CN112322620B - 基于硫代磷酸酯后修饰反应的双波长光激活核酸体系及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及核酸修饰技术领域,具体地,本发明涉及基于硫代磷酸酯后修饰反应的双波长光激活核酸体系及其应用。本发明提供一种基于硫代磷酸酯后修饰反应的双波长光激活核酸体系,通过将光敏分子引入功能性核酸分子的关键活性位点上,可以使功能性核酸的活性被抑制,在特定波长光照下,光敏分子可以从核酸上脱除,核酸功能恢复,从而可以实现功能性核酸在时间和空间上的精准调控。通过PS后修饰的方法,将光敏分子修饰至功能性核酸的关键活性位点,可以对功能性核酸分子进行空间和时间上的有效控制。
Description
技术领域
本发明涉及核酸修饰技术领域,具体地,本发明涉及基于硫代磷酸酯后修饰反应的双波长光激活核酸体系及其应用。
背景技术
核酸由核苷酸以3’5’-磷酸二酯键连接,包括核糖核酸(RNA)和脱氧核糖核酸(DNA),作为遗传物质基础在生物体内有重要意义。短链核酸,即寡核苷酸,因合成方便、易于理性设计及表征的特点,被广泛应用于分子检测、疾病治疗和基因功能研究等各领域。核酸结构的化学修饰对其生理功能、性质及应用有着重要的影响。
光是生物系统外源控制的一种理想工具,它具有许多优于传统生物调控的优势,尤其是能够在空间和时间层面有效的控制光照,进行可控的调节。此外,光照射是非侵入性的,对生物体的二次扰动小,并且可以通过光强度来控制对生物活性的调节程度。
通过亚磷酰胺的固相合成技术可在核酸上引入光敏基团,进行光对生物活性的调控,然而固相合成中经历的各种氧化、脱帽过程使得其上光敏分子的修饰很困难。因此,目前可被光激活的核酸合成难度较大,尤其是对可见光响应的光激活核酸体系。
发明内容
本发明旨在至少在一定程度上解决相关技术中的技术问题之一。为此,本发明的一个目的在于提供一种基于硫代磷酸酯(PS)后修饰反应的双波长光激活核酸体系,通过将光敏分子引入功能性核酸分子的关键活性位点上,可以使功能性核酸的活性被抑制,在特定波长光照下,光敏分子可以从核酸上脱除,核酸功能恢复,从而可以实现功能性核酸在时间和空间上的精准调控。因此,通过PS修饰的方法,将光敏分子修饰至功能性核酸的关键活性位点,可以对功能性核酸分子进行空间和时间上的有效控制。与固相合成技术相比,PS后修饰反应的条件温和、操作方便,因此,更易于获得所需的在特定位点有光敏分子的功能性核酸。
为此,本发明一方面提供一种经修饰的核酸分子。根据本发明的实施例,所述经修饰的核酸分子的结构式为:
其中,所述R为光敏基团,所述光敏基团选自以下式1或式2:
本发明用含PS修饰的核酸分子(DNA或RNA)与不同的溴代光敏分子(对365nm波长光响应的邻硝基苄溴衍生物Br-NBOPM或对490nm波长光响应的香豆素衍生物Br-DEACM)反应,生成笼蔽核酸(caged DNA或caged RNA)。当所修饰光敏分子为Br-NBOPM时,PS修饰功能性核酸上的NBOPM可以在365nm光照下从核酸上脱除,恢复成PS-功能性核酸;当修饰光敏分子为Br-DEACM时,PS修饰功能性核酸上的DEACM可以在490nm光照下从核酸上脱除,恢复成PS-功能性核酸。
根据本发明的实施例,所述经修饰的核酸分子还具有以下附加技术特征:
根据本发明的实施例,所述核酸分子选自功能性的DNA和/或RNA;
任选地,所述功能性的DNA选自脱氧核酶(DNAzyme)、反义DNA(antisense DNA)、荧光原位杂交探针、核酸适配体(aptamer)、DNA折纸单元结构、引物、含PS修饰的基因组DNA、含PS修饰的质粒;
任选地,所述功能性的RNA选自CRISPR基因编辑体系的向导RNA(guide RNA)、小分子干扰RNA(siRNA)、反义RNA(antisense RNA)、核酶、信使RNA(mRNA)、转运RNA(tRNA)、核糖体RNA(rRNA);
任选地,所述经修饰的核酸分子上具有3-6个,优选3-4个修饰位点。
脱氧核酶是一类具有类蛋白酶催化功能的短链DNA,它通常包括过氧化物模拟酶DNAzyme和具有RNA酶切活性DNAzyme两种。通过将光敏分子引入脱氧核酶序列中,可以实现脱氧核酶催化活性在时间和空间上的精准调控。结合多种光敏分子笼蔽策略,进行多层次的波长选择性光控激活脱氧核酶,可以使脱氧核酶在各领域得到更深入的应用。
CRISPR-Cas9基因编辑技术利用向导RNA(guide RNA)来介导核酸酶(Cas9)到达DNA靶点,并对目标靶点进行特异性的切割。与持续激活型CRISPR-Cas9基因编辑系统相比,光控CRISPR-Cas9基因编辑可对基因编辑进行时间和空间上的更好控制,同时给脱靶留下更小的时间窗口,从而降低脱靶效率。结合多重光敏分子笼蔽策略,可分别先后对不同的靶点进行基因编辑。
根据本发明的实施例,所述核酸分子为RNA时,其2’OH用选自2’-OMe、2’-F、2’-MOE、锁核酸(LNA)中的至少之一进行保护。以避免2’-OH对反应产物进行进攻。
本发明另一方面提供制备所述的经修饰的核酸分子的方法。根据本发明的实施例,所述方法包括:将硫代磷酸酯修饰的核酸分子与光敏分子反应,获得所述经修饰的核酸分子,
其中,所述光敏分子选自以下式3或式4的光敏基团:
式3中R1选自卤素;
式4中R2选自卤素。
本发明提供了基于硫代磷酸酯(PS)的反应活性,用含PS修饰的核酸分子(DNA或RNA)与不同的溴代光敏分子(对365nm波长光响应的邻硝基苄溴衍生物或对490nm波长光响应的香豆素衍生物)反应,生成笼蔽核酸(caged DNA或caged RNA)。该笼蔽核酸可被365nm或490nm光激活,并恢复成PS-DNA或PS-RNA。当DNA或RNA具有功能性时,笼蔽DNA或RNA(caged DNA或caged RNA)可被光激活,恢复成有活性的DNA或RNA。DNA可以是脱氧核酶(DNAzyme)、反义DNA(antisense DNA)、荧光原位杂交(FISH)探针、核酸适配体(aptamer)、DNA折纸单元结构、引物、含PS修饰的基因组DNA、含PS修饰的质粒等,RNA可以是CRISPR基因编辑体系的向导RNA、小分子干扰RNA、反义RNA、核酶、信使RNA、转运RNA、核糖体RNA等。
本发明的基于核酸分子磷酸骨架上PS后修饰的光敏分子修饰方法,操作简单、条件温和、适用性广,使得光敏分子笼蔽的核酸分子修饰变得容易;本发明的基于PS后修饰反应的笼蔽核酸,当所修饰光敏分子为NBOPM时可被365nm光激活;当所修饰光敏分子为DEACM时,可被490nm光激活;当对不同的核酸分子分别进行NBOPM和DEACM,可实现490nm→365nm的先后激活。本发明的基于PS后修饰反应的笼蔽核酸反应不仅适用于PS修饰的DNA,同样适用于2’-OH经保护的RNA。本发明中的笼蔽DNAzyme可实现365nm光激活或490nm光激活或490nm→365nm的先后激活。本发明中的笼蔽向导RNA(caged gRNA)可实现365nm光激活或490nm光激活或490nm→365nm的先后激活,从而实现不同波长光照激活不同靶点的CRISPR-Cas9基因编辑。
根据本发明的实施例,所述方法还具有以下附加技术特征:
根据本发明的实施例,所述卤素选自Cl、I、Br;
任选地,所述光敏分子的化学式为以下式5或式6:
式5所示化合物为对365nm波长光响应的邻硝基苄溴衍生物,式6所示化合物为对490nm波长光响应的香豆素衍生物。
根据本发明的实施例,所述硫代磷酸酯修饰的核酸分子与所述光敏分子反应时的摩尔比为1:10-1:10000;
任选地,所述硫代磷酸酯修饰的核酸分子与所述光敏分子在水溶液体系或水与有机溶剂混合体系中进行,反应体系的pH 4-10;
任选地,向所述反应体系中加入缓冲液,所述缓冲液选自磷酸盐缓冲液、碳酸盐缓冲液、MES缓冲液、MOPS缓冲液、HEPES缓冲液;
任选地,所述硫代磷酸酯修饰的核酸分子中具有3-6个,优选3-4个硫代磷酸酯修饰位点。
反应体系的pH过低可能会导致核酸降解,pH过高产物可能会水解。
根据本发明的实施例,所述硫代磷酸酯修饰的核酸分子与所述光敏分子反应的反应温度10℃-80℃;
任选地,反应时间为0.5h-200h,优选为10h-50h。
本发明另一方面提供一种光激活核酸体系。根据本发明的实施例,所述光激活核酸体系中含有两种所述的经修饰的核酸分子,其中,一种所述经修饰的核酸分子中的R基团为式1,另一种所述经修饰的核酸分子中的R基团为式2,所述式1或式2的基团具有不同波长的光响应。
本发明通过将光敏分子引入功能性核酸分子的关键活性位点上,可以使功能性核酸的活性被抑制,在特定波长光照下,光敏分子可以从核酸上脱除,核酸功能恢复,从而可以实现功能性核酸在时间和空间上的精准调控。因此,通过PS修饰的方法,将光敏分子修饰至功能性核酸的关键活性位点,可以对功能性核酸分子进行空间和时间上的有效控制。与固相合成技术相比,PS后修饰反应的条件温和、操作方便,因此,更易于获得所需的在特定位点有光敏分子的功能性核酸。
根据本发明的实施例,所述核酸分子选自有功能的DNA和/或RNA;
任选地,所述功能性的DNA选自脱氧核酶(DNAzyme)、反义DNA(antisense DNA)、荧光原位杂交探针、核酸适配体(aptamer)、DNA折纸单元结构、引物、含PS修饰的基因组DNA、含PS修饰的质粒;
任选地,所述功能性的RNA选自CRISPR基因编辑体系的向导RNA(guide RNA)、小分子干扰RNA(siRNA)、反义RNA(antisense RNA)、核酶、信使RNA(mRNA)、转运RNA(tRNA)、核糖体RNA(rRNA)。
根据本发明的实施例,所述核酸分子为RNA时,其2’OH用选自2’-OMe、2’-F、2’-MOE、锁核酸中的至少之一进行保护。
根据本发明的实施例,所述经修饰的核酸分子上具有3-6个,优选3-4个修饰位点。根据本发明的一些优选的实施例,在本发明的光激活核酸体系的基础上,可以进一步优化经修饰的核酸分子上具有的光敏基团的个数,也即具有的修饰位点的个数,在功能性核酸上修饰位点的个数为3-6个,优选3-4个时,功能性核酸的功能更易被抑制,并在特定波长光照下,光敏基团从核酸上脱除,使得核酸功能恢复。
本发明另一方面提供所述的经修饰的核酸分子或所述的方法制备的经修饰的核酸分子或所述的光激活核酸体系在调控所述核酸分子的时空表达中的应用。
本发明通过PS修饰的方法,将光敏分子修饰至功能性核酸的关键活性位点,可以对功能性核酸分子进行空间和时间上的有效控制。与固相合成技术相比,PS后修饰反应的条件温和、操作方便,因此,更易于获得所需的在特定位点有光敏分子的功能性核酸。
本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出,部分将从下面的描述中变得明显,或通过本发明的实践了解到。
附图说明
本发明的上述和/或附加的方面和优点从结合下面附图对实施例的描述中将变得明显和容易理解,其中:
图1显示本发明中PS-核酸分子与溴代光敏分子的反应及反应产物的光激活过程;
图2显示本发明中对365nm和490nm光响应的光敏分子;
图3显示本发明中当核酸分子为RNA时,需在RNA上做的修饰类型;
图4显示本发明中Br-NBOPM和Br-DEACM的合成路径;
图5显示本发明中光控DNAzyme示意图;
图6显示本发明中对3PS DNAzyme上光敏分子修饰及其光脱除变性PAGE表征;
图7显示本发明中光控DNAzyme体系的荧光动力学表征;
图8显示本发明中CRISPR-Cas9体系中的两段式gRNA;
图9显示本发明中PS-crRNA上修饰光敏分子及其光脱除变性PAGE表征;
图10显示本发明中光控CRISPR-Cas9的体外切割;
图11显示本发明中光控CRISPR-Cas9的人细胞中基因编辑的T7EI表征;
图12显示本发明中Br-NBOPM的质谱表征;
图13显示本发明中Br-DEACM的质谱表征;
图14显示本发明中T15-1PS上修饰NBOPM及其产物对365nm光响应脱除的变性PAGE表征;
图15显示本发明中T15-1PS-NBOPM响应365nm波长光照前后的质谱表征;
图16显示本发明中T15-1PS上修饰DEACM及其产物对490nm光响应脱除的变性PAGE表征;
图17显示本发明中T15-1PS-DEACM响应490nm波长光照前后的质谱表征。
具体实施方式
下面详细描述本发明的实施例。下面描述的实施例是示例性的,仅用于解释本发明,而不能理解为对本发明的限制。
本发明提供一种笼蔽核酸(caged DNA或caged RNA)的修饰方法。该方法通过PS的反应活性,与溴代光敏分子反应,生成被光敏分子笼蔽的核酸分子。笼蔽核酸分子可被光激活,恢复成PS-DNA或PS-RNA,如图1所示。
光敏分子可以为响应365nm波长的光敏基团NBOPM,或响应490nm波长的光敏基团DEACM,结构如图2所示。
当核酸分子为RNA时,其2’OH需用2’-OMe或2’-F或2’-MOE或LNA进行保护,均为商业化固相合成可做的修饰(如图3所示),以避免2’-OH对反应产物进行进攻。
在本发明的一些实施方案,本发明提供制备笼蔽核酸的方法:将硫代磷酸酯修饰的核酸分子与光敏分子反应,获得所述经修饰的核酸分子,
其中,所述光敏分子的化学式为以下式5或式6:
反应条件为在水溶液体系或者水与有机溶剂混合体系中,反应过程加入一定的缓冲液,包括但不限于磷酸盐缓冲、碳酸盐缓冲、MES(4-吗啉乙磺酸)缓冲、MOPS(3-(N-吗啉基)丙磺酸)缓冲、HEPES(羟乙基哌嗪乙硫磺酸)缓冲等。有机溶剂用于彻底溶解有机反应物,包括但不限于DMF、DMSO、乙醇、乙腈等所有有机溶剂。pH可在4-10之间,反应温度可为10℃-80℃,硫代磷酸酯修饰的核酸分子的反应浓度为10nM-1mM,溴化物的反应浓度为100μM-100mM,反应时间为1分钟及以上。
对365nm光响应的Br-NBOPM和对490nm光响应的Br-DEACM的合成反应路径如图4所示。
当笼蔽核酸为特定位点PS修饰的脱氧核酶(DNAzyme)时,在不同的DNAzyme上修饰不同的光敏分子,可实现490nm或365nm波长的分别激活或实现490nm→365nm波长的不同DNAzyme的先后激活。当DNAzyme为RNA底物切割型时,其可进行如图5所示的激活切割。该顺次光激活DNAzyme体系与细胞环境兼容,可在细胞中实现490nm→365nm波长的逐次激活。
当笼蔽核酸为特定位点PS修饰的CRISPR-Cas9基因编辑的向导RNA(gRNA)时,在不同靶点的gRNA上修饰不同的光敏分子,可实现490nm或365nm波长的分别激活基因编辑或实现490nm→365nm波长的先后激活不同靶点的基因编辑。
核酸分子包括并不限于DNAzyme、反义DNA、荧光原位杂交(FISH)探针、gRNA、小干扰RNA(siRNA)、反义RNA(asRNA)等。
在本发明的一些实施方案中,进行溴代光敏分子的合成,对365nm波长响应的Br-NBOPM和对490nm波长响应的Br-DEACM的合成路径如图4所示,对合成产物进行薄层层析鉴定、核磁表征及质谱表征。
在本发明的一些实施方案中,本发明进行PS修饰DNAzyme上光敏分子的修饰,以8-17DNAzyme为例进行发明阐述,其序列为17Dz:CACGTCCATCTCTTCTCCGAGCCGGTCGAAATAGTGAGT,如SEQ ID NO:1所示,进行PS修饰后的序列为17Dz-3PS:CACGTCCATCTCTTCTCCG*A*G*CCGGTCGAAATAGTGAGT,底物序列为FAM-17S-IBQ:/56-FAM/ACTCACTATrAGGAAGAGATG/3IABkFQ/,17Dz-3PS与Br-NBOPM/Br-DEACM反应后的产物及产物经365nm光照/490nm光照后产物的变性PAGE表征如图6所示,可见NBOPM或DEACM可成功修饰至17Dz-3PS上,365nm或490nm光照后,所修饰的NBOPM或DEACM可从DNAzyme上脱除,恢复成17Dz-3PS。对笼蔽8-17DNAzyme进行功能测试,如图5进行设计,修饰光敏基团的DNAzyme被称为笼蔽DNAzyme(caged DNAzyme),笼蔽DNAzyme无法在金属离子存在时催化底物RNA碱基的断裂。对NBOPM-DNAzyme进行365nm波长光照,NBOPM可从笼蔽DNAzyme上脱除,恢复成17Dz-3PS,催化活性恢复,结果如图7所示。对DEACM-DNAzyme进行490nm波长光照,DEACM可从笼蔽DNAzyme上脱除,恢复成17Dz-3PS,催化活性恢复,结果如图7所示。
本发明继而进行了PS修饰RNA上光敏分子的修饰和光激活脱除实验。以CRISPR-Cas9基因编辑体系的向导RNA(gRNA)为例进行发明阐述。gRNA采用两段式法,即一段crRNA加一段tracrRNA,同时在crRNA上进行光敏分子修饰(图8)。EMX1 crRNA序列为EMX1 crRNA:GAGUCCGAGCAGAAGAAGAAGUUUUAGAGCUAUGCUGUUUUG,如SEQ ID NO:2所示,PS修饰的EMX1crRNA序列为:EMX1 crRNA(*141718):GAGUCCGAGCAGAmA*GAmA*mG*AAGUUUUAGAGCUAUGCUGUUUUG或EMX1 cr RNA(*14161820):GAGUCCGAGCAGAmA*GmA*AmG*AmA*GUUUUAGAGCUAUGCUGUUUUG。HBB crRNA序列为HBB crRNA:CUUGCCCCACAGGGCAGUAAGUUUUAGAGCUAUGCUGUUUUG,如SEQ ID NO:3所示,PS修饰的HBB crRNA序列为HBB crRNA(*141718):CUUGCCCCACAGGmG*CAmG*mU*AAGUUUUAGAGCUAUGCUGUUUUG或HBB crRNA(*14171820):CUUGCCCCACAGGmG*CAmG*mU*AmA*GUUUUAGAGCUAUGCUGUUUUG。EMX1 crRNA(*141718)与Br-DEACM反应,并对反应产物用490nm波长LED灯进行照射;HBB crRNA(*14171820)与Br-NBOPM反应,并对反应产物进行365nm波长照射。变性PAGE结果表征如图9所示。
基于上述PS-RNA与溴代光敏分子的反应及光脱除表现,本发明继而构建了CRISPR-Cas9的光刺激响应体系。如图8所示,对crRNA的seed region的部分特定碱基进行磷酸骨架上的PS修饰(其2’OH需用2’-OMe或2’-F或2’-MOE或LNA进行保护,以避免2’-OH对反应产物的进攻),在seed region的某些特定位置进行PS修饰可以保留其介导CR ISPR-Cas9基因编辑活性。先对光敏分子笼蔽crRNA的CRISPR-Cas9体系进行体外切割验证,结果如图10所示,无论是在crRNA上进行NBOPM还是DEACM修饰,均可实现其在特定波长的光激活体外切割。在体外切割基础上,本发明随后进行了CRISPR-Cas9体系的特定波长光刺激响应人细胞基因编辑验证,结果如图11所示,无论是在crRNA上进行NBOPM还是DEACM修饰,均可在人细胞中实现特定波长的光激活CRISPR-Cas9基因编辑。
在本发明的一些具体实施方案中,通过PS后修饰方法合成光敏分子笼蔽的核酸分子:在水和有机溶剂混合体系中,PS修饰的DNA或PS修饰的RNA(同时2’-OH用2’-OMe、2'-F、2’-MOE或LNA等保护)和溴代光敏分子(Br-NPOBM或Br-DEACM)作为反应物,两反应物溶解于pH在4-10之间的缓冲体系,如磷酸盐缓冲、MES(4-吗啉乙磺酸)缓冲、MOPS(3-(N-吗啉基)丙磺酸)缓冲、HEPES(羟乙基哌嗪乙硫磺酸)缓冲等。加入有机溶剂,以彻底溶解Br-NPOBM或Br-DEACM,DNA或RNA的反应浓度为10nM-1mM,溴化物的反应浓度为100μM-100mM,在10℃-60℃下反应0.5h-200h。反应完可通过超滤器(Amicon)去除过量的小分子,对产物进行纯化,也可以对反应混合物进行变性PAGE,然后对产物进行切胶回收、纯化。可通过变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)和Q-TOF-MS对产物进行表征和验证。
在本发明的一些具体实施方案中,光控DNAzyme过程:首先将一定量将8-17DNAzyme(17Dz、17Dz-3PS、17Dz-3PS-NBOPM光照前后、17Dz-3PS-DEACM光照前后)与底物17S(一端荧光团标记另一端淬灭团标记)加入至一定体积的反应缓冲液中,使得8-17DNAzyme和17S终浓度各为5nM~1μM、20nM~5μM,其中缓冲液为10mM~500mM MES或MOPS或HEPES,20mM~1M钠盐(如硝酸钠、氯化钠等),pH 5~8。在上述体系中,加入一定量锌离子或铅离子(避免影响其他组分浓度,配合适浓度储备液,加少量体积,约总体积的0.01%~2%),终浓度0~10μM(其中0μM作为空白对照),立即混匀后转移至石英皿中,并放入荧光分光光度计中测荧光动力学曲线,根据修饰的荧光团确定合适的激发发射波长并控制一定温度(10℃~30℃)进行测试。光激活体系中,17Dz-3PS-NBOPM在365nm紫外光下照射15分钟,17Dz-3PS-DEACM在490nm LED灯下光照90分钟。
在本发明的一些具体实施方案中,光控CRISPR-Cas9体外切割:在pH在6-8之间缓冲液体系,如HEPES(羟乙基哌嗪乙硫磺酸)缓冲、磷酸盐缓冲、碳酸盐缓冲、Tris(三羟甲基氨基甲烷)等,以gRNA(w/wo NBOPM或w/wo DEACM)、Cas9、切割底物为反应物,RNA的反应浓度为10nM-1mM,Cas9的反应浓度为100nM-1mM,切割底物反应浓度为1nM-100μM,在37℃下反应0.1h-50h。光激活体系中,gRNA-NBOPM在365nm紫外光下照射15分钟,gRNA-DEACM在490nmLED灯下光照90分钟。反应产物用琼脂糖凝胶电泳进行表征。
在本发明的一些具体实施方案中,光控CRISPR-Cas9基因编辑体系:用脂质体或纳米颗粒等转染试剂将Cas9质粒或Cas9 mRNA或Cas9蛋白以及gRNA(w/wo NBOPM或w/woDEACM)转染至细胞中。当转染的是Cas9质粒时,5-20h后再向细胞中转入gRNA;当转染的是Cas9 mRNA时,0-10h后再向细胞中转入gRNA;当转染的是Cas9蛋白时,gRNA和Cas9先在体外形成复合体RNP,然后一起转染。光激活体系中,gRNA-NBOPM在365nm紫外光下照射15分钟,gRNA-DEACM在490nm LED灯下光照90分钟。转染48h后,用试剂盒提取经转染处理的细胞的基因组DNA(gDNA),并以之为模板,进行PCR扩增,得到一段dsDNA,继而进行T7EI分析或TIDE分析,计算indel。
下面详细描述本发明的实施例。下面描述的实施例是示例性的,仅用于解释本发明,而不能理解为对本发明的限制。实施例中未注明具体技术或条件的,按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者,均为可以通过市购获得的常规产品。
实施例1:Br-NBOPM的合成
如图4a所示,将K2CO3(6.9g)加入到溶解在50mL乙腈中的邻硝基苄溴(6.8g,32mmol)溶液中,然后加入2-羟基苯甲醛(4.6g,35mmol)。将混合物在80-100℃反应回流2小时,加入NaH2PO4溶液调节pH至中性或偏酸性,而后在旋蒸仪中除去溶剂,用乙酸乙酯/水萃取提纯,萃取液用Na2SO4干燥,减压浓缩,得到橙色油状物,为中间产物1。然后在0℃下,将NaBH4(0.3g)加入到溶于40mL甲醇溶液的产物1(1g)中反应1小时后蒸发溶剂并通过用乙酸乙酯/水萃取纯化,得到中间产物2。然后将中间产物2溶解在二氯甲烷中,然后在室温下滴加三溴化磷,搅拌反应0.5小时后,加入水以淬灭反应,并将混合物用二氯甲烷/水萃取,将有机层用Na2SO4干燥,过滤并旋蒸浓缩,得到目标产物Bromo-NBOPM。1H NMR(δ,ppm,300MHz,CDCl3):4.5~4.8(2H,m),5.5~5.7(2H,m),6.9~7,1(2H,t),7.3~7.8(4H,t),8.0~8.3(2H,t).13C-NMR(δ,ppm,300MHz,CDCl3):29.29,66.94,112.27,121.58,125.12,126.44,128.47,128.57,130.56,131.18,133.79,134.42,146.83,156.04。测量质谱数值为323.1([M+H]+),理论分子量为322.16。质谱表征结果如图12所示。
实施例2:Br-DEACM的合成
如图4b所示,将2.5g 10mmole 7-(二乙氨基)-4-(羟甲基)香豆素溶解在二氯甲烷溶剂中,室温下滴加三溴化磷,搅拌反应0.5小时后,加入水以淬灭反应,并将混合物用二氯甲烷/水萃取,将有机层用Na2SO4干燥,过滤并旋蒸浓缩,得到目标产物Bromo-DEACM。1H NMR(δ,ppm,300MHz,CDCl3):1.1~1.3(6H,m),3.3~3.5(3H,d),4.4(2H,m),6.5~6.7(2H,t),7.5(H,d).13C-NMR(δ,ppm,300MHz,CDCl3):13.12,42.37,47.54,98.61,107.26,108.73,115.41,125.2,148.71,155.13,156.83,159.07。测量质谱数值为310.0([M+H]+),理论分子量为309.04。质谱表征结果如图13所示。
实施例3:T15-1PS(TTTTTTTT*TTTTTTT)上的NBOPM修饰及其对365nm波长光响应脱除
将20μL 100μM T15-1PS、20μL 100mM PBS(pH 6.0)、80μL DMF及10μL溶解于DMF中的50mM NBOPM-Br混合均匀后置于摇床上室温反应48h。反应完全后用Amicon-10k超滤管和水离心洗涤6次,12000rpm,每次12分钟,以除去过量未反应的溴代小分子。反应产物用UV260进行浓度测定,而后用变性PAGE及质谱进行表征,结果分别如图14和图15所示。
实施例4:T15(TTTTTTTT*TTTTTTT)上的DEACM修饰及其490nm波长光响应脱除
将20μL 100μM T15-1PS、20μL 100mM PBS(pH 6.0)、80μL DMF及10μL溶解于DMF中的50mM DEACM-Br混合均匀后置于摇床上室温反应48h。清洗方法和表征方法如实施例5。变性PAGE及质谱表征结果分别如图16和图17所示。
实施例5:NBOPM修饰的8-17 DNAzyme的合成
将20μL 100μM PS-8-17 DNAzyme、20μL 100mM PBS(pH 6.0)、80μL DMF及10μL溶解于DMF中的50mM NBOPM-Br混合均匀后置于摇床上室温反应48h。反应完全后用Amicon-10k超滤管和水离心洗涤6次,12000rpm,每次12分钟,以除去过量未反应的溴代小分子。反应产物用UV260进行浓度测定,而后用变性PAGE进行表征,结果如图6左图所示。
实施例6:DEACM修饰的8-17 DNAzyme的合成
将20μL 100μM PS-8-17 DNAzyme、20μL 100mM PBS(pH 6.0)、20μL DMF及10μL溶解于DMF中的50mM DEACM-Br混合均匀后置于摇床上室温反应48h。清洗方法和表征方法如实施例5。变性PAGE表征结果如图6右图所示。
实施例7:8-17 DNAzyme的光激活反应
将8-17 DNAzyme(17Dz、17Dz-3PS、17Dz-3PS-NBOPM光照前后、17Dz-3PS-DEACM光照前后)和两边分别标记荧光团和猝灭团的底物(FAM-17S-IBQ)进行切割反应,有效切割后释放荧光团所产生的荧光信号可用于检测DNAzyme的活性。反应体系终浓度为:50nM 17Dz(各种形式),250nM FAM-17S-IBQ,0.5mM Zn2+。加入硝酸锌后反应立刻开始,因此需要快速混匀立即测试荧光强度随时间变化的动力学曲线,测试FAM的最大激发/发射波长为490nm/520nm,测试时间300s。上述光照时间分别为17Dz-3PS-NBOPM在365nm紫外光下照射15分钟,17Dz-3PS-DEACM进行490nm光照90分钟。反应缓冲液为100mM NaCl,100mM MOPS,pH 7.0。所得结果以长时发应后所有底物都切完的荧光强度为对照,将绝对荧光强度转化为相对底物切割比例,建立不同测试样品底物切割比和时间的动力学关系曲线。更换另一种靶标底物(Cy5-17S-IBQ)的8-17 DNAzyme(17Dz-3PS-CQ)进行与上述相同的步骤荧光测试,但测试最大激发/发射波长更换为645nm/667nm。
实施例8:NBOPM修饰的EMX1 gRNA的合成
将20μL 100μM PS-2′-OMe EMX1 crRNA、20μL 100mM PBS(pH 6.0)、80μL DMF及10μL溶解于DMF中的50mM NBOPM-Br混合均匀后置于摇床上室温反应48h。清洗方法和表征方法如实施例3。
实施例9:DEACM修饰的HBB gRNA的合成
将20μL 100μM PS-2′-OMe HBB crRNA、20μL 100mM PBS(pH 6.0)、20μL DMF及10μL溶解于DMF中的50mM DEACM-Br混合均匀后置于摇床上室温反应48h。清洗方法和表征方法如如实施例3。
实施例10:光激活CRISPR-Cas9体系的体外切割
用基因组提取试剂盒提取293T-Cas9细胞的的gDNA,以之为模板,同时分别以EMX1fw和EMX1 rv或HBB fw和HBB rv为正反向引物进行PCR扩增,PCR产物用胶提取试剂盒(Omega)进行纯化,得到EMX1 dsDNA或HBB dsDNA。用UV260对EMX1 dsDNA或HBB dsDNA进行浓度测定并以之作为体外切割反应的底物。将1μL 1μM EMX1 crRNA或HBB crRNA(w/woNBOPM或DEACM)、1μL 1μM tracrRNA、0.5μL 1μM Cas9 1μL 30nM dsDNA底物、24.5μL H2O以及1μL 10xNEBufferTM3.1缓冲液混合于PCR管并置于培养箱中37℃孵育1h。crRNA-NBOPM在365nm紫外光下照射15分钟,crRNA-DEACM进行490nm光照90分钟。反应产物用1.5%琼脂糖凝胶电泳进行鉴定。
实施例11:光激活CRISPR-Cas9体系在人细胞中的基因编辑
在含DMEM、10%FBS及双抗的培养基中培养可持续稳定表达Cas9蛋白的293T-Cas9细胞,当细胞长到约70%汇合度时,对细胞进行传代并铺板至48孔板。铺板时所用的培养基为含10%FBS的DMEM(不含双抗)。约20h后,当48孔板中的细胞长到约70%汇合度时,对细胞进行转染。转染试剂采用Life Technologies的RNAimax(RNAiMAX),转染方法参照RNAimax的产品说明书并稍作修改。将20pmol EMX1 crRNA(w/wo DEACM)或20pmolHBB crRNA(w/wo NBOPM)、20pmol tracrRNA混合于15μL opti-mem培养基中,混合均匀,室温孵育2min;同时,将1μL RNAimax混合于15μL opti-mem培养基中,混合均匀,室温孵育2min。将上述RNA溶液和RNAimax混合均匀,室温孵育5-10min后,加入48孔板的孔中。转染48h后,用试剂盒提取经转染处理的细胞的基因组DNA(gDNA),并以之为模板,分别以EMX1fw和EMX1 rw为正反向引物或HBB fw和HBB rv为正反向引物进行PCR扩增,得到EMX1 dsDNA或HBB dsDNA,继而进行T7EI分析,计算indel。
在本说明书的描述中,参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中,对上述术语的示意性表述不必须针对的是相同的实施例或示例。而且,描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。此外,在不相互矛盾的情况下,本领域的技术人员可以将本说明书中描述的不同实施例或示例以及不同实施例或示例的特征进行结合和组合。
尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例,可以理解的是,上述实施例是示例性的,不能理解为对本发明的限制,本领域的普通技术人员在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。
序列表
<110> 清华大学
<120> 基于硫代磷酸酯后修饰反应的双波长光激活核酸体系及其应用
<130> PIDC3204108
<160> 3
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
cacgtccatc tcttctccga gccggtcgaa atagtgagt 39
<210> 2
<211> 42
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
gaguccgagc agaagaagaa guuuuagagc uaugcuguuu ug 42
<210> 3
<211> 42
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
cuugccccac agggcaguaa guuuuagagc uaugcuguuu ug 42
Claims (26)
1.一种经修饰的核酸分子,其特征在于,所述经修饰的核酸分子的结构式为:
其中,所述R为光敏基团;
所述光敏基团选自以下式1或式2:
式1,式2。
2.根据权利要求1所述的经修饰的核酸分子,其特征在于,所述核酸分子选自功能性的DNA和/或RNA。
3.根据权利要求2所述的经修饰的核酸分子,其特征在于,所述功能性的DNA选自脱氧核酶、反义DNA、荧光原位杂交探针、核酸适配体、DNA折纸单元结构、引物、含PS修饰的基因组DNA、含PS修饰的质粒。
4.根据权利要求2所述的经修饰的核酸分子,其特征在于,所述功能性的RNA选自CRISPR基因编辑体系的向导RNA、小分子干扰RNA、反义RNA、核酶、信使RNA、转运RNA、核糖体RNA。
5.根据权利要求2所述的经修饰的核酸分子,其特征在于,所述经修饰的核酸分子上具有3-6个修饰位点。
6.根据权利要求5所述的经修饰的核酸分子,其特征在于,所述经修饰的核酸分子上具有3-4个修饰位点。
7.根据权利要求1所述的经修饰的核酸分子,其特征在于,所述核酸分子为RNA时,其2’OH用选自2’-OMe、2’-F、2’-MOE、锁核酸中的至少之一进行保护。
8.制备权利要求1-7中任一项所述的经修饰的核酸分子的方法,其特征在于,所述方法包括:将硫代磷酸酯修饰的核酸分子与光敏分子反应,获得所述经修饰的核酸分子,
其中,所述光敏分子选自以下式3或式4的光敏基团:
式3,式4,
式3中R1选自卤素;
式4中R2选自卤素。
9.根据权利要求8所述的方法,其特征在于,所述卤素选自I、Cl、Br。
10.根据权利要求8所述的方法,其特征在于,所述光敏分子的化学式为以下式5或式6:
式5,式6。
11.根据权利要求8或9所述的方法,其特征在于,所述硫代磷酸酯修饰的核酸分子与所述光敏分子反应时的摩尔比为1:10-1:10000。
12.根据权利要求8所述的方法,其特征在于,所述硫代磷酸酯修饰的核酸分子与所述光敏分子在水溶液体系或水与有机溶剂混合体系中进行,反应体系的pH 4-10。
13.根据权利要求12所述的方法,其特征在于,向所述反应体系中加入缓冲液,所述缓冲液选自磷酸盐缓冲液、碳酸盐缓冲液、MES缓冲液、MOPS缓冲液、HEPES缓冲液。
14.根据权利要求8所述的方法,其特征在于,所述硫代磷酸酯修饰的核酸分子中具有3-6个硫代磷酸酯修饰位点。
15.根据权利要求14所述的方法,其特征在于,所述硫代磷酸酯修饰的核酸分子中具有3-4个硫代磷酸酯修饰位点。
16.根据权利要求8所述的方法,其特征在于,所述硫代磷酸酯修饰的核酸分子与所述光敏分子反应的反应温度10℃-80℃。
17.根据权利要求8所述的方法,其特征在于,所述硫代磷酸酯修饰的核酸分子与所述光敏分子反应的反应时间为0.5 h-200 h。
18.根据权利要求8所述的方法,其特征在于,所述硫代磷酸酯修饰的核酸分子与所述光敏分子反应的反应时间为10 h-50 h。
19.一种光激活核酸体系,其特征在于,所述光激活核酸体系中含有两种权利要求1-7中任一项所述的经修饰的核酸分子,其中,一种所述经修饰的核酸分子中的R基团为式1,另一种所述经修饰的核酸分子中的R基团为式2,所述式1或式2的基团具有不同波长的光响应。
20.根据权利要求19所述的光激活核酸体系,其特征在于,所述核酸分子选自功能性的DNA和/或RNA。
21.根据权利要求20所述的光激活核酸体系,其特征在于,所述功能性的DNA选自脱氧核酶、反义DNA、荧光原位杂交探针、核酸适配体、DNA折纸单元结构、引物、含PS修饰的基因组DNA、含PS修饰的质粒。
22.根据权利要求20所述的光激活核酸体系,其特征在于,所述功能性的RNA选自CRISPR基因编辑体系的向导RNA、小分子干扰RNA、反义RNA、核酶、信使RNA、转运RNA、核糖体RNA。
23.根据权利要求20所述的光激活核酸体系,其特征在于,所述核酸分子为RNA时,其2’OH用选自2’-OMe、2’-F、2’-MOE、锁核酸中的至少之一进行保护。
24.根据权利要求19所示激活核酸体系,其特征在于,所述经修饰的核酸分子上具有3-6个。
25.根据权利要求24所述的激活核酸体系,其特征在于,所述经修饰的核酸分子上具有3-4个修饰位点。
26.权利要求1-7中任一项所述的经修饰的核酸分子或权利要求8-18中任一项所述的方法制备的经修饰的核酸分子或权利要求19-25中任一项所述的光激活核酸体系在调控所述核酸分子的时空表达中的应用。
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---|---|---|---|
PB01 | Publication | ||
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SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
GR01 | Patent grant | ||
GR01 | Patent grant |