JP2014526517A - 血液脳関門を通過することができるナノ抱合体 - Google Patents

Abstract

多価ナノ抱合体は、治療用途における極めて重要な課題に対処する。この単一体の標的治療薬は、血液脳関門（ＢＢＢ）を通過することができ、このため、中枢神経系（ＣＮＳ）障害の治療に有効である。さらに、ナノ抱合体の非常に高い細胞取り込みにもかかわらず、それらはこれまで試験された細胞型において毒性を示さない。本性質は、オフターゲット効果を低減するための治療薬送達用途において極めて重要である。一態様において、本開示はナノ抱合体を含む組成物を提供し、そのナノ抱合体は、中枢神経系（ＣＮＳ）障害で特異的に発現するポリペプチドをコードする標的ポリヌクレオチドに十分に相補的であるポリヌクレオチドを含み、血液脳関門（ＢＢＢ）を通過する能力を有する。
【選択図】なし

Description

関連出願の相互参照
本出願は、２０１１年９月１４日に出願された米国仮特許出願第６１／５３４，８５３号の、米国特許法第１１９条（ｅ）項に基づく優先権の利益を主張し、その開示は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
政府権益に関する記述

本発明は、国立衛生研究所／国立がん研究所より与えられた助成金番号Ｕ５４ ＣＡ１５１８８０のもと、政府の援助を受けて行われた。政府は、本発明においてある特定の権利を有する。

本開示は、血液脳関門を通過するナノ抱合体およびそれらの治療用使用方法を対象とする。

脳は、選ばれた分子にのみ到達を許可するという点で独特である。これは有用な防御機構であるが、また一方で、潜在的に有益な分子薬剤が中枢神経系（ＣＮＳ）へ到達することを妨げ、したがって、分子薬剤が多くの神経障害またはＣＮＳの他の状態において治療効果を発揮できないようにする。

血液脳関門（ＢＢＢ）は、脳への到達を厳しく制御することよって神経保護機能を実施し、その結果、それはまた脳組織への薬理作用のある物質の到達を妨げ、それらの通過のための媒介物の使用を必要とする。血液脳関門（ＢＢＢ）の浸透性はしばしば、薬物またはペプチドのＣＮＳへの透過性に対する律速因子である［非特許文献１、非特許文献２］。脳は、密着結合によって厳密に封止される脳毛細血管内皮細胞によって形成されるＢＢＢによって、潜在的な毒性物質から守られている。加えて、脳毛細血管は、他の器官の毛細血管と比べて、少数の卵円窓および少数のエンドサイトーシス小胞を有する［非特許文献１］。受容体媒介性トランスサイトーシス（ＲＭＴ）によって取り込まれるトランスフェリン、ラクトフェリン、および低比重リポタンパク質等の一部の特定のタンパク質を除いて、大きい親水性分子がＢＢＢを横断して通過することはほとんどない［非特許文献１、非特許文献３、非特許文献４、非特許文献５、および非特許文献６］。
悪性神経膠腫（ＭＧ）は、最も蔓延している致死性の中枢神経系原発性癌である。最も高いグレードのＭＧであるグレードＩＶ多形膠芽細胞腫（ＧＢＭ）と診断された患者は、外科的切除および積極的な治療計画にもかかわらず、診断後９〜１２カ月しか生存することができない。統合的化学療法（テモゾラミド（ｔｅｍｏｚｏｌａｍｉｄｅ）（ＴＭＺ））を用いた放射線を使用する集学的アプローチは、患者の最大１４．６カ月の生存という微々たる増加しかもたらしていない。さらに、再発は極めて一般的であり、そのような進行に対する救済療法は効果がない。ＧＢＭは、特に、高い抗治療性癌幹細胞集団（脳腫瘍幹細胞、ＢＴＳＣ）のためおよび分類される遺伝子異常が疾患の表現型特徴をどのように決定付けるかの不完全な理解のために、依然として非常に不可解な難病である。それは、病勢盛んな腫瘍内の神経新生にもかかわらず、懸命な治療（アポトーシス）に対しても強い耐性がある。他の悪性腫瘍に有効であることが証明されている標的化受容体チロシンキナーゼ阻害剤を用いた高いグレードの神経膠腫の治療における継続的な失敗は、神経膠腫薬物開発のすべての側面の再評価を促し、疾患に対抗するための革新的な技術プラットフォームを開発し、かつ細胞培養に基づく生体内モデルシステムを改良する包括的な必要性を強調した。

Ｐａｒｄｒｉｄｇｅ，Ｎｅｕｒｏｖｉｒｏｌ．５：５５６−５６９（１９９９） Ｂｉｃｋｅｌ ｅｔ ａｌ．，Ａｄｖ．Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖ．Ｒｅｖ．４６：２４７−２７９（２００１） Ｔｓｕｊｉ ｅｔ ａｌ．，Ａｄｖ．Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖ．Ｒｅｖ．３６：２７７−２９０（１９９９） Ｋｕｓｕｈａｒａ ｅｔ ａｌ．，Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖ．Ｔｏｄａｙ ６：１５０−１５６（２００１） Ｄｅｈｏｕｃｋ ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１３８：８７７−８８９（１９９７） Ｆｉｌｌｅｂｅｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７４：７０１１−７０１７（１９９９）

多価ナノ抱合体は、複数の段階において上述の極めて重要な課題に対処する。この単一体の標的治療薬は、血液脳関門（ＢＢＢ）を通過することができ、このため、中枢神経系（ＣＮＳ）障害の治療に有効である。さらに、ナノ抱合体の非常に高い細胞取り込みにもかかわらず、それらはこれまで試験された細胞型において毒性を示さない（以下の表１を参照されたい）。本性質は、オフターゲット効果を低減するための治療薬送達用途において極めて重要である。

表１に示される細胞型の一部は、脳／神経系の細胞であるが、データは生体外実験から収集された。

一態様において、本開示はナノ抱合体を含む組成物を提供し、そのナノ抱合体は、中枢神経系（ＣＮＳ）障害で特異的に発現するポリペプチドをコードする標的ポリヌクレオチドに十分に相補的であるポリヌクレオチドを含み、血液脳関門（ＢＢＢ）を通過する能力を有する。一部の実施形態において、組成物は、標的化部分をさらに含む。種々の実施形態において、障害は、異常な遺伝子発現によって引き起こされる。一部の実施形態において、組成物は治療薬をさらに含み、さらなる実施形態において、治療薬はテモゾラミドである。一部の実施形態において、ナノ抱合体は、標的化部分および／または治療薬をさらに含む。

さらなる実施形態において、障害は、急性および／または慢性であると企図される。

一部の実施形態において、急性障害は、局所脳虚血、全脳虚血、脳外傷、脊髄損傷、急性感染症、てんかん重積症、片頭痛、急性精神病、自殺性鬱病および急性不安／恐怖症、ならびに外傷性脳損傷および腫れを含むがこれらに限定されない傷害関連の病気から成る群から選択される。さらなる実施形態において、慢性障害は、慢性神経変性、網膜変性、鬱病、慢性情動障害、リソソーム蓄積障害、脳の慢性感染症、脳癌、卒中リハビリテーション、先天性代謝異常、自閉症、および精神遅滞から成る群から選択される。

さらなる実施形態において、ナノ抱合体は、少なくとも約４００、約６００、約８００、約１０００、約１２００ダルトン以上の質量を有する。一部の実施形態において、ナノ抱合体は、少なくとも約１、約２、約３、約５、約１０、約２０、約３０、約４０、約５０、約６０、約７０、約８０、約９０、約１００、約２００、約５００、約７００、約９００キロダルトン以上の質量を有する。

一部の実施形態において、本開示のナノ抱合体は、約−１０ミリボルト（ｍＶ）〜約−５０ミリボルト（ｍＶ）のゼータ電位（表面電荷）測定値を有する。さらなる実施形態において、ナノ抱合体は、約−１０ｍＶ〜約−４０ｍＶ、または約−１０ｍＶ〜約−３０ｍＶ、または約−２０ｍＶ〜約−５０ｍＶ、または約−２０ｍＶ〜約−４０ｍＶ、または約−３０ｍＶ〜約−４５ｍＶ、または約−３０ｍＶ〜約−５０ｍＶのゼータ電位測定値を有する。一部の実施形態において、ナノ抱合体は約−１０ｍＶ、約−１５ｍＶ、約−２０ｍＶ、約−２５ｍＶ、約−３０ｍＶ、約−３５ｍＶ、約−４０ｍＶ、約−４５ｍＶ、約−５０ｍＶ、または約−６０ｍＶのゼータ電位測定値を有する。

一態様において、本開示は、血液脳関門を横断することができる組成物を必要としている患者を治療する方法であって、患者に機能性ナノ抱合体を含む治療上有効量の組成物を投与することを含む方法を提供し、ナノ抱合体は、標的ポリヌクレオチドとハイブリッド形成し、かつその発現を阻害するように、標的ポリヌクレオチドに十分に相補的である配列を有するポリヌクレオチドを含む。本開示の態様または実施形態のいずれかにおいて、患者は、ヒトであると企図される。

別の態様において、本開示は、機能性ナノ抱合体を含む組成物を患者に投与する方法であって、方法は、患者に治療上有効量の組成物を投与することを含み、ナノ抱合体が、標的ポリヌクレオチドとハイブリッド形成し、かつその発現を阻害するように、標的ポリヌクレオチドに十分に相補的である配列を有するポリヌクレオチドを含み、該組成物が、血液脳関門を横断する能力を有し、ならびに患者が、血液脳関門を横断することができる組成物を必要としている、方法を提供する。

本開示の態様または実施形態のいずれかにおいて、本明細書に記載される組成物は、治療薬をさらに含む。本開示の態様または実施形態のいずれかにおいて、患者は、中枢神経系（ＣＮＳ）障害に罹っている。本開示の態様または実施形態のいずれかにおいて、患者は、異常な遺伝子発現によって引き起こされる障害に罹っている。

一部の実施形態において、患者は、急性および／または慢性障害に罹っている。患者が急性障害に罹っている実施形態において、急性障害は、局所脳虚血、全脳虚血、脳外傷、脊髄損傷、急性感染症、てんかん重積症（ＳＥ）、片頭痛、急性精神病、自殺性鬱病および急性不安／恐怖症、ならびに外傷性脳損傷および腫れを含むがこれらに限定されない傷害関連の病気から成る群から選択されるとさらに企図される。

患者が慢性障害に罹っている実施形態において、慢性障害は、慢性神経変性、網膜変性、鬱病、慢性情動障害、リソソーム蓄積障害、脳の慢性感染症、脳癌、卒中リハビリテーション、先天性代謝異常、自閉症、および精神遅滞から成る群から選択されるとさらに企図される。

一部の実施形態において、本開示の組成物は、１回のみ投与される。一部の実施形態において、本開示の組成物は、週に約１回を超えない頻度で投与される。

別の態様において、本開示は、（ａ）任意に容器中にナノ抱合体またはナノ抱合体を含む組成物、（ｂ）任意に追加の治療薬、ならびに（ｃ）本明細書に開示される方法もしくは実施形態のいずれかを指示する、あるいは開示する添付文書、パッケージラベル、使用説明書または他のラベルを含むパッケージまたはキットを提供する。

選択された神経膠腫、ＢＴＳＣ株、および外植片中のＢｃｌ２Ｌ１２発現（Ａ）およびＲＴＫ活性プロファイル（Ｂ）を示す。 ＲＮＡナノ抱合体が、Ｂｃｌ２Ｌ１２発現を有効に発現停止することを示す。（ＡおよびＢ）神経膠腫細胞株およびｈｕＢＴＳＣ＿１８を、指示される量のＲＮＡナノ抱合体（対照（Ｃｏ）／組み換えられたＲＮＡ配列−ＲＮＡ−ＡｕＮＰ、対照ＲＮＡナノ抱合体、ならびにＢｃｌ２Ｌ１２標的化ＲＮＡナノ抱合体（Ｌ１２−１−およびＬ１２−２−ＲＮＡナノ抱合体））で処置し、ｑＲＴ−ＰＣＲ（Ａ）およびウエスタンブロット（Ｂ）分析にかけた。Ｂｃｌ２Ｌ１２およびＨｓｐ７０の移動位置が示される。＊で標識した帯は、翻訳後に修飾されるＢｃｌ２Ｌ１２を表す。（Ｃ）ノックダウン活性を従来のリポプレックス送達ｓｉＲＮＡと比較した。（Ｄ）ノックダウン持続性の研究のため、ＬＮ２３５細胞をＬ１２−ＲＮＡナノ抱合体（１ｎＭ）で５日間処置し、抗Ｂｃｌ２Ｌ１２ウエスタンブロット分析にかけた。（Ｅ）Ｂｃｌ２Ｌ１２のＲＮＡナノ抱合体媒介性ノックダウンは、増強されたカスパーゼ活性をもたらす。対照ナノ抱合体、Ｌ１２−１ナノ抱合体、およびＬ１２−２ナノ抱合体で処置されるＬＮ２３５細胞を、示される期間中、スタウロスポリン（ＳＴＳ、５００ｎＭ）で処置し、溶解し、活性カスパーゼ３および７のウエスタンブロット分析にかけた。活性サブユニット（大型（ＬＳ）、大型および大型＋Ｎペプチド（ＬＳ＋Ｎ））ならびにＨｓｐ７０（負荷対照）の移動位置が示される。ヒストグラムは、対応するウエスタンブロットのデンシトメトリー分析によって評価されるように、Ｂｃｌ２Ｌ１２発現を数量化する。 低下した浸潤能をもたらし、ＳＴＳに煽動されるアポトーシスに対する感受性を上昇するＬＮ２３５細胞中のａＢ−クリスタリンの中和を示す。（Ａ）ＬＮ２３５細胞を、ａＢ−クリスタリン標的化ナノ抱合体またはｓｉＲＮＡで処置し、溶解し、かつａＢ−クリスタリンおよびＨｓｐ７０特異的抗体を使用してウエスタンブロット分析にかけた。（Ｂ）ＣＲＹＡＢおよび対照ＲＮＡナノ抱合体で処置された細胞を、マトリゲル浸潤アッセイにかけ、浸潤する細胞の数をトリパンブルー染色によって数量化した。（Ｃ）対照ＣＲＹＡＢ−１−およびＣＲＹＡＢ−２−ＲＮＡナノ抱合体で処置されたＬＮ２３５細胞を処置し、図２Ｅ（ＬＳ（大型サブユニット）、ＬＳ＋Ｎ（大型サブユニット＋Ｎペプチド））に記載されるように分析した。ヒストグラムは、対応するウエスタンブロットのデンシトメトリー分析によって評価されるように、Ｂｃｌ２Ｌ１２発現を数量化する。 Ｃｙ５で標識化されるＡｕ−ＮＰの共焦点免疫蛍光法によって評価されるように、ナノ抱合体の腫瘍内の取り込みを示す。 連続した冠状切片の共焦点ＩＦ画像を使用して経時的にみられる分散の数量化を示す。 ＩＣＰ−ＭＳによって評価されるように、ナノ抱合体の腫瘍内の取り込みを示す。 正常な脳および外植片構造内に局所的に送達されるＤＮＡ−Ｇｄ（ＩＩＩ）ナノ抱合体のＭＲＩによって評価されるように、ナノ抱合体の腫瘍内の取り込みを示す。 ＩＣＰ−ＭＳ（Ａ）対照ＲＮＡナノ抱合体（５μ１、３００ｎＭ）の直接頭蓋内（ＬＣ．）送達によって評価されるように、頭蓋内対静脈内投与のナノ抱合体の腫瘍内の取り込みを示す。ナノ抱合体を一回局所的に送達し、次いで、脳および腫瘍組織を投与４８時間後収集する。（Ｂ）対照ＲＮＡナノ抱合体（１００μｌ、３００ｎＭ）の全身静脈内（Ｉ．Ｖ．）注射。４８時間毎に４回のナノ抱合体の注射。４回目の注射の２４時間後、組織を収集した。 腫瘍マウスの生存におけるＲＮＡナノ抱合体の効果を示す。対照、Ｌ１２−１、およびＬ１２−２のＲＮＡナノ抱合体を、尾静脈注射（Ｉ．Ｖ．）を介してマウスに投与した。各マウスは、５回の注射を受けた（総量７ｍｇ／ｋｇとなる１注射当たり１．４ｍｇ／ｋｇのＲＮＡの処置、５００ｎＭで約１５０〜２００μ１のＲＮＡナノ抱合体）。対照とＬ１２−１−ＲＮＡナノ抱合体処置群との間に、生存日数の差は見られなかった（ｐ＝０．５０）。しかし、対照とＬ１２−２−ＲＮＡナノ抱合体処置群との間では著しい差が得られた。（ｐ＝０．０１）．

血液脳関門は、中枢神経系への多くの末梢性投与剤の送達における律速因子である。本開示は、ＢＢＢを通過することができ、ＢＢＢを横断した時点でそれらの活性を保持するナノ抱合体を提供する。本発明の種々の態様は、これらと関連する１つ以上の生体分子を有するナノ抱合体を提供することによってこれらの要因に対処する。一部の実施形態において、ナノ抱合体は、さらに治療薬と結合されるか、あるいは同時投与される。

本明細書で使用される場合、「治療」または「治療する」は、治療的利益および／または予防的利益を達成することを含む。治療的利益によるとは、根底にある治療される障害または状態の根絶または寛解を意味する。例えば、神経障害を持つ個人において、治療的利益は、部分的もしくは完全な障害の進行の停止、または部分的もしくは完全な障害の回復を含む。また、治療的利益は、患者がまだその状態に冒され得る事実にもかかわらず、患者において改善が得られるように、根底にある状態に関連する生理学的もしくは心理的な症状のうちの１つ以上の根絶または寛解でも達成される。治療の予防的利益は、状態の防止、状態の進行を遅らせること（例えば、神経障害の進行を緩徐化する）、または状態の発生の可能性を減少させることを含む。本明細書で使用される場合、「治療する」または「治療」は、予防を含む。

一部の実施形態において、ナノ抱合体は、「末梢性に投与される」か、あるいは「末梢性投与される」である。本明細書で使用される場合、これらの用語は、任意に治療薬と同時投与される個人への任意の形態のナノ抱合体の投与を指し、それはＣＮＳへの直接投与ではなく、すなわち、血液脳関門の非脳側と接触して薬剤をもたらす。「末梢投与」は、本明細書で使用される場合、静脈内、皮下、筋肉内、腹腔内、経皮、吸入、経頬、鼻腔内、直腸内、および経口投与を含む。

本明細書で使用される場合、「ハイブリダイゼーション」は、ワトソンクリックＤＮＡ相補性、フーグスティーン結合、あるいは当技術分野で知られている他の配列特異的結合の規則に従う水素結合による２つまたは３つの核酸のストランドの間の相互作用を意味する。ハイブリダイゼーションは、当技術分野で知られている異なるストリンジェンシー状態下で行われ得る。「特異的にハイブリッド形成する」とは、本明細書で使用される場合、相補的な、または実質的に相補的なポリヌクレオチドストランド間の安定化された二本鎖を可能にするハイブリダイゼーションのことである。例えば、２１のヌクレオチド単位を有するポリヌクレオチドストランドは、別の２１のヌクレオチド単位のポリヌクレオチドと塩基対をつくることができるが、「二本鎖」が１９の塩基対であるように、各ストランド上の１９の塩基のみが相補的または十分に相補的である。残りの塩基は、例えば、５’および／または３’のオーバーハングとして存在し得る。さらに、二本鎖内で１００％の相補性は必要ではなく、実質的な相補性が二本鎖内で許容可能である。十分な相補性とは、７５％以上の相補性を指す。例えば、１９の塩基対から成る二本鎖でのミスマッチは９４．７％の相補性をもたらし、二本鎖を十分相補的にしている。

用語「治療上有効量」は、本明細書で使用される場合、確認された疾患もしくは状態を治療する、寛解させる、または防止するか、あるいは検出可能な治療的、予防的、または阻害効果を示す十分な量の化合物を指す。その効果は、例えば、臨床状態の改善、または症状の低下によって検出され得る。対象に正確に有効な量は、対象の体重、大きさ、および健康状態、状態の性質および範囲、ならびに投与のために選択される治療または治療の組み合わせに左右されるであろう。薬物が米国食品医薬品局（ＦＤＡ）によって認可されている場合、「治療上有効量」は、確認された疾患または状態の治療のためにＦＤＡまたはそれに対応する外国の機関によって認可された用量を指す。

本明細書で使用される場合、「血液脳関門を横断することができる組成物を必要としている」患者とは、血液脳関門を横断することができる組成物から利益を得ることになる患者である。患者は、血液脳関門を横断することができる組成物を用いた療法が症状を寛解させるのに有用であり得る任意の疾患または状態に罹っていることがある。

「ＣＮＳの障害」または「ＣＮＳ障害」は、それらの用語が本明細書で使用される場合、脳および／または脊髄に影響する、ならびに最適以下の機能をもたらすあらゆる状態を包含する。一部の実施形態において、障害は、急性障害である。ＣＮＳの急性障害には、局所脳虚血、全脳虚血、脳外傷、脊髄損傷、急性感染症、てんかん重積症（ＳＥ）、片頭痛、急性精神病、自殺性鬱病、および急性不安／恐怖症が挙げられる。一部の実施形態において、障害は、慢性障害である。ＣＮＳの慢性障害は、慢性神経変性、網膜変性、鬱病、慢性情動障害、リソソーム蓄積障害、脳の慢性感染症、脳癌、卒中リハビリテーション、先天性代謝異常、自閉症、精神遅滞が挙げられる。慢性神経変性は、プリオン病、アルツハイマー病（ＡＤ）、パーキンソン病（ＰＤ）、ハンチントン病（ＨＤ）、多発性硬化症（ＭＳ）、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、横断性脊髄炎、運動ニューロン疾患、ピック病、結節性硬化症、リソソーム蓄積障害、カナバン病、レット症候群、脊髄小脳失調症、フリードライヒ失調症、視神経萎縮症、および網膜変性といった神経変性疾患、ならびにＣＮＳの老化を含む。

本明細書で使用される場合、「併用」は、同時投与（ｃｏｎｃｕｒｒｅｎｔ ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ）または同時投与（ｃｏ−ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ）と置き換え可能であると理解される。このため、用語は、両方の薬剤が同時に身体に作用することを可能にする手段で２つの薬剤が与えられる限り、同時にもしくは異なる時点で、ならびに同じ経路で、もしくは異なる経路での投与を包含すると理解される。例えば、併用は、同じもしくは異なる開業医によって処方されるものであるかを問わず、または同じもしくは異なる効能のためのものを問わず、同時に投与される投薬を指してもよい。

本明細書および付属の特許請求の範囲に使用される、単数形「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」は、文脈が明確に指定しない限り、複数形の参照を含むことを、ここに記載しておく。

用語「約」は、本明細書で使用される場合、おおよそを意味すると理解されることにもまた留意されたい。

用語「付着される」、「抱合される」、および「機能させる」は、本明細書において置き換え可能に使用され、ポリヌクレオチド、ペプチド、ポリペプチド、治療薬、造影剤、およびそれらの組み合わせとナノ抱合体との関連を指すことにさらに留意されたい。
血液脳関門（ＢＢＢ）

本明細書で使用される場合、「血液脳関門」（ＢＢＢ）は、脳毛細血管内皮細胞膜内の密着結合によって形成される末梢循環と脳と脊髄との間の関門を指し、それは脳内への分子の輸送を制限する高選択性の関門を作る。脳内の血液脳関門、脊髄内の血液脊髄関門、および網膜内の血液網膜関門は、中枢神経系（ＣＮＳ）内の近接した毛細血管関門であり、集団的に血液脳関門またはＢＢＢと称される。

ＢＢＢは、脊椎動物脳を灌流する毛細血管の内皮内の上皮様高抵抗密着結合によって形成される。治療用分子が４００〜６００ダルトン以下の分子量を有する脂溶性でない限り、脳透過性は制限される［Ｐａｒｄｒｉｄｇｅ，Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ ６：４９４−５００（２００６）］。ＢＢＢの存在のため、分子の循環は、２つのプロセス、（ｉ）自由拡散によるＢＢＢを通る小分子の脂質媒介性輸送、または（ｉｉ）触媒輸送のうちの１つを介してのみ脳細胞へ到達する。後者は、低分子量の栄養素および水溶性ビタミンの担体媒介性輸送プロセス、またはペプチド（例えば、インスリン）、血漿タンパク質（例えば、トランスフェリン）、もしくはウイルスを循環するための受容体媒介性輸送を含む。ＢＢＢ浸透性自体が毛細血管内皮細胞の細胞膜の生化学的性質によって制御される一方、すべての脳微小血管の生物学は、毛細血管内皮と、基底膜を内皮細胞および脳内の毛細血管基底膜の反管腔側表面の９９％を包囲するアストロサイト足突起と共有する脳の微小循環、すなわち毛細血管周皮細胞を含む他の２つの主要細胞との間のパラクリン相互作用の機能である。頻繁に毛細血管内皮に基づく微小血管機能は、毛細血管周皮細胞または毛細血管アストロサイト足突起のいずれかによって、実際に実行される［Ｐａｒｄｒｉｄｇｅ，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｖｉｒ．５：５５６−５６９（１９９９）］。

ＢＢＢは、主として、血液とＣＳＦと脳間質液との間の物質の動きを制御することによって、ＣＮＳの動作環境を決定する。ＢＢＢは、血管関門または内皮関門、および脈絡叢の上皮関門（血液ＣＳＦ関門とも名付けられる）に分割される。毛細血管を含み、かつ細動脈および細静脈を覆う内皮細胞は、脊髄および脳のほとんどの領域において関門機能を構成する［Ｒａｐｏｐｏｒｔ，Ｂｌｏｏｄ Ｂｒａｉｎ Ｂａｒｒｉｅｒ ｉｎ Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，Ｒａｖｅｎ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ．（１９７６）］。内皮細胞は、近接するＣＮＳの無窓内皮細胞間の密着結合の周囲のベルトが末梢組織の毛細血管床内で見られる漏出を防止という点において、修飾される。脳内皮の密着結合に相当する細胞内の密着結合は、脈絡叢で近接する上皮細胞間［Ｊｏｈａｎｓｏｎ，Ｔｈｅ ｃｈｏｒｏｉｄ ｐｌｅｘｕｓ−ａｒａｃｈｎｏｉｄ ｍｅｍｂｒａｎｅ−ｃｅｒｅｂｒｏｓｐｉｎａｌ ｆｌｕｉｄ ｓｙｓｔｅｍ．Ｉｎ：Ｎｅｕｒｏｎａｌ Ｍｉｃｒｏｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ．Ｂｏｕｌｔｏｎ ＡＡ，Ｂａｋｅｒ ＧＢ，Ｗａｌｚ Ｗ（ｅｄｓ）．Ｔｈｅ Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ：Ｃｌｉｆｔｏｎ，Ｎｅｗ Ｊｅｒｓｅｙ，ｐｐ ３３−１０４（１９８８）］、およびくも膜細胞間［Ｂａｌｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｃｏｍｐ Ｎｅｕｒｏｌ ２５１：２６０−２８０（１９８６）］に存在する。脳内皮は、同様に他の修飾を有する。それらは、血液媒介性巨大分子のエンドサイトーシスおよび管腔原形質膜の再循環に関与するが、末梢内皮および脈絡叢より少ない程度である［Ｂｒｏａｄｗｅｌｌ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｐｅｒｓｐｅｃｔｉｖｅ ｆｏｒ ｔｈｅ ｔｒａｎｓｃｙｔｏｓｉｓ ｏｆ ｐｅｐｔｉｄｅｓ ａｎｄ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｔｈｒｏｕｇｈ ｔｈｅ ｍａｍｍａｌｉａｎ ｂｌｏｏｄ−ｂｒａｉｎ ｆｌｕｉｄ ｂａｒｒｉｅｒｓ．Ｉｎ：Ｔｈｅ Ｂｌｏｏｄ−Ｂｒａｉｎ Ｂａｒｒｉｅｒ．Ｐａｒｄｒｉｄｇｅ ＷＭ（ｅｄ）．Ｒａｖｅｎ Ｐｒｅｓｓ Ｌｔｄ：Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ｐｐ１６５−１９９（１９９３）］。二次リソソームは、ＢＢＢ内皮内でエンドサイトーシスを経る多くの巨大分子を加水分解するが、すべてではない［Ｂｒｏａｄｗｅｌｌ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７８：７８２０−７８２４（１９８１）、Ｂｒｏａｄｗｅｌｌ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｐｅｒｓｐｅｃｔｉｖｅ ｆｏｒ ｔｈｅ ｔｒａｎｓｃｙｔｏｓｉｓ ｏｆ ｐｅｐｔｉｄｅｓ ａｎｄ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｔｈｒｏｕｇｈ ｔｈｅ ｍａｍｍａｌｉａｎ ｂｌｏｏｄ−ｂｒａｉｎ ｆｌｕｉｄ ｂａｒｒｉｅｒｓ．Ｉｎ：Ｔｈｅ Ｂｌｏｏｄ−Ｂｒａｉｎ Ｂａｒｒｉｅｒ．Ｐａｒｄｒｉｄｇｅ ＷＭ（ｅｄ）．Ｒａｖｅｎ Ｐｒｅｓｓ Ｌｔｄ：Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ｐｐ１６５−１９９（１９９３）］。内皮のこれらの修飾は、末梢組織中の毛細血管床の血漿限外濾過液特性を有効に排除し、ＢＢＢの限定的な浸透性を決定する働きをする［Ｂａｎｋｓ，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｖｉｒ．５：５３８−５５５（１９９９）］。

したがって、ほとんどの潜在的に治療的な、診断上の、または研究分子は、薬理学的に有効な量でＢＢＢを通過しない。ＢＢＢを迂回するように、脳室内の（ＩＣＶ）注入、脳内の（ＩＣ）投与、および対流増進拡散（ＣＥＤ）等の浸潤性経頭蓋薬物送達方法が使用される。脳への経頭蓋薬物送達は、高額であり、浸潤性であり、概して効果がない。ＩＣＶ経路は、典型的に、脳実質内ではなく脳の上衣表面にのみ薬物を送達する。神経増殖因子（ＮＧＦ）等のニューロトロフィンのＩＣ投与は、脳内の低効率の薬物拡散のために、薬物を局部注射部位にのみ送達する。ニューロトロフィンのＣＥＤは、脱髄およびアストログリオーシスを引き起こす脳の白質路を通る優先的な流体の流れをもたらす。

本開示は、これらの高浸潤性であり、概して意に満たないＢＢＢを迂回するための方法の代替案を提案し、ナノ抱合体が、末梢血液からＢＢＢを通過することを可能にする。それは、所望の物質を末梢血液からＣＮＳへ輸送することができるナノ抱合体の使用に基づく。４００〜６００ダルトン以上の質量を有する治療薬の脳透過性が制限され、およびさらにＤＮＡの一塩基の質量がおおよそ３２０ダルトンであることから、本明細書に提示されるデータが、各々が多数の塩基を含む多数のポリヌクレオチドで機能させたナノ抱合体が、いかなる相当量でＢＢＢを通過することができることを示すことは予期されない。

一態様において、本開示は、ＢＢＢを通過することができるナノ抱合体を使用する組成物および方法を提供する。組成物および方法は、ナノ抱合体、および任意に治療薬を末梢血液から血液脳関門を横断しＣＮＳ中に輸送することにおいて有用である。
ナノ抱合体

本開示の組成物は、ナノ抱合体を含む。ナノ抱合体は、ある特定の態様において、中空であるナノ粒子を含む。ナノ抱合体は、種々の実施形態において、生体分子をさらに含む。本明細書で使用される場合、「生体分子」は、ポリヌクレオチド、ペプチド、ポリペプチド、小分子、治療薬、造影剤、およびそれらの組み合わせを含むと理解される。ナノ抱合体の種々の態様において、生体分子のすべては、同一であり、または選択的に、少なくとも２つの生体分子が異なる。

本開示のナノ抱合体は、ポリマー系ナノ抱合体ではない。このため、例えば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）被覆ヘキサデシルシアノアクリレートナノ球体、ポリ（ブチルシアノアクリレート）ナノ粒子、ポリソルベート８０で被覆されたポリ（ブチルシアノアクリレート）ナノ粒子、脂質ナノ粒子、例えば酸化鉄で負荷された凝脂ナノ滴のエマルジョンから成る脂質ナノ粒子、または架橋したＰＥＧおよびポリエチレンイミンから成るナノゲルを含むナノ抱合体は、本開示の企図される態様または実施形態ではない。

本開示は、種々の実施形態において、少なくとも約４００、約６００、約８００、約１０００、約１２００ダルトン以上の質量を有するナノ抱合体を提供する。さらなる実施形態において、ナノ抱合体は、少なくとも約１、約２、約３、約５、約１０、約２０、約３０、約４０、約５０、約６０、約７０、約８０、約９０、約１００、約２００、約５００、約７００、約９００キロダルトン以上の質量を有する。本明細書で使用される場合、ナノ抱合体の質量は、ナノ粒子に結合するいかなる生体分子および／または治療薬（複数可）の質量を加えたナノ粒子（存在する場合）の質量を含むと理解される。
ナノ粒子

ナノ粒子は、一部の態様において、そこに付着される生体分子を有するように機能させられ、提供される。ナノ粒子の大きさ、形状、および化学組成物は、生じる機能性ナノ粒子の性質に影響を与える。これらの性質は、例えば、光学的性質、光電子的性質、電気化学的性質、電子工学的性質、種々の溶液での安定性、磁気的性質、ならびに細孔およびチャネルサイズの変動を含む。ナノ粒子の混合物は、異なる大きさ、形状および／または化学組成物を有し、また、ナノ粒子の使用は、均一の大きさ、形状および／または化学組成物を有し、したがって、性質の混合が企図される。好適な粒子の例には、限定することなく、それらの開示が参照によってその全体が組み込まれる米国特許第７，２３８，４７２号および国際公開第ＷＯ２００３／０８５３９号に記載されるもの等の、集合粒子、等方性（球形粒子等）、異方性粒子（非球形ロッド、四面体、および／またはプリズム等）、およびコアシェル粒子が挙げられる。

一実施形態において、ナノ粒子は金属性であり、および種々の態様において、ナノ粒子はコロイド金属である。このため、種々の実施形態において、本発明のナノ粒子は、金属（例えば、限定することなく、銀、金、白金、アルミニウム、パラジウム、銅、コバルト、インジウム、ニッケル、またはナノ粒子形成の影響を受けやすい任意の他の金属を含む）、半導体（例えば、限定することなく、ＣｄＳｅ、ＣｄＳ、およびＺｎＳで被覆されるＣｄＳまたはＣｄＳｅを含む）、ならびに磁性（例えば、強磁性）コロイド物質を含む。

また、米国特許公開第２００３／０１４７９６６号に記載されるように、本発明のナノ粒子は、市販されているもの、ならびに例えば、溶液中の進行性の核形成から（例えば、膠質反応によって）、またはスパッタ堆積等の種々の物理的および化学的蒸着プロセスによって生成される、合成されるものを含む。例えば、ＨａＶａｓｈｉ，Ｖａｃ．Ｓｃｉ．Ｔｅｃｈｎｏｌ．Ａ５（４）：１３７５−８４（１９８７）、Ｈａｙａｓｈｉ，Ｐｈｙｓｉｃｓ Ｔｏｄａｙ，４４−６０（１９８７）、ＭＲＳ Ｂｕｌｌｅｔｉｎ，Ｊａｎｕａｒｙ １９９０，１６−４７を参照されたい。米国特許公開第２００３／０１４７９６６号にさらに記載されるように、企図されるナノ粒子は、当技術分野で知られている方法を使用して、ＨＡｕＣｌ_４およびクエン酸還元剤を使用して代替的に生成される。例えば、Ｍａｒｉｎａｋｏｓ ｅｔ ａｌ．，Ａｄｖ．Ｍａｔｅｒ．１１：３４−３７（１９９９）、Ｍａｒｉｎａｋｏｓ ｅｔ ａｌ．，Ｃｈｅｍ．Ｍａｔｅｒ．１０：１２１４−１９（１９９８）、Ｅｎｕｓｔｕｎ＆Ｔｕｒｋｅｖｉｃｈ，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．８５：３３１７（１９６３）を参照されたい。

ナノ粒子は、平均粒径で約１ｎｍ〜約２５０ｎｍ、平均粒径で約１ｎｍ〜約２４０ｎｍ、平均粒径で約１ｎｍ〜約２３０ｎｍ、平均粒径で約１ｎｍ〜約２２０ｎｍ、平均粒径で約１ｎｍ〜約２１０ｎｍ、平均粒径で約１ｎｍ〜約２００ｎｍ、平均粒径で約１ｎｍ〜約１９０ｎｍ、平均粒径で約１ｎｍ〜約１８０ｎｍ、平均粒径で約１ｎｍ〜約１７０ｎｍ、平均粒径で約１ｎｍ〜約１６０ｎｍ、平均粒径で約１ｎｍ〜約１５０ｎｍ、平均粒径で約１ｎｍ〜約１４０ｎｍ、平均粒径で約１ｎｍ〜約１３０ｎｍ、平均粒径で約１ｎｍ〜約１２０ｎｍ、平均粒径で約１ｎｍ〜約１１０ｎｍ、平均粒径で約１ｎｍ〜約１００ｎｍ、平均粒径で約１ｎｍ〜約９０ｎｍ、平均粒径で約１ｎｍ〜約８０ｎｍ、平均粒径で約１ｎｍ〜約７０ｎｍ、平均粒径で約１ｎｍ〜約６０ｎｍ、平均粒径で約１ｎｍ〜約５０ｎｍ、平均粒径で約１ｎｍ〜約４０ｎｍ、平均粒径で約１ｎｍ〜約３０ｎｍ、または平均粒径で約１ｎｍ〜約２０ｎｍ、平均粒径で約１ｎｍ〜約１０ｎｍの大きさの範囲であり得る。他の態様において、ナノ粒子の大きさは、約５ｎｍ〜約１５０ｎｍ（平均粒径）、約５〜約５０ｎｍ、約１０〜約３０ｎｍ、約１０〜１５０ｎｍ、約１０〜約１００ｎｍ、または約１０〜約５０ｎｍである。ナノ粒子の大きさは、約５ｎｍ〜約１５０ｎｍ（平均粒径）、約３０〜約１００ｎｍ、約４０〜約８０ｎｍである。方法で使用されるナノ粒子の大きさは、それらの特定の使用または用途による必要に応じて異なる。大きさの変動は、本明細書に記載されるように、ナノ粒子のある特定の物理的特性、例えば、光学的性質または機能させられ得る表面積の量を最適化するために、有利に使用される。

より大きい直径のナノ粒子は、一部の態様において、ナノ抱合体生成の間、より多くの生体分子と機能させるものと企図される［Ｈｕｒｓｔ ｅｔ ａｌ．，Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ７８（２４）：８３１３−８３１８（２００６）］。一部の態様において、したがって、ナノ抱合体の生成で使用される生体分子の数は、ナノ抱合体当たり約１０〜約２５，０００の生体分子である。さらなる態様において、ナノ抱合体の生成で使用される生体分子の数は、ナノ抱合体当たり約５０〜約１０，０００の生体分子、またはナノ抱合体当たり約２００〜約５，０００の生体分子、またはナノ抱合体当たり約５０〜約１００の生体分子、またはナノ抱合体当たり約２０〜約１００の生体分子、またはナノ抱合体当たり約２０〜約５０の生体分子である。このため、種々の実施形態において、ナノ抱合体の生成で使用される生体分子の数は、ナノ抱合体当たり約１０、約１５、約２０、約２５、約３０、約３５、約４０、約４５、約５０、約５５、約６０、約６５、約７０、約７５、約８０、約８５、約９０、約９５、約１００、約１５０、約２００、約２５０、約３００、約３５０、約４００、約５００、約６００、約７００、約８００、約９００、約１，０００、約２，０００、約５０００、約１０，０００、約１５，０００、約２０，０００、約２５，０００以上である。
中空ナノ抱合体

本明細書に記載されるように、種々の態様において、本開示によって提供されるナノ抱合体は、中空である。中空ナノ抱合体の空隙率および／または強剛性は、一部には、ナノ抱合体生成中にナノ粒子の表面上で架橋される生体分子の密度に左右される。一般的に、ナノ粒子の表面上で架橋される生体分子のより低い密度が、より多孔質のナノ抱合体をもたらす一方、ナノ粒子の表面上で架橋される生体分子のより高い密度はより剛性のナノ抱合体をもたらす。中空ナノ抱合体の空隙率および密度はまた、生体分子間の架橋の度合いおよび種類に左右される。

中空ナノ抱合体を生成する方法は、当技術分野で既知であり、概して、そのそれぞれが参照することによってその全体が本明細書に組み込まれる、国際特許出願ＰＣＴ／ＵＳ２０１０／０５５０１８号、およびＺｈａｎｇｅｔ ａｌ．［Ｊ Ａｍ Ｃｈｅｍ Ｓｏｃ．１３２（４３）：１５１５１−１５１５３（２０１０）］に記載される。

一部の実施形態において、中空ナノ抱合体は、ポリアルキン化学を介して調製される［Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ａｍ Ｃｈｅｍ Ｓｏｃ．１３２（４３）：１５１５１−１５１５３（２０１０）］。均一二機能性（ｈｏｍｏｂｉｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ）クロスリンカー（例えば、スルホ−ＥＧＳ）、または他の反応基（例えば、限定することなく、アミン、アミド、アルコール、エステル、アルデヒド、ケトン、チオール、ジスルフィド、カルボン酸、フェノール、イミダゾール、ヒドラジン、ヒドラゾン、アジド、およびアルキン）の使用を通して等、さらなる架橋ストラテジがまた企図される。

表面補助架橋（ｓｕｒｆａｃｅ ａｓｓｉｓｔｅｄ ｃｒｏｓｓｌｉｎｋｉｎｇ）（ＳＡＣ）と称される中空ナノ抱合体を調製するさらなる方法は、ナノ粒子表面上に構築され、ともに架橋される修飾核酸の混合される単層および反応チオラート分子を含む。本明細書で使用される場合、「単層」は、生体分子の単一の層のみがナノ抱合体の表面で架橋されることを意味する。本明細書で使用される場合、生体分子は、限定することなく、ポリヌクレオチド、ペプチド、ポリペプチド、小分子、治療薬、造影剤、およびそれらの組み合わせを含む。

対象の生体分子の架橋を生じる化学物質は、当業者に既知であり、限定することなく、グルタル酸ジサクシンイミジル、スベリン酸ジサクシンイミジル、スベリン酸ビス［スルホサクシンイミジル］、トリス−サクシンイミジルアミノトリアセテート、サクシンイミジル４−ヒドラジノニコチン酸塩アセトンヒドラゾン、サクシンイミジル４−ヒドラジドテレフタレート塩酸塩、サクシンイミジル４−ホルミル安息香酸塩、ジチオビス［サクシンイミジルプロピオン酸塩］、３，３’−ジチオビス［スルホサクシンイミジルプロピオン酸塩］、ジサクシンイミジル酒石酸塩、ビス［２−（サクシンイミドオキシカルボニルオキシ）エチル］スルホン、エチレングリコールビス［サクシンイミジルコハク酸塩］、エチレングリコールビス［スルホサクシンイミジルコハク酸塩］、ジメチルアジピミデート（ａｄｉｐｉｍｉｄａｔｅ）・２ＨＣｌ、ジメチルピメリミデート（ｐｉｍｅｌｉｍｉｄａｔｅ）・２ＨＣｌ、ジメチルスベリミデート（Ｓｕｂｅｒｉｍｉｄａｔｅ）・２ＨＣｌ、１，５−ジフルオロ−２，４−ジニトロベンゼン、β−［トリス（ヒドロキシメチル）ホスフィノ］プロパン酸、ビス−マレイミドエタン、１，４−ビスマレイミドブタン、ビスマレイミドヘキサン、トリス［２−マレイミドエチル］アミン、１，８−ビス−マレイミド−ジエチレングリコール、１，１１−ビス−マレイミド−トリエチレングリコール、１，４ビスマレイミジル−２，３−ジヒドロキシブタン、ジチオ−ビスマレイミドエタン、１，４−ジ−［３’−（２’−ピリジルジチオ）−プロピオンアミド］ブタン、１，６−ヘキサン−ビス−ビニルスルホン、ビス−［ｂ−（４−アジドサリチルアミド）エチル］ジスルフィド、Ｎ−（ａ−マレイミドアセトキシ）サクシンイミドエステル、Ｎ−［β−マレイミドプロピルオキシ］サクシンイミドエステル、Ｎ−［ｇ−マレイミドブチリルオキシ］サクシンイミドエステル、Ｎ−［ｇ−マレイミドブチリルオキシ］スルホサクシンイミドエステル、ｍ−マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシサクシンイミドエステル、ｍ−マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシスルホサクシンイミドエステル、サクシンイミジル４−［Ｎ−マレイミドメチル］シクロヘキサン−１−カルボキシレート、スルホサクシンイミジル４−［Ｎ−マレイミドメチル］シクロヘキサン−１−カルボキシレート、Ｎ−ｅ−マレイミドカプロイルオキシ］サクシンイミドエステル、Ｎ−ｅ−マレイミドカプロイルオキシ］スルホサクシンイミドエステル、サクシンイミジル４−［ｐ−マレイミドフェニル］酪酸塩、スルホサクシンイミジル４−［ｐ−マレイミドフェニル］酪酸塩、サクシンイミジル−６−［β−マレイミドプロピオンアミド］ヘキサン酸塩、サクシンイミジル−４−［Ｎ−マレイミドメチル］シクロヘキサン−１−カルボキシ−［６−アミドカプロン酸塩］、Ｎ−［ｋ−マレイミドウンデカノイル（ｕｎｄｅｃａｎｏｙｌ）オキシ］スルホサクシンイミドエステル、Ｎ−サクシンイミジル３−（２−ピリジルジチオ）−プロピオン酸塩、サクシンイミジル６−（３−［２−ピリジルジチオ］−プロピオンアミド）ヘキサン酸塩、４−サクシンイミジルオキシカルボニル−メチル−ａ−［２−ピリジルジチオ］トルエン、４−スルホサクシンイミジル−６−メチル−ａ−（２−ピリジルジチオ）トルアミド］ヘキサン酸塩）、Ｎ−サクシンイミジルヨードアセテート、サクシンイミジル３−［ブロモアセトアミド］プロピオン酸塩、Ｎ−サクシンイミジル［４−ヨードアセチル］アミノ安息香酸塩、Ｎ−スルホサクシンイミジル［４−ヨードアセチル］アミノ安息香酸塩、Ｎ−ヒドロキシサクシンイミジル−４−アジドサリチル酸、Ｎ−５−アジド−２−ニトロベンゾイルオキシサクシンイミド、Ｎ−ヒドロキシスルホサクシンイミジル−４−アジド安息香酸塩、スルホサクシンイミジル［４−アジドサリチルアミド］−ヘキサン酸塩、Ｎ−サクシンイミジル−６−（４’−アジド−２’−ニトロフェニルアミノ）ヘキサン酸塩、Ｎ−スルホサクシンイミジル−６−（４’−アジド−２’−ニトロフェニルアミノ）ヘキサン酸塩、スルホサクシンイミジル−（パーフルオロアジドベンズアミド）−エチル−１，３’−ジチオプロプリオネート（ｐｒｏｐｒｉｏｎａｔｅ）、スルホサクシンイミジル−２−（ｍ−アジド−ｏ−ニトロベンズアミド）−エチル−１，３’−プロプリオネート、スルホサクシンイミジル２−［７−アミノ−４−メチルクマリン−３−アセトアミド］エチル−１，３’ジチオプロピオン酸塩、サクシンイミジル４，４’−アジペンタノエート（ａｚｉｐｅｎｔａｎｏａｔｅ）、サクシンイミジル６−（４，４’−アジペンタンアミド（ａｚｉｐｅｎｔａｎａｍｉｄｏ））ヘキサン酸塩、サクシンイミジル２−（［４，４’−アジペンタンアミド］エチル）−１，３’−ジチオプロプリオネート、スルホサクシンイミジル４，４’−アジペンタノエート、スルホサクシンイミジル６−（４，４’−アジペンタンアミド）ヘキサン酸塩、スルホサクシンイミジル２−（［４，４’−アジペンタンアミド］エチル）−１，３’−ジチオプロプリオネート、ジシクロヘキシルカルボジイミド、１−エチル−３−［３−ジメチルアミノプロピル］カルボジイミド塩酸塩、Ｎ−［４−（ｐ−アジドサリチルアミド）ブチル］−３’−（２’−ピリジルジチオ）プロピオンアミド、Ｎ−［β−マレイミドプロパン酸］ヒドラジド、トリフルオロ酢酸塩、［Ｎ−ｅ−マレイミドカプロン酸］ヒドラジド、トリフルオロ酢酸塩、４−（４−Ｎ−マレイミドフェニル）酪酸ヒドラジド塩酸塩、Ｎ−［ｋ−マレイミドウンデカン酸］ヒドラジド、３−（２−ピリジルジチオ）プロピオニルヒドラジド、ｐ−アジドベンゾイルヒドラジド、Ｎ−［ｐ−マレイミドフェニル］イソシアン酸塩、およびサクシンイミジル−［４−（ソラレン−８−イルオキシ）］−酪酸塩を含む。
生体分子

本明細書に記載されるように、生体分子は、限定することなく、ポリヌクレオチド、ペプチド、ポリペプチド、小分子、治療薬、造影剤、およびそれらの組み合わせを含む。本開示の種々の態様において、本明細書に記載される生体分子は、共有結合的にナノ粒子と結合する。
ポリヌクレオチド

本開示によって企図されるポリヌクレオチドは、本明細書で定義されるＤＮＡ、ＲＮＡ、ならびにそれらの修飾形態および組み合わせを含む。したがって、一部の態様において、ナノ抱合体は、ＤＮＡを含む。一部の実施形態において、ＤＮＡは二重鎖であり、さらなる実施形態において、ＤＮＡは単鎖である。さらなる態様において、ナノ抱合体はＲＮＡを含み、なおさらなる態様において、ナノ抱合体は二重鎖ＲＮＡを含み、特定の実施形態において、二重鎖ＲＮＡ剤は小干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）である。用語「ＲＮＡ」は、２つの分離したストランドの二本鎖、ならびに単鎖構造を含む。単鎖ＲＮＡはまた、二次構造を持つＲＮＡを含む。一態様において、ヘアピンループを有するＲＮＡが企図される。

ナノ抱合体が複数の構造ポリヌクレオチドを含むとき、ポリヌクレオチドは、一部の態様において、ナノ抱合体の一部であるポリヌクレオチドおよび標的ポリヌクレオチドのハイブリダイゼーションが行われるように、ポリヌクレオチドの標的配列に十分に相補的である配列から成る。種々の態様におけるポリヌクレオチドは、二重鎖分子がまた、標的ポリヌクレオチドの単一ストランド配列とハイブリッド形成する単一ストランド配列を含む限り、単鎖または二重鎖である。一部の態様において、ナノ抱合体の一部であるポリヌクレオチドのハイブリダイゼーションは、二重鎖標的ポリヌクレオチドと三重鎖構造を形成し得る。別の態様において、三重鎖構造は、ナノ抱合体の一部である二重鎖ポリヌクレオチドの単鎖標的ポリヌクレオチドとのハイブリダイゼーションによって形成され得る。三重鎖ポリヌクレオチド複合体のさらなる記載は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる国際出願ＰＣＴ／ＵＳ２００６／４０１２４号で見られる。

一部の態様において、ポリヌクレオチドは、本明細書に記載されるスペーサーを含有する。スペーサーは、一態様において、１つのポリヌクレオチドの別のポリヌクレオチドへの架橋を促進する１つ以上の架橋部分を含む。

「ポリヌクレオチド」は、当技術分野において、個々に重合したヌクレオチドサブユニットを含むと理解される。用語「ヌクレオチド」またはその複数形は、本明細書で使用される場合、本明細書で考察されるような、さもなければ当技術分野で知られている修飾形態と置き換え可能である。ある特定の場合において、当技術分野は、用語「核酸塩基」を使用し、それは天然発生のヌクレオチド、および修飾されたヌクレオチドを含む非天然発生のヌクレオチドを包含する。このため、ヌクレオチドまたは核酸塩基は、天然発生の核酸塩基アデニン（Ａ）、グアニン（Ｇ）、シトシン（Ｃ）、チミン（Ｔ）、およびウラシル（Ｕ）を意味する。非天然発生の核酸塩基は、例えば、限定することなく、キサンチン、ジアミノプリン、８−オキソ−Ｎ６−メチルアデニン、７−デアザキサンチン、７−デアザグアニン、Ｎ４，Ｎ４−エタノシトシン、Ｎ’，Ｎ’−エタノ−２，６−ジアミノプリン、５−メチルシトシン（ｍＣ）、５−（Ｃ３-Ｃ６）−アルキニル−シトシン、５−フルオロウラシル、５−ブロモウラシル、偽イソシトシン、２−ヒドロキシ−５−メチル−４−トリアゾロピリジン、イソシトシン、イソグアニン、イノシン、ならびにＢｅｎｎｅｒらの米国特許第５，４３２，２７２号、ならびにＳｕｓａｎ Ｍ．Ｆｒｅｉｅｒ ａｎｄ Ｋａｒｌ−Ｈｅｉｎｚ Ａｌｔｍａｎｎ，１９９７，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，ｖｏｌ．２５：ｐｐ４４２９〜４４４３に記載される「非天然発生の」核酸塩基を含む。用語「核酸塩基」はまた、既知のプリンおよびピリミジン複素環だけではなく、それらの複素環式類似体および互変異性体も含む。さらに天然発生の、および非天然発生の核酸塩基は、米国特許第３，６８７，８０８号（Ｍｅｒｉｇａｎら）、Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ，Ｅｄ．Ｓ．Ｔ．Ｃｒｏｏｋｅ ａｎｄ Ｂ．Ｌｅｂｌｅｕ，ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ，１９９３におけるＳａｎｇｈｖｉによる第１５章、Ｅｎｇｌｉｓｃｈ ｅｔ ａｌ．，１９９１，Ａｎｇｅｗａｎｄｔｅ Ｃｈｅｍｉｅ，Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｅｄｉｔｉｏｎ，３０：６１３−７２２（特に６２２頁および６２３頁、ならびにｔｈｅ Ｃｏｎｃｉｓｅ Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ ｏｆ Ｐｏｌｙｍｅｒ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｊ．Ｉ．Ｋｒｏｓｃｈｗｉｔｚ Ｅｄ．，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，１９９０，ｐａｇｅｓ ８５８〜８５９、Ｃｏｏｋ，Ａｎｔｉ−Ｃａｎｃｅｒ Ｄｒｕｇ Ｄｅｓｉｇｎ １９９１，６，５８５−６０７を参照されたく、これらはそれぞれ、参照することによってその全体が本明細書に組み込まれる、）で開示されるものを含む。種々の態様において、ポリヌクレオチドはまた、最も古典的な意味でヌクレオシド塩基ではないが、ヌクレオシド塩基として役立つある特定の「普遍的塩基」を含む、核酸塩基のように役立つ複素環式化合物等の化合物を含む非天然発生のヌクレオチドの分類である１つ以上の「ヌクレオシド塩基」または「塩基ユニット」を含む。普遍的塩基は、３−ニトロピロール、任意に置換されるインドール（例えば、５−ニトロインドール）、および任意に置換されるヒポキサンチンを含む。他の望ましい普遍的塩基は、当技術分野で知られている普遍的塩基を含む、ピロール、ジアゾール、またはトリアゾール誘導体を含む。

修飾されたヌクレオチドは、欧州特許第１０７２６７９号および国際公開第９７／１２８９６号に記載され、それらの開示は参照により本明細書に組み込まれる。修飾されたヌクレオチドは、限定することなく、５−メチルシトシン（５−ｍｅ−Ｃ）、５−ヒドロキシメチルシトシン、キサンチン、ヒポキサンチン、２−アミノアデニン、６−メチル、ならびにアデニンおよびグアニンの他のアルキル誘導体、２−プロピル、ならびにアデニンおよびグアニンの他のアルキル誘導体、２−チオウラシル、２−チオチミンおよび２−チオシトシン、５−ハロウラシルおよびシトシン、５−プロピニルウラシルおよびシトシン、ならびにピリミジン塩基の他のアルキニル誘導体、６−アゾウラシル、シトシンおよびチミン、５−ウラシル（偽ウラシル）、４−チオウラシル、８−ハロ、８−アミノ、８−チオール、８−チオアルキル、８−ヒドロキシル、ならびに他の８−置換アデニンおよびグアニン、５−ハロ、特に５−ブロモ、５−トリフルオロメチル、ならびに他の５−置換ウラシルおよびシトシン、７−メチルグアニンおよび７−メチルアデニン、２−Ｆ−アデニン、２−アミノ−アデニン、８−アザグアニンおよび８−アザアデニン、７−デアザグアニンおよび７−デアザアデニン、ならびに３−デアザグアニンおよび３−デアザアデニンを含む。さらに修飾塩基は、フェノキサジンシチジン（１Ｈ−ピリミド［５，４−ｂ］［１，４］ベンゾキサジン−２（３Ｈ）−オン）、フェノチアジンシチジン（１Ｈ−ピリミド［５，４−ｂ］［１，４］ベンゾチアジン−２（３Ｈ）−オン）等の三環系ピリミジン、置換フェノキサジンシチジン（例えば、９−（２−アミノエトキシ）−Ｈ−ピリミド［５，４−ｂ］［１，４］ベンゾキサジン−２（３Ｈ）−オン）、カルバゾールシチジン（２Ｈ−ピリミド［４，５−ｂ］インドール−２−オン）、ピリドインドールシチジン（Ｈ−ピリド［３’，２’：４，５］ピロロ［２，３−ｄ］ピリミジン−２−オン）等のＧ−クランプを含む。修飾塩基はまた、その中でプリンまたはピリミジン塩基が他の複素環で置き換えられるもの、例えば、７−デアザ−アデニン、７−デアザグアノシン、２−アミノピリジン、および２−ピリドンを含み得る。さらなる核酸塩基は、米国特許第３，６８７，８０８号で開示されるもの、Ｔｈｅ Ｃｏｎｃｉｓｅ Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ Ｏｆ Ｐｏｌｙｍｅｒ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ａｎｄ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，ｐａｇｅｓ ８５８〜８５９，Ｋｒｏｓｃｈｗｉｔｚ，Ｊ．Ｉ．，ｅｄ．Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，１９９０で開示されるもの、Ｅｎｇｌｉｓｃｈｅｔ ａｌ．，１９９１，Ａｎｇｅｗａｎｄｔｅ Ｃｈｅｍｉｅ，Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｅｄｉｔｉｏｎ，３０：６１３で開示されるもの、およびＡｎｔｉｓｅｎｓｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，ｐａｇｅｓ ２８９〜３０２，Ｃｒｏｏｋｅ，Ｓ．Ｔ．ａｎｄ Ｌｅｂｌｅｕ，Ｂ．，ｅｄ．，ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ，１９９３におけるＳａｎｇｈｖｉ，Ｙ．Ｓ．，による第１５章で開示されるものを含む。ある特定のこれらの塩基は、結合親和性を増加するために有用であり、５−置換ピリミジン、６−アザピリミジン、ならびに２−アミノプロピルアデニン、５−プロピニルウラシル、および５−プロピニルシトシンを含むＮ−２、Ｎ−６、およびＯ−６置換プリンを含む。５−メチルシトシン置換は、０．６〜１．２℃で核酸二本鎖安定性を増加することを示し、ある特定の態様において、２’−Ｏ−メトキシエチル糖修飾と組み合せられる。それらの開示が参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第３，６８７，８０８号、米国特許第４，８４５，２０５号、同第５，１３０，３０２号、同第５，１３４，０６６号、同第５，１７５，２７３号、同第５，３６７，０６６号、同第５，４３２，２７２号、同第５，４５７，１８７号、同第５，４５９，２５５号、同第５，４８４，９０８号、同第５，５０２，１７７号、同第５，５２５，７１１号、同第５，５５２，５４０号、同第５，５８７，４６９号、同第５，５９４，１２１号、同第５，５９６，０９１号、同第５，６１４，６１７号、同第５，６４５，９８５号、同第５，８３０，６５３号、同第５，７６３，５８８号、同第６，００５，０９６号、同第５，７５０，６９２号、および同第５，６８１，９４１号を参照されたい。

所定の配列のポリヌクレオチドを生成するための方法が、周知である。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（２ｎｄ ｅｄ．１９８９）、およびＦ．Ｅｃｋｓｔｅｉｎ（ｅｄ．）Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ ａｎｄ Ａｎａｌｏｇｕｅｓ，１ｓｔ Ｅｄ．（Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９９１）を参照されたい。固相合成方法が、ポリリボヌクレオチドおよびポリデオキシリボヌクレオチドの両方に対して好ましい（ＤＮＡを合成する周知の方法もまたＲＮＡの合成に有用である）。ポリリボヌクレオチドはまた、酵素学的に調製され得る。非天然発生の核酸塩基は、ポリヌクレオチドに組み込まれることもできる。例えば、米国特許第７，２２３，８３３号、Ｋａｔｚ，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，７４：２２３８（１９５１）、Ｙａｍａｎｅ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，８３：２５９９（１９６１）、Ｋｏｓｔｕｒｋｏ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１３：３９４９（１９７４）、Ｔｈｏｍａｓ，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，７６：６０３２（１９５４）、Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１２７：７４−７５（２００５）、およびＺｉｍｍｅｒｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１２４：１３６８４−１３６８５（２００２）を参照されたい。

本開示のナノ抱合体は、概して、約５ヌクレオチド〜約１００ヌクレオチドの長さのポリヌクレオチドを含む。より具体的には、ナノ抱合体は、約５〜約９０ヌクレオチドの長さ、約５〜約８０ヌクレオチドの長さ、約５〜約７０ヌクレオチドの長さ、約５〜約６０ヌクレオチドの長さ、約５〜約５０ヌクレオチドの長さ、約５〜約４５ヌクレオチドの長さ、約５〜約４０ヌクレオチドの長さ、約５〜約３５ヌクレオチドの長さ、約５〜約３０ヌクレオチドの長さ、約５〜約２５ヌクレオチドの長さ、約５〜約２０ヌクレオチドの長さ、約５〜約１５ヌクレオチドの長さ、約５〜約１０ヌクレオチドの長さのポリヌクレオチド、ならびにポリヌクレオチドが所望の結果を達成することができる範囲において具体的に開示される大きさの中間の長さのすべてのポリヌクレオチドを含む。したがって、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００ヌクレオチド以上の長さのポリヌクレオチドが企図される。

一部の態様において、本明細書に記載されるポリヌクレオチドは、アルキンを含む。種々の実施形態において、１〜１００のアルキン部分が、ポリヌクレオチド上に存在する。さらなる態様において、約５〜約５０のアルキン部分、または約１０〜約２０のアルキン部分が、ポリヌクレオチド上に存在する。一態様において、１０のアルキン部分が、ポリヌクレオチド上に存在する。さらなる態様において、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００以上のアルキン部分が、ポリヌクレオチド上に存在する。

別の実施形態において、ポリヌクレオチド上のアルキン部分は、５’末端上である。さらなる実施形態において、ポリヌクレオチド上のアルキン部分は、３’末端上である。一部の態様において、アルキン部分は、ポリヌクレオチドの長さの一部分のみを表すと企図される。例として、ポリヌクレオチドが２０ヌクレオチドの長さの場合、次いで、最初の１０ヌクレオチド（種々の態様において、５’または３’末端のいずれかから数える）が、アルキン部分を含むと企図される。このため、合計２０ヌクレオチドのうちのアルキン部分を含む１０ヌクレオチドは、ポリヌクレオチド中のヌクレオチドの５０％をアルキン部分に結合する。種々の態様において、ポリヌクレオチド中のヌクレオチドの約０．０１％〜約１００％が、アルキン部分に結合すると企図される。さらなる態様において、ポリヌクレオチド中のヌクレオチドの約１％〜約７０％、または約２％〜約６０％、または約５％〜約５０％、または約１０％〜約５０％、または約１０％〜約４０％、または約２０％〜約５０％、または約２０％〜約４０％が、アルキン部分と結合する。

本明細書で定義されるポリヌクレオチドはまた、アプタマーを含む。アプタマーの生成および使用は、当業者に知られている。一般的に、アプタマーは、標的リガンドと密接に結合し、かつ慎重に区別することができる種と結合する核酸またはペプチドである［Ｙａｎ ｅｔ ａｌ．，ＲＮＡ Ｂｉｏｌ．６（３）３１６−３２０（２００９）、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる］。アプタマーは、一部の実施形態において、試験管内進化法（ＳＥＬＥＸ）プロセスと称される技術によって得ることができる［Ｔｕｅｒｋ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４９：５０５−１０（１９９０）、米国特許第５，２７０，１６３号、および米国特許第５，６３７，４５９号、それぞれ参照によりその全体が本明細書に組み込まれる］。核酸アプタマーの一般考察は、例えば、限定することなく、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ ａｎｄ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ａｐｔａｍｅｒｓ：Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ（Ｅｄｉｔｅｄ ｂｙ Ｍａｙｅｒ，Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ，２００９）、およびＣｒａｗｆｏｒｄ ｅｔ ａｌ．，Ｂｒｉｅｆｉｎｇｓ ｉｎ Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ ａｎｄ Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ ２（１）：７２−７９（２００３）で見られる。ＲＮＡアプタマーの選択、ＤＮＡアプタマーの選択、標的タンパク質に共有結合的に結合することができるアプタマーの選択、修飾アプタマーライブラリの使用、ならびに診断薬および治療薬としてのアプタマーの使用を含むが、これらに限定されないアプタマーのさらなる考察は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれるＭｏｌｅｋｕｌｙａｒｎａｙａ Ｂｉｏｌｏｇｉｙａ，Ｖｏｌ．３４，Ｎｏ．６，２０００，ｐｐ．１０９７〜１１１３から翻訳された、Ｋｏｐｙｌｏｖ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ３４（６）：９４０−９５４（２０００）に提供される。種々の実施形態において、アプタマーは、約１０〜約１００ヌクレオチドの長さである。
スペーサー

ある特定の態様において、ナノ抱合体は、ナノ抱合体がスペーサーをさらに含むポリヌクレオチドを含むものを含むと企図される。スペーサーは、種々の態様において、以下に記載されるように、１つ以上の架橋部分を含む。

「スペーサー」は、本明細書で使用される場合、１つ以上の架橋部分を含有する、またはナノ抱合体がナノ粒子を含む一部の態様において、ナノ粒子とポリヌクレオチドとの間の距離を増加するか、あるいは、複数のコピーにおいてナノ粒子に付着されるとき、個々のポリヌクレオチドの間の距離を増加するのに役立つ部分を意味する。ナノ抱合体が生物学的活性のために使用される本開示の態様において、スペーサーは、それが付着されるポリヌクレオチドの活性に直接関与しないと企図される。

このため、一部の態様において、スペーサーは、本明細書において１つ以上の架橋部分を介した架橋を促進すると企図される。スペーサーは、種々の態様において、ポリヌクレオチドが同じ配列を有するか、異なる配列を有するかにかかわらず、直列型の個々のポリヌクレオチド間に位置されるようなものであるとさらに企図される。一態様において、スペーサーは、存在するとき、有機部分である。別の態様において、スペーサーは、水溶性ポリマー、核酸、ポリペプチド、オリゴ糖、炭水化物、脂質、またはそれらの組み合わせを含むがこれらに限定されないポリマーである。

一部の実施形態において、スペーサーは、ナノ粒子に機能するが、他の生体分子に結合されない。これら実施形態において、スペーサーの機能は、生体内でナノ抱合体を保護することである。このため、一部の実施形態において、スペーサーは、ナノ粒子に機能する。さらなる実施形態において、スペーサーは、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）である。水溶性ポリマーがＰＥＧである実施形態において、ＰＥＧは、共有結合を介してナノ粒子に機能すると企図される。一部の実施形態において、ＰＥＧは、チオール結合を介してナノ粒子に付着している。ＰＥＧ化は、循環中ナノ抱合体を保護し、その薬力学的および薬物動態学的プロファイルを改善すると企図される［Ｈａｒｒｉｓ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖ．２：２１４−２１（２００３）］。ＰＥＧ化プロセスは、エチレングリコール（ポリエチレングリコール（ＰＥＧ））の反復単位をナノ粒子に付着する。ＰＥＧ分子は、大きい流体力学的体積（球状タンパク質の大きさの５〜１０倍）を有し、易水溶性および水和性、非毒性、非免疫原性であり、身体から迅速に排除される。ナノ抱合体のＰＥＧ化は、種々の実施形態において、酵素的分解に対する増加した抵抗性、上昇した生体内半減期、減少された投薬頻度、低下した免疫原性、増加した物理および熱安定性、増加した溶解性、増加した液体安定性、ならびに減少した凝集をもたらす。

スペーサーの長さは、種々の実施形態において、少なくとも約５ヌクレオチド、少なくとも約１０ヌクレオチド、１０〜３０ヌクレオチド、またはさらに３０ヌクレオチドを超える。スペーサーは、ナノ粒子に、または標的ポリヌクレオチドに結合するポリヌクレオチドの能力に干渉しない任意の配列を有し得る。スペーサーは、互いに、またはポリヌクレオチドのものに対して相補的な配列を有すべきではないが、すべてまたは一部において標的ポリヌクレオチドに相補的であってもよい。ある特定の態様において、ポリヌクレオチドスペーサーの塩基は、すべてアデニン、すべてチミン、すべてシチジン、すべてグアニン、すべてウラシル、またはすべていくつかの他の修飾塩基である。
修飾されたポリヌクレオチド

上記で考察されるように、修飾されたポリヌクレオチドは、ナノ抱合体の生成における使用が企図される。種々の態様において、ポリヌクレオチドは、完全に修飾されるか、あるいは部分的に修飾される。このため、種々の態様において、ポリヌクレオチド中のヌクレオチド単位の１つ以上の、もしくはすべての糖および／または１つ以上の、もしくはすべてのヌクレオチド間結合は、「非天然発生」基で置き換えられる。

一態様において、本実施形態は、ペプチド核酸（ＰＮＡ）を熟考する。ＰＮＡ化合物において、ポリヌクレオチドの糖骨格は、骨格を含有するアミドで置き換えられる。例えば、米国特許第５，５３９，０８２号、同第５，７１４，３３１、および同第５，７１９，２６２号、ならびにＮｉｅｌｓｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９９１，２５４，１４９７−１５００を参照されたく、それらの開示は、参照により本明細書に組み込まれる。

開示されるポリヌクレオチドについて企図されるヌクレオチドと非天然ヌクレオチドとの間の他の結合は、米国特許第４，９８１，９５７号、同第５，１１８，８００号、同第５，３１９，０８０号、同第５，３５９，０４４号、同第５，３９３，８７８号、同第５，４４６，１３７号、同第５，４６６，７８６号、同第５，５１４，７８５号、同第５，５１９，１３４号、同第５，５６７，８１１号、同第５，５７６，４２７号、同第５，５９１，７２２号、同第５，５９７，９０９号、同第５，６１０，３００号、同第５，６２７，０５３号、同第５，６３９，８７３号、同第５，６４６，２６５号、同第５，６５８，８７３号、同第５，６７０，６３３号、同第５，７９２，７４７号、および同第５，７００，９２０号、米国特許公開第２００４０２１９５６５号、国際特許公開第ＷＯ ９８／３９３５２号、および同第ＷＯ ９９／１４２２６号、Ｍｅｓｍａｅｋｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ ５：３４３−３５５（１９９５）、ならびにＳｕｓａｎ Ｍ．Ｆｒｅｉｅｒ ａｎｄ Ｋａｒｌ−Ｈｅｉｎｚ Ａｌｔｍａｎｎ，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２５：４４２９−４４４３（１９９７）で記載されるものを含み、それらの開示は参照により本明細書に組み込まれる。

ポリヌクレオチドの具体的な例は、修飾骨格または非天然ヌクレオシド間結合を含有するものを含む。修飾骨格を有するポリヌクレオチドは、骨格内にリン原子を保持するもの、および骨格内にリン原子を有さないものを含む。それらのヌクレオシド間骨格内にリン原子を有さない修飾されたポリヌクレオチドは、「ポリヌクレオチド」の意義の範囲内であると見なされる。

リン原子を含有する修飾されたポリヌクレオチド骨格は、例えば、ホスホロチオエート、キラルホスホロチオエート、ジチオリン酸、ホスホトリエステル、アミノアルキルホスホトリエステル、３’−アルキレンホスホン酸塩、５’−アルキレンホスホン酸塩およびキラルホスホン酸塩を含むメチルおよび他のアルキルホスホン酸塩、ホスフィン酸塩、３’−アミノホスホロアミド酸塩およびアミノアルキルホスホロアミド酸塩を含むホスホロアミド酸塩、チオノホスホロアミド酸塩、チオノアルキルホスホン酸塩、チオノアルキルホスホトリエステル、これらの正常な３’−５’結合、２’−５’結合類似体を有するセレノリン酸塩およびボラノリン酸塩、ならびに１つ以上のヌクレオチド間結合が、３’−３’、５’−５’、または２’−２’結合である反転極性を有するものを含む。最も３’−側のヌクレオチド間結合に単一の３’−３’結合、すなわち脱塩基であってもよい単一反転ヌクレオシド残基（ヌクレオチドが欠損しているか、またはその位置にヒドロキシル基を有する）を含む、反転極性を有するポリヌクレオチドも企図される。塩類、混合塩、および遊離酸形態も企図される。

上記のリン含有結合の調製を教示する代表的な米国特許としては、米国特許第３，６８７，８０８号、同第４，４６９，８６３号、同第４，４７６，３０１号、同第５，０２３，２４３号、同第５，１７７，１９６号、同第５，１８８，８９７号、同第５，２６４，４２３号、同第５，２７６，０１９号、同第５，２７８，３０２号、同第５，２８６，７１７号、同第５，３２１，１３１号、同第５，３９９，６７６号、同第５，４０５，９３９号、同第５，４５３，４９６号、同第５，４５５，２３３号、同第５，４６６，６７７号、同第５，４７６，９２５号、同第５，５１９，１２６号、同第５，５３６，８２１号、同第５，５４１，３０６号、同第５，５５０，１１１号、同第５，５６３，２５３号、同第５，５７１，７９９号、同第５，５８７，３６１号、同第５，１９４，５９９号、同第５，５６５，５５５号、同第５，５２７，８９９号、同第５，７２１，２１８号、同第５，６７２，６９７号、および同第５，６２５，０５０号が挙げられ、それらの開示は参照により本明細書に組み込まれる。

リン原子を含まない修飾されたポリヌクレオチド骨格は、短鎖アルキルもしくはシクロアルキルヌクレオシド間結合、混合ヘテロ原子およびアルキルもしくはシクロアルキルヌクレオシド間結合、または１つ以上の短鎖ヘテロ原子もしくは複素環式ヌクレオシド間結合により形成される骨格を有する。これらは、モルホリノ結合、シロキサン骨格、スルフィド、スルホキシドおよびスルホン骨格、ホルムアセチルおよびチオホルムアセチル骨格、メチレンホルムアセチルおよびチオホルムアセチル骨格、リボアセチル骨格、アルケン含有骨格、スルファミン酸塩骨格、メチレンイミノおよびメチレンヒドラジノ骨格、スルホン酸およびスルホンアミド骨格、アミド骨格、および混合Ｎ、Ｏ、ＳおよびＣＨ_２構成要素を有する他のものを有するものを含む。さらに他の実施形態において、ポリヌクレオチドにはホスホロチオエート骨格が提供され、オリゴヌクレオシドにはヘテロ原子骨格が提供され、米国特許第５，４８９，６７７号、および同第５，６０２，２４０号に記載される-ＣＨ２-ＮＨ-Ｏ-ＣＨ２-、-ＣＨ２-Ｎ（ＣＨ３）-Ｏ-ＣＨ２-、-ＣＨ２-Ｏ-Ｎ（ＣＨ３）-ＣＨ２-、-ＣＨ２-Ｎ（ＣＨ３）-Ｎ（ＣＨ３）-ＣＨ２-、および-Ｏ-Ｎ（ＣＨ３）-ＣＨ２-ＣＨ２-を含む。例えば、米国特許第５，０３４，５０６号、同第５，１６６，３１５号、同第５，１８５，４４４号、同第５，２１４，１３４号、同第５，２１６，１４１号、同第５，２３５，０３３号、同第５，２６４，５６２号、同第５，２６４，５６４号、同第５，４０５，９３８号、同第５，４３４，２５７号、同第５，４６６，６７７号、同第５，４７０，９６７号、同第５，４８９，６７７号、同第５，５４１，３０７号、同第５，５６１，２２５号、同第５，５９６，０８６号、同第５，６０２，２４０号、同第５，６１０，２８９号、同第５，６０２，２４０号、同第５，６０８，０４６号、同第５，６１０，２８９号、同第５，６１８，７０４号、同第５，６２３，０７０号、同第５，６６３，３１２号、同第５，６３３，３６０号、同第５，６７７，４３７号、同第５，７９２，６０８号、同第５，６４６，２６９号、および同第５，６７７，４３９号を参照されたく、それらの開示は参照により本明細書に組み込まれる。

種々の形態において、ポリヌクレオチド内の２つの連続したモノマー間の結合は、-ＣＨ２-、-Ｏ-、-Ｓ-、-ＮＲＨ-、＞Ｃ＝Ｏ、＞Ｃ＝ＮＲＨ、＞Ｃ＝Ｓ、-Ｓｉ（Ｒ”）２-、-ＳＯ-、-Ｓ（Ｏ）２-、-Ｐ（Ｏ）２-、-ＰＯ（ＢＨ３）-、-Ｐ（Ｏ，Ｓ）-、-Ｐ（Ｓ）２-、-ＰＯ（Ｒ”）-、-ＰＯ（ＯＣＨ３）-、および-ＰＯ（ＮＨＲＨ）-から選択される２〜４個、望ましくは３個の基／原子から成り、式中、ＲＨは水素およびＣ１−４アルキルから選択され、Ｒ”はＣ１−６アルキルおよびフェニルから選択される。そのような結合の例示的な例は、-ＣＨ２-ＣＨ２-ＣＨ２-、-ＣＨ２-ＣＯ-ＣＨ２-、-ＣＨ２-ＣＨＯＨ-ＣＨ２-、-Ｏ-ＣＨ２-Ｏ-、-Ｏ-ＣＨ２-ＣＨ２-、-Ｏ-ＣＨ２-ＣＨ＝（後続モノマーへの結合として使用されるとき、Ｒ５を含む）、-ＣＨ２-ＣＨ２-Ｏ-、-ＮＲＨ-ＣＨ２-ＣＨ２-、-ＣＨ２-ＣＨ２-ＮＲＨ-、-ＣＨ２-ＮＲＨ-ＣＨ２-−、-Ｏ-ＣＨ２-ＣＨ２-ＮＲＨ-、-ＮＲＨ-ＣＯ-Ｏ-、-ＮＲＨ-ＣＯ-ＮＲＨ-、-ＮＲＨ-ＣＳ-ＮＲＨ-、-ＮＲＨ-Ｃ（＝ＮＲＨ）-ＮＲＨ-、-ＮＲＨ-ＣＯ-ＣＨ２-ＮＲＨ-Ｏ-ＣＯ-Ｏ-、-Ｏ-ＣＯ-ＣＨ２-Ｏ-、-Ｏ-ＣＨ２-ＣＯ-Ｏ-、-ＣＨ２-ＣＯ-ＮＲＨ-、-Ｏ-ＣＯ-ＮＲＨ-、-ＮＲＨ-ＣＯ-ＣＨ２-、-Ｏ-ＣＨ２-ＣＯ-ＮＲＨ-、-Ｏ-ＣＨ２-ＣＨ２-ＮＲＨ-、-ＣＨ＝Ｎ-Ｏ-、-ＣＨ２-ＮＲＨ-Ｏ-、-ＣＨ２-Ｏ-Ｎ＝（後続モノマーへの結合として使用されるとき、Ｒ５を含む）、-ＣＨ２-Ｏ-ＮＲＨ-、-ＣＯ-ＮＲＨ-ＣＨ２-、-ＣＨ２-ＮＲＨ-Ｏ-、-ＣＨ２-ＮＲＨ-ＣＯ-、-Ｏ-ＮＲＨ-ＣＨ２-、-Ｏ-ＮＲＨ、-Ｏ-ＣＨ２-Ｓ-、-Ｓ-ＣＨ２-Ｏ-、-ＣＨ２-ＣＨ２-Ｓ-、-Ｏ-ＣＨ２-ＣＨ２-Ｓ-、-Ｓ-ＣＨ２-ＣＨ＝（後続モノマーへの結合として使用されるとき、Ｒ５を含む）、-Ｓ-ＣＨ２-ＣＨ２-、-Ｓ-ＣＨ２-ＣＨ２-Ｏ-、-Ｓ-ＣＨ２-ＣＨ２-Ｓ-、-ＣＨ２-Ｓ-ＣＨ２-、-ＣＨ２-ＳＯ-ＣＨ２-、-ＣＨ２-ＳＯ２-ＣＨ２-、-Ｏ-ＳＯ-Ｏ-、-Ｏ-Ｓ（Ｏ）２-Ｏ-、-Ｏ-Ｓ（Ｏ）２-ＣＨ２-、-Ｏ-Ｓ（Ｏ）２-ＮＲＨ-、-ＮＲＨ-Ｓ（Ｏ）２-ＣＨ２-；-Ｏ-Ｓ（Ｏ）２-ＣＨ２-、-Ｏ-Ｐ（Ｏ）２-Ｏ-、-Ｏ-Ｐ（Ｏ，Ｓ）-Ｏ-、-Ｏ-Ｐ（Ｓ）２-Ｏ-、-Ｓ-Ｐ（Ｏ）２-Ｏ-、-Ｓ-Ｐ（Ｏ，Ｓ）-Ｏ-、-Ｓ-Ｐ（Ｓ）２-Ｏ-、-Ｏ-Ｐ（Ｏ）２-Ｓ-、-Ｏ-Ｐ（Ｏ，Ｓ）-Ｓ-、-Ｏ-Ｐ（Ｓ）２-Ｓ-、-Ｓ-Ｐ（Ｏ）２-Ｓ-、-Ｓ-Ｐ（Ｏ，Ｓ）-Ｓ-、-Ｓ-Ｐ（Ｓ）２-Ｓ-、-Ｏ-ＰＯ（Ｒ”）-Ｏ-、-Ｏ-ＰＯ（ＯＣＨ３）-Ｏ-、-Ｏ-ＰＯ（ＯＣＨ２ＣＨ３）-Ｏ-、-Ｏ-ＰＯ（ＯＣＨ２ＣＨ２Ｓ-Ｒ）-Ｏ-、-Ｏ-ＰＯ（ＢＨ３）-Ｏ-、-Ｏ-ＰＯ（ＮＨＲＮ）-Ｏ-、-Ｏ-Ｐ（Ｏ）２-ＮＲＨＨ-、-ＮＲＨ-Ｐ（Ｏ）２-Ｏ-、-Ｏ-Ｐ（Ｏ，ＮＲＨ）-Ｏ-、-ＣＨ２-Ｐ（Ｏ）２-Ｏ-、-Ｏ-Ｐ（Ｏ）２-ＣＨ２-、および-Ｏ-Ｓｉ（Ｒ”）２-Ｏ-であり、とりわけ-ＣＨ２-ＣＯ-ＮＲＨ-、-ＣＨ２-ＮＲＨ-Ｏ-、-Ｓ-ＣＨ２-Ｏ-、-Ｏ-Ｐ（Ｏ）２-Ｏ-Ｏ-Ｐ（−Ｏ，Ｓ）-Ｏ-、-Ｏ-Ｐ（Ｓ）２-Ｏ-、-ＮＲＨＰ（Ｏ）２-Ｏ-、-Ｏ-Ｐ（Ｏ，ＮＲＨ）-Ｏ-、-Ｏ-ＰＯ（Ｒ”）-Ｏ-、-Ｏ-ＰＯ（ＣＨ３）-Ｏ-、および-Ｏ-ＰＯ（ＮＨＲＮ）-Ｏ-が企図され、式中、ＲＨは水素およびＣ１−４アルキルから選択され、Ｒ”はＣ１−６アルキルおよびフェニルから選択される。さらなる例示的な例は、Ｍｅｓｍａｅｋｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９９５ Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ，５：３４３−３５５、およびＳｕｓａｎ Ｍ．Ｆｒｅｉｅｒ ａｎｄ Ｋａｒｌ−Ｈｅｉｎｚ Ａｌｔｍａｎｎ，１９９７，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，ｖｏｌ ２５：ｐｐ ４４２９−４４４３に記載される。

ポリヌクレオチドのさらに他の修飾された形態は、米国特許出願第２００４０２１９５６５号に詳細に記載されており、その開示は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。

修飾されたポリヌクレオチドは、１つ以上の置換糖部分も含有してもよい。ある特定の態様において、ポリヌクレオチドは、２’位に、ＯＨ；Ｆ；Ｏ−、Ｓ−、もしくはＮ−アルキル；Ｏ−、Ｓ−、もしくはＮ−アルケニル；Ｏ−、Ｓ−、もしくはＮ−アルキニル；またはＯ−アルキル−Ｏ−アルキルのうちの１つを含み、それらのアルキル、アルケニル、およびアルキニルは、置換または非置換のＣ１〜Ｃ１０アルキルまたはＣ２〜Ｃ１０アルケニルおよびアルキニルであってもよい。他の実施形態には、Ｏ［（ＣＨ２）ｎＯ］ｍＣＨ３、Ｏ（ＣＨ２）ｎＯＣＨ３、Ｏ（ＣＨ２）ｎＮＨ２、Ｏ（ＣＨ２）ｎＣＨ３、Ｏ（ＣＨ２）ｎＯＮＨ２、およびＯ（ＣＨ２）ｎＯＮ［（ＣＨ２）ｎＣＨ３］２が含まれ、式中、ｎおよびｍは１〜約１０である。他のポリヌクレオチドは、２’位に、Ｃ１〜Ｃ１０低級アルキル、置換低級アルキル、アルケニル、アルキニル、アルカリル、アラルキル、Ｏ−アルカリルもしくはＯ−アラルキル、ＳＨ、ＳＣＨ３、ＯＣＮ、Ｃｌ、Ｂｒ、ＣＮ、ＣＦ３、ＯＣＦ３、ＳＯＣＨ３、ＳＯ２ＣＨ３、ＯＮＯ２、ＮＯ２、Ｎ３、ＮＨ２、ヘテロシクロアルキル、ヘテロシクロアルカリル、アミノアルキルアミノ、ポリアルキルアミノ、置換シリル、ＲＮＡ切断基、レポーター基、介入物、ポリヌクレオチドの薬物動態特性を改善するための基、またはポリヌクレオチドの薬力学的特性を改善するための基、ならびに類似の特性を有する他の置換基のうちの１つを含む。一態様において、修飾は、２’−メトキシエトキシ（２’−Ｏ−ＣＨ２ＣＨ２ＯＣＨ３であって、２’−Ｏ−（２−メトキシエチル）または２’−ＭＯＥとしても知られる）（Ｍａｒｔｉｎ ｅｔ ａｌ．，１９９５，Ｈｅｌｖ．Ｃｈｉｍ．Ａｃｔａ，７８：４８６−５０４）、すなわち、アルコキシアルコキシ基を含む。他の修飾は、２’−ジメチルアミノオキシエトキシ、すなわち、２’−ＤＭＡＯＥとしても知られるＯ（ＣＨ２）２ＯＮ（ＣＨ３）２基、および２’−ジメチルアミノエトキシエトキシ（当技術分野で２’−Ｏ−ジメチル−アミノ−エトキシ−エチルまたは２’−ＤＭＡＥＯＥとしても知られている）、すなわち、２’−Ｏ-ＣＨ２-Ｏ-ＣＨ２-Ｎ（ＣＨ３）２を含む。

さらに他の修飾は、２’−メトキシ（２’−Ｏ-ＣＨ３）、２’−アミノプロポキシ（２’−ＯＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＮＨ２）、２’−アリル（２’−ＣＨ２-ＣＨ＝ＣＨ２）、２’−Ｏ−アリル（２’−Ｏ-ＣＨ２-ＣＨ＝ＣＨ２）、および２’−フルオロ（２’−Ｆ）を含む。２’−修飾は、アラビノ（上）位またはリボ（下）位であってもよい。一態様において、２’−アラビノ修飾は、２’−Ｆである。同様の修飾が、ポリヌクレオチド上の他の位置で、例えば、３’末端ヌクレオチド上または２’−５’結合ポリヌクレオチド内の糖の３’位、および５’末端ヌクレオチドの５’位で行われてもよい。ポリヌクレオチドは、ペントフラノシル糖の代わりに、シクロブチル部分等の糖模擬体も有してもよい。例えば、米国特許第４，９８１，９５７号、同第５，１１８，８００号、同第５，３１９，０８０号、同第５，３５９，０４４号、同第５，３９３，８７８号、同第５，４４６，１３７号、同第５，４６６，７８６号、同第５，５１４，７８５号、同第５，５１９，１３４号、同第５，５６７，８１１号、同第５，５７６，４２７号、同第５，５９１，７２２号、同第５，５９７，９０９号、同第５，６１０，３００号、同第５，６２７，０５３号、同第５，６３９，８７３号、同第５，６４６，２６５号、同第５，６５８，８７３号、同第５，６７０，６３３号、同第５，７９２，７４７号、および同第５，７００，９２０号を参照されたく、それらの開示は、参照により本明細書に組み込まれる。

一態様において、糖の修飾は、２’−ヒドロキシル基が糖環の３’または４’炭素原子に結合され、それによって二環式糖部分を形成するロックド核酸（ＬＮＡ）を含む。この結合は、ある特定の態様において、２’酸素原子と４’炭素原子とを架橋するメチレン（−ＣＨ２−）_ｎ基であり、式中、ｎは１または２である。ＬＮＡおよびその調製物は、国際公開第９８／３９３５２号および同第９９／１４２２６号に記載されており、それらの開示は参照により本明細書に組み込まれる。
ポリヌクレオチド特徴

本開示のナノ抱合体は、種々の態様において、複数のポリヌクレオチドを含む。その結果、各ナノ抱合体は、十分に相補的な配列を有する複数の標的ポリヌクレオチドに結合する能力を有する。例えば、特定のポリヌクレオチドが標的とされる場合、単一のナノ抱合体は、同じ分子の複数のコピーに結合する能力を有する。一態様において、ナノ抱合体が同一ポリヌクレオチドを含む、すなわち、各ポリヌクレオチドが同じ長さおよび同じ配列を有する方法が提供される。他の態様において、ナノ抱合体は、同一ではない２つ以上のポリヌクレオチドを含む、すなわち、ナノ抱合体のポリヌクレオチドのうちの少なくとも１つが、それが異なる長さおよび／または異なる配列を有するという点において、ナノ抱合体の少なくとも１つの他のポリヌクレオチドと異なる。ナノ抱合体が異なるポリヌクレオチドを含む態様において、これらの異なるポリヌクレオチドは、同じ単一の標的ポリヌクレオチドと異なる位置で結合するか、あるいは異なる遺伝子産物をコードする異なる標的ポリヌクレオチドと結合する。したがって、種々の態様において、単一のナノ抱合体は、１つを超える遺伝子産物の発現を阻害するための方法において使用され得る。それ故に、ポリヌクレオチドは、標的ポリヌクレオチド内の１つ以上の特定の領域においてか、標的ポリヌクレオチドの全長にわたってかどうかにかかわらず、所望のレベルの遺伝子発現の阻害をもたらす必要性があり得るため、特定のポリヌクレオチドを標的にするように使用される。

したがって、一態様において、ポリヌクレオチドは、標的配列の知識を用いて設計される。代替として、ナノ抱合体内のポリヌクレオチドは、本明細書に記載されるような所望の効果を達成するために標的ポリヌクレオチドとハイブリッド形成する必要はない。

ナノ抱合体の生成が企図されるポリヌクレオチドは、一態様において、標的ポリヌクレオチドから発現される遺伝子産物の発現を制御するものを含む。したがって、標的ポリヌクレオチドとハイブリッド形成し、かつ翻訳を阻害するアンチセンスポリヌクレオチド、標的ポリヌクレオチドとハイブリッド形成し、かつＲＮＡｓｅ活性（例えばＲＮＡｓｅＨ）を開始するｓｉＲＮＡポリヌクレオチド、二重鎖ポリヌクレオチドとハイブリッド形成し、かつ転写を阻害する三重らせん形成性ポリヌクレオチド、ならびに標的ポリヌクレオチドとハイブリッド形成し、かつ翻訳を阻害するリボザイムが企図される。

一部の態様において、ポリヌクレオチドベースのナノ抱合体は、ナノ抱合体の効率的な取り込みを可能にする。種々の態様において、ポリヌクレオチドは、ナノ抱合体の増加した取り込み効率を可能にするヌクレオチド配列を含む。本明細書で使用される場合、「効率」は、細胞における／細胞によるナノ抱合体の取り込みの数または割合を指す。ナノ抱合体の細胞への進入および退出のプロセスは動的なものであるため、効率は、より多くのナノ抱合体を取り込むことにより、または細胞に進入するそれらのナノ抱合体をより長期間保持することにより増加させることができる。同様に、効率は、より少ないナノ抱合体を取り込むことにより、または細胞に進入するそれらのナノ抱合体をより短期間保持することにより減少させることができる。

このため、ヌクレオチド配列は、所望される任意のヌクレオチド配列であってもよく、種々の態様において、ナノ抱合体の細胞取り込みもしくは遺伝子制御の増加または減少のために選択することができる。ヌクレオチド配列は、一部の態様において、ポリヌクレオチドが付着するナノ粒子が細胞によって取り込まれる効率に影響するホモポリマー配列を含む。したがって、ホモポリマー配列は、効率を増加または減少する。種々の態様において、ヌクレオチド配列は、それが厳密にホモポリマー配列ではないように、核酸塩基の組み合わせであることもまた企図される。例えば、限定することなく、種々の態様において、ヌクレオチド配列は、２つのチミジンの後に２つのウリジンが続く交互のチミジンおよびウリジン残基を含むか、あるいは増加した取り込みに影響する任意の組み合わせが本開示によって企図される。一部の態様において、取り込み効率に影響するヌクレオチド配列は、追加の配列を含むポリヌクレオチド中にドメインとして含まれる。この「ドメイン」は、追加のヌクレオチド配列が例えば、限定することなく、遺伝子発現を制御するのに役立つことになる一方、取り込み効率に影響する特徴として機能するのに役立つことになる。種々の態様において、ポリヌクレオチド中のドメインは、ナノ抱合体に対して、近位、遠位、または中心位置のいずれかであり得る。ポリヌクレオチドが、１つを超えるドメインを含むことがまた企図される。

ホモポリマー配列は、一部の実施形態において、細胞によるナノ抱合体の取り込みの効率を増加する。一部の態様において、ホモポリマー配列は、チミジン残基（ポリＴ）またはウリジン残基（ポリＵ）の配列を含む。さらなる態様において、ポリＴまたはポリＵ配列は、２つのチミジンまたはウリジンを含む。種々の態様において、ポリＴまたはポリＵ配列は、約３〜約５００のチミジンまたはウリジン残基を含む。さらなる実施形態において、ポリＴまたはポリＵ配列は、約３〜約１０、約２０、約３０、約４０、約５０、約６０、約７０、約８０、約９０、約１００、約１５０、約２００以上のチミジンまたはウリジン残基を含む。一部の実施形態において、ポリＴまたはポリＵ配列は、約１０〜約５０、約２０〜約１００、または約４０〜約２００のチミジンまたはウリジン残基を含む。したがって、種々の実施形態において、ポリＴまたはポリＵ配列は、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、約５５、約６０、約６５、約７０、約７５、約８０、約８５、約９０、約９５、約１００、約１２５、約１５０、約１７５、約２００、約２５０、約３００、約３５０、約４００、約４５０、約５００以上のチミジンまたはウリジン残基を含む。

一部の実施形態において、ホモポリマー配列を含むポリヌクレオチドを含むナノ抱合体が、同じポリヌクレオチドを含むがホモポリマー配列を欠損するナノ抱合体よりも高い効率で、細胞によって取り込まれることが企図される。種々の態様において、ホモポリマー配列を含むポリヌクレオチドを含むナノ抱合体は、同じポリヌクレオチドを含むがホモポリマー配列を欠損するナノ抱合体よりも約２倍、約３倍、約４倍、約５倍、約６倍、約７倍、約８倍、約９倍、約１０倍、約２０倍、約３０倍、約４０倍、約５０倍、約１００倍以上、より効率的に細胞によって取り込まれる。

他の態様において、ドメインは、リン酸塩ポリマー（Ｃ３残基）である。一部の態様において、ドメインは、２つのリン酸塩から成るリン酸塩ポリマー（Ｃ３残基）を含む。一部の実施形態において、Ｃ３残基は、約３〜約５００、または約５〜約５０のリン酸塩、または約１０〜約５０のリン酸塩、または約２０〜約７０のリン酸塩、または約５０〜約２００のリン酸塩を含む。種々の態様において、Ｃ３残基は、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、約５５、約６０、約６５、約７０、約７５、約８０、約８５、約９０、約９５、約１００、約１２５、約１５０、約１７５、約２００、約２５０、約３００、約３５０、約４００、約４５０、約５００以上のリン酸塩を含む。

一部の実施形態において、ドメインを含むポリヌクレオチドを含むナノ抱合体は、同じポリヌクレオチドを含むがドメインを欠損するナノ抱合体よりも低い効率で、細胞によって取り込まれると企図される。種々の態様において、ドメインを含むポリヌクレオチドを含むナノ抱合体は、同じポリヌクレオチドを含むがドメインを欠損するナノ抱合体よりも約２倍、約３倍、約４倍、約５倍、約６倍、約７倍、約８倍、約９倍、約１０倍、約２０倍、約３０倍、約４０倍、約５０倍、約１００倍以上、効率悪く細胞によって取り込まれる。

ナノ抱合体およびポリヌクレオチドとの所望の組み合わせのための、ナノ抱合体を安定させるために適した面密度、およびそれを得るために必要な条件は、経験的に判断され得る。概して、少なくとも２ピコモル／ｃｍ^２の面密度が、安定したナノ抱合体−ポリヌクレオチド組成物を提供するのに適しているであろう。一部の態様において、面密度は少なくとも１５ピコモル／ｃｍ^２である。さらなる態様において、ポリヌクレオチドは、約０．３ピコモル／ｃｍ^２〜約１０ピコモル／ｃｍ^２、または約０．６ピコモル／ｃｍ^２〜約１５ピコモル／ｃｍ^２、または約１ピコモル／ｃｍ^２〜約２０ピコモル／ｃｍ^２、または約０．３ピコモル／ｃｍ^２〜約１００ピコモル／ｃｍ^２の面密度でナノ抱合体に結合される。ポリヌクレオチドが、少なくとも２ピコモル／ｃｍ^２、少なくとも３ピコモル／ｃｍ^２、少なくとも４ピコモル／ｃｍ^２、少なくとも５ピコモル／ｃｍ^２、少なくとも６ピコモル／ｃｍ^２、少なくとも７ピコモル／ｃｍ^２、少なくとも８ピコモル／ｃｍ^２、少なくとも９ピコモル／ｃｍ^２、少なくとも１０ピコモル／ｃｍ^２、少なくとも約１５ピコモル／ｃｍ^２、少なくとも約１９ピコモル／ｃｍ^２、少なくとも約２０ピコモル／ｃｍ^２、少なくとも約２５ピコモル／ｃｍ^２、少なくとも約３０ピコモル／ｃｍ^２、少なくとも約３５ピコモル／ｃｍ^２、少なくとも約４０ピコモル／ｃｍ^２、少なくとも約４５ピコモル／ｃｍ^２、少なくとも約５０ピコモル／ｃｍ^２、少なくとも約５５ピコモル／ｃｍ^２、少なくとも約６０ピコモル／ｃｍ^２、少なくとも約６５ピコモル／ｃｍ^２、少なくとも約７０ピコモル／ｃｍ^２、少なくとも約７５ピコモル／ｃｍ^２、少なくとも約８０ピコモル／ｃｍ^２、少なくとも約８５ピコモル／ｃｍ^２、少なくとも約９０ピコモル／ｃｍ^２、少なくとも約９５ピコモル／ｃｍ^２、少なくとも約１００ピコモル／ｃｍ^２、少なくとも約１２５ピコモル／ｃｍ^２、少なくとも約１５０ピコモル／ｃｍ^２、少なくとも約１７５ピコモル／ｃｍ^２、少なくとも約２００ピコモル／ｃｍ^２、少なくとも約２５０ピコモル／ｃｍ^２、少なくとも約３００ピコモル／ｃｍ^２、少なくとも約３５０ピコモル／ｃｍ^２、少なくとも約４００ピコモル／ｃｍ^２、少なくとも約４５０ピコモル／ｃｍ^２、少なくとも約５００ピコモル／ｃｍ^２、少なくとも約５５０ピコモル／ｃｍ^２、少なくとも約６００ピコモル／ｃｍ^２、少なくとも約６５０ピコモル／ｃｍ^２、少なくとも約７００ピコモル／ｃｍ^２、少なくとも約７５０ピコモル／ｃｍ^２、少なくとも約８００ピコモル／ｃｍ^２、少なくとも約８５０ピコモル／ｃｍ^２、少なくとも約９００ピコモル／ｃｍ^２、少なくとも約９５０ピコモル／ｃｍ^２、少なくとも約１０００ピコモル／ｃｍ^２以上の面密度でナノ抱合体に結合される方法がまた提供される。

本明細書で使用される場合、「抱合部位」は、造影剤がそこに付着されるポリヌクレオチド上の部位を意味すると理解される。造影剤をポリヌクレオチドに付着する方法は、概して、当技術分野で知られている［例えば、Ｓｏｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｃｈｅｍ Ｉｎｇ Ｅｎｇｌ ４８（４８）：９１４３−９１４７（２００９）を参照されたい］。ある特定の態様において、本開示はまた、ナノ抱合体の一部である１つ以上のポリヌクレオチドが抱合部位を含む一方、抱合部位を含まない同じナノ抱合体の一部である１つ以上のポリヌクレオチドを提供する。抱合部位を通る造影剤のナノ抱合体への抱合は、概して、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる国際出願ＰＣＴ／ＵＳ２０１０／４４８４４号に記載される。本開示は、一態様において、ポリヌクレオチドを含むナノ抱合体を提供し、ポリヌクレオチドは、１〜約１０の抱合部位を含む。別の態様において、ポリヌクレオチドは、５つの抱合部位を含む。一般的に、ヌクレオチドのその骨格（リン酸基）および核酸塩基の両方は、修飾され得る。したがって、本開示は、２ｎ抱合部位が存在すると企図し、そこで、ｎ＝ポリヌクレオチド鋳型の長さである。関連する態様において、組成物は、複数のポリヌクレオチドを含むナノ抱合体を含むと企図される。一部の態様において、複数のポリヌクレオチドは、造影剤が１つ以上の抱合部位を通ってそこに結合される少なくとも１つのポリヌクレオチド、ならびに本明細書に記載される遺伝子制御活性を有する少なくとも１つのポリヌクレオチドを含む。

したがって、一部の実施形態において、ナノ抱合体の一部である１つ以上のポリヌクレオチドが造影剤に抱合される一方、同じナノ抱合体の一部である１つ以上のポリヌクレオチドが造影剤に抱合されないと企図される。
ポリヌクレオチドマーカー／標識

本明細書に記載されるポリヌクレオチドは、種々の態様において、任意に検出可能な標識を含む。したがって、本開示は、ポリヌクレオチドハイブリダイゼーションが検出可能な変化によって検出される組成物および方法を提供する。一態様において、ハイブリダイゼーションは、肉眼で、または分光学的に観察される色の変化を生じさせる。

ポリヌクレオチドハイブリダイゼーションから生じる検出可能な変化を可視化するための方法はまた、限定することなく、蛍光顕微鏡法、マイクロタイタープレートリーダー、または蛍光励起細胞分取器（ＦＡＣＳ）を含む、任意の蛍光検出法を含む。

本開示によって企図される標識は、本明細書に記載されるフルオロフォアのいずれか、ならびに当技術分野で知られている他の検出可能な標識を含むことが理解されるであろう。例えば、標識にはまた、レドックスアクティブプローブ（ｒｅｄｏｘ ａｃｔｉｖｅ ｐｒｏｂｅ）、化学発光分子、放射性標識、色素、蛍光分子、リン光分子、以下に記載されるイメージング剤および／または造影剤、量子ドット、ならびに分光学的手法を使用して検出され得る任意のマーカー、すなわち、顕微鏡法および細胞数測定を使用して検出可能なそれらのマーカーが挙げられるが、これらに限定されない。検出可能な標識が検出される本開示の態様において、本開示は、任意の発光、蛍光、もしくはリン光分子または粒子が、貴金属表面によって、または当技術分野で知られている消光分子によって、効率的に反応停止される（本開示によって企図される消光分子には、Ｄａｂｓｙｌ（ジメチルアミノアゾベンゼンスルホン酸）、Ｂｌａｃｋ Ｈｏｌｅ Ｑｕｅｎｃｈｅｒｓ、Ｑｘｌ消光剤、Ｉｏｗａ ｂｌａｃｋ ＦＱ、Ｉｏｗａ ｂｌａｃｋ ＲＱ、ＩＲＤｙｅ ＱＣ−１、およびそれらの組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない）ことを提供する。したがって、分子の各型は、開示される組成物および方法での使用が企図される。

蛍光分子で生体分子を標識化し、蛍光を測定する方法は、当技術分野でよく知られている。

好適な蛍光分子もまた当技術分野でよく知られており、限定することなく、１，８−ＡＮＳ（１−アニリノナフタレン−８−スルホン酸）、１−アニリノナフタレン−８−スルホン酸（１，８−ＡＮＳ）、５−（および−６）−カルボキシ−２’、７’−ジクロロフルオレセインｐＨ９．０、５−ＦＡＭｐＨ９．０、５−ＲＯＸ（５−カルボキシ−Ｘ−ローダミン、トリエチルアンモニウム塩）、５−ＲＯＸｐＨ７．０、５−ＴＡＭＲＡ、５−ＴＡＭＲＡｐＨ７．０、５−ＴＡＭＲＡ−ＭｅＯＨ、６ＪＯＥ、６，８−ジフルオロ−７−ヒドロキシ−４−メチルクマリンｐＨ９．０、６−カルボキシローダミン６ＧｐＨ７．０、６−カルボキシローダミン６Ｇ、塩酸塩、６−ＨＥＸ、ＳＥｐＨ９．０、６−ＴＥＴ、ＳＥｐＨ９．０、７−アミノ−４−メチルクマリンｐＨ７．０、７−ヒドロキシ−４−メチルクマリン、７−ヒドロキシ−４−メチルクマリンｐＨ９．０、Ａｌｅｘａ３５０、Ａｌｅｘａ４０５、Ａｌｅｘａ４３０、Ａｌｅｘａ４８８、Ａｌｅｘａ５３２、Ａｌｅｘａ５４６、Ａｌｅｘａ５５５、Ａｌｅｘａ５６８、Ａｌｅｘａ５９４、Ａｌｅｘａ６４７、Ａｌｅｘａ６６０、Ａｌｅｘａ６８０、Ａｌｅｘａ７００、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ４３０抗体抱合体ｐＨ７．２、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ４８８抗体抱合体ｐＨ８．０、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ４８８ヒドラジド−水、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ５３２抗体抱合体ｐＨ７．２、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ５５５抗体抱合体ｐＨ７．２、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ５６８抗体抱合体ｐＨ７．２、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ６１０Ｒ−フィコエリトリンストレプトアビジンｐＨ７．２、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ６４７抗体抱合体ｐＨ７．２、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ６４７Ｒ−フィコエリトリンストレプトアビジンｐＨ７．２、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ６６０抗体抱合体ｐＨ７．２、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ６８０抗体抱合体ｐＨ７．２、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ７００抗体抱合体ｐＨ７．２、アロフィコシアニンｐＨ７．５、ＡＭＣＡ抱合体、アミノクマリン、ＡＰＣ（アロフィコシアニン）、Ａｔｔｏ６４７、ＢＣＥＣＦｐＨ５．５、ＢＣＥＣＦｐＨ９．０、ＢＦＰ（青蛍光タンパク質）、ＢＯ−ＰＲＯ−１−ＤＮＡ、ＢＯ−ＰＲＯ−３−ＤＮＡ、ＢＯＢＯ−１−ＤＮＡ、ＢＯＢＯ−３−ＤＮＡ、ボディパイ６５０／６６５−Ｘ、ＭｅＯＨ、ボディパイＦＬ抱合体、ボディパイＦＬ、ＭｅＯＨ、ボディパイＲ６ＧＳＥ、ボディパイＲ６Ｇ、ＭｅＯＨ、ボディパイＴＭＲ−Ｘ抗体抱合体ｐＨ７．２、ボディパイＴＭＲ−Ｘ抱合体、ボディパイＴＭＲ−Ｘ、ＭｅＯＨ、ボディパイＴＭＲ−Ｘ、ＳＥ、ボディパイＴＲ−ＸファラシジンｐＨ７．０、ボディパイＴＲ−Ｘ、ＭｅＯＨ、ボディパイＴＲ−Ｘ、ＳＥ、ＢＯＰＲＯ−１、ＢＯＰＲＯ−３、カルセイン、カルセインｐＨ９．０、カルシウムクリムゾン、カルシウムクリムゾンＣａ２＋、カルシウムグリーン、カルシウムグリーン−１Ｃａ２＋、カルシウムオレンジ、カルシウムオレンジＣａ２＋、カルボキシナフトフルオレセインｐＨ１０．０、カスケードブルー、カスケードブルーＢＳＡｐＨ７．０、カスケードイエロー、カスケードイエロー抗体抱合体ｐＨ８．０、ＣＦＤＡ、ＣＦＰ（シアン蛍光タンパク質）、ＣＩ−ＮＥＲＦｐＨ２．５、ＣＩ−ＮＥＲＦｐＨ６．０、シトリン、クマリン、Ｃｙ２、Ｃｙ３、Ｃｙ３．５、Ｃｙ５、Ｃｙ５．５、ＣｙＱＵＡＮＴＧＲ−ＤＮＡ、ダンシルカダベリン、ダンシルカダベリン、ＭｅＯＨ、ＤＡＰＩ、ＤＡＰＩ−ＤＮＡ、ダポキシル（Ｄａｐｏｘｙｌ）（２−アミノエチル）スルホンアミド、ＤＤＡＯｐＨ９．０、Ｄｉ−８ＡＮＥＰＰＳ、Ｄｉ−８−ＡＮＥＰＰＳ−脂質、ＤｉＩ、ＤｉＯ、ＤＭ−ＮＥＲＦｐＨ４．０、ＤＭ−ＮＥＲＦｐＨ７．０、Ｄｓレッド、ＤＴＡＦ、ｄＴｏｍａｔｏ、ｅＣＦＰ（高感度シアン蛍光タンパク質）、ｅＧＦＰ（高感度緑蛍光タンパク質）、エオシン、エオシン抗体抱合体ｐＨ８．０、エリスロシン−５−イソチオシアン酸塩ｐＨ９．０、エチジウム臭化物、エチジウムホモ二量体、エチジウムホモ二量体−１−ＤＮＡ、ｅＹＦＰ（高感度黄色蛍光タンパク質）、ＦＤＡ、ＦＩＴＣ、ＦＩＴＣ抗体抱合体ｐＨ８．０、ＦｌＡｓＨ、Ｆｌｕｏ−３、Ｆｌｕｏ−３Ｃａ２＋、Ｆｌｕｏ−４、フルオロ（Ｆｌｕｏｒ）−ルビー、フルオレセイン、フルオレセイン０．１Ｍ ＮａＯＨ、フルオレセイン抗体抱合体ｐＨ８．０、フルオレセインデキストランｐＨ８．０、フルオレセインｐＨ９．０、フルオロ−エメラルド、ＦＭ１−４３、ＦＭ１−４３脂質、ＦＭ４−６４、ＦＭ４−６４、２％ＣＨＡＰＳ、ＦｕｒａレッドＣａ２＋、Ｆｕｒａレッド、高Ｃａ、Ｆｕｒａレッド、低Ｃａ、Ｆｕｒａ−２Ｃａ２＋、Ｆｕｒａ−２、高Ｃａ、Ｆｕｒａ−２、Ｃａなし、ＧＦＰ（Ｓ６５Ｔ）、Ｈｃレッド、ヘキスト３３２５８、ヘキスト３３２５８−ＤＮＡ、ヘキスト３３３４２、Ｉｎｄｏ−１Ｃａ２＋、Ｉｎｄｏ−１、Ｃａを含まない、Ｉｎｄｏ−１、Ｃａ飽和、ＪＣ−１、ＪＣ−１ｐＨ８．２、リサミンローダミン、ＬＯＬＯ−１−ＤＮＡ、ルシファーイエロー、ＣＨ、ライソセンサー（ＬｙｓｏＳｅｎｓｏｒ）ブルー、ライソセンサーブルーｐＨ５．０、ライソセンサーグリーン、ライソセンサーグリーンｐＨ５．０、ライソセンサーイエローｐＨ３．０、ライソセンサーイエローｐＨ９．０、ライソトラッカー（ＬｙｓｏＴｒａｃｋｅｒ）ブルー、ライソトラッカーグリーン、ライソトラッカーレッド、マグネシウムグリーン、マグネシウムグリーンＭｇ２＋、マグネシウムオレンジ、マリーナブルー、ｍＢａｎａｎａ、ｍＣｈｅｒｒｙ、ｍＨｏｎｅｙｄｅｗ、ミトトラッカー（ＭｉｔｏＴｒａｃｋｅｒ）グリーン、ミトトラッカーグリーンＦＭ、ＭｅＯＨ、ミトトラッカーオレンジ、ミトトラッカーオレンジ、ＭｅＯＨ、ミトトラッカーレッド、ミトトラッカーレッド、ＭｅＯＨ、ｍＯｒａｎｇｅ、ｍＰｌｕｍ、ｍＲＦＰ、ｍＳｔｒａｗｂｅｒｒｙ、ｍＴａｎｇｅｒｉｎｅ、ＮＢＤ−Ｘ、ＮＢＤ−Ｘ、ＭｅＯＨ、ＮｅｕｒｏＴｒａｃｅ５００／５２５、緑蛍光ニッスル染色−ＲＮＡ、ナイルブルー、ＥｔＯＨ、ナイルレッド、ナイルレッド−脂質、ニッスル、オレゴングリーン４８８、オレゴングリーン４８８抗体抱合体ｐＨ８．０、オレゴングリーン５１４、オレゴングリーン５１４抗体抱合体ｐＨ８．０、パシフィックブルー、パシフィックブルー抗体抱合体ｐＨ８．０、フィコエリトリン、ピコグリーンｄｓＤＮＡ定量化試薬、ＰＯ−ＰＲＯ−１、ＰＯ−ＰＲＯ−１−ＤＮＡ、ＰＯ−ＰＲＯ−３、ＰＯ−ＰＲＯ−３−ＤＮＡ、ＰＯＰＯ−１、ＰＯＰＯ−１−ＤＮＡ、ＰＯＰＯ−３、ヨウ化プロピジウム、ヨウ化プロピジウム−ＤＮＡ、Ｒ−フィコエリトリンｐＨ７．５、ＲｅＡｓＨ、レゾルフィン、レゾルフィンｐＨ９．０、Ｒｈｏｄ−２、Ｒｈｏｄ−２Ｃａ２＋、ローダミン、ローダミン１１０、ローダミン１１０ｐＨ７．０、ローダミン１２３、ＭｅＯＨ、ローダミングリーン、ローダミンファロイジンｐＨ７．０、ローダミンレッド−Ｘ抗体抱合体ｐＨ８．０、ローダミネン（Ｒｈｏｄａｍｉｎｅｎ）グリーンｐＨ７．０、Ｒｈｏｄｏｌグリーン抗体抱合体ｐＨ８．０、サファイア、ＳＢＦＩ−Ｎａ＋、ナトリウムグリーンＮａ＋、スルホローダミン１０１、ＥｔＯＨ、ＳＹＢＲグリーンＩ、ＳＹＰＲＯルビー、ＳＹＴＯ１３−ＤＮＡ、ＳＹＴＯ４５−ＤＮＡ、ＳＹＴＯＸブルー−ＤＮＡ、テトラメチルローダミン抗体抱合体ｐＨ８．０、テトラメチルローダミンデキストランｐＨ７．０、テキサスレッド−Ｘ抗体抱合体ｐＨ７．２、ＴＯ−ＰＲＯ−１−ＤＮＡ、ＴＯ−ＰＲＯ−３−ＤＮＡ、ＴＯＴＯ−１−ＤＮＡ、ＴＯＴＯ−３−ＤＮＡ、ＴＲＩＴＣ、Ｘ−Ｒｈｏｄ−１Ｃａ２＋、ＹＯ−ＰＲＯ−１−ＤＮＡ、ＹＯ−ＰＲＯ−３−ＤＮＡ、ＹＯＹＯ−１−ＤＮＡ、ならびにＹＯＹＯ−３−ＤＮＡを含む。
ポリペプチド

ナノ抱合体は、種々の態様において、ポリペプチドを含む。ポリペプチドは、ナノ抱合体と結合され得るか、あるいは、一部の実施形態においては、治療薬としてナノ抱合体と組成物内に送達され得る。本明細書で使用される場合、「ポリペプチド」は、アミノ酸残基から成るポリマーを指す。ポリペプチドは、当技術分野において理解され、限定することなく、抗体、酵素、およびホルモンを含む。関連する態様において、ポリペプチドを含むナノ抱合体は、標的分子を認識し、かつそれと結合し、標的分子の検出を可能にする。

本開示のポリペプチドは、天然発生または非天然発生のいずれかであり得る。ポリペプチドは、本明細書に上述されるように、任意にスペーサーを含む。
天然発生のポリペプチド

天然発生のポリペプチドは、限定することなく、天然に存在するか、あるいは、例えば、化学合成または組換え発現技術によって天然で見られる形態で生成され得る生物活性ポリペプチド（抗体を含む）を含む。天然発生のポリペプチドはまた、リポタンパク質、ならびに例えば、限定することなく、グリコシル化タンパク質等の翻訳後修飾タンパク質を含む。

本開示の方法および組成物における使用が企図される抗体は、限定することなく、生体内または生体外のいずれかで標的分子を認識し、それと結合する抗体を含む。
非天然発生のポリペプチド

本開示によって企図される非天然発生のポリペプチドには、合成ポリペプチド、ならびに本明細書に定義される天然発生もしくは非天然発生のポリペプチドの断片、類似体、および変異体が挙げられるが、これらに限定されない。非天然発生のポリペプチドはまた、タンパク質もしくはタンパク質物質であって、それらの構造の一部として、Ｄ−アミノ酸、Ｄ−もしくはＬ−立体配置の修飾、誘導体化または非天然発生のアミノ酸および／またはペプチド模倣ユニットを有するタンパク質もしくはタンパク質物質を含む。用語「タンパク質」は、典型的に、大きいポリペプチドを指す。用語「ペプチド」は、典型的に、短い（すなわち、約５０個のアミノ酸以下）ポリペプチドを指す。

非天然発生のポリペプチドは、例えば、自動ポリペプチド合成機を使用して、または代替的に、所望のポリペプチドをコードする修飾ポリヌクレオチドを使用する組換え発現技術を使用して、調製される。

本明細書で使用される場合、ポリペプチドの「断片」は、全長ポリペプチドまたはタンパク質発現産物より小さいポリペプチドまたはタンパク質のいずれかの部分を指すことを意味する。

本明細書で使用される場合、「類似体」は、構造が実質的に類似し、および同じ生物学的活性を有するが、全体分子、またはその断片のいずれかに対し様々な程度の活性を有することができる２つ以上のポリペプチドのいずれかを指す。類似体は、他のアミノ酸に関する１つ以上のアミノ酸の置換、欠失、挿入および／または付加を含む１つ以上の変異に基づき、アミノ酸配列の組成が異なる。置換は置換されたアミノ酸およびそれを置換するアミノ酸の物理化学または機能関連性に基づき保存的または非保存的であり得る。

本明細書で使用される場合「変異体」は、通常はその分子の一部ではない追加の化学的部分を含むように修飾されたポリペプチド、タンパク質、またはその類似体を指す。そのような部分は、例えば、限定することなく、分子の溶解度、吸収、および／または生物学的半減期を調節することができる。そのような効果を媒介することができる部分は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（１９８０）で開示されている。そのような部分を分子に結合させるための手順は、当技術分野においてよく知られている。種々の態様において、ポリペプチドは、グリコシル化、ＰＥＧ化、および／またはポリシアリル化により修飾される。

１つの融合成分が、断片または模倣物質である融合タンパク質を含む融合タンパク質もまた企図される。「模倣物質」は、本明細書で使用される場合、模倣物質の元であるタンパク質に匹敵する生物学的活性を有するペプチドまたはタンパク質を意味する。例として、内皮増殖因子模倣物質は、天然の内皮増殖因子に匹敵する生物活性を有するペプチドまたはタンパク質である。本用語はさらに、例えば対象のタンパク質の天然リガンドの効果を増強することにより、対象のタンパク質の活性を間接的に模倣するペプチドまたはタンパク質を含む。

ポリペプチドは、抗体をそれらの断片および誘導体と共に含み、Ｆａｂ’断片、Ｆ（ａｂ）２断片、Ｆｖ断片、Ｆｃ断片、１つ以上の相補性決定領域（ＣＤＲ）断片、個々の重鎖、個々の軽鎖、二量体重鎖および軽鎖（無傷抗体において見られるヘテロ四量体重鎖および軽鎖に対立するものとして）、単鎖抗体（ｓｃＡｂ）、ヒト化抗体（ならびにヒト化抗体の様式で修飾されたが、生じる抗体が非ヒト種における抗体によりよく似ている抗体）、キレート化組換え抗体（ＣＲＡＢ）、二重特異性抗体および多特異性抗体、ならびに当技術分野で知られている他の抗体誘導体または断片が挙げられるが、これらに限定されない。
造影剤

種々の態様において、ナノ抱合体を含む方法および組成物が本明細書で開示され、ここで生体分子は、抱合部位を介して造影剤に抱合される。種々の態様において、造影剤は、ポリヌクレオチドおよび／またはポリペプチドに抱合される。本明細書で使用される場合、「造影剤」は、様々な器官および組織の見かけ密度の差を生成させ、描かれた隣接する体組織および器官の観察をより容易にするために、細胞に導入される化合物または他の物質である。本明細書に記載されるポリヌクレオチドまたはポリペプチドへの造影剤の抱合が、本開示の組成物および方法において有用であることが理解されるであろう。

本開示により提供される方法には、ナノ抱合体と結合された造影剤の緩和能が、ナノ抱合体と結合されていない造影剤の緩和能に比べて増加されるものが挙げられる。一部の態様において、その増加は約１倍〜約２０倍である。さらなる態様において、増加は約２倍〜約１０倍であり、さらに別の態様では、増加は約３倍である。

一部の実施形態において、造影剤は、ガドリニウム、キセノン、酸化鉄、マンガンキレート（Ｍｎ−ＤＰＤＰ）、および銅から成る群から選択される。このため、一部の実施形態において、造影剤は常磁性化合物であり、一部の態様において、常磁性化合物はガドリニウムである。

本開示はまた、ポジトロン放出断層撮影（ＰＥＴ）走査に有用である造影剤を企図する。一部の態様において、ＰＥＴ造影剤は放射性核種である。ある特定の実施形態において、造影剤は、^１１Ｃ、^１３Ｎ、^１８Ｆ、^６４Ｃｕ、^６８Ｇｅ、^９９ｍＴｃ、および^８２Ｒｕから成る群から選択される標識を含むＰＥＴ造影剤を含む。特定の実施形態において、造影剤は、［^１１Ｃ］コリン、［^１８Ｆ］フルオロデオキシグルコース（ＦＤＧ）、［^１１Ｃ］メチオニン、［^１１Ｃ］コリン、［^１１Ｃ］アセテート、［^１８Ｆ］フルオロコリン、^６４Ｃｕキレート、^９９ｍＴｃキレート、および［^１８Ｆ］ポリエチレングリコールスチルベンから成る群から選択されるＰＥＴ造影剤である。

本開示はまた、ＰＥＴ造影剤がポリヌクレオチド合成プロセス中にポリヌクレオチド内に導入されるか、あるいはポリヌクレオチド合成後にヌクレオチドに抱合される方法を提供する。例えば、限定することなく、リン原子のうちの１つが^３２Ｐまたは^３３Ｐと置換される、リン酸基中の酸素原子のうちの１つが^３５Ｓと置換される、または水素原子のうちの１つ以上が^３Ｈと置換されるヌクレオチドが合成され得る。放射性核種を含有する官能基はまた、抱合部位を介してヌクレオチドに抱合され得る。

ある特定の実施形態において、ポリヌクレオチドに抱合されるＭＲＩ造影剤は、鉄もしくは常磁性放射性トレーサおよび／または複合体であり、ガドリニウム、キセノン、酸化鉄、および銅を含むがこれらに限定されない。ＭＲＩ造影剤には、ポジティブ造影剤および／またはネガティブ造影剤が挙げられるが、これらに限定されない。ポジティブ造影剤は、Ｔ_１緩和時間の減少（Ｔ_１加重画像に対するシグナル強度の増加）を引き起こす。それら（ＭＲＩ上で明るく見える）は、典型的に、活性元素としてガドリニウム、マンガン、または鉄を含有する小分子量化合物である。これらの元素はすべて、それらの外殻中に不対電子スピンおよび長い緩和能を有する。特殊な群のネガティブ造影剤（ＭＲＩ上で暗く見える）には、パーフルオロカーボン（パーフルオロ化学薬品）が挙げられ、これは、その存在がＭＲイメージングにおいてシグナルに関与する水素原子を排除するためである。

本開示の組成物は、種々の態様において、約５０〜約２．５×１０^６の造影剤を含むナノ抱合体を含むように企図される。一部の実施形態において、ナノ抱合体は約５００〜約１×１０^６の造影剤を含む。
標的化部分

用語「標的化部分」は、本明細書で使用される場合、特定の標的、標的領域への結合、あるいはそこへの限局化、標的細胞（複数可）への進入、または標的受容体への結合において、化合物または他の分子を支援する任意の分子構造を指す。例えば、限定することなく、標的化部分はタンパク質を含んでもよく、所望の標的部位に生体内または生体外で結合することができる抗体およびタンパク質断片、ペプチド、小分子、抗癌剤、ポリヌクレオチド結合剤、炭水化物、細胞表面受容体のためのリガンド、アプタマー、脂質（カチオン性、中性、およびステロイド性脂質、ビロソーム、およびリポソームを含む）、標的化部分として機能し得る抗体およびホルモンが挙げられる。標的化部分は、ナノ抱合体の特異細胞型、ならびに細胞内位置への送達に有用である。

受容体媒介性輸送機構はＢＢＢに存在し、これらは脳内皮の小胞輸送システムを含む［Ｊｏｎｅｓ ｅｔ ａｌ．，Ｐｈａｒｍ Ｒｅｓ．２４（９）：１７５９−１７７１（２００７）］。鉄［Ｊｅｆｆｅｒｉｅｓ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ３１２：１６２−１６３（１９８４）］、インスリン［Ｄｕｆｆｙ ｅｔ ａｌ．，Ｂｒａｉｎ Ｒｅｓ ４２０：３２−３８（１９８７）］、およびレプチン［Ｇｏｌｄｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ ９９：１４−１８（１９９７）］等の栄養素の脳流入は、トランスサイトーシスとして知られる経細胞受容体媒介性輸送機構によって生じる。

一部の実施形態において、標的化部分はタンパク質である。本開示の組成物のタンパク質部分は、一部の態様において、組成物を標的細胞に標的化することができるタンパク質である。本開示の標的化タンパク質は、受容体、基質、抗原決定基、または標的細胞上の他の結合部位もしくは他の標的部位に結合することができる。

標的化タンパク質として有用な抗体は、ポリクローナルまたはモノクローナルであり得る。特異型の細胞に結合する多くのモノクローナル抗体（ＭＡｂ）が開発されている。遺伝子工学またはタンパク質工学によって派生した抗体も、同様に使用され得る（例えば、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＥ抗体）。

本開示において標的化薬剤として使用される抗体は、無傷分子、その断片、またはその機能等価物であり得る。本開示の組成物において有用な抗体断片の例は、これらは従来の方法によって、または遺伝子もしくはタンパク質工学によって生成され得るＦ（ａｂ’）_２、Ｆａｂ’Ｆａｂ、およびＦｖ断片である。

さらなる態様において、本開示によって企図される標的化部分には、糖（例えば、マンノース、マンノース−６−リン酸塩、ガラクトース）が挙げられるが、これらに限定されない。さらなる態様において、部分は、鉄の脳への送達を媒介するために脳毛細血管によって高度に発現されるトランスフェリン受容体（ＴｆＲ）［Ｊｅｆｆｅｒｉｅｓ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ３１２：１６２−１６３（１９８４）］、インスリン受容体およびインスリン様増殖因子受容体［Ｄｕｆｆｙ ｅｔ ａｌ．，Ｂｒａｉｎ Ｒｅｓ ４２０：３２−３８（１９８７）］、低密度リポタンパク質受容体関連タンパク質１および低密度リポタンパク質受容体関連タンパク質２［Ｇａｉｌｌａｒｄ ｅｔ ａｌ．，Ｅｘｐｅｒｔ Ｏｐｉｎ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖ ２：２９９−３０９（２００５）］、ならびにジフテリア毒素受容体／ヘパリン結合上皮性増殖因子様増殖因子［Ｇａｉｌｌａｒｄ ｅｔ ａｌ．，Ｉｎｔ Ｃｏｎｇｒｅｓ Ｓｅｒｉｅｓ １２７７：１８５−１９８（２００５）］のうちのいずれか１つまたは組み合わせを標的とする。受容体媒介性トランスサイトーシス（ＲＭＴ）をもたらすことができる本開示によって企図される追加部分には、Ｆｅｎｇら［Ｉｎ：Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｔｏ ｔｈｅ Ｃｅｎｔｒａｌ Ｎｅｒｖｏｕｓ Ｓｙｓｔｅｍ，Ｋｅｗａｌ Ｋ．Ｊａｉｎ（Ｅｄｉｔｏｒ），ｖｏｌ．４５：１５−３４（２０１０）］で開示されるものが挙げられるが、これらに限定されない。

一部の実施形態において、ナノ抱合体のポリヌクレオチド部分は、追加のまたは補助的な標的化部分として機能し得る。ポリヌクレオチド部分は、細胞外標的化を支援するように、または細胞内の標的化部分として機能するように選択または設計され得る。つまり、ポリヌクレオチド部分は、標的細胞を探し求めるＤＮＡプローブとして機能し得る。この追加の標的化能力は、組成物の標的細胞への送達における特異性を改善するのに役立つであろう。ポリヌクレオチドは、さらにまたは代替的に、標的細胞内の組成物を標的とするように選択または設計され得るが、一方、標的化タンパク質は、抱合体を細胞外で標的とする。

標的化部分は、種々の実施形態において、ナノ抱合体と結合され得ることが企図される。ナノ抱合体がナノ粒子を含む態様において（すなわち、中空ではない）、標的化部分が、ナノ粒子、ポリヌクレオチド／ポリペプチド、またはその両方のいずれかに付着されることが企図される。さらなる態様において、標的化部分はナノ抱合体組成物と結合し、他の態様では、標的化部分は本開示の組成物の投与前に、投与と同時に、あるいは投与後に投与される。
治療薬

本開示の態様または実施形態のいずれかにおいて、治療薬は、ナノ抱合体とともに送達されると企図される。そのような送達は、種々の実施形態において、治療薬とナノ抱合体との結合によって促進され得るか、あるいは送達は、治療薬とナノ抱合体を同時投与することによって促進され得る。治療薬をナノ抱合体に結合する方法は、当技術分野で知られており、例えば、限定することなく、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、国際特許出願ＰＣＴ／ＵＳ２０１０／０５５０１８号に記載される。一部の実施形態において、治療薬は、神経栄養因子である。
ニューロトロフィン

多くの神経栄養因子は、脳内の神経保護であるが、血液脳関門を通過しない。これらの因子は、本開示の組成物および方法における使用に適しており、脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）、神経増殖因子（ＮＧＦ）、ニューロトロフィン−４／５、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）−２および他のＦＧＦ、ニューロトロフィン（ＮＴ）−３、エリスロポエチン（ＥＰＯ）、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）、上皮増殖因子（ＥＧＦ）、形質転換増殖因子（ＴＧＦ）−α、ＴＧＦ−β、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）、インターロイキン−１受容体遮断薬（ＩＬ−１ｒａ）、毛様体神経栄養因子（ＣＮＴＦ）、膠細胞由来神経栄養因子（ＧＤＮＦ）、ニュールツリン、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）、ヘレグリン、ニューレグリン、アルテミン（ａｒｔｅｍｉｎ）、パーセフィン、インターロイキン、顆粒球コロニー刺激因子（ＣＳＦ）、顆粒球マクロファージＣＳＦ、ネトリン、カルジオトロフィン−１、ヘッジホッグ、白血病阻害因子（ＬＩＦ）、ミッドカイン、プレイオトロフィン、骨形成タンパク質（ＢＭＰ）、ネトリン、サポシン、セマフォリン、および幹細胞因子（ＳＣＦ）を含む。
抗癌剤

一部の態様において、本開示の組成物は、抗癌剤を含む。好適な抗癌剤には、アクチノマイシンＤ、アレムツズマブ、アロプリノールナトリウム、アミホスチン、アムサクリン、アナストロゾール、Ａｒａ−ＣＭＰ、アスパラギナーゼ、アザシタジン、ベンダムスチン、ベバシズマブ、ビカルチミド（Ｂｉｃａｌｕｔｉｍｉｄｅ）、ブレオマイシン（例えば、ブレオマイシンＡ_２およびＢ_２）、ボルテゾミブ、ブスルファン、カンプトテシンナトリウム塩、カペシタビン、カルボプラチン、カルムスチン、セツキシマブ、クロラムブシル、シスプラチン、クラドリビン、クロファラビン、シクロホスファミド、シタラビン、ダカルバジン、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、ダウノルビシンリポソーム、ダカルバジン、デシタビン、ドセタキセル、ドキソルビシン、ドキソルビシンリポソーム、エピルビシン、エストラムスチン、エトポシド、エトポシドリン酸塩、エキセメスタン、フロクスウリジン、フルダラビン、フルアダラビン（Ｆｌｕａｄａｒａｂｉｎｅ）リン酸塩、５−フルオロウラシル、ホテムスチン、フルベストラント、ゲムシタビン、ゴセレリン、ヘキサメチルメラミン、ヒドロキシ尿素、イダルビシン、イホスファミド、イマチニブ、イリノテカン、イクサベピロン、ラパチニブ、レトロゾール、リュープロリドトリアセテート、ロムスチン、メクロレタミン、メルファラン、６−メルカプトプリン、メトトレキサート、ミトラマイシン、マイトマイシンＣ、ミトタン、ミトキサントロン、ニムスチン、オファツムマブ、オキサリプラチン、パクリタキセル、パニツムマブ、ペグアスパルガーゼ、ペメトレキセド、ペントスタチン、ペルツズマブ、ピコプラチン、ピポブロマン、プレリキサホル、プロカルバジン、ラルチトレキセド、リツキシマブ、ストレプトゾシン、テモゾロミド、テニポシド、６−チオグアニン、チオテパ、トポテカン、トラスツズマブ、トレオスルファン、トリエチレンメラミン、トリメトレキサート、ウラシルナイトロジェンマスタード、バルルビシン、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ビンデシン、ビノレルビン、ならびにそれらの類似体、前駆体、誘導体、およびプロドラッグが挙げられるが、これらに限定されない。上記の化合物のうちの２つ以上が、本開示の組成物において組み合わせて使用され得ることに留意されたい。
小分子

用語「小分子」は、本明細書で使用される場合、化合物、例えば、任意に誘導体化され得るペプチド模倣薬、または天然もしくは合成のいずれかである任意の他の低分子量有機化合物を指す。そのような小分子は、治療的に送達可能な物質であってもよく、または送達を促進するようにさらに誘導体化されてもよい。

「低分子量」によって、１０００ダルトン未満、典型的に、３００〜７００ダルトンの分子量を有する化合物が意味される。低分子量化合物は、種々の態様において、約１００、約１５０、約２００、約２５０、約３００、約３５０、約４００、約４５０、約５００、約５５０、約６００、約６５０、約７００、約７５０、約８００、約８５０、約９００、または約１０００ダルトンである。
方法

本開示は、ＢＢＢを通過することができるナノ抱合体を含む組成物を提供する。そのような組成物は、種々の態様において、ＣＮＳの急性および慢性障害の治療に有用である。例えば、限定することなく、本開示の組成物は、局所脳虚血、全脳虚血、および脊髄損傷等の急性の脳および脊髄状態、ならびにプリオン病、アルツハイマー病（ＡＤ）、パーキンソン病（ＰＤ）、ハンチントン病（ＨＤ）、ＡＬＳ、多発性硬化症、横断性脊髄炎、運動ニューロン疾患、ピック病、結節性硬化症、リソソーム蓄積障害、カナバン病、レット症候群、脊髄小脳失調症、フリードライヒ失調症、視神経萎縮症、および網膜変性を含む神経変性疾患の慢性治療の治療において有用である。ＳＭＡおよびＡＬＳ等の下位運動ニューロン疾患、ならびにポンペ病、リソソーム蓄積障害、多形神経膠芽腫、およびパーキンソン病の治療がまた企図される。リソソーム蓄積障害には、アクチベーター欠乏症／ＧＭ２ガングリオシドーシス、α−マンノシドーシス、アスパルチルグルコサミン尿症、コレステリルエステル蓄積症、慢性ヘキソサミニダーゼＡ欠乏症、シスチン症、ダノン病、ファブリー病、ファーバー病、フコシドーシス、ガラクトシアリドーシス、ゴーシェ病（Ｉ型、ＩＩ型、ＩＩＩ型）、ＧＭ１ガングリオシドーシス（乳児性、後期乳児性／若年性、成人性／慢性）、Ｉ−細胞疾患／ムコリピドーシスＩＩ、乳児性遊離シアル酸蓄積症／ＩＳＳＤ、若年性ヘキソサミニダーゼＡ欠乏症、クラッベ病（乳児発症、遅発症）、異染性白質ジストロフィー、ムコ多糖症（偽性ハーラーポリジストロフィー／ムコリピドーシスＩＩＩＡ、ＭＰＳＩハーラー症候群、ＭＰＳＩシャイエ症候群、ＭＰＳＩハーラー・シャイエ症候群、ＭＰＳＩＩハンター症候群、サンフィリポ症候群Ａ型／ＭＰＳＩＩＩＡ、サンフィリポ症候群Ｂ型／ＭＰＳＩＩＩＢ、サンフィリポ症候群Ｃ型／ＭＰＳＩＩＩＣ、サンフィリポ症候群Ｄ型／ＭＰＳＩＩＩＤ、モルキオ症候群Ａ型／ＭＰＳＩＶＡ、モルキオ症候群Ｂ型／ＭＰＳＩＶＢ、ＭＰＳＩＸヒアルロニダーゼ欠乏症、ＭＰＳＶＩマロトー・ラミー症候群、ＭＰＳＶＩＩスライ症候群、ムコリピドーシスＩ／シアリドーシス、ムコリピドーシスＩＩＩＣ、ムコリピドーシスＩＶ型）、多重スルファターゼ欠乏症、ニーマン・ピック病（Ａ型、Ｂ型、Ｃ型）、神経セロイドリポフスチン症（ＣＬＮ６疾患（非定型後期乳児性、遅発バリアント、早期若年性）、バッテン・シュピールマイアー・フォークト／若年性ＮＣＬ／ＣＬＮ３疾患、フィンランドバリアント後期乳児性ＣＬＮ５（Ｆｉｎｎｉｓｈ Ｖａｒｉａｎｔ Ｌａｔｅ Ｉｎｆａｎｔｉｌｅ ＣＬＮ５）、ジャンスキー・ビールショフスキー疾患／後期乳児性ＣＬＮ２／ＴＰＰ１疾患、Ｋｕｆｓ／成人発症ＮＣＬ／ＣＬＮ４疾患、ノーザン癲癇（Ｎｏｒｔｈｅｒｎ Ｅｐｉｌｅｐｓｙ）／バリアント後期乳児性ＣＬＮ８、サンタビューリ・ハルティア（Ｓａｎｔａｖｕｏｒｉ−Ｈａｌｔｉａ）／乳児性ＣＬＮ１／ＰＰＴ疾患、β−マンノシドーシス、ポンペ病／グリコーゲン蓄積症ＩＩ型、濃化異骨症、サンドホフ病／成人発症／ＧＭ２ガングリオシドーシス、サンドホフ病／ＧＭ２ガングリオシドーシス−−乳児性、サンドホフ病／ＧＭ２ガングリオシドーシス−−若年性、シンドラー病、サラ病／シアル酸蓄積症、テイ・サックス／ＧＭ２ガングリオシドーシス、および／またはウォルマン病が挙げられるが、これらに限定されない。さらなる実施形態において、脊髄および脳外傷／傷害を含む神経系傷害を伴うレット症候群といった神経系疾患、脳卒中、ならびに脳癌の治療のための方法および材料の使用が示される。

一部の態様において、本開示の組成物は、栄養因子または保護因子であるポリペプチドを含む。一部の実施形態において、栄養因子または保護因子は、本開示のナノ抱合体と同時投与される。種々の実施形態において、栄養因子または保護因子の使用は、脊髄および脳外傷／傷害を含む神経系傷害、脳卒中、ならびに脳癌に加え、アルツハイマー病、パーキンソン病、ハンチントン病を含むが、これらに限定されない本明細書で企図される神経変性障害に関して示される。既知の神経系増殖因子の非限定的な例には、神経増殖因子（ＮＧＦ）、脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）、ニューロトロフィン−３（ＮＴ−３）、ニューロトロフィン−４／５（ＮＴ−４／５）、ニューロトロフィン−６（ＮＴ−６）、毛様体神経栄養因子（ＣＮＴＦ）、膠細胞株由来神経栄養因子（ＧＤＮＦ）、線維芽細胞増殖因子ファミリー（例えば、ＦＧＦの１〜１５）、白血病阻害因子（ＬＩＦ）、インスリン様増殖因子ファミリーのある特定のメンバー（例えば、ＩＧＦ−１）、ニュールツリン、パーセフィン、骨形成タンパク質（ＢＭＰ）、イムノフィリン、増殖因子の形質転換増殖因子（ＴＧＦ）ファミリー、ニューレグリン、上皮性増殖因子（ＥＧＦ）、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）、血管内皮増殖因子ファミリー（例えば、ＶＥＧＦ１６５）、フォリスタチン、およびＨｉｆｌが挙げられる。本明細書で企図される栄養因子または保護因子のそれぞれを制御する亜鉛フィンガー転写因子がまた、概して企図される。さらなる実施形態において、例えば、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、アンチセンス、またはｍｉＲＮＡによるＮＦκＢ阻害もしくは神経保護のためのＮＦκＢ（ＮＦκＢおよび異なる細胞型の関連経路の二重作用）を介するミクログリアおよびアストログリア活性化の阻害を含むが、これらに限定されない神経免疫機能を調節するための方法が企図される。当業者によって理解されるように、上述の阻害性ＲＮＡのうちのいずれか１つ以上は、種々の実施形態において、本明細書に記載されるナノ抱合体と結合する。

なおさらなる実施形態において、ナノ抱合体は、Ｂｃｌ−２ファミリーメンバーと特異的にハイブリッド形成し、かつそれを阻害するポリヌクレオチドを含む。一実施形態において、Ｂｃｌ−２ファミリーメンバーは、Ｂｃｌ２Ｌ１２である。

一部の実施形態において、本開示の材料および方法の使用は、パーキンソン病等の神経変性障害に関して示される。種々の実施形態において、ナノ抱合体は、芳香族酸ドーパ脱炭酸酵素（ＡＡＤＣ）、チロシンヒドロキシラーゼ、ＧＴＰ−シクロヒドロラーゼ１（ｇｔｐｃｈ１）、アポトーシス阻害剤（例えば、ｂｃｌ２、ｂｃｌｘＬ）、膠細胞由来神経栄養因子（ＧＤＮＦ）、阻害性神経伝達物質−アミノ酪酸（ＧＡＢＡ）、およびドーパミン生合成に関与する酵素と同時投与される。さらなる実施形態において、ナノ抱合体は、パーキンおよび／またはシヌクレインの修飾因子と同時投与される。

一部の実施形態において、本開示の材料および方法の使用は、アルツハイマー病等の神経変性障害に関して示される。さらなる実施形態において、アセチルコリン生成を増加するための方法が企図される。なおさらなる実施形態において、コリンアセチルトランスフェラーゼ（ＣｈＡＴ）のレベルを上昇するか、あるいはアセチルコリンエステラーゼ（ＡｃｈＥ）の活性を阻害する方法が企図される。

一部の実施形態において、ナノ抱合体は、ハンチントン病等の神経変性障害を治療するための、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、アンチセンス、および／またはｍｉＲＮＡを介した変異ハンチントンタンパク質（ｈｔｔ）発現を阻害するポリヌクレオチドを含む。

一部の実施形態において、本開示の材料および方法の使用は、ＡＬＳ等の神経変性障害に関して示される。一部の態様において、本開示によって企図される実施形態を用いた治療は、ＴＮＦα、一酸化窒素、ペルオキシナイトライト、および／または一酸化窒素合成酵素（ＮＯＳ）等の疾患の分子マーカーの発現の減少をもたらす。

他の態様において、ナノ抱合体は、ＡＬＳのためのスーパーオキシドジスムターゼ等の変異タンパク質に向けられる低分子ヘアピン型ＲＮＡを含む。

一部の実施形態において、本開示の材料および方法の使用は、レット症候群等の神経発達障害の防止または治療に関して示される。レット症候群に関連する実施形態に関して、ナノ抱合体は、タンパク質２（ＭｅＣＰ２）と結合するメチルシトシンと同時投与される。
遺伝子発現を阻害する方法

本開示によって提供されるさらなる方法は、標的ポリヌクレオチドから発現される遺伝子産物の発現を阻害する方法を含み、遺伝子産物の発現を阻害するために十分である、標的ポリヌクレオチドを本明細書に記載される組成物に接触することを含む。遺伝子産物の阻害は、本開示の組成物を用いた標的ポリヌクレオチドとハイブリダイゼーションによって生じる。

ナノ抱合体の一部であるポリヌクレオチドの配列は、標的ポリヌクレオチドと特異的にハイブリッド形成するために、その標的ポリヌクレオチドのものに１００％相補的である必要がないことが当技術分野において理解される。その上、ナノ抱合体の一部であるポリヌクレオチドは、１つ以上のセグメントにわたって標的ポリヌクレオチドとハイブリッド形成することができ、介在性のまたは隣接するセグメントはハイブリダイゼーション事象（例えば、限定することなく、ループ構造またはヘアピン構造）に関与しない。パーセント相補性は、ナノ抱合体の一部であるポリヌクレオチドの長さにわたって判定される。例えば、ポリヌクレオチドの２０ヌクレオチドの１８個が、全長１００ヌクレオチドの標的ポリヌクレオチド中の２０ヌクレオチド領域に相補的であるポリヌクレオチドを含むナノ抱合体を所与として、ナノ抱合体の一部であるポリヌクレオチドは、９０パーセント相補的であることになる。この例において、残りの非相補的なヌクレオチドは、相補的なヌクレオチドと密集しているか、あるいは相補的なヌクレオチドが散在していてもよく、互いにまたは相補的なヌクレオチドに近接する必要はない。標的ポリヌクレオチドの領域を有するナノ抱合体の一部であるポリヌクレオチドのパーセント相補性は、ＢＬＡＳＴプログラム（基本局所配列検索ツール（ｂａｓｉｃ ｌｏｃａｌ ａｌｉｇｎｍｅｎｔ ｓｅａｒｃｈ ｔｏｏｌ））、および当技術分野で知られているＰｏｗｅｒＢＬＡＳＴプログラム（Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１９９０，２１５，４０３−４１０、Ｚｈａｎｇ ａｎｄ Ｍａｄｄｅｎ，Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ．，１９９７，７，６４９−６５６）を使用して、日常的に判定され得る。

提供される遺伝子産物発現を阻害する方法には、標的遺伝子産物の発現が、ポリヌクレオチドを含むナノ抱合体の不在下における遺伝子産物発現と比較して、少なくとも約５％、少なくとも約１０％、少なくとも約１５％、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または１００％阻害されるものが挙げられる。言い換えると、提供される方法は、基本的に標的遺伝子産物の発現のいかなる程度の阻害を生じるものを包含する。

阻害の程度は、体液標本から、もしくは生検標本から生体内で、または当技術分野でよく知られている画像処理技術によって判定される。代替的に、阻害の程度は、概して、本明細書に記載される組成物の使用により生体内で生じると予期され得る阻害の程度の予測可能な測定として、細胞培養アッセイ中の生体外で判定される。標的ポリヌクレオチドの阻害は、所与の細胞上での阻害の効果を評価するために使用されることが、本開示によって企図される。非限定的な例として、遺伝子産物の阻害の効果を研究することができ、そこで遺伝子産物はシグナル伝達経路の一部である。代替的に、遺伝子産物の阻害を研究することができ、そこで遺伝子産物はアポトーシス経路に関与すると仮定される。

本明細書に記載される方法のいずれかが、所望の結果を達成するために組み合わせて使用されてもよいことが理解されるであろう。例えば、限定することなく、本明細書に記載される方法は、標的ポリヌクレオチドの検出ならびにその発現の制御の両方ができるように組み合わせられ得る。一部の実施形態において、この組み合わせは、生体外または生体内のいずれかで経時的に標的ポリヌクレオチド発現の阻害を定量化するように使用され得る。経時的な定量化は、一態様において、特定の時点で細胞を培養物から除去し、かつ各時点で標的ポリヌクレオチドの発現の相対レベルを評価することによって達成される。一態様において、検出可能な標識の可視化を介して評価される標的ポリヌクレオチド量の減少は、標的ポリヌクレオチドの阻害の速度を経時的に示す。

このため、標的ポリヌクレオチドとハイブリッド形成し、かつその発現を阻害する所与のポリヌクレオチドの有効性を判定すること、ならびに細胞上の所与のポリヌクレオチドの阻害の効果を判定することは、企図される態様である。
プローブとしてのナノ抱合体の使用

ナノ抱合体は、一態様において、核酸または細胞を検出するための診断検査においてプローブとして使用される。

標的核酸を検出する本方法の一部の実施形態は、基質を利用する。検出可能な変化の観察を可能にする任意の基質が使用され得る。好適な基質には、透明固体表面（例えば、ガラス、石英、プラスチック、および他のポリマー）、不透明固体表面（例えば、ＴＬＣシリカプレート等の白色固体表面、露紙、ガラス繊維フィルター、硝酸セルロース膜、ナイロン膜）、ならびに伝導性固体表面（例えば、酸化インジウム錫（ＩＴＯ））が挙げられる。基質は、任意の形状または厚さであり得るが、概して、平坦で薄い。ガラス（例えば、スライドガラス）またはプラスチック（例えば、マイクロタイタープレートのウェル）等の透明基質が好適である。ポリヌクレオチドを基質に付着する方法およびナノ抱合体に対するそれらの使用は、参照により本明細書にその全体が組み込まれる米国特許出願第２００２０１７２９５３号に開示される。

基質を用いることによって、検出可能な変化を増幅させ、アッセイの感度を増加させることができる。一態様において、方法は、標的ポリヌクレオチドを、あるポリヌクレオチドを上に付着させた基質と接触させるステップであって、このポリヌクレオチドは（ｉ）標的核酸の配列の第１の部分に相補的である配列を有し、接触させるステップが基質上のポリヌクレオチドと標的核酸とのハイブリダイゼーションを可能にするために有効な条件下で行われる、ステップと、（ｉｉ）基質に結合された標的核酸を、あるポリヌクレオチド上に付着させた第１の型のナノ抱合体と接触させるステップであって、このポリヌクレオチドは標的核酸の配列の第２の部分に相補的である配列を有し、接触させるステップがナノ抱合体の一部であるポリヌクレオチドと標的核酸とのハイブリダイゼーションを可能にするために有効な条件下で行われる、ステップと、を含む。次に、基質に結合されるナノ抱合体の第１の型は、ポリヌクレオチドを含むナノ抱合体の第２の型に接触され、ナノ抱合体の第２の型上のポリヌクレオチドは、ナノ抱合体の第１の型を生成するために使用されるポリヌクレオチドの配列の少なくとも一部分に相補的である配列を有し、接触ステップは、ナノ抱合体の第１および第２の型上でポリヌクレオチドのハイブリダイゼーションを可能にするように有効な条件下で行われる。最後に、これらのハイブリダイゼーションによって生成される検出可能な変化が観察される。

ナノ抱合体上のポリヌクレオチドの核酸へのハイブリダイゼーションに応じて起こる検出可能な変化は、色の変化、ナノ抱合体の凝集の形成、放射線マーカーの検出、または凝集されたナノ抱合体の沈殿であり得る。色の変化は肉眼で、または分光学的に観察され得る。ナノ抱合体の凝集の形成は、電子顕微鏡によって、または比濁法によって観察され得る。凝集されたナノ抱合体の沈殿は、肉眼で、または顕微鏡的に観察され得る。肉眼で観察可能な変化が好適である。肉眼で観察可能な色の変化が特に好適である。

肉眼での色の変化の観察に基づいて標的核酸ハイブリダイゼーションを検出する方法は、安価で迅速、かつ簡単で強固（試薬が安定している）であり、特殊なまたは高価な設備を必要とせず、ほとんど、あるいは全く器具類が必要とされない。これらの利点により、例えば、ＤＮＡ配列決定における研究および分析研究所において、特定の病原体の存在を検出する分野において、感染を迅速に特定して治療のための薬物の処方を支援するために診療所で、また高価でない一次スクリーニングのために家およびヘルスセンターにおいて使用するのに、特に好適なものとなる。

ポリヌクレオチドを含むナノ抱合体は、対象の標的分子を標的にするアッセイにおいて使用され得る。このため、ポリヌクレオチドを含むナノ抱合体は、バイオバーコードアッセイなどのアッセイにおいて使用されてもよい。例えば、米国特許第６，３６１，９４４号、同第６，４１７，３４０号、同第６，４９５，３２４号、同第６，５０６，５６４号、同第６，５８２，９２１号、同第６，６０２，６６９号、同第６，６１０，４９１号、同第６，６７８，５４８号、同第６，６７７，１２２号、同第６６８２，８９５号、同第６，７０９，８２５号、同第６，７２０，１４７号、同第６，７２０，４１１号、同第６，７５０，０１６号、同第６，７５９，１９９号、同第６，７６７，７０２号、同第６，７７３，８８４号、同第６，７７７，１８６号、同第６，８１２，３３４号、同第６，８１８，７５３号、同第６，８２８，４３２号、同第６，８２７，９７９号、同第６，８６１，２２１号、および同第６，８７８，８１４号を参照されたく、それらの開示は参照により本明細書に組み込まれる。

一部の実施形態において、本開示の組成物は、ナノフレア技術において有用である。ナノフレアは、生細胞内部のポリヌクレオチドレベルの蛍光検出のためにｓｉｃＰＮ構造をうまく活用することができるポリヌクレオチド機能化ナノ粒子との関連で前に記載されている［国際公開第２００８／０９８２４８号および米国特許出願公開第２０１１／０１１１９７４号に記載されており、そのそれぞれは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる］。このシステムにおいて、ｓｉｃＰＮは「フレア」として作用し、検出可能に標識化され、入ってくる標的ポリヌクレオチドによって置換または表面から放出される。このため、ナノフレア技術は、本明細書に記載されるナノ抱合体との関連において有用であることが企図される。
用量および薬学的組成物

本明細書で記載される組成物のいずれも、所望の治療効果を達成する治療的有効量で哺乳類に投与され得ることが理解されるであろう。

本明細書で記載される組成物は、薬学的に許容される賦形剤、担体、または希釈剤と共に、薬学的組成物に製剤化されてもよい。化合物または組成物は、例えば、限定することなく、本明細書で記載される疾患、障害、または感染の治療を可能にする任意の経路により投与されることができる。状況に応じて、薬学的組成物は、体腔内に適用または滴下される、皮膚または粘膜膜を通して吸収される、経口摂取される、吸入される、および／または血液循環に導入される。一部の実施形態において、ナノ抱合体を含む組成物は、組成物を血液循環に導入するように、静脈内に、動脈内に、または腹腔内に投与される。非静脈内投与がまた、特に低分子量治療に関して適切である。ある特定の状況において、脳内の（実質内の）、脳室内の、筋肉内の、眼内の、門脈内の、病巣内の、髄内の、くも膜下腔内の、心室内の、経皮の、皮下の、鼻腔内の、尿道の、もしくは経腸の手段による注射を介して、徐放システムによって、または注入装置によって、末梢性に、経口的に、局所的に、舌下に、膣内に、直腸内にナノ抱合体を含む薬学的組成物を送達することが望ましい。

投与は、単一用量投与の形態で行われることがあり、または本実施形態の化合物は、分割用量もしくは単一用量のいずれかで期間にわたって投与されてもよい。本実施形態の化合物が対象に投与されるが、投与される化合物の量および選択される投与の経路は、疾患状態の効果的な治療を可能にするように選択されるべきである。治療薬の併用投与（すなわち、併用療法）がまた企図され、これらの実施形態の一部において、治療薬のうちの少なくとも１つは、本明細書に記載されるナノ抱合体と結合する。

ナノ抱合体が神経膠腫細胞株および／または患者由来の腫瘍ニューロスフェア（ＴＮＳ）において研究される実施形態において、約０．１ｎＭ〜約１０ｎＭ、または約０．５ｎＭ〜約８ｎＭ、または約１ｎＭ〜約１０ｎＭ、または約０．１ｎＭ〜約０．５ｎＭ、または約０．１ｎＭ〜約５ｎＭが投与されることが企図される。特定の実施形態において、約０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０ｎＭ以上のナノ抱合体が神経膠腫細胞株および／または患者由来のＴＮＳに投与されることが企図される。一部の実施形態において、ナノ抱合体の投与は、約２４〜４８時間、もしくは約２４〜３６時間、もしくは約２４〜４０時間、もしくは約３６〜４８時間、もしくは約２４時間、約３０時間、約３６時間、約４０時間、または約４８時間以上進行する。

さらなる実施形態において、本明細書に記載されるナノ抱合体組成物の投与は、約１ｍｇ／ｋｇ〜約５０ｍｇ／ｋｇ、または約５ｍｇ／ｋｇ〜約５０ｍｇ／ｋｇ、または約５ｍｇ／ｋｇ〜約３０ｍｇ／ｋｇ、または約５ｍｇ／ｋｇ〜約２０ｍｇ／ｋｇ、または約５ｍｇ／ｋｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇである。一実施形態において、投与は静脈内投与であり、投与されるナノ抱合体組成物の量は７ｍｇ／ｋｇである。さらなる実施形態において、ナノ抱合体組成物は、毎日、毎週、または毎月投与される。一部の実施形態において、単回投与は、日ごとに与えられる。さらなる実施形態において、ナノ抱合体組成物および／または治療薬の２、３、４、５、６、７、８、９、１０回以上の投与は、日ごと、または１日おき、または毎週、または毎月与えられる。

本明細書に記載される治療薬とナノ抱合体組成物の投与は、種々の実施形態において、同時に開始される、または治療薬がナノ抱合体組成物の１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０日以上後で投与されることが企図される。代替の実施形態において、治療薬は、ナノ抱合体組成物が投与される１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０日以上前に投与される。所与の状況に対する組成物の治療的および予防的有効量は、臨床医の技術および判断の範囲内にあるルーチン実験により決定することができる。例えば、限定することなく、投与されるテモゾラミドの量は、約１０ｍｇ／ｋｇ、または約２０ｍｇ／ｋｇ、または約３０ｍｇ／ｋｇ、または約４０ｍｇ／ｋｇ、または約５０ｍｇ／ｋｇ以上である。

ある実施形態において、薬学的組成物は、特定の投与形式および用法に応じて、担体、溶媒、安定剤、アジュバント、希釈剤等の薬学的に許容される賦形剤とともに製剤化することができる。薬学的組成物は、一般に、生理学的に相溶性のｐＨを達成するように製剤化されるべきであり、製剤および投与経路に応じて、約３ｐＨ〜約１１ｐＨ、好ましくは約３ｐＨ〜約７ｐＨの範囲であってもよい。代替の実施形態において、ｐＨが約５．０ｐＨ〜約８ｐＨの範囲に調節されることが好ましい場合がある。より具体的には、薬学的組成物は、種々の態様において、１つ以上の薬学的に許容される賦形剤とともに、治療上有効量または予防的有効量の、本明細書に記載される少なくとも１つの組成物を含む。本明細書に記載される、薬学的組成物は、任意に、本明細書に記載される化合物の組み合わせを含んでもよい。

用語「薬学的に許容される賦形剤」は、本明細書に記載される化合物等の、薬学的薬剤の投与用の賦形剤を指す。本用語は、過度の毒性なしに投与され得る任意の薬学的賦形剤を指す。

薬学的に許容される賦形剤は、一部には、投与される特定の組成物ならびにその組成物を投与するために使用される特定の方法により決定される。したがって、広範な薬学的組成物の好適な製剤が存在する（例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓを参照されたい）。

適切な賦形剤は、タンパク質、多糖類、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、重合アミノ酸、アミノ酸共重合体、および不活性ウイルス粒子等の、大きく、ゆっくり代謝される巨大分子を含む担体分子であってもよい。他の例示的な賦形剤は、抗酸化剤（例えば、アスコルビン酸）、キレート剤（例えば、ＥＤＴＡ）、炭水化物（例えば、デキストリン、ヒドロキシアルキルセルロース、および／またはヒドロキシアルキルメチルセルロース）、ステアリン酸、液体（例えば、油、水、食塩水、グリセロールおよび／またはエタノール）、湿潤剤または乳化剤、ｐＨ緩衝物質等を含む。

加えて、薬学的組成物は、減菌の注射可能な水性エマルジョンまたは油性懸濁液等の、減菌の注射可能な調製物の形態であってもよい。本エマルジョンまたは懸濁液は、適切な分散剤または湿潤剤および懸濁剤を使用して、当業者により調合されてもよい。減菌の注射可能な調製物も、１，２−プロパン−ジオール中の溶液等、非毒性の非経口的に許容される希釈液または溶媒中の減菌の注射可能な溶液または懸濁液であってもよい。

減菌の注射可能な調製物はまた、凍結乾燥された粉末としても調製することができる。加えて、減菌の固定油は、溶媒または懸濁媒体として用いることができる。本目的のために、合成モノまたはジグリセリドを含む、任意の無刺激性固定油が利用されてもよい。加えて、同様に脂肪酸（例えば、オレイン酸）も、注射可能物の調製に使用することができる。
キット

本開示の組成物を含むキットもまた提供される。一実施形態において、キットは少なくとも１つの容器を含み、容器は本明細書で記載される１つ以上の生体分子を含む本明細書で記載される少なくとも１つの型のナノ抱合体を保持する。生体分子がポリヌクレオチドである本開示の態様において、第１の型のナノ抱合体の一部であるポリヌクレオチドは、標的ポリヌクレオチドの第１の部分の１つ以上の配列に相補的（または本明細書で開示されるように十分相補的）である１つ以上の配列を有する。容器は任意に、標的ポリヌクレオチドの第２の部分の１つ以上の配列に相補的な配列を有するポリヌクレオチドを含む１つ以上の追加の型のナノ抱合体を含む。

別の実施形態において、キットは少なくとも２つの容器を含む。第１の容器は、標的ポリヌクレオチドの１つ以上の部分に結合することができる本明細書で記載される１つ以上のポリヌクレオチドを含む本明細書で開示される１つ以上のナノ抱合体を保持する。第２の容器は、標的ポリヌクレオチドの同じまたは異なる部分の１つ以上の配列と結合することができる１つ以上のポリヌクレオチドを含む１つ以上のナノ抱合体を保持する。

別の実施形態において、キットはポリヌクレオチドおよびナノ粒子を別々の容器中に有し、ナノ抱合体は、本明細書に記載される方法のために使用される前に生成される。一態様において、ポリヌクレオチドおよび／またはナノ粒子は、ナノ抱合体が生成できるように機能化される。代替的に、ポリヌクレオチドおよび／またはナノ粒子は、官能基なしでキットに提供され、この場合、それらはアッセイを実施する前に機能化されなければならない。

提供されるキットの種々の態様において、ポリヌクレオチドは標識を含み、またはキットは、ポリヌクレオチドに付着され得る標識を含む。代替的に、キットは標識されたナノ粒子またはナノ粒子に付着され得る標識を含む。各実施形態において、キットは任意に説明書を含み、各容器は標識を含み、キット自体は標識を含み、キットは任意に１つ以上の非特異的ポリヌクレオチド（対照として用いるため）を含む。

（実施例１）
Ｂｃｌ−２様タンパク質１２（Ｂｃｌ２Ｌ１２）発現、ならびにヒト脳腫瘍幹細胞（ＢＴＳＣ）および由来する同所性異種外植片中の活性化された受容体チロシンキナーゼ（ＲＴＫ）のコンペンディアムを評価した（図１）。原発性ＧＢＭ腫瘍試料における従来の研究［Ｓｔｅｇｈ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ．２１：９８−１１１（２００７）］に従って、Ｂｃｌ２Ｌ１２の強い発現を、試験されたＢＴＳＣの大部分において特定し、高Ｂｃｌ２Ｌ１２発現のあるＢＴＳＣ系１８（ｈｕＢＴＳＣ＿１８）を初期の機能性研究のために選択した（図１Ａ）。加えて、複数のＲＴＫが神経膠腫細胞内で、およびそれらの対応する同所性外植片（図１Ｂ）内で同時活性化することが立証された。特に、生体外神経膠腫細胞株内のＲＴＫの活性プロファイルは、概して、外植された腫瘍ＢＴＳＣ由来移植片内で維持され、対応する培養物と比べてより特徴的なＲＴＫシグニチャーを示し、腫瘍微小環境がＢＴＳＣ潜在性腫瘍の腫瘍内ＲＴＫ活性化状態に著しく影響することを示唆する。

（実験例２）
治療法の開発のため、Ｂｃｌ２Ｌ１２標的化ＲＮＡｉ金ナノ粒子（ＲＮＡ−ＡｕＮＰ、本明細書に記載されるナノ抱合体）を生成し、神経膠腫細胞株およびｈｕＢＴＳＣ＿１８内の内在性Ｂｃｌ２Ｌ１２をノックダウンするその能力をスクリーニングした。Ｂｃｌ２Ｌ１２ｍＲＮＡレベルを４０％（図２Ａ）、およびＢｃｌ２Ｌ１２タンパク質存在度を６０〜９５％（図２Ｂ）減少することができたＢｃｌ２Ｌ１２−ＲＮＡナノ抱合体（Ｌ１２−１−およびＬ１２−２−ＲＮＡナノ抱合体）を特定した。その後、ＬＮ２３５細胞においてＢｃｌ２Ｌ１２タンパク質発現を強く中和するナノ抱合体濃度（０．１ｎＭ）を判定し（図２Ｂ）、それを同様の効果を達成するために必要とされる１００ｎＭの従来のリポプレックス送達ｓｉＲＮＡオリゴヌクレオチドと比較し（図２Ｃ）、ＲＮＡｉ機能性ナノ抱合体が遺伝子発現のサイレンシングにおいて従来の方法よりもはるかに有効であることを示す。重要なことに、ＢＴＳＣ中の同様の高く強いＫＤ有効性、およびナノ抱合体治療後最大５日間確認されたＢｃｌ２Ｌ１２タンパク質ノックダウンの持続性が立証された（図２Ｄ）。最終的に、Ｂｃｌ２Ｌ１２標的化ｓｉＲＮＡおよびｓｈＲＮＡ［Ｓｔｅｇｈ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ．２１：９８−１１１（２００７）］に示されるように、Ｂｃｌ２Ｌ１２のナノ抱合体媒介性ノックダウンは、活性カスパーゼ３および７のウエスタンブロット解析によって証明されるように増強されたエフェクターカスパーゼ活性化をもたらし（図２Ｅ）、ナノ抱合体駆動（ｎａｎｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ−ｄｒｉｖｅｎ）Ｂｃｌ２Ｌ１２ノックダウンの機能性を確認する。

二次標的のノックダウンの実証：細胞内の遺伝子発現を有効に発現停止するＲＮＡナノ抱合体の能力をさらに実証するため、Ｂｃｌ２Ｌ１２下流エフェクターａＢ−クリスタリン（ＣＲＹＡＢ）を二次原型神経膠腫遺伝子標的（ｐｒｏｔｏｔｙｐｉｃ ｇｌｉｏｍａｇｅｎｉｃ ｔａｒｇｅｔ）として選択した。ａＢ−クリスタリンは、Ｂｃｌ２Ｌ１２によって転写的に誘導され、腫瘍細胞移動／浸潤を促進し、エフェクターカスパーゼ−３活性化を阻害するように機能する。図３は、内在性ａＢ−クリスタリンのＲＮＡナノ抱合体媒介性ノックダウン（図３Ａ；ＲＮＡナノ抱合体（１０ｎＭ）およびｓｉＲＮＡ／リポプレックス媒介性ノックダウン（１００ｎＭ）の比較）、減少された浸潤特性（図３Ｂ）、ならびにａＢ−クリスタリン切除時の神経膠腫細胞の増強されたカスパーゼ−３活性化（図３Ｃ）を示す。これらの研究は、レトロウイルス性／リポレックス（ｌｉｐｏｌｅｘ）送達ｓｈ／ｓｉＲＮＡに類似の下流シグナル制御への有効性および影響（すなわち、カスパーゼ活性化および細胞浸潤）を有する２つの原型神経膠腫腫瘍性タンパク質の強力なノックダウンを示した。［Ｓｔｅｇｈ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ．２１：９８−１１１（２００７）、Ｓｔｅｇｈ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ．Ｓ．Ａ．１０５：１０７０３−８（２００８）］。

（実施例３）
細胞培養物中でＢＣｌ２Ｌ１２−およびＣＲＹＡＢ−ＲＮＡナノ抱合体の広範なアポトーシス促進活性が確立され、同所性外植片および遺伝子改変マウスのＲＮＡナノ抱合体の機能性が生体内で確認された。これらの研究は、遺伝子改変神経膠腫マウスモデルにおける腫瘍縮小を試験した。これらのナノ抱合体の既知の細胞および組織取り込み性質をさらに拡大し、頭蓋内注射時の正常および癌性の頭蓋内組織中へのＲＮＡナノ抱合体の透過性を文書化し、ＢＴＳＣ異種移植片内へのその取り込みを評価した（図４）。ＢＴＳＣ接種およびＣｙ５−Ａｕ−ＮＰ投与に続いて、脳を解剖し、冠状切片を共焦点蛍光顕微鏡法にかけた。図４Ａ（下部パネル）は、Ｕ８７ＭＧ移植片に類似のＢＴＳＣ同所性腫瘍外植片内のＲＮＡナノ抱合体の強い分散を示し、図４Ｂは、蛍光シグナルの頭蓋内分散の数量化を示す。腫瘍および非腫瘍要素内への頭蓋内ナノ抱合体取り込みを誘導結合型プラズマ質量分光法（ＩＣＰ−ＭＳ；図４Ｃ）によって、また多様式ガドリニウム（Ｇｄ（ＩＩＩ））濃縮多価ＤＮＡ金ナノ粒子（ＤＮＡ−Ｇｄ（ＩＩＩ）−ＡｕＮＰｓ）抱合体を使用した磁気共鳴（ＭＲ）画像法（図４Ｄ）によって検証した。

頭蓋内Ｕ８７ＭＧ異種移植片内のＤＮＡ−Ｇｄ（ＩＩＩ）ナノ抱合体の主な蓄積をＭＲによって、および対応するヘマトキシリンおよびエオシン（Ｈ＆Ｅ）画像によって証明した（図４Ｄ、左パネル）。腫瘍細胞およびＤＮＡ−Ｇｄ（ＩＩＩ）ナノ抱合体をブレグマの近くに注射したが、腫瘍形成および（腫瘍内の）ＤＮＡ−Ｇｄ（ＩＩＩ）−ナノ抱合体の蓄積は、前脳構造内で最も顕著であったことに留意しなければならない。これは、腫瘍要素を選択的に濃縮するように前後軸に沿って遊走されるナノ抱合体を示す。ナノ抱合体の広範囲腫瘍内分散に基づき（ＤＮＡ−Ｇｄ（ＩＩＩ）ナノ抱合体に占有された頭蓋内空間を定量化可能に評価するためのＭＲ画像の３Ｄ再構築の図４Ｄ右パネルを参照されたい）、本発明者は、尾静脈を介した系統的な静脈内（Ｉ．Ｖ．）注射を伴う直接脳への頭蓋内（Ｉ．Ｃ．）注射を使用してマウス脳内におけるＲＮＡナノ抱合体の分布を比較した。脳の残余部分よりもはるかに多い量のナノ抱合体が異種移植された腫瘍内で発見され、増強された腫瘍内のナノ抱合体の蓄積を再確認した（図５）。

最後に、腫瘍縮小に対するＢｃｌ２Ｌ１２標的化ＲＮＡナノ抱合体の影響を、全身注射を使用して生体内Ｕ８７神経膠腫細胞株異種間移植片内で試験した。生体外所見（図２Ｂ、左パネル、Ｕ８７ＭＧを参照されたい）と並行して、Ｌ１２−２ナノ抱合体で治療されたマウスが、Ｂｃｌ２Ｌ１２タンパク質の減少された活性により説明される著しく延長された寿命（ｐ値＝０．０１）を示すことが発見された（図６）。Ｌ１２−１ナノ抱合体は、寿命に対して著しい効果（ｐ値＝０．５０）を有しておらず、Ｕ８７細胞株中の生体外Ｂｃｌ２Ｌ１２のノックダウンに有効ではなかった。

開示される内容は、種々の態様、実施形態、および技術を参照して記載されてきた。しかし、開示される内容の趣旨および範囲内で多くの変更および改変がされ得ることを理解されたい。引用されるすべての参考文献は、参照によりそのすべて、または文脈から確認されるそれらが関連する開示を提供する範囲までが本明細書に組み込まれる。

Claims (22)

1. ナノ抱合体を含む組成物であって、前記ナノ抱合体は、中枢神経系（ＣＮＳ）障害で特異的に発現するポリペプチドをコードする標的ポリヌクレオチドに十分に相補的であるポリヌクレオチドを含み、前記ナノ抱合体は血液脳関門（ＢＢＢ）を通過する能力を有する、組成物。
2. 標的化部分をさらに含む、請求項１に記載の組成物。
3. 治療薬をさらに含む、請求項１または請求項２に記載の組成物。
4. 前記治療薬が、テモゾラミド（ｔｅｍｏｚｏｌａｍｉｄｅ）である、請求項３に記載の組成物。
5. 前記障害が、異常な遺伝子発現によって引き起こされる、請求項１〜４のいずれか１項に記載の組成物。
6. 前記障害が、急性である、請求項１〜５のいずれか１項に記載の組成物。
7. 前記急性障害が、局所脳虚血、全脳虚血、脳外傷、脊髄損傷、急性感染症、てんかん重積症、片頭痛、急性精神病、自殺性鬱病、急性不安／恐怖症、および傷害関連の病気から成る群から選択される、請求項６に記載の組成物。
8. 前記障害が、慢性である、請求項１〜５のいずれか１項に記載の組成物。
9. 前記慢性障害が、慢性神経変性、網膜変性、鬱病、慢性情動障害、リソソーム蓄積障害、脳の慢性感染症、脳癌、卒中リハビリテーション、先天性代謝異常、自閉症、および精神遅滞から成る群から選択される、請求項８に記載の組成物。
10. 前記ナノ抱合体が、少なくとも約４００、約６００、約８００、約１０００、約１２００ダルトン以上の質量を有する、請求項１〜９のいずれか１項に記載の組成物。
11. 前記ナノ抱合体が、約−１０ミリボルト（ｍＶ）〜約−５０ミリボルト（ｍＶ）のゼータ電位測定値を有する、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の組成物。
12. 血液脳関門を横断することができる組成物を必要としている患者を治療する方法であって、前記患者に機能性ナノ抱合体を含む治療上有効量の組成物を投与することを含み、前記ナノ抱合体は、標的ポリヌクレオチドとハイブリッド形成し、かつその発現を阻害するように、前記標的ポリヌクレオチドに十分に相補的である配列を有するポリヌクレオチドを含む、方法。
13. 機能性ナノ抱合体を含む組成物を患者に投与する方法であって、前記方法は、前記患者に治療上有効量の前記組成物を投与することを含み、
    前記ナノ抱合体が、標的ポリヌクレオチドとハイブリッド形成し、かつその発現を阻害するように、前記標的ポリヌクレオチドに十分に相補的である配列を有するポリヌクレオチドを含み、前記組成物が、血液脳関門を横断する能力を有し、前記患者が、血液脳関門を横断することができる組成物を必要としている、方法。
14. 前記組成物が、治療薬をさらに含む、請求項１２または請求項１３に記載の方法。
15. 前記患者が、中枢神経系（ＣＮＳ）障害に罹っている、請求項１２〜１４のいずれか１項に記載の方法。
16. 前記患者が、異常な遺伝子発現によって引き起こされる障害に罹っている、請求項１２〜１５のいずれか１項に記載の方法。
17. 前記患者が、急性および／または慢性障害に罹っている、請求項１２〜１６のいずれか１項に記載の方法。
18. 前記急性障害が、局所脳虚血、全脳虚血、脳外傷、脊髄損傷、急性感染症、てんかん重積症、片頭痛、急性精神病、自殺性鬱病、急性不安／恐怖症、および傷害関連の病気から成る群から選択される、請求項１７に記載の方法。
19. 前記慢性障害が、慢性神経変性、網膜変性、鬱病、慢性情動障害、リソソーム蓄積障害、脳の慢性感染症、脳癌、卒中リハビリテーション、先天性代謝異常、自閉症、および精神遅滞から成る群から選択される、請求項１７に記載の方法。
20. 前記組成物が、１回のみ投与される、請求項１２〜１９のいずれか１項に記載の方法。
21. 前記組成物が、週に約１回を超えない頻度で投与される、請求項１２〜１９のいずれか１項に記載の方法。
22. 前記患者がヒトである、請求項１２〜２１のいずれか１項に記載の方法。