CN102281872A - 多价rna纳米颗粒组合物 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及用双链RNA官能化的纳米颗粒，供用于包括但不限于基因调节在内的各种用途。更具体而言，本发明提供了使RNA结合于纳米颗粒以实现稳定性或活性增加的新策略。

Description

多价RNA纳米颗粒组合物
政府利益声明
根据国家癌症研究所/癌症纳米技术中心(National Cancer Institute/Centersof Cancer Nanotechnology Excellence(NCF/CCNE))授予的专款号5U54CA119341和国家健康研究所(National Institutes of Health，NIH)授予的专款号5DP1 OD000285，本申请是在政府的支持下进行的。
技术领域
本发明涉及用双链RNA官能化的纳米颗粒。本发明还提供将RNA与纳米颗粒缀合的方法。
背景技术
RNA干扰(RNAi)是这样一种现象：其中，当双链RNA(dsRNA)存在于细胞中时，其抑制具有与所述双链RNA中的单链充分互补的序列的基因的表达。基因表达的抑制是由从靶基因转录的信使RNA(mRNA)的降解造成的[Sharp ct ah，Genes and Development 15：485-490(2001)]。负责诱导RNAi的双链RNA称为干扰RNA。利用遗传方法和生物化学方法，已经研究了dsRNA介导RNAi的机制和细胞机构。生物化学分析表明，引入细胞细胞质的dsRNA首先被加工成长度为21-25个核苷酸的RNA片段[Hammond et al.，Nature 404：293-296(2000)；Hamilton et al.，Science 286：950-952(1999)；Zamore et al.，Cell 101：25-33(2000)；Yang et al.，Current Biology 10：1191-1200(2000)；Parrish et al.，Molecular Cell 6：1077-1087(2000)]。在体外研究中已经证明，至少在一种机制中，通过RNase III(RNA酶III)样酶Dicer产生这些称为小干扰RNA(siRNA)的dsRNA[Hammond et al.，Nature 404：293-296(2000)]。这些siRNA可能发挥mRNA切割的向导的功能，因为靶mRNA在与特定siRNA杂交的区域中心的位置受到切割[Sharp 2001]。生物化学证据表明，siRNA是称为RNA诱导的沉默复合物RNA-induced silencing complex(RISC)的多组分核酸酶复合物的一部分[Hammond et al.，Nature 404：293-296(2000)]。已经将该复合物蛋白中的一种蛋白即Argonaute 2鉴定为argonaute基因家族的产物[Sharp et al.，Genes and Development 15：485-490(2001)]。该蛋白是小鼠发育必不可少的，并且缺乏Argonaute2的细胞不能建立针对siRNA的实验反应。Argonaute2内隐性核糖核酸酶H结构域中的突变，可以通过与archealArgonaute蛋白结构的比较来鉴定，并且使RISC失活。因此Argonaute将“切片机(Slicer)”活性归功于RISC，从而为RNAi提供催化引擎[Liu et al.，Science305(5689)：1437-1441(2004)]。
该基因家族也含有秀丽线虫(C.elegans)同源物rde-1和相关基因、粗糙脉胞菌(N.crassa)同源物qde-2以及拟南芥(Arabidopsis)同源物arg-1，并且通过遗传研究已经证明，该基因家族是RNAi所需的[Sharp et al.，Genes andDevelopment 15：485-490(2001)；Hammond et al.，Nature 404：293-296(2000)；Hamilton et al.，Science 286：950-952(1999)]。秀丽线虫中的遗传筛查已经确定mut-7基因是RNAi必不可少的。该基因具有与RNaseD相似之处，这表明该基因产物在反应的mRNA降解步骤中发挥作用[Sharp et al.，Genes andDevelopment 15：485-490(2001)]。
在过去的10年中，研究人员已经设计、合成、研究以及应用了多家DNA官能化的金纳米颗粒(DNA-Au NP).[Mirkin et al.，Nature 382：607(1996)]。这些努力已经使得对有关杂合纳米结构有了新的基本理解[Demers et al.，Anal.Chem.72：5535(2000)；Jin et al.，J.Am.Chem.Soc.125：1643(2003)；Lytton-Jean et al.，J.Am.Chem Soc 127：12754-12754(2005)；Storhoff et al.，J.Am.Chem.Soc.122：4640(2000)；You et al.，Soft Matter 2：190(2006)；Wanget al.，Nanomed.1：413(2006)]、重要且在某些情况下商业上可行的监测和诊断测定[Nam et al.，Science 301：1884(2003)；Stoeva et al.，J.Am.Chem.Soc.128：8378(2006)；Liu et al.，J.Am.Chem.Soc.126：12298(2004)；Faulds et al.，Anal.Chem.76：412(2004)]，以及能通过使用DNA合成子使材料组装程序化[Mirkin et al.，Nature 382：607(1996)；Park et al.，Nature 451：553(2008)；Nykypanchuk et al.，Nature，451：549(2008)]。多价DNA-Au NPs具有几个独特的特性，诸如明显且升高的解链温度[Jin et al.，J.Am.Chem.Soc.125：1643(2003)]、增强的结合特性[Lytton-Jean et al.，J.Am.Chem Soc 127：12754-12754(2005)](与同一序列的游离链相比)和距离依赖性光学特性[Elghanian et al.，Science 277：1078(1997)]。与有关多价分子系统的研究[Gestwicki et al.，J.Am.Chem.Soc.124：14922(2002)]一致，被提议的这些独特特性来源于高表面DNA密度和纳米颗粒参与多齿相互作用(multidentateinteractions)的能力。
发明内容
本文所描述的是纳米颗粒组合物，其具有赋予使得所述组合物可用于基因调节的物理特性的结合的RNA单层。与将RNA引入细胞的其他材料相反，这些组合物不仅仅是RNA的送递工具，相反是利用由表面配体的排列和高密度产生的协作特性的单实体试剂。本文所述的组合物无需转染剂即可进入细胞，并且以与常规的多聚体载体相比增强抑制活性(knockdown activity)的方式抵抗降解。
因此，在某些方面，提供了纳米颗粒组合物，其包含与纳米颗粒结合的一种或多种核糖核酸(RNA)多核苷酸，其中，所述RNA多核苷酸具有多肽相互作用位点，并且其中所述RNA多核苷酸具有在适于形成双链体的条件下形成双链体的序列，所述双链体在所述双链体的单链中具有至少一个与靶多核苷酸的序列充分互补的结构域，以允许所述单链与所述靶多核苷酸在适当的条件下杂交，且所述双链体的结构域与所述靶多核苷酸的序列的杂交产生多肽识别的底物位点，且所述RNA多核苷酸以相对于所述多肽相互作用位点和所述纳米颗粒定向特异性方式结合所述纳米颗粒。
在某些方面，提供了纳米颗粒组合物，其中，所述RNA多核苷酸与纳米颗粒共价结合。在其他方面，提供了纳米颗粒组合物，其中，所述RNA多核苷酸不与纳米颗粒共价结合。
在其他方面，提供了纳米颗粒组合物，其中，每个与所述纳米颗粒结合的RNA多核苷酸具有相同的序列。在其他方面，提供了纳米颗粒组合物，其中至少两个与所述纳米颗粒结合的RNA多核苷酸具有不同的序列。
在某些实施方案中，提供了纳米颗粒组合物，其中，所述双链体包含RNA多核苷酸所形成的发夹结构。
本文所公开的方法考虑了进一步包含附加多核苷酸的纳米颗粒组合物，所述附加多核苷酸具有与RNA多核苷酸的序列充分互补的序列，以便允许在适当条件下与RNA多核苷酸杂交，以形成双链体。
在某些方面，提供了纳米颗粒组合物，其中所述附加多核苷酸是RNA。在其他方面，提供了纳米颗粒组合物，其中所述附加多核苷酸是脱氧核糖核酸(DNA)。
在其他实施方案中，提供了纳米颗粒组合物，其中，所述附加多核苷酸与纳米颗粒共价结合。在某些方面，提供了纳米颗粒组合物，其中，所述附加多核苷酸不与纳米颗粒共价结合。
在某些实施方案中，提供了纳米颗粒组合物，其中，所述多肽相互作用位点相对于RNA多核苷酸中点，位于靠近所述纳米颗粒的一端。
在其他实施方案中，提供了纳米颗粒组合物，其中，所述多肽相互作用位点相对于RNA多核苷酸的中点，位于位于远离所述纳米颗粒的一端。
在所述方法的某些方面，提供了纳米颗粒组合物，其具有的RNA的表面密度为至少约2pmol/cm2至约1000pmol/cm2。
在各种实施方案中，提供了纳米颗粒组合物，其中，所述多肽相互作用位点与选自以下的蛋白结合：RNase H、RNase D、RNase L、RNase III、Dicer、Argonaute、Argonaute2以及人免疫缺陷病毒反式激活反应RNA结合蛋白(transactivating response RNA-binding protein，TRBP)。
所述方法的其他方面提供了纳米颗粒组合物，其中，所述多核苷酸的结构域的长度为约10个核苷酸。
在某些实施方案中，提供了纳米颗粒组合物，其中，所述RNA多核苷酸还包括与靶多核苷酸的第二序列充分互补的第二结构域，并且所述RNA多核苷酸的第二结构域与靶多核苷酸的第二序列的杂交产生第二多肽识别的其他底物位点。在某些方面，提供了纳米颗粒组合物，其中，所述多核苷酸的第二结构域的长度为约10个核苷酸。
在某些方面，提供了纳米颗粒组合物，其中，底物位点和其他底物位点是相同的。在其他方面，提供了纳米颗粒组合物，其中，底物位点和其他底物位点是不同的。
在某些方面，提供了纳米颗粒组合物，其中，所述RNA多核苷酸和所述附加多核苷酸在足以允许杂交的长度上彼此互补。在其他方面，提供了纳米颗粒组合物，其中，所述RNA多核苷酸和所述附加多核苷酸在它们的全长上彼此互补。
在某些实施方案中，提供了纳米颗粒组合物，其中，所述RNA多核苷酸通过硫醇连接缀合于纳米颗粒。
在某些方面，提供了纳米颗粒组合物，其中，所述RNA多核苷酸的半衰期与不和纳米颗粒结合的相同RNA多核苷酸的半衰期至少基本上相同。在其他方面，提供了纳米颗粒组合物，其中所述RNA多核苷酸的半衰期是不与纳米颗粒结合的相同RNA半衰期的约1倍、约2倍、约3倍、约4倍、约5倍或更多。
在各种实施方案中，提供了纳米颗粒组合物，其中，所述RNA多核苷酸的长度为约5至约100个核苷酸。在某些方面，提供了纳米颗粒组合物，其中所述附加多核苷酸的长度为约5至约100个核苷酸。
在某些实施方案中，提供了纳米颗粒组合物，其中，所述纳米颗粒是金。在某些方面，提供了纳米颗粒，其中所述纳米颗粒是银。
在某些方面，提供了使RNA多核苷酸与纳米颗粒结合的方法，其包括下述步骤：将硫醇化的RNA多核苷酸双链体与所述纳米颗粒的混合物在一系列溶液中陈化(aging)，以便使所述RNA多核苷酸与所述纳米颗粒结合，从包含约0.1M NaCl的第一溶液开始，每种溶液相对于前一溶液包含浓度渐增的氯化钠(NaCl)。在相关方面，所述方法还包括在最后的陈化步骤后超声处理所述混合物的步骤。在某些方面，所述方法还包括分离所述纳米颗粒的步骤。
在某些实施方案中，提供了使RNA与纳米颗粒结合的方法，包括：
(a)将硫醇化的RNA双链体与所述纳米颗粒在包含约0.1M氯化钠(NaCl)的溶液中混合；
(b)在一系列盐溶液中陈化所述混合物，每种盐溶液相对于前一溶液都包含浓度渐增的NaCl；
(c)超声处理所述混合物；以及
(d)纯化缀合的纳米颗粒。
在所述方法的各种方面，盐溶液系列的变化范围为约0.1M至约0.3MNaCl。
所述方法的某些方面还包括用寡(乙二醇)硫醇(OEG)钝化纳米颗粒的表面。
在某些实施方案中，提供了调节靶多核苷酸表达的方法，包括使所述靶多核苷酸与本公开的纳米颗粒组合物的结构域杂交以形成多肽的底物位点的步骤。在某些方面，杂交导致靶多核苷酸降解。在各种方面，多肽选自RNase H、RNase D、RNase L、RNase III、Dicer、Argonaute、Argonaute2以及TRBP。
根据下文所提供的详细描述，本发明的其他方面将变得显而易见。然而，应当理解的是，下列详细描述和实施例尽管表示本发明优选的实施方案，但是其仅以例证的方式给出，因为根据本详细描述，本发明精神和范围内的各种变化和修改对本领域技术人员而言是显而易见的。
附图说明
图1描绘金纳米颗粒(NP)的特征。在高压灭菌之前(a)和之后(b)，纳米颗粒吸光度谱和TEM成像。比例尺为50nm。
图2描绘金纳米颗粒溶液中存在RNase。未处理的Au NP表现出阳性信号，而使经处理去除RNase活性的颗粒无RNase。
图3描绘汇合的HeLa细胞的光学显微术图像。在RNA纳米颗粒组合物合成时，在添加RNA双链体后，添加30μmol/mL寡乙二醇-硫醇(OEG-硫醇)，作为表面钝化配体。发现该添加防止培养物中的颗粒沉淀。(a)没有添加OEG-硫醇的细胞培养物中的RNA-纳米颗粒组合物表现出颗粒沉淀(黑色)。(b)具有OEG-硫醇的细胞培养物中的RNA-纳米颗粒组合物。比例尺为30μm。
图4描绘RNA-Au NP的细胞摄取。(a)与RNA-Au NP(Cy5标记的RNA)一起孵育了6个小时的HeLa细胞的荧光显微术图像。比例尺为20μm。(b)将RNA-Au NP处理的细胞与未处理的对照相比的流式细胞术分析。
图5描绘(a)4天内荧光素酶表达的抑制。(b)RNA-Au NP的稳定性。dsRNA(正方形)和RNA-Au NP(三角形)在10％血清中的稳定性的比较。
图6描绘RNase III对用双链或单链发夹RNA官能化的RNA-Au NP的活性。两个系统都被RNase III识别为底物。最大荧光的差异部分归因于装载的差异(参见表1)。未添加酶的反应用于背景修正。
图7描绘Dicer对用双链(有义/FITC AS、AS/FITC有义)或单链发夹RNA(FITC HP)官能化的RNA-Au NP的活性。两个系统都被Dicer识别为底物，然而，如果有义链被固定，则可以观察到更高的活性。最大荧光的差异部分归因于装载的差异(参见表1)。未添加酶的反应用于背景修正。
图8描绘RNase III对固定的有义、反义和发夹RNA-Au NP的活性。对于这种酶而言，如果固定有义链，则可观察到更高的活性。
具体实施方式
到目前为止，还没有研发出利用多价颗粒和它们不寻常的特性装载和转运RNA穿过细胞膜的方法。实际上，必须开发克服合成途径和材料，以克服与一种与RNA有关的最富有挑战性的问题，特别是其化学不稳定性。
RNAi特异性抑制靶基因的表达的能力具有显著的优势。例如，许多疾病都是由特定基因或基因组的异常表达引起的。RNAi可用于抑制有害基因的表达，因而缓解疾病症状，或甚至提供治愈。例如，可以抑制有助于癌性状态或病毒复制的基因。另外，可以抑制引起诸如强直性肌营养不良的显性异常疾病的突变基因。炎性疾病，如关节炎，也可以通过抑制如环加氧酶或细胞因子的基因来治疗。靶器官的实例包括但不限于肝、胰、脾、皮肤、脑、前列腺、心脏等。此外，RNAi可用于产生模拟真实基因“敲除”动物的动物，以便研究基因功能。下文提供了所考虑的用途和靶标的其他描述。
RNA技术也可以促进药物发现。用于靶标确认的RNA方法提供了筛查潜在的药物靶标的更快且花费更少的方法。药物靶向信息不仅通过抑制潜在的药物靶标获得，而且还通过确定抑制的蛋白以及因此的通路是否具有显著的表型作用获得。例如，LDL受体表达的抑制应当提高血浆LDL水平，以及因此表明所述受体的上调具有治疗益处。可以用表达阵列测定抑制对除了靶基因或通路之外的基因的表达的应答作用[Sharp et al.，Genes andDevelopment 15：485-490(2001)]。应当将基因产物置于功能通路和网络(相互作用通路)内。
本文公开了RNA寡核苷酸官能化的金纳米颗粒利用由寡核苷酸的表面官能化而产生的全部特性来增加结合的RNA的稳定性和效能，同时保持在催化性RNA干扰通路中起作用的能力。
多价RNA-纳米颗粒组合物(如果纳米颗粒是金，则为RNA-Au NP)的合成要求，所有的组分不含核酸酶，如RNase，核酸酶降解RNA配体并且通过使Au表面暴露而导致不稳定的Au NP相互作用(这可通过聚集来证明)。尽管制备无RNase的有机组分和溶液的条件已经完全确立，但是本文还是提供了产生无RNase的无机金纳米颗粒的方法。
应当注意的是，术语“多核苷酸”和“寡核苷酸”在本文中交换使用。还应当注意的是“缀合的”(conjugated)和“官能化”(functionalized)在本文中也交换使用。
如本文所用，“底物位点”是被多肽识别和作用的多核苷酸(其是单链或双链的)上的位置。如本文所用，“被……作用”应当理解为表示识别并与底物位点结合的多肽所执行的任何酶促功能。
如本文所用，“多肽相互作用位点”指多肽识别的多核苷酸(其是单链或者双链的)上的位点。在各种方面，多肽识别相互作用位点导致多核苷酸的切割。在某些实施方案中，识别多肽相互作用位点的多肽自身作用于多核苷酸，在其他实施方案中，识别多核苷酸识别位点的多肽指导一种或多种其他多肽作用于所述多核苷酸的活性。
如本文所用，术语“靶标”或“靶多核苷酸”指给定的RNA多核苷酸所针对的多核苷酸。
如本文所用，“RNA”指包含至少一个核糖核苷酸残基的分子。
如本文所用，“双链体”指两个互补的或基本上互补的多核苷酸中的区域，所述多核苷酸彼此通过Watson-Crick碱基配对或通过允许互补或基本上互补的多核苷酸链间稳定化的双链体的任何其他方式形成碱基对。例如，具有21个核苷酸单元的多核苷酸链可以与另一个21个核苷酸单元的多核苷酸碱基配对，然而在每个链上仅19个碱基是互补或基本上互补的，以致“双链体”具有19个碱基对。剩余的碱基可以例如作为5′和3′突出端(overhangs)存在。此外，在双链体中，并不需要100％的互补性；在双链体内基本的互补性是允许的。基本的互补性指75％或更高的互补性。例如，由19个碱基对组成的双链体中的错配导致94.7％的互补性，从而是双链体是基本上互补的。
纳米颗粒
因此提供了被官能化为具有与其连接的多核苷酸的纳米颗粒。纳米颗粒的大小、形成和化学组成有助于所得的多核苷酸官能化的纳米颗粒的特性。这些特性包括例如光学特性、光电特性、电化学特性、电子特性、在各种溶液中的稳定性、磁特性以及孔和通道大小变化。考虑了具有不同大小、形状和/或化学组成的纳米颗粒的组合物，以及具有统一大小、形状和化学组成的纳米颗粒的用途，和因此特性的混合。合适的颗粒的实例包括但不限于聚集颗粒、同向性颗粒(如球状颗粒)、各向异性颗粒(如非球状杆、四面体和/或棱柱)以及美国专利7,238,472和国际公开WO 2003/08539所述的核-壳颗粒(core-shell particle)，上述文献的公开通过引用全文并入。
在一实施方案中，纳米颗粒是金属的，并且在各种方面，纳米颗粒是胶态金属。因此，在各种实施方案中，本发明的纳米颗粒包括金属(包括例如但不限于银、金、铂、铝、钯、铜、钴、铟、镍，或适用于纳米颗粒形成的任何其他金属)、半导体(包括例如但不限于CdSe、CdS和CdS或用ZnS包被的CdSe)和磁性(例如磁铁)胶质材料。
还如美国专利公开2003/0147966所述，本发明的纳米颗粒包括商购可获得的纳米颗粒，以及合成的纳米颗粒，如由在溶液中渐进性成核(如通过胶体反应)或通过各种物理和化学蒸汽淀积过程产生，如溅射淀积。参阅例如HaVashi，Vac.Sci.Technol.A5(4)：1375-84(1987)；Hayashi，Physics Today，44-60(1987)；MRS Bulletin，January 1990，16-47。如美国专利公开2003/0147966进一步所述，利用本领域已知的方法，使用HauCU和柠檬酸盐还原剂，可选地产生所考虑的纳米颗粒。参阅例如Marinakos et al.，Adv.Mater.11：34-37(1999)；Marinakos et al.，Chem.Mater.10：1214-19(1998)；Enustun &Turkevich，J.Am.Chem.Soc.85：3317(1963)。
纳米颗粒平均直径的大小范围为约1nm至约250nm、约1nm至约240nm、约1nm至约230nm、约1nm至约220nm、约1nm至约210nm、约1nm至约200nm、约1nm至约190nm、约1nm至约180nm、约1nm至约170nm、约1nm至约160nm、约1nm至约150nm、约1nm至约140nm、约1nm至约130nm、约1nm至约120nm、约1nm至约110nm、约1nm至约100nm、约1nm至约90nm、约1nm至约80nm、约1nm至约70nm、约1nm至约60nm、约1nm至约50nm、约1nm至约40nm、约1nm至约30nm或约1nm至约20nm、约1nm至约10nm。在其他方面，纳米颗粒的大小为约5nm至约150nm(平均直径)、约5至约50nm、约10至约30nm、约10至150nm、约10nm至约100nm，或约10nm至约50nm。纳米颗粒的大小为约5nm至约150nm(平均直径)、约30nm至约100nm、约40nm至约80nm。方法中所用的纳米颗粒大小根据它们具体用途或应用而变化。大小的变化有利地用于优化纳米颗粒的某些物理特征，如可以按本文所述推理的光学特性或表面积的数量。
与纳米颗粒连接的多核苷酸
因此提供了具有与其连接的多核苷酸的纳米颗粒，其中，双链RNA与纳米颗粒结合。在某些方面，与纳米颗粒结合的RNA是小干扰RNA(siRNA)。考虑了双链RNA与纳米颗粒通过各种方式的结合。
根据本文所述的方法，合成柠檬酸盐稳定化的金纳米颗粒，并用0.1％焦碳酸二乙酯(DEPC)将颗粒处理12小时，同时搅拌，随后于120℃高压灭菌60分钟。在某些方面，用DEPC处理纳米颗粒进行约1小时。在各种方面，用DEPC处理纳米颗粒进行约1.5、约2、约2.5、约3、约3.5、约4、约4.5、约5、约5.5、约6、约6.5、约7、约7.5、约8、约8.5、约9、约9.5、约10、约10.5、约11、约11.5、约12、约12.5、约13、约13.5、约14、约14.5、约15、约20、约25、约30、约3天、约7天或更长。
在一实施方案中，单链RNA多核苷酸直接连接于纳米颗粒，任选地通过本文所述的间隔区(spacer)连接。在单链RNA多核苷酸连接于纳米颗粒的方面中，RNA多核苷酸包含两个充分互补的部分，以允许所述两个部分在适当的条件下彼此杂交从而形成发夹结构。
在另一实施方案中，任选地通过本文所述的间隔区，将双链RNA直接固定于纳米颗粒上，从而使得双链RNA仅一条链直接连接于纳米颗粒。
在其他实施方案中，连接于纳米颗粒的多核苷酸是DNA。当DNA连接于纳米颗粒时，所述DNA由与RNA双链体的单链区充分互补的序列构成，从而发生连接于纳米颗粒的DNA多核苷酸和RNA双链体的单链区的杂交，由此使双链RNA与纳米颗粒结合。在一方面，双链RNA的单链区是突出端。在各种方面的DNA是单链或者双链的，只要双链分子也包括与双链RNA的单链区杂交的单链区。
多核苷酸定向
有义对反义
在某些方面，连接于纳米颗粒的RNA的链是“有义”链，且双链RNA的互补链与有义链杂交，但是不连接于纳米颗粒。在其他方面，连接于纳米颗粒的RNA的链是“反义”链，且双链RNA的互补链与反义链杂交，但是不连接于纳米颗粒。如本文所用，“有义”链是与靶多核苷酸相同的链，而“反义”链是与靶多核苷酸互补的链。有义链或反义链与纳米颗粒的连接决定双链RNA与纳米颗粒定向的一方面。
本文证明，RNA双链体，其中的有义链连接于纳米颗粒且反义链与有义链杂交但不连接于纳米颗粒，比其中的反义链连接于纳米颗粒且有义链与反义链杂交但不连接于纳米颗粒的RNA双链体具有更高的活性(参阅实施例5)。在不受限于理论的情况下，认为RNA双链体与纳米颗粒的连接的定向(例如但不限于无论是RNA双链体的有义链，还是反义链连接于纳米颗粒)对呈递本公开所考虑的多肽的底物是重要的。在某些方面，多肽是Dicer。在某些方面，多肽是Argonaute。
多肽相互作用位点的位置
在某些实施方案中，本公开考虑了连接于纳米颗粒的多核苷酸是RNA。还考虑了，使多核苷酸连接于纳米颗粒，从而使位于RNA序列中的蛋白相互作用位点相对于纳米颗粒位于近端或远端。在这些方面，“近端”和“远端”指相对于多核苷酸的中点。例如，如果连接于纳米颗粒的多核苷酸的长度为20个碱基，则中点在距纳米颗粒10个碱基的位置，且蛋白相互作用位点相对于第10个碱基位于近端或远端。
利用本文所公开的方法将RNA多核苷酸固定于纳米颗粒上，允许控制本公开的多肽接近双链体。
在某些实施方案中，可以利用长度变化的间隔区序列，来改变纳米颗粒上RNA多核苷酸间的数量和距离，由此控制靶多核苷酸降解的速率。在不受限于理论的情况下，通过将RNA多核苷酸固定于纳米颗粒上，使得蛋白相互作用位点如上文所说位于近端位置，可以控制靶多核苷酸降解的速率。这方面，与下文所说的表面密度方法联合，可以允许或者防止本公开的多肽接近蛋白相互作用位点。
在下文，本文进一步详细描述了间隔区。
间隔区
在某些方面，考虑了官能化的纳米颗粒，其包括这样的纳米颗粒：其中寡核苷酸通过间隔区连接于纳米颗粒。本文所用的“间隔区”表示这样的部分：其本身不参与调节基因表达，但是当以多拷贝的方式连接于纳米颗粒时，其作用是增加纳米颗粒和功能寡核苷酸之间的距离，或增加个体寡核苷酸之间的距离。因此所考虑的间隔区以串联方式位于个体寡核苷酸之间，无论寡核苷酸具有相同的序列还是具有不同的序列。在一方面，如果存在，间隔区是有机部分。在另一方面，间隔区是多聚体，包括但不限于水溶性多聚体、核酸、多肽、寡糖、碳水化合物、脂质、乙二醇或其组合。
在某些方面，间隔区具有与其共价结合的多核苷酸，所述多核苷酸可以与纳米颗粒结合。如上文所述，这些多核苷酸是相同的多核苷酸。作为间隔区与纳米颗粒结合的结果，多核苷酸被远离纳米颗粒的表面隔开，并且更易与其靶标杂交。在间隔区是多核苷酸的情况中，在各种实施方案中，间隔区的长度为至少约10个核苷酸、10-30个核苷酸或甚至多于30个核苷酸。间隔区可以具有不干扰多核苷酸与纳米颗粒或靶多核苷酸结合的能力的任何序列。间隔区不应当具有彼此互补或与寡核苷酸的序列互补的序列，但是可以与靶多核苷酸全部或部分互补。在某些方面，多核苷酸间隔区的碱基都是腺嘌呤、都是胸腺嘧啶、都是胞苷、都是鸟嘌呤、都是尿嘧啶或都是某些其他修饰的碱基。
表面密度
本文所提供的纳米颗粒在纳米颗粒的表面上具有多核苷酸的组装密度，其在各种方面足以导致纳米颗粒间和单个纳米颗粒上多核苷酸链间的协作行为。在另一方面，纳米颗粒间的协作行为增加了多核苷酸对核酸酶降解的抗性。仍然在另一方面，细胞摄取纳米颗粒受与纳米颗粒结合的多核苷酸的密度的影响。如PCT/US2008/65366所述，其在此通过引用全文并入，在纳米颗粒表面上更高密度的多核苷酸与细胞摄取的纳米颗粒的增加有关。
足以使纳米颗粒稳定的表面密度和对于期望的纳米颗粒和多核苷酸的组合获得所述密度所需的条件可以根据经验来确定。通常，至少2pmole/cm2的表面密度足以提供稳定的纳米颗粒-寡核苷酸组合物。在某些方面，表面密度为至少15pmoles/cm2。还通过了方法，其中多核苷酸以下述表面密度结合于纳米颗粒：至少2pmol/cm2、至少3pmol/cm2、至少4pmol/cm2、至少5pmol/cm2、至少6pmol/cm2、至少7pmol/cm2、至少8pmol/cm2、至少9pmol/cm2、至少10pmol/cm2、至少约15pmol/cm2、至少约20pmol/cm2、至少约25pmol/cm2、至少约30pmol/cm2、至少约35pmol/cm2、至少约40pmol/cm2、至少约45pmol/cm2、至少约50pmol/cm2、至少约55pmol/cm2、至少约60pmol/cm2、至少约65pmol/cm2、至少约70pmol/cm2、至少约75pmol/cm2、至少约80pmol/cm2、至少约85pmol/cm2、至少约90pmol/cm2、至少约95pmol/cm2、至少约100pmol/cm2、至少约125pmol/cm2、至少约150pmol/cm2、至少约175pmol/cm2、至少约200pmol/cm2、至少约250pmol/cm2、至少约300pmol/cm2、至少约350pmol/cm2、至少约400pmol/cm2、至少约450pmol/cm2、至少约500pmol/cm2、至少约550pmol/cm2、至少约600pmol/cm2、至少约650pmol/cm2、至少约700pmol/cm2、至少约750pmol/cm2、至少约800pmol/cm2、至少约850pmol/cm2、至少约900pmol/cm2、至少约950pmol/cm2、至少约1000pmol/cm2或更高。
已经证明，纳米颗粒表面上多核苷酸的密度调节与表面上多核苷酸和/或与纳米颗粒本身的特异性多肽相互作用。在各种条件下，基于多核苷酸密度所引起的立体位阻，可以抑制一些多肽与结合于纳米颗粒的多核苷酸的相互作用。在期望多核苷酸与多肽的相互作用另外被立体位阻排除的方面，降低纳米颗粒表面上多核苷酸的密度，以允许多肽与多核苷酸相互作用。
已经证明，多核苷酸表面密度调节与纳米颗粒结合的多核苷酸的稳定性。在一实施方案中，提供了与纳米颗粒结合的RNA多核苷酸，其中RNA多核苷酸的半衰期至少基本上与不与纳米颗粒结合的相同RNA多核苷酸的半衰期相同。在其他实施方案中，与纳米颗粒结合的RNA多核苷酸的半衰期比不与纳米颗粒结合的相同RNA多核苷酸的半衰期长约5％、约10％、约20％、约30％、约40％、约50％、约60％、约70％、约80％、约90％，是不与纳米颗粒结合的相同RNA多核苷酸的半衰期的约2倍、约3倍、约4倍、约5倍、约6倍、约7倍、约8倍、约9倍、约10倍、约20倍、约30倍、约40倍、约50倍、约60倍、约70倍、约80倍、约90倍、约100倍、约200倍、约300倍、约400倍、约500倍、约600倍、约700倍、约800倍、约900倍、约1000倍、约5000倍、约10,000倍、约50,000倍、约100,000倍、约200,000倍、约300,000倍、约400,000倍、约500,000倍、约600,000倍、约700,000倍、约800,000倍、约900,000倍、约1,000,000倍或更多。
连接多核苷酸的方法
考虑用于所述方法的多核苷酸包括通过任何方式结合于纳米颗粒的多核苷酸。不管多核苷酸通过何种方式连接于纳米颗粒，在各种方面中的连接通过5′连接、3′连接、有些内连接类型或这些连接的任何组合实现。
一方面，使纳米颗粒、多核苷酸或两者官能化，以便将多核苷酸连接于纳米颗粒。使纳米颗粒和多核苷酸官能化的方在本领域内是已知的。例如，在3’末端或5’末端用烷烃硫醇官能化的多核苷酸易于连接于金纳米颗粒。参阅Whitesides，Proceedings of the Robert A.Welch Foundation 39th Conference OnChemical Research Nanophase Chemistry，Houston，Tex.，pages 109-121(1995)。还参阅Mucic et al.[Chem.Commun.555-557(1996)]，其描述了将3′硫醇DNA连接于平坦的金表面的方法。烷烃硫醇方法也可以用于将寡核苷酸连接于其他金属、半导体和磁胶体并连接于本文所述的其他类型的纳米颗粒。将寡核苷酸连接于固体表面的其他官能团包括硫代磷酸酯基团(参阅例如美国专利5,472,881，用于有关寡核苷酸-硫代磷酸酯与金表面能的结合)、取代的烷基硅氧烷[(参阅例如Burwell，Chemical Technology，4，370-377(1974)和Matteucci and Caruthers，J.Am.Chem.Soc，103，3185-3191(1981)，用于寡核苷酸与硅石和玻璃表面的结合，以及参阅Grabar et al.，[Anal.Chem.，67，735-743]，用于氨基烷基硅氧烷的结合和巯基烷基硅氧烷的相似结合]。具有5′硫代核苷或3’硫代核苷的多核苷酸可用于将寡核苷酸连接于固体表面。下述参考文献描述了可用于将寡核苷酸连接于纳米颗粒的其他方法：Nuzzo etal.，J.Am.Chem.Soc，109，2358(1987)(在金上的二硫化物)；Allara and Nuzzo，Langmuir，1，45(1985)(在铝上的羧酸)；Allara and Tompkins，J.ColloidInterface ScL，49，410-421(1974)(在铜上的羧酸)；Her，The Chemistry OfSilica，Chapter 6，(Wiley 1979)(在硅石上的羧酸)；Timmons and Zisman，J.Phys.Chem.，69，984-990(1965)(在铂上的羧酸)；Soriaga and Hubbard，J.Am.Chem.Soc，104，3937(1982)(在铂上的芳环化合物)；Hubbard，Ace Chem.Res.，13，177(1980)(在铂上的环丁砜、亚砜和其他官能化的溶剂)；Hickman et al.，J.Am.Chem.Soc，111，7271(1989)(在铂上的异腈)；Maoz and Sagiv，Langmuir，3，1045(1987)(在硅石上的硅烷)；Maoz and Sagiv，Langmuir，3，1034(1987)(在硅石上的硅烷)；Wasserman et al.，Langmuir，5，1074(1989)(在硅石上的硅烷)；Eltekova and Eltekov，Langmuir，3，951(1987)(在二氧化钛和硅石上的芳族羧酸、醛、醇、和甲氧基)；Lee et al.，J.Phys.Chem.，92，2597(1988)(在金属上的刚性磷酸盐)。
美国专利申请第09/760,500号和第09/820,279号及国际申请第PCT/US01/01190号和第PCT/US01/10071号描述了用环状二硫化物官能化的寡核苷酸。在某些方面，环状二硫化物在其环上具有5个或6个原子，包括2个硫原子。合适的环状二硫化物可商购获得，或通过已知方法合成。还考虑了用还原形式的环状二硫化物官能化。用三个环状二硫化物锚定基团官能化描述在PCT/US2008/63441中，在此通过引用将其全文并入。
在利用环状二硫化物官能化的某些方面，将寡核苷酸通过一个或多个连接体连接于纳米颗粒。在一实施方案中，连接体包含连接于环状二硫化物的烃部分。合适的烃可商购获得，并且连接于环状二硫化物。一方面，烃部分是类固醇残基。与利用烷烃硫醇或非环状二硫化物作为连接体制备的组合物相比，利用包含连接于环状二硫化物的类固醇残基的连接体制备的寡核苷酸-纳米颗粒组合物更稳定，并且在某些情况下，发现寡核苷酸-纳米颗粒组合物的稳定性是其300倍。在某些实施方案中，环状二硫化物的两个硫原子足够紧密地靠在一起，使得这两个硫原子同时连接于纳米颗粒。在其他方面，两个硫原子彼此邻近。在使用两个硫原子的方面，烃部分足够大，以便呈递筛查纳米颗粒表面的疏水表面。
在其他方面，使寡核苷酸连接于表面的方法基于下述文献所述的陈化方法：1999年6月25日提交的美国专利申请序列号09/344,667；2000年6月26日提交的序列号09/603,830；2001年1月12日提交的序列号09/760,500；2001年3月28日提交的序列号No.09/820,279；2001年8月10日提交的序列号09/927,777；和1997年7月21日提交的国际申请第PCT/US97/12783号；2000年6月26日提交的PCT/US00/17507；2001年1月12日提交的PCT/US01/01190；2001年3月28日提交的PCT/US01/10071，上述文献的公开通过引用全文并入。陈化方法提供了稳定性和选择性增强的纳米颗粒-寡核苷酸组合物。一方面，所述方法包括提供寡核苷酸，所述寡核苷酸具有与其共价结合的部分，所述部分包含可以与纳米颗粒结合的官能团。所述部分和官能团是允许寡核苷酸与纳米颗粒结合(即通过化学吸附或共价结合)的部分或官能团。例如，具有共价结合于其5’或3’末端的烷烃硫醇、烷烃二硫化物或环状二硫化物的寡核苷酸将所述寡核苷酸结合于多种纳米颗粒，包括金纳米颗粒。
已经发现，使用“陈化”步骤所产生的组合物比无“陈化”步骤所产生的组合物稳定得多。纳米颗粒表面上寡核苷酸密度的增加通过“陈化”步骤实现。“陈化”步骤所实现的表面密度会取决于纳米颗粒的大小和类型以及寡核苷酸的长度、序列和浓度。可以根据经验确定足以使纳米颗粒稳定的表面密度和对于期望的纳米颗粒和寡核苷酸的组合获得所述密度所需的条件。通常，至少2picomole/cm2的表面密度足以提供稳定的纳米颗粒-寡核苷酸组合物。无论如何，如本文所公开的，考虑了各种寡核苷酸密度。
在寡核苷酸与纳米颗粒初始结合后，将“陈化”步骤并入官能化的纳米颗粒的生产中。简而言之，使寡核苷酸与纳米颗粒在水中接触足以允许至少一些所述寡核苷酸通过官能团与纳米颗粒结合的时间。此类时间可以根据经验确定。在一方面，考虑了约12-24小时的时间。用于寡核苷酸结合的其他合适的条件也可以根据经验确定。例如，考虑了约10-20nM纳米颗粒的浓度和在室温下孵育。
接下来，将至少一种盐添加到水中，以便形成盐溶液。所述盐是任何水溶性盐，包括例如但不限于氯化钠、氯化镁、氯化钾、氯化铵、乙酸钠、乙酸铵或这些盐中两种或多种的组合，或这些盐中之一的磷酸缓冲液。以浓缩溶液或可选地以固体的方式添加盐。在各种实施方案中，一次添加全部的盐，或者随时间逐渐添加盐。“随时间逐渐”表示以至少两部分、以被一段时间隔开的间隔添加盐。合适的时间间隔可以根据经验确定。
盐溶液的离子强度必须足以至少部分地克服寡核苷酸彼此间的静电排斥，和带负电荷的寡核苷酸对带正电荷的纳米颗粒的静电吸引或带负电荷的寡核苷酸与带负电荷的纳米颗粒的静电排斥。通过随时间逐渐添加盐降低静电吸引和排斥，在纳米颗粒上产生寡核苷酸的最高表面密度。对于每种盐或盐的组合，可以根据经验确定合适的离子强度。在一方面，所利用的氯化钠的终浓度在磷酸缓冲液中为0.01M至约1.0M，同时随时间逐渐增加氯化钠的浓度。在另一方面，所利用的氯化钠的终浓度为约0.01M至约0.5M或约0.1M至约0.3M，同时随时间逐渐增加氯化钠的浓度。
在添加盐之后，使寡核苷酸和纳米颗粒在盐溶液中孵育一段时间，以允许其他寡核苷酸与纳米颗粒结合以产生稳定的纳米颗粒-寡核苷酸组合物。纳米颗粒上寡核苷酸密度的增加使组合物稳定，本文已对此做了描述。该孵育的时间可根据经验确定。作为实例，在一方面，考虑了约24-28的总孵育时间，其中在该总时间内逐渐增加盐浓度。在盐溶液中孵育的该第二时段在本文中称为“陈化”步骤。用于该“陈化”步骤的其他合适的条件也可以根据经验确定。作为实例，在室温下和pH 7.0孵育来进行陈化步骤。
利用“陈化”所产生的组合物通常比无“陈化”步骤所产生的组合物稳定得多。如上文所指出的，该稳定性的增加是由于纳米颗粒表面上寡核苷酸的密度增加导致的，密度增加可通过“陈化”步骤实现。通过“陈化”步骤所获得的表面密度将取决于纳米颗粒的大小和类型以及寡核苷酸的长度、序列和浓度。
如本文所用，“稳定”表示，在组合物制备后至少6个月的时期内，大多数核苷酸保持与纳米颗粒连接，且在检测核酸的方法和纳米加工的方法所经历的标准条件下，寡核苷酸能与核酸和寡核苷酸靶标杂交。
多核苷酸
本文所用术语“核苷酸”和其复数可以与本文所讨论的或者本领域中以其他方式所知的修饰形式互换。在某些情况下，本领域使用“核碱基”，其包括天然存在的核苷酸以及可以聚合的核苷酸的修饰物。因此核苷酸或核碱基表示天然存在的核碱基腺嘌呤(A)、鸟嘌呤(G)、胞嘧啶(C)、胸腺嘧啶(T)和尿嘧啶(U)，以及非天然存在的核碱基，如黄嘌呤、二氨基嘌呤、8-氧代-N6-甲基腺嘌呤、7-去氮杂黄嘌呤、7-去氮杂鸟嘌呤、N4，N4-桥亚乙基胞嘧啶、N′，N′-桥亚乙基-2，6-二氨基嘌呤、5-甲基胞嘧啶(mC)、5-(C3-C6)-炔基-胞嘧啶、5-氟尿嘧啶、5-溴尿嘧啶、假异胞嘧啶、2-羟基-5-甲基-4-三唑吡啶、异胞嘧啶、异鸟嘌呤、肌甙，以及Benner et al.，美国专利5,432,272和Susan M.Freier andKarl-Heinz Altmann，1997，Nucleic Acids Research，vol.25：pp 4429-4443所述的“非天然存在”的核碱基。术语“核碱基”不但包括已知的嘌呤和嘧啶杂环，而且还包括其杂环类似物和互变异构体。其他天然和非天然存在的核碱基包括以下文献所公开的核碱基：美国专利3,687,808(Merigan，et al.)；Chapter 15by Sanghvi，in Antisense Research and Application，Ed.S.T.Crooke and B.Lebleu，CRC Press，1993；Englisch et al.，1991，Angewandte Chemie，International Edition，30：613-722(特别是参阅622和623页，以及the ConciseEncyclopedia of Polymer Science and Engineering，J.I.Kroschwitz Ed.，JohnWiley & Sons，1990，pages 858-859，Cook，Anti-Cancer Drug Design 1991，6，585-607，上述每篇文献在此通过引用全文并入)。在各种方面，多核苷酸也包括一个或多个“核苷碱基”或“碱基单元”，其包括诸如杂环化合物的化合物，所述化合物的作用如同包括某些“通用碱基”在内的核碱基，所述通用碱基在最经典的意义看来不是核苷碱基但是发挥核苷碱基的作用。通用碱基包括3-硝基吡咯、任选地取代的吲哚(如5-硝基吲哚)以及任选地取代的次黄嘌呤。其他期望的通用碱基包括吡咯、二唑或三唑衍生物，包括本领域已知的通用碱基。
多核苷酸也可以包括修饰的核碱基。“修饰的碱基”在本领域内应当理解为是能与天然碱基(如腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶、尿嘧啶和/或胸腺嘧啶)配对和/或能与非天然存在的碱基配对的碱基。示例性的修饰的碱基描述于EP 1 072679和WO 97/12896中，两者的公开通过引用并入本文。修饰的碱基包括但不限于5-甲基胞嘧啶(5-me-C)、5-羟甲基胞嘧啶、黄嘌呤、次黄嘌呤、2-氨基腺嘌呤、腺嘌呤和鸟嘌呤的6-甲基和其他烷基衍生物、腺嘌呤和鸟嘌呤的2-丙基和其他烷基衍生物、2-硫代脲嘧啶、2-硫代胸腺嘧啶和2-硫代胞嘧啶、5-卤代尿嘧啶和胞嘧啶、5-丙炔基尿嘧啶和胞嘧啶和嘧啶碱基的其他炔基衍生物、6-偶氮尿嘧啶、胞嘧啶和胸腺嘧啶、5-尿嘧啶(假尿嘧啶)、4-硫代脲嘧啶，8-卤代、8-氨基、8-硫醇、8-硫代烷基、8-羟基和其他8-取代的腺嘌呤和鸟嘌呤，5-卤代特别是5-溴代、5-三氟甲基和其他5-取代的尿嘧啶和胞嘧啶，7-甲基鸟嘌呤和7-甲基腺嘌呤，2-F-腺嘌呤、2-氨基-腺嘌呤、8-氮杂鸟嘌呤和8-氮杂腺嘌呤、7-去氮杂鸟嘌呤和7-去氮杂腺嘌呤和3-去氮杂鸟嘌呤和3-去氮杂腺嘌呤。其他修饰的碱基包括三环嘧啶，如吩噁嗪胞苷(1H-嘧啶[5，4-b][1，4]苯并噁嗪-2(3H)-酮)、吩噻嗪胞苷(1H-嘧啶[5，4-b][1，4]苯并噻嗪-2(3H)-酮)；G形夹具(G-clamp)如取代的吩噁嗪胞苷(如9-(2-氨基乙氧基)-H-嘧啶[5，4-b][1，4]苯并噁唑-2(3H)-酮)、咔唑胞苷(2H-嘧啶[4，5-b]吲哚-2-酮)、吡啶并吲哚胞苷(H-吡啶[3′，2′:4，5]吡咯[2，3-d]嘧啶-2-酮)。修饰的碱基也可以包括这样的碱基：其中，嘌呤或嘧啶碱基被其他杂环取代，如7-去氮杂-腺嘌呤、7-去氮杂鸟嘌呤、2-氨基嘧啶和2-吡啶酮。其他核碱基包括：美国专利3,687,808所公开的核碱基、公开于The Concise Encyclopedia Of PolymerScience And Engineering，pages 858-859，Kroschwitz，J.L，ed.John Wiley &Sons，1990的核碱基，公开于Englisch et al.，1991，Angewandte Chemie，International Edition，30：613的核碱基，以及Sanghvi，Y.S.，Chapter 15，Antisense Research and Applications，pages 289-302，Crooke，S.T.and Lebleu，B.，ed.，CRC Press，1993公开的核碱基。这些碱基中有某些可用于增加结合亲和性，并包括5-取代的嘧啶、6-氮杂嘧啶和N-2、N-6和O-6取代的嘌呤，包括2-氨基丙基腺嘌呤、5-丙炔基尿嘧啶和5-丙炔基胞嘧啶。已经证明，5-甲基胞嘧啶取代使核酸双链体的稳定性增加0.6-1.2℃，并且在某些方面，与2′-O-甲氧基乙基糖修饰物组合。参阅U.S.Pat.Nos.3,687,808、U.S.Pat.Nos.4,845,205；5,130,302；5,134,066；5,175,273；5,367,066；5,432,272；5,457,187；5,459,255；5,484,908；5,502,177；5,525,711；5,552,540；5,587,469；5,594,121、5,596,091；5,614,617；5,645,985；5,830,653；5,763,588；6,005,096；5,750,692和5,681,941，上述专利公开通过引用并入本文。
制备预定序列的多核苷酸的方法，是众所周知的。参阅例如Sambrook et al.，Molecular Cloning：A Laboratory Manual(2nd ed.1989)and F.Eckstein(ed.)Oligonucleotides and Analogues，1st Ed.(Oxford University Press，New York，1991)。对于多核糖核苷酸和多脱氧核糖核苷酸两者而言，优选固相合成方法(合成DNA的众所周知的方法可用于合成RNA)。多核糖核苷酸也可以酶促制备。也可以将非天然存在的核碱基并入多核苷酸中。参阅例如美国专利7,223,833；Katz，J.Am.Chem.Soc，74：2238(1951)；Yamane，et al.，J.Am.Chem.Soc，83：2599(1961)；Kosturko，et al.，Biochemistry，13：3949(1974)；Thomas，J.Am.Chem.Soc，76：6032(1954)；Zhang，et al.，J.Am.Chem.Soc，127：74-75(2005)；和Zimmermann，et al.，J.Am.Chem.Soc，124：13684-13685(2002)。
所提供的用多核苷酸或其修饰形式官能化的纳米颗粒通常包含长度为约5个核苷酸至约100个核苷酸的多核苷酸。更具体而言，纳米颗粒用多核苷酸官能化，所述多核苷酸的长度为约5至约90个核苷酸、约5至约80个核苷酸、约5至约70个核苷酸、约5至约60个核苷酸、约5至约50个核苷酸、约5至约45个核苷酸、约5至约40个核苷酸、约5至约35个核苷酸、约5至约30个核苷酸、约5至约25个核苷酸、约5至约20个核苷酸、约5至约15个核苷酸、约5至约10个核苷酸，和长度位于具体公开的大小至能使多核苷酸实现期望结果的长度之间的全部多核苷酸。因此考虑了长度为5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100或更多个核苷酸的多核苷酸。
考虑用于连接于纳米颗粒的多核苷酸包括调节靶多核苷酸所表达的具有产物表达的多核苷酸。因此，考虑了与靶多核苷酸杂交并启动RNase活性(例如RNase H)的RNA多核苷酸、与双链多核苷酸杂交并抑制转录的形成三螺旋的多核苷酸以及与靶多核苷酸杂交并抑制翻译的核酶。
在各种方面，如果靶向特定mRNA，则单个纳米颗粒-结合剂组合物能与多个拷贝的相同转录物结合。在一方面，提供了用相同多核苷酸官能化的纳米颗粒，即每个多核苷酸具有相同的长度和相同的序列。在其他方面，用两个或多个多核苷酸使纳米颗粒官能化，所述多核苷酸是不同的，即至少一个连接的多核苷酸与至少另一个连接的多核苷酸的不同在于，其具有不同的长度和/或不同的序列。在使不同的多核苷酸连接于纳米颗粒的方面，这些不同的多核苷酸与相同的单个靶多核苷酸结合，但是在不同的位置或不同的底物位点与编码不同的基因产物的不同的靶多核苷酸结合。因此，在各种方面，单个纳米颗粒-结合剂组合物靶向多个基因产物。多核苷酸因此是靶标特异性多核苷酸，根据需要，是在靶多核苷酸的一个或多个特异性区域，还是在所述靶多核苷酸的全长中实现期望的具有表达的抑制水平。
多核苷酸特征
本公开在各种实施方案中提供了用于基因调节的共价RNA-纳米颗粒组合物。小干扰RNAs是双链RNA试剂，其与靶RNA(通常是信使RNA(mRNA))的一部分具有互补性(即能与之杂交)。通常，这类互补性为100％，如果需要，可以小于100％，如约20％、约25％、约30％、约35％、约40％、约45％、约50％、约55％、约60％、约70％、约75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％。例如，21个碱基中有19个碱基是碱基配对的。因此，应当理解，所述方法所用的寡核苷不必与代特异性杂交的期望的靶核酸100％互补。而且，寡核苷酸可在一个或多个片段内彼此杂交，从而使得干扰或邻近片段不参与杂交事件(如环状结构或发夹结构)。利用BLAST程序(Basic Local Alignment Search Tools)和本领域已知的PowerBLAST程序(Altschul et ciL，1990，J.MoI.Biol.，215：403-410；Zhang andMadden，1997，Genome Res.，7：649-656)，可以按常规方式测定任何给定寡核苷酸之间的互补性百分比。
在某些方面，如果期望在各种等位基因变体间进行选择，需要与靶基因的100％的互补性，以便从其他等位基因序列中有效辨别靶序列。当在等位基因靶标之间进行选择时，长度的选择也是重要的因素，因为其是与互补性百分比和区分等位基因差异的能力有关的其他因素。
“杂交”表示根据本领域已知的Watson-Crick DNA互补性、Hoogstein结合或其他序列特异性结合规则，两链或三链核酸通过氢键间的相互作用。杂交可以在本领域已知的不同严格条件下进行。
术语“RNA”两条单独链的双链体以及单链、三链或四链结构。单链RNA的实例是具有发夹环的RNA。RNA序列需要具有足够的长度，以便使小干扰RNA和靶RNA通过互补碱基配对相互作用结合在一起。本文所公开的方法可用的RNA可以具有不同的长度。本文所公开的RNA包含双链体的单链中与靶多核苷酸的序列充分互补的结构域，以便允许所述单链与所述靶多核苷酸在适当的条件下杂交，并且双链体的结构域与靶多核苷酸的序列的杂交产生了多肽识别的底物位点。该结构域的长度通常大于或等于10个核苷酸，并且具有与靶RNA杂交的足够长度；特别是10-100个核苷酸；更特别是10-80个核苷酸间的任何整数，如10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99以及100。“足够长度”表示大于或等于10个核苷酸的寡核苷酸，其具有的长度大小足以在期望的条件下提供预期的功能。
RNA可以在体外聚合，重组RNA含有嵌合序列或这些基团的衍生物。在各种实施方案中，RNA含有核糖核苷酸、脱氧核糖核苷酸、合成的核苷酸或任何合适的组合，使得靶序列的表达受到抑制。
送递的RNA可以停留在细胞质或细胞核内。可将RNA送递到细胞，以抑制内源或外源核苷酸序列的表达，或影响不与细胞天然相关的特定生理特征。
可将RNA送递到细胞，以便产生治疗性的细胞变化。送递用于治疗目的(改善动物健康的现有技术包括治疗或预防疾病)的RNA或其他遗传材料称为基因疗法。可以将RNA直接原位送递到生物体，或间接转移到离体细胞，随后再将所述离体细胞移植到生物体。进入细胞需要RNA阻断蛋白的产生或降低RNA的量。本公开所考虑的多核苷酸序列在下文做了进一步描述。
多核苷酸序列和杂交
在某些方面，本公开提供了靶向具体核酸的方法。可以靶向任何类型的核酸，并且所述方法可以用于例如基因表达的治疗性调节(参阅例如PCT/US2006/022325，所述文献的公开通过引用并入本文)。可以被本发明的方法靶向的核酸的实例包括但不限于基因(如与具体疾病有关的基因)、病毒RNA或mRNA、RNA、单链核酸。
靶核酸可以位于细胞、组织样品或生物流体中，这在本领域内也是已知的。参阅例如Sambrook et al.，Molecular Cloning：A Laboratory Manual(2nd ed.1989)和B.D.Hames and S.J.Higgins，Eds.，Gene Probes 1(IRL Press，NewYork，1995)。
术语“起始密码子区”和“翻译起始密码子区”指从翻译起始密码子起在任一方向(5′或3′)上包括连续核苷酸的一部分mRNA或基因。同样，术语“终止密码子区”和“翻译终止密码子区”指从翻译终止密码子起在任一方向(5′或3′)上包括连续核苷酸的一部分此类mRNA或基因。因此，“起始密码子区”(或“翻译起始密码子区”)和“终止密码子区”(或“翻译终止密码子区”)都是可被官能化的纳米颗粒上的寡核苷酸有效靶向的区域。
其他靶区域包括5′非翻译区(5′UTR)，其是从翻译起始密码子起在5’方向上的一部分mRNA，包括mRNA的5′帽位点和翻译起始密码子之间的核苷酸(或基因上的相应序列)；和3′非翻译区(3′UTR)，其是从自翻译终止密码子起在3’方向上的一部分mRNA，包括mRNA的翻译终止密码子和3′末端之间的核苷酸(或基因上的相应核苷酸)。mRNA的5′帽位点包含通过5′-5′三磷酸键连接于mRNA的5’最远端的残基的N7甲基化的鸟苷。mRNA的5′帽区被认为包括5′帽结构本身以及邻近帽位点的前50个核苷酸。
对于原核靶核酸而言，在各种方面，核酸是从基因组DNA转录的RNA。对于真核靶核酸而言，核酸是动物核酸、植物核酸、真菌核酸，包括酵母核酸在内。如上，靶核酸是从基因组DNA序列转录的RNA。在某些方面，靶核酸是线粒体核酸。对于病毒靶核酸而言，核酸是病毒基因组RNA，或从基因组DNA转录的RNA。
所提供的抑制基因产物表达的方法包括：与缺少寡核苷酸官能化的纳米颗粒情况下的基因产物表达相比，靶基因产物的表达受到至少约5％、至少约10％、至少约15％、至少约20％、至少约25％、至少约30％、至少约35％、至少约40％、至少约45％、至少约50％、至少约55％、至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或100％的抑制。换而言之，所提供的方法包括实质上导致以任何程度抑制靶基因产物表达的方法。
抑制程度通过体液样品或活检样品在体内测定或通过本领域众所周知的成像技术测定。可选地，在细胞培养测定中测定抑制的程度，这通常作为抑制程度的可预测的度量，其可以在体内通过使用的具体类型的纳米颗粒和具体寡核苷酸来预计。
修饰的多核苷酸
考虑了用于使纳米颗粒官能化的修饰的多核苷酸，其中多核苷酸的核苷酸单元中一个或多个糖和/或一个或多个核苷酸间连接被“非天然存在”的基团取代。在一方面，该实施方案考虑了肽核酸(PNA)。在PNA化合物中，多核苷酸的糖-主链被含有酰胺的主链取代。参阅例如美国专利5,539,082；5,714,331和5,719,262，以及Nielsen et al.，Science，1991，254，1497-1500，上述文献的公开通过引用并入本文。
针对公开的多核苷酸所考虑的核苷酸和非天然核苷间的其他连接包括下述文献所述的连接：美国专利4,981,957；5,118,800；5,319,080；5,359,044；5,393,878；5,446,137；5,466,786；5,514,785；5,519,134；5,567,811；5,576,427；5,591,722；5,597,909；5,610,300；5,627,053；5,639,873；5,646,265；5,658,873；5,670,633；5,792,747；和5,700,920；U.S.Patent Publication No.20040219565；International Patent Publication Nos.WO 98/39352和WO 99/14226；Mesmaekeret.al.，Current Opinion in Structural Biology 5：343-355(1995)以及Susan M.Freier and Karl-Heinz Altmann，Nucleic Acids Research，25：4429-4443(1997)，上述文献的公开通过引用并入本文。
多核苷酸的具体实例包括含有修饰的主链或非天然核苷酸间连接的多核苷。具有修饰的主链的多核苷酸包括在主链上保留了磷原子的多核苷酸和在主链上不具有磷原子的多核苷酸。在核苷间主链上不具有磷原子的修饰的多核苷酸被认为在“多核苷酸”含义的范围内。
含有磷原子的修饰的多核苷酸主链包括例如硫代磷酸酯、手性硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、磷酸三酯、氨基烷基磷酸三酯，甲基和其他烷基磷酸酯，包括3′-亚烃基磷酸酯、5′-亚烃基磷酸酯和手性亚烃基磷酸酯，亚膦酸酯，氨基磷酸酯，包括3′-氨基氨基磷酸酯(3-amino phosphor amidate)和氨基烷基氨基磷酸酯(aminoalkylphosphoramidate)，硫代氨基磷酸酯(thionophosphoramidate)，硫羰烷基磷酸酯(thionoalkylphosphonate)，硫羰烷基磷酸三酯(thionoalkylphosphotriester)，具有正常的3′-5′连接的硒基磷酸酯(selenophosphate)和硼烷基磷酸酯(boranophosphate)，这些的2′-5′连接的类似物，具有反极性的那些，其中一个或多个核苷酸间连接是3′到3′、5′到5′或2′到2′连接。还考虑了具有反极性的多核苷酸，其在最远的3’核苷酸间连接处包含单个3′到3′连接，即脱碱基(abasic)的单个反核苷残基(核苷酸遗失具有取代其的羟基)。还考虑了盐、混合盐和游离酸形式。
教导了上述含磷连接的代表性美国专利包括U.S.Pat.Nos.3,687,808、4,469,863、4,476,301、5,023,243、5,177,196、5,188,897、5,264,423、5,276,019、5,278,302、5,286,717、5,321,131、5,399,676、5,405,939、5,453,496、5,455,233、5,466,677、5,476,925、5,519,126、5,536,821、5,541,306、5,550,111、5,563,253、5,571,799、5,587,361、5,194,599、5,565,555、5,527,899、5,721,218、5,672,697以及5,625,050，上述的公开通过引用并入本文。
不包括磷原子的修饰的多核苷酸主链具有由以下形成的主链：短链烷基或环烷基核苷间连接，混合的杂原子和烷基或环烷基核苷间连接，或一个或多个短链杂原子或杂环核苷间连接。这些主链包括：具有吗啉代连接的主链；硅氧烷主链；硫化物、亚砜和砜主链；甲酰基(formacetyl)和硫代甲酰基(thioformacetyl)主链；亚甲基甲酰基和硫代甲酰基主链；核糖乙酰基(riboacetyl)主链；含有烯烃的主链；氨基磺酸酯主链；亚甲基亚氨基和亚甲基联氨基主链；磺酸酯和磺酰胺主链；酰胺主链；和其他具有混合的N、O、S以及CH2组成部分的主链。仍然在其他实施方案中，多核苷酸具有硫代磷酸酯主链，且寡核苷具有杂原子主链，且包括美国专利5,489,677和5,602,240所述的-CH2-NH-O-CH2-、-CH2-N(CH3)-O-CH2-、-CH2-O-N(CH3)-CH2-、-CH2-N(CH3)-N(CH3)-CH2-和O-N(CH3)-CH2-CH2-。参阅例如美国专利5,034,506、5,166,315、5,185,444、5,214,134、5,216,141、5,235,033、5,264,562、5,264,564、5,405,938、5,434,257、5,466,677、5,470,967、5,489,677、5,541,307、5,561,225、5,596,086、5,602,240、5,610,289、5,602,240、5,608,046、5,610,289、5,618,704、5,623,070、5,663,312、5,633,360、5,677,437、5,792,608、5,646,269和5,677,439，上述专利的公开通过引用全文并入本文。
在各种形式中，寡聚体中两个连续单体间连接由选自以下的2-4个，优选3个基团/原子组成：-CH2-、-O-、-S-、-NRH-、＞C＝O、＞C＝NRH、＞C＝S、-Si(R″)2-、-SO-、-S(O)2-、-P(O)2-、-PO(BH3)-、-P(O，S)-、-P(S)2-、-PO(R″)-、-PO(OCH3)-和-PO(NHRH)-，其中RH选自氢和C1-4-烷基，且R″选自C1-6-烷基和苯基。这类连接的说明性实例是-CH2-CH2-CH2-、-CH2-CO-CH2-、-CH2-CHOH-CH2-、-O-CH2-O-、-O-CH2-CH2-、-O-CH2-CH＝(当用作与随后单体的连接时，包括R5)、-CH2-CH2-O-、-NRH-CH2-CH2-、-CH2-CH2-NRH-、-CH2-NRH-CH2-、-O-CH2-CH2-NRH-、-NRH-CO-O-、-NRH-CO-NRH-、-NRH-CS-NRH-、-NRH-C(＝NRH)-NRH-、-NRH-CO-CH2-NRH-O-CO-O-、-O-CO-CH2-O-、-O-CH2-CO-O-、-CH2-CO-NRH-、-O-CO-NRH-，-NRH-CO-CH2-、-O-CH2-CO-NRH-、-O-CH2-CH2-NRH-、-CH＝N-O-、-CH2-NRH-O-、-CH2-O-N＝(当用作与随后单体的连接时包括R5)、-CH2-O-NRH-、-CO-NRH-CH2-、-CH2-NRH-O-、-CH2-NRH-CO-、-O-NRH-CH2-、-O-NRH、-O-CH2-S-、-S-CH2-O-、-CH2-CH2-S-、-O-CH2-CH2-S-、-S-CH2-CH＝(当用作与随后单体的连接时包括R5)、-S-CH2-CH2-、-S-CH2-CH2-O-、-S-CH2-CH2-S-、-CH2-S-CH2-、-CH2-SO-CH2-、-CH2-SO2-CH2-、-O-SO-O-、-O-S(O)2-O-、-O-S(O)2-CH2-、-O-S(O)2-NRH-、-NRH-S(O)2-CH2-、-O-S(O)2-CH2-、-O-P(O)2-O-、-O-P(O，S)-O-、-O-P(S)2-O-、-S-P(O)2-O-、-S-P(O，S)-O-、-S-P(S)2-O-、-O-P(O)2-S-、-O-P(O，S)-S-、-O-P(S)2-S-、-S-P(O)2-S-、-S-P(O，S)-S-、-S-P(S)2-S-、-O-PO(R″)-O-、-O-PO(OCH3)-O-、-O-PO(OCH2CH3)-O-、-O-PO(OCH2CH2S-R)-O-、-O-PO(BH3)-O-、-O-PO(NHRN)-O-、-O-P(O)2-NRHH-、-NRH-P(O)2-O-、-O-P(O，NRH)-O-、-CH2-P(O)2-O-、-O-P(O)2-CH2-和-O-Si(R″)2-O-；其中，考虑了-CH2-CO-NRH-、-CH2-NRH-O-、-S-CH2-O-、-O-P(O)2-O-O-P(-O，S)-O-、-O-P(S)2-O-、-NRHP(O)2-O-、-O-P(O，NRH)-O-、-O-PO(R″)-O-、-O-PO(CH3)-O-以及-O-PO(NHRN)-O-，如果RH选自氢和C1-4-烷基，且R″选自C1-6-烷基和苯基。其他说明性实例在下述文献中给出：Mesmaeker et.al.，1995，Current Opinion in StructuralBiology，5：343-355和Susan M.Freier and Karl-Heinz Altmann，1997，NucleicAcids Research，vol 25：pp 4429-4443。
其他修饰形式的多核苷酸还详细描述于美国专利申请20040219565中，该申请的公开通过引用全文并入本文。
修饰的多核苷酸也可以含有一个或多个取代的糖部分。在某些方面，多核苷酸在2′位置包含下述之一：OH；F；O-、S-或N-烷基；O-、S-或N-烯基；O-、S-或N-炔基；或O-烷基-O-烷基，其中，烷基、烯基和炔基可以是取代的或未取代的C1-C10烷基或C2-C10烯基和炔基。其他实施方案包括O[(CH2)nO]mCH3、O(CH2)nOCH3、O(CH2)nNH2、O(CH2)nCH3、O(CH2)nONH2以及O(CH2)nON[(CH2)nCH3]2，其中n和m为1到约10。附加多核苷酸在2’位置包含下述之一：C1-C10低级烷基、取代的低级烷基、烯基、炔基、烷芳基、芳烷基、O-烷芳基或O-芳烷基、SH、SCH3、OCN、Cl、Br、CN、CF3、OCF3、SOCH3、SO2CH3、ONO2、NO2、N3、NH2、杂环烷基、杂环烷芳基、氨基烷基氨基、聚烷基氨基(polyalkylamino)、取代的甲硅烷基、RNA切割基团、报道基团、嵌入物(intercalator)、改善多核苷酸药物动力学特性的基团或改善多核苷酸药效特性的基团，以及具有相似特性的其他取代基。在一方面，修饰包括2’-甲氧基乙氧基(2′-O-CH2CH2OCH3，也称为2′-O-(2-甲氧基乙基)或2′-MOE)(Martin et al.，1995，HeIv.Chim.Acta，78：486-504)，即烷氧基烷氧基基团。其他修饰包括2′-二甲基氨氧基乙氧基(dimethylaminooxyethoxy)，即O(CH2)2ON(CH3)2基团，也称为2′-DMAOE，和2′-二甲基氨基乙氧基乙氧基(在本领域也称为2′-O-二甲基-氨基-乙氧基-乙基或2′-DMAEOE)，即2′-O-CH2-O-CH2-N(CH3)2。
其他修饰还包括2′-甲氧基(2′-O-CH3)、2′-氨丙基(T-OCH2CH2CH2NH2)、2′-烯丙基(2′-CH2-CH＝CH2)、2′-O-烯丙基(2′-O-CH2-CH＝CH2)和2′-氟(2′-F)。2′修饰可以位于阿拉伯(向上)的位置或核糖(向下)的位置。在一方面，2′-阿拉伯修饰是2′-F。也可以在多核苷酸的其他位置进行相似的修饰，例如在3′末端核苷酸或2′-5′连接的多核苷酸上的糖的3′位置，和5′末端核苷酸的5′位置。多核苷酸也可以具有取代戊呋喃糖基糖的诸如环丁基部分的糖模拟物。参阅例如U.S.Pat.Nos.4,981,957；5,118,800；5,319,080；5,359,044；5,393,878；5,446,137；5,466,786；5,514,785；5,519,134；5,567,811；5,576,427；5,591,722；5,597,909；5,610,300；5,627,053；5,639,873；5,646,265；5,658,873；5,670,633；5,792,747；和5,700,920，上述专利的公开通过引用全文并入本文。
在一方面，糖的修饰包括锁核酸(LNA)，其中2′羟基连接于糖环的3′或4′碳原子。由此形成双环糖部分。在某些方面连接时桥接2′氧原子和4′碳原子的亚甲基(-CH2-)n基团，其中n是1或2。LNA和其制剂描述于WO 98/39352和WO 99/14226，上述文献的公开通过引用并入本文。
嵌合
在给定化合物中并不需要所有位置都统一受到修饰，并且事实上，可以在单个化合物中，甚至在寡核苷酸内的单个核苷处，并入多于1个的上述修饰。这些“嵌合”反义化合物通常含有至少一个包括上文所述修饰在内的区域，而剩余的寡核苷酸保持“未修饰的”。
在某些方面，修饰赋予对核酸酶降解的增加的抗性，增加的细胞摄取，增加的稳定性和/或对靶核酸的结合亲和性。在其他方面，修饰充当能切割RNA:DNA或RNA:RNA杂合体的酶的底物。作为实例，RNase H是细胞内切核酸酶，且切割RNA:DNA双链体的RNA链。因此，RNase H的激活导致RNA靶标的切割，从而极大地增强寡核苷酸介导的基因表达的抑制的效率。RNA:RNA杂合体的切割可以以相似的方式通过诸如RNaseL的内切核糖核酸酶的作用实现，RNase L切割细胞RNA和病毒RNA两者。RNA靶标的切割可以通过凝胶电泳，且如果需要和本领域已知的相关的核酸杂交技术以常规的方式检测。
如上文所述，嵌合化合物可以两个或多个寡核苷酸、修饰的寡核苷酸、寡核苷和/或寡核苷酸模拟物的复合合结构形成。这类化合物在本领域中也称为杂合体或gapmer。参阅例如美国专利5,013,830；5,149,797；5,220,007；5,256,775；5,366,878；5,403,711；5,491,133；5,565,350；5,623,065；5,652,355；5,652,356和5,700,922。上述专利的公开通过引用全文并入本文。
实施例
实施例1.无RNase的纳米颗粒的制备
利用公开的方法[Frens，Nature Physical Science 241：20-22(1973)]，制备柠檬酸盐稳定化的金纳米颗粒(13nm)。合成后，用0.1％焦碳酸二乙酯(DEPC)将颗粒处理12小时，同时搅拌，然后于121℃高压灭菌60分钟。重要且相当令人惊讶的是，纳米颗粒的光学和物理特性未受到该相对极端处理的影响，这可由UV分光术和透射电镜TEM分析(图1)测量。随后的配体官能化也未受到该处理的影响。利用RNaseAlert试剂盒(Ambion)，对这些溶液中RNase活性的检测表明，与对照或未处理的颗粒相比，没有可检测的RNase活性(图2)。
实施例2.无RNase的纳米颗粒的修饰
所得的无RNase的纳米颗粒利用公开的程序[Demers et al.，Anal.Chem.72：5535(2000)]，通过硫醇化的寡核苷酸进一步适当地修饰。在无该预处理的情况下，不能实现随后的用RNA的官能化，推测是由于基于RNA的表面加帽配体的快速降解所致。使双链体杂交，并添加于无RNase的Au NP，所述双链体由27个碱基的RNA链和以乙二醇间隔区和烷基硫醇终止的25个碱基的互补体组成，其中允许它们经由硫醇-金键以化学的方式吸收。对于这项工作，将序列设计为靶向萤火虫荧光素酶基因。
利用TOM-RNA试剂(Glen Research)和MerMade 6(Bioautomation)合成RNA寡核苷酸，或以商业方式制备(Integrated DNA Technologies)。使用TOP-RNA盒(Varian)，纯化通过非商业来源合成的寡核苷酸。本研究所用的序列是：荧光素酶有义序列，5′-磷酸rCrGrA rCrUrU rCrGrU rGrCrC rArGrArGrUrC rUrUrU rCrGAC间隔区18间隔区18-硫醇-3′(SEQ ID NO：1)，荧光素酶反义序列，5′-rGrUrC rGrArA rArGrA rCrUrC rUrGrG rCrArC rGrArArGrUrC rGrUrA-3′(SEQ ID NO：2)，Cy3荧光素酶，5′-Cy3 rGrUrC rGrArArArGrA rCrUrC rUrGrG rCrArC rGrArA rGrUrC rGrUrA-3′(SEQ ID NO：3)，Cy5荧光素酶，5′-Cy5 rGrUrC rGrArA rArGrA rCrUrC rUrGrG rCrArC rGrArArGrUrC rGrUrA-3′(SEQ ID NO：4)，荧光素酶dabcyl，5′-rCrGrA rCrUrUrCrGrU rGrCrC rArGrA rGrUrC rUrUrU rCrGA C-dabcyl-3′(SEQ ID NO：5)，海肾(Renilla)荧光素酶有义，5′-磷酸rGrGrA rGrGrA rCrGrC rUrCrC rArGrArUrGrA rArArU rGrGGT间隔区18间隔区18-硫醇-3′(SEQ ID NO：6)，海肾荧光素酶反义，5′rArCrC rCrArU rUrUrC rArUrC rUrGrG rArGrC rGrUrCrCrUrG-3′(SEQ ID NO：7)。
将预形成的硫醇化的RNA双链体(1000nM)与已经用0.1M的NaCl调整的无RNase的Au NP溶液(10nM)一起孵育。将该混合物在浓度渐增的盐溶液(从0.1到0.3M NaCl)中陈化，并进行超声处理，以增加表面上寡核糖核苷酸的覆盖度。在添加双链体24小时后，添加寡乙二醇(Oligoethylene glycol，OEG)(30μmol/mL的终浓度)，并防止颗粒在细胞培养物中沉淀(图3)。在此浓度下添加不改变双链体装载。在官能化后，通过在4℃下离心(13,000rpm，20分钟)，纯化颗粒，并悬浮于无菌的磷酸缓冲盐溶液(PBS：137mM NaCl、10mM磷酸盐、2.7mM KCl，pH 7.4)中。重复该过程三次。为了防止由于离心过程引起的发热所导致的双链体去杂交，必须冷冻离心。为了测定dsRNA装载，用花菁3(Cy3)荧光染料标记反义链。利用550nm下激发的Jobin YvonFluorolog FL3-22并测量1nm增长中从560到620nm的发射，来测量荧光，并与标准曲线进行比较。每个颗粒的双链体的数量通过以下方式计算：利用25μM的氰化钾氧化金，测量荧光反义链(表示形成的双链体)的数量，并除以纳米颗粒的浓度。每个RNA金纳米颗粒组合物在每个13nm Au NP上含有33+4个RNA双链体。
为了防止RNA双链体的去杂交，在添加双链体之前，将Au NP溶液的盐浓度用NaCl调整为0.1M。随后，每次添加之后，使盐浓度在12小时内从0.1M NaCl增加到0.3M NaCl，以便增加纳米颗粒表面上寡核苷酸的覆盖度[Hurst et al.，Anal Chem 78：8313(2006)]。为了产生更稳定的组合物，用30μmol/mL寡乙烯基乙二醇硫醇(OEG-硫醇)作为其他表面钝化配体处理RNA官能化的颗粒(方案1)。发现在细胞培养条件下，OEG-硫醇钝化使这些纳米材料稳定延长的时期。
Figure BPA00001373877800331
方案1.共价RNA金纳米颗粒组合物的制备。通过杂交，形成RNA双链体(含有双链RNA序列、乙烯基乙二醇间隔区和烷基硫醇基团)，随后与无RNase的纳米颗粒一起孵育。用寡乙烯基乙二醇硫醇(OEG-Thiol)进一步钝化增加细胞培养物的另外稳定性。
实施例3.RNA-纳米颗粒组合物的细胞摄取
通过共焦显微镜，利用上文所制备的荧光(花菁5，Cy5)组合物，研究组合物进入细胞的能力。向HeLa细胞的培养物添加RNA-Au NP。将细胞培养于玻璃盖玻片上并以用荧光团标记的RNA双链体官能化的纳米颗粒处理。处理6小时后，去除盖玻片，用PBS洗涤，并固定于用PBS填充的封固于载玻片上的小室(chamber)中。通过扫描式共焦显微镜(Zeiss 510 LSM)在63x放大率和633nm HeNe激光激发源下获得所有图像。6小时后，成像研究在全部HeLa细胞中都表现出荧光(图4a)。有意思的是，注意到如同DNA Au-NPs，RNA Au-NPs不需要转染剂进入细胞[Giljohann et al.，Nano Lett.7：3818(2007)]。实际上，分析流式细胞术证实RNA-Au NP在＞99％的细胞群中摄取(图4b)。对于流式细胞术实验，用荧光标记的(Cy5)RNA-纳米颗粒组合物处理细胞。转染后6个小时，使细胞胰蛋白酶化，以便从细胞培养孔中去除它们。利用在635nm下激发的DakoCytomation CyAn，进行流式细胞术。
实施例4.RNA-纳米颗粒组合物的活性
已经确定RNA-Au NPs通过细胞内在化，因此接下来检查RNA-金纳米颗粒组合物的细胞内活性。利用转染的荧光素酶质粒作为该模型系统的靶标，在HeLa细胞中进行蛋白抑制研究。将HeLa细胞(ATCC)培养于具有10％热失活的胎牛血清(FBS)的Eagle极限必须培养基(EMEM)中，并维持在37℃、5％CO2。将细胞接种于96孔板，并培养1天后，转染含有萤火虫荧光素酶和海肾基因的质粒(psiCHECK 2，Promega)。利用Lipofectamine 2000(Invitrogen)，根据制造商的推荐，添加质料(每孔0.2μg)。在质粒引入后(24小时)，将此培养基用含有针对萤火虫荧光素酶的官能化的RNA-Au NPs(3nM纳米颗粒浓度，≈100nM RNA双链体浓度)的血清减少的培养基替换。在处理1天后，细胞是约70％汇合的。在实验结束时，计数处理细胞的重复孔，并利用Guava EasyCyte Mini(Guava Technologies)，测量生存力。对于用RNAAu NP处理的细胞而言，孵育后生存力＞98％。
为了比较，利用商业试剂Lipofectamine 2000，根据制造商推荐的实验方案，转染相同数量的荧光素酶RNA双链体(100nM)。在处理24小时后，用新鲜的EMEM替换培养基。利用Dual-Glo(Promega)测定，根据制造商的实验方案，在所示的天数后，测定细胞的荧光素酶表达。
针对未受到转染的对照，使荧光素酶表达定量归一化，此定量归一化表明纳米颗粒试剂以剂量和试剂依赖性方式下调萤火虫荧光素酶。对照(海肾)表达不受针对萤火虫荧光素酶而设计的RNA-Au NP的影响，这表明抑制也是序列特异性的。有意思的是，三个用RNA-Au NP的独立实验的结果表现出的抑制均优于处理4天后无RNA的抑制(73+7％RNA-Au NPs对33+2％无RNA，图5a)。
荧光素酶持久稳固的抑制是纳米颗粒上RNA稳定化的结果。为了进行该测定，将Cy3-标记的RNA颗粒在96孔板、在90μL的PBS中稀释至5nM的浓度。对于dabcyl标记的分子RNA，浓度为150nM。将微量培养板置于维持在37℃的Photon Technology International FluoDia T70荧光平板读数器中。在允许样品平衡(10分钟)后，添加10μL胎牛血清(FBS，GeminiBioproducts)，使样品达到10％血清浓度。为了防止蒸发，用40μL矿物油覆盖反应。每5分钟，测量样品的荧光(激发＝530nm，发射＝570nm)，达48小时。用取代FBS的10μL PBS的等分试样处理的样品，测定基线荧光。当观察不到进一步的荧光增加时，将反应的终点测定为时间函数。一式三份，测量所有样品。
在这些稳定性实验中，在血清中孵育的组合物相对于它们的分子副本，表现出稳定性极大地增强。例如，在存在10％血清的情况下，RNA-Au NP组合物的半衰期比分子RNA双链体的半衰期大6倍(816+59分钟对133+30分钟，图5b)。这些数据表明，纳米颗粒结合在细胞外环境中提供了显著的免于降解的保护。由于RNA的细胞外寿命对于它们的贮存、处理和潜在的治疗应用而言非常重要，因此纳米颗粒结合为功能RNA配体的保护和送递提供了显著的优势。重要的是，这种增强的稳定性不需要化学修饰来保护RNA的完整性。
实施例5.多核苷酸在纳米颗粒表面上的定向
可以控制固定于纳米颗粒上的RNA的定向。固定Dicer酶的RNA底物的策略允许控制对双链体的接近。可以利用不同的固定化学品单硫醇或二硫醇以及不同长度的间隔区序列，来改变RNA双链体间的数量和距离，从而控制RNA降解的速率。
进行实验，来确定Dicer即在本系统中负责抑制RNAi的RNase是否能识别并切割这些双链体。在典型的酶促动力学实验中，将RNA-Au NP(约5nM)与Dicer(0.1U/mL终浓度)于37℃在反应缓冲液中混合。通过监测每72秒荧光的增加达至少12小时，测量RNA双链体降解的速率。为了测定最大和最小荧光，使用不含有溶解金的酶(最小值)或含有3mM氰化钾(KCN)的样品(最大值)。KCN氧化金纳米颗粒，从而排除荧光团标记的链的淬火。
每个纳米颗粒的双链体的数量通过以下方式测定：荧光标记1条或两条链，并将与给定浓度的RNA官能化的纳米颗粒有关的荧光与利用相同的链所产生的标准曲线进行比较。代表性装载研究的结果示于表1中。
  纳米颗粒的类型  荧光团的位置   双链体的数量
  两条链  杂交链的5’末端   91
  单链RNA发夹  发夹的5’末端   34
表1.利用两种不同的RNA装载策略，测定RNA双链体装载。缀合物在反义链(与共价连接于纳米颗粒的有义链杂交)上包含荧光素，或在发夹系统的情况下，RNA在5’末端用荧光素标记。
将RNase III与Dicer的活性进行比较，RNase III是已知降解dsRNA的核糖核酸酶。RNase III和Dicer都具有针对所检测的两种系统的活性，这可通过在一段时间内高于背景(没向反应中添加酶)的荧光的增加来测量。图6表示在存在RNase III的情况下的活性。
当每个系统都以与RNase III相似的方式用Dicer处理时，随时间观察到相称的荧光增加(图7)。因此，与RNase III相比，高于背景的荧光中的绝对差异，对于Dicer而言，更高。这些数据表明，当这些RNA浓密地固定于纳米颗粒表明上时，Dicer比如RNase III的非特异性酶更特异性地识别所述RNA。此外，对于固定与反义链相比的有义链，可以观察定向偏爱(图8)。在有义链化学连接于颗粒的情况下，观察到更高的活性。在不受限于理论的情况下，这可以反映反义链在RNAi机制中担当引导链的能力。认为这种差异具有调节和调谐细胞中RNAi反应的用途。
Figure IPA00001373877400031
Figure IPA00001373877400041

Claims (38)

1.一种纳米颗粒组合物，包含：
与纳米颗粒结合的一种或多种核糖核酸(RNA)多核苷酸；
所述RNA多核苷酸具有多肽相互作用位点；
所述RNA多核苷酸具有在适于形成双链体的条件下形成双链体的序列；
所述双链体在所述双链体的单链中具有至少一个与靶多核苷酸的序列充分互补的结构域，以允许所述单链与所述靶多核苷酸在适当的条件下杂交，且所述双链体的所述结构域与所述靶多核苷酸的序列的杂交产生多肽识别的底物位点；且
所述RNA多核苷酸以相对于所述多肽相互作用位点和所述纳米颗粒的定向特异性方式结合所述纳米颗粒。
2.如权利要求1所述的纳米颗粒组合物，其中所述RNA多核苷酸与所述纳米颗粒共价结合。
3.如权利要求1所述的纳米颗粒组合物，其中所述RNA多核苷酸不与所述纳米颗粒共价结合。
4.如权利要求1所述的纳米颗粒组合物，每个与所述纳米颗粒结合的RNA多核苷酸具有相同的序列。
5.如权利要求1所述的纳米颗粒组合物，其中至少2个与所述纳米颗粒结合的RNA多核苷酸具有不同的序列。
6.如权利要求1所述的纳米颗粒组合物，其中所述双链体包含所述RNA多核苷酸所形成的发夹结构。
7.如权利要求1所述的纳米颗粒组合物，还包含附加多核苷酸，所述附加多核苷酸具有与所述RNA多核苷酸的序列充分互补的序列，以允许与所述RNA多核苷酸在适当的条件下杂交形成所述双链体。
8.如权利要求7所述的纳米颗粒组合物，其中所述附加多核苷酸是RNA。
9.如权利要求7所述的纳米颗粒组合物，其中所述附加多核苷酸是脱氧核糖核酸(DNA)。
10.如权利要求7所述的纳米颗粒组合物，其中所述附加多核苷酸与所述纳米颗粒共价结合。
11.如权利要求7所述的纳米颗粒组合物，其中所述附加多核苷酸不与所述纳米颗粒共价结合。
12.如权利要求1所述的纳米颗粒组合物，其中所述多肽相互作用位点相对于所述RNA多核苷酸的中点位于靠近所述纳米颗粒的一端。
13.如权利要求1所述的纳米颗粒组合物，其中所述多肽相互作用位点相对于所述RNA多核苷酸的中点位于远离所述纳米颗粒的一端。
14.如权利要求1所述的纳米颗粒组合物，具有至少约2pmol/cm2至约1000pmol/cm2的RNA表面密度。
15.如权利要求1所述的纳米颗粒组合物，其中所述多肽相互作用位点与选自由RNase H、RNase D、RNase L、RNase III、Dicer、Argonaute、Argonaute2以及人免疫缺陷病毒反式激活反应RNA结合蛋白(TRBP)组成的组中的蛋白结合。
16.如权利要求1所述的纳米颗粒组合物，其中所述多核苷酸的结构域的长度为约10个核苷酸。
17.如权利要求16所述的纳米颗粒组合物，其中所述RNA多核苷酸还包括与所述靶多核苷酸的第二序列充分互补的第二结构域，且所述RNA多核苷酸的第二结构域与所述靶多核苷酸的第二序列的杂交产生第二多肽识别的其他底物位点。
18.如权利要求17所述的纳米颗粒组合物，其中所述多核苷酸的所述第二结构域的长度为约10个核苷酸。
19.如权利要求17所述的纳米颗粒组合物，其中所述底物位点和所述其他底物位点是相同的。
20.如权利要求17所述的纳米颗粒组合物，其中所述底物位点和所述其他底物位点是不同的。
21.如权利要求7所述的纳米颗粒组合物，其中所述RNA多核苷酸和所述附加多核苷酸在足以允许杂交的长度上彼此互补。
22.如权利要求21所述的纳米颗粒组合物，其中所述RNA多核苷酸和所述附加多核苷酸在它们的全长上彼此互补。
23.如权利要求1所述的纳米颗粒组合物，其中所述RNA多核苷酸通过硫醇连接缀合于所述纳米颗粒。
24.如权利要求1所述的纳米颗粒组合物，其中所述RNA多核苷酸的半衰期与不和纳米颗粒结合的相同RNA多核苷酸的半衰期至少基本上相同。
25.如权利要求1所述的纳米颗粒组合物，其中所述RNA多核苷酸的半衰期是不和纳米颗粒结合的相同RNA的半衰期的约1倍、约2倍、约3倍、约4倍、约5倍或更多。
26.如权利要求1所述的纳米颗粒组合物，其中所述RNA多核苷酸的长度为约5至约100个核苷酸。
27.如权利要求7所述的纳米颗粒组合物，其中所述附加多核苷酸的长度为约5至约100个核苷酸。
28.如权利要求1所述的纳米颗粒组合物，其是金纳米颗粒。
29.如权利要求1所述的纳米颗粒组合物，其是银纳米颗粒。
30.一种将RNA多核苷酸与纳米颗粒结合的方法，包括下述步骤：将硫醇化的RNA多核苷酸双链体与所述纳米颗粒的混合物在一系列溶液中陈化，以使所述RNA多核苷酸与所述纳米颗粒结合，从包含约0.1M NaCl的第一溶液开始，每种溶液相对于前一溶液包含浓度渐增的氯化钠(NaCl)。
31.如权利要求30所述的方法，还包括在最后的陈化步骤后超声处理所述混合物的步骤。
32.如权利要求30或31所述的方法，还包括分离所述纳米颗粒的步骤。
33.一种将RNA与纳米颗粒结合的方法，包括：
(a)将硫醇化的RNA双链体与所述纳米颗粒在包含约0.1M氯化钠(NaCl)的溶液中混合；
(b)在一系列盐溶液中陈化所述混合物，每种盐溶液相对于前一溶液包含浓度渐增的NaCl；
(c)超声处理所述混合物；以及
(d)纯化缀合的纳米颗粒。
34.如权利要求33所述的方法，其中所述一系列盐溶液的变化范围为约0.1M至约0.3M NaCl。
35.如权利要求33所述的方法，还包括用寡(乙二醇)硫醇(OEG)钝化所述纳米颗粒的表面。
36.一种调节靶多核苷酸表达的方法，包括使所述靶多核苷酸与权利要求1所述的纳米颗粒组合物的结构域杂交以形成多肽的底物位点的步骤。
37.如权利要求36所述的方法，其中杂交导致所述靶多核苷酸的降解。
38.如权利要求37所述的方法，其中所述多肽选自由RNase H、RNase D、RNase L、RNase III、Dicer、Argonaute、Argonaute2和TRBP组成的组中。
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Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN107435063A (zh) * 2016-05-27 2017-12-05 首都师范大学 一种快速制备巯基修饰DNA纳米金复合物(DNA‑AuNP)的方法
CN107881176A (zh) * 2017-11-16 2018-04-06 苏州纳葛诺斯生物科技有限公司 标记外泌体的试剂及其制备方法和使用方法
CN108025910A (zh) * 2015-07-21 2018-05-11 Dnp123公司 可编程、自组装的具补丁纳米颗粒以及相关装置、系统和方法
CN114272391A (zh) * 2021-12-28 2022-04-05 深圳湾实验室坪山生物医药研发转化中心 一种核酸导向的靶rna降解的纳米复合物及其制备方法

Families Citing this family (33)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US8252756B2 (en) 2005-06-14 2012-08-28 Northwestern University Nucleic acid functionalized nanoparticles for therapeutic applications
WO2008098248A2 (en) 2007-02-09 2008-08-14 Northwestern University Particles for detecting intracellular targets
MX2009013046A (es) 2007-05-30 2010-02-17 Univ Northwestern Nanoparticulas con grupo funcional de acido nucleico para aplicaciones terapeuticas.
JP5539962B2 (ja) 2008-04-25 2014-07-02 ノースウェスタン、ユニバーシティ コレステロールを隔離するのに適したナノ構造体
EP3335705A1 (en) 2008-11-24 2018-06-20 Northwestern University Polyvalent rna-nanoparticle compositions
US20100233270A1 (en) 2009-01-08 2010-09-16 Northwestern University Delivery of Oligonucleotide-Functionalized Nanoparticles
AU2010203474B2 (en) * 2009-01-08 2015-11-19 Northwestern University Inhibition of bacterial protein production by polyvalent oligonucleotide modified nanoparticle conjugates
WO2011053940A2 (en) 2009-10-30 2011-05-05 Northwestern University Templated nanoconjugates
AU2011207563B2 (en) 2010-01-19 2016-03-10 Northwestern University Synthetic nanostructures including nucleic acids and/or other entities
JP2014531898A (ja) 2011-09-11 2014-12-04 オーラセンス, エルエルシーAurasense, Llc 細胞取り込み制御システム
AU2012308302A1 (en) 2011-09-14 2014-03-20 Northwestern University Nanoconjugates able to cross the blood-brain barrier
US10260089B2 (en) 2012-10-29 2019-04-16 The Research Foundation Of The State University Of New York Compositions and methods for recognition of RNA using triple helical peptide nucleic acids
US20160194642A1 (en) 2013-07-25 2016-07-07 Exicure, Inc Spherical nucleic acid-based constructs as immunoregulatory agents
ES2750608T3 (es) 2013-07-25 2020-03-26 Exicure Inc Construcciones esféricas a base de ácido nucleico como agentes inmunoestimulantes para uso profiláctico y terapéutico
GB201313897D0 (en) * 2013-08-02 2013-09-18 Maersk Olie & Gas Conformance control in enhanced oil recovery
WO2015023797A1 (en) 2013-08-13 2015-02-19 Northwestern University Lipophilic nanoparticles for drug delivery
ES2725948T3 (es) 2014-06-04 2019-09-30 Exicure Inc Suministro multivalente de inmunomoduladores mediante ácidos nucleicos esféricos liposomales para aplicaciones profilácticas o terapéuticas
US9910035B1 (en) 2014-07-16 2018-03-06 Verily Life Sciences Llc Polyvalent functionalized nanoparticle-based in vivo diagnostic system
EP3204499A4 (en) 2014-10-06 2018-04-25 Exicure, Inc. Anti-tnf compounds
CN107106493A (zh) 2014-11-21 2017-08-29 西北大学 球形核酸纳米颗粒缀合物的序列特异性细胞摄取
WO2016085986A1 (en) 2014-11-24 2016-06-02 Northwestern University High density lipoprptein nanoparticles for inflammation
US10078092B2 (en) 2015-03-18 2018-09-18 Northwestern University Assays for measuring binding kinetics and binding capacity of acceptors for lipophilic or amphiphilic molecules
US10967072B2 (en) 2016-04-27 2021-04-06 Northwestern University Short interfering RNA templated lipoprotein particles (siRNA-TLP)
AU2017261360A1 (en) 2016-05-06 2018-11-29 Exicure Operating Company Liposomal Spherical Nucleic Acid (SNA) constructs presenting Antisense Oligonucleotides (ASO) for specific knockdown of interleukin 17 receptor MRNA
WO2018039629A2 (en) 2016-08-25 2018-03-01 Northwestern University Micellar spherical nucleic acids from thermoresponsive, traceless templates
WO2018201090A1 (en) 2017-04-28 2018-11-01 Exicure, Inc. Synthesis of spherical nucleic acids using lipophilic moieties
US11433131B2 (en) 2017-05-11 2022-09-06 Northwestern University Adoptive cell therapy using spherical nucleic acids (SNAs)
CN109420177B (zh) 2017-08-28 2022-03-04 香港中文大学 用于有效体内递送dna纳米结构至动脉粥样硬化斑块的材料和方法
CN109777794A (zh) * 2019-01-04 2019-05-21 三峡大学 一种核糖核酸酶及其抑制剂筛选的发光体系，制备方法及其应用
WO2020181144A1 (en) * 2019-03-06 2020-09-10 Northwestern University Hairpin-like oligonucleotide-conjugated spherical nucleic acid
EP4114970A4 (en) * 2020-03-02 2024-04-03 Northwestern University ADJUSTMENT FUSES FOR DETECTION OF INTRACELLULAR ANALYTES IN LIVING CELLS
WO2022098768A1 (en) * 2020-11-03 2022-05-12 The General Hospital Corporation Therapeutic, radiolabeled nanoparticles and methods of use thereof
WO2024069235A2 (en) 2022-09-30 2024-04-04 Sixfold Bioscience Ltd. Compositions containing oligonucleotides with theranostic applications

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20030147966A1 (en) * 2001-07-10 2003-08-07 Stefan Franzen Nanoparticle delivery vehicle
CN101180400A (zh) * 2004-05-24 2008-05-14 Mida科技有限公司 含有rna配体的纳米颗粒

Family Cites Families (259)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US3687808A (en) 1969-08-14 1972-08-29 Univ Leland Stanford Junior Synthetic polynucleotides
US4179337A (en) 1973-07-20 1979-12-18 Davis Frank F Non-immunogenic polypeptides
US4489055A (en) 1978-07-19 1984-12-18 N.V. Sopar S.A. Process for preparing biodegradable submicroscopic particles containing a biologically active substance and their use
US4289872A (en) 1979-04-06 1981-09-15 Allied Corporation Macromolecular highly branched homogeneous compound based on lysine units
JPS6023084B2 (ja) 1979-07-11 1985-06-05 味の素株式会社 代用血液
US4469863A (en) 1980-11-12 1984-09-04 Ts O Paul O P Nonionic nucleic acid alkyl and aryl phosphonates and processes for manufacture and use thereof
US5023243A (en) 1981-10-23 1991-06-11 Molecular Biosystems, Inc. Oligonucleotide therapeutic agent and method of making same
US4640835A (en) 1981-10-30 1987-02-03 Nippon Chemiphar Company, Ltd. Plasminogen activator derivatives
US4476301A (en) 1982-04-29 1984-10-09 Centre National De La Recherche Scientifique Oligonucleotides, a process for preparing the same and their application as mediators of the action of interferon
JPS5927900A (ja) 1982-08-09 1984-02-14 Wakunaga Seiyaku Kk 固定化オリゴヌクレオチド
FR2540122B1 (fr) 1983-01-27 1985-11-29 Centre Nat Rech Scient Nouveaux composes comportant une sequence d'oligonucleotide liee a un agent d'intercalation, leur procede de synthese et leur application
US4605735A (en) 1983-02-14 1986-08-12 Wakunaga Seiyaku Kabushiki Kaisha Oligonucleotide derivatives
US4948882A (en) 1983-02-22 1990-08-14 Syngene, Inc. Single-stranded labelled oligonucleotides, reactive monomers and methods of synthesis
US4824941A (en) 1983-03-10 1989-04-25 Julian Gordon Specific antibody to the native form of 2'5'-oligonucleotides, the method of preparation and the use as reagents in immunoassays or for binding 2'5'-oligonucleotides in biological systems
US4587044A (en) 1983-09-01 1986-05-06 The Johns Hopkins University Linkage of proteins to nucleic acids
US5118802A (en) 1983-12-20 1992-06-02 California Institute Of Technology DNA-reporter conjugates linked via the 2' or 5'-primary amino group of the 5'-terminal nucleoside
US5118800A (en) 1983-12-20 1992-06-02 California Institute Of Technology Oligonucleotides possessing a primary amino group in the terminal nucleotide
US4496689A (en) 1983-12-27 1985-01-29 Miles Laboratories, Inc. Covalently attached complex of alpha-1-proteinase inhibitor with a water soluble polymer
US5550111A (en) 1984-07-11 1996-08-27 Temple University-Of The Commonwealth System Of Higher Education Dual action 2',5'-oligoadenylate antiviral derivatives and uses thereof
FR2567892B1 (fr) 1984-07-19 1989-02-17 Centre Nat Rech Scient Nouveaux oligonucleotides, leur procede de preparation et leurs applications comme mediateurs dans le developpement des effets des interferons
US5367066A (en) 1984-10-16 1994-11-22 Chiron Corporation Oligonucleotides with selectably cleavable and/or abasic sites
US5430136A (en) 1984-10-16 1995-07-04 Chiron Corporation Oligonucleotides having selectably cleavable and/or abasic sites
US5258506A (en) 1984-10-16 1993-11-02 Chiron Corporation Photolabile reagents for incorporation into oligonucleotide chains
US4828979A (en) 1984-11-08 1989-05-09 Life Technologies, Inc. Nucleotide analogs for nucleic acid labeling and detection
FR2575751B1 (fr) 1985-01-08 1987-04-03 Pasteur Institut Nouveaux nucleosides de derives de l'adenosine, leur preparation et leurs applications biologiques
US5235033A (en) 1985-03-15 1993-08-10 Anti-Gene Development Group Alpha-morpholino ribonucleoside derivatives and polymers thereof
US5405938A (en) 1989-12-20 1995-04-11 Anti-Gene Development Group Sequence-specific binding polymers for duplex nucleic acids
US5166315A (en) 1989-12-20 1992-11-24 Anti-Gene Development Group Sequence-specific binding polymers for duplex nucleic acids
US5034506A (en) 1985-03-15 1991-07-23 Anti-Gene Development Group Uncharged morpholino-based polymers having achiral intersubunit linkages
US5185444A (en) 1985-03-15 1993-02-09 Anti-Gene Deveopment Group Uncharged morpolino-based polymers having phosphorous containing chiral intersubunit linkages
US4762779A (en) 1985-06-13 1988-08-09 Amgen Inc. Compositions and methods for functionalizing nucleic acids
EP0206448B1 (en) 1985-06-19 1990-11-14 Ajinomoto Co., Inc. Hemoglobin combined with a poly(alkylene oxide)
US5317098A (en) 1986-03-17 1994-05-31 Hiroaki Shizuya Non-radioisotope tagging of fragments
US4791192A (en) 1986-06-26 1988-12-13 Takeda Chemical Industries, Ltd. Chemically modified protein with polyethyleneglycol
JPS638396A (ja) 1986-06-30 1988-01-14 Wakunaga Pharmaceut Co Ltd ポリ標識化オリゴヌクレオチド誘導体
DE3788914T2 (de) 1986-09-08 1994-08-25 Ajinomoto Kk Verbindungen zur Spaltung von RNS an eine spezifische Position, Oligomere, verwendet bei der Herstellung dieser Verbindungen und Ausgangsprodukte für die Synthese dieser Oligomere.
US5541308A (en) 1986-11-24 1996-07-30 Gen-Probe Incorporated Nucleic acid probes for detection and/or quantitation of non-viral organisms
US5264423A (en) 1987-03-25 1993-11-23 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Inhibitors for replication of retroviruses and for the expression of oncogene products
US5276019A (en) 1987-03-25 1994-01-04 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Inhibitors for replication of retroviruses and for the expression of oncogene products
US5229490A (en) 1987-05-06 1993-07-20 The Rockefeller University Multiple antigen peptide system
US4904582A (en) 1987-06-11 1990-02-27 Synthetic Genetics Novel amphiphilic nucleic acid conjugates
AU598946B2 (en) 1987-06-24 1990-07-05 Howard Florey Institute Of Experimental Physiology And Medicine Nucleoside derivatives
US5585481A (en) 1987-09-21 1996-12-17 Gen-Probe Incorporated Linking reagents for nucleotide probes
AU630076B2 (en) 1987-09-21 1992-10-22 Gen-Probe Incorporated Non-nucleotide linking reagents for nucleotide probes
US5188897A (en) 1987-10-22 1993-02-23 Temple University Of The Commonwealth System Of Higher Education Encapsulated 2',5'-phosphorothioate oligoadenylates
US4924624A (en) 1987-10-22 1990-05-15 Temple University-Of The Commonwealth System Of Higher Education 2,',5'-phosphorothioate oligoadenylates and plant antiviral uses thereof
US5525465A (en) 1987-10-28 1996-06-11 Howard Florey Institute Of Experimental Physiology And Medicine Oligonucleotide-polyamide conjugates and methods of production and applications of the same
DE3738460A1 (de) 1987-11-12 1989-05-24 Max Planck Gesellschaft Modifizierte oligonukleotide
WO1989005358A1 (en) 1987-11-30 1989-06-15 University Of Iowa Research Foundation Dna and rna molecules stabilized by modifications of the 3'-terminal phosphodiester linkage and their use as nucleic acid probes and as therapeutic agents to block the expression of specifically targeted genes
US5403711A (en) 1987-11-30 1995-04-04 University Of Iowa Research Foundation Nucleic acid hybridization and amplification method for detection of specific sequences in which a complementary labeled nucleic acid probe is cleaved
US5082830A (en) 1988-02-26 1992-01-21 Enzo Biochem, Inc. End labeled nucleotide probe
EP0406309A4 (en) 1988-03-25 1992-08-19 The University Of Virginia Alumni Patents Foundation Oligonucleotide n-alkylphosphoramidates
US5278302A (en) 1988-05-26 1994-01-11 University Patents, Inc. Polynucleotide phosphorodithioates
US5109124A (en) 1988-06-01 1992-04-28 Biogen, Inc. Nucleic acid probe linked to a label having a terminal cysteine
US5216141A (en) 1988-06-06 1993-06-01 Benner Steven A Oligonucleotide analogs containing sulfur linkages
US5175273A (en) 1988-07-01 1992-12-29 Genentech, Inc. Nucleic acid intercalating agents
US5262536A (en) 1988-09-15 1993-11-16 E. I. Du Pont De Nemours And Company Reagents for the preparation of 5'-tagged oligonucleotides
US5194599A (en) 1988-09-23 1993-03-16 Gilead Sciences, Inc. Hydrogen phosphonodithioate compositions
US5512439A (en) 1988-11-21 1996-04-30 Dynal As Oligonucleotide-linked magnetic particles and uses thereof
US5599923A (en) 1989-03-06 1997-02-04 Board Of Regents, University Of Tx Texaphyrin metal complexes having improved functionalization
US5457183A (en) 1989-03-06 1995-10-10 Board Of Regents, The University Of Texas System Hydroxylated texaphyrins
US5391723A (en) 1989-05-31 1995-02-21 Neorx Corporation Oligonucleotide conjugates
US5256775A (en) 1989-06-05 1993-10-26 Gilead Sciences, Inc. Exonuclease-resistant oligonucleotides
US4958013A (en) 1989-06-06 1990-09-18 Northwestern University Cholesteryl modified oligonucleotides
US5451463A (en) 1989-08-28 1995-09-19 Clontech Laboratories, Inc. Non-nucleoside 1,3-diol reagents for labeling synthetic oligonucleotides
US5134066A (en) 1989-08-29 1992-07-28 Monsanto Company Improved probes using nucleosides containing 3-dezauracil analogs
US5254469A (en) 1989-09-12 1993-10-19 Eastman Kodak Company Oligonucleotide-enzyme conjugate that can be used as a probe in hybridization assays and polymerase chain reaction procedures
US5591722A (en) 1989-09-15 1997-01-07 Southern Research Institute 2'-deoxy-4'-thioribonucleosides and their antiviral activity
US5399676A (en) 1989-10-23 1995-03-21 Gilead Sciences Oligonucleotides with inverted polarity
US5721218A (en) 1989-10-23 1998-02-24 Gilead Sciences, Inc. Oligonucleotides with inverted polarity
DE69034150T2 (de) 1989-10-24 2005-08-25 Isis Pharmaceuticals, Inc., Carlsbad 2'-Modifizierte Oligonukleotide
US5264562A (en) 1989-10-24 1993-11-23 Gilead Sciences, Inc. Oligonucleotide analogs with novel linkages
US5264564A (en) 1989-10-24 1993-11-23 Gilead Sciences Oligonucleotide analogs with novel linkages
US5292873A (en) 1989-11-29 1994-03-08 The Research Foundation Of State University Of New York Nucleic acids labeled with naphthoquinone probe
US5177198A (en) 1989-11-30 1993-01-05 University Of N.C. At Chapel Hill Process for preparing oligoribonucleoside and oligodeoxyribonucleoside boranophosphates
US5130302A (en) 1989-12-20 1992-07-14 Boron Bilogicals, Inc. Boronated nucleoside, nucleotide and oligonucleotide compounds, compositions and methods for using same
US5486603A (en) 1990-01-08 1996-01-23 Gilead Sciences, Inc. Oligonucleotide having enhanced binding affinity
US5670633A (en) 1990-01-11 1997-09-23 Isis Pharmaceuticals, Inc. Sugar modified oligonucleotides that detect and modulate gene expression
US5587470A (en) 1990-01-11 1996-12-24 Isis Pharmaceuticals, Inc. 3-deazapurines
US5646265A (en) 1990-01-11 1997-07-08 Isis Pharmceuticals, Inc. Process for the preparation of 2'-O-alkyl purine phosphoramidites
US5459255A (en) 1990-01-11 1995-10-17 Isis Pharmaceuticals, Inc. N-2 substituted purines
US5578718A (en) 1990-01-11 1996-11-26 Isis Pharmaceuticals, Inc. Thiol-derivatized nucleosides
WO1993007883A1 (en) 1991-10-24 1993-04-29 Isis Pharmaceuticals, Inc. Derivatized oligonucleotides having improved uptake and other properties
US5587361A (en) 1991-10-15 1996-12-24 Isis Pharmaceuticals, Inc. Oligonucleotides having phosphorothioate linkages of high chiral purity
US5681941A (en) 1990-01-11 1997-10-28 Isis Pharmaceuticals, Inc. Substituted purines and oligonucleotide cross-linking
US5623065A (en) 1990-08-13 1997-04-22 Isis Pharmaceuticals, Inc. Gapped 2' modified oligonucleotides
US5220007A (en) 1990-02-15 1993-06-15 The Worcester Foundation For Experimental Biology Method of site-specific alteration of RNA and production of encoded polypeptides
US5149797A (en) 1990-02-15 1992-09-22 The Worcester Foundation For Experimental Biology Method of site-specific alteration of rna and production of encoded polypeptides
AU7579991A (en) 1990-02-20 1991-09-18 Gilead Sciences, Inc. Pseudonucleosides and pseudonucleotides and their polymers
US5214136A (en) 1990-02-20 1993-05-25 Gilead Sciences, Inc. Anthraquinone-derivatives oligonucleotides
US5321131A (en) 1990-03-08 1994-06-14 Hybridon, Inc. Site-specific functionalization of oligodeoxynucleotides for non-radioactive labelling
US5470967A (en) 1990-04-10 1995-11-28 The Dupont Merck Pharmaceutical Company Oligonucleotide analogs with sulfamate linkages
GB9009980D0 (en) 1990-05-03 1990-06-27 Amersham Int Plc Phosphoramidite derivatives,their preparation and the use thereof in the incorporation of reporter groups on synthetic oligonucleotides
EP0455905B1 (en) 1990-05-11 1998-06-17 Microprobe Corporation Dipsticks for nucleic acid hybridization assays and methods for covalently immobilizing oligonucleotides
US5637459A (en) 1990-06-11 1997-06-10 Nexstar Pharmaceuticals, Inc. Systematic evolution of ligands by exponential enrichment: chimeric selex
US5270163A (en) 1990-06-11 1993-12-14 University Research Corporation Methods for identifying nucleic acid ligands
US5218105A (en) 1990-07-27 1993-06-08 Isis Pharmaceuticals Polyamine conjugated oligonucleotides
US5618704A (en) 1990-07-27 1997-04-08 Isis Pharmacueticals, Inc. Backbone-modified oligonucleotide analogs and preparation thereof through radical coupling
US5602240A (en) 1990-07-27 1997-02-11 Ciba Geigy Ag. Backbone modified oligonucleotide analogs
US5541307A (en) 1990-07-27 1996-07-30 Isis Pharmaceuticals, Inc. Backbone modified oligonucleotide analogs and solid phase synthesis thereof
US5610289A (en) 1990-07-27 1997-03-11 Isis Pharmaceuticals, Inc. Backbone modified oligonucleotide analogues
US5489677A (en) 1990-07-27 1996-02-06 Isis Pharmaceuticals, Inc. Oligonucleoside linkages containing adjacent oxygen and nitrogen atoms
US5623070A (en) 1990-07-27 1997-04-22 Isis Pharmaceuticals, Inc. Heteroatomic oligonucleoside linkages
US5138045A (en) 1990-07-27 1992-08-11 Isis Pharmaceuticals Polyamine conjugated oligonucleotides
US5677437A (en) 1990-07-27 1997-10-14 Isis Pharmaceuticals, Inc. Heteroatomic oligonucleoside linkages
BR9106702A (pt) 1990-07-27 1993-06-08 Isis Pharmaceuticals Inc Analogo de oligonucleotideos e processos para modular a producao de uma proteina por um organismo e para tratar um organismo
US5608046A (en) 1990-07-27 1997-03-04 Isis Pharmaceuticals, Inc. Conjugated 4'-desmethyl nucleoside analog compounds
DE69115702T2 (de) 1990-08-03 1996-06-13 Sterling Winthrop Inc Verbindungen und verfahren zur unterdrückung der genexpression
US5245022A (en) 1990-08-03 1993-09-14 Sterling Drug, Inc. Exonuclease resistant terminally substituted oligonucleotides
US5177196A (en) 1990-08-16 1993-01-05 Microprobe Corporation Oligo (α-arabinofuranosyl nucleotides) and α-arabinofuranosyl precursors thereof
US5512667A (en) 1990-08-28 1996-04-30 Reed; Michael W. Trifunctional intermediates for preparing 3'-tailed oligonucleotides
US5214134A (en) 1990-09-12 1993-05-25 Sterling Winthrop Inc. Process of linking nucleosides with a siloxane bridge
US5561225A (en) 1990-09-19 1996-10-01 Southern Research Institute Polynucleotide analogs containing sulfonate and sulfonamide internucleoside linkages
JPH06505704A (ja) 1990-09-20 1994-06-30 ギリアド　サイエンシズ，インコーポレイテッド 改変ヌクレオシド間結合
US5432272A (en) 1990-10-09 1995-07-11 Benner; Steven A. Method for incorporating into a DNA or RNA oligonucleotide using nucleotides bearing heterocyclic bases
KR930702373A (ko) 1990-11-08 1993-09-08 안토니 제이. 페이네 합성 올리고누클레오티드에 대한 다중 리포터(Reporter)그룹의 첨합
US5672697A (en) 1991-02-08 1997-09-30 Gilead Sciences, Inc. Nucleoside 5'-methylene phosphonates
US5539082A (en) 1993-04-26 1996-07-23 Nielsen; Peter E. Peptide nucleic acids
US5719262A (en) 1993-11-22 1998-02-17 Buchardt, Deceased; Ole Peptide nucleic acids having amino acid side chains
US5714331A (en) 1991-05-24 1998-02-03 Buchardt, Deceased; Ole Peptide nucleic acids having enhanced binding affinity, sequence specificity and solubility
US7223833B1 (en) 1991-05-24 2007-05-29 Isis Pharmaceuticals, Inc. Peptide nucleic acid conjugates
US5371241A (en) 1991-07-19 1994-12-06 Pharmacia P-L Biochemicals Inc. Fluorescein labelled phosphoramidites
US5571799A (en) 1991-08-12 1996-11-05 Basco, Ltd. (2'-5') oligoadenylate analogues useful as inhibitors of host-v5.-graft response
ES2103918T3 (es) 1991-10-17 1997-10-01 Ciba Geigy Ag Nucleosidos biciclicos, oligonucleotidos, procedimiento para su obtencion y productos intermedios.
US5594121A (en) 1991-11-07 1997-01-14 Gilead Sciences, Inc. Enhanced triple-helix and double-helix formation with oligomers containing modified purines
TW393513B (en) 1991-11-26 2000-06-11 Isis Pharmaceuticals Inc Enhanced triple-helix and double-helix formation with oligomers containing modified pyrimidines
AU3222793A (en) 1991-11-26 1993-06-28 Gilead Sciences, Inc. Enhanced triple-helix and double-helix formation with oligomers containing modified pyrimidines
US5484908A (en) 1991-11-26 1996-01-16 Gilead Sciences, Inc. Oligonucleotides containing 5-propynyl pyrimidines
US5792608A (en) 1991-12-12 1998-08-11 Gilead Sciences, Inc. Nuclease stable and binding competent oligomers and methods for their use
US5359044A (en) 1991-12-13 1994-10-25 Isis Pharmaceuticals Cyclobutyl oligonucleotide surrogates
US5700922A (en) 1991-12-24 1997-12-23 Isis Pharmaceuticals, Inc. PNA-DNA-PNA chimeric macromolecules
US5565552A (en) 1992-01-21 1996-10-15 Pharmacyclics, Inc. Method of expanded porphyrin-oligonucleotide conjugate synthesis
US5595726A (en) 1992-01-21 1997-01-21 Pharmacyclics, Inc. Chromophore probe for detection of nucleic acid
FR2687679B1 (fr) 1992-02-05 1994-10-28 Centre Nat Rech Scient Oligothionucleotides.
US5633360A (en) 1992-04-14 1997-05-27 Gilead Sciences, Inc. Oligonucleotide analogs capable of passive cell membrane permeation
WO1993021259A1 (en) 1992-04-14 1993-10-28 Cornell Research Foundation Inc. Dendritic based macromolecules and method of production
US5434257A (en) 1992-06-01 1995-07-18 Gilead Sciences, Inc. Binding compentent oligomers containing unsaturated 3',5' and 2',5' linkages
EP0577558A2 (de) 1992-07-01 1994-01-05 Ciba-Geigy Ag Carbocyclische Nukleoside mit bicyclischen Ringen, Oligonukleotide daraus, Verfahren zu deren Herstellung, deren Verwendung und Zwischenproduckte
US5272250A (en) 1992-07-10 1993-12-21 Spielvogel Bernard F Boronated phosphoramidate compounds
US5652355A (en) 1992-07-23 1997-07-29 Worcester Foundation For Experimental Biology Hybrid oligonucleotide phosphorothioates
US5472881A (en) 1992-11-12 1995-12-05 University Of Utah Research Foundation Thiol labeling of DNA for attachment to gold surfaces
US5574142A (en) 1992-12-15 1996-11-12 Microprobe Corporation Peptide linkers for improved oligonucleotide delivery
US5476925A (en) 1993-02-01 1995-12-19 Northwestern University Oligodeoxyribonucleotides including 3'-aminonucleoside-phosphoramidate linkages and terminal 3'-amino groups
GB9304618D0 (en) 1993-03-06 1993-04-21 Ciba Geigy Ag Chemical compounds
CA2159631A1 (en) 1993-03-30 1994-10-13 Sanofi Acyclic nucleoside analogs and oligonucleotide sequences containing them
WO1994022891A1 (en) 1993-03-31 1994-10-13 Sterling Winthrop Inc. Oligonucleotides with amide linkages replacing phosphodiester linkages
DE4311944A1 (de) 1993-04-10 1994-10-13 Degussa Umhüllte Natriumpercarbonatpartikel, Verfahren zu deren Herstellung und sie enthaltende Wasch-, Reinigungs- und Bleichmittelzusammensetzungen
NL9301919A (nl) 1993-05-27 1994-12-16 Pelt & Hooykaas Werkwijze voor het afvangen van milieuschadelijke stoffen uit met dergelijke stoffen verontreinigd materiaal.
EP0748382B1 (en) 1993-09-02 2002-11-06 Ribozyme Pharmaceuticals, Inc. Non-nucleotide containing enzymatic nucleic acid
US5502177A (en) 1993-09-17 1996-03-26 Gilead Sciences, Inc. Pyrimidine derivatives for labeled binding partners
ATE174600T1 (de) 1993-10-27 1999-01-15 Ribozyme Pharm Inc 2'-amido-und 2'-peptido-modifizierte oligonukleotide
US5457187A (en) 1993-12-08 1995-10-10 Board Of Regents University Of Nebraska Oligonucleotides containing 5-fluorouracil
CA2178729A1 (en) 1993-12-09 1995-06-15 Eric B. Kmiec Compounds and methods for site-directed mutations in eukaryotic cells
US5446137B1 (en) 1993-12-09 1998-10-06 Behringwerke Ag Oligonucleotides containing 4'-substituted nucleotides
US5519134A (en) 1994-01-11 1996-05-21 Isis Pharmaceuticals, Inc. Pyrrolidine-containing monomers and oligomers
US5596091A (en) 1994-03-18 1997-01-21 The Regents Of The University Of California Antisense oligonucleotides comprising 5-aminoalkyl pyrimidine nucleotides
US5627053A (en) 1994-03-29 1997-05-06 Ribozyme Pharmaceuticals, Inc. 2'deoxy-2'-alkylnucleotide containing nucleic acid
US5625050A (en) 1994-03-31 1997-04-29 Amgen Inc. Modified oligonucleotides and intermediates useful in nucleic acid therapeutics
US5646269A (en) 1994-04-28 1997-07-08 Gilead Sciences, Inc. Method for oligonucleotide analog synthesis
US5525711A (en) 1994-05-18 1996-06-11 The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services Pteridine nucleotide analogs as fluorescent DNA probes
US5597696A (en) 1994-07-18 1997-01-28 Becton Dickinson And Company Covalent cyanine dye oligonucleotide conjugates
US5580731A (en) 1994-08-25 1996-12-03 Chiron Corporation N-4 modified pyrimidine deoxynucleotides and oligonucleotide probes synthesized therewith
US5597909A (en) 1994-08-25 1997-01-28 Chiron Corporation Polynucleotide reagents containing modified deoxyribose moieties, and associated methods of synthesis and use
US5792747A (en) 1995-01-24 1998-08-11 The Administrators Of The Tulane Educational Fund Highly potent agonists of growth hormone releasing hormone
US5652356A (en) 1995-08-17 1997-07-29 Hybridon, Inc. Inverted chimeric and hybrid oligonucleotides
US5912340A (en) 1995-10-04 1999-06-15 Epoch Pharmaceuticals, Inc. Selective binding complementary oligonucleotides
US20050059016A1 (en) 2002-11-05 2005-03-17 Ecker David J. Structural motifs and oligomeric compounds and their use in gene modulation
US20040147022A1 (en) * 1996-06-06 2004-07-29 Baker Brenda F. 2'-methoxy substituted oligomeric compounds and compositions for use in gene modulations
US20020172953A1 (en) 1996-07-29 2002-11-21 Mirkin Chad A. Movement of biomolecule-coated nanoparticles in an electric field
US6506564B1 (en) 1996-07-29 2003-01-14 Nanosphere, Inc. Nanoparticles having oligonucleotides attached thereto and uses therefor
CA2262018C (en) 1996-07-29 2007-10-02 Nanosphere Llc Nanoparticles having oligonucleotides attached thereto and uses therefor
US6582921B2 (en) 1996-07-29 2003-06-24 Nanosphere, Inc. Nanoparticles having oligonucleotides attached thereto and uses thereof
US7098320B1 (en) 1996-07-29 2006-08-29 Nanosphere, Inc. Nanoparticles having oligonucleotides attached thereto and uses therefor
US6361944B1 (en) 1996-07-29 2002-03-26 Nanosphere, Inc. Nanoparticles having oligonucleotides attached thereto and uses therefor
US6750016B2 (en) 1996-07-29 2004-06-15 Nanosphere, Inc. Nanoparticles having oligonucleotides attached thereto and uses therefor
US20060002949A1 (en) 1996-11-14 2006-01-05 Army Govt. Of The Usa, As Rep. By Secretary Of The Office Of The Command Judge Advocate, Hq Usamrmc. Transcutaneous immunization without heterologous adjuvant
JP3756313B2 (ja) 1997-03-07 2006-03-15 武 今西 新規ビシクロヌクレオシド及びオリゴヌクレオチド類縁体
JP2002514919A (ja) 1997-04-04 2002-05-21 バイオサイト ダイアグノスティックス，インコーポレイテッド 多価ライブラリーおよびポリクローナルライブラリー
US6974669B2 (en) 2000-03-28 2005-12-13 Nanosphere, Inc. Bio-barcodes based on oligonucleotide-modified nanoparticles
WO1999011655A1 (en) 1997-09-04 1999-03-11 Gryphon Sciences Modular protein libraries and methods of preparation
JP4236812B2 (ja) 1997-09-12 2009-03-11 エクシコン エ／エス オリゴヌクレオチド類似体
US6242246B1 (en) 1997-12-15 2001-06-05 Somalogic, Inc. Nucleic acid ligand diagnostic Biochip
US6403312B1 (en) 1998-10-16 2002-06-11 Xencor Protein design automatic for protein libraries
US6827979B2 (en) 1999-01-07 2004-12-07 Northwestern University Methods utilizing scanning probe microscope tips and products therefor or produced thereby
AR022404A1 (es) 1999-01-25 2002-09-04 Photogen Inc Metodo y agentes para la terapia de radiacion mejorada
WO2000075306A2 (en) 1999-04-30 2000-12-14 Cyclops Genome Sciences Limited Method for producing double stranded polynucleotides
US6656730B1 (en) 1999-06-15 2003-12-02 Isis Pharmaceuticals, Inc. Oligonucleotides conjugated to protein-binding drugs
EP1198591B1 (en) 1999-06-25 2011-03-16 Nanosphere, Inc. Nanoparticles having oligonucleotides attached thereto and uses therefor
EP1072679A3 (en) 1999-07-20 2002-07-31 Agilent Technologies, Inc. (a Delaware corporation) Method of producing nucleic acid molecules with reduced secondary structure
AU783874B2 (en) 1999-11-29 2005-12-15 Avi Biopharma, Inc. Uncharged antisense oligonucleotides targeted to bacterial 16S and 23S PRNAS and their uses
US20030181412A1 (en) 1999-12-21 2003-09-25 Ingeneus Corporation Method for modifying transcription and/or translation in an organism for therapeutic, prophylactic and/or analytic uses
JP2003519241A (ja) 1999-12-30 2003-06-17 アバンテイス・フアルマ・エス・アー 二層型鉱物粒子に取り込まれた核酸を含む組成物
CA2396113C (en) 2000-01-13 2009-04-07 Nanosphere, Inc. Nanoparticles having oligonucleotides attached thereto and uses therefor
US6287860B1 (en) 2000-01-20 2001-09-11 Isis Pharmaceuticals, Inc. Antisense inhibition of MEKK2 expression
CA2402955C (en) 2000-03-28 2010-03-09 Nanosphere, Inc. Nanoparticles having oligonucleotides attached thereto and uses therefor
US6991900B2 (en) 2000-06-28 2006-01-31 California Institute Of Technology Methods for identifying an essential gene in a prokaryotic microorganism
CA2415494C (en) 2000-07-11 2007-09-18 Northwestern University Method of detection by enhancement of silver staining
US6806289B1 (en) 2000-07-14 2004-10-19 Stephen J. Lippard Coordination complexes, and methods for preparing by combinatorial methods, assaying and using the same
US6678548B1 (en) 2000-10-20 2004-01-13 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Unified probabilistic framework for predicting and detecting seizure onsets in the brain and multitherapeutic device
CZ302719B6 (cs) 2000-12-01 2011-09-21 MAX-PLANCK-Gesellschaft zur Förderung der Wissenschaften e.V. Izolovaná molekula dvouretezcové RNA, zpusob její výroby a její použití
DE10065475A1 (de) 2000-12-28 2002-07-18 Switch Biotech Ag Verwendung von "intermediate-conductance" Kaliumkanälen und Modulatoren zur Diagnose und Behandlung von Krankheiten mit gestörter Keratinozytenfunktion
US7667004B2 (en) 2001-04-17 2010-02-23 Abmaxis, Inc. Humanized antibodies against vascular endothelial growth factor
IL142875A (en) 2001-04-30 2009-08-03 Avigdor Shafferman PEG-linked cholinesterases for the detoxification of circulating organophosphorus
US20060019917A1 (en) 2001-05-18 2006-01-26 Sirna Therapeutics, Inc. RNA interference mediated inhibition of stromal cell-derived factor-1 (SDF-1) gene expression using short interfering nucleic acid (siNA)
WO2002096262A2 (en) 2001-05-25 2002-12-05 Northwestern University Non-alloying core shell nanoparticles
EP1404860B8 (en) 2001-05-30 2013-12-25 The Scripps Research Institute Delivery system for nucleic acids
AU2002343792A1 (en) 2001-11-28 2003-06-10 Center For Advanced Science And Technology Incubation, Ltd. siRNA EXPRESSION SYSTEM AND PROCESS FOR PRODUCING FUNCTIONAL GENE-KNOCKDOWN CELLS AND THE LIKE USING THE SAME
CA2470965C (en) 2001-12-17 2015-10-27 Tao Chen System biology approach: high throughput screening (hts) platforms with multiple dimensions
US20040038303A1 (en) 2002-04-08 2004-02-26 Unger Gretchen M. Biologic modulations with nanoparticles
EP1513859B1 (en) 2002-05-30 2010-07-14 Memorial Sloan-Kettering Cancer Center Kinase suppressor of ras inactivation for therapy of ras mediated tumorigenesis
DE10238298A1 (de) 2002-08-21 2004-03-04 Beiersdorf Ag Verwendung von Antisense-Oligonucleotiden zur Behandlung von degenerativen Hauterscheinungen
EP1572964A4 (en) 2002-10-18 2007-08-08 Nucleonics Inc STRUCTURES AND CONSTRUCTIONS OF DOUBLE STRANDED RNA AND METHODS FOR THEIR GENERATION AND USE
US20040219565A1 (en) 2002-10-21 2004-11-04 Sakari Kauppinen Oligonucleotides useful for detecting and analyzing nucleic acids of interest
US20060105343A1 (en) 2003-01-09 2006-05-18 Children's Medical Center Corporation Methods for diagnosis and prognosis of cancer
US7138520B2 (en) 2003-01-13 2006-11-21 Massachusetts Institute Of Technology Coordination complexes having tethered therapeutic agents and/or targeting moieties, and methods of making and using the same
US7727969B2 (en) 2003-06-06 2010-06-01 Massachusetts Institute Of Technology Controlled release nanoparticle having bound oligonucleotide for targeted delivery
GB0313259D0 (en) 2003-06-09 2003-07-16 Consejo Superior Investigacion Magnetic nanoparticles
US20050096263A1 (en) 2003-10-30 2005-05-05 Keay Susan K. Novel antiproliferative factor and methods of use
US20080057128A1 (en) 2003-07-18 2008-03-06 Omeros Corporation Biodegradable triblock copolymers, synthesis methods therefore, and hydrogels and biomaterials made there from
US7611728B2 (en) 2003-09-05 2009-11-03 Supernus Pharmaceuticals, Inc. Osmotic delivery of therapeutic compounds by solubility enhancement
DK3342425T3 (da) 2003-09-09 2020-03-16 Geron Corp Modificerede oligonukleotider til inhibering af telomerase
CA2559955C (en) * 2004-03-15 2016-02-16 City Of Hope Methods and compositions for the specific inhibition of gene expression by double-stranded rna
US20050287593A1 (en) 2004-05-03 2005-12-29 Schering Corporation Use of cytokine expression to predict skin inflammation; methods of treatment
AU2005244742A1 (en) 2004-05-12 2005-12-01 Genentech, Inc. Novel gene disruptions, compositions and methods relating thereto
US20080213177A1 (en) 2004-05-24 2008-09-04 Thomas William Rademacher Nanoparticles Comprising Rna Ligands
US20060008907A1 (en) 2004-06-09 2006-01-12 The Curators Of The University Of Missouri Control of gene expression via light activated RNA interference
WO2006012695A1 (en) 2004-08-04 2006-02-09 Panvax Limited An immunogenic composition
US20060105342A1 (en) * 2004-08-31 2006-05-18 Mario Villena Computerized systems for formation and update of databases
TW200616606A (en) 2004-10-19 2006-06-01 Schering Ag Treatment and prevention of multi-drug resistance
JP2008524203A (ja) 2004-12-17 2008-07-10 コーニンクレッカ フィリップス エレクトロニクス エヌ ヴィ 分子イメージングのためのターゲティング剤
BRPI0518952A2 (pt) 2004-12-17 2008-12-16 Koninkl Philips Electronics Nv mÉtodo para a produÇço de um agente de contraste marcador ou um agente terapÊutico, agentes de contraste marcadores, e, uso dos agentes de contraste marcadores ou dos agentes terapÊuticos de marcaÇço
EP1674128A1 (en) 2004-12-22 2006-06-28 Steinbeis-Transferzentrum für Herz-Kreislaufforschung Magnetic pole matrices useful for tissue engineering and treatment of disease
US8007829B2 (en) 2005-01-19 2011-08-30 William Marsh Rice University Method to fabricate inhomogeneous particles
KR100704011B1 (ko) 2005-02-16 2007-04-04 한국과학기술원 금속나노입자와 양자점의 ｆｒｅｔ에 의한 생체분자특이결합 검출 방법
US8246995B2 (en) 2005-05-10 2012-08-21 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Hydrophobic nanotubes and nanoparticles as transporters for the delivery of drugs into cells
US8252756B2 (en) 2005-06-14 2012-08-28 Northwestern University Nucleic acid functionalized nanoparticles for therapeutic applications
US8067571B2 (en) 2005-07-13 2011-11-29 Avi Biopharma, Inc. Antibacterial antisense oligonucleotide and method
JP2007101498A (ja) 2005-10-07 2007-04-19 Fujifilm Corp 蛍光プローブ及び蛍光検出方法
WO2007047455A2 (en) 2005-10-13 2007-04-26 Northwestern University Colorimetric screening of dna binding/intercalating agents with gold nanoparticle probes
FR2892819B1 (fr) 2005-10-28 2008-02-01 Centre Nat Rech Scient Nanoparticules a luminescence persistance pour leur utilisation en tant qu'agent de diagnostic destine a l'imagerie optique in vivo
US20100167051A1 (en) 2006-03-31 2010-07-01 Goia Dan V Process for Manufacture of Silver-Based Particles and Electrical Contact Materials
US20090035576A1 (en) 2006-09-08 2009-02-05 Prasad Paras N Nanoparticles for two-photon activated photodynamic therapy and imaging
WO2008098248A2 (en) 2007-02-09 2008-08-14 Northwestern University Particles for detecting intracellular targets
WO2008112218A2 (en) * 2007-03-12 2008-09-18 Antigen Express, Inc. Li-rnai involved li suppression in cancer immunotherapy
US8323694B2 (en) 2007-05-09 2012-12-04 Nanoprobes, Inc. Gold nanoparticles for selective IR heating
WO2008141289A1 (en) 2007-05-10 2008-11-20 Northwestern University Silver nanoparticle binding agent conjugates based on moieties with triple cyclic disulfide anchoring groups
MX2009013046A (es) 2007-05-30 2010-02-17 Univ Northwestern Nanoparticulas con grupo funcional de acido nucleico para aplicaciones terapeuticas.
US20100183504A1 (en) 2007-06-14 2010-07-22 Fanqing Frank Chen Multimodal imaging probes for in vivo targeted and non-targeted imaging and therapeutics
US20080317768A1 (en) 2007-06-21 2008-12-25 Boeing Company Bioconjugated nanoparticles
US7514474B1 (en) 2007-10-31 2009-04-07 Meta Cosmetics, Llc Prostaglandin analog compositions and methods to treat epithelial-related conditions
US20090148384A1 (en) 2007-12-10 2009-06-11 Fischer Katrin Functionalized, solid polymer nanoparticles comprising epothilones
US20110262976A1 (en) 2008-01-17 2011-10-27 Indigene Pharmaceuticals, Inc. PRODUCTION OF R-a-LIPOIC ACID BY FERMENTATION USING GENETICALLY ENGINEERED MICROORGANISMS
US20110172404A1 (en) 2008-05-19 2011-07-14 Cornell University Self-Assembly of Nanoparticles Through Nuclei Acid Engineering
EP3335705A1 (en) * 2008-11-24 2018-06-20 Northwestern University Polyvalent rna-nanoparticle compositions
WO2010078516A2 (en) 2009-01-01 2010-07-08 Cornell University Multifunctional nucleic acid nano-structures
AU2010203474B2 (en) 2009-01-08 2015-11-19 Northwestern University Inhibition of bacterial protein production by polyvalent oligonucleotide modified nanoparticle conjugates
JP6145270B2 (ja) 2009-04-15 2017-06-07 ノースウェスタン ユニバーシティ オリゴヌクレオチド機能化ナノ粒子の送達
US20120269730A1 (en) 2009-08-07 2012-10-25 Northwestern University Intracellular Delivery of Contrast Agents with Functionalized Nanoparticles
US9307200B2 (en) 2014-04-10 2016-04-05 Cisco Technology, Inc. Use of face and motion detection for best view framing in video conference endpoint

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20030147966A1 (en) * 2001-07-10 2003-08-07 Stefan Franzen Nanoparticle delivery vehicle
CN101180400A (zh) * 2004-05-24 2008-05-14 Mida科技有限公司 含有rna配体的纳米颗粒

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
JUN XU ET AL.: "Thermodynamics of DNA Hybridization on Gold Nanoparticles", 《J.AM.CHEM.SOC.》 *
史毅等: "RNA干扰与siRNA（小干扰RNA）研究进展", 《生命科学》 *

Cited By (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN108025910A (zh) * 2015-07-21 2018-05-11 Dnp123公司 可编程、自组装的具补丁纳米颗粒以及相关装置、系统和方法
CN107435063A (zh) * 2016-05-27 2017-12-05 首都师范大学 一种快速制备巯基修饰DNA纳米金复合物(DNA‑AuNP)的方法
CN107435063B (zh) * 2016-05-27 2020-12-22 首都师范大学 一种快速制备巯基修饰DNA纳米金复合物(DNA-AuNP)的方法
CN107881176A (zh) * 2017-11-16 2018-04-06 苏州纳葛诺斯生物科技有限公司 标记外泌体的试剂及其制备方法和使用方法
CN114272391A (zh) * 2021-12-28 2022-04-05 深圳湾实验室坪山生物医药研发转化中心 一种核酸导向的靶rna降解的纳米复合物及其制备方法

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