CN112342213B - 核酸分子及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种核酸分子,所述核酸分子包括:主链,所述主链中含有核苷酸,所述主链的磷酸骨架上具有至少一个硫代磷酸酯修饰。本发明所提供的核酸分子可以响应次氯酸根,由硫代磷酸酯形成的硫代磷酸二酯键在次氯酸根的作用下可以发生断裂。该核酸分子可以用于基因编辑系统对生物体进行基因编辑,可以用于次氯酸根的检测,也可以用于制备治疗与次氯酸根浓度有关疾病的药物。
Description
技术领域
本发明涉及生物化学领域,具体地涉及核酸分子、检测样品中次氯酸根的方法,检测样品中次氯酸根的试剂盒、基因编辑系统、制备核酸分子的方法、基因编辑方法。
背景技术
次氯酸(HClO)是一种具有生物活性的活性氧(ROS)分子。生物体内的HOCl/OCl-通常是由髓过氧化物酶(myeloperoxidase,MPO)介导的氯离子和H2O2的反应所产生的。由于HOCl具有强氧化性,因此在生物体内可以作为免疫系统的一部分,直接或间接地参与到生物体防御侵入性细菌和其它病原体的过程中。另一方面,HOCl及其衍生物在日常生活中也已被广泛应用,包括纺织品的漂白,以及饮用水等生活用品的消毒等。然而,尽管HOCl有着重要的实际功能,过量的HOCl却也会带来很多困扰。生物体内的HOCl水平异常可导致细胞和组织的损伤并引起多种疾病,而生活用品尤其是饮用水中的HOCl含量超标也可能会引起皮肤损伤等危害。
常用HOCl探针通常是将能与HOCl发生特异性化学反应的有机小分子与荧光分子结合,通过化学反应的发生来控制荧光的产生或淬灭,从而达到检测或成像的目的,例如含碳碳双键的有机小分子和基于BODIPY基团的一类有机分子等。尽管荧光探针用于HOCl检测有很多优点,但也存在一些问题,例如使用的pH范围比较窄,需要有机溶剂,或者是检测限不够低等,并且大多数的荧光探针都是小分子探针,仅仅用于检测和成像,无法进一步调控生命活动。
因此,开发一种可用于HOCl检测或原位成像的新型化学工具对于更好地了解HOCl在生物系统中的作用及其与上述疾病的关系具有重要意义。
CRISPR-Cas9基因编辑技术利用向导RNA(guide RNA)来介导核酸酶(Cas9)到达DNA靶点,并对目标靶点进行特异性的切割。Cas9核酸酶有两个酶切功能结构域:RuvC和HNH,分别作用于底物DNA的两条链,当这两个结构域被激活时,Cas9在底物DNA上产生双链断裂(Double strand breaks,DSBs)。细胞通过NHEJ的修复会在DSB处造成INDEL效应(insertion and deletion),进而造成基因的移码突变而达到基因敲除的目的。此外,还可以通过同源重组等方式对基因进行精确编辑。
与持续激活型CRISPR-Cas9基因编辑系统相比,刺激响应型CRISPR-Cas9基因编辑可对基因编辑进行时间和空间上的更好控制,同时给脱靶留下更小的时间窗口,从而降低脱靶效率。
因此开发一种可以通过响应刺激来改变核酸分子状态的核酸分子,在基因编辑及药物制造等领域都非常重要。
发明内容
在本发明的第一方面,本发明提出了一种核酸分子。根据本发明的实施例,所述核酸分子包括:主链,所述主链中含有核苷酸,所述主链的磷酸骨架上具有至少一个硫代磷酸酯修饰。根据本发明实施例的核酸分子主链上的硫代磷酸二酯键可以在次氯酸根的作用下发生断裂,所述硫代磷酸二酯键由带有所述硫代磷酸酯修饰的核苷酸构成。根据本发明实施例的核酸分子具有两种形式,一种形式为主链完整,且主链上携带有硫代磷酸酯,另一种形式为硫代磷酸二酯键断裂,核酸分子的主链断裂为至少两个核酸片段。当核酸分子所处的环境中无次氯酸根,核酸分子以完整主链的形式存在;当核酸分子所处的环境中含有次氯酸根,核酸分子主链上的硫代磷酸二酯键在次氯酸根的作用下发生断裂,核酸分子以断开的核酸片段形式存在。此外,发明人发现,所述核酸分子对游离羟基也有轻微响应,但灵敏度远低于次氯酸根,所述核酸分子对其他活性氧无响应。
根据本发明的实施例,上述核酸分子还可进一步包括如下附加技术特征至少之一:
根据本发明的实施例,所述核酸分子进一步包括:荧光基团对,所述荧光基团对中的两个基团分别与所述核酸分子两个末端相连,所述荧光基团对中的两个基团之间可以发生荧光共振能量转移。根据本发明实施例的核酸分子可以制备成荧光探针形式,具有完整主链的核酸分子两端分别连接荧光报告基团和荧光淬灭基团,荧光报告基团可以发出荧光,荧光淬灭基团可以吸收荧光报告基团的荧光,使荧光不被检测到。
根据本发明的实施例,所述荧光基团对包括下列至少之一:
5'6-FAM/3'BHQ1、5'6-FAM/3'BHQ2、5'6-FAM/3'TAMRA、5'6-FAM/3'Dabcyl、5'6-FAM/3'Eclipse、5'6-FAM/3'MGB、5'TET/3'BHQ1、5'TET/3'BHQ2、5'TET/3'TAMRA、5'TET/3'Dabcyl、5'TET/3'MGB、5'JOE/3'BHQ1、5'JOE/3'BHQ2、5'JOE/3'TAMRA、5'JOE/3'Dabcyl、5'JOE/3'MGB、5'HEX/3'BHQ1、5'HEX/3'BHQ2、5'HEX/3'TAMRA、5'HEX/3'Dabcyl、5'HEX/3'Eclipse、5'HEX/3'MGB、5'VIC/3'BHQ1、5'VIC/3'BHQ2、5'VIC/3'MGB、5'CY3/3'BHQ2、5'CY3/3'Dabcyl、5'CY3/3'MGB、5'TAMRA/3'BHQ2、5'TAMRA/3'Dabcyl、5'TAMRA/3'Eclipse、5'TAMRA/3'MGB、5'ROX/3'BHQ2、5'ROX/3'Dabcyl、5'ROX/3'Eclipse、5'ROX/3'MGB、5'TexasRed/3'BHQ2、5'Texas Red/3'Dabcyl、5'Texas Red/3'MGB、5'Quasar 670/3'BHQ2、5'Quasar 670/3'BHQ3、5'CY5/3'BHQ2、5'CY5/3'BHQ3、5'CY5/3'Dabcyl、5'CY5/3'MGB和5'CY5.5/3'BHQ2。需要注意的是,能够发生荧光共振能量转移的基团对都可以连接于核酸分子的两端。
根据本发明的实施例,所述核苷酸为脱氧核糖核苷酸和核糖核苷酸的至少之一。所述核酸分子可以为DNA、RNA,可以为任何携带有核糖核苷酸和/或脱氧核糖核苷酸的分子,如信使RNA(mRNA)、转运RNA(tRNA)、核糖体RNA(rRNA)、小干扰RNA(siRNA)和反义RNA(asRNA)、信标分子、基因组DNA、循环DNA(cfDNA)等。
根据本发明的实施例,所述核酸分子为2nt~100nt。发明人发现,所述长度的核酸分子在次氯酸根的作用下发生断裂的敏感性高,有利于应用于荧光探针、生物活性分子的制备。
根据本发明的实施例,所述主链上的硫代磷酸酯修饰为1~10个。发明人发现,硫代磷酸酯的修饰个数为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10时,均可以响应次氯酸根的刺激,硫代磷酸二酯键发生断裂,从而使主链断裂为核酸片段。
根据本发明的实施例,所述核酸分子为gRNA。根据本发明的实施例,所述核酸分子为gRNA时,可以用于刺激响应型基因调控,通过响应次氯酸根浓度,改变gRNA的分子结构,进而调控靶位点的状态。
根据本发明的实施例,所述gRNA 5’端和/或3’端的至少一部分序列与靶标核酸序列相同,并且在5’端和/或3’端形成发卡结构;优选地,所述gRNA5’端和/或3’端具有与靶标序列相同的片段,所述与靶标核酸序列相同的片段长度为10nt~20nt。根据本发明实施例的gRNA在5’端和/或3’端的至少一部分序列与靶标核酸序列相同,进而可以与gRNA分子上与靶标核酸序列互补的核苷酸进行互补配对,形成发卡结构,gRNA分子则不能与靶标分子结合。
根据本发明的实施例,所述与靶标核酸序列相同的片段上具有至少一个硫代磷酸酯修饰。根据本发明实施例的gRNA,与靶标核酸序列相同的片段上具有至少一个硫代磷酸酯修饰,可以在次氯酸根的作用下发生断裂,脱离gRNA分子上与靶标核酸序列互补的核苷酸,使gRNA分子与靶标核酸序列互补的核酸完全暴露,进而可以与靶标核酸序列结合,引导Cas蛋白对靶标序列进行切割等生物学反应。
根据本发明的实施例,所述核酸分子呈可注射,或者所述核酸分子是以脂质、溶液形式呈现的。根据本发明的实施例,根据本发明实施例的核酸分子可以经过细胞显微注射、转染等方式进入细胞内;可以经过皮下注射、腹腔注射、静脉注射、肌肉注射等形式进入动物体内,所述动物为人、小鼠、猴子、大鼠等哺乳动物或者非哺乳动物;可以经过注射、孵育等方式进入植物体内,所述植物为水稻、玉米、拟南芥、小麦等。需要注意的是,所述gRNA也可以在体外溶液中发挥作用。
在本发明的第二方面,本发明提出了一种检测样品中次氯酸根的方法。根据本发明的实施例,所述方法包括:将上述带有荧光基团的核酸分子与待测样品接触,以便获得待检测试剂;检测待检测试剂的荧光强度,并与检测结果确定所述待测样品中是否含有次氯酸根和/或次氯酸根含量。根据本发明的实施例,所述荧光强度与次氯酸根的含量成正相关,荧光强度越强,代表样品中次氯酸根的含量越高。根据本发明的实施例,本发明的方法对于次氯酸根的检测限可以低至0.83nM,远低于一般荧光探针。
根据本发明的实施例,上述方法还可进一步包括如下附加技术特征至少之一:
根据本发明的实施例,所述方法进一步包括:利用含有不同浓度次氯酸根的标准品与所述核酸分子接触,并检测荧光强度,以便绘制标准曲线;将待检测试剂的荧光强度与标准曲线比对,以便获得待检测试剂中次氯酸根的含量。根据本发明实施例的方法,利用不同浓度的核酸分子或不同长度的核酸分子对样本品中的次氯酸根进行检测时,可以先利用次氯酸根标准品制备标准曲线,根据标准曲线中的荧光强度和次氯酸根浓度的关系,最终确定待检测样品中次氯酸根的浓度。
根据本发明的实施例,所述荧光强度不小于3a.u时是待测样品中含有次氯酸根的指示,所述荧光强度和次氯酸浓度成正相关。根据本发明实施例的方法,荧光强度达到3a.u及以上时,说明待检测样品中含有次氯酸根。需要注意的是,荧光强度与核酸分子上携带的荧光基团、核酸分子的长度等均有关系,荧光强度为3a.u是本发明实施例中一个较优的指示。
在本发明的第三方面,本发明提出了一种检测样品中次氯酸根的试剂盒。根据本发明的实施例,所述试剂盒中包括:上述带有荧光基团的核酸分子。根据本发明的实施例,所述试剂盒可以用于检测样品中的次氯酸根含量,所述样品中含有液体,可以为溶液、细胞、组织、器官等。
在本发明的第四方面,本发明提出了一种基因编辑系统。根据本发明的实施例,所述系统包括:上述带有发卡结构的gRNA分子。根据本发明实施例的基因编辑系统上述带有发卡结构的gRNA分子能够对次氯酸根响应的特性,在具有次氯酸根的环境下可以发挥gRNA分子的生物学活性,进而对目标基因进行编辑,在极低浓度次氯酸根或者不存在次氯酸根的情况下,核酸分子被修饰基团封闭,不可以发挥生物学功能。
根据本发明的实施例,上述基因编辑系统还可进一步包括如下附加技术特征至少之一:
根据本发明的实施例,所述系统进一步包括:Cas蛋白,所述Cas蛋白以DNA、RNA、多肽和蛋白质至少之一的形式存在,所述Cas蛋白包括选自Cas9、Cas12a、Cas12b和Cas13至少之一。根据本发明实施例的基因编辑系统利用Cas蛋白对其目标核酸进行切割,进而达到对目标核酸进行编辑的目的。
根据本发明的实施例,所述系统进一步包括:志愿分子,所述志愿分子以DNA和RNA至少之一的形式存在。根据本发明实施例的基因编辑系统,利用志愿分子作为模板,在目标核酸被切割之后,以志愿分子作为模板进行核酸的损伤修复,进而改变目标核酸的序列。
在本发明的第五方面,本发明提出了一种基因编辑方法。根据本发明的实施例,所述方法包括:向待编辑的核酸靶点,提供在本发明第四方面所提出的基因编辑系统;使所述核酸分子在次氯酸根的作用下,去除所述与靶标核酸序列相同的片段,以便在所述核酸靶点进行基因编辑。根据本发明的基因编辑方法,针对待编辑的核酸靶点设计所述核酸分子主链,核酸分子的3’末端和/或5’末端具有与靶标核酸序列相同的片段,并且该片段上具有硫代磷酸脂修饰。在极低浓度次氯酸根或者次氯酸根的情况下,核酸分子上与靶标核酸序列结合的位点被封闭形成环状结构,无法引导核酸编辑蛋白对目标核酸进行剪切等操作;在具有次氯酸根的条件下,核酸分子上与靶标核酸序列相同的片段被切除,恢复生物活性,可以发挥其向导RNA的作用,使目标核酸被核酸编辑蛋白剪切。
根据本发明的实施例,上述方法还可进一步包括如下附加技术特征至少之一:
根据本发明的实施例,所述次氯酸根是通过注射、孵育、生物体自身代谢提供。发明人发现,无论是通过技术手段外加给生物体的次氯酸根,还是生物体自身代谢异常导致细胞内过量的次氯酸根,均可以切除所述核酸分子上与靶标核酸序列相同的片段。
附图说明
图1为根据本发明实施例的可用于检测次氯酸浓度的核酸分子设计,其中(a)PS修饰的分子信标(PS-MB);(b)PS修饰的超短核酸分子;
图2为根据本发明实施例的PS-DNA和PO-DNA的结构及含不同结构的DNA被次氯酸处理后的产物的变性PAGE表征,其中,图(a)为PS-DNA的结构及被次氯酸处理后的产物的变性PAGE表征,图(b)为PO-DNA的结构及被次氯酸处理后的产物的变性PAGE表征;
图3为根据本发明实施例的PS修饰分子信标对次氯酸的浓度响应曲线;
图4为根据本发明实施例的PS修饰分子信标对其他ROS的特异性测试;
图5为根据本发明实施例的PS修饰的超短DNA分子对次氯酸的浓度响应曲线;
图6为根据本发明实施例的PS修饰的超短DNA分子对其他ROS的特异性测试;
图7为根据本发明实施例的PS-MB在Hela细胞中对次氯酸的响应;
图8为根据本发明实施例的用于进行次氯酸刺激响应CRISPR的向导RNA(gRNA)设计;
图9为根据本发明实施例的PS-gRNA被不同浓度次氯酸切割后的变性PAGE表征;
图10为根据本发明实施例的PS-gRNA介导的刺激响应CRISPR-Cas9的切割结果。
具体实施方式
下面详细描述本发明的实施例,所述实施例的示例在附图中示出。下面通过参考附图描述的实施例是示例性的,旨在用于解释本发明,而不能理解为对本发明的限制。
需要说明的是,在本文中所使用的次氯酸根可以以次氯酸、次氯酸盐等形式呈现。
需要说明的是,在本文中所使用的硫代磷酸酯(PS)修饰是指由硫原子取代核酸磷酸骨架上的非桥联氧原子,进而形成具有序列特异性和空间构象专一性的核酸大分子结构的一种核酸修饰方法。
在本发明的第一方面,本发明提出了一种核酸分子。根据本发明的实施例,所述核酸分子包括:主链,所述主链中含有核苷酸,所述主链的磷酸骨架上具有至少一个硫代磷酸酯修饰。根据本发明实施例的核酸分子上具有硫代磷酸脂修饰,所述具有硫代磷酸脂的核苷酸所形成的硫代磷酸二酯键只可以特异性地在次氯酸地存在下断裂,具有高度选择性。
根据本发明的实施例,所述核酸分子进一步包括:荧光基团对,所述荧光基团对中的两个基团分别与所述核酸分子两个末端相连,所述荧光基团对中的两个基团之间可以发生荧光共振能量转移。根据本发明的实施例,基于硫代磷酸酯(PS)修饰核酸探针上的硫代磷酸二酯键可以被次氯酸根(ClO-)特异性切割,并在PS位点处断裂的反应原理,设计了一段中间有PS修饰,两端分别标记荧光报告基团/荧光淬灭基团的可用于检测次氯酸或对细胞中的次氯酸进行原位成像的核酸探针。与传统小分子荧光探针相比,核酸探针设计灵活、合成简单。当核酸探针完整时,荧光报告基团与荧光淬灭基团的距离较近,不可以检测到荧光信号,当有次氯酸根存在的情况下,核酸分子被切割,荧光报告基团与荧光淬灭基团的距离较远,可以检测到荧光报告基团的荧光信号。
根据本发明的实施例,所述核酸分子为2nt~100nt。发明人发现,核酸分子可以为发卡型的分子信标(Molecular Beacon,MB),也可以为2nt~15nt的随机核酸序列,PS修饰数量可以为1~10个,如附图1所示。当核酸分子为分子信标时,由于发卡结构的存在,两端荧光报告基团与荧光淬灭基团距离较近,进而使荧光无法检测到,当具有硫代磷酸脂修饰的分子信标在次氯酸根的作用下断裂,荧光报告基团与荧光淬灭基团距离较远,进而可以检测到荧光信号。发明人发现,当核酸分子为随机核酸序列时,长度为5nt时对次氯酸根相响应的灵敏度高,且噪音小。
根据本发明的具体实施例,当核酸分子为分子信标(PS-MB)时,以序列5’-FAM-CACGCT*CAAAAAAAAAAAGAGC*GTG-Dabcyl-3’为例,PS-MB在缓冲液中会形成发卡结构,5’端FAM会接近3’端Dabcyl,从而荧光被淬灭。当溶液中存在一定浓度次氯酸时,PS-MB可在PS处被切割断裂成5’-FAM-CACGCT-3’、5’-CAAAAAAAAAAAGAGC-3’及5’-GTG-Dabcyl-3’,FAM远离Dabcyl,溶液中的荧光增强。当核酸分子为短链DNA时,以序列5’-FAM-TTA*TT-Dabcyl-3’为例,该短链DNA的5’距离3’近,FAM被Dabcyl淬灭,溶液无荧光。当溶液中存在一定浓度次氯酸时,5’-FAM-TTA*TT-Dabcyl-3’可被次氯酸切割断裂,FAM远离Dabcyl,溶液中荧光增强。在此基础上,本发明随后将PS-MB转染至细胞中,发现未经HClO处理过的细胞荧光较弱,而经HClO处理过的细胞则有较强荧光,如附图6所示。
在本发明的另一方面,本发明提出了一种具有发卡结构的gRNA,根据本发明的实施例,所述gRNA为可被次氯酸根切割断裂的掩蔽gRNA,如图8所示。所述gRNA 5’端和/或3’端的至少一部分序列与靶标核酸序列相同,并且在5’端和/或3’端形成发卡结构;优选地,所述gRNA5’端和/或3’端具有与靶标序列相同的片段,所述与靶标核酸序列相同的片段长度为10nt~20nt。根据本发明实施例的gRNA在5’端和/或3’端的至少一部分序列与靶标核酸序列相同,进而可以与gRNA分子上与靶标核酸序列互补的核苷酸进行互补配对,形成发卡结构,gRNA分子则不能与靶标分子结合。
根据本发明的具体实施例,如附图7所示,gRNA可以为一段式的sgRNA也可以为两段式的crRNA+tracrRNA。当为crRNA+tracrRNA时,以EMX1 crRNA(hp,*)为例,其序列TTGT*ACTTT*GTCCT*ACCGGAGGACAAAGUACAAAGUUUUAGAGCUAUGCUGUUUUG。当溶液或细胞中不存在次氯酸时,EMX1 crRNA(hp,*)会自身形成发卡结构,其靶向目标基因靶点的序列将会被掩蔽,无法介导CRISPR-Cas9基因编辑;当溶液或细胞中存在一定浓度次氯酸时,EMX1 crRNA(hp,*)可在PS位点处被次氯酸切割成原始EMX1 crRNA序列:ACCGGAGGACAAAGUACAAAGUUUUAGAGCUAUGCUGUUUUG,从而可与tracrRNA一起介导Cas9对靶点进行基因编辑。
在本发明的又一方面,本发明提出了一种基因编辑系统。所述系统包括:上述带有发卡结构的gRNA分子。根据本发明实施例的基因编辑系统上述带有发卡结构的gRNA分子能够对次氯酸根响应的特性,在具有次氯酸根的环境下可以发挥gRNA分子的生物学活性,进而对目标基因进行编辑,在极低浓度次氯酸根或者不存在次氯酸根的情况下,核酸分子被修饰基团封闭,不可以发挥生物学功能。
根据本发明的实施例,上述基因编辑系统还可进一步包括如下附加技术特征至少之一:
根据本发明的实施例,所述系统进一步包括:Cas蛋白,所述Cas蛋白以DNA、RNA、多肽和蛋白质至少之一的形式存在,所述Cas蛋白包括选自Cas9、Cas12a、Cas12b和Cas13至少之一。根据本发明实施例的基因编辑系统利用Cas蛋白对其目标核酸进行切割,进而达到对目标核酸进行编辑的目的,本基因编辑系统中的Cas蛋白以DNA、RNA、多肽和蛋白质至少之一的形式存在,在发挥其生物学功能时,DNA、RNA、多肽则需要经过转录和翻译等生物学过程,形成具有生物学活性的蛋白质形式。
根据本发明的实施例,所述系统进一步包括:志愿分子,所述志愿分子以DNA和RNA至少之一的形式存在。根据本发明实施例的基因编辑系统,利用志愿分子作为模板,在目标核酸被切割之后,以志愿分子作为模板进行核酸的损伤修复,进而改变目标核酸的序列。
根据本发明的实施例,所述核酸分子可以制备为药物组合物,用于诊断和治疗与次氯酸根升高有关的疾病,如线粒体损伤、衰老、肿瘤、神经退行性疾病、糖尿病、动脉硬化等疾病,在细胞内次氯酸根异常升高的情况下,所述核酸分子可以与Cas蛋白配合对与疾病相关基因或者与次氯酸根升高有关的基因进行特异性编辑,进而减轻病症。
下面将结合具体实施例对本发明进行进一步解释说明。下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明,均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等,如无特殊说明,均可从商业途径得到。
实验方法:
1、在pH 4~10的缓冲体系或者水中,将PS修饰的MB或PS修饰同时两端分别标记荧光基团/淬灭基团的短链DNA分子(1nM~10μM)与一定浓度的次氯酸(1nM~10μM)混合均匀,在4℃~60℃下反应10min~20h。用荧光分光光度计对反应产物进行荧光强度测定。
2、用脂质体或纳米颗粒将PS-MB或PS修饰同时两端分别标记荧光基团/淬灭基团的短链DNA或RNA分子转染进细胞(人或其他动物细胞),核酸分子在培养基中的浓度为1nM~1μM,转染10min~12h后,对细胞进行换液,换成含次氯酸或其他可诱导细胞产生次氯酸的化合物的培养基。细胞中的核酸分子和次氯酸作用10min~4h后,用荧光显微镜或共聚焦荧光显微镜对细胞进行成像分析。
3、在pH在6~8之间缓冲液体系,如HEPES(羟乙基哌嗪乙硫磺酸)缓冲、Tris(三羟甲基氨基甲烷)、磷酸盐缓冲液、碳酸盐缓冲液等,以gRNA(PS-gRNA或gRNA)、Cas9、切割底物为反应物,RNA的反应浓度为10nM~1mM,Cas9的反应浓度为100nM~1mM,切割底物反应浓度为1nM~100μM,次氯酸浓度为0-100μM,在37℃下反应0.1h~50h。反应产物用琼脂糖凝胶电泳进行表征。
实施例一:次氯酸在PS位点处对PS-DNA进行切割
为了验证次氯酸可对PS修饰DNA进行切割,选用PS-DNA:5’-CGCGAC*ATTGTGCCCTGCTCGCGCAATATC-3’和PO-DNA:5’-CGCGACATTGTGCCCTGCTCGCGCAATATC-3’进行实验。在10mM PBS,pH 6.0缓冲体系中,DNA(PS-DNA或PO-DNA)浓度为10μM,其中PS-DNA为具有硫代磷酸酯的DNA,PO-DNA为不具有硫代磷酸脂修饰的DNA。次氯酸浓度分别为0、10μM、100μM、1000μM,将混合液置于37℃反应1h。用20%变性PAGE对反应产物进行表征,结果如图2所示,PS-DNA经高浓度次氯酸处理后会发生断裂,而PO-DNA则不会被次氯酸切割。
实施例二:PS-MB用于检测次氯酸
PS-MB序列为5’-FAM-CACGCT*CAAAAAAAAAAAGAGC*GTG-Dabcyl-3’,在1xPBS缓冲液中,PS-MB浓度为200nM,对PS-MB进行退火处理(95℃3min,而后室温缓慢冷却),以利于分子信标结构的形成。而后,向体系中加入次氯酸,次氯酸浓度分别为0、100nM、200nM、500nM、1000nM,将次氯酸和PS-MB的混合液置于37℃反应1h,而后用荧光分光光度计进行荧光测定,激发/发射波长为490nm/520nm。结果如图3所示。当体系中不存在次氯酸时,520nm的发射光荧光值约为5a.u,随着体系中次氯酸浓度升高,荧光强度逐渐增强,当次氯酸浓度达到1μM时,体系荧光值可达约16a.u,次氯酸检测曲线如图3b所示,线性检测范围为0~1μM,根据检测限为3σ/坡度的定义,该检测体系检测限为18nM。
实施例三:PS-MB对次氯酸的其他活性氧(ROS)的特异性响应测试
特异性测试反应体系中的ROS,除次氯酸钠的终浓度为1μM外,H2O2、TBHP、·OH、O2 -等终浓度均为10μM,PS-MB的终浓度为200nM,缓冲体系为1xPBS。10μM H2O2和10μM TBHP分别由30%H2O2和70%TBHP稀释得到;10μM·OH由50μM Fe2+和10μM H2O2通过芬顿反应制得,采用NADH-PMS体系产生O2 -,反应体系中NADH终浓度为25μM,PMS为10μM。将该反应体系置于37℃条件反应1h。结果如图4所示。1μM可导致的荧光值约为70a.u,而10μM除·OH以外的其他活性氧分子导致的荧光值均和不含次氯酸的体系相当,10μM·OH会使得体系的荧光值由10a.u左右上升至20a.u左右。这表明除了次氯酸外,PS-MB对游离羟基(·OH)有轻微响应,对其他常见活性氧无响应。
实施例四:5nt PS-DNA用于检测次氯酸及其对其他ROS的特异性测试
5nt PS-DNA序列为5’-FAM-TTA*TT-Dabcyl-3’,在1xPBS缓冲液中,5nt PS-DNA浓度为100nM,向体系中加入次氯酸,次氯酸浓度分别为0、10nM、20nM、50nM、100nM、150nM,将次氯酸和DNA的混合液置于37℃反应1h,而后用荧光分光光度计进行荧光测定,激发/发射波长为490nm/520nm。检测曲线如图5所示。当体系中不存在次氯酸时,520nm的发射光荧光值约为2a.u,随着体系中次氯酸浓度升高,荧光强度逐渐增强,当次氯酸浓度为1μM时,体系荧光值可至95a.u左右。线性检测范围为0~160nM,根据检测限为3σ/坡度的定义,该检测体系检测限为0.83nM。特异性测试实验中,5nt PS-DNA浓度为100nM,其他条件如实施实例三,结果如图6所示。1μM可导致的荧光值约为95a.u,而10μM除·OH以外的其他活性氧分子导致的荧光值均和不含次氯酸的体系相当,10μM·OH会使得体系的荧光值由2a.u左右上升至5a.u左右。
实施例五:PS-MB用于细胞次氯酸成像分析
在含DMEM、10%FBS及双抗的培养基中培养Hela细胞,当细胞长到约70%汇合度时,对细胞进行传代并铺板至共聚焦玻底皿(~1cm孔径)中。铺板时所用的培养基为含10%FBS的DMEM(不含双抗)。约20h后,当玻底皿中的细胞长到约70%汇合度时,对细胞进行转染。转染试剂采用Life Technologies的lipo 3000,转染方法参照产品说明书并稍作修改。向各玻底皿中用lipo 3000转入100pmol的PS-MB,转染完2h后,对玻底皿中的细胞进行换培养基处理(w/wo 5μM次氯酸)。经次氯酸处理1h后,对细胞进行成像分析。结果如图7所示。当细胞中不含次氯酸时,共聚焦荧光显微镜下只能观测到微弱荧光;含5μM次氯酸的细胞在荧光显微镜下能观测到较强的荧光。
实施例六:PS-gRNA被次氯酸切割
PS-gRNA序列为TTGT*ACTTT*GTCCT*ACCGGAGGACAAAGUACAAAGUUUUAGAGCUAUGCUGUUUUG,在1xNEB Cas9 buffer体系中,PS-gRNA浓度为1μM,次氯酸浓度分别为0、1μM、5μM、10μM、20μM、50μM、100μM、1mM,将PS-gRNA和次氯酸的反应混合液置于37℃反应1h,用10%变性PAGE对反应产物进行表征,并用SYBR gold对PAGE胶染色,结果如图9所示。当次氯酸浓度为0-5μM时,变性PAGE上观察不到明显的经切割得到的gRNA;当次氯酸浓度达到10μM时,约5%的PS-gRNA被切割为gRNA,且随着次氯酸浓度升高,切割比例逐步增大。
实施例七:次氯酸刺激响应CRISPR-Cas9体系
用基因组提取试剂盒提取293T细胞的的gDNA,以之为模板,同时分别以EMX1 fw和EMX1 rv为正反向引物进行PCR扩增,PCR产物用胶提取试剂盒(Omega)进行纯化,得到EMX1dsDNA。用UV260对EMX1 dsDNA进行浓度测定并以之作为体外切割反应的底物。将1μL 1μMEMX1 crRNA(PS-gRNA或gRNA)、1μL 1μM tracrRNA、0.5μL 1μM Cas9、1μL不同浓度次氯酸、1μL 30nM EMX1 dsDNA底物、24.5μL H2O以及1μL 10xNEBufferTM3.1缓冲液混合于PCR管并置于PCR仪中37℃孵育1h,次氯酸终浓度分别为0、1μM、5μM、10μM、20μM。反应产物用1.5%琼脂糖凝胶电泳进行鉴定,结果如附图10所示。最左侧的泳道为DL 2000DNA marker,泳道1为不加gRNA的负对照,泳道2为添加gRNA的正对照,泳道3~7为添加PS-gRNA及不同浓度次氯酸(0、1μM、5μM、10μM、20μM)的切割结果。结果表明,不添加次氯酸时,PS-gRNA无法介导Cas9切割dsDNA底物;添加次氯酸后,PS-gRNA在PS处发生断裂,断裂所得的gRNA可介导Cas9切割底物。
此外,术语“第一”、“第二”仅用于描述目的,而不能理解为指示或暗示相对重要性或者隐含指明所指示的技术特征的数量。由此,限定有“第一”、“第二”的特征可以明示或者隐含地包括至少一个该特征。在本发明的描述中,“多个”的含义是至少两个,例如两个,三个等,除非另有明确具体的限定。
在本说明书的描述中,参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中,对上述术语的示意性表述不必须针对的是相同的实施例或示例。而且,描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。此外,在不相互矛盾的情况下,本领域的技术人员可以将本说明书中描述的不同实施例或示例以及不同实施例或示例的特征进行结合和组合。
尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例,可以理解的是,上述实施例是示例性的,不能理解为对本发明的限制,本领域的普通技术人员在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。
Claims (9)
1.一种核酸分子,其特征在于,包括:
主链,所述主链中含有核苷酸,所述主链的磷酸骨架上具有至少一个硫代磷酸酯修饰;
荧光基团对,所述荧光基团对中的两个基团分别与所述核酸分子两个末端相连,所述荧光基团对中的两个基团之间可以发生荧光共振转移;
所述核酸分子为gRNA;
所述gRNA 5’端的至少一部分序列与靶标核酸序列相同,并且在5’端形成发卡结构,所述发卡结构使得所述gRNA不能与所述靶标核酸序列结合;
所述gRNA 经次氯酸根切割后能与所述靶标核酸序列结合;
所述与靶标核酸序列相同的片段上具有至少一个硫代磷酸酯修饰。
2.根据权利要求1所述的核酸分子,其特征在于,所述荧光基团对包括下列至少之一:
5' 6-FAM/3' BHQ1、5' 6-FAM/3' BHQ2、5' 6-FAM/3' TAMRA、5' 6-FAM/3' Dabcyl、5'6-FAM/3' Eclipse、5' 6-FAM/3' MGB、5' TET/3' BHQ1、5' TET/3' BHQ2、5' TET/3'TAMRA、5' TET/3' Dabcyl、5' TET/3' MGB、5' JOE/3' BHQ1、5' JOE/3' BHQ2、5' JOE/3'TAMRA、5' JOE/3' Dabcyl、5' JOE/3' MGB、5' HEX/3' BHQ1、5' HEX/3' BHQ2、5' HEX/3'TAMRA、5' HEX/3' Dabcyl、5' HEX/3' Eclipse、5' HEX/3' MGB、5' VIC/3' BHQ1、5' VIC/3' BHQ2、5' VIC/3' MGB、5' CY3/3' BHQ2、5' CY3/3' Dabcyl、5' CY3/3' MGB、5' TAMRA/3' BHQ2、5' TAMRA/3' Dabcyl、5' TAMRA/3' Eclipse、5' TAMRA/3' MGB、5' ROX/3'BHQ2、5' ROX/3' Dabcyl、5' ROX/3' Eclipse、5' ROX/3' MGB、5' Texas Red/3' BHQ2、5'Texas Red/3' Dabcyl、5' Texas Red/3' MGB、5' Quasar 670/3' BHQ2、5' Quasar 670/3' BHQ3、5' CY5/3' BHQ2、5' CY5/3' BHQ3、5' CY5/3' Dabcyl、5' CY5/3' MGB和5'CY5.5/3' BHQ2。
3.根据权利要求1所述的核酸分子,其特征在于,所述主链上的硫代磷酸酯修饰为1~10个。
4.根据权利要求1所述的核酸分子,其特征在于,
所述gRNA 5’端具有与靶标序列相同的片段,所述与靶标核酸序列相同的片段长度为10 nt-20 nt。
5.一种检测样品中次氯酸根的方法,其特征在于,所述方法用于非诊断目的,包括:
将权利要求1~4任一项所述的核酸分子与待测样品接触,以便获得待检测试剂;
检测待检测试剂的荧光强度,并与检测结果确定所述待测样品中是否含有次氯酸根和/或次氯酸根含量。
6.根据权利要求5所述的方法,其特征在于,进一步包括:
利用含有不同浓度次氯酸根的标准品与所述核酸分子接触,并检测荧光强度,以便绘制标准曲线;
将待检测试剂的荧光强度与标准曲线比对,以便获得待检测试剂中次氯酸根的含量;
任选地,所述荧光强度不小于3a.u时是待测样品中含有次氯酸根的指示,所述荧光强度和次氯酸浓度成正相关。
7.一种检测样品中次氯酸根的试剂盒,其特征在于,包括:权利要求1~4任一项所述的核酸分子。
8.根据权利要求1~4、7任一项所述的核酸分子,其特征在于,所述核酸分子呈可注射,或者所述核酸分子是以脂质、溶液形式呈现的。
9.一种基因编辑系统,其特征在于,包括:权利要求1~4任一项所述的核酸分子,
可选的,进一步包括:Cas蛋白,所述Cas蛋白以DNA、RNA、多肽和蛋白质至少之一的形式存在,所述Cas蛋白包括选自Cas9、Cas12a、Cas12b和Cas13至少之一;
可选地,进一步包括:志愿分子,所述志愿分子作为模板进行所述核酸分子的损伤修复,所述志愿分子以DNA和RNA至少之一的形式存在。
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