MX2011005429A - Composiciones de nanoparticulas de arn polivalentes. - Google Patents

Composiciones de nanoparticulas de arn polivalentes.

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Dwight Seferos
David A Giljohann
Pinal C Patel
Andrew E Prigodich
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Abstract

La presente invención se refiere a las nanopartículas conjugadas con dúplex de ARN para una variedad de usos que incluyen pero no están limitados a la regulación de genes. Más específicamente, el descubrimiento proporciona una nueva estrategia para la conjugación de ARN con una nanopartícula para obtener estabilidad y actividad incrementadas.

Description

COMPOSICIONES DE NANOPARTÍCULAS DE ARN POLIVALENTES CAMPO DE LA INVENCIÓN La presente invención se refiere a nanopartículas conjugadas con dúplex de ARN. La invención también propone un método para la conjugación de ARN con una nanopartícul .
ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN La interferencia del ARN ( ARNi ) es un fenómeno caracterizado porque el ARN de doble cadena ( R AdC ) , cuando está presente en una célula, inhibe la expresión de un gen que tiene una secuencia suficientemente complementaria a una de las cadenas simples del ARN de doble cadena. La inhibición de la expresión del gen es causada por la degradación del ARN mensajero (RNAJ transcrito del gen señalado [Sharp y colaboradores, Genes and Development 15: 485-490 (2001)]. El ARN de doble cadena responsable de la inducción del R Ai se denomina ARN de interferencia. El mecanismo y la maquinaria celular a través de las cuales el R AdC media el RNAi han sido investigados usando ambos enfoques, genético y bioquímico. Los análisis bioquímicos sugieren que el RNAdc introducido en el citoplasma de una célula es primero procesado en fragmentos de ARN de 21 a 25 nucleotidos de largo [Hammond y colaboradores, Nature 404: 293-296 (2000); Hamilton y colaboradores, Science 286: 950-952 (1999); Zamore y colaboradores, Cell 101: 25-33 (2000); Yang y colaboradores, Current Biology 10: 1191-1200 (2000); Parrish y colaboradores, Molecular Cell 6: 1077-1087 (2000)]. En estudios in vitro, se ha mostrado que estos ARNs de doble cadena, llamados ARNs de baja interferencia (ARNbi) son generados por lo menos en un mecanismo mediante el ARNse III como enzima Dicer [Hammond y colaboradores, Nature 404: 293-296 (2000)]. Estos ARNs de baja interferencia posiblemente actúan como guías para el desdoblamiento del ARNra mientras que el ARNm objetivo es desdoblado en una posición central de la región hibridizada para un AR bi particular [Sharp 2011] . La evidencia bioquímica sugiere que el ARNbi es parte de un complejo de nucleasa multi-componente denominado complejo de silenciamiento inducido por ARN (CSIARN) [Hammond y colaboradores, Nature 404: 293-296 (2000)]. Una de las proteínas de este complejo, Argonauta 2, ha sido identificada como un producto del gen de la familia argonauta [Sharp y colaboradores, Genes and Development 15: 485-490 (2001)]. Esta proteína es esencial para el desarrollo del ratón, las células sin Argonauta 2 son incapaces de montar una respuesta experimental a los ARNbis . Las mutaciones dentro de un dominio críptico de ribonucleasa H con Argonauta 2, identificadas por comparación con la estructura arqueada de una proteína Argonauta, inactivan el complejo CSIARN. En consecuencia, el Argonauta contribuye con la actividad de "cortadora" para el complejo CSIARN, proporcionando el motor catalítico para el AR i [LIu y colaboradores, Science (305)5689: 1437-1441 (2004) ] .
Se ha demostrado, mediante estudios genéticos, que ésta familia de genes, la cual también contiene el homólogo rde-1 de C. elegans y genes relacionados, el homólogo gde-2 de N. crassa y el homólogo arg-1 de Arabidopsis, se requiere para el ARNi [Sharp y colaboradores, Genes and Development 15: 485-490 (2001); Hammond y colaboradores, Nature 404: 293-296 (2000) ; Hamilton y colaboradores, Science 286: 950-952 (1999)] . Las pantallas genéticas en C. elegans también han identificado el gen mut-7 como esencial para el ARNi . Este gen es parecido al AR se D, sugiriendo que el producto del gen actúa en la fase de degradación en la reacción del ARNm [Sharp y colaboradores, Genes and Development 15: 485-490 (2001) ] .
Durante la década pasada, los investigadores han diseñado, sintetizado, estudiado, y aplicado nanopartículas de oro funcionalizadas con ADN polivalente (NPs de ADN-Au) . [Mirkin y colaboradores, Nature 382: 607 (1996)]. Estos esfuerzos han resultado en una nueva comprensión fundamental de las nanoestructuras híbridas [Demers y colaboradores, Anal. Chem. 72: 5535 (2000); Jin y colaboradores, J. Am.
Chem. Soc. 125: 1643 (2003); Lytton-Jean y colaboradores, J. Am. Chem Soc 127: 12754-12754 (2005); Storhoff y colaboradores, J. Am. Chem. Soc . 122: 4640 (2000); You y colaboradores, Soft Matter 2: 190 (2006); Wang y colaboradores, Nanomed. 1: 413 (2006)], en ciertos casos importantes, la detección y ensayos de diagnóstico comercialmente viables [Nam y colaboradores, Science 301: 1884 (2003); Stoeva y colaboradores, J. Am. Soc. 128: 8378 (2006); Liu y colaboradores, J. Am. Soc 126: 12298 (2004); Faulds y colaboradores, Anal. Chem. 76: 412 (2004)] y la habilidad para programar la formación de los materiales a través del uso de los sintones de ADN [Mirkin y colaboradores, Nature 382: 607 (1997); Park y colaboradores, Nature 451: 553 (2008); Nykypanchuck y colaboradores, Nature 451: 549 (2008)]. Las NPs (nanopartículas) de ADN-Au polivalente tienen varias propiedades únicas, tales como la forma y temperaturas de fusión elevadas [Jin y colaboradores, J. Am. Chem. Soc. 125: 1643 (2003); propiedades de enlace mejoradas [Lytton-Jean y colaboradores, J. Am. Chem Soc 127: 12754-12754 (2005) y, en comparación con las cadenas libres de la misma secuencia, propiedades ópticas dependientes de la distancia [Elghanian y colaboradores, Science 277: 1078 (1997)] . De acuerdo con la investigación en sistemas moleculares polivalentes [Gestwicki y colaboradores, J. Am.
Chem Soc 124: 14922 (2002)], la superficie de alta densidad del ADN y la habilidad de las nanopartículas para participar en interacciones muíti -dentadas son el origen propuesto de estas propiedades únicas.
SUMARIO DE LA INVENCIÓN Lo que se describe aquí es una composición de nanopartículas asociada con una monocapa de ARN que imparte propiedades físicas tales para que la composición sea útil en la regulación genética. En contraste con otros materiales para la introducción ARN en una célula, estas composiciones no son simplemente una herramienta de suministro de ARN sino que son agentes de entidad simple que toman ventaja de las propiedades cooperativas que resultan de la disposición y alta densidad de los ligandos de superficie. La composición descrita aquí entra en las células sin agentes de transfección y es resistente a la degradación de manera que mejora la disminución de la actividad en comparación con los acarreadores de polímeros convencionales.
Por lo tanto, en algunos aspectos, es proporcionada una composición de nanopartículas que comprende uno o más polinucleotidos de ácido nucleico (ARN) en asociación con una nanopartícula, caracterizada porque el polinucleotido de ARN tiene un sitio de interacción de polipéptido, y el polinucleotido de ARN tiene una secuencia para formar, bajo condiciones apropiadas, un dúplex, éste tiene por lo menos un dominio de una cadena simple suficientemente complementario para la secuencia de un polinucleotido seleccionado que permite la hibridación de una cadena simple bajo condiciones apropiadas, y la hibridación del dominio del dúplex con la secuencia del polinucleotido seleccionado crea un sitio en el sustrato reconocido por el polipéptido y el polinucleotido del ARN asociado con la nanopartícula está en una forma de orientación específica con respecto al sitio de interacción del polipéptido y la nanopartícula.
En algunos aspectos, es propuesta una composición de nanopartículas con un polinucleotido de ARN que está covalentemente asociado con la nanopartícula. En otros aspectos, es propuesta una composición de nanopartículas con el polinucleotido de ARN que no está en asociación covalente con la nanopartícula.
En aspectos porteriores, es propuesta una composición de nanopartículas caracterizada porque cada polinucleotido de ARN en asociación con la nanopartícula tiene una secuencia idéntica. En otros aspectos, es propuesta una composición de nanopartículas caracterizada porque, por lo menos, dos polinucleotidos de ARN en asociación con las nanopartículas tienen diferentes secuencias.
En algunas incorporaciones, es propuesta una composición de nanopartículas caracterizada porque el dúplex consta de una estructura de horquilla formada por los polinucleotidos de ARN.
Los métodos descritos aquí contemplan una composición de nanopartículas que comprende un polinucleotido adicional que tiene una secuencia suficientemente complementaria para una secuencia en el polinucleotido de ARN que permite la hibridación del polinucleotido de ARN bajo condiciones adecuadas para formar el dúplex.
En algunos aspectos, se propone una composición de nanopartículas caracterizada porque el polinucleotido adicional es de ARN. En otros aspectos, es propone una composición de nanopartículas caracterizada porque el polinucleotido adicional es ácido desoxirribonucleico (ADN) .
En otras incorporaciones, se propone una composición de nanopartículas caracterizada porque el polinucleotido adicional está covalentemente asociado con la nanopartícula . En otros aspectos, es propuesta una composición de nanopartículas caracterizada porque el polinucleotido adicional no está covalentemente asociado con la nanopartícula .
En algunas incorporaciones, es propuesta una composición de nanopartículas caracterizada porque el sitio de interacción del polipéptido se encuentra próximo a la nanopartícula con respecto al punto medio en el polinucleotido de ARN.
En incorporaciones posteriores, se propone una composición de nanopartículas caracterizada porque el sitio de interacción del polipéptido se encuentra alejado de la nanopartícula con respecto al punto medio en el polinucleotido de ARN.
En algunos aspectos de los métodos, se propone una composición de nanopartículas que tiene una densidad de superficie del ARN de por lo menos 2 a 1,000 pmol/cm2 aproximadamente .
En varias incorporaciones, es propuesta una composición de nanopartículas caracterizada porque el sitio de interacción del polipéptido se asocia con una proteína seleccionada del grupo que consiste de RNasa H, RNasa D, RNasa L, RNasa III, Dicer, Argonauta, Argonauta 2 y el virus de la inmunodeficiencia humana que trans-activa la respuesta de una proteína unida al ARN (PURT) .
Aspectos posteriores de los métodos proponen una composición de nanopartículas caracterizada porque el dominio del polinucleotido es aproximadamente de 10 nucleotidos de largo .
En algunas incorporaciones, se propone una composición de nanopartículas caracterizada porque el polinucleotido del ARN incluye además un segundo dominio suficientemente complementario para una segunda secuencia del polinucleotido elegido y la hibridación del segundo dominio del polinucleotido de ARN para la segunda secuencia en el polinucleotido seleccionado crea un sitio en el sustrato adicional reconocido por un segundo polipéptido. En algunos aspectos, se propone una composición de nanopartículas caracterizada porque el segundo dominio del polinucleotido es de 10 nucleotidos de largo aproximadamente.
En algunos aspectos, se propone una composición de nanopartículas caracterizada porque el sitio del sustrato y el sitio del sustrato adicional son iguales. En otros aspectos, se propone una composición de nanopartícula caracterizada porque el sitio del sustrato y el sitio del sustrato adicional son diferentes.
En algunos aspectos, se propone una composición de nanopartículas caracterizada porque el polinucleotido del ARN y el polinucleotido adicional son complementarios uno del otro con una longitud suficiente que permita la hibridación.
En otros aspectos, se propone una composición de nanopartículas caracterizada porque el polinucleotido de ARN y el polinucleotido adicional son complementarios el uno del otro en toda su longitud.
En algunas incorporaciones, es propuesta una composición de nanopartículas caracterizada porque el polinucleotido de ARN es conjugado con la nanopartícula mediante un enlace tiol .
En algunos aspectos, se propone una composición de nanopartículas caracterizada porque el polinucleotido de ARN tiene una vida media que es sustancialmente , por lo menos, igual a la vida media de un polinucleotido de ARN idéntico que no está asociado con una nanopartícula. En otros aspectos, se propone una composición de nanopartículas caracterizada porque el polinucleotido de RNA tiene una vida media que es aproximadamente de 1 a 5 veces mayor o más que la vida media de un ARN idéntico que no está asociado con una nanopartícula .
En varias incorporaciones, es propuesta una composición de nanopartículas caracterizada porque el polinucleotido de ARN es aproximadamente de 5 a 100 nucleotidos de largo. En algunos aspectos, es propuesta una composición de nanopartículas caracterizada porque el polinucleotido adicional es aproximadamente de 5 a 100 nucleotidos de largo.
En algunas incorporaciones, se propone una composición de nanopartículas en la cual la nanopartícula es oro. En algunos aspectos, se propone una composición de nanopartículas en la cual la nanopartícula es plata.
En algunos aspectos, se propone un método de asociación de un polinucleotido de ARN con una nanopartícula . que comprende la etapa de envejecimiento de la mezcla de un dúplex de polinucleotido de ARN unido mediante un enlace tiol a una nanopartícula en una serie de soluciones para asociar el polinucleotido de ARN a la nanopartícula, cada solución comprende un aumento de la concentración de cloruro de sodio (NaCl) en relación con la solución previa comenzando con una primera solución que contiene NaCl aproximadamente 0.1 M. En aspectos relacionados, el método además comprende la etapa de sonicación de la mezcla después de la última etapa de envejecimiento. En algunos aspectos, el método comprende además la etapa de aislamiento de las nanopartículas.
En algunas incorporaciones, es propuesto un método de asociación del ARN a una nanopartícula que comprende: (a) la mezcla de un dúplex tiolado de AR con la nanopartícula en una solución que contiene cloruro de sodio (NaCl) 0.1 M aproximadamente; (b) envejecimiento de la mezcla en series de soluciones de sal, cada una conteniendo e incrementando la concentración de NaCl en relación con la solución previa; (c) la sonicación de la mezcla; y (d) purificación de la nanopartícula conjugada.
En varios aspectos del método, los rangos de las soluciones salinas son de 0.1 a 0.3 M de NaCl.
Algunos aspectos del método comprenden además la pasivación de la superficie de la nanopartícula con oligo (etilenglicol) tiol (OEG) .
En algunas incorporaciones, se propone un método 'de regulación de la expresión de un polinucleotido elegido que incluye la etapa de hibridación del polinucleotido seleccionado con el dominio de una composición de nanopartículas de la invención para formar un sitio de sustrato para un polipéptido. En algunos aspectos, la hibridación resulta en la degradación del polinucleotido elegido. En varios aspectos, el polipéptido es seleccionado del grupo que consiste de RNasa H, RNasa D, RNasa L, RNasa III, Dicer, Argonauta, Argonauta 2, y PURT.
Llegarán a ser evidentes algunos aspectos adicionales de la invención a partir de la descripción detallada que se proporciona más adelante. Sin embargo, se debe entender que la siguiente descripción detallada y ejemplos, mientras que indican las incorporaciones preferidas de la invención, son dados por medio de ilustraciones solamente, ya que varios cambios y modificaciones en el espíritu y el alcance de la invención se harán evidentes para aquellos expertos en el tema a partir de esta descripción detallada.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS La figura 1 representa la caracterización de las nanopartículas de oro (NPs) . El espectro de absorción de las nanopartículas y las imágenes TEM antes (a) y después (b) de procesar en autoclave, la barra de escala es en nm.
La figura 2 representa la presencia de RNasas en soluciones de nanopartículas de oro. Las NPs de oro sin tratar muestran una señal positiva, mientras que las partículas tratadas para eliminar la actividad de la RNasa se presentan libres de ésta.
La figura 3 presenta las imágenes de un microscopio de luz de células de HeLa confluentes. En la síntesis de las composiciones de nanopartículas de ARN, se adicionaron 30 pmol/mL de oligo etilenglicol-tiol (OEG-tiol) como un ligando de pasivación de superficie siguiendo la adición del dúplex de ARN. Se encontró que esta adición para previene la precipitación de partículas en el cultivo. (a) las composiciones de nanopartículas de ARN en el cultivo celular sin adición de OEG-thiol muestran la precipitación ¡de partículas (negro) . (b) las composiciones de nanopartículas de ARN en el cultivo celular con OEG-tiol. La barra de escala es de 30 m.
La figura 4 representa la captación celular de NPs . de RNA-Au. (a) Imágenes de microscopio de fluorescencia de células HeLa incubadas por 6 horas con NPs de RNA-Au (Cy5 etiquetado de ARN) . La escala de barra es de 20 µ?p, (b) Análisis de citometría de flujo comparando células tratadas de NPs de RNA-Au con controles sin tratar.
La figura 5 representa (a) Disminución de la expresión de luciferasa en 4 días, (b) Estabilidad de las NPs de RNA-Au. Comparación de la estabilidad de ARNdc (cuadrados) y NPs de RNA-Au (triángulos) en 10% de suero.
La figura 6 representa la actividad de R asa III contra NPs de RNA-Au funcionalizados con una o dos cadenas de RNA de horquilla. Ambos sistemas son reconocidos por RNasa III como sustratos. La diferencia en la máxima fluorescencia es parcialmente debida a la diferencia en la carga (ver tabla 1) . La reacción sin adición de enzima fue utilizada para la corrección de fondo.
La figura 7 representa la actividad del Dicer contra las NPs de RNA-Au funcionalizadas con RNA de horquilla de dos cadenas (Sentido/FITC AS, AS/FITC Sentido) o de una cadena (FITC HP) . Ambos sistemas son reconocidos por Dicer como sustratos, sin embargo la actividad más alta se puede observar en el caso del sentido de inmovilización de la cadena (ver tabla 1). La diferencia en la máxima fluorescencia es parcialmente debida a la diferencia en la carga (ver tabla 1) . La reacción sin adición de enzima se utilizó para la corrección de fondo.
La figura 8 representa la actividad de la RNasa III contra las NPs de RNA-Au de sentido inmóvil, antisentido y de horquilla. Para esta enzima, la actividad más alta puede observarse donde el sentido de la cadena es inmovilizado.
La Figura 9 muestra un esquema de preparación de Composiciones de Nanopartículas de Oro-ARN Polivalentes. Los dúplex de ARN (que contienen una secuencia de ARN de doble cadena, un espaciador de etilenglicol y un grupo alquiltiol) son formados mediante la hibridización y subsecuente incubación con nanopartículas libres de ARNasa. La pasivación posterior con oligoetilenglicol-tiol (OEG-Tiol) confiere estabilidad adicional en el cultivo celular.
DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN A la fecha, ningún método se ha desarrollado para utilizar partículas polivalentes y sus propiedades inusuales para cargar y transportar el ARN a través de las membranas celulares. De hecho, uno debe desarrollar rutas sintéticas y materiales que superen uno de los problemas más desafiantes asociados con el ARN, el más notable es la inestabilidad química.
La habilidad para inhibir específicamente la expresión de un gen elegido mediante RNAi tiene beneficios obvios. Por ejemplo, muchas enfermedades surgen de la expresión anormal de un gen particular o un grupo de genes. El RNAi podría ser usado para inhibir la expresión de genes deletéreos y con esto aliviar síntomas de enfermedades o incluso proporcionar una cura. Por ejemplo, los genes que contribuyen a un estado canceroso o para replicación viral podrían ser inhibidos.
Adicionalmente, los genes mutantes causantes de enfermedades genéticas dominantes tales como la distrofia miotónica, podrían ser inhibidos. Las enfermedades inflamatorias tales como la artritis también podrían ser tratadas mediante la inhibición de tales genes como la ciclooxigenasa y citocinas. Como ejemplos de órganos específicos se podrían incluir sin limitación el hígado, páncreas, bazo, piel, cerebro, próstata, corazón, etc. Además, el RNAi podría ser utilizado para generar animales que imiten la genética real eliminando a los animales para estudio de la función genética. Una descripción posterior de usos contemplados y objetivos se proporciona más adelante.
El descubrimiento de medicamentos también podría facilitarse mediante la tecnología del ARN. El acceso del ARN para la validación de objetivos proporciona un enfoque más rápido y menos costoso para identificar los objetivos medicinales potenciales. La información para la elección de medicamentos se obtiene no sólo mediante la inhibición de una medicina potencial específica sino también determinando si una proteína inhibida, y por lo tanto la ruta, tiene efectos fenotípicos significantes. Por ejemplo, la inhibición de la expresión del receptor de LDL debe aumentar los niveles plasmáticos de LDL, y por lo tanto sugerir que la sobre-regulación del receptor podría ser de beneficio terapéutico.
Las matrices de expresión pueden ser utilizadas para determinar el efecto responsable de la inhibición en la expresión de genes en lugar de genes o rutas específicas [Sharp y colaboradores, Genes and Development 15: 485-490 (2001)] . Se situará el producto del gen dentro de las vías funcionales y redes (vías de interacción) .
En este documento se manifiesta que las nanopartículas de oro que funcionan con oligonucleótidos de ARN toman ventaja del conjunto de propiedades que resultan de la funcionalización superficial de los oligonucleótidos, para aumentar la estabilidad y eficacia del ARN unido mientras que conservan la habilidad para actuar en la ruta catalítica del ARN de interferencia.
La síntesis de las composiciones de nanopartículas polivalentes de ARN (NPs de RNA-Au para aquellos casos en que la nanopartícula es de oro) requiere que todos los componentes estén libres de nucleasas tales como la RNasa, la cual degrada los ligandos de ARN y resulta en interacciones inestables de las NPs de oro mediante la exposición de la superficie del oro (evidenciada por la agregación) . Mientras que las condiciones para la preparación de componentes orgánicos y soluciones libres de RNasa están bien establecidas, aquí se proporcionan métodos para crear nanopartículas inorgánicas de oro libres de RNasa.
Es de señalar que los términos "polinucleotido" y "oligonucleotido" son utilizados aquí indistintamente. También es de señalar que los términos "conjugado" y "funcionalizado" son igualmente utilizados indistintamente.
Como se utiliza aquí, un "sitio de sustrato" es una locación en un polinucleotido (el cual tiene una o dos cadenas) que es reconocida y sobre la cual actúa un polipéptido. Como se utiliza aquí el término "actúa sobre" se entiende como cualquier función enzimática que presenta un polipéptido que reconoce y se une al sitio de sustrato.
Como se utiliza aquí, un "sitio de interacción del polipéptido" se refiere a un sitio en un polinucleotido (que puede tener una o dos cadenas) que es reconocido por un polipéptido. El reconocimiento de un sitio de interacción por un polipéptido resulta, en varios aspectos, en una ruptura del polinucleotido. En ciertas incorporaciones, el polipéptido que reconoce por si mismo el sitio de interacción de polipéptido, actúa sobre el polinucleotido y en otras incorporaciones, el polipéptido que reconoce el sitio de reconocimiento del polinucleotido dirige la actividad de uno o más polipéptidos adicionales para que actúen sobre el polinucleotido .
Como se utiliza aquí, el término "objetivo o específico" ó "polinucleotido elegido" se refiere a un polinucleotido contra el cual un polinucleotido de ARN dado puede ser dirigido .
Como se utiliza aquí, "ARN" se refiere a una molécula que comprende por lo menos una unidad ribónucleotida .
Como se utiliza aquí, "dúplex" se refiere a una región en dos polinucleotidos complementarios o sustancialmente complementarios que forman pares de bases entre ellos, ya sea por el emparejamiento de bases de atson-Crick o alguna otra manera que permita estabilizar un dúplex entre cadenas de polinucleotidos que son complementarias o sustancialmente complementarias. Por ejemplo, una cadena de polinucleotido que tiene 21 unidades de nucleotidos puede formar un emparejamiento de bases con algún otro polinucleotido que tenga 21 unidades de nucleotidos, aunque sólo 19 bases en cada cadena son complementarias o sustancialmente complementarias, así que el "dúplex" tiene 19 pares de bases. Las bases restantes pueden, por ejemplo, existir como extremos 5' o 3' . Más allá, dentro del dúplex, la complementariedad del 100% no es requerida; la complementariedad sustancial es permisible con un dúplex. La complementariedad sustancial se refiere al 75% o mayor complementariedad. Por ejemplo, un desajuste en el dúplex que consiste en 19 pares de bases resulta con 94.7% de complementariedad, produciendo el dúplex sustancialmente complementario .
NANOPARTÍCULAS Las nanopartículas así proporcionadas, son conjugadas para tener un polinucleotido unido a las mismas. El tamaño, forma y composición química de las nanopartículas contribuyen a las propiedades de la nanopartícula conjugada con un polinucleotido resultante. Estas propiedades incluyen por ejemplo, propiedades ópticas, optoelectrónicas , electroquímicas, electrónicas, estabilidad en varias soluciones, propiedades magnéticas y variación del tamaño de poro y canal . Las mezclas de nanopartículas que tienen diferentes tamaños, formas y/o composiciones químicas, asi como el uso de nanopartículas que tienen tamaños, formas y composición química uniformes, contemplan, por lo tanto, una mezcla de propiedades. Como ejemplos de partículas adecuadas se incluyen, sin limitación, agregado de partículas, isotrópicas (tales como partículas esféricas) , partículas anisotrópicas (tales como barras no esféricas, tetraédricas y/o prismas) y partículas con caparazón, tales como aquellas descritas en la Patente de los Estados Unidos No. 7,238,472 y en la Publicación Internacional No. WO 2003/08539, cuyas revelaciones son incorporadas por referencia en su totalidad.
En un ejemplo típico, la nanopartícula es metálica, y en varios aspectos, es un metal coloidal. Por lo tanto, en varias incorporaciones, las nanopartículas de la invención incluyen metal (incluyendo por ejemplo y sin limitación, plata, oro, platino, aluminio, paladio, cobre, cobalto, indio, níquel, o cualquier otro metal dócil para la formación de nanopartículas) , semiconductor (incluyendo por ejemplo y sin limitación, CdSe, CdS y CdS o CdSe cubiertos con ZnS) y materiales coloidales magnéticos (por ejemplo, ferromagnetita) .
También, como se describe en la Publicación de Patente de los Estados Unidos No. 2003/0147966, las nanopartículas de la invención incluyen aquellas que están disponibles comercialmente , así como aquellas que son. sintetizadas, por ejemplo, producidas por nucleación progresiva en solución (por ejemplo, reacción coloidal) o por varios procesos físicos y químicos de deposición de vapor tal como la deposición catódica. Ver, por ejemplo, HaVashi, Vac. Sci. Technol. A5(4): 1375-84 (1987); Hayashi, Physics Today, 44-60 (1987); MRS Bulletin, January 1990, 16-47. Como fue descrito más detalladamente en la Publicación de Patente de los Estados Unidos No. 2003/0147966, las nanopartículas contempladas son producidas alternativamente usando HAuCl4 y un agente reductor de citrato, usando métodos conocidos en éste ámbito. Ver, por ejemplo, Marinakos y colaboradores Adv. Mater. 11:34-37 (1999); Marinakos y colaboradores, Chem. Mater. 10: 1214-19 (1998); Enustum & Turkevich, J. Am. Chem. Soc. 85 : 3317 (1963) .
Las nanopartículas pueden variar en rango de tamaño aproximadamente de 1 nm a 250 nm de diámetro medio, de 1 nm a 240 nm de diámetro medio, de 1 nm a 230 nm de diámetro medio, de 1 nm a 220 nm de diámetro medio, de 1 nm a 210 nm de diámetro medio, de 1 nm a 200 nm de diámetro medio, de 1 nm a 190 nm de diámetro medio, de 1 nm a 180 nm de diámetro medio, de 1 nm a 170 nm de diámetro medio, de 1 nm a 160 nm de diámetro medio, de 1 nm a 150 nm de diámetro medio, de 1 nm a 140 nm de diámetro medio, de 1 nm a 130 nm de diámetro medio, de 1 nm a 120 nm de diámetro medio, de 1 nm a 110 nm de diámetro medio, de 1 nm a 100 de diámetro medio de 1 nm a 90 nm de diámetro medio, de 1 nm a 80 nm de diámetro medio, de 1 nm a 70 nm de diámetro medio, de 1 nm a 60 nm de diámetro medio, de 1 nm a 50 nm de diámetro medio, de 1 nm a 40 nm de diámetro medio, de 1 nm a 30 nm de diámetro medio o de 1 nm a 20 nm de diámetro medio, de 1 nm a 10 nm de diámetro medio. En otros aspectos, el tamaño de las nanopartículas es aproximadamente de 5 nm a 150 nm (diámetro medio) , de 5 a 50 nm, de 10 a 30 nm, de 10 a 150 nm, de 10 a 100 nm, de 10 a 50 nm. El tamaño de las nanopartículas es aproximadamente de 5 a 150 nm (diámetro medio) , de 30 a 100 nm, de 40 a 80 nm. El tamaño de las nanopartículas usadas en un método varía según se requiera por su uso o aplicación particular. La variación del tamaño es ventajosamente utilizada para optimizar ciertas características físicas de las nanopartículas, por ejemplo, las propiedades ópticas o la cantidad del área de superficie que pueden ser derivadas como está descrito aquí .
UNIÓN DE UN POLINUCLEOTIDO A UNA NANOPARTÍCULA Las nanopartículas así propuestas con polinucleotidos unidos a ellas están caracterizadas porque el dúplex de ARN está asociado con la nanopartícula . En algunos aspectos, el ARN que está asociado con la nanopartícula es un ARN de baja interferencia (ARNbi) . La asociación del dúplex de ARN con las nanopartículas está contemplada a través de varios recursos1.
De acuerdo con los métodos que se describen aquí, las nanopartículas de oro estabilizadas con citrato son sintetizadas y tratadas con dietilpirocarbonato al 0.1% (DEPC) por 12 horas con agitación, después procesadas en una autoclave a 121°C por 60 minutos. En algunos aspectos, el tratamiento de las nanopartículas con DEPC se lleva a cabo por 1 hora aproximadamente. En varios aspectos, el tratamiento de las nanopartículas con DEPC se lleva a cabo aproximadamente por 1.5, 2 , 2.5, 3, 3.5, 4 , 4.5, 5, 5.5, 6, 6.5, 7, 7.5, 8, 8.5, 9, 9.5, 10, 10.5, 11, 11.5, 12, 12.5, 13, 13.5, 14, 14.5, 15, 20, 25 o 30 horas, 3 días, 7 días o más .
En un ejemplo típico, un polinucleotido de ARN de cadena simple se une directamente a la nanopartícula, opcionalmente , a través de un espaciador como se describe aquí. En aquellos aspectos en donde el polinucleotido de una sola cadena se une a la nanopartícula, el polinucleotido de ARN comprende dos porciones que son suficientemente complementarias para permitir la hibridación de las dos porciones una con otra bajo condiciones adecuadas para formar la estructura de horquilla .
En otro ejemplo típico, un dúplex de ARN es inmovilizado directamente en una nanopartícula, opcionalmente, a través de un espaciador como se describe aquí, de tal manera que únicamente una cadena del dúplex de ARN se una directamente a la nanopartícula.
En otras incorporaciones, el polinucleotido unido a la nanopartícula es ADN. Cuando el ADN está unido a la nanopartícula, el ADN consta de una secuencia que es suficientemente complementaria para una región de una cadena simple del dúplex de ARN de tal manera que la hibridación del polinucleotido de ADN unido a la nanopartícula y a la región de una cadena simple del dúplex de ARN se lleve a cabo asociando el dúplex de ARN a la nanopartícula. En un aspecto, la región de la cadena simple del dúplex de ARN es un extremo sobresaliente. El ADN, en varios aspectos, es de cadena simple ó doble, tan larga como para que la molécula de doble cadena también incluya una región de una cadena simple que hibridice a la región de una cadena simple del dúplex de ARN.
ORIENTACIÓN DEL POLINUCLEOTIDO SENTIDO VS . ANTI- SENTIDO En algunos aspectos, la cadena del ARN que está unida a la nanopartícula es la cadena de "sentido" y la cadena complementaria del dúplex de ARN es hibridizada con la cadena de sentido pero no está unida a la nanopartícula. En otros aspectos, la cadena del ARN que está unida a la nanopartícula es la cadena "anti-sentido" y la cadena complementaria del dúplex de ARN es la hibridizada con la cadena anti-sentido pero no está unida a la nanopartícula. Como se utiliza aquí, una cadena de "sentido" es una cadena que es idéntica al polinucleotido elegido y una cadena "anti-sentido" es una cadena que es complementaria para el polinucleotido de elegido. La unión de la cadena de sentido o la cadena de anti-sentido a la nanopartícula determina un aspecto de la orientación del ARN de doble cadena a una nanopartícula.
Se demuestra aquí que el dúplex de ARN caracterizado porque la cadena de sentido se une a una nanoparticula y una cadena de anti-sentido es hibridizada con la cadena de sentido pero sin unirse a una nanoparticula, tienen una mayor actividad (ver ejemplo 5) que un dúplex de ARN en donde la cadena de anti-sentido se une a una nanoparticula y la cadena de sentido es hibridizada con la cadena anti-sentido pero sin unirse a la nanoparticula. Sin estar sujeta a la teoría, la orientación de la unión del dúplex de ARN a una nanoparticula (por ejemplo y sin limitación, ya sea si en una cadena de sentido o una cadena de anti-sentido del dúplex de ARN es unida a una nanoparticula) es considerada importante por presentar un sustrato para un polipéptido contemplado por el presente descubrimiento. En algunos aspectos, el polipéptido es Dicer. En algunos aspectos, el polipéptido es Argonauta.
POSICIÓN DEL SITIO DE INTERACCIÓN DE POLIPÉPTIDO En algunas incorporaciones, el descubrimiento contempla que un polinucleotido unido a una nanoparticula es ARN. También se contempla que un polinucleotido se une a una nanoparticula tal que el sitio de interacción de una proteína localizado en una secuencia en el ARN es, ya sea, proximal o distal en relación con una nanoparticula. En estos aspectos, "proximal" y "distal" se refieren al punto medio en el polinucleotido. Por ejemplo, si un polinucleotido que está unido a una nanopartícula es de 20 bases de largo, entonces el punto medio se encuentra localizado a 10 bases de la nanopartícula, y un sitio de interacción de la proteína puede ser, ya sea, proximal o distal en relación con la décima base .
La inmovilización de un polinucleotido de ARN en una nanopartícula usando métodos descritos aquí, permite el control de acceso al dúplex mediante un polipéptido de la invención .
En algunas incorporaciones, las secuencias de espaciadores de longitud variable son utilizadas para variar el número y la distancia entre los polinucleotidos de ARN en una nanopartícula controlando así la velocidad de degradación del polinucleotido elegido. Sin estar sujeto a la teoría, uno puede controlar la velocidad de degradación del polinucleotido elegido mediante la inmovilización del polinucleotido de ARN en una nanopartícula de tal modo que el sitio de interacción de la proteína esté a una posición proximal como se describió anteriormente. Esta característica, combinada con la característica de densidad de superficie como la descrita más adelante, puede permitir o prevenir el acceso mediante un polipéptido de la invención al sitio de interacción de la proteína.
Los espaciadores se describen con más detalle a continuación .
ESPACIADORES En ciertos aspectos, se considera que las nanopartículas conjugadas incluyen a aquellas que se caracterizan porque un oligonucleótido se une a una nanopartícula a través de un espaciador. "Espaciador", como se utiliza aquí, significa una mitad que no participa en la modulación de la expresión del gen en per se, sino que sirve para incrementar la distancia entre la nanopartícula y los oligonucleótidos funcionales o para incrementar la distancia entre los oligonucleótidos individuales cuando se unen a la nanopartícula en copias múltiples. Así, se considera que los espaciadores están localizados entre los oligonucleótidos individuales en tándem, ya sea que los oligonucleótidos tengan la misma secuencia o secuencias diferentes. En un aspecto, cuando el espaciador está presente, es una mitad orgánica. En otro aspecto, el espaciador es un polímero, que incluye, pero no se limita, a un polímero soluble en agua, un ácido nucleico, un polipéptido, un oligosacárido, un carbohidrato, un lípido, un etilglicol, o combinaciones de éstos.
En ciertos aspectos, el espaciador tiene un polinucleotido unido covalentemente a él, el cual se puede enlazarse a las nanopartículas. Estos polinucleotidos son los mismos polinucleotidos descritos con anterioridad. Como resultado del enlace del espaciador con las nanopartículas, el polinucleótido es espaciado lejos de la superficie de las nanopartículas y es más accesible para la hibridación con su objetivo. En casos en donde el espaciador es un polinucleótido, la longitud del espaciador, en varias incorporaciones, es de por lo menos 10 nucleótidos, 10-30 nucleótidos o incluso más grande que 30 nucleótidos. El espaciador puede tener cualquier secuencia la cual no interfiera con la habilidad de los polinucleotidos para unirse a las nanopartículas o al polinucleótido elegido. Los espaciadores no deben tener secuencias complementarias una de la otra o con las de los oligonucleótidos , pero pueden ser, total o en parte, complementarias para el polinucleótido elegido. En ciertos aspectos, las bases del polinucleótido espaciador son todas adeninas, todas timinas, todas citosinas, todas guaninas, todos uraciles o todas de alguna otra base modificada.
DENSIDAD DE SUPERFICIE Las nanopartículas como las propuestas aquí, tienen una densidad de empaque de los polinucleótidos en la superficie de la nanopartícula que es, en varios aspectos, suficiente para resultar en un comportamiento cooperativo entre las nanopartículas y las cadenas de polinucleótidos en una nanopartícula simple. En otro aspecto, el comportamiento cooperativo entre las nanopartículas incrementa la resistencia del polinucleótido a la degradación por nucleasa. En otro aspecto, la captación de las nanopartículas por una célula está influenciada por la densidad de polinucleótidos asociados con la nanopartícula. Como se describe en el documento PCT/US2008/65366 , incorporado aquí por referencia en su totalidad, una mayor densidad de polinculeótidos en la superficie de una nanopartícula está asociada con una mayor captación de nanopartículas por una célula.
Una densidad de superficie adecuada para hacer a las nanopartículas estables y las condiciones necesarias para obtenerlo, para una combinación deseada de nanopartículas y polinucleótidos, puede ser determinada empíricamente. Generalmente, una densidad de superficie de por lo menos. 2 pmoles/cm2 serán adecuadas para proporcionar composiciones estables de nanopartículas y oligonucleótidos . En algunos aspectos, la densidad de superificie es de por lo menos 15 pmoles/cm2. También son propuestos los métodos en donde el polinucleótido está unido a la nanopartícula a una densidad de superficie de por lo menos 2 pmol/cm2, de 3 pmol/cm2, de 4 pmol/cm2, de 5 pmol/cm2, de 6 pmol/cm2, de 7 pmol/cm2, de 8 pmol/cm2, de 9 pmol/cm2, de 10 pmol/cm2, de 15 pmol/cm2, de 20 pmol/cm2, de 25 pmol/cra2, de 30 pmol/cm2, de 35 pmol/cm2, de 40 pmol/cm2, de 45 pmol/cm2, de 50 pmol/cm2, de 55 pmol/cm2, de 60 pmol/cm2, de 65 pmol/cm2, de 70 pmol/cm2, de 75 pmol/cm2, de 80 pmol/cm2, de 85 pmol/cm2, de 90 pmol/cm2, de 95 pmol/cm2, de 100 pmol/cm2, de 125 pmol/cm2, de 150 pmol/cm2, de 175 pmol/cm2, de 200 pmol/cm2, de 250 pmol/cm2, de 300 pmol/cm2, de 350 pmol/cm2, de 400 pmol/cm2, de 450 pmol/cm2, de 500 pmol/cm2, de 550 pmol/cm2, de 600 pmol/cm2, de 650 pmol/cm2, de 700 pmol/cm2, de 750 pmol/cm2, de 800 pmol/cm2, de 850 pmol/cm2, de 900 pmol/cm2, de 950 pmol/cm2, de 1000 pmol/cm2 o más.
Se ha demostrado que la densidad de polinucleotidos en la superficie de una nanopartícula modula las interacciones de polipéptidos específicos con el polinucleótido en la superficie y/o con la misma nanopartícula. Bajo varias condiciones, algunos polipéptidos pueden estar restringidos para interactuar con polinucleotidos asociados con una nanopartícula basado en un impedimento estérico causado por la densidad de los polinucleotidos. En aspectos en donde es deseable que la interacción de los polinucleotidos con polipéptidos que, por otra parte, son opuestos por un impedimento estérico, la densidad de los polinucleotidos en la superficie de la nanopartícula disminuye para permitir que el polipéptido interactúe con el polinucleótido.
También se ha demostrado que la densidad de superficie del polinucleótido modula la estabilidad del polinucleótido asociado con la nanopartícula. En un ejemplo típico, se propone un polinucleótido de ARN asociado con una nanopartícula caracterizado porque el polinculeótido de ARN tiene una vida media que es por lo menos sustancialmente igual a la vida media de un polinuceótido de ARN idéntico que no está asociado con una nanopartícula. En otras incorporaciones, el polinucleótido de ARN asociado con la nanopartícula tiene una vida media aproximadamente mayor al 5%, mayor al 10%, mayor al 20%, mayor al 30%, mayor al 40%, mayor al 50%, mayor al 60%, mayor al 70%, mayor al 80%, mayor al 90%, de 2 veces mayor, de 3 veces mayor, de 4 veces mayor, de 5 veces mayor, de 6 veces mayor, de 7 veces mayor, de 8 veces mayor. De 9 veces mayor. De 10 veces mayor, de 20 veces mayor, de 30 veces mayor, de 40 veces mayor, de .50 veces mayor, de 60 veces mayor, de 70 veces mayor, de 80 veces mayor, de 90 veces mayor, de 100 veces mayor, de 200 veces mayor, de 300 veces mayor, de 400 veces mayor, de 500 veces mayor, de 600 veces mayor, de 700 veces mayor, de 800 veces mayor, de 900 veces mayor, de 1000 veces mayor, de 5000 veces mayor, de 10,000 veces mayor, de 50,000 veces mayor, de 100,000 veces mayor, de 200,000 veces mayor, de 300,000 veces mayor, de 400,000 veces mayor, de 500,000 veces mayor, de 600,000 veces mayor, de 700,000 veces mayor, de 800,000 veces mayor, de 900,000 veces mayor, de 1,000,000 veces mayor o más que la vida media de un polinucleótido de ARN que no esté asociado con una nanopartícula .
MÉTODOS DE UNIÓN DE POLINUCLEOTIDOS Los polinucleótidos considerados para ser usados en los métodos incluyen a aquellos unidos a la nanopartícula a través de cualquier medio. Sin considerar los medios por los cuales el polinucleótido esté unido a la nanopartícula, la unión en varios aspectos es afectada por un enlace 5', un enlace 3 ' , algún tipo de enlace interno o cualquier combinación de estas uniones.
En un aspecto, las nanopartículas , los polinucleótidos o ambos son conjugados con la finalidad de unir los polinucleótidos a las nanopartículas. Los métodos para conjugar las nanopartículas y polinucleótidos son conocidos en el ámbito. Por ejemplo, los polinucleótidos conjugados con alcanotioles en su extremo terminal 3' o en su extremo terminal 5', se unen fácilmente a las nanopartículas de oro. Ver Whitesides, Procceedings of the Robert A. elch Foundation 39th Conference On Chemical Research Nanophase Chemistry, Houston, Tex., páginas 109-121 (1995). También ver Mucic y colaboradores, [Chem. Commun. 555-557 (1996)] el cual describe un método de enlace de ADN 3' tiol a superficies delgadas de oro. El método de alcanotiol también puede ser utilizado para unir los oligonucleótidos con otro metal, a coloides semiconductores y magnéticos y a los otros tipos de nanopartículas que descritas aquí. Otros grupos funcionales para la unión de oligonucleótidos a superficies sólidas incluyen grupos fosforotioato (ver, por ejemplo, la Patente de los Estados Unidos No. 5,472,881 para el enlace oligonucleótidos-fosforotioatos a superficies de oro) , los alquilsiloxanos sustituidos [(ver, por ejemplo, Burwell, Chemical Technology, 4, 370-377 (1974) y Matteucci and Caruthers, J. Am. Chem. Soc . , 103, 3185-3191 (1981) para el enlace de oligonucleótidos al sílice y superficies de vidrio, y Grabar y colaboradores, [Anal. Chem., 67, 735-743] para el enlace de aminoalquilsiloxanos y para enlaces similares de mercaptoalquilsiloxanos] . Los polinucleótidos con un tionucleósido 5' o un tionucleósido 3', también pueden ser usados para unir los oligonucleótidos a superficies sólidas. Las siguientes referencias describen otros métodos que pueden ser empleados para unir oligonucleótidos con nanopartículas: Nuzzo y colaboradores, J. Am. Chem. Soc, 109, 2358 (1987) (disulfuros en oro); Aliara y Nuzzo, Langmuir, 1, 45 (1985) (ácidos carboxílieos en aluminio) ; Aliara y Tompkins, J. Colloid Interface Sci., 49, 410-421 (1974) (ácidos carboxílicos en cobre) ; Iler, The Chemistry Of Silica, Chapter 6, (Wiley 1979) (ácidos carboxílicos en sílice); Timmons y Zisman, J. Phys . Chem. , 69, 984-990 (1965) (ácidos carboxílicos en platino); Soriaga y Hubbard, J. Am. Chem., 104, 3937 (1982) (compuestos de anillo aromático en platino); Hubbard, Acc. Chem. Res., 13, 177 (1980) (sulfolanos, sulfóxidos y otros solventes conjugados en platino) ; Hickman y colaboradores, J. Am. Chem. Soc . , 111, 7271 (1989) (isonitrilos en platino); Maoz y Sagiv, Langmuir, 3, 1045 (1987) (silanos en sílice); Maoz y Sagiv, Langmuir, 3, 1034 (1987) (silanos en sílice) ; Wasserman y colaboradores, Langmuir, 5, 1074 (1989) (silanos en sílice); Eltekova y Etekov, Langmuir, 3, 951 (1987) (ácidos carboxílicos aromáticos, aldehidos, alcoholes y grupos metoxi en dióxido de titanio y sílice); Lee y colaboradores, J. Phys. Chem., 92, 2597 (1988) (fosfatos rígidos en metales) .
La Solicitud de Patente Ser. Nos. 09/760,500 y 09/820,279 y las solicitudes internacionales nos. PCT/US01/01190 y PCT/US01/10071 describen los oligonucleótidos conjugados con un disulfuro cíclico. Los disulfuros cíclicos en ciertos aspectos tienen 5 o 6 átomos en sus anillos, incluyendo los dos átomos de azufre. Los disulfuros cíclicos apropiados están disponibles comercialmente o son sintetizados mediante procedimientos conocidos. También está considerada la conjugación con las formas reducidas de los disulfuros cíclicos. La conjugación con grupos de disulfuros cíclicos de triple anclaje se describen en el documento PCT/US2008/63441 , incorporado aquí por referencia en su totalidad.
En ciertos aspectos en donde es utilizada la conjugación del disulfuro cíclico, los oligonucleótidos están unidos a una nanopartícula a través de uno o más enlaces . En un ejemplo típico, el enlace consiste de una fracción de hidrocarburo unida a un disulfuro cíclico. Los hidrocarburos convenientes están disponibles comercialmente, y están unidos a los disulfuros cíclicos. La fracción de hidrocarburo es, en un aspecto, un residuo de esteroide. Las composiciones de oligonucleótido-nanopartícula que son preparadas usando enlazantes que consisten de un residuo de esteroide unido a un disulfuro cíclico son más estables en comparación con las composiciones preparadas usando alcanotioles o disulfuros acíclicos como enlazante, y en ciertos ejemplos, se ha encontrado que las composiciones de oligonucleótidos y nanopartículas son 300 veces más estables. En ciertas incorporaciones los dos átomos de azufre del disulfuro cíclico están muy juntos de tal manera que los dos átomos de azufre se unen simultáneamente a la nanopartícula. En otros aspectos, los dos átomos de azufre son adyacentes entre sí.
En ocasiones donde es utilizada, la fracción de hidrocarburos es lo suficientemente larga para presentar una superficie hidrofóbica que cubre las superficies de la nanopartícula .
En otros aspectos, un método para unir oligonucleótidos en una superficie está basado en un proceso de envejecimiento descrito en las Solicitudes de Patente de los Estados Unidos Ser. No. 09/344,667, archivada en Jun. 25, 1999: Ser. No. 09/603,830, archivada en Jun. 26, 2000; Ser. No. 09/760,500, archivada en Ene. 12, 2001; Ser. No. 09/820, 279, archivada en Mar. 29, 2001; Ser. No. 09/927, 777, archivada en Ago. 10, 2001; y en las Solicitudes Internacionales nos. PCT/US97/12783 , archivada en Jul . 21, 1997; PCT/US00/7507 , archivada en Jun. 26, 2000; PCT/US01/01190 , archivada en Ene. 12,2001; PCT/US01/10071, archivada en Mar. 28, 2011, los descubrimientos son incorporados por referencia en su totalidad. El proceso de envejecimiento de composiciones de nanopartículas y oligonucleótidos proporciona una notable estabilidad y selectividad. El proceso consiste en proporcionar una parte de oligonucleótidos que tienen enlaces covalentes y una parte que consiste de un grupo funcional el cual puede unirse a las nanopartículas. Las fracciones y los grupos funcionales son aquellos que permitan la unión (por ejemplo, mediante adsorción química o enlace covalente) de los oligonucleótidos a nanopartículas. Por ejemplo, los oligonucleótidos que tienen un alcanotiol, un disulfuro de alcano o un disulfuro cíclico unidos covalentemente a sus extremos 5' o 3' unen a los oligonucleótidos con una variedad de nanopartículas , incluyendo nanopartículas de oro.
Se ha encontrado que las composiciones producidas mediante la etapa de "envejecimiento" son considerablemente más estables que aquellas producidas sin la etapa de "envejecimiento" . La densidad aumentada de los oligonucleótidos en las superficies de las nanopartículas se obtiene mediante la etapa de "envejecimiento" . La densidad de la superficie obtenida mediante la etapa de "envejecimiento" dependerá del tamaño y tipo de nanopartículas y de la longitud, secuencia y concentración de los oligonucleótidos. Una densidad de superficie adecuada para producir nanopartículas estables y las condiciones necesarias para obtenerlas, para una combinación deseable de nanopartículas y oligonucleótidos, puede ser determinada empíricamente. Generalmente, una densidad de superficie de por lo menos 2picomoles/cm2 será adecuada para proporcionar composiciones de nanopartículas y oligonucleótidos estables. Sin considerar, varias densidades de oligonucleótidos están contempladas como aquí se manifiesta.
Una fase de "envejecimiento" está incorporada en la producción de nanopartículas conjugadas seguida de una unión inicial u oligonucleótidos a una nanopartícula . En breve, los oligonucleótidos son contactados con las nanopartículas en el agua por un tiempo suficiente para permitir por lo menos que algunos de los oligonucleótidos se unan a las nanopartículas por medio de grupos funcionales. Dicho tiempo puede determinarse empíricamente. En un aspecto, se considera un tiempo aproximado de 12-24 horas. Otras condiciones convenientes para unir los oligonucleótidos también pueden determinarse empíricamente. Por ejemplo, se considera una concentración aproximada de 10-20 nM de nanopartículas y una incubación a temperatura ambiente.
A continuación, por lo menos es agregada una sal al agua para formar una solución de salina. La sal es cualquiera soluble en agua, incluyendo, por ejemplo y sin limitación, cloruro de sodio, cloruro de magnesio, cloruro de potasio, cloruro de amonio, acetato de sodio, acetato de amonio, una combinación de dos o más de estas sales, o una de estas sales en un regulador de fosfatos. La sal es agregada como una solución concentrada o alternativamente como sólido. En varias incorporaciones, es agregada toda la sal al mismo tiempo o se agrega gradualmente con tiempo. Por "gradualmente con tiempo" significa que la sal es agregada en por lo menos dos porciones a intervalos espaciados separados por un periodo de tiempo. Los intervalos de tiempo convenientes pueden determinarse empíricamente .
La fuerza iónica de la solución salina debe ser suficiente para superar, por lo menos parcialmente, la repulsión electrostática de los oligonucleótidos entre sí y, ya sea, la atracción electrostática entre los oligonucleótidos cargados negativamente y las nanopartículas cargadas positivamente ó la repulsión electrostática entre los oligonucleótidos cargados negativamente y las nanopartículas cargadas negativamente. Reduciendo gradualmente la atracción y repulsión electrostática mediante la adición gradual y lenta de la sal, se obtiene la más alta densidad de superficie de los oligonucleótidos sobre las nanopartículas. Las fuerzas iónicas apropiadas pueden determinarse empíricamente para cada sal ó combinación de sales. En un aspecto, es utilizada una concentración final de cloruro de sodio aproximadamente de 0.01 M a 1.0 M en regulador de fosfatos, con la concentración de cloruro de sodio siendo incrementada gradualmente conforme al tiempo. En otro aspecto, es utilizada una concentración final de cloruro de sodio aproximadamente de 0.01 M a 0.5 ó aproximadamente de 0.1 M a 0.3 M con la concentración de cloruro de sodio siendo incrementada gradualmente conforme al tiempo.
Después de adicionar la sal, los oligonucleótidos y las nanopartículas son incubados en solución salina durante un periodo de tiempo para permitir que los oligonucleótidos adicionales se unan a las nanopartículas para producir las composiciones de oligonucleótido-nanopartícula estables. Aquí se ha descrito que una densidad de superficie incrementada de los oligonucleótidos sobre las nanopartículas estabiliza las composiciones . El tiempo de ésta incubación puede determinarse empíricamente. A manera de ejemplo, en un aspecto, el tiempo de incubación total es de 24-48 horas aproximadamente en donde es considerado el incremento gradual paulatino de la concentración de sal durante éste tiempo total. Este segundo periodo de incubación en la solución salina es mencionado aquí como la etapa de "envejecimiento" . Otras condiciones adecuadas para ésta etapa de "envejecimiento" también pueden ser determinadas empíricamente. A manera de ejemplo, una etapa de envejecimiento es llevada a cabo con incubación a temperatura ambiente y un pH de 7.0.
Las composiciones producidas mediante el uso del "envejecimiento" son, en general, más estables que aquellas producidas sin la etapa de "envejecimiento" . Como se notó anteriormente, ésta estabilidad aumentada es debida a la densidad incrementada de los oligonucleótidos sobre las superficies de las nanopartículas lo cual es obtenido mediante la etapa de "envejecimiento" . La densidad de superficie obtenida mediante la fase de "envejecimiento" dependerá del tamaño y tipo de las nanopartículas y de la longitud, secuencia y concentración de los oligonucleótidos .
Como es usado aquí, "estable" significa que, por un periodo de por lo menos seis meses después de que la composición fue elaborada, una mayoría de los oligonucleótidos permanece unida a las nanopartículas y los oligonucleótidos son capaces de hibridizarse con ácido nucleico y con oligonucleótidos seleccionados bajo condiciones estándar encontradas en métodos de detección de ácido nucleico y métodos de nano-fabricación.
POLINUCLEÓTIDOS El término "nucleótido" o su plural son usados aquí indistintamente con formas modificadas como se discutió aquí y de otras maneras conocidas en éste ámbito. En ciertos casos, en el ámbito se usa el término "nucleobase" el cual abarca los nucleótidos que se presentan naturalmente así como las modificaciones de los nucleótidos que pueden ser polimerizados . De éste modo, nucleótido o nucleobase se refiere a las nucleobases que se presentan naturalmente adenina (A) , guanina (G) , citosina (C) , timina (T) y uracilo (U) así como las nucleobases que se presentan de manera no-natural tales como xantina, diaminopurina, 8-OXO-N6-metiladenina, 7 -deazaguanina, N4 , N4 -etanocitosina, ?',?'-etano-2 , 6 -diaminopurina, 5-metilcitosina (mC) , 5-(C3-C3)-alquinil-citosina, 5-fluorouracilo, 5-bromouracilo, pseudoisocitosina, 2-hidroxi-5-metil-4-triazolopiridina, isocitosina, isoguanina, inosina y las nucleobases que se presentan de forma no-natural descritas por Benner y colaboradores, Patente de los Estados Unidos No. 5,432,272 y Susan M. Freier y Karl-Heinz Altmann, 1997, Nucleic Acids Research, vol . 25: pp 4429-4443. El término "nucleobase" también incluye no sólo las purinas y pirimidinas heterocíclicas conocidas sino también a los análogos heterocíclicos y tautómeros de ellas. Además de las nucleobases que se presentan de manera natural y no-natural, incluye aquellas descubiertas en la Patente de los Estados Unidos No. 3,687,808 (Merigan y colaboradores), en el Capítulo 15 por Sanghvi, en Antisense Research and Application, Ed. S. T. Crooke y B. Lebleu, CRC Press, 1993, en Englisch y colaboradores, 1991, Angewandte Chemie, International Edition, 30: 613-722 (ver especialmente las páginas 622 y 623 y en la Concise Encyclopedia of Polymer Science and Engineering, J. I. Kroschwitz Ed. , John Wiley & Sons, 1990, páginas 858-859, Cook, Anti-Cancer Drug Design 1991, 6, 585-607, cada uno de los cuales está incorporado aquí por referencia en su totalidad) . En varios aspectos, los polinucleótidos también incluyen una o más "bases nucleosidicas" ó "unidades base" las cuales incluyen compuestos tales como compuestos heterocíclicos que pueden servir como nucleobases incluyendo ciertas "bases universales" que no son bases nucleosidicas en el mayor sentido clásico pero serven como bases nucleosidicas. Las bases universales incluyen al 3 -nitropirrol , opcionalmente índoles substituidos (por ejemplo, 5-nitroindol) y opcionalmente hipoxantina substituida. Otras bases universales deseables incluyen a aquellas bases conocidas en éste ámbito.
Los polinucleótidos también pueden incluir nucleobases modificadas. Se entiende en éste ámbito que una "base modificada" es una que puede aparearse con una base natural (por ejemplo, adenina, guanina, citosina, uracilo y/o timina) y/o puede aparearse con una base no-natural presente. Ejemplos de bases modificadas son descritos en los documentos EP 1 072 679 y WO 97/12896, de los cuales, los descubrimientos son incorporados aquí por referencia. Las nucleobases modificadas incluyen sin limitación, 5-metilcitosina (5-me-C) , 5 -hidroximetil citosina, xantina, hipoxantina, 2-aminoadenina, 6-metil y otros alquil derivados de adenina y guanina, 2-propil y otros alquil derivados de adenina y guanina, 3 -tiouracilo, 2-tiotimina y 2 -tiocitosina, 5-halouracilo y citosina, 5-propinil uracilo y citosina y otros alquinil derivados de bases piriraídicas, 6-azouracilo, citosina y timina, 5-uracilo (pseudouracilo) , 4-tiouracilo, 8-halo, 8-amino, 8-tiol, 8-tioalquil, 8-hidroxil y otras adeninas y guaninas 8-substituidas , 5 -halo particularmente 5-bromo, 5-trifluorometil y otros uracilos y citosinas 5-substituídos , 7 -metilguanina y 7-metiladenina, 2-F-adenina, 2-amino-adenina, 8-azaguanina y 8-azaadenina, 7-deazaguanina y 7-deazaadenina y 3-deazaguanina y 3-deazaadenina. Además, las bases modificadas incluyen pirimidinas tricíclicas tales como fenoxazina citidina (lH-pirimido [5, 4-b] [1 , 4] benzoxazin-2(3H)-ona), fenotiazina citidina (lH-pirimido [5 , 4 -b] [1 , 4] benzotiazin-2 (3H) -ona) , suj etadores-G tales como la fenoxazina citidina substituida (por ejemplo, 9-(2-aminoetoxi) -H-pirimido [5, 4-b] [1, 4] benzoxazin-2 (3H) -ona) , carbazol citidina (2H-pirimido [4 , 5-b] indol-2-ona) , piridoindol citidina (H-pirido [3 ' , 2 ' : 4 , 5] pirrólo [2,3-d] pirimidin-2-ona) . Las bases modificadas también pueden incluir aquellas en las cuales la base purica o pirimidica es remplazada con otros heterocíclicos , por ejemplo la 7-deazaadenina, 7-deazaguanosina, 2 -aminopiridina y 2-piridona. Nucleobases adicionales incluyen a aquellas manifestadas en la Patente de los Estados Unidos No. 3,687,808, aquellas manifestadas en The Concise Encyclopedia Of Polyraer Science And Engineering, páginas 858-859, Kroschwitz, J. I., Ed. , John Wiley & Sons, 1990, aquellas descubiertas por Englisch y colaboradores, 1991, Angewandte Chemie, International Edition, 30: 613, y aquellas descubiertas por Sanghvi,Y. S., Capítulo 15, Antisense Research and Applications, páginas 289-302, Crooke, S. T. y Lebleu, B., ed. , CRC Press, 1993. Ciertas de estas bases son útiles para aumentar la afinidad de enlace e incluyen pirimidinas 5-substituidas , 6-azapirimidinas y purinas N-2, N-6 y 0-6 substituidas, incluyendo la 2-aminopropiladenina, 5-propiniluracilo y 5-propinilcitosina, las substituciones de la 5-metilcitosina han mostrado incrementar la estabilidad del dúplex de ácido nucleico en 0.6-1.2 °C y están, en ciertos aspectos, combinadas con modificaciones del 2 ' -O-metoxietil azúcar. Ver las Patentes de los Estados Unidos Nos. 3,687,808; 4,845,205; 5,130,302; 5,134,066; 5,175,273; 5,367,066; 5,432,272; 5,457,187; 5,459,255; 5,484,908; 5,502,177; 5,525,711; 5,551,540; 5,587,469; 5,594,121; 5,596,091; 5,614,617; 5,645,985; 5,830,653; 5,763,588; 6,005,096; 5,750,692 y 5,681,941, de los cuales, los descubrimientos se incorporan aquí por referencia.
Los métodos de elaboración de polinucleótidos de una secuencia pre-determinada son bien conocidos. Ver, por ejemplo, Sambrook y colaboradores, Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2nd ed. 1989) y F. Eckstein (ed. ) Oligonucleotides and Analogues, lst ed. (Oxford University Press, New York, 1991). Los métodos de síntesis en fase sólida son preferidos para ambos poliribonucleótidos y polidesoxiribonucleótidos (los métodos bien conocidos de síntesis de ADN también son útiles para sintetizar AR ) . Los poliribonucleótidos también pueden ser preparados enzimáticamente . Las nucleobases no-naturales presentes pueden ser incorporadas también al polinucleótido . Ver, por ejemplo la Patente de los Estados Unidos No. 7,223,833; Katz, J. Am. Chem. Soc .. , 74:2238 (1951); Yamane y colaboradores, J. Am. Chem., 83:2599 (1961); Kosturko y colaboradores, Biochemistry, 13:3949 (1974); Thomas, J. Am. Chem., 76:6032 (1954); Zhang y colaboradores, J. Am. Chem. , 127 : 74-75 (2005) y Zimmermann y colaboradores, J. Am. Chem., 124:13684-13685 (2002) .
Las nanopartículas propuestas que son conjugadas con un polinucleótido o una forma modificada de ellas, generalmente incluyen un polinucleótido de 5 a 100 nucleótidos aproximadamente de longitud. Más específicamente, las nanopartículas son conjugadas con polinucleótidos que son aproximadamente de 5 a 90 nucleótidos de longitud, de 5 a 80 nucleótidos de longitud, de 5 a 70 nucleótidos de longitud, de 5 a 60 nucleótidos de longitud, de 5 a 50 nucleótidos de longitud, de 5 a 45 nucleótidos de longitud, de 5 a 40 nucleótidos de longitud, de 5 a 35 nucleótidos de longitud, de 5 a 30 nucleótidos de longitud, de 5 a 25 nucleótidos de longitud, de 5 a 20 nucleótidos de longitud, de 5 a 15 nucleótidos de longitud, de 5 a 10 nucleótidos de longitud y todos los polinucleótidos de longitud intermedia de los tamaños específicamente manifestados hasta cierto punto en que el polinucleótido sea capaz de producir el resultado deseado. En concordancia, son contemplados los polinucleótidos de 5 , 6 , 7, 8, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 52, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100 o más nucleótidos de longitud Los polinucleótidos considerados para unirse a una nanopartícula incluyen a aquellos los cuales modulan la expresión de un gen proveniente de un polinucleótido seleccionado. En concordancia, son considerados los polinucleótidos de ARN los cuales hibridizan a un polinucleótido elegido e inician una actividad de AR asa (por ejemplo, ARNasa H) , los polinucleótidos que forman triple hélice los cuales hibridizan a polinucleótidos de doble cadena e inhiben la transcripción y las ribozimas las cuales hibridizan al polinucleótido elegido e inhiben la transcripción .
En varios aspectos, si un mARN específico es seleccionado, una composición simple de agente de unión y nanopartícula tiene la habilidad para unir múltiples copias de la misma transcripción. En un aspecto, es propuesta una nanopartícula que es conjugada con polinucleótidos idénticos, por ejemplo, cada polinucleótido tiene la misma longitud y la misma secuencia. En otros aspectos, la nanopartícula es conjugada con dos o más polinecleótidos los cuales no son idénticos, por ejemplo, por lo menos uno de los polinucleótidos unidos difiere, por lo menos con otro de los polinucleótidos unidos, en que éste tiene una longitud y/o una secuencia diferente. En aspectos en donde polinucleótidos diferentes están unidos a la nanopartícula, éstos polinucleótidos diferentes unen al mismo polinucleótido simple seleccionado pero en diferentes locaciones ó sitios de sustrato ó unidos a diferentes polinucleótidos elegidos los cuales codifican diferentes productos del gen. En concordancia, en varios aspectos, una simple composición de nanopartícula-agente de unión selecciona más de un producto del gen. Los polinucleótidos son así, polinucleótidos de selección específica, ya sea que se trate de una o más regiones específicas en el polinucleótido seleccionado ó de la longitud completa del polinucleótido elegido, si la necesidad puede ser afectar a un nivel deseado de inhibición la expresión del gen.
PROPIEDADES DE LOS POLINUCLEÓTIDOS El presente descubrimiento establece, en varias incorporaciones, las composiciones de nanopartícula-ARN polivalente que son útiles para la regulación de genes. Los ARNs de baja interferencia son agentes de ARN de doble cadena que tienen complementariedad para (por ejemplo, son capaces de hibridizarse con) una porción del ARN seleccionado (generalmente ARM mensajero (mARM) ) . Generalmente tal complementariedad es 100% pero puede ser menos si se desea, tal como aproximadamente 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 70%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ó 99%. Por ejemplo, 19 de 21 bases pueden ser apareadas. Así, se entenderá que un oligonucleótido utilizado en los métodos no necesita ser complementario al 100% para un ácido nucleico elegido para ser específicamente hibridizable.
Además, los oligonucleótidos pueden hibridizar a cada uno o más de otros segmentos que intervienen o segmentos adyacentes que no están involucrados en el evento de hibridación (por ejemplo, una estructura de lazo o de horquilla) . El porcentaje de complementariedad . entre cualquier oligonucleótido dado puede ser determinado rutinariamente usando programas HBABL (Herramientas de Búsqueda de Alineación Básica Local) y programas HBABL de poder conocidos en éste ámbito (Altschul y colaboradores, 1990, J. Mol. Biol., 215:403-410; Zhang y Madden, 1997, Genome Res., 7:649-656) .
En algunos aspectos, donde se desea la selección entre varios variantes alélicos, se requiere una complementariedad de 100% para el gen elegido con la finalidad de discernir de manera efectiva la secuencia elegida de otra secuencia alélica. Cuando se selecciona entre objetivos alélicos, la elección de la longitud también es un factor importante ya que es el otro factor involucrado en el porcentaje de complementariedad y en la habilidad para discernir entre diferencias alélicas.
"Hibridización" significa una interacción entre dos o tres cadenas de ácidos nucleicos madiante puentes de hidrógeno en concordancia con las reglas de complementariedad del ADN de Watson-Crick, enlace Hoogstein u otro enlace de secuencias específicas conocido en éste ámbito. La hibridización puede ser realizada bajo diferentes condiciones de rigor conocidas en éste ámbito.
El término "ARN" incluye los dúplex de dos cadenas separadas así como estructuras de cadenas simples, triples o cuádruples. Un ejemplo de una cadena simple de ARN es un mARN con una vuelta de horquilla. La secuencia del ARN necesita ser de suficiente longitud para facilitar la interacción del ARN de baja interferencis y del ARN elegido, juntos, a través del apareamiento de bases complementarias. El ARN útil en los métodos expuestos aquí puede ser de longitudes variantes . El ARN, como se manifiesta aquí, consta de un dominio en una cadena simple del dúplex suficientemente complementaria para una secuencia en un polinucleótido elegido para permitir la hibridización de la cadena simple con el polinucleótido elegido bajo condiciones apropiadas y la hibridización del dominio del dúplex para que la secuencia en el polinucleótido elegido genere un sitio de substrato reconocido por un polipéptido. La longitud de éste dominio generalmente es mayor que ó igual a diez nucleótidos y de suficiente longitud para hibridizarse con el ARN elegido; específicamente de 10-100 nucleótidos; más específicamente cualquier entero entre 10 y 80 nucleótidos tales como 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 y 100. Por "longitud suficiente" se entiende un oligonucleótido de más que ó igual a 10 nucleótidos que es de una longitud suficientemente grande para producir la función deseada bajo las condiciones esperadas .
El ARN puede ser polimerizado in vi tro, el ARN recombinante contiene secuencias quiméricas o derivados de éstos grupos. El ARN contiene, en varios casos, ribonucleótidos , desoxiribonucleótidos , nucleótidos sintéticos o cualquier combinación adecuada de tal manera que la expresión del gen seleccionado es inhibida.
El ARN liberado puede estar dentro del citoplasma o del núcleo. El ARN puede ser liberado en una célula para inhibir la expresión en una secuencia de nucleótidos endógena ó exógena o para afectar una característica fisiológica específica no-naturalmente asociada con la célula.
Un ARN puede ser liberado a una célula con la finalidad de producir un cambio celular que es terapéutico. La liberación de ARN o de otro material genético con propósitos terapéuticos (el arte del mejoramiento de la salud en un animal que incluye el tratamiento o prevención de una enfermedad) es llamada genoterapia. El ARN puede ser liberado ya sea directamente al organismo in situ o indirectamente mediante la transferencia a una célula ex vivo que es entonces trasplantada al organismo. Se requiere de la entrada del ARN a la célula para bloquear la producción de una proteína o para disminuir la cantidad de ARN. Las secuencias de los polinucleótidos considerados por el presente descubrimiento serán descritos más adelante.
SECUENCIAS DE POLINUCLEÓTIDOS E HIBRIDIZACION En algunos aspectos, la invención propone métodos para fijar como objetivos (selección o elección) de ácidos nucleicos específicos. Cualquier tipo de ácido nucleico puede ser seleccionado y los métodos pueden ser usados, por ejemplo, para modulación terapéutica de la expresión de genes ( Ver, por ejemplo, el documento PCT/US2006/022325 , del cual, el descubrimiento es incorporado aquí por referencia) . Los ejemplos de ácidos nucleicos que pueden ser seleccionados mediante los métodos de la invención incluyen pero no se limitan a los genes ) por ejemplo, un gen asociado con una enfermedad particular) , ARN viral, ARN y ácidos nucleicos de cadena simple.
El ácido nucleico elegido puede estar en las células, muestras de tejido o fluidos biológicos como también es sabido en éste ámbito. Ver, por ejemplo, Sambrook y colaboradores, Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2nd ed., 1989 y B. D. Hames y S. J. Higgins, Eds , . Gene Probes I (IRL Press, New York, 1995) .
Los términos "región del codón de inicio" y "región del codón de inicio de translación" se refieren a una porción del mARN o gen que abarca a nucleótidos contiguos en cualquier dirección (por ejemplo, 5' o 3') a partir de un codón de inicio de translación. De manera similar, los términos "región del codón de término" y "región del codón de terminación de translación" se refieren a una porción de tal mARN o gen que abarca a los nucleótidos contiguos en cualquier dirección (por ejemplo, 5' o 3') a partir de un codón de terminación de translación. Consecuentemente, la "región del codón de inicio" (o "región del codón de inicio de translación") y la "región del codón de término" (o "región del codón de terminación de translación") son todas regiones las cuales pueden ser fijadas como objetivos de manera eficiente con los oligonucleótidos en las nanopartículas conjugadas.
Otras regiones de elección incluyen la región 5' no-transladada (5'RNT), la porción de un mARN en la dirección 5' del codón de inicio de translación que incluye nucleótidos entre el sitio 5 ' tope y la región del codón de inicio de translación de un mAR (o nucleótidos que corresponden en el gen) y la región 3' no-transladada (3'R T), la porción de un mARN en la dirección 3' del codón de terminación de translación que incluye nucleótidos entre la región del codón de terminación de translación y el sitio 3 'terminal de un mARN (o nucleótidos que corresponden en el gen) . El sitio 5 'tope de un mARN consta de un residuo de guanosina N7-metilada unido al residuo 5 '-mayor del mARN por medio de un enlace 5 '- 5 ' trifosfato . Se considera que la región 5 ' tope de un mARN incluye la misma estructura 5 'tope así como los primeros 50 nucleótidos adyacentes al sitio tope.
Para el ácido nucleico procariótico elegido, en varios aspectos, el ácido nucleico es ARN transcrito del ADN genómico. Para el ácido nucleico eucariótico elegido, 'el ácido nucleico es un ácido nucleico de origen animal, vegetal o fungal incluyendo el ácido nucleico de levaduras. Como se estableció anteriormente, el ácido nucleico elegido es un ARN transcrito de una secuencia del ADN genómico. En ciertos aspectos, el ácido nucleico elegido es un ácido nucleico mitocondrial . Para el ácido nucleico viral elegido, el ácido nucleico es ARN genómico viral o ARN transcrito de un ADN genómico viral .
Los métodos propuestos para la inhibición del producto de expresión del gen incluyen a aquellos en donde el producto de la expresión del gen elegido es inhibido por lo menos en 5% aproximadamente, por lo menos en 10%, por lo menos en 15%, por lo menos en 20%, por lo menos en 25%, por lo menos en 30%, por lo menos en 35%, por lo menos en 40%, por lo menos en 45%, por lo menos en 50%, por lo menos en 55%, por lo menos en 60%, por lo menos en 65%, por lo menos en 70%, por lo menos en 75%, por lo menos en 80%, por lo menos en 85%, por lo menos en 90%, por lo menos en 95%, por lo menos en 96%, por lo menos en 97%, por lo menos en 98%, por lo menos en 99% o 100% comparado con la expresión del producto del gen en ausencia de un conjugado oligonucleótido-nanopartícula . En otras palabras, los métodos propuestos abarcan a aquellos los cuales dan como resultado esencialmente cualquier grado de inhibición del producto de la expresión del gen elegido.
El grado de inhibición es determinado in vivo a partir de una muestra de fluido corporal o de una muestra de biopsia o mediante técnicas de imagenología bien conocidas en éste ámbito. Alternativamente, el grado de inhibición es determinado por ensayo en cultivo celular, generalmente , como una medida predictiva del grado de inhibición que puede esperarse in vivo y que resulta del uso de un tipo específico de nanopartícula y un oligonucleótido especifico.
POLINUCLEÓTIDOS MODIFICADOS Los polinucleótidos modificados están considerados para la conjugación de nanopart culas en donde ambos enlaces (uno o más de azúcar y/o uno o más internucleótidos) de las unidades de nucleótidos en el polinucleótido son remplazados con grupos "no-naturalmente presentes" . En un aspecto, ésta incorporación contempla un ácido nucleico péptido (ANP) . En los compuestos ANP, el azúcar central de un polinucleótido es remplazado por una amina central. Ver, por ejemplo, las Patentes de los Estados Unidos Nos. 5,539,082/5,714,331 y 5,719,262 y Nielsen y colaboradores, Science, 1991, 254, 1497-1500, de los cuales, los descubrimientos están incorporados aquí por referencia.
Otros enlaces entre nucleótidos y nucleótidos no-naturales considerados para los polinucleótidos descubiertos incluyen a aquellos descritos en las Patentes de los Estados Unidos Nos. 4,981,957; 5,118,800; 5,319,080; 5,359,044; 5,393,878; 5,446,137; 5,466,786, 5,514,785; 5,519,134; 5,567,811; 5,576,427; 5,591,722; 5,597,909; 5,610,300; 5,627,053; 5,639,873; 5,646,265; 5,658,873; 5,670,633; 5,792,747 y 5,700,920; en la Publicación de Patente de los Estados Unidos No. 20040219565; en las Publicaciones de Patente Internacional Nos. WO 98/39352 y WO 99/14226; Mesmaeker y colaboradores, Current Opinión in Structural Biology 5:343-355 (1995) y Susan M. Freier y Karl-Heinz Altmann, Nucleic Acids Research, 25:4429-4443 (1997), de los cuales, los descubrimientos están incorporados aquí por referencia .
Los ejemplos específicos de polinucleótidos incluyen a aquellos que contienen enlaces centrales modificados o enlaces de internucleósidos no-naturales. Los polinucleótidos que tienen enlaces centrales modificados incluyen a aquellos que retienen un átomo de fósforo en el enlace central y a aquellos que no tienen un átomo de fósforo en el enlace central. Los polinucleótidos modificados que no tienen un átomo de fósforo en su enlace internucleósido central son considerados para estar dentro del significado de "polinucleótido" .
Los enlaces centrales de polinucleótidos modificados que contienen un átomo de fósforo incluyen, por ejemplo, fósforotioatos , fósforoditioatos , fósforotioatos quirales, fosfotriésteres , aminoalquilfosfotriésteres , metil y otros alquil fosfonatos que incluyen 3 ' -alquilenfosfonatos , 5'-alquilenfosfonatos y fosfonatos quirales, fosfinatos, fosforamidatos que incluyen 3 ' amino fosforamidato y aminoalquilfosforamidatos , tionofosforamidatos , tionoalquilfosfonatos , tionoalquilfosfotrésteres , selenofosfatos y borofosfatos que tienen enlaces 3' -5' normales, análogos 2' -5' enlazados de éstos y aquellos que tienen polaridad invertida y que se caracterizan porque uno o más de los enlaces internucleótidos es un enlace 3' a 3', 5' a 5' 6 2' a 2' . También están considerados los polinucleótidos que tienen polaridad invertida que consta de un enlace simple 3' a 3' al enlace internucleótido 3' -mayor, por ejemplo, un residuo simple de nucleósido invertido el cual puede ser no-básico (que carece de un nucleótido o tiene un grupo hidroxilo en lugar de éste) . También están consideradas las sales, mezcla de sales y formas libres de ácido .
Las patentes de los Estados Unidos representativas que instruyen en la preparación de los anteriores enlaces que contienen fósforo incluyen las Patentes de los Estados Unidos Nos. 3,687,808; 4,469,863; 4,476,301; 5,023,243; 5,177,196; 5,188,897; 5,264,423; 5,276,019, 5, 278, 302 5, 286, 717; 5,321,131; 5,399,676; 5,405,939, 5,453,496 5,455, 233; 5,466,677; 5,476,925; 5,519,126, 5, 536, 821 5, 541, 306; 5,550,111; 5,563,253; 5,571,799, 5, 587, 361 5, 194, 599; 5,565,555; 5,527,899; 5,721,218; 5,672,697 y 5,625,050, de las cuales, los descubrimientos están incorporados aquí por referencia .
Los enlaces centrales de polinucleótidos modificados que no incluyen un átomo de fósforo tienen enlaces centrales que son formados mediante una cadena corta de internucleósidos con enlaces alquil o cicloalquil, enlaces heteroatómicos mezclados con enlaces internucleósidos con enlaces alquil o cicloalquil ó uno o más enlaces heteroatómicos o heterocíclicos de internucleósidos de cadena corta. Estos incluyen a aquellos que contienen enlaces morfolino; enlaces centrales siloxano; enlaces centrales sulfuro, sulfóxido y sulfona; enlaces centrales formacetil y tioformacetil ; enlaces centrales metilen formacetil y metilen tioformacetil ; enlaces centrales riboacetil; enlaces centrales que contienen alqueno; enlaces centrales sulfamato; enlaces centrales metilenimino y metilenhidrazino; enlaces centrales sulfonato y sulfonamida; enlaces centrales amida y otros que contienen partes componentes con N, O, S y CH2 mezclados. Aún en otras incorporaciones, los polinucleótidos están provistos con enlaces centrales de fósforotioato y oligonucleótidos con enlaces centrales heteroatómicos e incluyen -CH2-NH-0-CH2- , -CH2-N(CH3) -0-CH2-, -CH2-0-N(CH3) -CH2- , -CH2-N (CH3) -N (CH3) -CH2- y -O-N (CH3) -CH2-CH2- descritas en las Patentes de los Estados Unidos Nos. 5,489,677 y 5,602,240. Ver, por ejemplo, las Patentes de los Estados Unidos Nos. 5,034,506; 5,166,315; 5,185,444; 5,214,134; 5,216,141; 5,235,033; 5,264,562; 5,264,564; 5,405,938; 5,434,257; 5,466,677; 5,470,967; 5,489,677; 5,541,307; 5,561,225; 5,596,086; 5,602,240; 5,610,289; 5,608,046; 5,610,289; 5,618,704; 5,623,070; 5,663,312; 5,633,360; 5,677,437; 5,792,608; 5,646,269 y 5,677,439, de loas cuales, los descubrimientos están incorporados aquí por referencia en su totalidad.
En varias formas, el enlace entre dos monómeros sucesivos en el oligo, consisten de 2 a , deseablemente 3, grupos/átomos seleccionados de -CH2-, -O-, -S-, -NRH-, DC=0, ?C=NRH, DC=S, -Si(R")2-, -SO-, S(0)2-, -P(0)2-, -PO(BH3)-, -P(0,S)-, P(S2)-, -PO(R")-, -PO(OCH3)- Y -PO(NHRH)- donde RH es seleccionado de hidrógeno y Cl-4 -alquil y R" es seleccionado de Cl-6-alquil y fenil. Como ejemplos ilustrativos de tales enlaces están -CH2-CH2-CH2- , -CH2-CO-CH2- , -CH2-CHOH-CH2- , -O-CH2-0-, -0-CH2_CH2-, -0-CH2-CH= (incluyendo R5 cuando es usado como enlace para un monómero sucesivo), -CH2-CH2-0-, -NRH-CH2-CH2-, -CH2-CH2-NRH- , -CH2-NRH-CH2- , -0-CH2-CH2- NRH-, -NRH-CO-O-, - RH-CO-NRH- , NRH-CS-NRH- , - RH-C ( =NRH) - RH- , -NRH-CO-CH2-NRH-0-C0-O- , -0-CO-CH2-0- , -0-CH2-CO-0- , -CH2-CO-NRH- , -O-CO-NRH-, -NRH-CO-CH2 - , -O- CH2-CO-NRH, -O-CH2-CH2-NRH-, -CH=N-0-, -CH2-NRH-0-, -CH2-0-N= (incluyendo R5 cuando es usado como enlace para un monómero sucesivo), -CH2-o-NRH-, -C0-NRH-CH2- , -CH2-NRH-O-, -CH2-NRH-CO- , -O-NRH-CH2 - , -O-NRH-, -0-CH2-S-, -S-CH2-O-, -CH2-CH2-S-, -0-CH2-CH2-S- , -S-CH2-CH= ( incluyendo R5 cuando es usado como enlace para un monómero sucesivo) , -S-CH2 -CH2 - , -S-CH2-CH2-0- , -S-CH2-CH2-S- , -CH2-S-CH2-, -CH2-SO-CH2-, -CH2-S02-CH2-, -0-SO-O-, -0-S(0)2-0-, -0-S (O) 2-CH2- , -0-S(0)2-NRH-, -NRH-S (0) 2-CH2- , -0-P(0)2-0-, -0-P (0, S) -0- , -0-P(S)2-0-, -S-P(0)2-0-, -S-P (O, S) -O- , -S-P(S)2-0-, -0-P(0)2-S-, -0-P(0, S) -S- , -0-P(S)2-S-, -S-P(0)2-S-, -S-P(0,S) -s-, -s-P(S)2-S-, -0-PO(R" ) -O- , -0-PO(OCH3) -O- , -0-PO (OCH2CH3) -O- , -O-PO(OCH2CH2S-R) -O-, -0-P (BH3 ) -O- , -0-PO (NHRN) -O- , -0-P(0)2NRH H-, -NRH-P(0)2-0-, -0-P (0,NRH)-0- , -CH2-P (O) 2-0- , -O-P (O) 2-CH2-Y -O-Si (R" ) 2-0- ; entre los cuales -CH2-CO-NRH- , -CH2-NRH-0-, -S-CH2-0-, -0-P(0)2-0-0-P(-0,S) -O-, -0-P(S)2-0-, -NRH P(0)2-0-, -0-P(0,NRH) -0-, -0-P0(R" ) -0- , -0-PO (CH3) -0- Y -0-PO (NHRN) -0- , en donde se contempla que RH es seleccionado del hidrógeno y Cl-4-alquil y R" es seleccionado de Cl-6-alquil y fenil. Se proporcionan más ejemplos ilustrativos en Mesmaeker y colaboradores, 1995, Current Opinión in Structural Biology, 5: 343-355 y Susan . Freier y Karl-Heinz Altmann, 1997, Nucleic Acids Reseach, vol 25: pp 4429-4443.
Otras formas de polinucleótidos modificados son aún descritas en detalle en la Solicitud de Patente de los Estados Unidos No. 20040219565 de la cual, el descubrimiento es incorporado aquí por referencia en su totalidad.
Los polinucleótidos modificados también pueden contener una o más fracciones de azúcar substituidas. En ciertos aspectos, los polinucleótidos consisten de uno de los siguientes en la posición 2': OH; F; 0-, S- ó N-alquil; O-, S- ó N-alquenil; O-, S- ó N-alquinil ó O-alquil-O-alquil , en donde el alquil, alquenil y alquinil pueden ser substituidos o no- substituidos por Cx a Cío alquil o C2 a Ci0 alquenil y alquinil. Otras incorporaciones incluyen 0 [ (CH2) n0] mCH3 , 0(CH2)nOCH3, 0(CH2)nNH2, 0(CH2)nCH3, 0(CH2)nONH2 y 0(CH2)nON[ (CH2)nCH3] 2, donde n y m son de 1 a 10 aproximadamente. Otros polinucleótidos consisten de uno de los siguientes en la posición 2' : Cl a CIO de un alquil inferior, alquil inferior substituido, alquenil, alquinil, alcaril, aralquil, O-alcaril u O-aralquil, SH, SCH3, OCN, Cl , Br, CN, CF3, OCF3, SOCH3 , S02CH3, ON02 , N02 , N3 , NH2, heterocicloalquil , heterocicloalcaril , aminoalquilamino, polialquilamino, silil substituido, un grupo que escinde al ARN, un grupo detonador, un intercalador, un grupo para el mejoramiento de las propiedades farmacocinéticas de un polinucleótido y otros sustituyentes que tienen propiedades similares. En un aspecto, una modificación incluye 2'-metoxietoxi (2 ' -0-CH2CH2OCH3 también conocido como 2' -O- (2-metoxietil) o 2'-OME) (Martin y colaboradores, 1995, Helv. Chim. Acta, 78: 486-504) por ejemplo, un grupo alcoxialcoxi . Otras modificaciones incluyen 2 ' -dimetilaminooxietoxi , por ejemplo, un grupo O (CH2) 2ON (CH3) 2 también conocido como 2'-DMAOE y 2 ' -dimetilaminoetoxietoxi (también conocido en el ámbito como 2 ' -O-dimetil-amino-etoxi-etil o 2 ' -DMAEOE) , por ejemplo, 2' -0-CH2-0-CH2-N (CH3) 2- Otras modificaciones aún incluyen 2 ' -metoxi (2 ' -0-CH3) , 2' -aminopropoxi (2' -OCH2CH2CH2NH2) , 2 ' -alil (2 ' -CH2-CH=CH2) , 2'-O-alil (2 ' -0-CH2-CH=CH2) y 2 ' -fluoro (2 ' -F) . La modificación 2' puede estar en la posición arabino (alta) o en la posición ribo (baja). En un aspecto, una modificación 2' -arabino es 2'-F. También pueden hacerse modificaciones similares en otras posiciones en el polinucleótido, por ejemplo, en la posición 3' del azúcar en el nucleótido 3 ' terminal o en los polinucleótidos enlazados en 2' -5' y en la posición 3' del nucleótido 5 'terminal. Los polinucleótidos también pueden tener imitadores de azúcar tales como las fracciones de ciclobutil en lugar del azúcar pentofuranosil . Ver, por ejemplo, las Patentes de los Estados Unidos Nos. 4,981,957; 5,118,800; 5,319,080; 5,359,044; 5,393,878; 5,446,137; 5,466,786; 5,514,785; 5,519,134; 5,567,811; 5,576,427; 5,591,722; 5,597,909; 5,610,300; 5,627,053; 5,639,873; 5,646,265; 5,658,873; 5,670,633; 5,792,747 y 5,700,920 de los cuales, los descubrimientos están incorporados en su totalidad aquí por referencia.
En un aspecto, una modificación del azúcar incluye Acidos Nucleicos Encriptados (ANEs) en los cuales el grupo 2'-hidroxilo está unido al átomo de carbón 3' o 4' del anillo del azúcar, formando así, una fracción de azúcar bicíclico. El enlace es, en ciertos aspectos, un grupo metileno (-(¾-) n en donde n es 1 ó 2, puenteando los átomos de oxígeno 2' y el átomo de carbón 4' . Los ANEs y su preparación están descritas en los documentos WO 98/39352 y WO 99/14226 de los cuales, los descubrimientos están incorporados aquí por referencia.
QUIMERAS No es necesario, para todas las posiciones en un compuesto dado, ser modificadas de manera uniforme y, de hecho, más de una de las modificaciones antes mencionadas pueden incorporarse en un solo compuesto o, más aún, en un solo nucleótido dentro de un oligonucleótido . Estos compuestos quiméricos anti- sentido típicamente contienen por lo menos una región que incluye una modificación como las que se han descrito aquí, mientras que el resto del oligonucleótido permanece "sin modificar" .
En ciertos aspectos, la modificación confiere mayor resistencia a la degradación por la nucleasa, mayor captación celular, mayor estabilidad y/o mayor afinidad de unión al ácido nucleico elegido. En otros aspectos, la modificación sirve como sustrato para enzimas capaces de escindir los híbridos AR : ADN o ARN : AR . A manera de ejemplo, la ARNasa H es una endonucleasa celular la cual rompe la cadena de ARN de un dúplex ARN:ADN. La activación de la ARNasa H, sin embargo, resulta en el rompimiento del ARN elegido, aumentando asi más la eficiencia de la inhibición de la expresión del gen mediada por un oligonucleótido . La escisión de los híbridos ARN: ARN puede, de algún modo, ser lograda mediante la acción de las endoribonucleasas tales como la ARNasa L la cual rompe tanto el ARN celular como el ARN viral. La escisión del ARN elegido puede ser detectada rutinariamente mediante electroforesis en gel y, si es necesario, mediante técnicas asociadas a la hibridación de ácido nucleico conocidas en éste ámbito.
Los compuestos quiméricos pueden formarse como estructuras compuestas de dos o más oligonucleótidos , oligonucleótidos modificados, oligonucleósidos y/o oligonucleótidos imitadores como los descritos anteriormente. Tales compuestos también han sido mencionados en el ámbito como híbridos o gapmers, Ver, por ejemplo, las Patentes de los Estados Unidos NOS. 5,013,830; 5,149,797; 5,220,007; 5,256,775; 5,366,878; 5,403,711; 5,491,133; 5,565,350; 5,623,065; 5,652,355; 5,652,356 y 5,700,922 de las cuales, los descubrimientos están incorporados aquí por referencia en su totalidad.
EJEMPLOS Ejemplo 1 Preparación de Nanopartículas libres de ARNasa Las nanopartículas de oro (13 nm) estabilizadas con citrato fueron preparadas usando procedimientos publicados [Frens, Nature Physical Science 241: 20-22 (1973)]. Enseguida de la síntesis, las partículas fueron tratadas con dietilpirocarbonato al 0.1% (DEPC) por 12 horas con agitación, después, autoclaveadas a 121 °C por 60 minutos. De manera muy importante y sorprendente, las propiedades ópticas y físicas de las nanopartículas no fueron afectadas por éste tratamiento relativamente extremo, como se determinó mediante análisis de espectroscopia y microscopía por transmisión de electrones (MTE) (Figura 1) . La subsecuente conjugación de ligandos tampoco fue afectada por éste tratamiento. La prueba de actividad de ARNasa en éstas soluciones utilizando un equipo RNasa Alert (Ambion) no mostró actividad de ARNasa detectable comparada con los controles de partículas sin tratamiento (Figura 2) .
Ejemplo 2 Modificación de Nanopartículas libres de ARNasa Las nanopartículas libres de ARNasa resultantes estuvieron dispuestas para su modificación mediante oligonucleótidos tiolados usando procedimientos publicados [Demers y colaboradores, Anal. Chem. 72: 5535 (2000)]. Sin éste pretratamiento, la conjugación subsecuente con ARN no podría lograrse, presumiblemente debido a la rápida degradación de los ligandos de ARN que cubren la superficie. Los dúplex compuestos de una cadena de ARN de 27 bases y una complementaria de 25 bases con un espaciador de etilenglicol y alquiltiol terminal fueron hibridizados y adheridos a las NPs de oro libres de ARNasa y se les permitió la adsorción química mediante un enlace oro-tiol. Para éste trabajo, las secuencias fueron diseñadas para fijar como objetivo al gen luciferasa de luciérnaga.
Los oligonucleótidos de ARN fueron sintetizados usando reactivos TOM-RNA (Glen Research) y un MerMade 6 (Bioautomation) o comercialmente hechos (Integrated DNA Technologies) . Los oligonucleótidos sintetizados mediante recursos no-comerciales fueron purificados usando cartuchos TOP-RNA (Varían) . Las secuencias usadas para éste estudio fueron: luciferasa de sentido, 5' -Fosfato rCrGrArCrUrUrCrGrUrGrCrCrArGrArGrUrCrUrUrUrCrGAC Espaciador 18 Espaciador 18-Tiol-3' (SEC ID No: 1), luciferasa antisentido, 5' -rGrUrCrGrArArArGrArCrUrCrUrGrGrCrArCrGrArArGrUrCrGrUrA-3 ' (SEC ID No: 2), Cy3 luciferasa, 5'-Cy3 rGrUrCrGrArArArGrArCrUrCrUrGrGrCrCrGrArArGrUrCrGrUrAr-3 ' (SEC ID No: 3), Cy5 luciferasa, 5'- Cy5rGrUrCrGrArArArGrArCrUrCrUrGrGrCrArCrGrArArGrUrCrGrUrA -3 ' (SEC ID No: 4), luciferasa dabcyl , 5'-rCrGrArCrUrUrCrGrUrGrCrCrArGrArGrUrCrUrUrUrCrGA C-dabcyl-3 ' (SEC ID No: 5), Renilla luciferasa de sentido, 5 ' -Fosfato rGrGrArGrGrArCrGrCrUrCrCrArGrArUrGrArArArUrGrGGT Espaciador 18 Espaciador 18-Tiol-3' (SEC ID No: 6), Renilla luciferasa anti-sentido, 5' rArCrCrCrArürUrUrCrArUrCrUrGrGrArGrCrGrUrCrCrUrG- 3 ' (SEC ID NO: 7) .
Los dúplex de ARN tiolado pre- formados (1000 nM) fueron incubados con solución de NPs de oro libre de ARNasa (10 nM) la cual ha sido ajustada con NaCl 0.1 M. La mezcla fue envejecida en soluciones de concentración de sal creciente (NaCl de 0.1 a 0.3 M) y sonicada para aumentar el recubrimiento de oligonucleótidos sobre la superficie. Se adicionó oligoetilenglicol (OEG) (concentración final de 30pmol/mL) 24 horas después de la adición del dúplex y se evitó la precipitación en el cultivo celular (Figura 3) . La adición a ésta concentración no cambia la carga de dúplex. Después de la conjugación, las partículas fueron purificadas mediante centrifugación a 13,000 rpm por 20 minutos a 4°C y re-suspendidas con regulador salino de fosfatos estéril (SRF: 137 mM de NaCl, 10 mM de Fosfato y 2.7 mM de KC1, pH de 7.4) . Este proceso se repitió tres veces. Fue necesaria la centrifugación con refrigeración para prevenir la deshibridización de los dúplex debida al calentamiento causado por el proceso de centrifugación. Para determinar la carga de R dC/ las cadenas anti- sentido fueron etiquetadas con colorante fluorescente de Cianina 3 (Cy3). La fluorescencia fue medida con un equipo Jobin Yvon Fluorolog PL3-22 con excitación a 550 nm y medición de la emisión de 560 a 620 nm con incrementos de 1 nm comparando con una curva estándar. El número de dúplex por partícula fue calculado mediante la oxidación del oro utilizando 25µ? de cianuro de potasio midiendo el número de cadenas anti-sentido fluorescentes (indicativo de los dúplex formados) y dividiendo entre la concentración de nanopartículas . Cada composición de nanopartículas de oro-ARN contenía 33 ± 4 dúplex de ARN por 13 nm de NPs de oro.
Para prevenir la deshibridización del dúplex de ARN, la concentración de sal de la solución de NPs de oro fue ajustada a 0.1M con NaCl antes de la adición del dúplex. Subsecuentemente, la concentración de NaCl se incrementó paulatinamente de 0.1M a 0.3M durante 12 horas con una breve ultrasonicación después de cada adición para aumentar el recubrimiento de oligonucleótidos sobre la superficie de la nanopartícula [Hurst y colaboradores, Anal Chem 78: 8313 (2006)] . Para producir una composición más estable, las partículas conjugadas con ARN fueron tratadas con 30 pmol/mL de oligoetilenglicol-tiol (OEG-Tiol) como un ligando adicional para pasivacion de la superficie (Figura 9) . Se encontró que la pasivación con OEG-Tiol estabiliza éstos nanomateriales bajo condiciones de cultivo celular por periodos de tiempo prolongados .
Ejemplo 3 Captación celular de Composiciones de Nanopartículas -ARN La habilidad de las composiciones para entrar a las células fue investigado mediante microscopía confocal utilizando composiciones fluorescentes (Cianina 5, Cy5) preparadas como se mencionó anteriormente. Las NPs de Oro-ARN fueron adicionadas a cultivos de células HeLa. Las células se cultivaron en fundas de cristal y fueron tratadas con nanopartículas conjugadas con dúplex de ARN etiquetados con un fluoróforo. Después de seis horas de tratamiento, las fundas fueron removidas, lavadas con SRF y fijadas en una cámara llena con SRF montada sobre una lámina de vidrio . Todas las imágenes fueron obtenidas mediante un microscopio de barrido confocal (Zeiss 510 LS ) con una magnificación de 63x y una fuente de excitación láser de He-Ne de 633 nm. El estudio de las imágenes revela fluorescencia en todo el citoplasma de las células HeLa después de 6 horas (Figura 4a) . Es interesante notar que como las NPs de oro-ADN, las NPs de oro-ARN no requieren de un agente de transfeccion para entrar a las células [Giljohann y colaboradores, Nano Lett. 7: 3818 (2007)]. De hecho, los análisis de citometría de flujo confirmaron la captación de las NPs de Oro-ARN en D99% de la población celular (Figura 4b) . Para los experimentos de citometría de flujo, las células fueron tratadas con composiciones de nanoparticulas-ARN etiquetadas fluorescentemente (Cy5) . Seis horas después de la infección, las células fueron tratadas con tripsina para removerlas de las paredes del cultivo celular. La citometría de flujo se realizó utilizando un equipo DakoCytomation CyAn con excitación a 635 nm.
Ejemplo 4 Actividad de las Composiciones de Nanopartículas-AR Habiendo determinado que las NPs de Oro-AR son introducidas por las células, la actividad de las NPs de Oro-ARN fue examinada a continuación. Se llevaron a cabo estudios de caída de proteínas en las células HeLa usando un plásmido de luciferasa transfectado como objetivo para este sistema modelo. Las células HeLa (ATCC) fueron cultivadas en medio mínimo esencial de Eagle (MMEE) con suero fetal de bovino (SFB) al 10% inactivado con calor y mantenido a 37 °C en atmósfera de C02 al 5%. Las células fueron sembradas en placas de 96 pozos y cultivadas por 1 día anterior a la transfección de un plásmido (psiCHECK 2, Promega) el cual contiene tanto la luciferasa de luciérnaga como los genes de Renilla. El plásmido (0.2 g por pozo) fue adicionado usando Lipofectamina 2000 (Invitrogen) en concordancia con las recomendaciones del fabricante. Después de la introducción del plásmido (24 horas) , el medio fue reemplazado con medio de suero reducido que contiene las NPs de Oro-ARN conjugadas (concentración de nanopartículas de 3 nM¾100nM de concentración de dúplex de ARN) dirigidas contra la luciferasa de luciérnaga. A un día de tratamiento, las células fueron confluentes aproximadamente en 70%. Al término de los experimentos, por duplicado, los pozos de las células tratadas fueron contados y se midió la viabilidad usando un equipo Guava EasyCyte Mini (Guava Technologies) . La viabilidad después de la incubación fue D98% para las células tratadas con las NPs de Oro-ARN.
Por comparación, el mismo número de dúplex ARN-luciferasa (lOOnM) fue transfectado usando el agente comercial Lipofectamina 2000 de acuerdo con el protocolo recomendado por el fabricante. Después de 24 horas de tratamiento, el medio fue reemplazado con MMEE fresco. , Se ensayó la expresión de la luciferasa en las células usando el ensayo Dual-Glo (Promega) de acuerdo con los protocolos del fabricante después del número de días indicado.
La cuantificación de la expresión de la luciferasa fue normalizada para los controles que no fueron transíectados y reveló que los agentes de las nanopartículas sub-regulan la luciferasa de luciérnaga en una manera dependiente de la dosis y el tiempo. La expresión del control (renilla) no es afectada por las NPs de Oro-ARN diseñadas contra la luciferasa de luciérnaga indicando que la caída también es una secuencia específica. Interesantemente, los resultados de los tres experimentos independientes con las NPs de Oro-ARN mostraron una caída que excede a la de los ARN libres cuatro días después del tratamiento (73 ± 7% de NPs de Oro-ARN contra 33 ± 2% libres, Figura 5a) .
La persistente caída de la luciferasa es el resultado de la estabilización del ARN en la nanopartícula . Para hacer esta determinación, las partículas de ARN etiquetadas con Cy3 fueron diluidas a una concentración de 5 nM en 90 ih de SFB en una placa de 96 pozos. Para el ARN molecular etiquetado con dabcyl, la concentración fue de 150 nM. La microplaca se colocó en un lector de fluorescencia en placas Photon Technology International FluoDia T70 que fue mantenido a 37°C. Después de permitir que la muestra se equilibrara (10 minutos) , se adicionaron 10 L de suero fetal bovino (SFB, Gemini Bioproducts) para llevar a las muestras a una concentración de suero de 10%. Para prevenir la evaporación, la reacción fue cubierta con 40 L de aceite mineral. La fluorescencia de la muestra (excitación = 530 nm, emisión = 570 nm) fue medida cada 5 minutos durante 48 horas. La línea básica de fluorescencia fue determinada a partir de una muestra tratada con una alícuota de 10 L de SRF en lugar de SFB. El punto final de la reacción fue determinado cuando no hubo más incremento en la fluorescencia observado en función del tiempo. Todas las muestras fueron medidas por triplicado.
En éstos experimentos de estabilidad, las composiciones incubadas en suero mostraron un gran aumento en la estabilidad en relación con sus contrapartes de ARN molecular. Por ejemplo, en presencia de suero al 10%, las composiciones de NPs de Oro-ARN tuvieron una vida media 6 veces mayor que los dúplex de ARN (816 + 59 min vs . 133 ± 30 min, Figura 5b) . Estos datos indican que la conjugación de nanopartículas proporciona una protección significativa contra la degradación en un contexto extracelular . De aquí que el tiempo de vida extracelular del ARN es de gran importancia para su almacenamiento, manejo y aplicación terapéutica, la conjugación de nanopartículas puede aportar una ventaja significativa para la protección y liberación de los ligandos funcionales de ARN. De manera importante, ésta estabilidad aumentada no requiere modificaciones químicas para proteger la integridad del ARN.
Ejemplo 5 Orientación del Polinucleótido en la Superficie de la Nanopartícula La orientación del ARN inmovilizado sobre una nanopartícula puede ser controlada. La estrategia de la inmovilización de los sustratos de ARN para las enzimas Dicer permite el control de acceso a los dúplex. Las diferentes químicas de inmovilización, monotiol ó ditiol y las diferentes longitudes de las secuencias espadadoras, pueden ser utilizados para variar el número y distancia entre los dúplex de ARN controlando así la velocidad de degradación del ARN.
Se han llevado a cabo experimentos para determinar si Dicer, una ARNasa responsable de la iniciación del AR i en éste sistema, podría ser capaz de reconocer y escindir éstos dúplex. En un experimento típico de cinética enzimática, las NPs de Oro-ARN (aproximadamente 5 nM) fueron mezcladas con Dicer (0.1 U/mL, final) en una reacción regulada a 37°C. La velocidad de degradación del dúplex de ARN fue determinada mediante el monitoreo del incremento en la fluorescencia cada 72 segundos durante , por lo menos, 12 horas. Para determinar la fluorescencia mínima y máxima se utilizaron las muestras que no contienen enzima (mínimo) ó 3 mM de cianuro de potasio (KCN) para disolver el oro (máximo) . El KCN oxida las nanopartículas de oro, eliminando el apagamiento de las cadenas etiquetadas con un fluoróforo.
Se determinó el número de dúplex por nanopartícula etiquetando con fluorescencia una de las cadenas y comparando la fluorescencia asociada con una concentración dada de nanaopartículas conjugadas con ARN, con una curva estándar generada usando las mismas cadenas. Los resultados de un estudio de cargas representativo es mostrado en la Tabla 1.
Tabla 1. Determinación de la carga de dúplex de ARN usando dos diferentes estrategias. Los conjugados contienen fluoresceína, tanto en la cadena anti-sentido (hibridizada con la cadena de sentido la cual está covalentemente unida a la nanopartícula) como en el caso del sistema de horquilla. El ARN está etiquetado con fluoresceína en el extremo 5' .
La ARNasa III, una ribonucleasa que es conocida por degradar ARNs de doble cadena, fue comparada con la actividad de Dicer. Ambas, la ARNasa III y Dicer son activas contra los dos sistemas probados y medidos mediante el incremento de la fluorescencia que le antecede (no se agregó enzima a la reacción) con respecto al tiempo. La Figura 6 muestra la actividad en presencia de la ARNasa III.
Cuando cada sistema fue tratado con Dicer de manera similar a la ARNasa III, fue observado un incremento conmensurado en la fluorescencia con respecto al tiempo (Figura 7) . Adicionalmente , la diferencia absoluta en la fluorescencia precedente fue mayor para Dicer en comparación con ARNasa III. Estos datos sugieren que estos ARNs son reconocidos más específicamente por Dicer que por una enzima no-específica como la ARNasa III cuando están densamente inmovilizados en la superficie de la nanopartícula . Además, pueden observarse preferencias en la orientación para la inmovilización de la cadena de sentido vs . La cadena antisentido (Figura 8) . En el caso donde la cadena de sentido está químicamente unida a la partícula se observó una mayor actividad. Sin apegarse a la teoría, esto puede reflejar la habilidad de la cadena anti- sentido para actuar como una cadena guía en la maquinaria del ARNi . Esta diferencia es contemplada para ser usada en la modulación y puesta a punto de la respuesta del ARNi en las células.

Claims (38)

NOVEDAD DE LA INVENCION Habiendo descrito el presente invento, se considera como una novedad y, por lo tanto, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes REIVINDICACIONES
1. Una composición de nanopartículas caracterizada porque incluye: uno o más polinucleótidos de ácido ribonucleico (ARN) en asociación con una nanopartícula; el polinucleótido de ARN que tiene un sitio de interacción con un polipéptido; el polinucleótido de ARN que tiene una secuencia que forma un dúplex bajo condiciones apropiadas para formar el dúplex; el dúplex que tiene por lo menos un dominio en una cadena simple del dúplex suficientemente complementaria para una secuencia en un polinucleótido seleccionado para permitir la hibridización de la cadena simple con el polinucleótido elegido bajo condiciones apropiadas y la hibridización del dominio del dúplex con la secuencia del polinucleótido elegido para crear un sitio de sustrsto reconocido por un polipéptido; y el polinucleótido de ARN asociado con la nanopartícula en una orientación específica con respecto al sitio de interacción del polipéptido y la nanopartícula .
2. La composición de nanopartículas de la reivindicación 1, caracterizada porque el polinucleótido de AR está asociado covalentemente con la nanopartícula.
3. La composición de nanopartículas de la reivindicación 1, caracterizada porque el polinucleótido de ARN no está en asociación covalente con la nanopartícula.
4. La composición de nanopartículas de la reivindicación 1, caracterizada porque cada polinucleótido de ARN en asociación con la nanopartícula tiene una secuencia idéntica.
5. La composición de nanopartículas de la reivindicación 1, caracterizada porque cuando menos dos polinucleótidos de ARN en asociación con la nanopartícula tienen diferentes secuencias .
6. La composición de nanopartículas de la reivindicación 1, caracterizada porque el dúplex consiste de una estructura de horquilla formada por el polinucleótido de ARN.
7. La composición de nanopartículas de la reivindicación 1, caracterizada además porque incluye un polinucleótido adicional que tiene una secuencia suficientemente complementaria para una secuencia el polinucleótido de ARN para permitir la hibridización con el polinucleótido de ARN bajo condiciones apropiadas para formar el dúplex.
8. La composición de nanopartículas de la reivindicación 7, caracterizada porque el polinucleótido adicional es ARN.
9. La composición de nanopartículas de la reivindicación 7, caracterizada porque el polinucleótido adicional es ácido desoxiribonucleico (ADN) .
10. La composición de nanopartículas de la reivindicación 7, caracterizada porque el polinucleótido adicional está covalentemente asociado con la nanopartícula .
11. La composición de nanopartículas de la reivindicación 7, caracterizada porque el polinucleótido adicional no está covalentemente asociado con la nanopartícula.
12. La composición de nanopartículas de la reivindicación 1, caracterizada porque el sitio de interacción del polipéptido está localizado próximo a la nanopartícula con respecto al punto medio del polinucleótide de ARN.
13. La composición de nanopartículas de la reivindicación 1, caracterizada porque el sitio de interacción del polipéptido está localizado alejado de la nanopartícula con respecto al punto medio del polinucleótide de ARN.
14. La composición de nanopartículas de la reivindicación 1, caracterizada porque tiene una densidad de superficie de ARN de por lo menos 2 pmol/cm2 a 1000 pmol/cm2.
15. La composición de nanopartículas de la reivindicación 1, caracterizada porque el sitio de interacción del polipéptido se asocia con una proteína seleccionada del grupo que consiste de ARNasa H, ARNasa D, ARNasa L, AR asa III, Dicer, Argonauta, Argonauta 2 y virus de inmunodeficiencia humana que transactivan la respuesta a una proteína unida al ARN (TRPU) .
16. La composición de nanopartículas de la reivindicación 1, caracterizada porque el dominio del polinucleótido tiene cerca de 10 nucleótidos de longitud.
17. La composición de nanopartículas de la reivindicación 16, caracterizada porque el polinucleótido de ARN incluye además un segundo dominio suficientemente complementario para una segunda secuencia en el polinucleótido elegido y la hibridización del segundo dominio del polinucleótido de ARN con la segunda secuencia en el polinucleótido elegido crea un sitio del sustrato adicional reconocido por un segundo polipéptido.
18. La composición de nanopartículas de la reivindicación 17, caracterizada porque el segundo dominio del polinucleótido tiene cerca de 10 nucleótidos de longitud.
19. La composición de nanopartículas de la reivindicación 17, caracterizada porque el sitio del sustrato y el sitio del sustrato adicional son iguales.
20. La composición de nanopartículas de la reivindicación 17, caracterizada porque el sitio del sustrsto y el sitio del sustrato adicional son diferentes.
21. La composición de nanopartículas de la reivindicación 7, caracterizada porque el polinucleótido de ARN y el polinucleótido adicional son complementarios entre sí sobre una longitud suficiente para permitir la hibridizacion.
22. La composición de nanopartículas de la reivindicación 21, caracterizada porque el polinucleótido de ARN y el polinucleótido adicional son complementarios entre sí en toda su longitud.
23. La composición de nanopartículas de la reivindicación 1, caracterizada porque el polinucleótido de ARN está conjugado con la nanopartícula mediante un enlace tiol.
24. La composición de nanopartículas de la reivindicación 1, caracterizada porque el polinucleótido de ARN tiene una vida media que es por lo menos substancialmente la misma ó idéntica a la vida media del polinucleótido de ARN que no está asociado con una nanopartícula.
25. La composición de nanopartículas de la reivindicación 1. caracterizada porque el polinucleótido de ARN tiene una vida media que es aproximadamente una vez mayor, dos veces mayor, tres veces mayor, cuatro veces mayor, cinco veces mayor o más que la vida media de un ARN idéntico que no está asociado con una nanopartícula.
26. La composición de nanopartículas de la reivindicación 1. caracterizada porque el polinucleótido de ARN tiene cerca de 5 a 100 nucleótidos de longitud.
27. La composición de nanopartículas de la reivindicación 7. caracterizada porque el polinucleótido adicional tiene cerca de 5 a 100 nucleótidos de longitud.
28. La composición de nanopartículas de la reivindicación 1, caracterizada porque es una de nanopartículas de oro.
29. La composición de nanopartículas de la reivindicación 1, caracterizada porque es una de nanopartículas de plata.
30. Un método que asocia un polinucleótido de ARN con una nanopartícula caracterizado porque comprende la etapa de envejecimiento de una mezcla de dúplex de polinucleótido de ARN tiolado con la nanopartícula en series de soluciones para asociar al polinucleótido de ARN con la nanopartícula, cada solución comprende un incremento en la concentración de cloruro de sodio (NaCl) en relación con la solución previa comenzando con una primera solución que contiene NaCl aproximadamente 0.1 M.
31. El método de la reivindicación 30, caracterizado porque comprende además la etapa de sonicación de la mezcla después de la última etapa de envejecimiento.
32. El método de la reivindicación 30 ó 31, caracterizado porque comprende además la etapa de aislamiento de las nanopartículas .
33. Un método de asociación de un ARN a una nanopartícula caracterizado porque comprende: (a) mezcla de un dúplex de AR tiolado con la nanopartícula en una solución que contiene cloruro de sodio (NaCl) aproximadamente 0.1 M; (b) envejecimiento de la mezcla en series de soluciones salinas cada una conteniendo un incremento en la concentración de NaCl en relación con la solución previa; (c) sonicación de la mezcla; y (d) purificación de las partículas conjugadas.
34. El método de la reivindicación 33, caracterizado porque las series de solución salina (NaCl) varían de 0.1 M a 0.3 M aproximadamente .
35. El método de la reivindicación 33, caracterizado porque comprende además la pasivación de la superficie de la nanopartícula con oligo (etilenglicol) tiol (OEG) .
36. Un método de regulación de la expresión de un polinucleótido fijado como objetivo caracterizado porque incluye la etapa de hibridización del polinucleótido fijado como objetivo con el dominio de la composición de nanopartículas de la reivindicación 1 para formar un sitio del sustrato para un polipéptido.
37. El método de la reivindicación 36, caracterizado porque la hibridización da como resultado la degradación del polinucleótido seleccionado como objetivo.
38. El método de la reivindicación 37, caracterizado porque el polipéptido es seleccionado del grupo que consiste de AR asa H, ARNasa D, AR asa L, AR asa III, Dicer, Argonauta, Argonauta 2 y TRPU.
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