CN114272391B

CN114272391B - 一种核酸导向的靶rna降解的纳米复合物及其制备方法

Info

Publication number: CN114272391B
Application number: CN202111620471.9A
Authority: CN
Inventors: 李子刚; 尹丰; 姜乐盈; 张亚萍; 刘招弟
Original assignee: Shenzhen Bay Laboratory Pingshan Biomedical R & D And Transformation Center; Peking University Shenzhen Graduate School
Current assignee: Shenzhen Bay Laboratory Pingshan Biomedical R & D And Transformation Center; Peking University Shenzhen Graduate School
Priority date: 2021-12-28
Filing date: 2021-12-28
Publication date: 2023-05-05
Anticipated expiration: 2041-12-28
Also published as: CN114272391A

Abstract

一种核酸导向的靶RNA降解的纳米复合物，包含核糖核酸酶RNaseL的招募基团和特定mRNA靶标的识别序列；纳米复合物的载体为金纳米颗粒；将RNase L的招募基团和特定mRNA靶标的识别序列通过Au‑S配位键随机修饰到载体上。复合物上mRNA识别序列与特定的mRNA靶标互补配对后，将整个纳米结构拉到mRNA附近，随后复合物上的RNaseL招募基团在合适的空间位置随机招募RNaseL的单体成二聚体诱使RNase L活化，最终实现靶标mRNA的降解。本发明中两种活性基团被随机固定在金纳米载体上，且互不干扰，未来可根据靶mRNA的不同，快速更换mRNA的识别序列，实现靶mRNA的选择性降解。

Description

一种核酸导向的靶RNA降解的纳米复合物及其制备方法

技术领域

本发明属于生物化学领域，涉及一种纳米复合物，具体来说是一种通过激活核糖核酸酶RNase L实现靶标mRNA降解的纳米复合物及其制备方法。

背景技术

蛋白质作为生命功能的重要执行者，其表达失衡是导致疾病的直接原因之一。传统的小分子药物多通过占据蛋白质的关键活性位点或调控中心，实现异常蛋白的功能抑制和下游蛋白的表达阻断。但此类小分子药物的潜在脱靶效应和持续给药方式一直是该领域亟待解决的问题。此外，目前也仅有不足25％的人类蛋白可被小分子药物靶向，这极大限制了可治疾病的种类。

为了解决上述问题，依赖泛素-蛋白酶体系统(Ubiquitin-Proteasome System,UPS)实现靶蛋白降解(PROTAC，Proteolysis Targeting Chimeras)的概念被提出。PROTAC最大的优势在于不再依赖于配体与蛋白的强相互作用，使得很多与靶标仅有弱相互作用的药物具备了成药可能。借助该技术发展的药物，使得可靶向的蛋白范围得到进一步拓展。尽管如此，目前仍有大部分致病蛋白不可被靶向。与此同时，Encode(Encyclopedia of DNAElements)项目的数据显示，仅有1％-2％的人类基因组可编码蛋白质，但有70％-80％的基因组被转录成了RNA。目前已有大量数据证实，在整个生命过程中，RNA也扮演着重要的角色，它们的转录失调可诱导多种疾病的发生。例如，在缺氧的癌细胞中microRNA-210过表达，诱导细胞外基质重塑，导致肿瘤细胞迁移能力增强。

RNA作为蛋白质的翻译模板，其转录异常是疾病的最根本致病机制，因此直接靶向RNA的疗法有望为直接或间接治疗多种疾病提供可行方案。目前，靶向致病蛋白上游mRNA的主要方式之一是设计一段与靶标mRNA互补的反义寡核苷酸(ASO)，通过占据蛋白翻译位点，实现蛋白表达抑制。此外，该ASO还可通过激活胞内核糖核酸酶RNase H，诱导靶RNA的直接降解。在此基础上，2018年Matthew D.Disney借鉴PROTAC想法，提出了一种新型诱导RNA降解的RIBOTAC(Ribonuclease Targeting Chimeras，核糖核酸酶靶向嵌合体)技术。该技术中，作者将核糖核酸酶RNase L的招募基团和靶向RNA的小分子以特定长度的linker连接，通过有效招募并激活RNase L，实现了microRNA前导分子(如pri-miR-96)的降解。与PROTAC不同的是，RIBOTAC分子招募的降解酶是一类核酸酶RNase L，降解靶标由原来的蛋白变更为核酸。基于此设计，近期有研究者将可靶向冠状病毒SARS-CoV-2基因的反义寡核苷酸ASO与RNase L招募基团连接，有效降低了E型蛋白和S型蛋白的表达，显著抑制了新型冠状病毒的增殖和侵染。综上所述，RIBOTAC分子相较传统的小分子或ASO药物，表现出更强的生物活性，有望为开发可靶向致病核酸的新型药物提供一种更安全、更有效的方法。

以上研究均表明，通过靶向诱导RNA降解，有望为疾病治疗提供新的可行方案。但无论是PROTAC还是RIBOTAC，linker的种类和长度对药效的发挥至关重要。合适的linker长度，保证了降解酶与靶标分子之间具有合适的空间距离，便于靶标分子被高效降解。然而，linker长度和种类的筛选无疑是一件时间和资源耗费极大的工作。此外，因linker两端的连接基团数量限制，目前大多数蛋白酶招募基团和靶标识别基团的价态比被局限为1:1，这意味着每次此类分子发挥作用，仅能降解一个靶标。如何解决上述问题，降低成本和时间消耗是未来PROTAC和RIBOTAC技术均需面临的重要挑战。

就上述问题，本发明受启发于RIBOTAC的概念，提出了一种核酸导向的靶RNA降解的纳米复合物的制备方法及应用。

发明内容

针对现有靶向RNA降解技术中存在的问题，本发明提出了一种核酸导向的靶RNA降解的纳米复合物的制备方法及应用，用于解决传统PROTAC和RIBOTAC技术中针对不同靶标需要筛选不同linker长度和种类的技术问题。

本发明提供了一种核酸导向靶RNA降解的纳米复合物，

1)包含核糖核酸酶RNaseL的招募基团和特定mRNA靶标的识别序列；

2)该纳米复合物的载体为金纳米颗粒；

3)步骤1)中的招募基团和特定mRNA靶标的识别序列通过Au-S配位键随机修饰到步骤2)的载体上。

进一步的，所述的一种特定mRNA靶标的识别序列的结构特征为：

1)一条单链寡核苷酸，用于与靶标mRNA互补配对。

2)磷酸骨架进行硫代修饰，并含有用于与金纳米载体连接的3’端巯基修饰。同时对序列中UNN核苷酸的核糖2位羟基进行氧甲基化修饰(N为随机碱基)，目的是避免激活后的RNaseL将mRNA的识别序列降解。

进一步的，所述的核糖核酸酶RNase L的招募基团，其结构特征为：

1)含有4个5’-2’腺嘌呤的头部用于激活RNase L；

2)含有用于与金纳米载体连接的2’端巯基修饰，并随之提供10个PO₃的space间隔长度，支撑末端5’-2’腺嘌呤的头部凸出在纳米复合物的表面上，以便于RNase L的招募。

进一步的，所述的核酸靶向目标核酸降解的纳米复合物制备方法，包括如下步骤：

1)一个制备特定mRNA靶标识别序列的步骤。通过查询NCBI获得靶RNA的cDNA序列。通过RNA Folding Form在线公开软件(http://www.unafold.org/mfold/applications/rna-folding-form.php)模拟靶RNA的二级结构，根据RNA的二级结构特征设计合适的ASO序列，要求ASO结合在RNA二级结构中的发卡环区，且在环区附件有凸出的UNN序列，即UNN凸环区，N为随机序列，便于为RNase L提供可切割的位点，最后将筛选获得的ASO序列的磷酸骨架进行硫代修饰，同时在其3’末端引入C6巯基修饰，用于与纳米金形成Au-S配位连接，此外，对该序列中UNN核苷酸的五碳糖2位羟基进行氧甲基化(OMe)修饰，避免激活的RNase L切割识别序列本身；

2)一个制备核糖核酸酶RNaseL招募基团的步骤，合成激活RNaseL的5’-2’PolyA4，通过核糖5’位与下一个核糖2’位的磷酸二酯键连接的4个腺嘌呤核糖核苷酸形成的RNA短链，该序列的2’末端引入C6巯基修饰，用于与纳米金形成Au-S配位连接，随后提供10个PO₃的space间隔长度，支撑5’-2’腺嘌呤的头部凸出在纳米复合物的表面上，便于招募RNase L单体；

3)一个制备复合物的步骤，对Au NPs(金纳米颗粒)进行预处理后，加入步骤1)中靶向特定mRNA的识别序列和步骤2)的RNase L的招募基团；放置过夜后，向体系中逐步加入NaCl进行老化，借助盐的离子特性屏蔽纳米金和两条核酸链之间的负电荷斥力，实现靶向特定mRNA的识别序列和RNase L的招募基团在纳米金表面上的随机修饰。通过RT-PCR评估细胞内靶mRNA的降解情况和RNaseL的升高情况，确定纳米复合物的有效性。

本发明设计了一种通过激活核糖核酸酶RNase L降解特定mRNA的纳米复合物；将RNase L的招募基团和mRNA的识别序列同时随机修饰到纳米载体上。该复合物上mRNA识别序列与特定的mRNA靶标互补配对后，将整个纳米结构拉近到mRNA附近，随后复合物上的RNase L招募基团在合适的空间位置随机招募并激活核糖核酸酶RNase L，最终实现靶标mRNA的降解。

本发明将RNase L的招募基团和mRNA的识别序列同时随机修饰到一种纳米载体的表面上。整个设计巧妙避开了常规PROTAC中连接子的筛选步骤，让机体自主、智能化选择合适的空间位置同时实现靶标的识别和降解。避免RNase L招募基团和特定核酸靶向序列之间共价连接子的种类和长度的优化过程，以及招募基团和靶向序列局限于1:1的设定，实现无linker的、二者比例随意调整的结构设计和宿主自主智能化的靶向降解。此外载体表面修饰的靶RNA招募基团，不再局限于一种。多种RNA招募基团的修饰，可为提高靶RNA的靶标降解能力提供极大便利。依托本发明的设计，仅需根据靶标不同，即可随意更换mRNA的识别序列，可快速将该新型RIBOTAC技术拓展到其他类型靶标的降解中。

本发明可根据需求随意更换mRNA的识别序列，此时本发明的靶标选择范围将不再局限于核酸种类(如microRNA、mRNA、circularRNA等)和核酸来源(内源或外源)。

本发明载体表面大量的靶RNA招募基团，使得结合靶标的数据不再局限于一个。一旦进入细胞，一个纳米载体很有可能同时靶向多个mRNA并激活数个RNase L，这将极大提高药物的靶标降解能力。依托本发明的设计，纳米金上两种识别基团随机修饰互不干扰，后期可根据靶mRNA的不同，快速更换mRNA的识别序列。

本发明和已有技术相比，其技术进步是显著的。本发明可以通过更改ASO序列信息降解不同的RNA。通过RT-PCR证实本发明的设计思路可拓展到不同种类靶标mRNA的降解中，未来有望为由RNA调控的相关疾病的治疗提供新的设计思路和可行治疗方案。本发明提出的RIBOTAC设计有望为靶RNA降解药物的开发提供一个全新的平台，同时还可为PROTAC技术的改进提供可行方案。

附图说明

图1为Au NPs与DNA-Au NPs电荷粒径结果图。(a)Au NPs与DNA-Au NPs粒径柱状图。(b)Au NPs与DNA-Au NPs粒径分布图。(c)Au NPs与DNA-AuNPs电位柱状图。(d)Au NPs与DNA-Au NPs电位分布图。

图2为Au NPs与DNA-Au NPs透射电镜结果图。

图3为mRNA识别基团ASO及RNase L招募基团PolyA4成功连接上纳米金载体的高效液相色谱验证图。(a)RNA-AuNPs复合物还原过程的示意图。(b)Au-A4经还原后，A4分子的HPLC结果图。(c)Au-ASO经还原后，ASO分子的HPLC结果图。(d)Au-ASO-A4经还原后，A4和ASO分子的HPLC结果图。

图4为ASO和A4的浓度与HPLC峰面积相对应的标准曲线图。

图5为不同配比的ASO与A4投药量对应的Au NPs上的实际修饰比。

图6为Au-ASO-A4纳米复合物诱导EGFR mRNA降解的结果图。(a)给药48h后EGFR基因表达情况结果图。(b)给药48h后RNase L基因表达情况结果图。(c)给药72h后EGFR基因表达情况结果图。(d)给药72h后RNase L基因表达情况结果图。

图7为Au-ASO-A4纳米复合物诱导OVA mRNA降解的RT-PCR结果图。

图8为本发明的原理图。

具体实施方式

下面结合附图对本发明进一步说明。

实施例1

本发明将核酸酶招募基团和特定mRNA靶标的识别序列通过Au-S配位键随机修饰到纳米金载体上，制备获得一种球型纳米复合物。该复合物上mRNA识别序列与特定的mRNA靶标互补配对后，可将整个纳米结构拉到mRNA附近，随后复合物上的RNase L招募基团在合适的空间位置随机招募并激活RNase L，最终实现靶标mRNA的降解。(如图8所示)。

本发明提供了一种核酸导向的目标核酸降解的纳米复合物，

1)包含一种核糖核酸酶RNase L的招募基团和一种特定mRNA靶标的识别序列；

2)该纳米复合物的载体为Au NPs(金纳米颗粒)；

1)一条单链寡核苷酸，用于与靶标mRNA互补配对。

2)为了提高识别序列的酶稳定性，需要对识别序列的主链进行硫代修饰，同时对序列为UNN碱基核苷酸的核糖2位羟基进行氧甲基化修饰，避免激活的RNase L将mRNA的识别序列降解。

进一步的，所述的核酸降解酶RNase L的招募基团，其结构特征为：

1)含有4个5’-2’腺嘌呤的头部用于招募并激活RNase L；

2)含有用于与Au连接的2’端巯基修饰，并随之提供10个PO₃的space间隔长度，支撑末端5’-2’腺嘌呤的头部凸出在纳米复合物的表面上。

为了验证上述设计的可行性，本发明以OVA(鸡卵清蛋白)和EGFR(表皮生长因子受体)为例进行详细说明。首先设计获得靶向两种蛋白mRNA的ASO序列，并选用5’-2’A4作为RNase L(核糖核酸酶)的招募基团。采用传统的加盐老化方法将上述带有末端巯基修饰的两类核酸分子与载体(金纳米颗粒)连接。用DTT(二硫苏糖醇)还原和HPLC鉴定策略，确定ASO和PolyA4可同时被修饰到纳米金上。随后通过系统的细胞实验，证实该纳米复合物可有效降解OVA和EGFR的mRNA。

实施例2反义寡核苷酸的设计

采用传统的反义寡核苷酸设计方法获得需要的ASO序列信息。

表一为本发明中涉及到的RNA序列信息(实施例6和例7中的ASO序列分别为anti-OVA和anti-EGFR)

备注：1)HS代表3’端带有C6巯基修饰。2)5’-2’-PolyA4-HS核酸骨架由核糖5’位与下一个核糖2’位形成的磷酸二酯键相连。

具体操作步骤为：

(1)查询NCBI获得靶RNA的cDNA序列(序列信息提供在实施例6和实施例7中)。

(2)通过RNA Folding Form在线公开软件(http://www.unafold.org/mfold/applications/rna-folding-form.php)模拟靶RNA的二级结构。

(3)根据RNA的二级结构特征设计合适的ASO序列，要求ASO结合在RNA二级结构中的发卡环区，且在环区附件有凸出的UNN序列(N为随机序列)，即UNN凸环区，便于为RNase L提供切割位点。

(4)最后将筛选获得的ASO序列的磷酸骨架进行硫代修饰，同时在其3’末端引入C6巯基修饰，用于与纳米金形成Au-S配位连接。此外，对该序列中的UNN碱基进行氧甲基化(OMe)修饰，避免激活的RNase L切割识别序列本身。

实施例3 RNase L招募基团2’-5’-Poly A4的设计

合成激活RNaseL的5’-2’PolyA4(通过核糖5’位与下一个核糖2’位的磷酸二酯键连接4个腺嘌呤核糖核苷酸形成的RNA短链)，含有用于与Au连接的2’端巯基修饰，并随之提供10个PO₃的space间隔长度，支撑末端5’-2’腺嘌呤的头部凸出在纳米复合物的表面上。

实施例4 RNA-Au NPs复合物的制备

(1)在RNA与Au NPs连接之前，需要对Au NPs进行预处理。具体操作步骤如下：向1mL AuNPs(金纳米颗粒)中加入10μL 20mg/mL的BSPP(双(对磺酰苯基)苯基膦)，室温避光12h后，12000rpm离心10min后去上清。随后用1mL无菌无酶水重悬纳米金，并向体系中加入总浓度为1μM的RNA，于室温避光过夜。

(2)随后向上述混合溶液中分六次逐步加入5M NaCl，每次间隔1h。使得每次加完后体系中NaCl的浓度依次为50mM、100mM、150mM、200mM、250mM和300mM。最后一次加入完成后室温避光过夜。

(3)12000rpm 25℃离心10min去上清，并用100μL无菌无酶水重悬，通过Nanodrop测定Au NPs浓度。

为了确定核酸是否成功被修饰到纳米金的表面，本发明利用马尔文激光粒度仪测量了AuNPs与DNA-Au NPs的电位和粒径，并使用透射电镜(TEM)对其微观形貌进行表征。如图1所示，加入DNA后，纳米复合物的粒径与电位相比于Au NPs均有增加。图2中的TEM表征结果显示，经过DNA修饰后，Au NPs的表面有一层透明的膜，进一步证实了DNA有效连接到了金纳米载体上。

实施例5 ASO与A4在载体上修饰比例的确定

体系中投入的核酸并非被完全修饰到纳米金的表面，为了准确评估载体表面上RNaseL招募基团和靶标识别基团的比例，本发明用HPLC定量的方法进行了评估(图3a)。具体操作如下：向1mL的RNA-Au NPs复合物中加入50μL100mM的DTT，37℃处理16h，将金载体上修饰的核酸还原下来。随后12000rpm离心10min去除上清。上清液用HPLC自动分析(图3b-d)。借助A4和ASO单链的标准定量曲线(图4)，计算修饰到纳米金上的A4或ASO的比例。图5结果显示，当ASO与A4投药比为1:1、2:1和3:1时，实际修饰比分别为0.74:1、2.13:1和2.41:1。

实施例6纳米复合物靶向诱导EGFR基因的mRNA降解

为了证明本发明构建的纳米复合物具有良好的核酸靶向降解效果。我们将ASO序列设计成为靶向EGFRmRNA(SEQ ID NO.1所示)的序列。按照上述步骤获得RNA-Au NPs复合物。随后将其与A549细胞分别孵育48h和72h。RT-PCR鉴定EGFR mRNA的转录情况。由图6结果可知，RNA-Au NPs组的EGFR mRNA水平下降，同时该组的RNase L mRNA的含量增加，预示着RNase L的有效激活和EGFRmRNA的有效降解，证实本发明构建的基于纳米载体的RIBOTAC策略切实可行。

表二为本发明中涉及到的RT-qPCR引物的序列信息

实施例7纳米复合物靶向诱导OVA基因mRNA降解

为了进一步证明本发明构建的方法具有普适性，我们将靶向EGFR的ASO序列，替换为可靶向OVAmRNA(SEQ ID NO.2所示)的序列。按照上述同样的方法制备获得RNA-Au NPs。将该复合物与B16-OVA细胞共孵育48h后，RT-PCR鉴定OVA基因的转录情况。由图7结果可知，RNA-Au NPs有效降解了OVA基因的mRNA，其降解效果明显优于单独的ASO给药组，证实了本发明的通用性。未来有望拓展到其他功能异常mRNA的降解中，为疾病治疗提供新的策略。

Claims

1.一种核酸导向的靶RNA降解的纳米复合物，其特征在于，

2)该纳米复合物的载体为金纳米颗粒；

3)步骤1)中的招募基团和特定mRNA靶标的识别序列通过Au-S配位键随机修饰到步骤2)的载体上；

所述的特定mRNA靶标的识别序列的结构特征为：

1)一条单链寡核苷酸，用于与靶标mRNA互补配对；

2)识别序列的磷酸骨架进行硫代修饰，并含有用于与纳米金载体连接的3’端巯基修饰，同时对序列中UNN核苷酸的核糖2位羟基进行氧甲基化修饰，N为随机碱基；

所述的核糖核酸酶RNase L的招募基团的结构特征为：

1)含有4个5’-2’腺嘌呤的头部，用于招募并激活RNase L；

2)含有用于与纳米金载体连接的2’端巯基修饰，并随之提供10个PO₃的space间隔长度，支撑末端5’-2’腺嘌呤的头部凸出在纳米复合物的表面上。

2.权利要求1所述的核酸导向的靶RNA降解的纳米复合物的制备方法，其特征在于包括如下步骤：

1)一个制备特定mRNA靶标识别序列的步骤，查询NCBI获得靶RNA的cDNA序列，通过RNAFolding Form在线公开软件模拟靶RNA的二级结构，根据RNA的二级结构特征设计ASO序列，所述的ASO序列结合在RNA二级结构中的发卡环区，要求该发卡环区附近有凸出的UNN序列，即凸环区，其中N为随机碱基，便于为RNase L提供可作用的切割位点，最后将筛选获得的ASO序列的磷酸骨架进行硫代修饰，同时在其3’末端引入C6巯基修饰，用于与纳米金形成Au-S配位键，同时对该序列中UNN核苷酸的五碳糖2位羟基进行氧甲基化修饰，避免激活的RNase L切割识别序列本身；

2)一个制备核糖核酸酶RNaseL招募基团的步骤，合成可激活RNaseL的5’-2’PolyA4，通过核糖5’位与下一个核糖2’位的磷酸二酯键连接4个腺嘌呤核糖核苷酸形成的RNA短链，该序列含有用于与纳米金载体连接的2’端巯基修饰，并随之提供10个PO₃的space间隔长度，用于支撑末端5’-2’腺嘌呤的头部凸出在纳米复合物的表面上；

3)一个制备复合物的步骤，对Au NPs进行预处理后，加入步骤1)中靶向特定mRNA的识别序列和步骤2)中RNase L的招募基团；放置过夜后，向体系中逐步加入NaCl进行老化，借助盐的离子特性屏蔽纳米金和两条核酸链之间的负电荷斥力，将靶向特定mRNA的识别序列和RNase L的招募基团随机修饰在金纳米球表面上。