CN115010669B - 一种核糖核酸酶靶向嵌合物工具及其制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

一种核糖核酸酶靶向嵌合物工具及其制备方法和应用，包括如式（1）所示的TGP210‑PQ和如式（2）所示的A4‑VE；本发明构建的光敏型核糖核酸酶靶向嵌合物工具的两个前体相较于原体系具有更小的分子量，细胞渗透率更高，能更好地发挥靶向降解胞内RNAs的功效。在可见光的驱动下，可实现时空分辨精细化调控的功能。

Description

一种核糖核酸酶靶向嵌合物工具及其制备方法和应用
技术领域
本发明属于化学生物学领域，具体涉及一种通过可见光驱动降解内源性RNA的核糖核酸酶靶向嵌合物工具(RIBOTAC)及其制备方法及应用。
背景技术
miRNAs可通过碱基配对识别目标mRNAs后抑制其翻译，许多生理与病理性行为都与体内miRNA对基因的调控有关。核糖核酸酶靶向嵌合体(RIBOTACs)是一种特异性靶向并降解细胞内RNAs的功能小分子，它主要由可靶向RNA的小分子配体和可招募核糖核酸酶的配体构成，通过邻位效应引起目标RNA的降解。近年来，利用特异性靶向Pri-/Pre-miRNA的特定配体，已经构建出各种形式的RIBOTACs工具。然而，由于缺少有效的外界控制手段，该工具很难对特定部位实现精细化调控。而且，较大的分子量(>2kDa)也影响了它被细胞的摄取。因此，新型的时空可控的核糖核酸酶靶向嵌合物工具亟待开发。
可见光驱动邻二酮与乙烯基醚生物正交环加成反应(DVPC)是一种由可见光引发的9,10- 菲醌(PQ)和乙烯基醚(VE)分子之间的生物正交环加成反应。由于其高反应动力学和高选择性，DVPC已被成功地应用于活细胞的蛋白质标记。借助这一理念，我们对靶向miRNA前体与RNase的配体分别用PQ与VE进行修饰，构建新型的核糖核酸酶靶向嵌合物工具。一方面，拆分的部分分子量较小，拥有更好的细胞渗透率；另一方面，可通过DVPC引发前体在细胞内组装，利用可见光精细化调控特定部位miRNA前体的降解。
发明内容
解决的技术问题：本发明提供一种核糖核酸酶靶向嵌合物工具及其制备方法和应用，适用于精细化时空分辨降解细胞内RNAs的效果。
技术方案：一种核糖核酸酶靶向嵌合物工具，包括如式(1)所示的TGP210-PQ和如式 (2)所示的A4-VE：
核糖核酸酶靶向嵌合物工具的制备方法，所述TGP210-PQ的制备步骤为：通过乙二胺作为连接基团先修饰PQ分子，在末端引入氨基；再通过TGP210末端的羧基与PQ末端的氨基以酰胺缩合反应得到小分子TGP210-PQ；所述A4-VE的制备步骤为：通过对硝基苯基乙烯氧基乙基碳酸酯与2’5’A4末端的氨基反应得到产物A4-VE。
上述TGP210-PQ的制备步骤为：将0.2mmol TGP210、0.25mmol DCC、0.25mmol NHS溶于10毫升THF中，并在室温下搅拌12小时；反应完成后，过滤混合物以除去白色沉淀物，浓缩滤液以得到中间粗产物；然后，将中间粗产物溶解在10毫升四氢呋喃中，接着加入9,10-菲醌。0.2mmol和DIPEA0.6mmol；反应在室温下继续进行5小时，当起始物质消失后，真空除去溶剂，用HPLC纯化混合物，得到产物TGP210-PQ。
上述A4-VE的制备步骤为：通过核酸合成仪合成2’5’A4，将4-硝基苯基(2-(乙烯氧基) 乙基)碳酸酯溶于DMSO，作为浓度为5mM储备溶液；将A4同样溶解在DMSO中，然后加入4-硝基苯(2-(乙烯氧基)乙基)碳酸酯储备溶液，反应混合物在25℃下振荡12小时，用HPLC纯化粗品，得到产物A4-VE。
上述核糖核酸酶靶向嵌合物工具在通过可见光降解Pre-miR210中的应用。
上述核糖核酸酶靶向嵌合物工具在制备抑制肿瘤药物中的应用。
具体来说，本发明采用化学方法制备光敏型核糖核酸酶靶向嵌合物工具并将其运用于可见光调控时空分辨降解细胞内RNAs。
(一)光敏型核糖核酸酶靶向嵌合物工具的制备
TGP210-PQ的制备：通过乙二胺作为连接基团先修饰PQ分子，在末端引入氨基。再通过TGP210末端的羧基与PQ末端的氨基以酰胺缩合反应得到小分子TGP210-PQ。
A4-VE的制备：通过对硝基苯基乙烯氧基乙基碳酸酯与2’5’A4末端的氨基反应得到产物 A4-VE
(二)光敏型核糖核酸酶靶向嵌合物工具对Pre-miR-210的体外降解
将Pre-miR-210的5’与3’端分别修饰FAM与BHQ基团，制备该荧光共振能量转移探针测试Pre-miR-210的降解效率。通过可见光驱动诱发光点击反应，在邻位效应的作用下降解靶向的Pre-miR-210，并通过酶标仪分析降解效率。
(三)光敏型核糖核酸酶靶向嵌合物工具降解肿瘤细胞内Pre-miR-210从而抑制肿瘤生长的应用
将光敏型核糖核酸酶靶向嵌合物工具的两个前体与MDA-MB-231细胞孵育。随后，通过可见光诱发光生物正交反应，通过q-PCR实验检测肿瘤细胞内Pre-miR-210降解效率，通过 MTT实验检测肿瘤细胞凋亡效率。
有益效果：本发明构建的光敏型核糖核酸酶靶向嵌合物工具的两个前体相较于原体系具有更小的分子量，细胞渗透率更高，能更好地发挥靶向降解胞内RNAs的功效。在可见光的驱动下，可实现时空分辨精细化调控的功能。
附图说明
图1为TGP210-PQ的制备方法；
图2为A4-VE的制备方法；
图3a为TGP210-PQ的核磁表征图；
图3b为TGP210-PQ的核磁表征图；
图3c为TGP210-PQ的液相质谱表征图；
图4为A4-VE的质谱表征图；
图5为光敏型核糖核酸酶靶向嵌合物工具处理Pre-miR-210的降解效率随光照时间与孵育时间的变化图；
图6为光敏型核糖核酸酶靶向嵌合物工具处理MDA-MB-231细胞后，内源性Pre-miR-210 的降解效率随光照时间的变化图；
图7为光敏型核糖核酸酶靶向嵌合物工具处理后MDA-MB-231细胞的凋亡率。
具体实施方式
实施例1、光敏型核糖核酸酶靶向嵌合物工具的制备
TGP210-PQ的制备：
如图1所示，将TGP210(0.2mmol)、DCC(0.25mmol)、NHS(0.25mmol)溶于10毫升THF中，并在室温下搅拌12小时。反应完成后，过滤混合物以除去白色沉淀物，浓缩滤液以得到中间粗产物。然后，将中间粗产物溶解在10毫升四氢呋喃中，接着加入1分子 0.2mmol和DIPEA 0.6mmol。反应在室温下继续进行5小时，当起始物质消失后，真空除去溶剂，用HPLC纯化混合物，得到产物TGP210-PQ。
A4-VE的制备：
如图2所示，通过核酸合成仪合成2’5’A4。将4-硝基苯基(2-(乙烯氧基)乙基)碳酸酯溶于DMSO，作为储备溶液(浓度为5mM)。将A4同样溶解在DMSO中，然后加入4-硝基苯(2-(乙烯氧基)乙基)碳酸酯储备溶液。反应混合物在25℃下振荡12小时。用HPLC 纯化粗品，得到产物A4-VE。
实施例2、光敏型核糖核酸酶靶向嵌合物工具的表征
TGP210-PQ与A4-VE的表征：
TGP210-PQ：如图3a、图3b和图3c，通过核磁与液相质谱进行表征；
A4-VE：如图4，通过基质辅助激光解析电离飞行时间质谱进行表征。
实施例3、光敏型核糖核酸酶靶向嵌合物工具通过可见光体外降解Pre-miR210
通过核酸合成仪合成5’端有FAM修饰的、3’端有BHQ修饰的Pre-miR-210(5’FAM/3’BHQ Pre-miR-210)。
将100nM 5’FAM/3’BHQ Pre-miR-210在1×RNase L缓冲液中在60℃下折叠5min，并慢慢冷却至室温。折叠后，补充10mM MgCl2，7mMβ-巯基乙醇和50mM的ATP。接着，在 1×RNase L缓冲液中制备50nM的RNase L和100nM的TGP210-PQ与1μM A4-VE，并加入至上述RNA溶液中。用420nm的光(80mW/cm2)照射样品0-10min。然后将样品转移到96 孔板上，在室温下孵化至规定的时间点后，用酶标仪测量荧光强度(Ex：485nm，Em：525nm)。实施例4、核糖核酸酶靶向嵌合物工具通过可见光调控降解肿瘤细胞内源性Pre-miR210从而抑制肿瘤生长的应用
光敏型核糖核酸酶靶向嵌合物工具处理MDA-MB-231细胞后，内源性Pre-miR-210的降解效率随光照时间的变化：
MDA-MB-231细胞被播种在12孔板上。在达到～80％汇合度并在缺氧条件下(1％O2) 处理48小时后，用TGP210-PQ(500nM)、A4-VE(50μM)处理细胞。4小时后，用0-20min 的420nm光照射(80mW/cm2)来照射细胞。72小时后，用PBS清洗细胞三次，并根据制造商的说明用TRIZOL试剂分离总RNA。然后对样品进行逆转录，用Applied Biosystem 7300 Real-timePCR系统进行定量，分析Pre-miR-210的水平。GAPDH被用来作为内参。
光敏型核糖核酸酶靶向嵌合物工具处理后MDA-MB-231细胞的凋亡率：
将MDA-MB-231细胞以每孔5000个细胞的浓度播种在96孔板中。在缺氧条件下(1％O2) 培养48小时后，用TGP210-PQ(500nM)和A4-VE(50μM)处理细胞。4小时后，用或不用20分钟的420nm光照射(80mW/cm2)来照射细胞。培养72小时后，每孔加入20μL的MTT溶液(最终浓度：1mg/mL)。然后，在培养4小时后加入150μL DMSO，并在490nm处测量吸光度以表示细胞活力。
上述具体实施方式不以任何形式限制本发明的技术方案，凡是采用等同替换或等效变换的方式所获得的技术方案均落在本发明的保护范围。

Claims (5)

1.一种核糖核酸酶靶向嵌合物工具，其特征在于，由如式(1)所示的TGP210-PQ和如式(2)所示的A4-VE组成：
2.权利要求1所述核糖核酸酶靶向嵌合物工具的制备方法，其特征在于，所述TGP210-PQ的制备步骤为：通过乙二胺作为连接基团先修饰PQ分子，在末端引入氨基得到再通过TGP210末端的羧基与通过乙二胺作为连接基团先修饰的PQ分子末端的氨基以酰胺缩合反应得到小分子TGP210-PQ；所述A4-VE的制备步骤为：通过对硝基苯基乙烯氧基乙基碳酸酯与2’5’A4末端的氨基反应得到产物A4-VE；所述TGP210为所述通过乙二胺作为连接基团先修饰的PQ分子为
所述对硝基苯基乙烯氧基乙基碳酸酯为
所述2’5’A4为/>
3.根据权利要求2所述核糖核酸酶靶向嵌合物工具的制备方法，其特征在于，所述TGP210-PQ的制备步骤为：将0.2mmol TGP210、0.25mmol DCC、0.25mmol NHS溶于10毫升THF中，并在室温下搅拌12小时；反应完成后，过滤混合物以除去白色沉淀物，浓缩滤液以得到中间粗产物；然后，将中间粗产物溶解在10毫升四氢呋喃中，接着加入通过乙二胺作为连接基团先修饰的PQ分子0.2mmol和DIPEA0.6mmol；反应在室温下继续进行5小时，当起始物质消失后，真空除去溶剂，用HPLC纯化混合物，得到产物TGP210-PQ。
4.根据权利要求2所述核糖核酸酶靶向嵌合物工具的制备方法，其特征在于，所述A4-VE的制备步骤为：通过核酸合成仪合成2’5’A4，将对硝基苯基乙烯氧基乙基碳酸酯溶于DMSO，作为浓度为5mM储备溶液；将2’5’A4同样溶解在DMSO中，然后加入对硝基苯基乙烯氧基乙基碳酸酯储备溶液，反应混合物在25℃下振荡12小时，用HPLC纯化粗品，得到产物A4-VE。
5.权利要求1所述核糖核酸酶靶向嵌合物工具在制备抑制肿瘤药物中的应用。
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Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN105420239A (zh) * 2015-10-29 2016-03-23 南京大学 可发生光点击化学反应的小分子rna及其制备方法和应用
WO2018098297A1 (en) * 2016-11-28 2018-05-31 The Scripps Research Institute Precise small molecule recognition of a toxic cug rna repeat expansion
WO2019209975A1 (en) * 2018-04-24 2019-10-31 The Scripps Research Institute Small molecule targeted recruitment of a nuclease to rna
CN114272391A (zh) * 2021-12-28 2022-04-05 深圳湾实验室坪山生物医药研发转化中心 一种核酸导向的靶rna降解的纳米复合物及其制备方法

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN105420239A (zh) * 2015-10-29 2016-03-23 南京大学 可发生光点击化学反应的小分子rna及其制备方法和应用
WO2018098297A1 (en) * 2016-11-28 2018-05-31 The Scripps Research Institute Precise small molecule recognition of a toxic cug rna repeat expansion
WO2019209975A1 (en) * 2018-04-24 2019-10-31 The Scripps Research Institute Small molecule targeted recruitment of a nuclease to rna
CN114272391A (zh) * 2021-12-28 2022-04-05 深圳湾实验室坪山生物医药研发转化中心 一种核酸导向的靶rna降解的纳米复合物及其制备方法

Non-Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Bifunctional chimera for ligand-directed photo-degradation of oncogenic microRNA;Chen Li，等;Chem. Commun.(第59期);第7639-7642页 *
Metal- and Strain-Free Bioorthogonal Cycloaddition of o-Diones with Furan-2(3H)-one as Anionic Cycloaddend;ZiweiXi，等;Angewandte Chemie International Edition;第61卷(第23期);e202200239 *
Small Molecule Targeted Recruitment of a Nuclease to RNA;Matthew G. Costales，等;J. Am. Chem. Soc.;第140卷(第22期);第6741–6744页 *
Targeted Degradation of a Hypoxia-Associated Non-coding RNA Enhances the Selectivity of a Small Molecule Interacting with RNA;Matthew G. Costales，等;Cell Chem Biol.;第26卷(第8期);第1180-1186.e5页 *
Visible Light-Initiated Bioorthogonal Photoclick Cycloaddition;Jinbo Li, 等;J. Am. Chem. Soc.;第140卷(第44期);第14542–14546页 *
适用于荧光成像的化学发色团与生物正交反应研究进展;张艳;陈鹏;姚祝军;;科学通报(第Z2期);第2872-2885页 *

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