysoSensor蓝pH5.0、LysoSensor绿、LysoSensor绿pH5.0、LysoSensor黄pH3.0、LysoSensor黄pH9.0、LysoTracker蓝、LysoTracker绿、LysoTracker红、镁绿、镁绿Mg2+、镁橙、Marina蓝、mBanana、mCherry、mHoneydew、MitoTracker绿、MitoTracker绿FM、MeOH、MitoTracker橙、MitoTracker橙、MeOH、MitoTracker红、MitoTracker红、MeOH、mOrange、mPlum、mRFP、mStrawberry、mTangerine、NBD-X、NBD-X、MeOH、NeuroTrace500/525、绿色荧光尼氏(Nissl)染色-RNA、尼罗蓝、EtOH、尼罗红、尼罗红-脂质、尼氏、Oregon绿488、Oregon绿488抗体缀合物pH8.0、Oregon绿514、Oregon绿514抗体缀合物pH8.0、太平洋蓝、太平洋蓝抗体缀合物pH8.0、藻红蛋白、PicoGreen双链DNA定量试剂、PO-PRO-1、PO-PRO-1-DNA、PO-PRO-3、PO-PRO-3-DNA、POPO-1、POPO-1-DNA、POPO-3、碘化丙锭、碘化丙锭-DNA、R-藻红蛋白pH7.5、ReAsH、试卤灵、试卤灵pH9.0、Rhod-2、Rhod-2Ca2+、罗丹明、罗丹明110、罗丹明110pH7.0、罗丹明123、MeOH、罗丹明绿、罗丹明的鬼笔环肽pH7.0、罗丹明红-X抗体缀合物pH8.0、罗丹明绿pH7.0、Rhodol绿抗体缀合物pH8.0、蓝宝石、SBFI-Na+、钠绿Na+、磺酰罗丹明101、EtOH、SYBRGreen I、SYPRO Ruby、SYTO13-DNA、SYTO45-DNA、SYTOX蓝-DNA、四甲基罗丹明抗体缀合物pH8.0、四甲基罗丹明葡聚糖pH7.0、德克萨斯红-X抗体缀合物pH7.2、TO-PRO-1-DNA、TO-PRO-3-DNA、TOTO-1-DNA、TOTO-3-DNA、TRITC、X-罗丹明-1Ca2+、YO-PRO-1-DNA、YO-PRO-3-DNA、YOYO-1-DNA和YOYO-3-DNA。
多肽
纳米缀合物，在各方面，包含多肽。所述多肽可与纳米缀合物相关联或可与纳米缀合物，如在一些实施方案中治疗剂一起递送至组合物。如本文所用，“多肽”是指包含氨基酸残基的聚合物。多肽是本领域熟知的，包括但不限于抗体、酶和激素。在相关方面，包含多肽的纳米缀合物识别并与靶向分子结合，并能够检测所述靶向分子。
本公开的多肽可以是天然或者非天然存在的。多肽任选地包括如上文所述的间隔基。
天然存在的多肽
天然存在的多肽包括但不限于天然存在的生物活性多肽(包括抗体)，或可由天然发现的形式例如通过化学合成或重组表达技术产生。天然存在的多肽也包括脂蛋白和翻译后修饰的蛋白质，诸如，例如但不限于，糖基化蛋白。
预期用于本公开的方法和组合物中的抗体包括，但不限于识别并结合体内或体外靶向分子的抗体。
非天然存在的多肽
本公开预期的非天然存在的多肽包括但不限于合成多肽以及片段、类似物和本文所定义的天然或者非天然存在的多肽的变体。非天然存在的多肽也包括具有D-氨基酸的、修饰的、衍生化的、或者D或L构型的非天然存在的氨基酸和/或作为其结构的一部分的肽模拟物单位的蛋白质或蛋白物质。术语“蛋白质”通常是指大的多肽。术语“肽”通常是指短的(即，等于或小于约50个氨基酸)的多肽。
例如使用自动多肽合成仪，或可选地使用重组表达技术(该技术使用编码所需多肽的修饰的多核苷酸)来制备非天然存在的多肽。
如本文所用，多肽“片段”意指多肽或小于全长多肽或蛋白质表达产物的蛋白质的任何部分。
如本文所用，“类似物”是指结构基本相似并具有相同的生物学活性但对整个分子或其片段可具有不同程度活性的两种或多种多肽。类似物在其基于一个或多个氨基酸对其它氨基酸的涉及取代、缺失、插入和/或添加的一个或多个突变的氨基酸序列的组合物中有所不同。基于被替代的氨基酸和替代它的氨基酸的物理-化学或功能的相关性，取代可以是保守的或非保守的。
如本文所用，“变体”是指多肽、蛋白质或其类似物，其被修饰以包含额外的并非通常是分子的一部分的化学部分。此类部分可调节，例如但不限于，分子的溶解性、吸收和/或生物半衰期。能介导此类作用的部分公开于Remington's Pharmaceutical Sciences(1980)。将此类部分偶联至分子的程序在本领域是熟知的。在各方面，多肽被糖基化、PEG化和/或聚唾液酸化修饰。
融合蛋白，包括其中一种融合组分是片段或模拟物的融合蛋白，也被预期。如本文所述，“模拟物”意指具有生物活性的肽或蛋白质，该活性与它的蛋白的模拟物相当。以举例的方式，内皮生长因子模拟物是具有生物活性的肽或蛋白质，该活性与天然内皮生长因子相当。该术语进一步包括间接模拟目标蛋白活性的肽或蛋白质，诸如通过增强目标蛋白天然配体的作用。
多肽包括抗体和其片段和衍生物，包括但不限于Fab'片段、F(ab)2片段、Fv片段、Fc片段、一个或多个互补决定区(CDR)片段、单个重链、单个轻链、二聚体重链和轻链(与在完整抗体中发现的异源四聚体重链和轻链相反)、单链抗体(scAb)、人源化抗体(以及在非人物种中以人源化抗体的方式修饰但得到的抗体非常近似抗体的抗体)、螯合重组抗体(CRAB)、双特异性抗体、多特异性抗体和本领域已知的其它抗体衍生物或片段。
造影剂
在各个方面，本文公开了包含纳米缀合物的方法和组合物，其中生物分子通过缀合位点与造影剂缀合。在各方面，造影剂与多核苷酸和/或多肽缀合。如本文所用，“造影剂”是引入到细胞中以产生不同器官和组织的表观密度差异的化合物或其它物质，它使看到描绘附近的身体组织和器官更容易。将理解，本文所述的造影剂与多核苷酸或多肽的缀合可用于本公开的组合物和方法。
本公开提供的方法包括其中结合纳米缀合物的造影剂的弛豫率相对于不与纳米缀合物结合的造影剂的弛豫率增加的那些。在一些方面，所述增加为约1倍至约20倍。在进一步的方面，所述增加为约2倍至约10倍，并且在又进一步的方面，所述增加为约3倍。
在一些实施方案中，造影剂选自钆、氙、氧化铁、锰螯合物(Mn-DPDP)和铜。因此，在一些实施方案中，该造影剂是顺磁化合物，并且在一些方面，该顺磁化合物是钆。
本公开还预期可用于正电子发射断层造影(PET)扫描的造影剂。在一些方面，该PET造影剂是放射性核素。在某些实施方案中，该造影剂包含PET造影剂，其包含选自11C、13N、18F、64Cu、68Ge、99mTc和82Ru的标签。在特定的实施方案中，该造影剂是选自[11C]胆碱、[18F]氟脱氧葡萄糖(FDG)、[11C]甲硫氨酸、[11C]胆碱、[11C]乙酸酯、[18F]氟代胆碱、64Cu螯合物、99mTc螯合物和[18F]聚乙二醇芪类的PET造影剂。
本公开也提供其中在多核苷酸合成过程期间PET造影剂被引入至多核苷酸中或在多核苷酸合成后与核苷酸缀合的方法。例如但不限于，可合成核苷酸，其中一个磷原子被32P或33P替代，磷酸基团中的一个氧原子被35S替代，或一个或多个氢原子被3H替代。含有放射性核素的官能团也可通过缀合位点与核苷酸缀合。
在某些实施方案中，与多核苷酸缀合的MRI造影剂是铁或顺磁放射性示踪剂和/或复合物，包括但不限于钆、氙、氧化铁和铜。MRI造影剂可包括但不限于阳性造影剂和/或阴性造影剂。阳性造影剂引起T1弛豫时间的降低(在T1加权图像上信号强度增加)。它们(在MRI上呈现亮色)通常是小分子量化合物，含有钆、锰或铁作为它们的活性元素。所有这些元素在其外壳上具有不成对的电子自旋和长的弛豫率。阴性造影剂的特殊基团(在MRI上呈现暗色)包括全氟化碳(全氟化学品)，因为它们的存在排除了在MR成像中负责信号的氢原子。
本公开的组合物，在各方面，预期包含纳米缀合物，该纳米缀合物包含约50至约2.5X106个造影剂。在一些实施方案中，纳米缀合物包含约500至约1X106个造影剂。
靶向部分
如本文所用，术语“靶向部分”是指任何分子结构，其有助于化合物或其它分子结合或另外定位于特定靶点、靶点区域、进入靶向细胞或结合于靶向受体。例如但不限于，靶向部分可包括蛋白质(包括抗体)和蛋白质片段(能与在体内或体外需要的靶点结合)、肽、小分子、抗癌剂、多核苷酸结合剂、碳水化合物、细胞表面受体的配体、适体、脂质(包括阳离子、中性和甾族脂质、病毒颗粒和脂质体)、抗体并且激素可作为靶向部分。靶向部分可用于将纳米缀合物递送至特定细胞类型，以及亚细胞位置。
受体介导的转运机制存在于BBB，并且这些涉及脑内皮的囊泡转运系统[Jones等，Pharm Res.24(9):1759-1771(2007)]。脑对营养物诸如铁[Jefferies等，Nature312:162-163(1984)]、胰岛素[Duffy等，Brain Res420:32-38(1987)]和瘦素[Golden等，J ClinInvest99:14-18(1997)]的摄入是通过称作胞吞转运的跨细胞的受体-介导的转运机制而发生。
在一些实施方案中，靶向部分是蛋白质。本公开的组合物的蛋白质部分，在一些方面，是能将组合物靶向于靶细胞的蛋白质。本公开的靶向蛋白可结合受体、底物、抗原决定簇、或靶细胞上或其它靶点的其它结合位点。
用作靶向蛋白的抗体可以是多克隆的或单克隆的。与特定类型的细胞结合的许多单克隆抗体(MAb)已被开发。来源于基因工程或蛋白质工程的抗体也可以被使用(例如，IgG、IgA、IgM、IgD、IgE抗体)。
在本公开中作为靶向剂的抗体可以是完整分子、其片段或其官能化等同物。用于本公开的组合物的抗体片段的实例是F(ab')2、Fab'Fab和Fv片段，它们可通过常规方法或通过基因或蛋白工程生产。
在另外的方面，本公开预期的靶向部分包括但不限于糖(例如，甘露糖、甘露糖-6-磷酸、半乳糖)。在进一步的方面，该部分靶向运铁蛋白受体(TfR)(它是由脑毛细血管高度表达以介导铁到脑的递送)[Jefferies等，Nature312:162-163(1984)]；胰岛素受体和胰岛素样生长因子受体[Duffy等，Brain Res420:32-38(1987)]；低密度脂蛋白受体-相关蛋白1和低密度脂蛋白受体-相关蛋白2(Gaillard等，Expert Opin Drug Deliv2:299-309(2005)]；和白喉毒素受体/肝素结合表皮生长因子样生长因子[Gaillard等，Int CongresSeries1277:185-198(2005)]的任何一个或其组合。本公开预期的能影响受体介导的胞吞(RMT)的其它部分包括但不限于，Feng等[在：Drug Delivery to the Central NervousSystem,Kewal K.Jain(编辑)，第45卷:15-34(2010)]中公开的那些。
在一些实施方案中，纳米缀合物的多核苷酸部分可用作额外的或辅助的靶向部分。所述多核苷酸部分可被选择或设计以有助于胞外靶向，或作为细胞内靶向部分。即，多核苷酸部分可用作找出靶细胞的DNA探针。该额外的靶向能力将用于改善将该组合物递送至靶细胞的特异性。所述多核苷酸还可额外地或可选地被选择或设计以靶向靶细胞内的组合物，而所述靶向蛋白靶向细胞外的缀合物。
预期该靶向部分，在各种实施方案中，能与纳米缀合物相关联。在其中纳米缀合物包含纳米颗粒(即，不是中空的)的各个方面，预期该靶向部分连接至纳米颗粒、多核苷酸/多肽或两者。在进一步的方面，该靶向部分与纳米缀合物组合物相关联，并且在其它方面，该靶向部分在本公开的组合物施用之前、同时或施用之后施用。
治疗剂
在本公开的任何方面或实施方案中，预期治疗剂与纳米缀合物一起递送。在不同的实施方案中，此类递送能通过将所述治疗剂和纳米缀合物关联而被促进，或递送能通过共同施用治疗剂和纳米缀合物而被促进。将治疗剂关联至纳米缀合物的方法是本领域已知的，并描述于，例如但不限于，国际专利申请号PCT/US2010/055018，其通过引用整体并入本文。在某些实施方案中，治疗剂是神经营养因子。
神经营养蛋白
在脑中许多神经营养因子是神经保护的，但没有穿过血脑屏障。这些因子适用于本公开的组合物和方法，包括脑衍生的神经营养因子(BDNF)、神经生长因子(NGF)、神经营养蛋白-4/5、成纤维细胞生长因子(FGF)-2和其它FGF、神经营养蛋白(NT)-3、促红细胞生成素(EPO)、肝细胞生长因子(HGF)、表皮生长因子(EGF)、转化生长因子(TGF)-α、TGF-β、血管内皮生长因子(VEGF)、白介素-1受体拮抗剂(IL-1ra)、睫状神经营养因子(CNTF)、神经胶质衍生的神经营养因子(GDNF)、神经营养因子(neurturin)、血小板衍生的生长因子(PDGF)、调蛋白、神经调节蛋白、artemin、persephin、白介素、粒细胞集落刺激因子(CSF)、粒细胞-巨噬细胞-CSF、神经生长因子(netrin)、心脏营养蛋白-1、刺猬(hedgehogs)、白血病抑制因子(LIF)、中期因子(midkine)、多效生长因子、骨形态发生蛋白(BMP)、神经生长因子(netrin)、鞘脂酶激活蛋白(saposin)、信号素(semaphorin)和干细胞因子(SCF)。
抗癌剂
在一些方面，本公开的组合物包含抗癌剂。合适的抗癌剂包括但不限于，放线菌素D、阿仑珠单抗、别嘌醇钠、氨磷汀、安吖啶、阿那曲唑、单磷酸阿糖胞苷(Ara-CMP)、门冬酰胺酶、氮杂胞苷(Azacytadine)、苯达莫司汀、贝伐珠单抗、比卡鲁胺、博莱霉素(例如，博莱霉素A2和B2)、硼替佐米、白消安、喜树碱钠盐、卡培他滨、卡铂、卡莫司汀、西妥昔单抗、苯丁酸氮芥、顺铂、克拉屈滨、氯法拉滨、环磷酰胺、阿糖胞苷、达卡巴嗪、更生霉素、柔红霉素、柔红霉素脂质体、达卡巴嗪、地西他滨、多西他赛、多柔比星、多柔比星脂质体、表柔比星、雌莫司汀、依托泊苷、磷酸依托泊苷、依西美坦、氟尿苷、氟达拉滨、磷酸氟达拉滨、5-氟尿嘧啶、福莫司汀、氟维司群、吉西他滨、戈舍瑞林、六甲蜜胺、羟基脲、伊达比星、异环磷酰胺、伊马替尼、伊立替康、伊沙匹隆、拉帕替尼、来曲唑、醋酸亮丙瑞林、洛莫司汀、氮芥、美法仑、6-巯嘌呤、甲氨蝶呤、光辉霉素、丝裂霉素C、米托坦、米托蒽醌、尼莫司汀、奥法木单抗(Ofatumumab)、奥沙利铂、紫杉醇、帕尼单抗、培门冬酶、培美曲塞、喷司他丁、帕妥珠单抗、吡铂、哌泊溴烷、普乐沙福、丙卡巴肼、雷替曲塞、利妥昔单抗、链脲佐菌素、替莫唑胺、替尼泊苷、6-硫鸟嘌呤、塞替派、托泊替康、曲妥珠单抗、曲奥舒凡、曲他胺、三甲曲沙、尿嘧啶氮芥、戊柔比星、长春碱、长春新碱、长春地辛、长春瑞滨及其类似物、前体、衍生物和其前药。应注意，两种或更多种上述化合物可用于本公开的组合物的组合。
小分子
如本文所用，术语“小分子”是指化学化合物，例如可任选地被衍生的肽类(peptidometic)，或者任何其它低分子量的天然或合成的有机化合物。此类小分子可以是治疗上可递送的物质或可进一步被衍生以促进递送。
“低分子量”意指具有小于1000道尔顿的分子量，通常在300和700道尔顿之间的化合物。低分子量化合物，在各个方面，为约100、约150、约200、约250、约300、约350、约400、约450、约500、约550、约600、约650、约700、约750、约800、约850、约900、或约1000道尔顿。
方法
本公开提供了包含能穿过BBB的纳米缀合物的组合物。此类组合物，在各方面，用于治疗急性和慢性CNS病症。例如而非限制，本发明的组合物可用于治疗急性脑和脊髓病状，诸如灶性脑局部缺血、全脑局部缺血和脊髓损伤，以及神经变性疾病包括朊病毒疾病、阿尔茨海默病(AD)、帕金森病(PD)、亨廷顿舞蹈病(HD)、ALS、多发性硬化、横贯性脊髓炎、运动神经元病、皮克病、结节性硬化症、溶酶体贮积失调、卡纳万氏病、雷特综合征、脊髓小脑性共济失调、弗里德赖希共济失调、视萎缩、和视网膜变性的长期治疗。还预期治疗低运动神经元疾病，诸如SMA和ALS以及庞皮病、溶酶体贮积失调、多形性成胶质细胞瘤和帕金森病。溶酶体贮积失调包括但不限于，活化剂缺陷/GM2神经节苷脂贮积病、α-甘露糖苷贮积症、天冬氨酰葡萄糖胺尿症、胆固醇酯贮积病、慢性己糖胺酶A缺乏、胱氨酸病、Danon病、法布里病(Fabry disease)、法勃氏病(Farber disease)、岩藻糖代谢病、半乳糖唾液酸贮积症、戈谢病(Gaucher Disease)(I型、II型、III型)、GM1神经节苷脂沉积症(婴儿、婴儿晚期/青少年、成人/慢性)、I-细胞疾病/粘脂贮积病II、婴儿无唾液酸存积病/ISSD、青少年己糖胺酶A缺乏、克拉伯病(Krabbe Disease)(婴儿发作型、晚发作型)、异染性脑白质营养不良、黏多醣贮积症(假胡尔勒氏多种营养不良(pseudo-Hurler polydystrophy)/粘脂贮积病IIIA、MPSI胡尔勒氏综合征、MPSI施艾氏(Scheie)综合征、MPSI胡尔勒氏-施艾氏综合征、MPS II亨特氏(Hunter)综合征、桑菲列普(Sanfilippo)综合征类型A/MPS III A、桑菲列普综合征类型B/MPS III B、桑菲列普综合征类型C/MPS III C、桑菲列普综合征类型D/MPSIII D、莫尔丘(Morquio)类型A/MPS IVA、莫尔丘类型B/MPS IVB、MPS IX透明质酸酶缺乏、MPS VI马洛托-拉米氏病(Maroteaux-Lamy)、MPS VII斯赖综合征(Sly syndrome)、粘脂贮积病I/唾液酸沉积症、粘脂贮积病IIIC、粘脂贮积病IV型)、多硫酸酯酶缺乏、尼曼-皮克(Niemann-pick)氏病(A型、B型、C型)、神经元蜡样质脂褐质沉积症(Neuronal CeroidLipofuscinoses)(CLN6疾病(非典型的婴儿晚期、晚期发作型变体、早期青少年)、巴-斯-沃三氏(Batten-Spielmeyer-Vogt)/青少年NCL/CLN3病、Finnish变体婴儿晚期CLN5、詹-比二氏(Jansky-Bielschowsky)病/婴儿晚期CLN2/TPP1病、Kufs/成年发作NCL/CLN4疾病、北方(Northern)癫痫/变体婴儿晚期CLN8、桑-哈(Santavuori-Haltia)/婴儿CLN1/PPT病、β-甘露糖苷贮积症、庞皮(Pompe)病/糖原贮积病II型、致密性成骨不全症、桑德霍夫(Sandhoff)病/成人发作型/GM2神经节苷脂沉积症、桑德霍夫病/GM2神经节苷脂沉积症--婴儿型、桑德霍夫病/GM2神经节苷脂沉积症--青少年型、欣德勒(Schindler)病、萨拉病(Salladisease)病/唾液酸存积病、泰-萨克斯病(Tay-Sachs)/GM2神经节苷脂沉积症和/或沃尔曼(Wolman)病。在进一步的实施方案中，方法和材料的使用被用于治疗神经系统疾病，诸如瑞特氏综合症(Rett syndrome)以及神经系统损伤包括脊髓和脑创伤/损伤、中风和脑癌。
在一些方面，本公开的组合物包含是营养或保护因子的多肽。在一些实施方案中，上述营养或保护因子与本公开的纳米缀合物共同施用。在各种实施方案中，营养或保护因子的使用被用于本文预期的神经变性疾病，包括但不限于阿尔茨海默病、帕金森氏病、亨廷顿舞蹈病和神经系统损伤包括脊髓和脑创伤/损伤、中风和脑癌。已知的神经系统生长因子的非限制性实例包括神经生长因子(NGF)、脑衍生的神经营养因子(BDNF)、神经营养因子-3(NT-3)、神经营养蛋白-4/5(NT-4/5)、神经营养因子-6(NT-6)、睫状神经营养因子(CNTF)、神经胶质细胞系衍生的神经营养因子(GDNF)、成纤维细胞生长因子家族(例如，FGF's1-15)、白血病抑制因子(LIF)、胰岛素样生长因子家族的某些成员(例如，IGF-1)、神经营养因子(neurturin)、persephin、骨形态发生蛋白(BMP)、免疫亲和素、生长因子的转化生长因子(TGF)家族、神经调节蛋白、表皮生长因子(EGF)、血小板衍生的生长因子(PDGF)、血管内皮生长因子家族(例如，VEGF165)、卵泡抑素和Hifl。同样预期锌指转录因子，其调节本文预期的每个营养或保护因子。在进一步的实施方案中，调节神经免疫功能的方法被预期，包括但不限于，通过siRNA、shRNA、反义或miRNA，通过例如，NFκB抑制，或NFκB神经保护(在不同细胞类型中NFκB和相关途径的双重作用)来抑制小神经胶质细胞和星形胶质细胞活化。本领域的技术人员应理解的是，在各种实施方案中，任何一种或多种上述抑制性RNA与本文所述的纳米缀合物相关联。
在又进一步的实施方案中，纳米缀合物包含特异性杂交并抑制Bcl-2家族成员的多核苷酸。在一个实施方案中，Bcl-2家族成员是Bcl2L12。
在一些实施方案中，本公开的材料和方法的使用被用于神经变性病症诸如帕金森氏病。在各种实施方案中，所述纳米缀合物与芳族酸多巴脱羧酶(AADC)、酪氨酸羟化酶、GTP-环化水解酶1(gtpch1)、凋亡抑制剂(例如，bcl2、bclxL)、神经胶质细胞系衍生的神经营养因子(GDNF)、抑制性神经递质-氨基丁酸(GABA)和多巴胺生物合成中涉及的酶共同施用。在进一步的实施方案中，纳米缀合物与改性剂Parkin和/或突触囊泡核蛋白(synuclein)共同施用。
在一些实施方案中，本公开的材料和方法被用于神经变性疾病诸如阿尔茨海默病。在进一步的实施方案中，用于增加乙酰胆碱生产的方法被预期。在又进一步的实施方案中，增加胆碱乙酰转移酶(ChAT)水平或抑制乙酰胆碱酯酶(AchE)活性的方法被预期。
在一些实施方案中，纳米缀合物包含多核苷酸，其通过siRNA、shRNA、反义和/或miRNA抑制突变的亨廷顿蛋白(htt)表达，用于治疗神经变性疾病诸如亨廷顿舞蹈病。
在一些实施方案中，本公开的材料和方法的使用被用于神经变性疾病诸如ALS。在一些方面，用本公开所预期的实施方案的治疗导致疾病的分子标记物，诸如TNFα、一氧化氮、过氧化亚硝酸盐和/或一氧化氮合酶(NOS)的表达减少。
在其它方面，纳米缀合物包含指向诸如ALS的超氧化物歧化酶的突变蛋白质的短发夹RNA。
在一些实施方案中，本公开的材料和方法的使用被用于预防或治疗神经发育病症诸如瑞特氏综合症。对于涉及瑞特氏综合症的实施方案，纳米缀合物与甲基胞嘧啶结合蛋白2(MeCP2)共同施用。
抑制基因表达的方法
本公开提供的其它方法包括抑制由靶多核苷酸表达的基因产物的表达的方法，其包括使靶多核苷酸与本文所述的组合物接触，其中所述接触足以抑制基因产物的表达。基因产物的抑制来源于靶多核苷酸与本公开的组合物的杂交。
本领域可理解，为了与其靶多核苷酸特异性杂交，作为纳米缀合物的一部分的多核苷酸的序列不必与其靶多核苷酸100％互补。此外，作为纳米缀合物的一部分的多核苷酸可经一个或多个片段与靶多核苷酸杂交，以致其间的或相邻的片段不涉及杂交事件中(例如并不限于，环结构或发夹结构)。互补性百分比经作为纳米缀合物的一部分的多核苷酸的长度来确定。例如，假设包含多核苷酸的纳米缀合物，其中多核苷酸的20个核苷酸中的18个与总长为100个核苷酸的靶多核苷酸的20个核苷酸区互补，那么作为纳米缀合物的一部分的多核苷酸将是90％互补性。在这一实施例中，其余非互补核苷酸可与互补核苷酸成簇或散布，不必彼此连续或与互补核苷酸连续。作为纳米缀合物的一部分的多核苷酸与靶多核苷酸的百分比互补性可常规地使用本领域已知的BLAST程序(基本的局部比对检索工具)和PowerBLAST程序(Altschul等，J.Mol.Biol.,1990,215,403-410；Zhang和Madden,GenomeRes.,1997,7,649-656)来确定。
提供的抑制基因产物表达的方法包括其中与不存在包含多核苷酸的纳米缀合物时的基因产物的表达相比，靶向基因产物的表达被抑制至少约5％、至少约10％、至少约15％、至少约20％、至少约25％、至少约30％、至少约35％、至少约40％、至少约45％、至少约50％、至少约55％、至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或100％的那些。换句话说，提供的方法包括基本导致靶向基因产物表达的任何程度的抑制的那些。
体内抑制程度从体液样品，或从活检样品或通过本领域熟知的成像技术来确定。可选地，体外抑制程度在细胞培养测定中确定，该测定通常作为体内期望的来源于本文所述的组合物的使用的抑制程度的可预测的测量。本公开预期，靶多核苷酸的抑制用来评估对给定细胞的抑制作用。以非限制性实例的方式，可以研究基因产物的抑制作用，其中所述基因产物是信号转导通路的一部分。可选地，可以研究基因产物的抑制，其中推测所述基因产物参与细胞凋亡途径。
将理解，本文所述的任何方法可联合使用以达到希望的结果。例如但不限于，本文描述的方法可被组合以允许检测靶多核苷酸以及调节其表达。在一些实施方案中，这种组合可用于定量体外或体内靶多核苷酸表达随时间的抑制。一方面，通过在指定时间点从培养物中除去细胞并评估在每个时间点靶多核苷酸表达的相对水平来实现随时间的定量。一方面，通过可检测标签的可视化评估，靶多核苷酸的数量随时间减少表明靶多核苷酸的抑制速率。
因此，确定杂交并抑制靶多核苷酸表达的给定多核苷酸的有效性，以及确定给定多核苷酸对细胞的抑制作用，是预期的方面。
纳米缀合物作为探针的用途
所述纳米缀合物，一方面，在检测核酸或细胞的诊断性测定中被用作探针。
检测靶向核酸的方法的一些实施方案使用基底。可以使用任何允许观察可检测的变化的基底。合适的基底包括透明固体表面(例如，玻璃、石英、塑料和其它聚合物)、不透明固体表面(例如，白色固体表面，诸如TLC硅胶板、滤纸、玻璃纤维过滤器、硝酸纤维素膜、尼龙膜)和导电固体表面(例如，铟-锡-氧化物(ITO))。基底可以是任何形状和厚度，但通常是平的和薄的。优选的是透明基底诸如玻璃(例如，载玻片)或塑料(例如，微量滴定板的孔)。将多核苷酸连接至基底和关于纳米缀合物其使用的方法，公开于美国专利申请20020172953，其通过引用整体并入本文。
通过使用基底，可检测的变化可被放大并且测定的灵敏度增加。一方面，该方法包括使靶多核苷酸与具有与其连接的多核苷酸的基底接触的步骤，所述多核苷酸(i)具有与靶向核酸的序列的第一部分互补的序列，在使基底上的多核苷酸与靶向核酸杂交的有效条件下实施接触步骤，和(ii)使结合至基底的靶向核酸与具有与其连接的多核苷酸的第一类纳米缀合物接触，所述多核苷酸具有与靶向核酸序列的第二部分互补的序列，在使作为纳米缀合物的一部分的多核苷酸与靶向核酸杂交的有效条件下实施接触步骤。接着，与基底结合的第一类型的纳米缀合物与包含多核苷酸的第二类型的纳米缀合物接触，在具有与多核苷酸序列的至少一部分互补的序列的第二类型的纳米缀合物上的多核苷酸用于生产第一类型的纳米缀合物，在使第一和第二类型的纳米缀合物上的多核苷酸杂交的有效条件下实施接触步骤。最后，由这些杂交产生的可检测的变化被观察到。
纳米缀合物上的多核苷酸与核酸杂交发生的可检测的变化可以是颜色变化、纳米缀合物聚集体的形成、放射性标记的检测或聚集的纳米缀合物的沉淀。颜色变化可用肉眼或频谱观察。纳米缀合物聚集体的形成能通过电子显微镜或通过浊度测定法观察。聚集的纳米缀合物的沉淀可用肉眼或显微镜观察。优选的是用肉眼观察的变化。特别优选的是用肉眼观察的颜色变化。
基于用肉眼观察颜色变化的检测靶向核酸杂交的方法廉价、快速、简单、坚固(试剂稳定)、不需要专门或昂贵的设备，并且几乎不需要仪器。这些优势使它们特别适用于，例如，DNA测序研究和分析实验室、检测特定病原体的存在的领域、用于快速识别感染有助于开处方药物用于治疗的医生的办公室、用于廉价的第一线筛选的家庭和健康中心。
包含多核苷酸的纳米缀合物可用于检测以靶向感兴趣的目标分子。因此，包含多核苷酸的纳米缀合物可用于诸如生物条形码测定的检测。参见，例如，美国专利No.6,361,944；6,417,340；6,495,324；6,506,564；6,582,921；6,602,669；6,610,491；6,678,548；6,677,122；6682,895；6,709,825；6,720,147；6,720,411；6,750,016；6,759,199；6,767,702；6,773,884；6,777,186；6,812,334；6,818,753；6,828,432；6,827,979；6,861,221；和6,878,814，其公开内容通过引用并入本文。
在一些实施方案中，本公开的组合物用于纳米闪光(nano-flare)技术。纳米闪光先前已描述于多核苷酸-官能化的纳米颗粒的上下文中，其可利用用于活细胞内的多核苷酸水平的荧光检测的sicPN结构(描述于WO2008/098248和美国专利申请公开号U.S.2011/0111974，其每个通过引用并入本文)。在这个系统中，sicPN用作“闪光”并且被可检测地标记和通过输入的靶多核苷酸从表面分离或释放。因此预期纳米闪光技术用于本文所述的纳米缀合物的上下文。
剂量和药物组合物
应理解，本文所述的任何组合物可以治疗有效量施用于哺乳动物以达到所需的治疗效果。
本文所述的组合物可与药学上可接受的赋形剂、载体或稀释剂配制成药物组合物。所述化合物或组合物可经任何途径施用，允许治疗例如但不限于，本文所述的疾病、病症或感染。根据情况，药物组合物应用或滴注入体腔、通过皮肤或粘膜吸收、摄取、吸入、和/或引入到循环中。在一些实施方案中，包含纳米缀合物的组合物经静脉内、动脉内或腹膜内施用以将组合物引入到循环中。非静脉内施用也是合适的，特别是对于低分子量的治疗剂。在某些情况下，需要外周、口服、局部、舌下、阴道、直肠递送包含纳米缀合物的药物组合物；通过脑内(内部-实质)、脑室内、肌内、眼内、门脉内(intraportal)、病灶内、髓内、鞘内、心室内、经皮、皮下、鼻内、尿道或肠内方法注射；通过持续释放系统；或通过植入装置。
施用可采用单剂量施用形式，或者实施方案的所述化合物可在一段时间内以分份的剂量或单剂量施用。然而，实施方案的化合物施用于受试者，施用的化合物的量和选择的施用途径可以被选择以允许有效地治疗所述疾病病状。还预期施用治疗剂组合(即，联合治疗)，并且在这些实施方案的一些中，治疗剂的至少一种与本文所述的纳米缀合物联合。
在神经胶质瘤细胞系和/或患者来源的肿瘤神经球(TNS)中研究纳米缀合物的实施方案中，预期施用约0.1nM至约10nM、或约0.5nM至约8nM、或约1nM至约10nM、或约0.1nM至约0.5nM、或约0.1nM至约5nM。在特定的实施方案中，预期将约0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10nM或更多的纳米缀合物施用于神经胶质瘤细胞系和/或患者来源的TNS。在一些实施方案中，纳米缀合物的施用进行约24-48、或约24-36、或约24-40、或约36-48、或约24、约30、约36、约40、或约48小时或更长。
在进一步的实施方案中，如本文所述的纳米缀合物组合物的施用为约1mg/kg至约50mg/kg、或约5mg/kg至约50mg/kg、或约5mg/kg至约30mg/kg、或约5mg/kg至约20mg/kg、或约5mg/kg至约10mg/kg。在一个实施方案中，所述施用是静脉内施用，并且施用的纳米缀合物组合物的数量为7mg/kg。在进一步的实施方案中，所述纳米缀合物组合物是每天、每周或每月施用。在一些实施方案中，每天给予单次施用。在进一步的实施方案中，纳米缀合物组合物和/或治疗剂的2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多次施用是每天、或每隔一天、或每周、或每月给予。
纳米缀合物组合物与本文所述的治疗剂的施用被预期，在各种实施方案中，将同时开始，或者治疗剂将在纳米缀合物组合物后1、2、3、4、5、6、7、8、9、10天或更多天施用。在可选的实施方案中，治疗剂将在纳米缀合物组合物施用前1、2、3、4、5、6、7、8、9、10天或更多天施用。对于给定情况下组合物的治疗和预防有效量可在医师的技巧和判断内通过常规实验来确定。例如但不限于，施用的替莫唑胺的量为约10mg/kg、或约20mg/kg、或约30mg/kg、或约40mg/kg、或约50mg/kg或更多。
在一个实施方案中，根据具体的施用方式和剂型，将药物组合物与药学上可接受的赋形剂诸如载体、溶剂、稳定剂、佐剂和/或稀释剂一起配制。药物组合物通常应当配制以达到生理学相容的pH，并且范围可从pH约3至pH约11，优选地约pH3至约pH7，这取决于制剂和施用途径。在可选的实施方案中，可优选将pH调节为约pH5.0至约pH8的范围。更具体地，在各方面药物组合物包含治疗或预防有效量的至少一种如本文所述的组合物，以及一种或多种药学上可接受的赋形剂。如本文所述，药物组合物可任选地包含本文所述的化合物的组合。
术语“药学上可接受的赋形剂”是指用于药剂施用的赋形剂，诸如本文所述的化合物。该术语是指施用时没有不适当的毒性的任何药物赋形剂。
药学上可接受的赋形剂通过施用的特殊组合物，以及通过用于施用组合物的特殊方法被部分确定。因此，存在各种药物组合物的广泛的合适的制剂(参见，例如，Remington's Pharmaceutical Sciences)。
合适的赋形剂可以是载体分子，其包括大的、缓慢代谢的大分子，诸如蛋白质、多糖、聚乳酸、聚乙醇酸、聚合氨基酸、氨基酸共聚物和灭活病毒颗粒。其它示例性的赋形剂包括抗氧化剂(例如，抗坏血酸)、螯合剂(例如，EDTA)、碳水化合物(例如，糊精、羟烷基纤维素和/或羟基烷基甲基纤维素)、硬脂酸、液体(例如，油、水、盐水、甘油和/或乙醇)润湿剂或乳化剂、pH缓冲物质等。
此外，药物组合物可以是无菌可注射制剂形式，诸如无菌可注射水合乳剂或油质混悬剂。通过本领域的普通技术人员使用合适的分散剂或湿润剂和悬浮剂可配制这种乳剂或混悬剂。无菌可注射制剂也可以为无毒、肠胃外可接受的稀释剂或溶剂中的无菌可注射的溶液或混悬剂，诸如1,2-丙二醇中的溶液。
无菌可注射制剂还可以制备成冻干粉末。此外，通常采用无菌不挥发性油作为溶剂或悬浮介质。对于这个目的，可采用任何温和不挥发性油，包括合成的单甘油酯或二甘油酯。此外，脂肪酸(例如，油酸)也可用于可注射液的制备。
试剂盒
还提供了包括本公开的组合物的试剂盒。在一个实施方案中，试剂盒包括至少一个容器，所述容器保存本文所述的包含本文所述的一种或多种生物分子的纳米缀合物的至少一种类型。在其中该生物分子是多核苷酸的本公开的各方面，预期作为纳米缀合物第一类型的一部分的多核苷酸具有一个或多个与靶多核苷酸的第一部分的一个或多个序列互补(或如本文所公开的充分互补)的序列。容器任选地包括一个或多个额外类型的包含多核苷酸的纳米缀合物，其序列与靶多核苷酸的第二部分的一个或多个序列互补。
在另一个实施方案中，试剂盒包括至少两个容器。第一容器保存一种或多种本文所公开的纳米缀合物，该纳米缀合物包含能与靶多核苷酸的一个或多个部分结合的一种或多种本文所述的多核苷酸。第二容器保存一种或多种纳米缀合物，该纳米缀合物包含能与靶多核苷酸的相同或不同部分的一个或多个序列结合的一种或多种多核苷酸。
在另一个实施方案中，试剂盒在分开的容器中含有多核苷酸和纳米颗粒，并且所述纳米缀合物在用于本文所述的方法之前被生产。一方面，所述多核苷酸和/或纳米颗粒被官能化，以致可产生所述纳米缀合物。可选地，试剂盒中提供了不含官能团的多核苷酸和/或纳米颗粒，在此情况下在进行分析之前必须将它们官能化。
在提供的试剂盒的各方面，多核苷酸包括标签，或者该试剂盒包括可附着于所述多核苷酸的标签。可选地，该试剂盒包括标记的纳米颗粒或可附着于该纳米颗粒的标签。在每个实施方案中，该试剂盒任选地包括指示、每个容器含有标签、试剂盒本身包括标签、试剂盒任选地包括一个或多个非特异的多核苷酸(用作对照)。
实施例
实施例1
在人脑肿瘤干细胞(BTSC)和衍生的原位异种移植物中，Bcl-2样蛋白12(Bc12L12)表达和活化的受体酪氨酸激酶(RTK)的概要被评估(图1)。根据以前对主要GBM肿瘤标本的研究[Stegh等，Genes Dev.21:98-111(2007)]，在大部分测试的BTSC中鉴定了Bcl2L12的高水平表达，并且具有高表达的Bcl2L12的BTSC细胞系18(huBTSC_18)被选择用于初始功能性研究(图1A)。此外，确定了在神经胶质瘤细胞中和在它们相应的原位外植体中多个RTK是被共同激活的(图1B)。值得注意的是，体外神经胶质瘤细胞系中RTK的活化曲线主要保持在外植体肿瘤-BTSC衍生的移植物，与相应的培养物相比表现出更加独特的RTK签名，表明肿瘤微环境显著影响BTSC-引发的肿瘤的肿瘤内RTK活化状态。
实施例2
用于治疗开发，生成Bcl2L12靶向RNAi金纳米颗粒(RNA-Au NP；如本文所述的纳米缀合物)并筛选其在神经胶质瘤细胞系和huBTSC_18中敲除内源Bcl2L12的能力。能减少Bcl2L12mRNA水平40％的Bcl2L12-RNA-纳米缀合被鉴定(图2A)和Bcl2L12蛋白丰度60-95％(图2B)-L12-1-和L12-2-RNA纳米缀合物。随后，加强中和LN235细胞中Bcl2L12蛋白表达的纳米缀合物浓度(0.1nM)被测定(图2B)，其与需要获得类似作用的100nM的常规的脂质体-DNA复合物(Lipoplex)-递送的siRNA寡核苷酸(图2C)相比，表明RNAi-官能化的纳米缀合物在使基因表达沉默中比常规方法显著更有效。重要的是，BTSC中类似的高度可靠的KD功效和已证实纳米缀合物治疗后Bcl2L12蛋白敲除持续多达5天被确立(图2D)。最后，如图所示Bcl2L12-靶向的siRNA和shRNA[Stegh等，Genes Dev.21:98-111(2007)]，Bcl2L12的纳米缀合物介导的敲除导致效应器半胱天冬酶活化增强，如对活性半胱天冬酶-3和-7的蛋白质印迹分析所证明(图2E)，证实纳米缀合物-驱动的Bcl2L12敲除的功能性。
敲除第二靶点的证明：为了进一步证明细胞中RNA-纳米缀合物有效地使基因表达沉默的能力，Bc12L12下游效应器aB-晶体蛋白(CRYAB)被选择作为第二原型神经胶质瘤基因(gliomagenic)靶点。aB-晶体蛋白(CRYAB)被Bcl2L12转录诱导并用于促进肿瘤细胞迁移/侵袭和抑制效应器半胱天冬酶-3活化。图3示出了内源性aB-晶体蛋白的RNA-纳米缀合物介导的敲除(图3A；比较RNA-纳米缀合物(10nM)和siRNA/脂质体-DNA复合物介导的敲除(100nM))、降低的侵袭性质(图3B)和神经胶质瘤细胞的基于αB-晶体蛋白消融的增强的半胱天冬酶-3活化(图3C)。这些研究显示两种原型神经胶质瘤癌蛋白的有力敲除，其类似于逆转录病毒/脂质体-DNA复合物-递送的sh/siRNA对下游信号有效果和影响(即，半胱天冬酶活化和细胞侵袭)[Stegh等，Genes Dev.21:98-111(2007)；Stegh等，Proc Natl AcadSci U.S.A.105:10703-8(2008)]。
实施例3
在细胞培养物中已建立BCl2L12-和CRYAB-RNA-纳米缀合物的广泛的前-凋亡活性，在原位移植物和基因工程小鼠中RNA-纳米缀合物的功能性在体内进行验证。在基因工程化的神经胶质瘤小鼠模型中这些研究测试肿瘤消退。这些纳米缀合物的已知的细胞和组织摄取性质的扩大，RNA-纳米缀合物到正常和癌性颅内组织的渗透用文件证明，并且其基于IC注射的摄取入BTSC异种移植物被评价(图4)。在BTSC接种和Cy5-Au-NP施用后，解剖脑，并且冠状切片进行共聚焦荧光显微镜检查。图4A(下图)显示与U87MG移植物类似，在BTSC原位肿瘤外植体内RNA-纳米缀合物的强分散并且图4B显示荧光信号的颅内分散的定量。通过电感耦合等离子体质谱法(ICP-MS；图4C)，并且还通过使用多重模型、钆(Gd(III))-富集的多价DNA金纳米颗粒(DNA-Gd(III)-Au NP)缀合物(图4D)的磁共振(MR)成像证实颅内纳米缀合物摄取进入肿瘤和非肿瘤元件。
通过MR和相应的苏木精和伊红(H&E)图像证实了DNA-Gd(III)-纳米缀合物主要累积在颅内U87MG-异种移植物中(图4D，左图)。重要的是要注意，肿瘤细胞和DNA-Gd(III)-纳米缀合物被紧密邻近地注射入前囱，然而，肿瘤形成和DNA-Gd(III)-纳米缀合物的(肿瘤内)累积在前脑结构中是最显著的。这表明纳米缀合物沿前后轴迁移以选择性富集肿瘤元件。基于纳米缀合物的广泛的肿瘤内分散(参见图4D右图的用以定量评估DNA-Gd(III)-纳米缀合物所占据的颅内空间的MR图像的3D重建)，我们比较了使用颅内(I.C.)直接注射到脑与通过尾静脉系统性静脉内(I.V.)注射的小鼠脑中RNA-纳米缀合物的分布。与脑的其余部分相比，在异种移植的肿瘤中发现纳米缀合物的含量显著较高，重新确认纳米缀合物在肿瘤内累积增强(图5)。
最后，使用系统注射在体内的U87神经胶质瘤细胞系异种移植物中测试Bcl2L12-靶向的RNA-纳米缀合物对肿瘤消退的影响。发现平行于体外研究结果(见图2B，左图，U87MG)，用L12-2-纳米缀合物处理的小鼠显示出寿命的显著延长(p值＝0.01)解释为Bcl2L12蛋白的活性降低(图6)。L12-1-纳米缀合物对寿命没有显著影响(p值＝0.50)，并且不能有效敲除体外U87细胞系中的Bcl2L12。
根据各方面、实施方案和技术，所公开的主题已被描述。应理解，然而，可进行许多变化和修改而仍然保持在所公开的主题的精神和范围内。本文引用的所有参考文献在此通过引用整体并入，或如上下文可确定的以它们提供相关公开内容的程度并入。

Claims (30)

1.一种组合物在制造用于治疗患有多形性成胶质细胞瘤的患者的药物中的用途，所述组合物包含官能化纳米缀合物，所述纳米缀合物的质量至少为1千道尔顿，所述纳米缀合物包含具有与杂交的靶多核苷酸足够互补并抑制靶多核苷酸表达的序列的多核苷酸，其中所述靶多核苷酸是Bcl-2家族成员。
2.根据权利要求1所述的用途，其中所述组合物进一步包含治疗剂，和/或其中所述纳米缀合物包含是金属的纳米颗粒，和/或其中所述纳米缀合物包含是中空的纳米颗粒。
3.根据权利要求2所述的用途，其中所述治疗剂是替莫唑胺，和/或其中所述纳米颗粒为银、金、铂、铝、钯、铜、钴、铟或镍。
4.根据权利要求1-3中任一项所述的用途，其中所述纳米缀合物的质量至少为2千道尔顿。
5.根据权利要求1-3中任一项所述的用途，其中所述组合物包括含有纳米颗粒的纳米缀合物，所述纳米颗粒的平均直径为5nm至150nm。
6.根据权利要求1-3中任一项所述的用途，其中所述多核苷酸与所述纳米缀合物共价连接，和/或其中所述纳米缀合物的ζ电位测量值为-10毫伏(mV)至-50毫伏(mV)，和/或其中所述多核苷酸以至少0.3pmol/cm2的表面密度存在于所述纳米缀合物的表面上。
7.根据权利要求1所述的用途，其中所述Bcl-2家族成员是Bcl2L12。
8.根据权利要求1所述的用途，其中所述组合物仅施用一次。
9.根据权利要求1所述的用途，其中所述组合物施用频率不大于每周一次。
10.根据权利要求1所述的用途，其中所述患者是人。
11.根据权利要求1-3中任一项所述的用途，其中所述纳米缀合物的质量至少为3千道尔顿。
12.根据权利要求1-3中任一项所述的用途，其中所述纳米缀合物的质量至少为5千道尔顿。
13.根据权利要求1-3中任一项所述的用途，其中所述纳米缀合物的质量至少为10千道尔顿。
14.根据权利要求1-3中任一项所述的用途，其中所述纳米缀合物的质量至少为20千道尔顿。
15.根据权利要求1-3中任一项所述的用途，其中所述纳米缀合物的质量至少为30千道尔顿。
16.根据权利要求1-3中任一项所述的用途，其中所述纳米缀合物的质量至少为40千道尔顿。
17.根据权利要求1-3中任一项所述的用途，其中所述纳米缀合物的质量至少为50千道尔顿。
18.根据权利要求1-3中任一项所述的用途，其中所述纳米缀合物的质量至少为60千道尔顿。
19.根据权利要求1-3中任一项所述的用途，其中所述纳米缀合物的质量至少为70千道尔顿。
20.根据权利要求1-3中任一项所述的用途，其中所述纳米缀合物的质量至少为80千道尔顿。
21.根据权利要求1-3中任一项所述的用途，其中所述纳米缀合物的质量至少为90千道尔顿。
22.根据权利要求1-3中任一项所述的用途，其中所述纳米缀合物的质量至少为100千道尔顿。
23.根据权利要求1-3中任一项所述的用途，其中所述纳米缀合物的质量至少为200千道尔顿。
24.根据权利要求1-3中任一项所述的用途，其中所述纳米缀合物的质量至少为500千道尔顿。
25.根据权利要求1-3中任一项所述的用途，其中所述纳米缀合物的质量至少为700千道尔顿。
26.根据权利要求1-3中任一项所述的用途，其中所述纳米缀合物的质量至少为900千道尔顿。
27.根据权利要求1-3中任一项所述的用途，其中所述组合物包括含有纳米颗粒的纳米缀合物，所述纳米颗粒的平均直径为30nm至100nm。
28.根据权利要求1-3中任一项所述的用途，其中所述组合物包括含有纳米颗粒的纳米缀合物，所述纳米颗粒的平均直径为40nm至80nm。
29.根据权利要求1-3中任一项所述的用途，其中所述多核苷酸以至少2pmol/cm2的表面密度存在于所述纳米缀合物的表面上。
30.根据权利要求1-3中任一项所述的用途，其中所述多核苷酸以至少15pmol/cm2的表面密度存在于所述纳米缀合物的表面上。
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