KR20150132395A - Rna-안내 게놈 편집의 특이성을 증가시키기 위한 rna-안내 foki 뉴클레아제(rfn)의 용도 - Google Patents

Rna-안내 게놈 편집의 특이성을 증가시키기 위한 rna-안내 foki 뉴클레아제(rfn)의 용도 Download PDF

Info

Publication number
KR20150132395A
KR20150132395A KR1020157029177A KR20157029177A KR20150132395A KR 20150132395 A KR20150132395 A KR 20150132395A KR 1020157029177 A KR1020157029177 A KR 1020157029177A KR 20157029177 A KR20157029177 A KR 20157029177A KR 20150132395 A KR20150132395 A KR 20150132395A
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
artificial sequence
dna
lys
leu
description
Prior art date
Application number
KR1020157029177A
Other languages
English (en)
Other versions
KR102210322B1 (ko
Inventor
제이. 케이쓰 중
솅다르 차이
Original Assignee
더 제너럴 하스피탈 코포레이션
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=51537665&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=KR20150132395(A) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by 더 제너럴 하스피탈 코포레이션 filed Critical 더 제너럴 하스피탈 코포레이션
Priority to KR1020217002429A priority Critical patent/KR102271292B1/ko
Publication of KR20150132395A publication Critical patent/KR20150132395A/ko
Application granted granted Critical
Publication of KR102210322B1 publication Critical patent/KR102210322B1/ko

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/87—Introduction of foreign genetic material using processes not otherwise provided for, e.g. co-transformation
    • C12N15/90—Stable introduction of foreign DNA into chromosome
    • C12N15/902—Stable introduction of foreign DNA into chromosome using homologous recombination
    • C12N15/907—Stable introduction of foreign DNA into chromosome using homologous recombination in mammalian cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/01—Preparation of mutants without inserting foreign genetic material therein; Screening processes therefor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
    • C12N15/102—Mutagenizing nucleic acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
    • C12N15/102—Mutagenizing nucleic acids
    • C12N15/1031—Mutagenizing nucleic acids mutagenesis by gene assembly, e.g. assembly by oligonucleotide extension PCR
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
    • C12N9/0071—Oxidoreductases (1.) acting on paired donors with incorporation of molecular oxygen (1.14)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/10—Transferases (2.)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/10—Transferases (2.)
    • C12N9/1003—Transferases (2.) transferring one-carbon groups (2.1)
    • C12N9/1007—Methyltransferases (general) (2.1.1.)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/16—Hydrolases (3) acting on ester bonds (3.1)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/16—Hydrolases (3) acting on ester bonds (3.1)
    • C12N9/22—Ribonucleases RNAses, DNAses
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/96—Stabilising an enzyme by forming an adduct or a composition; Forming enzyme conjugates
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y301/00—Hydrolases acting on ester bonds (3.1)
    • C12Y301/21—Endodeoxyribonucleases producing 5'-phosphomonoesters (3.1.21)
    • C12Y301/21004—Type II site-specific deoxyribonuclease (3.1.21.4)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/01—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/80—Fusion polypeptide containing a DNA binding domain, e.g. Lacl or Tet-repressor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/10—Type of nucleic acid
    • C12N2310/20—Type of nucleic acid involving clustered regularly interspaced short palindromic repeats [CRISPRs]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
    • C12N2710/00011—Details
    • C12N2710/00033—Use of viral protein as therapeutic agent other than vaccine, e.g. apoptosis inducing or anti-inflammatory
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2770/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses positive-sense
    • C12N2770/00011—Details
    • C12N2770/00033—Use of viral protein as therapeutic agent other than vaccine, e.g. apoptosis inducing or anti-inflammatory
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2800/00—Nucleic acids vectors
    • C12N2800/80—Vectors containing sites for inducing double-stranded breaks, e.g. meganuclease restriction sites
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y114/00—Oxidoreductases acting on paired donors, with incorporation or reduction of molecular oxygen (1.14)
    • C12Y114/11—Oxidoreductases acting on paired donors, with incorporation or reduction of molecular oxygen (1.14) with 2-oxoglutarate as one donor, and incorporation of one atom each of oxygen into both donors (1.14.11)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y201/00—Transferases transferring one-carbon groups (2.1)
    • C12Y201/01—Methyltransferases (2.1.1)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y301/00—Hydrolases acting on ester bonds (3.1)

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Crystallography & Structural Chemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Developing Agents For Electrophotography (AREA)
  • Lubricants (AREA)
  • Prostheses (AREA)

Abstract

RNA-안내 게놈 편집, 예를 들어, CRISPR/Cas9 시스템을 이용하는 편집의 특이성을 증가시키는 방법.

Description

RNA-안내 게놈 편집의 특이성을 증가시키기 위한 RNA-안내 FOKI 뉴클레아제(RFN)의 용도{USING RNA-GUIDED FOKI NUCLEASES (RFNS) TO INCREASE SPECIFICITY FOR RNA-GUIDED GENOME EDITING}
우선권의 주장
본 출원은 미국 특허법(35 USC §119(e)) 하에서 2013년 3월 15일자로 출원된 미국 특허 출원 제61/799,647호; 2013년 6월 21일자로 출원된 제61/838,178호; 2013년 6월 21일자로 출원된 제61/838,148호; 및 2013년 12월 26일자로 출원된 제61/921,007호의 우선권을 주장한다. 이들 기초출원의 전문은 본 명세서에 참고로 포함된다.
연방정부 지원된 연구 또는 개발
본 발명은 미국국립보건원에 의해 부여된 등록번호 DP1 GM105378의 하에서 정부 지원으로 이루어졌다. 정부는 본 발명에 특정 권리를 가진다.
본 발명의 기술분야
RNA-안내 게놈 편집, 예를 들어, CRISPR/Cas9 시스템을 이용하고, RNA-안내 FokI 뉴클레아제(RFNs), 예를 들어, FokI-dCas9 융합 단백질을 이용하는 편집의 특이성을 증가시키는 방법.
최근의 연구는 군집된, 주기적으로 간격을 둔 짧은 회문구조 반복부(regularly interspaced, short palindromic repeat: CRISPR)/CRISPR-관련(Cas) 시스템(Wiedenheft et al., Nature 482, 331-338 (2012); Horvath et al., Science 327, 167-170 (2010); Terns et al., Curr Opin Microbiol 14, 321-327 (2011))이 박테리아, 효모 및 인간 세포뿐만 아니라 과실파리, 제브라피쉬 및 마우스과 같은 전체 유기체에서 생체내에서 기준 게놈 편집으로서 작용할 수 있다는 것을 입증하였다(Wang et al., Cell 153, 910-918 (2013); Shen et al., Cell Res (2013); Dicarlo et al., Nucleic Acids Res (2013); Jiang et al., Nat Biotechnol 31, 233-239 (2013); Jinek et al., Elife 2, e00471 (2013); Hwang et al., Nat Biotechnol 31, 227-229 (2013); Cong et al., Science 339, 819-823 (2013); Mali et al., Science 339, 823-826 (2013c); Cho et al., Nat Biotechnol 31, 230-232 (2013); Gratz et al., Genetics 194(4):1029-35 (2013)) . 스트렙토코커스 피오게네스(S. pyogenes)로부터의 Cas9 뉴클레아제(본 명세서에서 이후에 단순히 Cas9)는 공학적으로 조작된 gRNA의 처음 20개 뉴클레오타이드와 프로토스페이서 인접 모티프(protospacer adjacent motif: PAM), 예를 들어, 서열 NGG 또는 NAG를 매칭하는 PAM 다음에 놓이는 관심 대상의 표적 게놈 DNA 서열의 상보성 가닥 사이의 염기쌍 상보성을 통해 안내될 수 있다(Shen et al., Cell Res (2013); Dicarlo et al., Nucleic Acids Res (2013); Jiang et al., Nat Biotechnol 31, 233-239 (2013); Jinek et al., Elife 2, e00471 (2013); Hwang et al., Nat Biotechnol 31, 227-229 (2013); Cong et al., Science 339, 819-823 (2013); Mali et al., Science 339, 823-826 (2013c); Cho et al., Nat Biotechnol 31, 230-232 (2013); Jinek et al., Science 337, 816-821 (2012)). 박테리아에서(Jiang et al., Nat Biotechnol 31, 233-239 (2013)) 그리고 인간 세포에서(Cong et al., Science 339, 819-823 (2013)) 시험관내에서 수행한 이전의 연구(Jinek et al., Science 337, 816-821 (2012))는 Cas9-매개된 절단이, 일부 경우에, gRNA/표적 부위 계면에서, 특히 20개의 뉴클레오타이드(nt) gRNA 상보성 영역의 3' 말단에 위치된 마지막 10 내지 12개의 뉴클레오타이드(nt)에서 단일의 미스매치에 의해 없어질 수 있다는 것을 나타내었다.
다수의 연구는 CRISPR-Cas 뉴클레아제가 5개까지의 미스매치를 용인하고, 여전히 절단할 수 있으며; 활성에 대한 임의의 주어진 단일 또는 조합의 효과를 예측하기가 어렵다는 것을 나타내었다. 종합하면, 이들 뉴클레아제는 상당한 표적을 벗어난 효과를 나타낼 수 있지만, 이들 부위를 예측하기 위해 시험감염시킬 수 있다. CRISPR/Cas 시스템을 이용하여, 예를 들어, RNA-안내 FokI 뉴클레아제(RFNs), 예를 들어, FokI-Cas9 또는 FokI-dCas9-based 융합 단백질을 이용하여 특이성을 증가시키는 방법이 본 명세서에 기재된다.
제1 양태에서, 본 발명은 dCas9의 말단, 예를 들어, N 말단에, 선택적으로 개재 링커(intervening linker), 예를 들어 2 내지 30개의 아미노산, 예를 들어 4 내지 12개의 아미노산, 예를 들어, Gly4Ser으로부터의 링커를 개재해서, 융합된 FokI 촉매적 도메인 서열을 포함하는, FokI-dCas9 융합 단백질을 제공한다. 일부 실시형태에서, FokI 촉매적 도메인은 서열번호 4의 아미노산 388 내지 583 또는 408 내지 583을 포함한다. 일부 실시형태에서, dCas9는 D10, E762, H983, 또는 D986에서; 및 H840 또는 N863에서의 돌연변이를 포함하는 돌연변이; 예를 들어, (i) D10A 또는 D10N; 및 (ii) H840A, H840Y 또는 H840N을 포함한다.
다른 양태에서, 본 발명은 이들 융합 단백질을 암호화하는 핵산, 핵산을 포함하는 벡터 및 핵산, 벡터, 또는 융합 단백질을 보유하거나 또는 발현시키는 숙주 세포를 제공한다.
다른 양태에서, 본 발명은 이중-가닥 DNA 분자에서, 예를 들어, 세포 내 게놈 서열에서 서열-특이적 파손을 유도하는 방법을 제공하며, 상기 방법은,
(a) 2개의 단일 안내 RNA(안내 RNA 둘 다를 이용하는 것이 가닥 둘 다의 표적화를 초래하도록(즉, 하나의 단일 안내 RNA가 제1 가닥을 표적화하고, 다른 하나의 안내 RNA가 상기 상보성 가닥을 표적화하도록) 2개의 단일 안내 RNA가 각각 표적 서열 중 한 가닥에 각각 상보성인 서열을 포함하고, FokI는 각각의 가닥을 절단하여 마주보는 DNA 가닥 상에서 한 쌍의 틈을 생성함으로써 이중-가닥 파손을 유발함), 또는
(b) tracrRNA와 2개의 crRNA(crRNA를 이용하는 것이 가닥 둘 다의 표적화를 초래하도록(즉, 하나의 crRNA는 제1 가닥을 표적화하고, 다른 하나의 crRNA는 상보성 가닥을 표적화함) 2개의 crRNA가 각각 표적 서열 중 한 가닥에 상보성인 서열을 포함하고, FokI는 각각의 가닥을 절단하여 마주보는 DNA 가닥 상에서 한 쌍의 틈을 생성함으로써 이중-가닥 파손을 유발함), 및
본 명세서에 기재된 FokI-dCas9 융합 단백질을 세포 내에서 발현시키는 단계 또는 이들과 세포를 접촉시키는 단계를 포함한다,
다른 양태에서, 본 발명은 세포 내에서 RNA-안내 게놈 편집의 특이성을 증가시키는 방법을 제공하며, 상기 방법은 본 명세서에 기재된 RNA-안내 FokI 뉴클레아제 (RFN) 융합 단백질과 세포를 접촉시키는 단계를 포함한다.
상기 방법은 (a) 2개의 단일 안내 RNA(안내 RNA 둘 다를 이용하는 것이 가닥 둘 다의 표적화를 초래하도록(즉, 하나의 단일 안내 RNA가 제1 가닥을 표적화하고, 다른 하나의 안내 RNA가 상기 상보성 가닥을 표적화하도록) 2개의 단일 안내 RNA가 각각 표적 서열 중 한 가닥에 각각 상보성인 서열을 포함하고, FokI는 각각의 가닥을 절단하여 마주보는 DNA 가닥 상에서 한 쌍의 틈을 생성함으로써 이중-가닥 파손을 유발함), 또는
(b) tracrRNA와 2개의 crRNA(crRNA를 이용하는 것이 가닥 둘 다의 표적화를 초래하도록(즉, 하나의 crRNA는 제1 가닥을 표적화하고, 다른 하나의 crRNA는 상보성 가닥을 표적화함) 2개의 crRNA가 각각 표적 서열 중 한 가닥에 상보성인 서열을 포함하고, FokI는 각각의 가닥을 절단하여 마주보는 DNA 가닥 상에서 한 쌍의 틈을 생성함으로써 이중-가닥 파손을 유발함)를 세포 내에서 발현시키거나 또는 이들을 세포와 접촉시키는 단계를 추가로 포함할 수 있다.
일부 실시형태에서, 2개의 표적 게놈 서열(즉, crRNA 및 단일 안내 RNA의 표적 상보성 영역이 상보적인 서열)은 10 내지 20개의 염기쌍만큼 떨어져 있으며, 바람직하게는 13 내지 17개의 염기쌍만큼 떨어져있다.
일부 실시형태에서, 삽입결실 돌연변이는 두 표적 서열 간에 유도된다.
일부 실시형태에서, 세포 내 RNA-안내 게놈 편집의 특이성은 증가된다.
달리 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용되는 모든 기술적 및 과학적 용어는 본 발명이 속하는 기술분야의 당업자에 의해 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 가진다. 방법 및 물질은 본 발명에서 사용을 위해 본 명세서에 기재되며; 당업계에 공지된 다른, 적합한 방법 및 물질이 또한 사용될 수 있다. 물질, 방법 및 예는 단지 예시적이며, 제한하는 것으로 의도되지 않는다. 모든 간행물, 특허출원, 특허, 서열, 데이터베이스 엔트리 및 본 명세서에 언급된 다른 참고문헌은 그들의 전문이 참고로 포함된다. 상충되는 경우에, 정의를 포함하는 본 명세서로 조절할 것이다.
본 발명의 다른 특징 및 이점은 다음의 상세한 설명 및 도면으로부터 그리고 청구범위로부터 명확하게 될 것이다.
도 1은 gRNA/Cas9 뉴클레아제 복합체가 그의 표적 DNA 부위에 결합되는 것을 개략적으로 도시한 도면. 가위는 게놈 DNA 표적 부위 상에서 Cas9 뉴클레아제의 대략의 절단 지점을 표시한다. 안내 RNA 상의 뉴클레오타이드의 넘버링은 5'으로부터 3'까지의 역방식으로 진행한다는 것을 주의한다.
도 2a는 gRNA의 5' 상보성 영역을 절단하기 위한 이유를 개략적으로 도시한 도면. 굵은 회색선 = 표적 DNA 부위, 얇은 진한 회색선 구조 = gRNA, 회색 타원 = Cas9 뉴클레아제, 검정색 선은 gRNA와 표적 DNA 부위 사이의 염기쌍을 나타낸다.
도 2b는 EGFP 붕괴 분석의 개략적 개요를 도시한 도면. 오류유발 NHEJ-매개된 수선에 의한 단일 통합 EGFP-PEST 리포터 유전자 내의 표적화된 Cas9-매개된 이중-가닥 파손의 수선은 암호 서열 및 세포 내 형광의 관련된 손실을 붕괴시키는 틀 이동 돌연변이를 야기한다.
도 2c 내지 도 2f는 (c) 단일 미스매치, (d) 인접한 이중 미스매치, (e) 가변적으로 간격을 둔 이중 미스매치, 및 (f) EGFP 리포터 유전자 서열 내 3개의 상이한 표적 부위 상에서 분석된 인접한 미스매치의 증가된 수를 보유하는, sgRNA를 보유하는 RGN의 활성을 도시한 도면. 복제물의 평균 활성(온라인 방법 참조)을 나타내고, 완전히 매칭된 단일 gRNA의 활성에 대해 정규화시킨다. 오차막대(Error bar)는 평균 표준오차를 나타낸다. 각각의 단일 gRNA에서 미스매칭된 위치를 아래쪽의 격자에서 회색으로 강조한다. 3개의 EGFP 표적 부위의 서열은 다음과 같았다:
EGFP 부위 1 GGGCACGGGCAGCTTGCCGGTGG(서열번호 1)
EGFP 부위 2 GATGCCGTTCTTCTGCTTGTCGG(서열번호 2)
EGFP 부위 3 GGTGGTGCAGATGAACTTCAGGG(서열번호 3)
도 2g는 gRNA의 5' 말단에서의 미스매치가 CRISPR/Cas를 3' 미스매치에 더 민감하게 만드는 것을 도시한 도면. 위치의 예외를 지니는 RNA와 DNA 사이의 gRNA 왓슨-크릭(Watson-Crick) 염기쌍은 왓슨-크릭 염기전환을 이용하여 미스매칭되는 "m"으로 표시된다(즉, EGFP 부위#2 M18 내지 19는 위치 18 및 19에서 gRNA를 그의 왓슨-크릭 상대로 바꿈으로써 미스매칭된다. gRNA의 5' 근처의 위치는 일반적으로 매우 잘 용인되지만, 이들 위치에서의 매치는 다른 잔기가 미스매칭될 때 뉴클레아제 활성에 중요하다. 모두 4개의 위치가 미스매칭될 때, 뉴클레아제 활성은 더 이상 검출가능하지 않다. 이는 추가로 이들 5' 위치에서의 매치가 다른 더 3'인 위치에서의 미스매치를 보상하게 할 수 있다는 것을 입증한다. 이들 실험은 코돈 최적화된 형태에 비해 뉴클레아제 활성의 더 낮은 절대 수준을 나타낼 수 있는 Cas9의 비-코돈 최적화된 형태에 의해 수행되었다.
도 2h는 인간 세포-기반 U2OS EGFP 붕괴 분석에서 15 내지 25개의 nt의 범위에 있는 가변 길이 상보성 영역을 보유하는 gRNA에 의해 지시되는 Cas9 뉴클레아제 활성의 효율을 도시한 도면. U6 프로모터로부터의 gRNA의 발현은 5' G의 존재를 필요로 하며, 따라서 표적 DNA 부위(15, 17, 19, 20, 21, 23 및 25개의 nt)에 대해 상보성의 특정 길이를 보유하는 gRNA를 단지 평가할 수 있었다.
도 3a는 Cas9에 의해 매개된 인간 세포에서의 EGFP 붕괴 효율 및 EGFP 리포터 유전자 내 4개의 표적 부위에 대한 전장 또는 단축된 gRNA를 도시한 도면. 상보성 영역 및 대응하는 표적 DNA 부위의 길이를 나타낸다. Ctrl = 상보성 영역을 결여하는 대조군 gRNA.
도 3b는 매칭된 표준 및 tru-RGN에 의해 7개의 상이한 인간 내인성 유전자 표적에서 도입된 표적화된 삽입결실 돌연변이의 효율. 상보성 영역 및 대응하는 표적 DNA 부위의 길이를 나타낸다. 삽입결실 빈도를 T7EI 분석에 의해 측정하였다. Ctrl = 상보성 영역을 결여하는 대조군 gRNA.
도 3c는 EMX1 부위에 대해 표적화된 tru-gRNA 또는 매칭된 전장 gRNA를 이용하여 RGN에 의해 유도된 삽입결실 돌연변이의 DNA 서열을 도시한 도면. gRNA 상보성 영역과 상호작용하는 표적 DNA 부위의 부분은 소문자로 나타내는 PAM 서열의 첫 번째 염기에 의해 회색으로 강조한다. 결실을 회색으로 강조한 파선에 의해 표시하고, 삽입은 회색으로 강조한 이탤릭체로 표시한다. 결실 또는 삽입된 염기의 순 갯수(net number) 및 각각의 서열을 단리시킨 횟수를 우측에 나타낸다.
도 3d는 매칭 표준 및 tru-RGN에 의해 2개의 내인성 인간 유전자에서 도입된 정확한 HDR/ssODN-매개된 변용(alteration)의 효율을 도시한 도면. BamHI 제한 분해 분석을 이용하여 HDR%를 측정하였다(실시예 2에 대한 실험 절차 참조). 대조군 gRNA = 비어있는 U6 프로모터 벡터.
도 3e는 U2OS.EGFP 세포를 고정된 양의 Cas9 발현 플라스미드와 함께 가변적 양의 전장 gRNA 발현 플라스미드(상부) 또는 tru-gRNA 발현 플라스미드(하부)를 이용하여 형질감염시키고, 이어서, 감소된 EGFP 발현으로 세포의 백분율에 대해 분석한 도면. 2회 중복 실험으로부터의 평균값을 평균의 표준 오차로 나타낸다. tru-gRNA에 의해 얻은 데이터는 이들 3개의 EGFP 표적 부위에 대한 tru-gRNA 플라스미드 대신 전장 gRNA 발현 플라스미드에 의해 수행한 실험으로부터의 데이터와 밀접하게 매칭된다는 것을 주의한다.
도 3f는 U2OS.EGFP 세포를 가변적 양의 전장 gRNA 발현 플라스미드(상부) 또는 tru-gRNA 발현 플라스미드(하부)(도 3e의 실험으로부터 각각 tru-gRNA에 대해 결정된 양)와 함께 가변적 양의 Cas9 발현 플라스미드로 형질감염시킨 것을 도시한 도면. 2회 중복 실험으로부터의 평균값을 평균의 표준 오차로 나타낸다. tru-gRNA로부터 얻은 데이터가 이들 3개의 EGFP 표적 부위에 대한 tru-gRNA 대신에 전장 gRNA 발현 플라스미드에 의해 수행한 실험으로부터의 데이터와 밀접하게 매칭된다는 것을 주의한다. 이들 적정의 결과는 EGFP 붕괴 분석에서 사용한 플라스미드의 농도를 실시예 1 및 2에서 수행한다.
도 4a 내지 도 4c는 RNA-안내 FokI 뉴클레아제 및 CRISPR/Cas 아형 Ypest 단백질 4(Csy4)-기반 다중복합 gRNA 발현 시스템을 도시한 도면.
(a) RNA-안내 FokI 뉴클레아제의 개략도. 2개의 FokI-dCas9 융합 단백질을 FokI 이량체화 및 DNA 절단을 용이하게 하기 위해 2개의 상이한 gRNA에 의해 인접한 표적 부위에 동원시켰다.
(b) Csy4-기반 다중복합 gRNA 발현 시스템의 개략도. 2개의 gRNA(임의의 5' 말단 뉴클레오타이드를 지님)를 Csy4 인식 부위에 측접하는 각각의 gRNA와 함께 U6 프로모터로부터의 단일 전사체에서 공동발현시켰다. Csy4를 절단하고 전사체로부터 gRNA를 방출한다. Csy4 인식 부위는 해당 부위에 결합되는 Csy4 뉴클레아제와 함께 gRNA의 3' 말단에 남아있다.
(c) 다중복합, Csy4-기반 시스템의 입증. EGFP 내 인접 부위에 표적화된 2개의 gRNA를 Csy4 및 Cas9 뉴클레아제와 함께 인간 U2OS.EGFP 세포에서 Csy4-기반 시스템을 이용하여 단일 RNA 전사체에서 발현시켰다. 이들 세포에서 유도된 삽입결실 돌연변이의 서열을 나타낸다. 야생형 서열을 상부에서 회색으로 강조한 표적 부위와 밑줄 표시한 내용으로 나타낸 PAM 서열 둘 다로 나타낸다. 결실을 회색 배경에 대해 파선으로 나타내고, 회색 배경에 대해 소문자로 삽입한다. 각각의 서열의 오른쪽에, 삽입(+) 또는 결실(△)의 크기를 명시한다.
도 5a 내지 도 5f는 RNA-안내 FokI 뉴클레아제의 설계 및 최적화를 도시한 도면.
(a) ZFN, TALEN, FokI-dCas9 융합 및 dCas9-FokI 융합의 개략적 도시.
(b) 두 배향 중 하나에서의 절반의 부위에 대해 표적화된 gRNA 쌍과 FokI-dCas9 융합의 EGFP 붕괴 활성의 선별: PAM 내부(좌측 패널) 및 PAM 외부(우측 패널). 절반의 부위를 0 내지 31bp의 범위에 있는 가변적 길이의 스페이서 서열에 의해 분리시켰다. EGFP 붕괴를 유세포 분석기에 의해 정량화시켰다, n = 1. dCas9-FokI 융합 및 동일한 gRNA 쌍에 대한 대응하는 데이터를 도 5e에 나타낸다.
(c) 절반의 부위가 PAM 외부로 배향되고, 스페이서 길이가 10 내지 20 bp의 범위에 있는 표적 부위에 대한 FokI-dCas9-매개된 EGFP 붕괴 활성의 추가적인 평가. EGFP 붕괴를 유세포 분석기에 의해 정량화하였다. 오차 막대는 평균의 표준 오차(s.e.m.), n = 2를 나타낸다.
(d) 스페이서 길이에 따라 그룹화한 (c)로부터의 데이터의 평균 EGFP 붕괴값. 오차 막대는 s.e.m을 나타낸다.
(e) 이들 플롯은 0 내지 31 bp의 간격 및 PAM 내부 및 PAM 외부 배향을 지니는 60종의 gRNA를 지니는 U2OS.EGFP 세포에서 EGFP 붕괴 분석에서 dCas9-FokI 활성에 대한 선별 결과를 나타낸다.
(f) U2OS 세포 내 FokI-dCas9 유도 돌연변이의 서열을 나타낸다. Cas9 또는 FokI-dCas9에 의해 결합되는 23-nt 표적 서열을 회색으로 표지한다. 프로토스페이서 인접 모티프 또는 PAM 서열을 밑줄과 함께 볼드체로 표시한다. 결실을 밝은 회색 배경 상에서 파선으로 표시한다. 삽입을 회색으로 강조한다. 삽입 또는 결실된 염기의 순 개수를 서열 우측의 열에 직접 표시한다.
도 6a 내지 도 6d는 FokI-dCas9 RFN의 이량체화가 효율적인 게놈 편집 활성에 필요하다는 것을 도시한 도면.
(a) 정확하게 표적화된 gRNA 쌍(EGFP 부위 47 및 81에 대해) 및 gRNA 중 하나 또는 다른 하나가 비-EGFP 서열에 대해 표적화된 다른 gRNA로 대체된 쌍(VEGFA 유전자에서)의 존재에서 평가한 두 RFN 쌍의 EGFP 붕괴 활성. EGFP 붕괴를 유세포 분석기에 의해 정량화하였다. EGFP, 향상된 녹색 형광 단백질; VEGFA, 혈관 내피 성장 인자 A. 오차 막대는 평균의 표준 오차(s.e.m.)를 나타낸다, n = 3.
(b) (a)의 EGFP 붕괴 분석에서 사용한 동일 세포로부터의 게놈 DNA를 이용하여 수행한 T7EI 분석에 의한 돌연변이유발 빈도의 정량화. 오차 막대는 s.e.m.을 나타낸다, n = 3.
(c) APC, MLH1 및 VEGFA 유전자 내 부위에 표적화된 RFN의 활성. 각각의 표적에 대해, 본 발명자들은 동족 gRNA의 쌍("좌측" 절반-부위에 대해 단지 하나의 gRNA, 또는 "우측" 절반-부위에 대해 단지 하나의 gRNA)과 함께 FokI-dCas9를 공동발현시켰다. 돌연변이유발률을 T7E1 분석에 의해 측정하였다. APC, 선종성 용종증 콜라이(Adenomatous polyposis coli); MLH1, mutL 상동체 1; VEGFA, 혈관표피성장인자 A. 오차막대는 s.e.m을 나타낸다, n = 3.
(d) 표적 상의 부위에서 그리고 VEGFA 부위 1을 표적화하기 위해 사용한 gRNA 중 하나에 대한5개의 이미 알려진 표적을 벗어난(OT) 부위에서 VEGFA 부위 1에 대패 표적화된 RFN의 돌연변이유발 빈도. 돌연변이 빈도를 심층 서열화(즉, 심층 서열분석)(deep sequencing)에 의해 결정하였다. 각각의 값을 3개의 독립적 형질감염 실험으로부터 모은 게놈 DNA로부터 제조한 단일 심층 서열화 라이브러리로부터 결정하였다. 표적 상의 VEGFA 부위 1(별표로 표시)에 대해 나타낸 값은 이하의 도 4a에 나타낸 것과 동일하며, 이 도면에 제시한 값과 용이한 비교를 위해 여기서만 나타낸다.
도 7a 내지 도 7b. 단일 gRNA와 함께 공동발현시킨 Cas9 틈내기효소(nickase) 또는 FokI-dCas9의 돌연변이유발 활성.
(a) 6개의 상이한 인간 유전자 부위에 대해 표적화된 1 또는 2개의 gRNA의 존재에서 FokI-dCas9(좌측 막대) 또는 Cas9 틈내기효소(중간 막대)에 의해 유도된 삽입결실 돌연변이 빈도. 각각의 유전자 표적에 대해, 본 발명자들은 gRNA 둘 다("좌측" 절반-부위에 대해 단지 하나의 gRNA 또는 "우측" 절반 부위에 대해 단지 다른 하나의 gRNA)에 의한 삽입결실을 평가하였다. 돌연변이 빈도를 심층 서열화에 의해 결정하였다. 보고한 각각의 삽입결실 빈도값을 3개의 독립적 형질감염 실험으로부터 풀링한 게놈 DNA로부터 제조한 단일 심층 서열화 라이브러리로부터 결정하였다. VEGFA, 혈관표피성장인자 A; DDB2, 손상-특이적 DNA 결합 단백질 2; FANCF, 판코니빈혈증, 상보성 그룹 F; FES, 고양이 육종 종양 유전자; RUNX 1, Runt-관련 전사 인자 1.
(b) gRNA에 의해 각각의 표적 부위에 대해 얻은 값을 각각의 단일 gRNA 실험과 또는 대조군 실험(gRNA 없음 및 Cas9 틈내기효소 없음 또는 FokI-dCas9)과 비교한 삽입결실 빈도의 배수적 감소로서 제시한 (a)로부터의 데이터. 이 배수적 감소를 FokI-dCas9(각각의 쌍에서 좌측 막대, 더 밝은 회색)와 Cas9 틈내기효소(각각의 쌍에서 우측 막대, 더 어두운 회색) 둘 다에 대해 계산하였다.
도 8a 내지 도 8c는 단일 Cas9 틈내기효소가 그들의 표적 부위 내로 고효율오 점돌연변이를 도입할 수 있음을 도시한 도면.
FokI-dCas9, Cas9 틈내기효소 또는 td토마토(tdTomato) 대조군의 존재에서 (a) VEGFA, (b) FANCF 및 (c) RUNX1 유전자 표적에 대해 단일 gRNA에 의해 표적화된 절반 부위에서의 각각의 위치에서 발견된 상이한 점돌연변이의 빈도. 심층 서열화에 의해 돌연변이 빈도를 결정하였다. 보고한 각각의 점돌연변이 값을 3가지의 독립적 형질감염 실험으로부터 풀링한 게놈 DNA로부터 제조한 단일 심층 서열화 라이브러리로부터 결정하였다. 이들 실험에 대해 사용한 게놈 DNA를 도 7a 내지 도 7b에서 삽입결실 돌연변이에 대해 분석한 동일한 세포로부터 단리시켰음을 주의한다. VEGFA, 혈관표피성장인자 A; FANCF, 판코니빈혈증, 상보성 그룹 F; RUNX 1, Runt-관련 전사 인자 1.
CRISPR RNA-안내 뉴클레아제(RGN)는 게놈 편집에 대한 손쉽고 효율적인 플랫폼으로서 빠르게 나타났다. 마라피니(Marraffini) 및 동료(Jiang et al., Nat Biotechnol 31, 233-239 (2013))는 최근에 박테리아에서 Cas9 RGN 특이성의 체계적인 조사를 수행하였지만, 인간 세포에서 RGN의 특이성은 광범위하게 정의되지 않았다. 인간 및 다른 진핵세포에서 RGN-매개된 표적을 벗어난 효과의 범주를 이해하는 것은, 이들 뉴클레아제가 연구 및 치료 적용을 위해 널리 사용되어야 한다면 결정적으로 필수적일 것이다. 본 발명자들은 Cas9-기반 RGN의 표적을 벗어난 절단을 특성규명하기 위해 인간 세포-기반 수용체 분석을 사용하였다. 단일 및 이중 미스매치는 안내 RNA(gRNA)-DNA 계면을 따라 그들의 위치에 따라서 다른 정도로 용인되었다. 인간 세포에서 내인성 좌위에 대해 표적화된 6개의 RGN 중 4개에 의해 유도된 표적을 벗어난 변용은 부분적으로 미스매치된 부위의 시험에 의해 용이하게 검출되었다. 동정된 표적을 벗어난 부위는 5개까지의 미스매치를 보유하며, 다수는 의도된 표적 상의 부위에서 관찰된 것과 비슷한(또는 더 높은) 빈도로 돌연변이유발된다. 따라서, RGN은 인간 세포에서 불안전하게 매칭된 RNA-DNA 계면에 의할 때조차 고도로 활성이며, 이는 연구 및 치료 적용분야에서 그들의 용도를 혼동하게 할 수 있는 발견이다.
본 명세서에 기재한 결과는 임의의 주어진 RGN의 특이성 프로파일이 단순하지도 또는 간단하지도 않다는 예측을 나타낸다. EGFP 리포터 분석 실험은 단일 및 이중 미스매치가 표적 부위 내에서 그들의 위치(들)에 엄격히 의존하지 않는 인간 세포 내 RGN 활성에 대해 가변적 효과를 가질 수 있다는 것을 나타낸다. 예를 들어, 앞서 공지된 보고와 일치되게, gRNA/DNA 계면의 3' 절반에서의 변용은 일반적으로 5' 절반에서의 변용보다 더 큰 효과를 가지지만(Jiang et al., Nat Biotechnol 31, 233-239 (2013); Cong et al., Science 339, 819-823 (2013); Jinek et al., Science 337, 816-821 (2012)); 그러나, 3' 말단에서의 단일 및 이중 돌연변이는 때때로 또한 잘 용인되는 것으로 나타난 반면, 5' 말단에서의 이중 돌연변이는 활성을 크게 약화시킬 수 있다. 추가로, 임의의 주어진 위치(들)에서 미스매치에 대한 이들 효과의 규모는 부위-의존적인 것으로 나타난다. 모든 가능한 뉴클레오타이드 치환의 시험(본 발명자들의 EGFP 리포터 실험에서 사용한 왓슨-크릭 염기전환을 능가)을 이용한 일련의 다수 RGN의 종합적인 프로파일링은 잠재적인 표적을 벗어난 범위 내로 추가적인 통찰력을 제공하게 할 수 있다. 이와 관련하여, 마라피니와 동료들의 최근에 기재한 박테리아 세포기반 방법(Jiang et al., Nat Biotechnol 31, 233-239 (2013)) 또는 리우(Liu) 및 동료에 의해 앞서 적용된 시험관내 조합적 라이브러리 기반 절단 부위-선택 방법(Pattanayak et al., Nat Methods 8, 765-770 (2011))은 RGN 특이성 프로파일의 더 큰 세트를 생성하는데 유용할 수 있다.
RGN 특이성을 종합적으로 예측함에 있어서 이들 도전에도 불구하고, 1 내지 5개의 미스매치에 의해 표적 상의 부위와 상이한 게놈 부위의 서브세트를 시험함으로써 진정한 표적을 벗어난 RGN을 동정할 수 있었다. 특히, 이들 실험의 조건 하에서, 다수의 이들 표적을 벗어난 부위에서 RGN-유도 돌연변이의 빈도는 의도된 표적 상의 부위에서 관찰된 것과 유사하였고(또는 더 높았고), 이는 T7EI 분석(본 발명자들의 실험실에서 수행한 바와 같이, 신뢰가능한 검출하한 ~2 내지 5% 돌연변이 빈도를 가짐)을 이용하여 이들 부위에서의 돌연변이 검출을 가능하게 한다. 이들 돌연변이율은 매우 높기 때문에, 이는 훨씬 더 낮은 빈도의 ZFN- 및 TALEN-유도 표적을 벗어난 변용을 검출하기 위해 이전에 필요로 되었던 심층 서열화 방법을 이용하여 회피할 수 있었다(Pattanayak et al., Nat Methods 8, 765-770 (2011); Perez et al., Nat Biotechnol 26, 808-816 (2008); Gabriel et al., Nat Biotechnol 29, 816-823 (2011); Hockemeyer et al., Nat Biotechnol 29, 731-734 (2011)). 인간 세포에서의 RGN 표적을 벗어난 돌연변이유발의 분석은 RGN 특이성 예측의 곤란함을 확인하였고 - 모든 단일 및 이중 미스매칭된 표적을 벗어난 부위가 돌연변이의 증거를 나타내지는 않는 반면, 5개만큼의 미스매치를 지니는 일부 부위는 또한 변용을 나타낼 수 있다. 더 나아가, 동정된 진실된 표적을 벗어난 부위는 의도된 표적 서열에 대해 전이 또는 염기전환 차이에 대한 임의의 분명한 바이어스를 나타내지 않는다.
표적을 벗어난 부위로 다수의 RGN을 알 수 있었지만, 이들 부위의 동정은 규모가 포괄적이지도 전장 게놈적(genome-wide)이지도 않았다. 연구한 6개의 RGN에 대해, 인간 게놈 내 잠재적인 표적을 벗어난 서열의 훨씬 더 큰 총수의 매우 작은 서브세트만을 시험하였다. T7EI 분석에 의해 표적을 벗어난 돌연변이의 이러한 매우 다수의 좌위를 시험하는 것은 실행적인 전략이지도 또는 비용 효과적인 전략이지도 않지만, 장래 연구에서의 고속대량 서열화는 매우 다수의 후보 표적을 벗어난 부위에 의문을 가질 수 있게 하며, 진정한 표적을 벗어난 돌연변이를 검출하기 위한 더 민감한 방법을 제공한다. 예를 들어, 이러한 접근은 본 발명자들이 임의의 표적을 벗어난 돌연변이를 아우르지 못한 2개의 RGN에 대해 추가적인 표적을 벗어난 부위를 밝힐 수 있게 한다. 추가로, 세포 내에서 RGN 활성에 영향을 미칠 수 있는 RGN 특이성의 그리고 임의의 후성적(epigenomic) 인자(예를 들어, DNA 메틸화 및 염색질 상태) 둘 다의 개선된 이해가 또한 시험될 필요가 있는 잠재적 부위의 수를 감소시키며, 이에 의해 더 실행적이고 알맞은 표적을 벗어난 RGN의 전장 게놈 평가를 하게 할 수 있다.
다수의 전략은 게놈의 표적을 벗어난 돌연변이의 빈도를 최소화하도록 사용될 수 있다. 예를 들어, RGN 표적 부위의 특이적 선택은 최적화될 수 있으며; 의도된 표적 부위로부터 위치가 5개까지 상이한 표적을 벗어난 부위가 RGN에 의해 효율적으로 돌연변이될 수 있다는 것을 고려하면, 미스매칭 계수화에 의해 판단되는 바와 같은 최소 수의 표적을 벗어난 부위를 지니는 표적 부위를 선택하는 것은 효과적이 될 가능성이 없는 것으로 보이고; 20bp RNA:DNA 상보성 영역 내에서 4 또는 5개의 위치만큼 상이한 수천개의 잠재적인 표적을 벗어난 부위는 전형적으로 인간 게놈에서 서열에 대해 표적화된 임의의 주어진 RGN에 대해 존재할 것이다. 또한 gRNA 상보성 영역의 뉴클레오타이드 함량은 잠재적인 표적을 벗어난 효과 범위에 영향을 미칠 수 있는 가능성이 있다. 예를 들어, 고 GC-함량은 RNA:DNA 혼성체를 안정화시키는 것으로 나타났고(Sugimoto et al., Biochemistry 34, 11211-11216 (1995)) 따라서 gRNA/게놈 DNA 혼성화를 미스매칭에 대해 더 안정하고 더 용인되도록 만드는 것으로 예상될 수 있다. 매우 다수의 gRNA를 이용하는 추가적인 실험은 이들 두 파라미터(게놈 내 미스매칭 부위의 수 및 RNA:DNA 혼성체의 안정성)가 RGN의 전장 게놈 특이성에 영향을 미치는지 여부 및 영향을 미치는 방법을 평가하는데 필요할 것이다. 그러나, 이러한 예측 파라미터가 정의됨에도 불구하고, 이러한 가이드라인을 실행하는 효과가 RGN의 표적화 범위를 추가로 제한한다는 것을 주의하는 것은 중요하다.
RGN-유도 표적을 벗어난 효과를 감소시키기 위한 하나의 잠재적인 일반적 전략은 세포 내에서 발현된 gRNA 및 Cas9 뉴클레아제의 농도를 감소시킬 수 있다. 이 생각은 U2OS.EGFP 세포 내 VEGFA 표적 부위 2 및 3에 대해 RGN을 이용하여 시험되었고; 더 적은 gRNA- 및 Cas9-발현 플라스미드를 형질감염시키는 것은 표적 상의 부위에서 돌연변이율을 감소시켰지만, 상대적 비율의 표적을 벗어난 돌연변이를 인식가능하게 변화시키지 않았다. 이와 일치되게, 표적 상의 돌연변이유발의 절대적인 비율이 U2OS.EGFP 세포에서 보다 더 낮다고 해도, 고수준의 표적을 벗어난 돌연변이유발률이 또한 2개의 다른 인간 세포 유형에서 관찰되었다(HEK293 및 K562 세포). 따라서, 세포 내에서 gRNA 및 Cas9 의 발현 수준의 감소는 표적을 벗어난 효과를 감소시키기 위한 용액을 제공할 가능성이 없다. 더 나아가, 이들 결과는 또한 인간 세포에서 관찰된 고비율의 표적을 벗어난 돌연변이유발이 gRNA 및/또는 Cas9의 과발현에 의해 야기되지 않는다는 것을 시사한다.
상당한 표적을 벗어난 돌연변이유발이 3종의 상이한 인간 세포 유형에서 RGN에 의해 유도될 수 있다는 발견은 이 게놈-편집 플랫폼의 더 광범위한 사용을 위한 중요한 암시를 가진다. 연구 적용을 위해, 고빈도의 표적을 벗어난 돌연변이의 잠재적으로 혼재하는 효과는 특히 원치않는 변용의 이종교배가 시험감염되는 동안의 느린 세대 시간(generation time)으로 배양 세포 또는 유기체를 수반하는 실험을 위해 고려될 필요가 있을 것이다. 이러한 효과를 제어하는 일 방법은 동일한 게놈 변용을 유도하는 상이한 DNA 서열에 대해 다수의 RGN을 이용하는 것일 수 있는데, 표적을 벗어난 효과가 무작위는 아니지만, 대신 표적화된 부위와 관련되기 때문이다. 그러나, 치료적 적용을 위해, 이들 발견은 이들 뉴클레아제가 인간 질환의 치료를 위해 더 장기간에 안정하게 사용되는 것이라면, RGN의 특이성이 신중하게 정해지고/정해지거나 개선될 필요가 있다는 것을 명확하게 나타낸다.
특이성을 개선시키는 방법
본 명세서에 나타내는 바와 같은, 스트렙토코커스 피오게네스 Cas9 단백질에 기반한 CRISPR-Cas RNA-안내 뉴클레아제는 의도된 표적 상의 활성과 비슷하거나 또는 더 높은 상당한 표적을 벗어난 돌연변이유발 효과일 수 있다(실시예 1). 이러한 표적을 벗어난 효과는 연구에 대해, 특히, 잠재적 치료 적용에 대해 문제가 있을 수 있다. 따라서, CRISPR-Cas RNA 안내 뉴클레아제(RGN)의 특이성을 개선시키는 방법이 필요하다.
실시예 1에 기재하는 바와 같이, Cas9 RGN는 인간 세포 내 표적을 벗어난 부위에서 고빈도의 삽입결실 돌연변이를 유도할 수 있다(또한 문헌[Cradick et al., 2013; Fu et al., 2013; Hsu et al., 2013; Pattanayak et al., 2013] 참조). 이들 원치않는 변용은 의도된 표적 상의 부위로부터 5개 미스매치만큼 다른 게놈 서열에서 생길 수 있다(실시예 1 참조). 추가로, gRNA 상보성 영역의 5' 말단에서의 미스매치는 일반적으로 3' 말단에서의 미스매치보다 더 잘 용인되지만, 이런 관련들은 절대적이지 않으며, 부위에 따른 의존을 나타낸다(실시예 1 및 문헌[Fu et al., 2013; Hsu et al., 2013; Pattanayak et al., 2013] 참조). 그 결과, 미스매치의 수 및/또는 위치에 의존하는 컴퓨터 계산 방법은 현재 진정한 표적을 벗어난 부위를 동정하기 위한 예측값으로 제한되었다. 따라서, RNA-안내 뉴클레아제가 연구 및 치료적 적용을 위해 사용되어야 한다면, 표적을 벗어난 돌연변이의 빈도를 감소시키는 방법은 중요한 우위로 남아있다.
이량체화는 Cas9 뉴클레아제의 특이성을 개선시키기 위한 매력적인 잠재적 전략이다. 이는 진정한 이량체 시스템이 아닌 짝지어진 Cas9 틈내기효소 접근과 별개이다. 짝지어진 틈내기효소는 DNA의 2개의 Cas9 틈내기효소를 공동국소화시키고, 이에 의해 정해지지 않은 메커니즘을 통해 고효율 게놈 편집을 유도함으로써 작용한다. 이량체화는 효소적 활성에 필요하지 않기 때문에, 단일 Cas9 틈내기효소는 또한 (알려지지 않은 메커니즘을 통해) 특정 부위에서 고효율로 삽입결실을 유도할 수 있고, 따라서 게놈 내 원치 않는 표적을 벗어난 돌연변이를 잠재적으로 야기할 수 있다.
따라서, RGN의 특이성을 개선시키기 위한 하나의 전략은 D10A 및 H840A 돌연변이를 보유하는 Cas 9의 촉매적 불활성 형태(또는 dCas9로서 알려짐)에 FokI 엔도뉴클레아제 도메인을 융합시키는 것이다. FokI 뉴클레아제 도메인은 이량체로서 기능하고, 따라서 이중-가닥 파손을 유도하기 위해 DNA의 동일 국소 조각에 2개의 서브유닛이 동원되어야 한다. 이 입체형태에서(도 9A 및 실시예 2), 2개의 FokI-dCas9 융합은 2개의 상이한 gRNA를 이용하여 적절한 입체배치에서 동원되어 이중-가닥 파손을 수득한다. 따라서, 이 시스템에서, FokI-dCas9 융합은 단일 RGN의 부위보다 2배 길이인 부위에 결합하며, 따라서 이 시스템은 더 특이적이 되는 것으로 예상된다.
따라서 FokI-dCas9 융합 단백질이 본 명세서에서 제공되되, FokI 서열은 선택적으로 개재 링커, 예를 들어, 2 내지 30개의 아미노산, 예를 들어, 4 내지 12개의 아미노산, 예를 들어, Gly4Ser(서열번호 23) 또는 (Gly4Ser)3의 링커를 개재해서 dCas9에(바람직하게는 dCas9의 아미노-말단 단부이지만, 또한 선택적으로는 카복실 말단에) 융합된다. 일부 실시형태에서, 융합 단백질은 dCas9와 FokI 도메인 사이에 링커를 포함한다. 이들 융합 단백질에서(또는 연쇄된 구조에서의 융합 단백질 사이에서) 사용될 수 있는 링커는 융합 단백질의 기능을 방해하지 않는 임의의 서열을 포함할 수 있다. 바람직한 실시형태에서, 링커는 짧으며, 예를 들어, 2 내지 20개의 아미노산이고, 전형적으로 가요성이다(즉, 글라이신, 알라닌 및 세린과 같이 고자유도를 지니는 아미노산을 포함함). 일부 실시형태에서, 링커는 GGGS(서열번호 22) 또는 GGGGS(서열번호 23)로 이루어진 하나 이상의 단위, 예를 들어, GGGS(서열번호 22) 또는 GGGGS(서열번호 23) 단위의 2, 3, 4개 이상의 반복부를 포함한다. 다른 링커 서열이 또한 사용될 수 있다.
또한 단지 공동-국소화보다는 이량체화가 효율적인 게놈 편집 활성에 필요한 RNA-안내 FokI 뉴클레아제 플랫폼이 본 명세서에 기재된다. 이들 뉴클레아제는 인간 세포 내에서 고도로 효율적인 게놈 편집을 강하게 매개할 수 있으며, 민감한 심층 서열화 방법에 의해 판단되는 바와 같이 표적을 벗어난 돌연변이를 감소시킬 수 있다. 또한 임의의 5' 말단 뉴클레오타이드를 지니는 gRNA의 쌍을 발현시키기 위한 효율적인 시스템, RFN 플랫폼 상에서 더 넓은 표적화 범위를 부여하는 방법이 기재된다. 최종적으로, 단량체 Cas9 틈내기효소는 일반적으로 단일 gRNA의 존재 하에 본 명세서에 기재된 뉴클레아제보다 더 바람직하지 않은 삽입결실 및 점돌연변이를 도입한다. 이들 결과는 가장 높은 가능한 게놈 편집 정확성을 필요로 하는 연구 또는 치료적 적용을 위해 중요하게 될 특징인 잘 특성규명된 이량체 구조 및 짝지어진 Cas9 틈내기효소에 비해 개선된 돌연변이유발 프로파일의 특이성 이점을 지니는 강하고, 사용하기 위운 플랫폼을 정한다.
따라서, 새로운 RNA-안내 FokI 뉴클레아제(RFN) 플랫폼은 인간 세포에서 강하고 고도로 특이성인 게놈 편집을 수행하기 위해 본 명세서에 기재된다. RFN은 활성을 위한 2개의 gRNA를 필요로 하며 이량체로서 기능한다. 놀랍게도, 활성 RFN의 공학적 조작은 FokI 도메인이 유전자 조작된 아연 핑거 또는 전사 활성제-유사 효과기 반복부 배열의 카복시-말단 단부에 융합되는 ZFN 및 TALEN과 상이한 구조인 dCas9 단백질의 아미노-말단 단부에 FokI 뉴클레아제 도메인의 융합을 필요로 하였다. RFN은 또한 (활성이 추가적인 간격에서 가능할 수 있지만, 그러나 일관된 성공이 더 적다고 해도) 각각의 Fok-dCas9/gRNA 복합체에 의해 결합되는 절반의 부위가 14 내지 17 bp의 상대적으로 제한된 개재 스페이서 길이를 지니는 특정 상대적 배향(PAM 외부)을 가지는 것을 필요로 한다.
RFN의 이량체 특성은 표준 단량체 Cas9 뉴클레아제에 대해 중요한 특이성 이점을 제공한다. 이상적인 이량체 시스템에서, 거의 내지 전혀 없는 활성은 절반-부위에 상에서 단량체가 관찰될 것이다. 본 데이터는 단일 gRNA에 의해 지시되는 FokI-dCas9가 RFN 절반 부위에서 돌연변이유발을 매우 적게 유도하거나 또는 거의 유도하지 않는다는 것을 입증한다. 12개의 단일 gRNA(6개의 RFN 표적 부위에 대해)은 공동발현시킨 FokI-dCas9와 함께 시험되고, 삽입결실은 매우 저빈도로(0.0045% 내지 0.47%의 범위), 일부 경우에 NA 또는 뉴클레아제의 발현이 없었던 대조군 세포에서 관찰된 배경 비율만큼 낮은 수준으로 관찰되었다. FokI 뉴클레아제 도메인이 이량체로서 기능하는 것을 고려하면, 단일 gRNA에 의해 관찰된 임의의 삽입결실은 DNA에 대한 FokI-dCas9 이량체의 동원에 기인할 가능성이 있는 것으로 추정된다. 메거니즘에도 불구하고, FokI-dCas9를 12개의 표적 상의 절반의 부위에서 단일 gRNA와 함께 시험하였을 때, 매우 저수준의 돌연변이유발만이 관찰된 것을 고려하면, 임의의 돌연변이유발이 부분적으로 미스매칭된 표적을 벗어난 절반 부위에서 유도될 가능성은 매우 적다. 사실, VEGFA에 표적화된 RFN은 심층 서열화에 의해 판단되는 바와 같은 gRNA 중 하나의 공지된 표적을 벗어난 부위에서 검출가능한 돌연변이를 유도하지 않았다.
RFN이 진정한 이량체 시스템이기 때문에, 그들은 공동국소화에 의존하지만 이량체화를 필요로 하지 않는 짝지어진 틈내기효소 기법 이상으로 다수의 중요한 이점을 소유한다. 우선, 본 명세서에서 직접적 비교는 단일 Cas9 틈내기효소가 일반적으로 동일한 개개 gRNA에 의해 지시되는 FokI-dCas9 융합 단백질보다 더 큰 효율로 삽입결실 돌연변이를 유도한다는 것을 나타낸다. 둘째로, 단량체 Cas9 틈내기효소는 또한 본 발명자들이 이 연구에서 다루지 않은 이전에 알려지지 않은 돌연변이유발 부작용인 고효율로 그들의 표적 절반 부위에서의 염기쌍 치환을 유도할 수 있다. 또한, 직접 비교는 단량체 Cas9 틈내기효소가 동일한 단일 gRNA에 의해 안내되는 FokI-dCas9 융합보다 실질적으로 더 고비율로 이들 원치않는 점돌연변이를 유도한다는 것을 나타낸다. 셋째로, 짝지어진 Cas9 틈내기효소는 이량체 RFN보다 표적 절반 부위의 배향 및 간격에서 더 큰 혼잡함을 나타내고, 따라서 표적을 벗어난 돌연변이가 유도될 부위의 더 큰 잠재적 범위를 가진다. 짝지어진 틈내기효소 절반 부위는 그들의 PAM 내부 또는 PAM 외부에 의해 그리고 0 내지 1000bp 길이의 범위에 있는 스페이서 서열에 의해 배향될 수 있다(Ran et al., Cell 154, 1380-1389 (2013); Mali et al., Nat Biotechnol 31, 833-838 (2013); Cho et al., Genome Res (2013)). Cas9 틈내기효소의 게놈 편집 활성은 효소의 이량체화에 의존하는 것이 아니라, 오히려 단지 두 틈의 공동국소화에 의존하기 때문에, 이런 혼잡함이 존재한다. 대조적으로, RFN은 그들의 특이성이 훨씬 더 엄격하며 -- 절반-부위는 그들의 PAM 외부를 가져야 하고, 효율적인 절단을 위해 2개의 적절하게 위치된 FokI 절단 도메인에 대한 필요에 기인하여 14 내지 17 bp만큼 이격되어 있어야 한다.
FokI
FokI은 DNA 인식 도메인 및 촉매적 (엔도뉴클레아제) 도메인을 포함하는 II형 제한 엔도뉴클레아제이다. 본 명세서에 기재된 융합 단백질은 모든 FokI 또는 단지 촉매적 엔도뉴클레아제 도메인, 예를 들어, 문헌[Li et al., Nucleic Acids Res. 39(1): 359-372 (2011); Cathomen and Joung, Mol. Ther. 16: 1200-1207 (2008)]에 기재된 바와 같은 젠뱅크 등록번호 AAA24927.1의 아미노산 388 내지 583 또는 408 내지 583, 또는 문헌[Miller et al. Nat Biotechnol 25: 778-785 (2007); Szczepek et al., Nat Biotechnol 25: 786-793 (2007); 또는 Bitinaite et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 95:10570-10575 (1998)]에 기재된 바와 같은 FokI의 돌연변이 형태를 포함할 수 있다.
FokI의 예시적인 아미노산 서열은 다음과 같다:
Figure pct00001
FokI을 암호화하는 예시적인 핵산 서열은 다음과 같다:
Figure pct00002
일부 실시형태에서, 본 명세서에서 사용되는 FokI 뉴클레아제는 서열번호 4에 대해, 예를 들어 서열번호 4의 아미노산 388 내지 583 또는 408 내지 583에 대해 적어도 50% 동일하다. 이들 변이체 뉴클레아제는 DNA를 절단하는 능력을 보유하여야 한다. 일부 실시형태에서, 뉴클레오타이드 서열은 서열번호 4의 아미노산 388 내지 583 또는 408 내지 583에 대해 약 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99% 또는 100% 동일하다. 일부 실시형태에서, 서열번호 4의 아미노산 388 내지 583 또는 408 내지 583으로부터의 임의의 차이는 비보존적 영역이다.
두 서열의 동일성 백분율을 결정하기 위해, 서열을 최적의 비교 목적을 위해 정렬한다(갭은 최적의 정렬에 필요한 제1 아미노산 및 제2 아미노산 또는 핵산 서열 중 하나 또는 둘 다에 도입되며, 비-상동성 서열은 비교 목적을 위해 무시될 수 있다). 비교 목적을 위해 정렬된 기준 서열의 길이는 적어도 50%(일부 실시형태에서, 기준 서열 길이의 약 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 85%, 90%, 95% 또는 100%가 정렬됨)이다. 이어서, 대응하는 위치에서 뉴클레오타이드 또는 잔기가 비교된다. 제1 서열 내 위치가 제2 서열 내 대응하는 위치와 동일한 뉴클레오타이드 또는 잔기에 의해 점유된다면, 분자는 해당 위치에서 동일하다. 두 서열 간의 동일성 백분율은 서열에 의해 공유되는 동일한 위치의 함수이며, 두 서열의 최적의 정렬을 위해 도입될 필요가 있는 갭의 수 및 각각의 갭의 길이를 고려한다.
서열의 비교 및 두 서열 간의 백분율 동일성의 결정은 수학적 알고리즘을 이용하여 수행될 수 있다. 본 출원의 목적을 위해, 두 아미노산 서열 간의 백분율 동일성은 갭 페널티 12, 갭 연장 페널티 4 및 틀이동 갭 페널티 5를 이용하는 블로섬(Blossum) 62 스코어링 매트릭스를 이용하여, GCG 소프트웨어 패키지 내 GAP 프로그램에 포함된 니들만(Needleman) 및 분슈(Wunsch)((1970) J. Mol. Biol. 48:444-453) 알고리즘을 이용하여 결정된다.
Cas9
다수의 박테리아는 Cas9 단백질 변이체를 발현시킨다. 스트렙토코커스 피오게네스(Streptococcus pyogenes)로부터의 Cas9는 현재 가장 통상적으로 사용되며; 일부 다른 Cas9 단백질은 스트렙토코커스 피오게네스 Cas9와 고수준의 서열 동일성을 가지며, 동일한 안내 RNA를 사용한다. 다른 것들은 더 다양하며, 상이한 gRNA를 사용하고, 마찬가지로 상이한 PAM 서열을 인식한다(RNA에 의해 구체화되는 서열에 인접한 단백질에 의해 구체화된 2 내지 5개의 뉴클레오타이드 서열). 실린스키(Chylinski) 등은 박테리아의 거대한 군으로부터 Cas9 단백질을 분류하였고(RNA Biology 10:5, 1-12; 2013), 매우 다수의 Cas9 단백질은 본 명세서에 참고로 포함되는 본 명세서의 보충적 도 1에서 그리고 보충적 표 1에서 열거된다. 추가적인 Cas9 단백질은 문헌[Esvelt et al., Nat Methods. 2013 Nov; 10(11):1116-21 및 Fonfara et al., "Phylogeny of Cas9 determines functional exchangeability of dual-RNA and Cas9 among orthologous type II CRISPR-Cas systems." Nucleic Acids Res. 2013 Nov 22. [Epub ahead of print] doi:10.1093/nar/gkt1074]에 기재되어 있다.
다양한 종의 Cas9 분자가 본 명세서에 기재된 방법 및 조성물에서 사용될 수 있다.스트렙토코커스 피오게네스 및 스트렙토코커스 써모필루스(S. thermophilus) Cas9 분자는 본 명세서의 다수의 개시내용이지만, 본 명세서에 열거된 종의 Cas9 단백질의, 또는 이로부터 유래되거나 또는 이를 기반으로 한 Cas9 분자가 마찬가지로 사용될 수 있다. 다시 말해서, 본 명세서의 다수의 설명이 스트렙토코커스 피오게네스 및 스트렙토코커스 써모필루스 Cas9 분자를 사용하지만, 다른 종으로부터의 Cas9 분자는 그들을 대신할 수 있다. 이러한 종은 문헌[Chylinski et al., 2013]의 보충적 도 1에 기반하여 만들어진 다음의 표에 제시되는 것을 포함한다.
Figure pct00003
Figure pct00004
Figure pct00005
Figure pct00006
본 명세서에 기재된 작제물 및 방법은 임의의 해당 Cas9 단백질, 및 그들의 대응하는 안내 RNA 또는 양립가능한 다른 안내 RNA를 포함할 수 있다. 스트렙토코커스 서모필루스 LMD-9 CRISPR1 시스템으로부터의 Cas9는 콩(Cong) 등(Science 339, 819 (2013))에서 인간 세포 내에서 작용하는 것으로 나타났다. 네이세리아 메닝기티디스로부터의 Cas9 오솔로그는 문헌[Hou et al., Proc Natl Acad Sci U S A. 2013 Sep 24;110(39):15644-9 및 Esvelt et al., Nat Methods. 2013 Nov;10(11):1116-21]에 기재되어 있다. 추가적으로 지네크(Jinek) 등은 시험관 내에서, 비록 약간 감소된 효율을 지니기는 하지만, 스트렙토코커스 써모필루스 및 리스테리아 이노쿠아로부터의 Cas9 오솔로그(그러나 상이한 안내 RNA를 사용할 가능성이 있는 네이세리아 메닝기티디스 또는 캄필로박터 제주니로부터의 오솔로그는 아님)가 이중 스트렙토코커스 피오게네스 gRNA에 의해 안내되어 표적 플라스미드 DNA를 절단할 수 있다는 것을 나타내었다.
일부 실시형태에서, 본 발명의 시스템은 촉매적으로 불활성인 단백질의 뉴클레아제 부분을 제공하기 위해 D10, E762, H983 또는 D986 및 H840 또는 N863, 예를 들어, D10A/D10N 및 H840A/H840N/H840Y에서의 돌연변이를 함유하여 박테리아에서 암호화된 바와 같은 또는 포유류 세포에서 발현을 위해 코돈 최적화된 스트렙토코커스 피오게네스로부터의 Cas9 단백질을 이용하며; 이들 위치에서의 치환은 알라닌일 수 있고(그들은 문헌[Nishimasu al., Cell 156, 935-949 (2014)]에서와 같음) 또는 그들은 다른 잔기, 예를 들어, 글루타민, 아스파라긴, 타이로신, 세린 또는 아스팔트산염일 수 있었다, 예를 들어, E762Q, H983N, H983Y, D986N, N863D, N863S 또는 N863H(도 1C). 본 명세서에서 기재되는 방법 및 조성물에서 사용될 수 있는 촉매적으로 불활성인 스트렙토코커스 피오게네스 Cas9의 서열은 다음과 같으며; D10A 및 H840A의 예시적인 돌연변이는 볼드체이며 밑줄 표시되어 있다.
Figure pct00007
Figure pct00008
일부 실시형태에서, 본 명세서에서 사용되는 Cas9 뉴클레아제는 스트렙토코커스 피오게네스 Cas9의 서열에 대해 적어도 약 50%, 즉, 서열번호 5에 대해 적어도 50% 동일하다. 일부 실시형태에서, 뉴클레오타이드 서열은 서열번호 5에 대해 약 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99% 또는 100% 동일하다. 일부 실시형태에서, 서열번호 5로부터의 임의의 차이는 문헌[Chylinski et al., RNA Biology 10:5, 1-12; 2013(예를 들어, 이의 보충적 도 1 및 보충적 표 1); Esvelt et al., Nat Methods. 2013 Nov;10(11):1116-21 및 Fonfara et al., Nucl. Acids Res. (2014) 42 (4): 2577-2590. [Epub ahead of print 2013 Nov 22] doi:10.1093/nar/gkt1074]에 제시된 서열의 서열 정렬에 의해 동정되는 비보존적 영역이다. 상기 제시한 바와 같이 동일성이 결정된다.
안내 RNA( gRNA )
안내 RNA는 일반적으로 말해서 2가지 상이한 시스템을 시작한다: 별도의 crRNA 및 tracrRNA를 사용하고 Cas9에 의한 절단을 안내하도록 함께 작용하는 시스템 1, 및 단일 시스템에서 2개의 별도의 안내 RNA를 합하는 키메라 crRNA-tracrRNA 혼성체를 사용하는 시스템 2(단일 안내 RNA 또는 sgRNA로서 지칭됨, 또한 문헌[Jinek et al., Science 2012; 337:816-821] 참조). tracrRNA는 가변적으로 절단될 수 있으며, 길이 범위는 별개의 시스템(시스템 1)과 키메라 gRNA 시스템(시스템 2) 둘 다에서 작용하는 것으로 나타났다. 예를 들어, 일부 실시형태에서, tracrRNA는 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35 또는 40개의 nt만큼 그의 3' 말단으로부터 절단될 수 있다. 일부 실시형태에서, tracrRNA 분자는 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35 또는 40개의 nt만큼 그의 5' 말단으로부터 절단될 수 있다. 대안적으로, tracrRNA 분자는 5'과 3' 말단 둘 다로부터, 예를 들어, 5' 말단 상에서 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15 또는 20개의 nt만큼 그리고 3' 말단 상에서 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35 또는 40개의 nt만큼 절단될 수 있다. 예를 들어, 문헌[Jinek et al., Science 2012; 337:816-821; Mali et al., Science. 2013 Feb 15;339(6121):823-6; Cong et al., Science. 2013 Feb 15;339(6121):819-23; 및 Hwang and Fu et al., Nat Biotechnol. 2013 Mar;31(3):227-9; Jinek et al., Elife 2, e00471 (2013))] 참조. 시스템 2에 대해, 일반적으로 더 긴 길이의 키메라 gRNA가 더 큰 표적 상의 활성을 나타내었지만, 다양한 길이의 gRNA의 상대적 특이성은 현재 정해지지 않은 채로 남아있으며, 따라서 더 짧은 gRNA를 사용하는 특정 예에서 바람직할 수 있다. 일부 실시형태에서, gRNA는 전사 시작 부위 상류의 약 100 내지 800bp 내에 있는 영역에 상보적이며, 예를 들어, 전사 시작 부위 상류의 약 500bp 내에 있고, 전사 시작 부위를 포함하거나, 또는 전사 시작 부위 하류의 약 100 내지 800bp 내에, 예를 들어, 약 500bp 내를 포함한다. 일부 실시형태에서, 하나 이상의 gRNA를 암호화하는 벡터(예를 들어, 플라스미드), 예를 들어 동일 영역의 표적 유전자 내에서 상이한 부위로 향하는 2, 3, 4, 5개 이상의 gRNA를 암호화하는 플라스미드가 사용된다.
Cas9 뉴클레아제는 안내 RNA, 예를 들어, 단일 gRNA 또는 tracrRNA/crRNA를 이용하고, 게놈 DNA 표적 부위의 상보성 가닥에 대해 상보성인 그의 5'에서 17 내지 20개의 nt를 보유하는, 예를 들어, 서열 NGG의 추가적인 근위의 프로토스페이서 인접 모티프(PAM)를 보유하는 특이적인 17 내지 20개의 nt 게놈 표적으로 안내될 수 있다. 따라서, 본 발명은 문헌[Mali et al., Science 2013 Feb 15; 339(6121):823-6]에 기재된 바와 같은 정상적으로는 트랜스-암호화된 tracrRNA, 예를 들어, 단일 Cas9 안내 RNA에 융합된 crRNA를 프로토스페이서 인접 모티프(PAM), 예를 들어, NGG, NAG, 또는 NNGG의 5' 바로 옆의 표적 서열에 대해 상보성 가닥의, 예를 들어 25 내지 17개, 선택적으로 20개 이하의 뉴클레오타이드(nt), 예를 들어, 20, 19, 18, 또는 17개 nt, 바람직하게는 17 또는 18개의 nt의 표적 서열에 대해 상보성인 5' 말단에서의 서열과 함께 사용하는 것을 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 단일 Cas9 안내 RNA는 하기 서열들로 이루어진다:
(X17-20)GUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCG(XN)(서열번호 6);
(X17-20)GUUUUAGAGCUAUGCUGAAAAGCAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUC(XN)(서열번호 7);
(X17-20)GUUUUAGAGCUAUGCUGUUUUGGAAACAAAACAGCAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUC(XN) (서열번호 8);
(X17-20)GUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGC(XN)(서열번호 9),
(X17-20)GUUUAAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUUAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGC(서열번호 10);
(X17-20)GUUUUAGAGCUAUGCUGGAAACAGCAUAGCAAGUUUAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGC(서열번호 11); 또는 (X17-20)GUUUAAGAGCUAUGCUGGAAACAGCAUAGCAAGUUUAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGC(서열번호 12);
여기서, X17-20은 표적 서열의 17 내지 20개의 연속적 뉴클레오타이드에 대해 상보성인 뉴클레오타이드 서열이다. 단일 안내 RNA를 암호화하는 DNA는 이전에 문헌에 기재되었다(Jinek et al., Science. 337(6096):816-21 (2012) 및 Jinek et al., Elife. 2:e00471 (2013)).
안내 RNA는 Cas9에 대한 리보핵산의 결합을 방해하지 않는 임의의 서열일 수 있는 XN을 포함할 수 있으며, 여기서 (RNA에서의) N은 0 내지 200, 예를 들어, 0 내지 100, 0 내지 50, 또는 0 내지 20일 수 있다.
일부 실시형태에서, 안내 RNA는 3' 말단 상에서 하나 이상의 아데닌(A) 또는 유라실(U) 뉴클레오타이드를 포함한다. 일부 실시형태에서, RNA는 RNA PolIII 전사를 종결시키는 종결 신호로서 사용되는 하나 이상의 T의 선택적 존재의 결과로서 분자의 3' 말단에서 하나 이상의 U, 예를 들어, 1 내지 8개 또는 그 이상의 U(예를 들어, U, UU, UUU, UUUU, UUUUU, UUUUUU, UUUUUUU, UUUUUUUU)를 포함한다.
본 명세서에 기재되는 일부 실시예는 단일 gRNA를 이용하지만, 상기 방법은 또한 이중 gRNA(예를 들어, 자연적으로 생기는 시스템에서 발견되는 crRNA 및 tracrRNA)와 함께 사용될 수 있다. 이 경우에, 단일 tracrRNA는 본 시스템, 예를 들어 하기를 이용하여 발현된 다수의 상이한 crRNA, 및 tracrRNA 서열과 함께 사용될 것이다:
(X17-20)GUUUUAGAGCUA (서열번호 13);
(X17-20)GUUUUAGAGCUAUGCUGUUUUG (서열번호 14); 또는
(X17-20)GUUUUAGAGCUAUGCU (서열번호 15). 이 경우에, crRNA들은 본 명세서에 기재된 방법 및 분자에서 안내 RNA로서 사용되고, tracrRNA는 동일 또는 상이한 DNA 분자로부터 발현될 수 있다. 일부 실시형태에서, 상기 방법은 서열 GGAACCAUUCAAAACAGCAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGC(서열번호 16) 또는 이의 활성 부분(활성 부분은 Cas9 또는 dCas9와 복합체를 형성하는 능력을 보유하는 것임)을 포함하거나 또는 이들로 이루어진 tracrRNA와 세포를 접촉시키는 단계를 포함한다. 일부 실시형태에서, tracrRNA 분자는 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35 또는 40개의 nt에 의해 그의 3' 말단으로부터 절단될 수 있다. 다른 실시형태에서, tracrRNA 분자는 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35 또는 40개의 nt만큼 그의 5' 말단으로부터 절단된다. 대안적으로, tracrRNA 분자는, 예를 들어, 5' 말단 상에서 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15 또는 20개의 nt만큼 그리고 3' 말단 상에서 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35 또는 40개의 nt만큼 5'과 3' 말단 둘 다로부터 절단될 수 있다. 서열번호 8에 추가로 예시적인 tracrRNA 서열은 하기를 포함한다: UAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGC(서열번호 17) 또는 또는 이의 활성 부분; 또는
AGCAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGC(서열번호 18) 또는 이의 활성 부분.
일부 실시형태에서, (X17-20)GUUUUAGAGCUAUGCUGUUUUG(서열번호 14)는 crRNA로서 사용되며, 다음의 tracrRNA가 사용된다: GGAACCAUUCAAAACAGCAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGC (서열번호 16) 또는 이의 활성 부분. 일부 실시형태에서, (X17-20)GUUUUAGAGCUA(서열번호 13)는 crRNA로서 사용되며, 다음의 tracrRNA가 사용된다: UAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGC(서열번호 17) 또는 이의 활성 부분. 일부 실시형태에서, (X17-20)GUUUUAGAGCUAUGCU(서열번호 15)는 crRNA로서 사용되며, 다음의 tracrRNA가 사용된다: AGCAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGC (서열번호 18) 또는 이의 활성 부분.
일부 실시형태에서, gRNA는 표적을 벗어난 효과를 최소화하기 위해 게놈의 나머지에서 임의의 서열과 상이한 적어도 3개 이상의 미스매치인 부위로 표적화된다.
변형된 RNA 올리고뉴클레오타이드, 예컨대 잠긴 핵산(LNA)은 더 바람직한(안정한) 입체형태에서 변형된 올리고뉴클레오타이드를 잠금으로써 RNA-DNA 혼성화의 특이성을 증가시키는 것으로 입증되었다. 예를 들어, 2'-O-메틸 RNA는 올리고뉴클레오타이드 내로 포함될 때 전반적인 열 안정성 및 선택성을 개선시킬 수 있는 2' 산소와 4' 탄소 사이의 추가적인 공유 결합이 있는 변형된 염기이다(화학식 I).
Figure pct00009
따라서, 일부 실시형태에서, 본 명세서에 개시된 tru-gRNA는 하나 이상의 변형된 RNA 올리고뉴클레오타이드를 포함할 수 있다. 예를 들어, 본 명세서에 기재된 절단된 안내 RNA 분자는 17 내지 18개 또는 17 내지 19개의 nt 중 하나, 일부 또는 모두를 가질 수 있고, 표적 서열에 상보적인 안내 RNA의 5' 영역은 변형되고(예를 들어, 잠긴(2'-O-4'-C 메틸렌 브릿지)), 5'-메틸사이티딘이며, 2'-O-메틸-슈도유리딘이고, 또는 이때 리보스 인산염 백본은 폴리아마이드쇄(펩타이드 핵산), 예를 들어, 합성 리보핵산에 의해 대체되었다.
다른 실시형태에서, tru-gRNA 서열의 뉴클레오타이드의 일부 또는 모두는 변형되고, 예를 들어, 잠긴(2'-O-4'-C 메틸렌 브릿지), 5'-메틸사이티딘, 2'-O-메틸-슈도유리딘일 수 있으며, 또는 이때 리보스 인산염 백본은 폴리아마이드쇄(펩타이드 핵산), 예를 들어, 합성 리보핵산에 의해 대체되었다.
일부 실시형태에서, 단일 안내 RNA 및/또는 crRNA 및/또는 tracrRNA는 3' 말단 상에서 하나 이상의 아데닌(A) 또는 유라실(U) 뉴클레오타이드를 포함할 수 있다.
기존의 Cas9-기반 RGN는 표적화를 관심 대상의 게놈 부위에 안내하기 위한 gRNA-DNA 이형이중가닥(heteroduplex) 형성을 사용한다. 그러나, RNA-DNA 이형이중가닥은 그들의 DNA-DNA 상대보다 더 혼잡한 범위의 구조를 형성할 수 있다. 효과에서, DNA-DNA 이중가닥은 미스매치에 더 민감한데, 이는 DNA-안내된 뉴클레아제가 표적을 벗어난 서열에 용이하게 결합하지 않아서 그들을 RNA-안내 뉴클레아제보다 상대적으로 더 특이적으로 만들 수 있다는 것을 시사한다. 따라서, 본 명세서에 기재된 방법에서 유용한 안내 RNA는 혼성체일 수 있고, 즉, 하나 이상의 데옥시리보뉴클레오타이드, 예를 들어, 짧은 DNA 올리고뉴클레오타이드는 모든 또는 일부의 gRNA, 예를 들어 모든 또는 일부의 gRNA의 상보성 영역을 대체한다. 이 DNA-기반 분자는 단일 gRNA 시스템에서 모든 또는 일부의 gRNA를 대체할 수 있거나 혹은 대안적으로 이중 crRNA/tracrRNA 시스템에서 모든 또는 일부의 crRNA 및/또는 tracrRNA를 대체할 수 있다. DNA를 상보성 영역 내로 혼입시키는 이러한 시스템은 RNA-DNA 이중가닥에 비해 미스매칭에 대해 DNA-DNA 이중가닥의 일반적 불용인에 기인하여 의도된 게놈 DNA 서열을 더 신뢰할 수 있게 표적화하여야 한다. 이러한 이중가닥의 제조방법은 당업계에 공지되어 있으며, 예를 들어, 문헌[Barker et al., BMC Genomics. 2005 Apr 22;6:57; 및 Sugimoto et al., Biochemistry. 2000 Sep 19;39(37):11270-81] 참조.
추가로, 별도의 crRNA와 tracrRNA를 사용하는 시스템에서, 하나 또는 둘 다는 합성일 수 있고, 하나 이상의 변형된(예를 들어, 잠긴) 뉴클레오타이드 또는 데옥시리보뉴클레오타이드를 포함할 수 있다.
세포 상황에서, 이들 합성 gRNA와 Cas9의 복합체는 CRISPR/Cas9 뉴클레아제 시스템의 게놈 전장 특이성을 개선시키기 위해 사용될 수 있었다.
기재된 방법은 본 명세서에 기재된 바와 같은 융합 단백질 + Cas9 gRNA 를 세포 내에서 발현시키는 단계 또는 이들과 세포를 접촉시키는 단계를 포함할 수 있다.
발현 시스템
기재된 융합 단백질을 사용하기 위해, 그들을 암호화하는 핵산으로부터 그들을 발현시키는 것이 바람직할 수 있다. 이는 다양한 방법으로 수행될 수 있다. 예를 들어, 안내 RNA를 암호화하는 핵산은 복제 및/또는 발현을 위해 원핵 또는 진핵세포로 형질전환하기 위한 중간체 벡터 내로 클로닝될 수 있다. 중간체 벡터는 융합 단백질의 생성을 위해 융합 단백질을 암호화하는 핵산의 저장 또는 조작을 위해, 전형적으로 원핵생물 벡터, 예를 들어, 플라스미드 또는 셔틀 벡터 또는 곤충 벡터이다. 융합 단백질을 암호화하는 핵산은 또한 식물 세포, 동물 세포, 바람직하게는 포유류 세포 또는 인간 세포, 진균세포, 박테리아 세포 또는 원생동물 세포에 투여를 위해 발현 벡터 내로 클로닝될 수 있다.
발현을 얻기 위해, 융합 단백질을 암호화하는 서열은 전형적으로 전사를 지시하기 위해 프로모터를 함유하는 발현 벡터 내로 서브클로닝된다. 적합한 박테리아 및 진핵생물 프로모터는 당업계에 잘 공지되어 있으며, 예를 들어, 문헌[Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual (3d ed. 2001); Kriegler, Gene Transfer and Expression: A Laboratory Manual (1990); 및 Current Protocols in Molecular Biology (Ausubel et al., eds., 2010)]에 기재되어 있다. 유전자 조작된 단백질을 발현시키기 위한 박테리아 발현 시스템은, 예를 들어, 이콜라이(E. coli), 바실러스 종(Bacillus sp.) 및 살모넬라(Salmonella)(Palva et al., 1983, Gene 22:229-235)에서 이용가능하다. 이러한 발현 시스템에 대한 키트는 상업적으로 입수가능하다. 포유류 세포, 효모 및 곤충 세포에 대한 진핵생물 발현 시스템은 당업계에 잘 공지되어 있고, 또한 상업적으로 입수가능하다.
핵산의 발현을 지시하기 위해 사용되는 프로모터는 특정 적용에 의존한다. 예를 들어, 강한 구성적 프로모터는 전형적으로 융합 단백질의 발현 및 정제를 위해 사용된다. 대조적으로, 안내 RNA가 유전자 조절을 위해 생체내에서 투여될 때, 안내 RNA의 특정 용도에 따라서 구성적 또는 유도성 프로모터 중 하나가 사용될 수 있다. 추가로, 안내 RNA의 투여를 위한 바람직한 프로모터는 약한 프로모터, 예컨대 유사한 활성을 갖는 HSV TK 또는 프로모터일 수 있다. 프로모터는 또한 전사촉진(transactivation)에 반응성인 구성요소, 예를 들어, 저산소증 반응 구성요소, Gal4 반응 구성요소, lac 리프레서 반응 구성요소 및 소분자 제어 시스템, 예컨대 테트라사이클린-조절 시스템 및 RU-486 시스템을 포함할 수 있다(예를 들어, 문헌[ Gossen & Bujard, 1992, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:5547; Oligino et al., 1998, Gene Ther., 5:491-496; Wang et al., 1997, Gene Ther., 4:432-441; Neering et al., 1996, Blood, 88:1147-55; 및 Rendahl et al., 1998, Nat. Biotechnol., 16:757-761] 참조).
프로모터에 추가로, 발현 벡터는 전형적으로 원핵생물 또는 진핵생물인 숙주 세포 내 핵산의 발현에 필요한 모든 추가적인 구성요소를 함유하는 전사 단위 또는 발현 카세트를 함유한다. 따라서 전형적인 발현 카세트는, 예를 들어, gRNA를 암호화하는 핵산 서열에 작동가능하게 연결된 프로모터, 및 예를 들어, 전사체의 효율적인 폴리아데닐화, 전사 종결, 리보솜 결합 부위 또는 번역 종결을 위해 필요한 임의의 신호를 함유한다. 카세트의 추가적인 구성요소는, 예를 들어, 인핸서 및 이종성 스플라이싱된 인트론 신호를 포함할 수 있다.
세포 내로 유전자 정보를 수송하기 위해 사용되는 특정 발현 벡터는 gRNA의 의도된 용도, 예를 들어 식물, 동물, 박테리아, 진균, 원생동물 등에서의 발현과 관련하여 선택된다. 표준 박테리아 발현 벡터는 플라스미드, 예컨대 pBR322 기반 플라스미드, pSKF, pET23D 및 상업적으로 입수가능한 태그-융합 발현 시스템, 예컨대 GST 및 LacZ를 포함한다.
진핵생물 바이러스로부터의 조절 구성요소를 함유하는 발현 벡터는 진핵생물 발현 벡터, 예를 들어, SV40 벡터, 유두종 바이러스 벡터 및 엡스타인-바르 바이러스로부터 유래된 벡터에서 종종 사용된다. 다른 예시적인 진핵생물 벡터는 SV40 초기 프로모터, SV40 후기 프로모터, 메탈로티오네인 프로모터, 뮤린 유방 종양 바이러스 프로모터, 라우스 육종 바이러스 프로모터, 폴리헤드린 프로모터 또는 진핵세포에서의 발현에 효과적인 것으로 나타난 다른 프로모터의 지시 하에서 단백질을 발현시키는 pMSG, pAV009/A+, pMTO10/A+, pMAMneo-5, 바큘로바이러스 pDSVE 및 임의의 다른 벡터를 포함한다.
안내 RNA를 발현시키기 위한 벡터는 안내 RNA의 발현을 구동시키기 위한 RNA Pol III 프로모터, 예를 들어, H1, U6 또는 7SK 프로모터를 포함할 수 있다. 이들 인간 프로모터는 플라스미드 형질감염 후에 포유류 세포에서 gRNA를 발현시킨다. 대안적으로, T7 프로모터는, 예를 들어, 시험관내 전사를 위해 사용될 수 있으며, RNA는 시험관내에서 전사 및 정제될 수 있다. 짧은 RNA, 예를 들어, siRNA, shRNA 또는 다른 소 RNA의 발현에 적합한 벡터가 사용될 수 있다. 도 4b에 기재한 Cys4-기반 다중복합 시스템을 이용하여, 다중 gRNA는 (RNA Pol II 또는 Pol III 프로모터에 의해 구동되는) 단일 전사체에서 발현될 수 있다.
일부 발현 시스템은 안정하게 형질감염된 세포주의 선택을 위한 마커, 예컨대 티미딘, 키나제, 하이그로마이신 B, 포스포트랜스퍼라제 및 다이하이드로엽산생성효소 환원효소를 가진다. 고수율 발현 시스템, 예컨대 폴리헤드린 프로모터 또는 다른 강한 바큘로바이러스 프로모터의 지시 하에서 gRNA 암호화 서열을 지니는 곤충 세포에서의 바큘로바이러스 벡터를 이용하는 것이 또한 적합하다.
발현 벡터 내에 전형적으로 포함된 구성요소는 또한 이콜라이에서 기능하는 레플리콘, 재조합 플라스미드를 보유하는 박테리아를 선택을 허용하는 유전자 암호화 항생제 내성 및 재조합 서열을 삽입하게 하는 플라스미드의 비필수 영역 내 독특한 제한 부위를 포함한다.
표준 형질감염 방법은 다량의 단백질을 발현되고, 이어서, 표준 기법을 이용하여 정제되는 박테리아, 포유류, 효모 또는 곤충 세포주를 생성하기 위해 사용된다(예를 들어, 문헌[Colley et al., 1989, J. Biol. Chem., 264:17619-22; Guide to Protein Purification, in Methods in Enzymology, vol. 182 (Deutscher, ed., 1990)] 참조). 진핵생물 및 원핵생물 세포의 형질전환은 표준 기법에 따라 수행된다(예를 들어, 문헌[Morrison, 1977, J. Bacteriol. 132:349-351; Clark-Curtiss & Curtiss, Methods in Enzymology 101:347-362 (Wu et al., eds, 1983)] 참조).
외래의 뉴클레오타이드 서열을 숙주 세포에 도입하기 위한 임의의 공지된 절차가 이용될 수 있다. 이들은 인산칼슘 형질감염, 폴리브렌(polybrene), 프로토플라스트 융합, 전기천공법, 뉴클레오펙션, 리포솜, 미세주입법, 네이키드 DNA(naked DNA), 플라스미드 벡터, 바이러스 벡터, 에피솜 및 게놈 DNA, cDNA, 합성 DNA 또는 다른 외래 유전자 물질을 숙주 세포 내로 도입하기 위한 통합적이며 임의의 다른 잘 공지된 방법의 사용을 포함한다(예를 들어, 문헌[Sambrook et al.], 상기 참조). 사용되는 특정 유전자 조작 절차는 적어도 하나의 유전자를 gRNA를 발현시킬 수 있는 숙주 세포 내로 성공적으로 도입할 유일한 필요가 있다.
본 발명은 벡터, 및 벡터를 포함하는 세포를 포함한다.
실시예
본 발명은 청구범위에 기재되는 본 발명의 범주를 제한하지 않는 다음의 실시예에서 추가로 기재된다.
실시예 1. RNA-안내 엔도뉴클레아제의 특이성 평가
CRISPR RNA-안내 뉴클레아제(RGN)는 게놈 편집을 위한 손쉽고 효율적인 플랫폼으로서 빠르게 나타났다. 본 실시예는 Cas9-기반 RGN의 표적을 벗어난 절단을 특정규명하기 위한 인간 세포-기반 리포터 분석의 사용을 기재한다.
재료 및 방법
다음의 재료 및 방법을 실시예 1에서 사용하였다.
안내 RNA의 구성
Cas9 표적화를 위해 가변적 20개의 nt 서열을 보유하는 DNA 올리고뉴클레오타이드를 BsmBI-분해된 플라스미드 pMLM3636 내로의 결찰과 양립가능한 4bp 돌출부를 지니는 짧은 이중-가닥 DNA 단편을 생성하기 위해 어닐링시켰다. 이들 어닐링된 올리고뉴클레오타이드의 클로닝은 U6 프로모터의 발현 하에서 20개의 가변 5' 뉴클레오타이드를 지니는 키메라 +103 단일-쇄 안내 RNA를 암호화하는 플라스미드를 생성한다(Hwang et al., Nat Biotechnol 31, 227-229 (2013); Mali et al., Science 339, 823-826 (2013)). 본 연구에서 사용되는 pMLM3636 및 발현 플라스미드 pJDS246(Cas9의 코돈 최적화된 형태를 암호화)는 둘 다 비영리적 플라스미드 유통 서비스 애드진(Addgene)(addgene.org/crispr-cas)을 통해 입수할 수 있다.
EGFP 활성 분석
EGFP-PEST 융합 유전자의 단일 통합 복제물을 보유하는 U2OS.EGF 세포를 앞서 기재한 바와 같이 배양시켰다(Reyon et al., Nat Biotech 30, 460-465 (2012)). 형질감염을 위해, 200,000개의 세포를 제조업자의 프로토콜에 따라 SE 셀라인 4D-뉴클레오펙터((SE Cell Line 4D-Nucleofector)(상표명) 엑스 키트(론자(Lonza))를 이용하여 30ng의 Td-토마토-암호화 플라스미드와 함께 표시량의 gRNA 발현 플라스미드 및 pJDS246으로 뉴클레오펙션시켰다. BD LSRII 유세포분석기를 이용하여 형질감염 후 2일에 세포를 분석하였다. gRNA/Cas9 플라스미드 농도를 최적화하기 위한 형질감염을 3회 중복해서 수행하고 나서, 모든 다른 형질감염을 2회 중복해서 수행하였다.
내인성 인간 게놈 부위의 PCR 증폭 및 서열 확인
퓨전 핫 스타트 II 고충실도 DNA 중합효소(Phusion Hot Start II high-fidelity DNA: NEB)를 이용하여 PCR 반응을 수행하였다. 터치다운 PCR(98℃, 10초; 72 내지 62℃, -1℃/주기, 15초; 72℃, 30 s]10 주기, [98℃, 10초; 62℃, 15초; 72℃, 30초]25 주기)을 이용하여 대부분의 좌위를 성공적으로 증폭시켰다. 남아있는 표적에 대한 PCR을 68℃ 또는 72℃의 일정한 어닐링 온도에서 그리고 필요하다면 3% DMSO 또는 1M 베타인에서 35주기로 수행하였다. 퀴악셀(QIAXCEL) 모세관 전기이동 시스템 상에서 PCR 산물을 분석하여 크기와 순도를 확인하였다. 확인한 산물을 엑소샙-아이티(ExoSap-IT)(애피메트릭스(Affymetrix))로 처리하고 나서, 생어(Sanger) 방법(MGH DNA 시퀀싱 코어(Sequencing Core))에 의해 서열화하여 각각의 표적 부위를 확인하였다.
인간 세포에서 RGN-유도 표적 상의 및 표적을 벗어난 돌연변이 빈도의 결정
U2OS.EGFP 및 K562 세포에 대해, 2 x 105개 세포를 제조업자의 설명서(론자)에 따라 4D-뉴클레오펙터 시스템을 이용하여 250ng의 gRNA 발현 플라스미드 및 비어있는 U6 프로모터 플라스미드(음성 대조군에 대해), 750ng의 Cas9 발현 플라스미드 및 30ng의 td-토마토 발현 플라스미드로 형질감염시켰다. HEK293 세포에 대해, 1.65 x 105개의 세포를 제조업자의 설명서(라이프 테크놀로지즈(Life Technologies))에 따라 리포펙타민 LTX(Lipofectamine LTX) 시약을 이용하여 125ng의 gRNA 발현 플라스미드 또는 비어있는 U6 프로모터 플라스미드(음성 대조군에 대해), 375ng의 Cas9 발현 플라스미드 및 30ng의 td-토마토 발현 플라스미드로 형질감염시켰다. 게놈 DNA를 제조업자의 설명서에 따라 퀴아앰프 DNA 혈액 미니 키트(QIAamp DNA Blood Mini Kit)(퀴아젠(QIAGEN))를 이용하여 형질감염시킨 U2OS.EGFP, HEK293 또는 K562 세포로부터 채취하였다. 표적을 벗어난 후보 부위를 증폭시키는 충분한 게놈 DNA를 생성하기 위해, (U2OS.EGFP 세포에 대해) 3회의 뉴클레오펙션으로부터의 DNA, (K562 세포에 대해) 2회의 뉴클레오펙션 또는 2회의 리포펙타민 LTX 형질감염을 함께 모은 후에 T7EI를 수행하였다. 이를 시험한 각각의 조건에 대해 2회 행함으로써 총 4회 또는 6회의 개개 형질감염을 나타내는 게놈 DNA의 2회 중복 풀을 생성하였다. 이어서, PCR을 상기 기재한 바와 같이 주형으로서 이들 게놈 DNA를 이용하여 수행하고, 제조업자의 설명서에 따라 앰푸어 XP 비즈(Ampure XP beads)(에이전코트(gencourt))를 이용하여 정제하였다. T7EI 분석을 앞서 기재한 바와 같이 수행하였다(Reyon et al., 2012, 상기 참조).
NHEJ-매개된 삽입결실 돌연변이의 DNA 서열화
T7EI 분석을 위해 사용한 정제된 PCR 산물을 제로 블런트(Zero Blunt) TOPO 벡터(Life Technologies)로 클로닝시키고 나서, 플라스미드 DNA를 MGH DNA 오토메이션 코어(Automation Core)에 의해 알칼리 용해 미니프렙 방법을 이용하여 단리시켰다. 생어 방법(MGH DNA 시퀀싱 코어)에 의해 M13 정방향 프라이머(5' - GTAAAACGACGGCCAG - 3'(서열번호 19)를 이용하여 플라스미드를 시퀀싱시켰다.
실시예 1a. 단일 뉴클레오타이드 미스매치
인간 세포에서 RGN의 특이성 결정요인을 정하는 것을 시작하기 위해, 다수의 gRNA/표적 DNA 계면 내의 전체적으로 미스매칭되는 다양한 위치의 효과를 평가하는 대규모 시험을 수행하였다. 이를 위하여, 표적화된 뉴클레아제 활성을 빠르게 정량화할 수 있는 앞서 기재한 정량적 인간 세포-기반 향상 녹색 형광 단백질(EGFP) 붕괴 분석(도 2b)(문헌[Methods above and Reyon et al.], 2012, 상기 참조)을 사용하였다. 이 분석에서, 뉴클레아제-유도 이중-가닥 파손(DSB)의 오류 유발 비-상동성 말단연결(NHEJ)에 의해 도입한 틀이동 삽입/결실(indel) 돌연변이를 불활성화시킴으로써 야기된 인간 U2OS.EGFP 세포 내 형광 신호 손실을 평가함으로써 단일 통합 EGFP 리포터 유전자에 대해 표적화된 뉴클레아제의 활성을 정량화할 수 있다(DSB)(도 2b). 본 명세서에 기재된 연구를 위해, EGFP 내의 상이한 서열에 대해 표적화된 3 내지 100개의 nt 단일 gRNA(sgRNA)를 다음과 같이 사용하였다:
EGFP 부위 1 GGGCACGGGCAGCTTGCCGGTGG(서열번호 1)
EGFP 부위 2 GATGCCGTTCTTCTGCTTGTCGG(서열번호 2)
EGFP 부위 3 GGTGGTGCAGATGAACTTCAGGG(서열번호 3)
각각의 이들 sgRNA는 EGFP 발현의 Cas9-매개를 효율적으로 지시할 수 있다(실시예 1e 및 2a, 및 도 3e(상부) 및 도 3f(상부)).
처음의 실험에서, 3개의 EGFP-표적화된 sgRNA의 상보적 표적화 영역에서 20개 중 19개의 뉴클레오타이드에서 단일 뉴클레오타이드 미스매치의 효과를 시험하였다. 이를 위해서, 변이체 sgRNA를 위치 1 내지 19에서 왓슨-크릭 염기전환 미스매치(3' 내지 5' 방향으로 1 내지 20으로 넘버링; 도 1 참조) 및 시험한 인간 세포에서 Cas9-매개된 EGFP 붕괴를 지시하는 이들 다양한 sgRNA의 능력을 보유하는 각각 3개의 표적부위에 대해 생성하였다(위치 20에서 치환을 보유하는 변이체 sgRNA는 생성되지 않았는데, 이 뉴클레오타이드는 U6 프로모터 서열의 부분이며, 따라서 영향을 미치는 발현을 피하기 위해 구아닌을 남겨야 하기 때문이다).
EGFP 표적 부위 #2에 대해, gRNA의 위치 1 내지 10에서 단일 미스매치는 관련된 Cas9 활성에 대해 극적인 효과를 가지는데(도 2c, 중간 패널), 이는 gRNA의 5' 말단에서의 미스매치가 3' 말단에서의 미스매치보다 더 잘 용인된다는 것을 시사하는 이전의 연구와 일치된다(Jiang et al., Nat Biotechnol 31, 233-239 (2013); Cong et al., Science 339, 819-823 (2013); Jinek et al., Science 337, 816-821 (2012)). 그러나, EGFP 표적 부위 #1 및 #3에 의해, gRNA에서 모든 그러나 소수의 위치에서의 단일 미스매치는 서열의 3' 말단 내에서조차 잘 용인되는 것으로 나타난다. 더 나아가, 이들 두 표적과 상이한 미스매치에 민감한 특이적 위치(도 2c, 상부 패널과 하부 패널을 비교) - 예를 들어, 표적 부위 #1은 위치 2에서 미스매치에 특히 민감한 반면, 표적 부위 #3은 위치 1 및 8에서 미스매치에 가장 민감하였다.
실시예 1b. 다중 미스매치
gRNA/DNA 계면에서 하나 이상의 미스매치의 효과를 시험하기 위해, 인접한 및 분리된 위치에서 이중 왓슨-크릭 염기전환 미스매치를 보유하는 일련의 변이체 sgRNA를 생성하였고, Cas9 뉴클레아제 활성을 지시하는 이들 sgRNA의 능력을 EGFP 붕괴 분석을 이용하여 인간 세포에서 시험하였다. 모두 3개의 표적 부위는 일반적으로 하나 또는 둘 다의 미스매치가 gRNA 표적화 영역의 3' 절반 내에서 생기는 이중 변용에 대해 더 큰 민감성을 나타내었다. 그러나, 이들 효과의 규모는 부위-특이적 변이를 나타내었으며, 표적 부위 #2는 이들 이중 미스매치에 대해 가장 큰 민감성을 나타내고, 표적 부위 #1은 일반적으로 최소로 나타낸다. 용인될 수 있는 인접한 미스매치의 수를 시험하기 위해, sgRNA 표적화 영역의 5' 말단에서 위치 19 내지 15의 범위에 있는 증가된 수의 미스매칭된 위치를 보유하는 변이체 gRNA를 구성하였다(단일 및 이중 미스매치가 더 잘 용인되는 것으로 나타난 경우).
이들 점점 증가하는 미스매칭된 sgRNA의 시험은 모두 3개의 표적 부위에 대해, 3개 이상의 인접한 미스매치의 도입이 RGN 활성의 상당한 손실을 초래한다는 것을 나타내었다. 활성의 갑작스런 감소는 3개의 상이한 EGFP-표적화된 gRNA에 대해 생겼는데, 5' 말단에서 위치 19로부터 시작하는 진행성 미스매치를 만들며 3' 말단쪽으로 이동하는 더 많은 미스매치를 첨가하기 때문이다. 구체적으로, 위치 19 및 19+18에서 미스매치를 함유하는 gRNA는 본질적으로 완전한 활성을 나타내는 반면, 위치 19+18+17, 19+18+17+16 및 19+18+17+16+15 에서 미스매치를 지니는 gRNA는 음성 대조군에 비해 본질적으로 차이를 나타내지 않는다(도 2f). (본 발명자들은 이들 변이체 gRNA에서 위치 20과 미스매치되지 않는데, 이 위치는 gRNA의 발현을 구동시키는 U6 프로모터의 부분이기 때문에 G로서 남아있을 필요가 있기 때문이다).
단축 gRNA 상보성이 더 큰 특이성을 지니는 RGN을 야기할 수 있는 추가적인 증거를 다음의 실험에서 얻었다: 4회의 상이한 EGFP-표적화된 gRNA에 대해(도 2h), 위치 18 및 19에서 이중 미스매치의 도입은 활성에 상당하게 영향을 미치지 않았다. 그러나, 그 다음에 위치 10 및 11에서 이들 gRNA 내로의 다른 이중 미스매치의 도입은 거의 완전한 활성의 손실을 야기한다. 흥미롭게도, 단지 10/11 이중 미스매치의 도입은 활성에 대한 영향만큼 크지 않다.
종합하면, 인간 세포에서의 이들 결과는 RGN의 활성이 gRNA 표적화 서열의 3' 절반에서 미스매치에 대해 더 효과적일 수 있다는 것을 확인한다. 그러나, 데이터는 또한 RGN의 특이성이 복잡하고 표적 부위-의존적이며, 단일 및 이중 미스매치가 종종 하나 이상의 미스매치가 gRNA 표적화 영역의 3' 절반에서 생길 때조차 잘 용인된다는 것을 명확하게 나타낸다. 더 나아가, 이들 데이터는 또한 gRNA/DNA 계면의 5' 절반에서의 모든 미스매치가 반드시 잘 용인되지 않는다는 것을 시사한다.
추가로, 이들 결과는 더 짧은 상보성 영역을 보유하는 gRNA(구체적으로는 ~17개의 nt)가 그들의 활성에서 더 특이적이 될 것이라는 것을 강하게 시사한다. 본 발명자들은 PAM 서열에 의해 부여된 2개의 nt의 특이성과 조합된 17개의 nt가 19 bp 서열의 세부사항, 즉, 인간 세포에서 발견되는 것과 같이 거대하고 복잡한 게놈에서 독특하게 되기에 충분한 길이의 것을 초래한다는 것을 주목한다.
실시예 1c. 표적을 벗어난 돌연변이
내인성 인간 유전자에 표적화된 RGN에 대해 표적을 벗어난 돌연변이가 동정될 수 있는지 여부를 결정하기 위해, VEGFA 유전자에서 셋, EMX1 유전자에서 하나, RNF2 유전자에서 하나 및 FANCF 유전자에서 하나의 상이한 부위를 표적화하는 6개의 sgRNA를 사용하였다. 이들 6개의 sgRNA는 T7 엔도뉴클레아제 I(T7EI) 분석에 의해 검출된 바와 같은 인간 U2OS.EGFP 세포 내 그들 각각의 내인성 좌위에서 Cas9-매개된 삽입결실을 효율적으로 지시하였다(상기 방법). 이들 6개의 RGN 각각에 대해, 이어서, 본 발명자들은 U2OS.EGFP 세포에서 뉴클레아제-유도 NHEJ-매개된 삽입결실 돌연변이의 증거에 대해 수십의 잠재적인 표적을 벗어난 부위(46 내지 64만큼의 수 범위)를 시험하였다. 평가한 좌위는 1 또는 2개의 뉴클레오타이드만큼 상이한 모든 게놈 부위뿐만 아니라 3 내지 6개의 뉴클레오타이드만큼 상이한 게놈 부위의 서브세트를 포함하고, gRNA 표적화 서열의 5' 절반에서 이들 미스매치 중 하나 이상을 갖는 것에 대한 성향을 지녔다. T7EI 분석을 이용하여, VEGFA 부위 1에 대해 4(시험한 53개의 후보 부위를 벗어남), VEGFA 부위 2 대해 12(시험한 46개를 벗어남), VEGFA 부위 3 대해 7(시험한 64개를 벗어남), 및 EMX1 부위에 대해 1개의(시험한 46개를 벗어남) 표적을 벗어난 부위를 용이하게 동정하였다. RNF2 또는 FANCF 유전자 각각에 대해 시험한 43 및 50개의 잠재적 부위 중에서 표적을 벗어난 돌연변이는 검출되지 않았다. 확인한 표적을 벗어난 부위에서 돌연변이의 비율은 매우 높았으며, 의도된 표적 부위에서 관찰한 비율의 5.6% 내지 125%(평균 40%)의 범위에 있었다. 진정한 표적을 벗어난 이들은 표적 부위의 3' 말단에서 미스매치뿐만 아니라 총 5개의 미스매치를 지니는 서열을 포함하였고, 대부분의 표적을 벗어난 부위는 단백질 암호 유전자 내에서 생겼다. 표적을 벗어난 부위의 서브세트의 DNA 서열화는 삽입결실 돌연변이가 RGN 절단 부위에서 생긴다는 추가적인 분자적 확인을 제공하였다(도 8a 내지 도 8c).
실시예 1d. 다른 세포 유형에서 표적을 벗어난 돌연변이
RGN이 U2OS.EGFP 세포에서 고빈도로 표적을 벗어난 돌연변이를 유발할 수 있다는 것이 확립하고, 다음에 이들 뉴클레아제가 또한 다른 유형의 인간 세포에서 이들 효과를 갖는지 여부를 결정하도록 추구하였다. 초기 실험을 위해 U2OS.EGFP 세포를 선택하였는데, TALEN의 활성을 평가하기 위해 이들 세포를 이전에 사용하였지만15, 인간 HEK293 및 K562 세포는 표적화된 뉴클레아제의 활성을 시험하는데 더 광범위하게 사용되었기 때문이다. 따라서, VEGFA 부위 1, 2 및 3에 대해 그리고 EMX1 부위에 대해 표적화된 4개의 RGN의 활성을 또한 HEK293 및 K562 세포 내에서 평가하였다. U2OS.EGFP 세포에서 관찰된 것보다 다소 더 낮은 돌연변이 빈도를 지님에도 불구하고, 각각의 이들 4개의 RGN이 이들 2개의 추가적인 인간 세포주에서의 그들의 의도된 표적 상의 부위에서 NHEJ-매개된 삽입결실 돌연변이를 효율적으로 유도하였다는 것을 발견하였다(T7EI 분석에 의해 평가함). U2OS.EGFP 세포 내에서 본래 동정된 이들 4개의 RGN에 대해 24개의 표적을 벗어난 부위의 평가는 다수가 그들의 대응하는 표적 상의 부위와 유사한 빈도로 HEK293 및 K562 세포에서 다시 돌연변이된다는 것을 나타내었다. 예상한 바와 같이, HEK293 세포로부터의 이들 표적을 벗어난 부위의 서브세트의 DNA 서열화는 변용이 예상한 게놈 좌위에서 생긴다는 추가적인 분자적 증거를 제공하였다. U2OS.EGFP 세포에서 동정한 표적을 벗어난 부위의 HEK293 세포 내에서 4개 그리고 K562 세포 내에서 11개가 검출가능한 돌연변이를 나타내지 않는다 이유를 확실히 알지 못한다. 그러나, 다수의 이들 표적을 벗어난 부위가 또한 U2OS.EGFP 세포에서 상대적으로 더 낮은 돌연변이 빈도를 나타내었다는 것을 주목한다. 따라서, 본 발명자들은 HEK293 및 K562 세포에서 이들 부위의 돌연변이율이 T7EI 분석의 신뢰가능한 검출한계(~2 내지 5%) 미만에 속할 수 있다는 것을 추측하는데, RGN이 일반적으로 본 발명자들의 실험에서의 U2OS.EGFP 세포에 비해 HEK293 및 K562 세포에서 더 낮은 활성을 갖는 것으로 나타났기 때문이다. 종합하면, HEK293 및 K562 세포에서 결과는 RGN에 의해 관찰한 고빈도의 표적을 벗어난 돌연변이가 다수의 인간 세포 유형에서 보이는 일반적인 현상일 것이라는 증거를 제공한다.
실시예 1e. EGFP 붕괴 분석을 위해 사용한 gRNA- 및 Cas9-발현 플라스미드 양의 적정
비상동성 말단 연결을 통한 틀이동 돌연변이의 도입이 EGFP의 발현을 강하게 붕괴시킬 수 있는 위치인 EGFP 뉴클레오타이드 502 상류에 위치된 3개의 상이한 서열(상기 나타낸 EGFP 부위 1 내지 3)에 대해 단일 안내 gRNA(sgRNA)를 생성하였다(Maeder, M.L. et al., Mol Cell 31, 294-301 (2008); Reyon, D. et al., Nat Biotech 30, 460-465 (2012)).
각각 3개의 표적 부위에 대해, gRNA-발현 플라스미드 양의 범위(12.5 내지 250ng)를 구성적으로 발현된 EGFP-PEST 리포터 유전자인 단일 복제물을 보유하는 본 발명자들의 U2OS.EGFP 리포터 세포 내로 Cas9 뉴클레아제의 코돈-최적화된 형태를 발현시키는 750ng의 플라스미드와 함께 처음에 형질감염시켰다. 모두 3개의 RGN는 가장 고농도의 gRNA플라스미드(250ng)에서 EGFP 발현을 효율적으로 붕괴시켰다(도 3e (상부)). 그러나, 표적 부위 #1 및 #3에 대한 RGN은 더 소량의 gRNA-발현 플라스미드가 형질감염될 때 동등한 붕괴 수준을 나타낸 반면, 표적 부위 #2에서의 RGN 활성은 형질감염된 gRNA-발현 플라스미드의 양이 감소되었을 때 바로 하락하였다(도 3e(상부)).
본 발명자들의 U2OS.EGFP 리포터 세포 내로 형질감염된 Cas9-암호화 플라스미드(50 ng 내지 750ng의 범위)의 양을 적정하고 나서, EGFP 붕괴를 분석하였다. 도 3f(상부)에 나타낸 바와 같이, 표적 부위 #1은 EGFP 붕괴 활성의 실질적인 손실 없이 형질감염된 Cas9-암호화 플라스미드 양의 3배 감소를 용인하였다. 그러나, 표적 부위 #2 및 #3을 표적화하는 RGN의 활성은 형질감염된 Cas9 플라스미드 양의 3배 감소로 즉시 줄어들었다(도 3f (상부)). 이들 결과에 기반하여, gRNA-/Cas9-발현 플라스미드의 25ng/250ng, 250ng/750ng 및 200ng/750ng 를 실시예 1a 내지 1d에 기재한 실험에 대해 각각 EGFP 표적 부위 #1, #2 및 #3에 대해 사용하였다.
일부 gRNA/Cas9 조합이 EGFP 발현을 붕괴시키는데 있어서 나머지보다 더 양호하게 작용하는 이유는 이해되지 않으며, 이들 조합 중 일부가 형질감염에 대해 사용되는 플라스미드의 양에 다소 민감한 이유도 이해되지 않는다. 이들 3개의 sgRNA에 대해 게놈 내에 존재하는 표적을 벗어난 부위의 범위가 각각의 그들의 활성에 영향을 미치는 것이 가능하지만, 3개의 sgRNA의 차별적인 거동을 고려하는 이들 특정 표적 부위(표　1) 각각에 대해 1 내지 6개의 bp만큼 상이한 게놈 부위의 수에서의 차이는 알 수 없었다.
Figure pct00010
실시예 2: FokI - dCas9 융합 단백질과 안내 RNA 쌍의 이용
단량체 CRISPR-Cas9 뉴클레아제는 표적화된 게놈 편집을 위해 널리 사용되지만, 원치않는 표적을 벗어난 돌연변이를 고빈도로 유도할 수 있다. 이 실시예는 연장된 이중-길이 서열을 인식하고, 절단 활성을 위해 2개의 단일 안내 RNA(gRNA)에 엄격하게 의존하는 새로운 이량체 RNA-안내 FokI 뉴클레아제(RFN)를 기재한다. RFN은 고효율로 내인성 인간 유전자에서 DNA 서열을 강하게 편집할 수 있다. 추가적으로, 표적화 범위에서 유용한 이량체 RFN을 제공하는 중요한 진보인 임의의 5' 말단 뉴클레오타이드를 보유하는 gRNA를 발현시키기 위한 방법을 기재한다. 직접 비교에서, 단량체 Cas9 틈내기효소는 일반적으로 매칭된 단일 gRNA에 의해 지시되는 RFN보다 고빈도로 원치않는 삽입결실 및 예상치 못한 중심 점돌연변이를 유도한다. RFN은 이량체화의 특이성 향상과 CRISPR RNA-기반 표적화를 조합하고, 고도로 정확한 게놈 편집을 필요로 하는 연구 및 치료 적용을 위한 중요한 새로운 플랫폼을 제공한다.
재료 및 방법
다음의 재료 및 방법을 실시예 2에서 사용하였다.
단일 및 다중복합 gRNA 발현 플라스미드
단일 또는 다중복합 gRNA를 암호화하는 플라스미드를 어닐링시킨 표적 부위 올리고이중가닥의 단일-단계 결찰(통합된 DNA 기법) 및 BsmBI-분해된 Csy4-측접된 gRNA 백본(pSQT1313; 애드진(Addgene))을 지니는 (다중복합 gRNA에 대한) 불변 영역 올리고이중가닥에서 조립하였다.
플라스미드를 암호화하는 다중복합 gRNA를 1) 제1 표적 부위를 암호화하는 어닐링된 올리고, 2) crRNA, tracrRNA 및 Csy4-결합 부위를 암호화하는 포스포릴화된 어닐링된 올리고, 및 3) BsmBI II형 제한 효소로 분해된 U6-Csy4부위-gRNA 플라스미드 백본 내로 제2 표적 부위를 암호화하는 어닐링된 올리고를 결찰시킴으로써 구성하였다. Csy4 RNA 결합 부위를 gRNA 서열의 3' 및 5' 말단에 부착하고 세포 내에서 Cas9와 함께 발현시켰다. Csy4 RNA 결합 부위 서열 'GUUCACUGCCGUAUAGGCAGCUAAGAAA'(서열번호 20)을 표준 gRNA 서열의 5' 및 3' 말단에 융합시켰다.
Figure pct00011
이 서열은 Cys4 부위에 의해 측접되는 다중복합 gRNA 서열이다(밑줄). 기능적으로, 하나의 전사체 상에서 다중복합으로 이를 암호화하는 것은 그들을 별도로 암호화하는 것과 동일한 결과를 가져야 한다. Csy4-측접 sgRNA의 모든 쌍을 본 명세서에 기재된 실험에서 다중복합 상황에서 발현시켰지만, sgRNA는 하나의 전사체뿐만 아니라 추가적인 Cys4 서열을 갖는 개개의 sgRNA 상에서 암호화된 Cys4 부위에 의해 분리된 다중복합 sgRNA에서 암호화시킬 수 있다. 이 서열에서, 제1 N20 서열은 한 가닥의 표적 게놈 서열에 상보성인 서열을 나타내고, 제2 N20 서열은 다른 하나의 표적 게놈 서열에 상보성인 서열을 나타낸다.
gRNA를 함유하는 Csy4 인식 부위를 암호화하는 플라스미드를 '2A' 펩타이드 결합에 의해 분리되는 Cas9 및 Csy4 단백질을 암호화하는 플라스미드화 함께 공동형질감염시켰다. 결과는 5' 및 3' 말단에 융합된 Csy4 부위를 지니는 gRNA가 이전에 기재한 U2OS-EGFP 붕괴 분석을 이용하여 인간 세포에서 Cas9-매개된 절단을 지시할 수 있는 채로 남아있다는 것을 나타내었다. 따라서, Csy4 RNA 결합 부위는 gRNA 서열의 3' 말단에 부착될 수 있으며, Cas9와 이들 Csy4 부위-함유 gRNA의 복합체는 세포 내에서 기능성으로 남아있다.
일부 실험에서, Csy4-T2A-FokI-dCas9를 암호화하는 작제물을 사용하였다. FokI-dCas9 융합의 서열을 이하에 나타내며, FokI와 dCas9 사이의 GGGGS(서열번호 23) 링커(밑줄) 및 핵 국소화 서열을 포함한다.
FokI - dCas9 아미노산 서열( FokI - G4S - dCas9 - nls - 3XFLAG )
Figure pct00012
FokI-dCas9 뉴클레오타이드 서열(FokI-G4S-dCas9-nls-3XFLAG)
Figure pct00013
Figure pct00014
대안적으로, 이하에 나타낸 바와 같이 N-말단과 C-말단의 핵 국소화 신호를 둘 다 함유한 작제물의 인간 코돈 최적화된 형태를 사용하였다.
Nls-FokI-dCas9-nls 아미노산 서열
Figure pct00015
Nls-FokI-dCas9-nls 뉴클레오타이드 서열
Figure pct00016
Figure pct00017
Figure pct00018
조직 배양 및 형질감염
모든 세포 배양 실험을 HEK 293 세포, U2OS 세포에서 또는 탈안정화된 EGFP 유전자인 안정하게 통합된 단일 복제물을 보유하는 U2OS 세포(U2OS.EGFP 세포)에서 수행하였다. 세포주를 37℃에서 5% CO2와 함께 10% FBS, 2mM 글루타맥스(라이프 테크놀로리지) 및 페니실린/스트렙토마이신으로 보충한 어드밴스트 DMEM(Advanced DMEM)에서 유지하였다. 추가적으로, U2OS.EGFP 세포를 400㎍/㎖의 G418의 존재 하에 배양시켰다.
U2OS 세포 및 U2OS.EGFP 세포를 제조업자의 지침에 따라 론자 4D-뉴클레오펙터의 DN-100을 이용하여 형질감염시켰다. 초기 FokI-dCas9 활성 선별 및 중심 스페이서 길이 분석 실험에서, 750ng의 pCAG-Csy4-FokI-dCas9-nls 뉴클레아제 플라스미드 및 250ng의 gRNA 암호화 플라스미드를 형질감염 대조군으로서 50ng td토마토 발현 플라스미드(클론테크(Clontech))와 함께 형질감염시켰다. U2OS 및 U2OS.EGFP 세포에서의 모든 다른 실험에서, 975ng의 인간 코돈 최적화된 pCAG-Csy4-T2A-nls-hFokI-dCas9-nls(SQT1601) 또는 pCAG-Cas9-D10A 틈내기효소(NW3)를 325ng의 gRNA 벡터 및 10ng의 Td 토마토 발현 플라스미드와 함께 형질감염시켰으며, 형질감염 후 3일에 분석하였다. HEK293 세포를 제조업자의 지침에 따라 리포펙타민(라이프 테크놀로지즈)을 이용하여 750ng의 뉴클레아제 플라스미드, 250ng의 gRNA 발현 플라스미드 및 10ng의 Td 토마토와 함께 형질감염시키고, 형질감염 3일 후에 NHEJ-매개된 돌연변이유발에 대해 분석하였다.
초기 스페이서 활성 선별을 위해 단일 형질감염을 수행하고, 중심 스페이서 길이 분석에 대한 형질감염을 2회 반복하였다. 모든 다른 형질감염을 3회 중복해서 수행하였다.
EGFP 붕괴 분석
U2OS.EGFP 수용체 세포를 이용하여 앞서 기재한 바와 같이 EGFP 붕괴 분석을 수행하였다(실시예 1 및 문헌[Reyon et al., Nat Biotech 30, 460-465 (2012)] 참조). BD 바이오사이언스(BD Biosciences) LSR II 또는 포르테사(Fortessa) FACS 분석기를 이용하여 EGFP 및 td토마토 발현에 대해 세포를 분석하였다.
T7EI 분석에 의한 뉴클레아제- 또는 틈내기효소-유도 돌연변이의 정량화
앞서 기재한 바와 같이 T7E1 분석을 수행하였다(Reyon et al., Nat Biotech 30, 460-465 (2012)). 요약하면, 게놈 DNA를 형질감염 72시간 후에 스치클론(Sciclone) G3 액체-조절 워크스테이션(캘리퍼(Caliper))와 함께 제조업자의 지침에 따라 에이전코트 DNA어드밴스 게놈 DNA 단리 키트(Agencourt DNAdvance Genomic DNA Isolation kit)(벡맨 콜터 게노믹스(Beckman Coulter Genomics))를 이용하여 단리시켰다. 게놈 좌위를 증폭시키기 위한 PCR 반응을 퓨전 핫-스타트 플렉스 DNA 중합효소(뉴질랜드 바이오랩스(New England Biolabs))를 이용하여 수행하였다. 2단계 프로토콜을 이용하여 샘플을 증폭시켰다(98℃, 30초; (98℃, 7초; 72℃, 30초) x 35; 72℃, 5분) 또는 터치다운 PCR 프로토콜((98℃, 10초; 72 내지 62℃, -1℃/주기, 15초; 72℃, 30초) x 10주기, (98℃, 10초; 62℃, 15초; 72℃, 30초) x 25주기). 200ng의 정제된 PCR 앰플리콘을 변성시키고, 혼성화시키고 나서, T7 엔도뉴클레아제 I(뉴 잉글랜드 바이오랩스(New England Biolabs))로 처리하였다. 앞서 기재한 바와 같은 퀴악셀(Qiaxcel) 모세관 전기이동 기기(퀴아젠(Qiagen))을 이용하여 돌연변이 빈도를 정량화하였다(Reyon et al., Nat Biotech 30, 460-465 (2012)).
돌연변이유발된 게놈 DNA의 생어 서열화
T7EI 분석을 위해 사용한 동일한 정제시킨 PCR 산물은 토포-클론드(Topo-cloned)(라이프 테크놀로지)였고, M13 역 프라이머(5'-GTAAAACGACGGCCAG-3'; 서열번호 19)를 이용하여 개개 클론의 플라스미드 DNA를 단리시키고 서열화하였다.
일루미나(Illumina) 라이브러리 제조 및 분석
퓨전 핫-스타트 FLEX DNA 중합효소를 이용하여 짧은 200 내지 350 bp PCR 산물을 증폭시켰다. 제조업자의 지침에 따라 앰퓨어 XP 비드(벡맨 콜터 게놈(Beckman Coulter Genomics))을 이용하여 PCR 산물을 증폭시켰다. 스치클론 G3 액체-조절 워크스테이션 상에서 고속대량 라이브러리 제조 시스템(카파 바이오시스템즈(Kapa Biosystems))을 이용하여 이중-지표(Dual-indexed) TruSeq 일루미나 심층 서열화 라이브러리를 제조하였다. 퀴악셀 모세관 전기이동 기기(퀴아젠)를 이용하여 최종 어댑터 결찰 라이브러리를 정량화시켰다. 150bp의 짝지어진 말단 서열화를 대나-파버 암연구소 분자 생물학 핵심 시설(Dana-Farber Cancer Institute Molecular Biology Core Facilities)에서 수행하였다.
MiSeq 짝지어진-말단 판독을 bwa를 이용하여 인간 게놈 기준 GChr37에 대해 맵핑하였다. 30 초과의 평균 정성 스코어에 의한 판독으로 의도된 표적 또는 후보 표적을 벗어난 뉴클레아제 결합 부위와 중복되는 삽입 또는 결실 돌연변이에 대해 분석하였다. 게놈 분석 툴키트(Genome Analysis Toolkit: GATK) 및 피톤(Python)을 이용하여 돌연변이 분석을 수행하였다.
표적을 벗어난 탐색 알고리즘:
인간 게놈에 걸쳐 슬라이딩 윈도(sliding window)에서의 구체화된 미스매치의 수 미만의 매치를 찾는 표적-부위 매칭 알고리즘을 실행하였다.
실시예 2a. 이량체 RNA-안내 뉴클레아제를 설계하기 위한 이유
이량체화의 특이성 이점을 Cas9 표적화의 용이함과 조합하는 단일 플랫폼을 개발할 수 있다는 가설을 세웠다. 이를 위해서, 잘 특성규명된, 이합체화-의존적 FokI 뉴클레아제 도메인을 RNA-안내 촉매적 불활성 Cas9(dCas9) 단백질에 융합시켰다. FokI-함유 ZFN 및 TALEN과 같이, 이들 융합의 이량체는 그들 사이에 특정 길이 "스페이서" 서열을 지니는 2개의 "절반-부위"로 구성된 표적 부위에 결합될 때 서열-특이적 DNA 절단을 매개할 수 있는 것으로 기대된다(도 4a). 이러한 융합은 그들이 활성을 위해 2개의 gRNA를 필요로 하여야 하기 때문에(도 4a) 그리고 단일 gRNA가 DNA 절단에 필요한 2개의 FokI-함유 융합 단백질을 동원하는데 너무 비효율적이거나 또는 할 수 없는 것으로 추정되기 때문에, 향상된 특이성을 갖는다는 가설을 세웠다. 이러한 이량체 시스템은 표준 단량체 Cas9 뉴클레아제에 비해 개선된 특이성을 나타내며 또한 단일 틈내기효소가 여전히 원치않는 돌연변이유발 효과를 발휘할 수 있는 짝지어진 틈내기효소 시스템 이상의 중요한 특이성 이점을 잠재적으로 가질 것이라는 가설을 세웠다.
실시예 2b. 5' 단부 뉴클레오타이드 제한이 없는 gRNA의 다중복합 발현
기존의 gRNA 발현 방법을 이용하는 이량체 RNA-안내 뉴클레아제에 대한 표적화 범위는 낮다. 두 서열 필요(dCas9에 의해 구체화된 5' NGG의 PAM 서열에 대한 필요 및 대부분의 발현 벡터 내 U6 프로모터의 사용에 의해 겹쳐진 gRNA의 5' 말단에서 G 뉴클레오타이드에 대한 필요)는 전형적으로 dCas9 단량체의 표적화 범위를 제한한다. 그러나, gRNA 내 5' G에 대한 필요가 줄어들 수 있다면, 표적화 범위는 16배만큼 개선된다.
임의의 5' 뉴클레오타이드를 지니는 gRNA의 발현을 가능하게 하는 다중복합 시스템을 개발하기 위해, Csy4 리보뉴클레아제에 대한 절단 부위에 각각 측접하는 2개의 gRNA가(Haurwitz et al., Science 329, 1355-1358 (2010)) U6 프로모터로부터 전사된 단일 RNA 내에서 발현될 수 있는 플라스미드를 구성하였다(도 4b). Csy4는 이 전사체를 가공하여 2개의 gRNA를 방출하는 것으로 예상되었다. Csy4-매개된 절단의 공지된 메커니즘에 기반하여((Haurwitz et al., Science 329, 1355-1358 (2010); Sternberg et al., RNA 18, 661-672 (2012)), 각각의 가공된 gRNA는 해당 부위에 결합된 Cys4 단백질을 지니는 그의 3' 말단 상에서 Csy4 인식 부위를 보유하여야 한다(도 4b). 이 입체배치에서, 임의의 5' 뉴클레오타이드를 지니는 gRNA를 발현시킬 수 있어야 한다. 그것을 사용하여 EGFP 리포터 유전자 내의 부위에 표적화된 2개의 gRNA를 발현시킴으로써 이 시스템은 시험하였다. 인간 세포 내 Csy4 및 Cas9 뉴클레아제와 함께 이 전사체의 공동발현은 EGFP 표적 부위에서의 삽입결실 돌연변이의 도입뿐만 아니라 이들 부위 내의 서열의 결실을 야기하였다(도 4c). 이들 실험은 gRNA가 둘 다 단일 모 RNA 전사체로부터 가공되고 둘 다 인간 세포 내에서의 Cas9 뉴클레아제 활성을 지시할 수 있다는 것을 시사한다.
실시예 2c. 이량체 RNA-안내 뉴클레아제의 구성 및 최적화
FokI 뉴클레아제 도메인 및 dCas9 단백질을 보유하는 2개의 상이한 혼성체 단백질을 구성하였다: FokI 뉴클레아제 도메인이 dCas9의 카복시-말단에 융합된 하나(dCas9-FokI) 및 그것이 아미노-말단에 융합된 다른 하나(FokI-dCas9)(도 5a). dCas9-FokI 단백질은 ZFN 및 TALEN과 구조가 유사하다(도 5a). 이들 융합 중 하나 또는 둘 다가 DNA의 부위 특이적 절단을 매개하는지의 여부를 확인하기 위해, EGFP 리포터 유전자 내로의 NHEJ-매개된 삽입결실의 도입을 빠르고 용이하게 정량화할 수 있는 잘 확립된 인간 세포 기반 분석을 사용하였다(실시예 1에서 상기 기재한 EGFP 붕괴 분석). 효율적인 절단을 위해 필요한 절반-부위의 기하학적 구조는 알려져 있지 않기 때문에, EGFP 내 다양한 부위에 대해 표적화된 60쌍의 gRNA를 설계하였다. 각각의 이들 gRNA 쌍에 의해 표적화된 2개의 절반 부위를 그들의 PAM 서열이 둘 다 스페이서 서열에 직접 인접하거나("PAM 내부" 배향) 또는 전장 표적 부위의 외부 경계에 위치되도록("PAM 외부" 배향) 배향시켰다(도 5b). 추가로, 스페이서 서열은 또한 0 내지 31 bp의 길이로 변하였다(도 5b 및 표 2).
Figure pct00019
Figure pct00020
Figure pct00021
Figure pct00022
Figure pct00023
Figure pct00024
Figure pct00025
Figure pct00026
Figure pct00027
놀랍게도, dCas9-FokI 단백질은 인간 U2OS.EGFP 세포에서 임의의 60개의 gRNA 쌍과 함께 공동 발현될 때, 검출가능한 EGFP 붕괴 활성을 나타내지 않았다(도 5e). 그러나, 동일한 60개의 gRNA 쌍을 지니는 FokI-dCas9 단백질의 선별은 PAM 외부 배향으로 그리고 13 내지 17개 bp의 스페이서 길이 및 26 bp의 스페이서 길이로 구성된 표적 부위 상의 EGFP 붕괴 활성을 나타내었다(13 내지 17 초과의 bp 스페이서 길이의 대략 1회전의 DNA 나선)(도 5b). 10 내지 20 bp 범위에 있는 스페이스 길이를 지니고 PAM 외부 배향으로 절반-부위를 지니는 추가적인 25개 표적 DNA 부위에 대한 FokI-dCas9의 시험은 13 내지 18 bp의 스페이서 길이를 지니는 표적 상에서 효율적인 절단을 입증하였다(도 5c 내지 도 5d). 이들 실험에서, 하나의 부위 각각을 17 또는 18 bp의 스페이서 길이에 대해 시험하였고, 13 bp 스페이서 길이를 지니는 모든 부위가 활성을 나타내지는 않았다. T7EI 분석 및 생어 서열화에 의한 성공적으로 표적화된 부위의 서브세트의 분석은 의도된 위치에서의 삽입결실의 존재를 추가로 확인하였다. 따라서, FokI-dCas9는 관심 대상의 전장 표적 부위를 효율적으로 절단하기 위해 2개의 적절하게 위치된 gRNA에 의해 지시될 수 있다. 단순함을 위해, 2개의 FokI-dCas9 융합과 2개의 gRNA의 복합체는 RNA-안내 FokI 뉴클레아제(RFN)로서 본 명세서에서 지칭된다.
EGFP 수용체 유전자에 의한 초기 발견을 연장시키기 위해 그리고 RFN이 내인성 인간 유전자의 일상적인 게놈 편집을 수행하기 위해 사용될 수 있었는지의 여부를 확인하기 위해, 9개의 상이한 인간 유전자에서 12개의 상이한 표적 부위에 대해 gRNA 쌍을 설계하였다(표 2). 시험한 12개의 RFN 중 11개는 T7EI 분석에 의해 판단되는 바와 같이 인간 U2OS.EGFP 세포 내 그들의 의도된 표적 부위에서 고효율(3 내지 40%의 범위)로 삽입결실을 도입하였다(표 2). HEK293 세포에서 이들 동일한 12개의 RFN 쌍과 유사한 결과를 얻었다(표 2). U2OS.EGFP 세포로부터 성공적으로 표적화된 대립유전자의 생어 서열화는 예상된 절단 부위에서 삽입결실(주로 결실) 범위의 도입을 나타내었다(도 5f). 두 상이한 인간 세포주에서 관찰된 고성공률 및 고효율의 변형은 내인성 인간 유전자를 변형시키기 위한 RFN의 강함을 입증한다.
실시예 2d. RFN은 절단 부위에 대해 연장된 특이성을 가진다
RFN이 이량체화와 관련된 향상된 인식 특이성을 갖는지의 여부를 시험하기 위해, 이들 뉴클레아제가 쌍 내의 gRNA가 둘 다의 존재에 의존하는지의 여부를 시험하였다. 이상적인 이량체 시스템에서, 단일 gRNA는 FokI-dCas9-유도 삽입결실을 효율적으로 지시할 수 없어야 한다. 초기 시험을 수행하기 위해, 인간 U2OS.EGFP 세포에서 표적 부위에 대한 FokI-dCas9-유도 삽입결실을 효율적으로 지시하는 것으로 나타난 EGFP 내 2개의 표적 부위(EGFP 부위 47 및 81)로 향하는 두 쌍의 gRNA를 사용하였다(도 5c). VEGFA 내 관련없는 부위에 대해 표적화된 gRNA를 지니는 이들 두 쌍의 각각에서 하나 또는 다른 하나의 gRNA의 대체는 EGFP 붕괴 활성의 감소(도 6a) 및 T7EI 분석에 의해 판단되는 바와 같은 검출가능하지 않은 수준으로 표적화된 돌연변이의 감소(도 6b)를 초래하였다. 유사하게, 인간 APC, MLH1 및 VEGFA 유전자 내에 FokI-dCas9-매개된 삽입결실을 효율적으로 도입하는 쌍을 이용하여 두 gRNA의 각각 중 단지 하나를 사용하는 효과를 시험하였고(표 2) 또한 T7EI 분석에 의한 검출가능한 RFN-유도 삽입결실의 손실을 관찰하였다(도 6c). 이들 결과는 RFN에 의한 게놈 편집의 효율적인 유도가 전장 표적 부위에 대해 적절한 상보성을 지니는 2개의 gRNA를 필요로 한다는 것을 입증한다.
본 발명자들의 RFN의 활성이 두 gRNA의 발현에 의존한다는 것을 고려하면, 쌍에서 단일 gRNA 중 하나의 알려진 표적을 벗어난 부위에 대한 그들의 돌연변이유발 효과가 무시할만해야 하는 것으로 기대되었다. 이들 직접적 비교를 수행하는 것은 단일 gRNA(그 자체가 또한 이량체 RFN을 표적화하는데 필요한 2개의 gRNA 중 하나로 작용할 수 있음)에 의해 안내된 단량체 Cas9 뉴클레아제에 대한 표적을 벗어난 부위를 알 것을 필요로 한다. 매우 소수의 단량체 Cas9 뉴클레아제 표적을 벗어난 부위가 문헌에서 정의되었지만, 5개의 표적을 벗어난 부위는 본 발명자들이 인간 VEGFA 유전자 내 이량체 RFN 부위를 표적화하기 위해 사용한 gRNA 중 하나에 대해 이전에 동정되었다(실시예 1). 이들 5개의 표적을 벗어난 부위가 VEGFA-표적화된 RFN이 발현된 세포 내 돌연변이의 증거를 나타내었는지의 여부를 확인하기 위해 심층 서열화를 사용하였다(이들은 본 발명자들이 도 6c에서 나타낸 T7EI 분석에 대해 사용한 것과 동일한 세포이다). 모두 5개의 표적을 벗어난 부위에서의 삽입결실 돌연변이의 빈도를 배경과 구별할 수 없었다(도 6d 및 표 3). 이들 결과는 RFN의 사용이 Cas9 뉴클레아제 및 단일 gRNA에 의해 본래 유도된 표적을 벗어난 효과를 본질적으로 제거할 수 있으며, FokI-dCas9와 함께 발현된 단일 gRNA가 삽입결실을 효율적으로 유도하지 않는다는 것을 입증한다. 현재는 추가 부위 상에서 이들의 직접적 비교를 수행할 수는 없지만, 이러한 실험은 이량체 RFN에 대한 절반-부위를 또한 표적화할 수 있는 더 단일의 gRNA 부위에 대해 표적을 벗어난 부위의 동정을 기다려야 할 것이며, 이량체 RFN이 표준 단량체 Cas9 뉴클레아제에 비해 향상된 특이성을 가진다는 결론을 내렸다.
Figure pct00028
Figure pct00029
Figure pct00030
실시예 2e. 단량체 Cas9 틈내기효소는 단일 gRNA/FokI-dCas9 복합체보다 더 고비율의 돌연변이유발을 유도한다
상기 주목한 바와 같이, 짝지어진 Cas9 틈내기효소 접근의 중요한 약점은 단일 단량체 틈내기효소가 특정 표적 부위에서 고빈도로 삽입결실 돌연변이를 도입할 수 있다는 것이다(실시예 1 및 문헌[Ran et al., Cell 154, 1380-1389 (2013); Mali et al., Nat Biotechnol 31, 833-838 (2013); Cho et al., 게놈 Res (2013); 및 Mali et al., Science 339, 823-826 (2013)]). 짝지어진 Cas9 틈내기효소 시스템에서 이량체화-의존도의 이런 결여는 두 단량체 틈내기효소가 게놈 내 다른 곳에서 원치않는 삽입결실 돌연변이를 생성할 수 있기 때문에 표적을 벗어난 효과의 잠재적 공급원이다. RFN이 이량체화-의존적 FokI 뉴클레아제를 이용하는 변용을 도입하기 때문에, 이들 융합은 일반적으로 단량체 Cas9 틈내기효소에 의해 관찰된 것에 비해 단지 하나의 gRNA의 존재에서 바람직하지 않은 삽입결실 활성을 더 적게 나타내야 한다는 가설을 세웠다.
이 가설을 시험하기 위해, FokI-dCas9 및 Cas9 틈내기효소의 활성을 6개의 이량체 인간 유전자 표적 부위에서 단일 gRNA의 존재 하에 비교하였다(총 12개의 절반-부위; 표 4). 한 쌍에서 단지 하나 및/또는 다른 하나의 gRNA에 의해 지시되는 단량체 Cas9 틈내기효소가 이들 표적에서 삽입결실 돌연변이를 유도할 수 있었기 때문에 이들 특정 부위를 선택하였다. 심층 서열화를 이용하여, FokI-dCas9 또는 Cas9 틈내기효소의 게놈 편집 활성을 gRNA 둘 다 또는 단지 하나 또는 다른 하나의 존재 하에 평가하였다. FokI-dCas9와 Cas9 틈내기효소는 둘 다 두 gRNA의 존재에서 고효율로 모두 6개 표적 부위에서 삽입결실을 유도하였다(표 5). 가설로 세운 바와 같이, 12개의 단일 gRNA에 의해 지시되는 단량체 Cas9 틈내기효소는 0.0048% 내지 3.04%의 범위에 있는 빈도로 삽입결실을 유도하였다(도 7a 및 표 5). 대조적으로, 동일한 12개의 단일 gRNA에 의해 지시되는 FokI-dCas9는 0.0045% 내지 0.473%의 범위에 있는 낮은 빈도로 삽입결실을 유도하였다(도 7a 및 표 5). 이들 데이터를 직접 비교함으로써, FokI-dCas9는 12개의 단일 gRNA 중 10개에 대해 Cas9 틈내기효소보다 더 낮은 빈도로 삽입결실을 유도하였다(도 7a 및 표 5). 추가로, FokI-dCas9는 짝지어진 gRNA 비율을 단일 gRNA 비율과 비교할 때 12개의 절반-부위 중 11개에서 Cas9 절단 효소보다 십입결실 빈도의 더 큰 배수적 감소를 나타내었다(도 7b).
Figure pct00031
Figure pct00032
Figure pct00033
심층 서열화 실험은 또한 특정 단량체 Cas9 틈내기효소의 이전에 기재하지 않은 그리고 예상치 못한 부작용, 즉, 그들의 표적 부위 내의 특정 위치에서의 점돌연변이의 도입을 아우르지 못한다. VEGFA 표적의 "우측" 절반-부위에 대한 단일 gRNA와 함께 공동발현시킨 Cas9 틈내기효소는 10.5%의 빈도로 인식 부위의 위치 15에서 염기 치환을 유도하였다(도 8a). FANCF 표적 부위 1(위치 16에서 16.3%의 돌연변이 빈도)의 "우측 절반-부위"로 향하거나(도 8b) 또는 RUNX1 표적 부위의 "우측" 절반-부위(위치 17에서 2%의 돌연변이 빈도)(도 8c)로 향하는 Cas9 틈내기효소 및 단일 gRNA에 의해 유사한 결과를 관찰하였다. 이들 위치에서 점돌연변이는 Cas9 틈내기효소 또는 gRNA가 세포 내에서 발현되지 않은 대조군 샘플 내에서 배경수준 초과로 관찰되지 않았다(도 8a 내지 도 8c). 흥미롭게도, 이 초돌연변이가 관찰된 세 부위 중 둘에 대해, 관찰된 대부분의 치환은 비-표적 DNA 가닥 상에서 C의 G로의 전환이다. 이들 점돌연변이가 관찰되는 위치는 dCas9/gRNA/표적 DNA 복합체에서 시험관내 P1 뉴클레아제에 민감하게 되는 것으로 관찰된 표적 부위의 가닥-분리된 영역 내에 속한다. 중요하게도, 이들 점돌연변이는 FokI-dCas9 단백질 및 동일한 gRNA를 발현시키는 세포 내에서 훨씬 더 낮은 빈도로(5 내지 100배 더 낮음) 생긴다(도 8a 내 지 도 8c). 전반적으로, 단일 gRNA에 의해 지시되는 FokI-dCas9 뉴클레아제는 매칭된 단일 Cas9 틈내기효소보다 더 낮은 빈도로 돌연변이유발 삽입결실 및 점돌연변이를 유도한다는 결론을 내렸다.
실시예 2f. 이량체 RFN는 고특이도를 가진다
2개의 gRNA에 의해 지시되는 이량체 RFN는 인간 세포에서 인식가능한 표적을 벗어난 돌연변이를 유도하는 것으로 예상되지 않는다. 두 절반-부위로 구성된 전장 서열을 절단하기 위한 gRNA의 쌍에 의해 지시된 RFN은 표적 부위에서 DNA의 44개 bp까지를 구체화하는 것으로 예상되었다. 이 길이의 서열은 뜻밖에도 (표적이 이중 게놈 서열에 놓이는 특정 상황을 제외하고) 거의 항상 독특할 것이다. 추가로, 이 전장 부위에 대해 게놈 내에서 거의 밀접하게 매칭된 부위는 대부분의 경우에 다수의 미스매치를 가져야 하며, 결국 RFN 이량체에 의해 활성을 최소화하거나 없애는 것으로 예상된다. 사실, 이 연구에서 RFN에 의해 성공적으로 표적화된 15개의 전장 서열에 대해 0 내지 16개의 미스매치를 보유하는(그리고 14 내지 17 bp 길이의 스페이서를 허용하는) 인간 게놈 내 모든 부위를 동정하였다. 이 분석은 모두 15개의 전장 서열이 독특하며 게놈 내에서 가장 밀접하게 매칭된 부위가 7 내지 12개의 미스매치 범위에 있다는 것을 나타내었다(표 6). 이 수의 미스매치를 함유하는 부위는 RFN에 의해 효율적으로 돌연변이유발되지 않아야 하며, 이 가설을 확인하기 위한 장래의 연구에서 관심대상이 될 것이다. 전반적으로, 이량체 RFN은 인간 세포에서 고특이도를 가져야 하지만, 특이성의 궁극적 특성규명은 전체 게놈에 걸쳐 RFN 특이도를 포괄적으로 정할 수 있는 편견없는 방법의 개발을 기대할 것이다.
Figure pct00034
참고문헌
Figure pct00035
Figure pct00036
Figure pct00037
Figure pct00038
다른 실시형태
본 발명이 이의 상세한 설명화 함께 기재되었지만, 앞서 언급한 설명은 예시적인 것이며 첨부하는 청구범위의 범주에 의해서 정해지는 본 발명의 범주를 제한하지 않는 것으로 의도된다는 것이 이해되어야 한다. 다른 양태, 이점 및 변형이 다음의 청구범위의 범주 내에 있다.
SEQUENCE LISTING <110> THE GENERAL HOSPITAL CORPORATION <120> USING RNA-GUIDED FOKI NUCLEASES (RFNS) TO INCREASE SPECIFICITY FOR RNA-GUIDED GENOME EDITING <130> 00786-0895WO1 <140> PCT/US2014/028630 <141> 2014-03-14 <150> 61/921,007 <151> 2013-12-26 <150> 61/838,148 <151> 2013-06-21 <150> 61/838,178 <151> 2013-06-21 <150> 61/799,647 <151> 2013-03-15 <160> 466 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic binding site oligonucleotide <400> 1 gggcacgggc agcttgccgg tgg 23 <210> 2 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic binding site oligonucleotide <400> 2 gatgccgttc ttctgcttgt cgg 23 <210> 3 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic binding site oligonucleotide <400> 3 ggtggtgcag atgaacttca ggg 23 <210> 4 <211> 583 <212> PRT <213> Planomicrobium okeanokoites <400> 4 Met Phe Leu Ser Met Val Ser Lys Ile Arg Thr Phe Gly Trp Val Gln 1 5 10 15 Asn Pro Gly Lys Phe Glu Asn Leu Lys Arg Val Val Gln Val Phe Asp 20 25 30 Arg Asn Ser Lys Val His Asn Glu Val Lys Asn Ile Lys Ile Pro Thr 35 40 45 Leu Val Lys Glu Ser Lys Ile Gln Lys Glu Leu Val Ala Ile Met Asn 50 55 60 Gln His Asp Leu Ile Tyr Thr Tyr Lys Glu Leu Val Gly Thr Gly Thr 65 70 75 80 Ser Ile Arg Ser Glu Ala Pro Cys Asp Ala Ile Ile Gln Ala Thr Ile 85 90 95 Ala Asp Gln Gly Asn Lys Lys Gly Tyr Ile Asp Asn Trp Ser Ser Asp 100 105 110 Gly Phe Leu Arg Trp Ala His Ala Leu Gly Phe Ile Glu Tyr Ile Asn 115 120 125 Lys Ser Asp Ser Phe Val Ile Thr Asp Val Gly Leu Ala Tyr Ser Lys 130 135 140 Ser Ala Asp Gly Ser Ala Ile Glu Lys Glu Ile Leu Ile Glu Ala Ile 145 150 155 160 Ser Ser Tyr Pro Pro Ala Ile Arg Ile Leu Thr Leu Leu Glu Asp Gly 165 170 175 Gln His Leu Thr Lys Phe Asp Leu Gly Lys Asn Leu Gly Phe Ser Gly 180 185 190 Glu Ser Gly Phe Thr Ser Leu Pro Glu Gly Ile Leu Leu Asp Thr Leu 195 200 205 Ala Asn Ala Met Pro Lys Asp Lys Gly Glu Ile Arg Asn Asn Trp Glu 210 215 220 Gly Ser Ser Asp Lys Tyr Ala Arg Met Ile Gly Gly Trp Leu Asp Lys 225 230 235 240 Leu Gly Leu Val Lys Gln Gly Lys Lys Glu Phe Ile Ile Pro Thr Leu 245 250 255 Gly Lys Pro Asp Asn Lys Glu Phe Ile Ser His Ala Phe Lys Ile Thr 260 265 270 Gly Glu Gly Leu Lys Val Leu Arg Arg Ala Lys Gly Ser Thr Lys Phe 275 280 285 Thr Arg Val Pro Lys Arg Val Tyr Trp Glu Met Leu Ala Thr Asn Leu 290 295 300 Thr Asp Lys Glu Tyr Val Arg Thr Arg Arg Ala Leu Ile Leu Glu Ile 305 310 315 320 Leu Ile Lys Ala Gly Ser Leu Lys Ile Glu Gln Ile Gln Asp Asn Leu 325 330 335 Lys Lys Leu Gly Phe Asp Glu Val Ile Glu Thr Ile Glu Asn Asp Ile 340 345 350 Lys Gly Leu Ile Asn Thr Gly Ile Phe Ile Glu Ile Lys Gly Arg Phe 355 360 365 Tyr Gln Leu Lys Asp His Ile Leu Gln Phe Val Ile Pro Asn Arg Gly 370 375 380 Val Thr Lys Gln Leu Val Lys Ser Glu Leu Glu Glu Lys Lys Ser Glu 385 390 395 400 Leu Arg His Lys Leu Lys Tyr Val Pro His Glu Tyr Ile Glu Leu Ile 405 410 415 Glu Ile Ala Arg Asn Ser Thr Gln Asp Arg Ile Leu Glu Met Lys Val 420 425 430 Met Glu Phe Phe Met Lys Val Tyr Gly Tyr Arg Gly Lys His Leu Gly 435 440 445 Gly Ser Arg Lys Pro Asp Gly Ala Ile Tyr Thr Val Gly Ser Pro Ile 450 455 460 Asp Tyr Gly Val Ile Val Asp Thr Lys Ala Tyr Ser Gly Gly Tyr Asn 465 470 475 480 Leu Pro Ile Gly Gln Ala Asp Glu Met Gln Arg Tyr Val Glu Glu Asn 485 490 495 Gln Thr Arg Asn Lys His Ile Asn Pro Asn Glu Trp Trp Lys Val Tyr 500 505 510 Pro Ser Ser Val Thr Glu Phe Lys Phe Leu Phe Val Ser Gly His Phe 515 520 525 Lys Gly Asn Tyr Lys Ala Gln Leu Thr Arg Leu Asn His Ile Thr Asn 530 535 540 Cys Asn Gly Ala Val Leu Ser Val Glu Glu Leu Leu Ile Gly Gly Glu 545 550 555 560 Met Ile Lys Ala Gly Thr Leu Thr Leu Glu Glu Val Arg Arg Lys Phe 565 570 575 Asn Asn Gly Glu Ile Asn Phe 580 <210> 5 <211> 1368 <212> PRT <213> Streptococcus pyogenes <400> 5 Met Asp Lys Lys Tyr Ser Ile Gly Leu Ala Ile Gly Thr Asn Ser Val 1 5 10 15 Gly Trp Ala Val Ile Thr Asp Glu Tyr Lys Val Pro Ser Lys Lys Phe 20 25 30 Lys Val Leu Gly Asn Thr Asp Arg His Ser Ile Lys Lys Asn Leu Ile 35 40 45 Gly Ala Leu Leu Phe Asp Ser Gly Glu Thr Ala Glu Ala Thr Arg Leu 50 55 60 Lys Arg Thr Ala Arg Arg Arg Tyr Thr Arg Arg Lys Asn Arg Ile Cys 65 70 75 80 Tyr Leu Gln Glu Ile Phe Ser Asn Glu Met Ala Lys Val Asp Asp Ser 85 90 95 Phe Phe His Arg Leu Glu Glu Ser Phe Leu Val Glu Glu Asp Lys Lys 100 105 110 His Glu Arg His Pro Ile Phe Gly Asn Ile Val Asp Glu Val Ala Tyr 115 120 125 His Glu Lys Tyr Pro Thr Ile Tyr His Leu Arg Lys Lys Leu Val Asp 130 135 140 Ser Thr Asp Lys Ala Asp Leu Arg Leu Ile Tyr Leu Ala Leu Ala His 145 150 155 160 Met Ile Lys Phe Arg Gly His Phe Leu Ile Glu Gly Asp Leu Asn Pro 165 170 175 Asp Asn Ser Asp Val Asp Lys Leu Phe Ile Gln Leu Val Gln Thr Tyr 180 185 190 Asn Gln Leu Phe Glu Glu Asn Pro Ile Asn Ala Ser Gly Val Asp Ala 195 200 205 Lys Ala Ile Leu Ser Ala Arg Leu Ser Lys Ser Arg Arg Leu Glu Asn 210 215 220 Leu Ile Ala Gln Leu Pro Gly Glu Lys Lys Asn Gly Leu Phe Gly Asn 225 230 235 240 Leu Ile Ala Leu Ser Leu Gly Leu Thr Pro Asn Phe Lys Ser Asn Phe 245 250 255 Asp Leu Ala Glu Asp Ala Lys Leu Gln Leu Ser Lys Asp Thr Tyr Asp 260 265 270 Asp Asp Leu Asp Asn Leu Leu Ala Gln Ile Gly Asp Gln Tyr Ala Asp 275 280 285 Leu Phe Leu Ala Ala Lys Asn Leu Ser Asp Ala Ile Leu Leu Ser Asp 290 295 300 Ile Leu Arg Val Asn Thr Glu Ile Thr Lys Ala Pro Leu Ser Ala Ser 305 310 315 320 Met Ile Lys Arg Tyr Asp Glu His His Gln Asp Leu Thr Leu Leu Lys 325 330 335 Ala Leu Val Arg Gln Gln Leu Pro Glu Lys Tyr Lys Glu Ile Phe Phe 340 345 350 Asp Gln Ser Lys Asn Gly Tyr Ala Gly Tyr Ile Asp Gly Gly Ala Ser 355 360 365 Gln Glu Glu Phe Tyr Lys Phe Ile Lys Pro Ile Leu Glu Lys Met Asp 370 375 380 Gly Thr Glu Glu Leu Leu Val Lys Leu Asn Arg Glu Asp Leu Leu Arg 385 390 395 400 Lys Gln Arg Thr Phe Asp Asn Gly Ser Ile Pro His Gln Ile His Leu 405 410 415 Gly Glu Leu His Ala Ile Leu Arg Arg Gln Glu Asp Phe Tyr Pro Phe 420 425 430 Leu Lys Asp Asn Arg Glu Lys Ile Glu Lys Ile Leu Thr Phe Arg Ile 435 440 445 Pro Tyr Tyr Val Gly Pro Leu Ala Arg Gly Asn Ser Arg Phe Ala Trp 450 455 460 Met Thr Arg Lys Ser Glu Glu Thr Ile Thr Pro Trp Asn Phe Glu Glu 465 470 475 480 Val Val Asp Lys Gly Ala Ser Ala Gln Ser Phe Ile Glu Arg Met Thr 485 490 495 Asn Phe Asp Lys Asn Leu Pro Asn Glu Lys Val Leu Pro Lys His Ser 500 505 510 Leu Leu Tyr Glu Tyr Phe Thr Val Tyr Asn Glu Leu Thr Lys Val Lys 515 520 525 Tyr Val Thr Glu Gly Met Arg Lys Pro Ala Phe Leu Ser Gly Glu Gln 530 535 540 Lys Lys Ala Ile Val Asp Leu Leu Phe Lys Thr Asn Arg Lys Val Thr 545 550 555 560 Val Lys Gln Leu Lys Glu Asp Tyr Phe Lys Lys Ile Glu Cys Phe Asp 565 570 575 Ser Val Glu Ile Ser Gly Val Glu Asp Arg Phe Asn Ala Ser Leu Gly 580 585 590 Thr Tyr His Asp Leu Leu Lys Ile Ile Lys Asp Lys Asp Phe Leu Asp 595 600 605 Asn Glu Glu Asn Glu Asp Ile Leu Glu Asp Ile Val Leu Thr Leu Thr 610 615 620 Leu Phe Glu Asp Arg Glu Met Ile Glu Glu Arg Leu Lys Thr Tyr Ala 625 630 635 640 His Leu Phe Asp Asp Lys Val Met Lys Gln Leu Lys Arg Arg Arg Tyr 645 650 655 Thr Gly Trp Gly Arg Leu Ser Arg Lys Leu Ile Asn Gly Ile Arg Asp 660 665 670 Lys Gln Ser Gly Lys Thr Ile Leu Asp Phe Leu Lys Ser Asp Gly Phe 675 680 685 Ala Asn Arg Asn Phe Met Gln Leu Ile His Asp Asp Ser Leu Thr Phe 690 695 700 Lys Glu Asp Ile Gln Lys Ala Gln Val Ser Gly Gln Gly Asp Ser Leu 705 710 715 720 His Glu His Ile Ala Asn Leu Ala Gly Ser Pro Ala Ile Lys Lys Gly 725 730 735 Ile Leu Gln Thr Val Lys Val Val Asp Glu Leu Val Lys Val Met Gly 740 745 750 Arg His Lys Pro Glu Asn Ile Val Ile Glu Met Ala Arg Glu Asn Gln 755 760 765 Thr Thr Gln Lys Gly Gln Lys Asn Ser Arg Glu Arg Met Lys Arg Ile 770 775 780 Glu Glu Gly Ile Lys Glu Leu Gly Ser Gln Ile Leu Lys Glu His Pro 785 790 795 800 Val Glu Asn Thr Gln Leu Gln Asn Glu Lys Leu Tyr Leu Tyr Tyr Leu 805 810 815 Gln Asn Gly Arg Asp Met Tyr Val Asp Gln Glu Leu Asp Ile Asn Arg 820 825 830 Leu Ser Asp Tyr Asp Val Asp Ala Ile Val Pro Gln Ser Phe Leu Lys 835 840 845 Asp Asp Ser Ile Asp Asn Lys Val Leu Thr Arg Ser Asp Lys Asn Arg 850 855 860 Gly Lys Ser Asp Asn Val Pro Ser Glu Glu Val Val Lys Lys Met Lys 865 870 875 880 Asn Tyr Trp Arg Gln Leu Leu Asn Ala Lys Leu Ile Thr Gln Arg Lys 885 890 895 Phe Asp Asn Leu Thr Lys Ala Glu Arg Gly Gly Leu Ser Glu Leu Asp 900 905 910 Lys Ala Gly Phe Ile Lys Arg Gln Leu Val Glu Thr Arg Gln Ile Thr 915 920 925 Lys His Val Ala Gln Ile Leu Asp Ser Arg Met Asn Thr Lys Tyr Asp 930 935 940 Glu Asn Asp Lys Leu Ile Arg Glu Val Lys Val Ile Thr Leu Lys Ser 945 950 955 960 Lys Leu Val Ser Asp Phe Arg Lys Asp Phe Gln Phe Tyr Lys Val Arg 965 970 975 Glu Ile Asn Asn Tyr His His Ala His Asp Ala Tyr Leu Asn Ala Val 980 985 990 Val Gly Thr Ala Leu Ile Lys Lys Tyr Pro Lys Leu Glu Ser Glu Phe 995 1000 1005 Val Tyr Gly Asp Tyr Lys Val Tyr Asp Val Arg Lys Met Ile Ala 1010 1015 1020 Lys Ser Glu Gln Glu Ile Gly Lys Ala Thr Ala Lys Tyr Phe Phe 1025 1030 1035 Tyr Ser Asn Ile Met Asn Phe Phe Lys Thr Glu Ile Thr Leu Ala 1040 1045 1050 Asn Gly Glu Ile Arg Lys Arg Pro Leu Ile Glu Thr Asn Gly Glu 1055 1060 1065 Thr Gly Glu Ile Val Trp Asp Lys Gly Arg Asp Phe Ala Thr Val 1070 1075 1080 Arg Lys Val Leu Ser Met Pro Gln Val Asn Ile Val Lys Lys Thr 1085 1090 1095 Glu Val Gln Thr Gly Gly Phe Ser Lys Glu Ser Ile Leu Pro Lys 1100 1105 1110 Arg Asn Ser Asp Lys Leu Ile Ala Arg Lys Lys Asp Trp Asp Pro 1115 1120 1125 Lys Lys Tyr Gly Gly Phe Asp Ser Pro Thr Val Ala Tyr Ser Val 1130 1135 1140 Leu Val Val Ala Lys Val Glu Lys Gly Lys Ser Lys Lys Leu Lys 1145 1150 1155 Ser Val Lys Glu Leu Leu Gly Ile Thr Ile Met Glu Arg Ser Ser 1160 1165 1170 Phe Glu Lys Asn Pro Ile Asp Phe Leu Glu Ala Lys Gly Tyr Lys 1175 1180 1185 Glu Val Lys Lys Asp Leu Ile Ile Lys Leu Pro Lys Tyr Ser Leu 1190 1195 1200 Phe Glu Leu Glu Asn Gly Arg Lys Arg Met Leu Ala Ser Ala Gly 1205 1210 1215 Glu Leu Gln Lys Gly Asn Glu Leu Ala Leu Pro Ser Lys Tyr Val 1220 1225 1230 Asn Phe Leu Tyr Leu Ala Ser His Tyr Glu Lys Leu Lys Gly Ser 1235 1240 1245 Pro Glu Asp Asn Glu Gln Lys Gln Leu Phe Val Glu Gln His Lys 1250 1255 1260 His Tyr Leu Asp Glu Ile Ile Glu Gln Ile Ser Glu Phe Ser Lys 1265 1270 1275 Arg Val Ile Leu Ala Asp Ala Asn Leu Asp Lys Val Leu Ser Ala 1280 1285 1290 Tyr Asn Lys His Arg Asp Lys Pro Ile Arg Glu Gln Ala Glu Asn 1295 1300 1305 Ile Ile His Leu Phe Thr Leu Thr Asn Leu Gly Ala Pro Ala Ala 1310 1315 1320 Phe Lys Tyr Phe Asp Thr Thr Ile Asp Arg Lys Arg Tyr Thr Ser 1325 1330 1335 Thr Lys Glu Val Leu Asp Ala Thr Leu Ile His Gln Ser Ile Thr 1340 1345 1350 Gly Leu Tyr Glu Thr Arg Ile Asp Leu Ser Gln Leu Gly Gly Asp 1355 1360 1365 <210> 6 <211> 262 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic guide RNA polynucleotide <220> <221> modified_base <222> (1)..(20) <223> a, c, u, g, unknown or other and this region may encompass 17-20 nucleotides <220> <221> modified_base <222> (63)..(262) <223> a, c, u, g, unknown or other and this region may encompass 0-200 nucleotides <400> 6 nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60 cgnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn 120 nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn 180 nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn 240 nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nn 262 <210> 7 <211> 275 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic guide RNA polynucleotide <220> <221> modified_base <222> (1)..(20) <223> a, c, u, g, unknown or other and this region may encompass 17-20 nucleotides <220> <221> modified_base <222> (76)..(275) <223> a, c, u, g, unknown or other and this region may encompass 0-200 nucleotides <400> 7 nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn guuuuagagc uaugcugaaa agcauagcaa guuaaaauaa 60 ggcuaguccg uuaucnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn 120 nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn 180 nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn 240 nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnn 275 <210> 8 <211> 287 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic guide RNA polynucleotide <220> <221> modified_base <222> (1)..(20) <223> a, c, u, g, unknown or other and this region may encompass 17-20 nucleotides <220> <221> modified_base <222> (88)..(287) <223> a, c, u, g, unknown or other and this region may encompass 0-200 nucleotides <400> 8 nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn guuuuagagc uaugcuguuu uggaaacaaa acagcauagc 60 aaguuaaaau aaggcuaguc cguuaucnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn 120 nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn 180 nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn 240 nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnn 287 <210> 9 <211> 296 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic guide RNA polynucleotide <220> <221> modified_base <222> (1)..(20) <223> a, c, u, g, unknown or other and this region may encompass 17-20 nucleotides <220> <221> modified_base <222> (97)..(296) <223> a, c, u, g, unknown or other and this region may encompass 0-200 nucleotides <400> 9 nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60 cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn 120 nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn 180 nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn 240 nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnn 296 <210> 10 <211> 96 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic guide RNA oligonucleotide <220> <221> modified_base <222> (1)..(20) <223> a, c, u, g, unknown or other and this region may encompass 17-20 nucleotides <400> 10 nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn guuuaagagc uagaaauagc aaguuuaaau aaggcuaguc 60 cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugc 96 <210> 11 <211> 106 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic guide RNA polynucleotide <220> <221> modified_base <222> (1)..(20) <223> a, c, u, g, unknown or other and this region may encompass 17-20 nucleotides <400> 11 nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn guuuuagagc uaugcuggaa acagcauagc aaguuuaaau 60 aaggcuaguc cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugc 106 <210> 12 <211> 106 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic guide RNA polynucleotide <220> <221> modified_base <222> (1)..(20) <223> a, c, u, g, unknown or other and this region may encompass 17-20 nucleotides <400> 12 nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn guuuaagagc uaugcuggaa acagcauagc aaguuuaaau 60 aaggcuaguc cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugc 106 <210> 13 <211> 32 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic tracrRNA oligonucleotide <220> <221> modified_base <222> (1)..(20) <223> a, c, u, g, unknown or other and this region may encompass 17-20 nucleotides <400> 13 nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn guuuuagagc ua 32 <210> 14 <211> 42 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic tracrRNA oligonucleotide <220> <221> modified_base <222> (1)..(20) <223> a, c, u, g, unknown or other and this region may encompass 17-20 nucleotides <400> 14 nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn guuuuagagc uaugcuguuu ug 42 <210> 15 <211> 36 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic tracrRNA oligonucleotide <220> <221> modified_base <222> (1)..(20) <223> a, c, u, g, unknown or other and this region may encompass 17-20 nucleotides <400> 15 nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn guuuuagagc uaugcu 36 <210> 16 <211> 79 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic tracrRNA oligonucleotide <400> 16 ggaaccauuc aaaacagcau agcaaguuaa aauaaggcua guccguuauc aacuugaaaa 60 aguggcaccg agucggugc 79 <210> 17 <211> 60 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic tracrRNA oligonucleotide <400> 17 uagcaaguua aaauaaggcu aguccguuau caacuugaaa aaguggcacc gagucggugc 60 <210> 18 <211> 64 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic tracrRNA oligonucleotide <400> 18 agcauagcaa guuaaaauaa ggcuaguccg uuaucaacuu gaaaaagugg caccgagucg 60 gugc 64 <210> 19 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 19 gtaaaacgac ggccag 16 <210> 20 <211> 28 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic Csy4 RNA binding site oligonucleotide <400> 20 guucacugcc guauaggcag cuaagaaa 28 <210> 21 <211> 252 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic multiplex guide RNA polynucleotide <220> <221> modified_base <222> (21)..(40) <223> a, c, u, g, unknown or other <220> <221> modified_base <222> (137)..(156) <223> a, c, u, g, unknown or other <400> 21 guucacugcc guauaggcag nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn guuuuagagc uagaaauagc 60 aaguuaaaau aaggcuaguc cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcguuc 120 acugccguau aggcagnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnguuu uagagcuaga aauagcaagu 180 uaaaauaagg cuaguccguu aucaacuuga aaaaguggca ccgagucggu gcguucacug 240 ccguauaggc ag 252 <210> 22 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic linker peptide <400> 22 Gly Gly Gly Ser 1 <210> 23 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic linker peptide <400> 23 Gly Gly Gly Gly Ser 1 5 <210> 24 <211> 1602 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic FokI-dCas9 polypeptide <400> 24 Met Gln Leu Val Lys Ser Glu Leu Glu Glu Lys Lys Ser Glu Leu Arg 1 5 10 15 His Lys Leu Lys Tyr Val Pro His Glu Tyr Ile Glu Leu Ile Glu Ile 20 25 30 Ala Arg Asn Ser Thr Gln Asp Arg Ile Leu Glu Met Lys Val Met Glu 35 40 45 Phe Phe Met Lys Val Tyr Gly Tyr Arg Gly Lys His Leu Gly Gly Ser 50 55 60 Arg Lys Pro Asp Gly Ala Ile Tyr Thr Val Gly Ser Pro Ile Asp Tyr 65 70 75 80 Gly Val Ile Val Asp Thr Lys Ala Tyr Ser Gly Gly Tyr Asn Leu Pro 85 90 95 Ile Gly Gln Ala Asp Glu Met Gln Arg Tyr Val Glu Glu Asn Gln Thr 100 105 110 Arg Asn Lys His Ile Asn Pro Asn Glu Trp Trp Lys Val Tyr Pro Ser 115 120 125 Ser Val Thr Glu Phe Lys Phe Leu Phe Val Ser Gly His Phe Lys Gly 130 135 140 Asn Tyr Lys Ala Gln Leu Thr Arg Leu Asn His Ile Thr Asn Cys Asn 145 150 155 160 Gly Ala Val Leu Ser Val Glu Glu Leu Leu Ile Gly Gly Glu Met Ile 165 170 175 Lys Ala Gly Thr Leu Thr Leu Glu Glu Val Arg Arg Lys Phe Asn Asn 180 185 190 Gly Glu Ile Asn Phe Gly Gly Gly Gly Ser Asp Lys Lys Tyr Ser Ile 195 200 205 Gly Leu Ala Ile Gly Thr Asn Ser Val Gly Trp Ala Val Ile Thr Asp 210 215 220 Glu Tyr Lys Val Pro Ser Lys Lys Phe Lys Val Leu Gly Asn Thr Asp 225 230 235 240 Arg His Ser Ile Lys Lys Asn Leu Ile Gly Ala Leu Leu Phe Asp Ser 245 250 255 Gly Glu Thr Ala Glu Ala Thr Arg Leu Lys Arg Thr Ala Arg Arg Arg 260 265 270 Tyr Thr Arg Arg Lys Asn Arg Ile Cys Tyr Leu Gln Glu Ile Phe Ser 275 280 285 Asn Glu Met Ala Lys Val Asp Asp Ser Phe Phe His Arg Leu Glu Glu 290 295 300 Ser Phe Leu Val Glu Glu Asp Lys Lys His Glu Arg His Pro Ile Phe 305 310 315 320 Gly Asn Ile Val Asp Glu Val Ala Tyr His Glu Lys Tyr Pro Thr Ile 325 330 335 Tyr His Leu Arg Lys Lys Leu Val Asp Ser Thr Asp Lys Ala Asp Leu 340 345 350 Arg Leu Ile Tyr Leu Ala Leu Ala His Met Ile Lys Phe Arg Gly His 355 360 365 Phe Leu Ile Glu Gly Asp Leu Asn Pro Asp Asn Ser Asp Val Asp Lys 370 375 380 Leu Phe Ile Gln Leu Val Gln Thr Tyr Asn Gln Leu Phe Glu Glu Asn 385 390 395 400 Pro Ile Asn Ala Ser Gly Val Asp Ala Lys Ala Ile Leu Ser Ala Arg 405 410 415 Leu Ser Lys Ser Arg Arg Leu Glu Asn Leu Ile Ala Gln Leu Pro Gly 420 425 430 Glu Lys Lys Asn Gly Leu Phe Gly Asn Leu Ile Ala Leu Ser Leu Gly 435 440 445 Leu Thr Pro Asn Phe Lys Ser Asn Phe Asp Leu Ala Glu Asp Ala Lys 450 455 460 Leu Gln Leu Ser Lys Asp Thr Tyr Asp Asp Asp Leu Asp Asn Leu Leu 465 470 475 480 Ala Gln Ile Gly Asp Gln Tyr Ala Asp Leu Phe Leu Ala Ala Lys Asn 485 490 495 Leu Ser Asp Ala Ile Leu Leu Ser Asp Ile Leu Arg Val Asn Thr Glu 500 505 510 Ile Thr Lys Ala Pro Leu Ser Ala Ser Met Ile Lys Arg Tyr Asp Glu 515 520 525 His His Gln Asp Leu Thr Leu Leu Lys Ala Leu Val Arg Gln Gln Leu 530 535 540 Pro Glu Lys Tyr Lys Glu Ile Phe Phe Asp Gln Ser Lys Asn Gly Tyr 545 550 555 560 Ala Gly Tyr Ile Asp Gly Gly Ala Ser Gln Glu Glu Phe Tyr Lys Phe 565 570 575 Ile Lys Pro Ile Leu Glu Lys Met Asp Gly Thr Glu Glu Leu Leu Val 580 585 590 Lys Leu Asn Arg Glu Asp Leu Leu Arg Lys Gln Arg Thr Phe Asp Asn 595 600 605 Gly Ser Ile Pro His Gln Ile His Leu Gly Glu Leu His Ala Ile Leu 610 615 620 Arg Arg Gln Glu Asp Phe Tyr Pro Phe Leu Lys Asp Asn Arg Glu Lys 625 630 635 640 Ile Glu Lys Ile Leu Thr Phe Arg Ile Pro Tyr Tyr Val Gly Pro Leu 645 650 655 Ala Arg Gly Asn Ser Arg Phe Ala Trp Met Thr Arg Lys Ser Glu Glu 660 665 670 Thr Ile Thr Pro Trp Asn Phe Glu Glu Val Val Asp Lys Gly Ala Ser 675 680 685 Ala Gln Ser Phe Ile Glu Arg Met Thr Asn Phe Asp Lys Asn Leu Pro 690 695 700 Asn Glu Lys Val Leu Pro Lys His Ser Leu Leu Tyr Glu Tyr Phe Thr 705 710 715 720 Val Tyr Asn Glu Leu Thr Lys Val Lys Tyr Val Thr Glu Gly Met Arg 725 730 735 Lys Pro Ala Phe Leu Ser Gly Glu Gln Lys Lys Ala Ile Val Asp Leu 740 745 750 Leu Phe Lys Thr Asn Arg Lys Val Thr Val Lys Gln Leu Lys Glu Asp 755 760 765 Tyr Phe Lys Lys Ile Glu Cys Phe Asp Ser Val Glu Ile Ser Gly Val 770 775 780 Glu Asp Arg Phe Asn Ala Ser Leu Gly Thr Tyr His Asp Leu Leu Lys 785 790 795 800 Ile Ile Lys Asp Lys Asp Phe Leu Asp Asn Glu Glu Asn Glu Asp Ile 805 810 815 Leu Glu Asp Ile Val Leu Thr Leu Thr Leu Phe Glu Asp Arg Glu Met 820 825 830 Ile Glu Glu Arg Leu Lys Thr Tyr Ala His Leu Phe Asp Asp Lys Val 835 840 845 Met Lys Gln Leu Lys Arg Arg Arg Tyr Thr Gly Trp Gly Arg Leu Ser 850 855 860 Arg Lys Leu Ile Asn Gly Ile Arg Asp Lys Gln Ser Gly Lys Thr Ile 865 870 875 880 Leu Asp Phe Leu Lys Ser Asp Gly Phe Ala Asn Arg Asn Phe Met Gln 885 890 895 Leu Ile His Asp Asp Ser Leu Thr Phe Lys Glu Asp Ile Gln Lys Ala 900 905 910 Gln Val Ser Gly Gln Gly Asp Ser Leu His Glu His Ile Ala Asn Leu 915 920 925 Ala Gly Ser Pro Ala Ile Lys Lys Gly Ile Leu Gln Thr Val Lys Val 930 935 940 Val Asp Glu Leu Val Lys Val Met Gly Arg His Lys Pro Glu Asn Ile 945 950 955 960 Val Ile Glu Met Ala Arg Glu Asn Gln Thr Thr Gln Lys Gly Gln Lys 965 970 975 Asn Ser Arg Glu Arg Met Lys Arg Ile Glu Glu Gly Ile Lys Glu Leu 980 985 990 Gly Ser Gln Ile Leu Lys Glu His Pro Val Glu Asn Thr Gln Leu Gln 995 1000 1005 Asn Glu Lys Leu Tyr Leu Tyr Tyr Leu Gln Asn Gly Arg Asp Met 1010 1015 1020 Tyr Val Asp Gln Glu Leu Asp Ile Asn Arg Leu Ser Asp Tyr Asp 1025 1030 1035 Val Asp Ala Ile Val Pro Gln Ser Phe Leu Lys Asp Asp Ser Ile 1040 1045 1050 Asp Asn Lys Val Leu Thr Arg Ser Asp Lys Asn Arg Gly Lys Ser 1055 1060 1065 Asp Asn Val Pro Ser Glu Glu Val Val Lys Lys Met Lys Asn Tyr 1070 1075 1080 Trp Arg Gln Leu Leu Asn Ala Lys Leu Ile Thr Gln Arg Lys Phe 1085 1090 1095 Asp Asn Leu Thr Lys Ala Glu Arg Gly Gly Leu Ser Glu Leu Asp 1100 1105 1110 Lys Ala Gly Phe Ile Lys Arg Gln Leu Val Glu Thr Arg Gln Ile 1115 1120 1125 Thr Lys His Val Ala Gln Ile Leu Asp Ser Arg Met Asn Thr Lys 1130 1135 1140 Tyr Asp Glu Asn Asp Lys Leu Ile Arg Glu Val Lys Val Ile Thr 1145 1150 1155 Leu Lys Ser Lys Leu Val Ser Asp Phe Arg Lys Asp Phe Gln Phe 1160 1165 1170 Tyr Lys Val Arg Glu Ile Asn Asn Tyr His His Ala His Asp Ala 1175 1180 1185 Tyr Leu Asn Ala Val Val Gly Thr Ala Leu Ile Lys Lys Tyr Pro 1190 1195 1200 Lys Leu Glu Ser Glu Phe Val Tyr Gly Asp Tyr Lys Val Tyr Asp 1205 1210 1215 Val Arg Lys Met Ile Ala Lys Ser Glu Gln Glu Ile Gly Lys Ala 1220 1225 1230 Thr Ala Lys Tyr Phe Phe Tyr Ser Asn Ile Met Asn Phe Phe Lys 1235 1240 1245 Thr Glu Ile Thr Leu Ala Asn Gly Glu Ile Arg Lys Arg Pro Leu 1250 1255 1260 Ile Glu Thr Asn Gly Glu Thr Gly Glu Ile Val Trp Asp Lys Gly 1265 1270 1275 Arg Asp Phe Ala Thr Val Arg Lys Val Leu Ser Met Pro Gln Val 1280 1285 1290 Asn Ile Val Lys Lys Thr Glu Val Gln Thr Gly Gly Phe Ser Lys 1295 1300 1305 Glu Ser Ile Leu Pro Lys Arg Asn Ser Asp Lys Leu Ile Ala Arg 1310 1315 1320 Lys Lys Asp Trp Asp Pro Lys Lys Tyr Gly Gly Phe Asp Ser Pro 1325 1330 1335 Thr Val Ala Tyr Ser Val Leu Val Val Ala Lys Val Glu Lys Gly 1340 1345 1350 Lys Ser Lys Lys Leu Lys Ser Val Lys Glu Leu Leu Gly Ile Thr 1355 1360 1365 Ile Met Glu Arg Ser Ser Phe Glu Lys Asn Pro Ile Asp Phe Leu 1370 1375 1380 Glu Ala Lys Gly Tyr Lys Glu Val Lys Lys Asp Leu Ile Ile Lys 1385 1390 1395 Leu Pro Lys Tyr Ser Leu Phe Glu Leu Glu Asn Gly Arg Lys Arg 1400 1405 1410 Met Leu Ala Ser Ala Gly Glu Leu Gln Lys Gly Asn Glu Leu Ala 1415 1420 1425 Leu Pro Ser Lys Tyr Val Asn Phe Leu Tyr Leu Ala Ser His Tyr 1430 1435 1440 Glu Lys Leu Lys Gly Ser Pro Glu Asp Asn Glu Gln Lys Gln Leu 1445 1450 1455 Phe Val Glu Gln His Lys His Tyr Leu Asp Glu Ile Ile Glu Gln 1460 1465 1470 Ile Ser Glu Phe Ser Lys Arg Val Ile Leu Ala Asp Ala Asn Leu 1475 1480 1485 Asp Lys Val Leu Ser Ala Tyr Asn Lys His Arg Asp Lys Pro Ile 1490 1495 1500 Arg Glu Gln Ala Glu Asn Ile Ile His Leu Phe Thr Leu Thr Asn 1505 1510 1515 Leu Gly Ala Pro Ala Ala Phe Lys Tyr Phe Asp Thr Thr Ile Asp 1520 1525 1530 Arg Lys Arg Tyr Thr Ser Thr Lys Glu Val Leu Asp Ala Thr Leu 1535 1540 1545 Ile His Gln Ser Ile Thr Gly Leu Tyr Glu Thr Arg Ile Asp Leu 1550 1555 1560 Ser Gln Leu Gly Gly Asp Gly Ser Pro Lys Lys Lys Arg Lys Val 1565 1570 1575 Ser Ser Asp Tyr Lys Asp His Asp Gly Asp Tyr Lys Asp His Asp 1580 1585 1590 Ile Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys 1595 1600 <210> 25 <211> 4809 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic FokI-dCas9 polynucleotide <400> 25 atgcaactag tcaaaagtga actggaggag aagaaatctg aacttcgtca taaattgaaa 60 tatgtgcctc atgaatatat tgaattaatt gaaattgcca gaaattccac tcaggataga 120 attcttgaaa tgaaggtaat ggaatttttt atgaaagttt atggatatag aggtaaacat 180 ttgggtggat caaggaaacc ggacggagca atttatactg tcggatctcc tattgattac 240 ggtgtgatcg tggatactaa agcttatagc ggaggttata atctgccaat tggccaagca 300 gatgaaatgc aacgatatgt cgaagaaaat caaacacgaa acaaacatat caaccctaat 360 gaatggtgga aagtctatcc atcttctgta acggaattta agtttttatt tgtgagtggt 420 cactttaaag gaaactacaa agctcagctt acacgattaa atcatatcac taattgtaat 480 ggagctgttc ttagtgtaga agagctttta attggtggag aaatgattaa agccggcaca 540 ttaaccttag aggaagtcag acggaaattt aataacggcg agataaactt tggtggcggt 600 ggatccgata aaaagtattc tattggttta gccatcggca ctaattccgt tggatgggct 660 gtcataaccg atgaatacaa agtaccttca aagaaattta aggtgttggg gaacacagac 720 cgtcattcga ttaaaaagaa tcttatcggt gccctcctat tcgatagtgg cgaaacggca 780 gaggcgactc gcctgaaacg aaccgctcgg agaaggtata cacgtcgcaa gaaccgaata 840 tgttacttac aagaaatttt tagcaatgag atggccaaag ttgacgattc tttctttcac 900 cgtttggaag agtccttcct tgtcgaagag gacaagaaac atgaacggca ccccatcttt 960 ggaaacatag tagatgaggt ggcatatcat gaaaagtacc caacgattta tcacctcaga 1020 aaaaagctag ttgactcaac tgataaagcg gacctgaggt taatctactt ggctcttgcc 1080 catatgataa agttccgtgg gcactttctc attgagggtg atctaaatcc ggacaactcg 1140 gatgtcgaca aactgttcat ccagttagta caaacctata atcagttgtt tgaagagaac 1200 cctataaatg caagtggcgt ggatgcgaag gctattctta gcgcccgcct ctctaaatcc 1260 cgacggctag aaaacctgat cgcacaatta cccggagaga agaaaaatgg gttgttcggt 1320 aaccttatag cgctctcact aggcctgaca ccaaatttta agtcgaactt cgacttagct 1380 gaagatgcca aattgcagct tagtaaggac acgtacgatg acgatctcga caatctactg 1440 gcacaaattg gagatcagta tgcggactta tttttggctg ccaaaaacct tagcgatgca 1500 atcctcctat ctgacatact gagagttaat actgagatta ccaaggcgcc gttatccgct 1560 tcaatgatca aaaggtacga tgaacatcac caagacttga cacttctcaa ggccctagtc 1620 cgtcagcaac tgcctgagaa atataaggaa atattctttg atcagtcgaa aaacgggtac 1680 gcaggttata ttgacggcgg agcgagtcaa gaggaattct acaagtttat caaacccata 1740 ttagagaaga tggatgggac ggaagagttg cttgtaaaac tcaatcgcga agatctactg 1800 cgaaagcagc ggactttcga caacggtagc attccacatc aaatccactt aggcgaattg 1860 catgctatac ttagaaggca ggaggatttt tatccgttcc tcaaagacaa tcgtgaaaag 1920 attgagaaaa tcctaacctt tcgcatacct tactatgtgg gacccctggc ccgagggaac 1980 tctcggttcg catggatgac aagaaagtcc gaagaaacga ttactccatg gaattttgag 2040 gaagttgtcg ataaaggtgc gtcagctcaa tcgttcatcg agaggatgac caactttgac 2100 aagaatttac cgaacgaaaa agtattgcct aagcacagtt tactttacga gtatttcaca 2160 gtgtacaatg aactcacgaa agttaagtat gtcactgagg gcatgcgtaa acccgccttt 2220 ctaagcggag aacagaagaa agcaatagta gatctgttat tcaagaccaa ccgcaaagtg 2280 acagttaagc aattgaaaga ggactacttt aagaaaattg aatgcttcga ttctgtcgag 2340 atctccgggg tagaagatcg atttaatgcg tcacttggta cgtatcatga cctcctaaag 2400 ataattaaag ataaggactt cctggataac gaagagaatg aagatatctt agaagatata 2460 gtgttgactc ttaccctctt tgaagatcgg gaaatgattg aggaaagact aaaaacatac 2520 gctcacctgt tcgacgataa ggttatgaaa cagttaaaga ggcgtcgcta tacgggctgg 2580 ggacgattgt cgcggaaact tatcaacggg ataagagaca agcaaagtgg taaaactatt 2640 ctcgattttc taaagagcga cggcttcgcc aataggaact ttatgcagct gatccatgat 2700 gactctttaa ccttcaaaga ggatatacaa aaggcacagg tttccggaca aggggactca 2760 ttgcacgaac atattgcgaa tcttgctggt tcgccagcca tcaaaaaggg catactccag 2820 acagtcaaag tagtggatga gctagttaag gtcatgggac gtcacaaacc ggaaaacatt 2880 gtaatcgaga tggcacgcga aaatcaaacg actcagaagg ggcaaaaaaa cagtcgagag 2940 cggatgaaga gaatagaaga gggtattaaa gaactgggca gccagatctt aaaggagcat 3000 cctgtggaaa atacccaatt gcagaacgag aaactttacc tctattacct acaaaatgga 3060 agggacatgt atgttgatca ggaactggac ataaaccgtt tatctgatta cgacgtcgat 3120 gccattgtac cccaatcctt tttgaaggac gattcaatcg acaataaagt gcttacacgc 3180 tcggataaga accgagggaa aagtgacaat gttccaagcg aggaagtcgt aaagaaaatg 3240 aagaactatt ggcggcagct cctaaatgcg aaactgataa cgcaaagaaa gttcgataac 3300 ttaactaaag ctgagagggg tggcttgtct gaacttgaca aggccggatt tattaaacgt 3360 cagctcgtgg aaacccgcca aatcacaaag catgttgcac agatactaga ttcccgaatg 3420 aatacgaaat acgacgagaa cgataagctg attcgggaag tcaaagtaat cactttaaag 3480 tcaaaattgg tgtcggactt cagaaaggat tttcaattct ataaagttag ggagataaat 3540 aactaccacc atgcgcacga cgcttatctt aatgccgtcg tagggaccgc actcattaag 3600 aaatacccga agctagaaag tgagtttgtg tatggtgatt acaaagttta tgacgtccgt 3660 aagatgatcg cgaaaagcga acaggagata ggcaaggcta cagccaaata cttcttttat 3720 tctaacatta tgaatttctt taagacggaa atcactctgg caaacggaga gatacgcaaa 3780 cgacctttaa ttgaaaccaa tggggagaca ggtgaaatcg tatgggataa gggccgggac 3840 ttcgcgacgg tgagaaaagt tttgtccatg ccccaagtca acatagtaaa gaaaactgag 3900 gtgcagaccg gagggttttc aaaggaatcg attcttccaa aaaggaatag tgataagctc 3960 atcgctcgta aaaaggactg ggacccgaaa aagtacggtg gcttcgatag ccctacagtt 4020 gcctattctg tcctagtagt ggcaaaagtt gagaagggaa aatccaagaa actgaagtca 4080 gtcaaagaat tattggggat aacgattatg gagcgctcgt cttttgaaaa gaaccccatc 4140 gacttccttg aggcgaaagg ttacaaggaa gtaaaaaagg atctcataat taaactacca 4200 aagtatagtc tgtttgagtt agaaaatggc cgaaaacgga tgttggctag cgccggagag 4260 cttcaaaagg ggaacgaact cgcactaccg tctaaatacg tgaatttcct gtatttagcg 4320 tcccattacg agaagttgaa aggttcacct gaagataacg aacagaagca actttttgtt 4380 gagcagcaca aacattatct cgacgaaatc atagagcaaa tttcggaatt cagtaagaga 4440 gtcatcctag ctgatgccaa tctggacaaa gtattaagcg catacaacaa gcacagggat 4500 aaacccatac gtgagcaggc ggaaaatatt atccatttgt ttactcttac caacctcggc 4560 gctccagccg cattcaagta ttttgacaca acgatagatc gcaaacgata cacttctacc 4620 aaggaggtgc tagacgcgac actgattcac caatccatca cgggattata tgaaactcgg 4680 atagatttgt cacagcttgg gggtgacgga tcccccaaga agaagaggaa agtctcgagc 4740 gactacaaag accatgacgg tgattataaa gatcatgaca tcgattacaa ggatgacgat 4800 gacaagtga 4809 <210> 26 <211> 1401 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic Nls-FokI-dCas9-nls polypeptide <400> 26 Met Asp Lys Lys Tyr Ser Ile Gly Leu Ala Ile Gly Thr Asn Ser Val 1 5 10 15 Gly Trp Ala Val Ile Thr Asp Glu Tyr Lys Val Pro Ser Lys Lys Phe 20 25 30 Lys Val Leu Gly Asn Thr Asp Arg His Ser Ile Lys Lys Asn Leu Ile 35 40 45 Gly Ala Leu Leu Phe Asp Ser Gly Glu Thr Ala Glu Ala Thr Arg Leu 50 55 60 Lys Arg Thr Ala Arg Arg Arg Tyr Thr Arg Arg Lys Asn Arg Ile Cys 65 70 75 80 Tyr Leu Gln Glu Ile Phe Ser Asn Glu Met Ala Lys Val Asp Asp Ser 85 90 95 Phe Phe His Arg Leu Glu Glu Ser Phe Leu Val Glu Glu Asp Lys Lys 100 105 110 His Glu Arg His Pro Ile Phe Gly Asn Ile Val Asp Glu Val Ala Tyr 115 120 125 His Glu Lys Tyr Pro Thr Ile Tyr His Leu Arg Lys Lys Leu Val Asp 130 135 140 Ser Thr Asp Lys Ala Asp Leu Arg Leu Ile Tyr Leu Ala Leu Ala His 145 150 155 160 Met Ile Lys Phe Arg Gly His Phe Leu Ile Glu Gly Asp Leu Asn Pro 165 170 175 Asp Asn Ser Asp Val Asp Lys Leu Phe Ile Gln Leu Val Gln Thr Tyr 180 185 190 Asn Gln Leu Phe Glu Glu Asn Pro Ile Asn Ala Ser Gly Val Asp Ala 195 200 205 Lys Ala Ile Leu Ser Ala Arg Leu Ser Lys Ser Arg Arg Leu Glu Asn 210 215 220 Leu Ile Ala Gln Leu Pro Gly Glu Lys Lys Asn Gly Leu Phe Gly Asn 225 230 235 240 Leu Ile Ala Leu Ser Leu Gly Leu Thr Pro Asn Phe Lys Ser Asn Phe 245 250 255 Asp Leu Ala Glu Asp Ala Lys Leu Gln Leu Ser Lys Asp Thr Tyr Asp 260 265 270 Asp Asp Leu Asp Asn Leu Leu Ala Gln Ile Gly Asp Gln Tyr Ala Asp 275 280 285 Leu Phe Leu Ala Ala Lys Asn Leu Ser Asp Ala Ile Leu Leu Ser Asp 290 295 300 Ile Leu Arg Val Asn Thr Glu Ile Thr Lys Ala Pro Leu Ser Ala Ser 305 310 315 320 Met Ile Lys Arg Tyr Asp Glu His His Gln Asp Leu Thr Leu Leu Lys 325 330 335 Ala Leu Val Arg Gln Gln Leu Pro Glu Lys Tyr Lys Glu Ile Phe Phe 340 345 350 Asp Gln Ser Lys Asn Gly Tyr Ala Gly Tyr Ile Asp Gly Gly Ala Ser 355 360 365 Gln Glu Glu Phe Tyr Lys Phe Ile Lys Pro Ile Leu Glu Lys Met Asp 370 375 380 Gly Thr Glu Glu Leu Leu Val Lys Leu Asn Arg Glu Asp Leu Leu Arg 385 390 395 400 Lys Gln Arg Thr Phe Asp Asn Gly Ser Ile Pro His Gln Ile His Leu 405 410 415 Gly Glu Leu His Ala Ile Leu Arg Arg Gln Glu Asp Phe Tyr Pro Phe 420 425 430 Leu Lys Asp Asn Arg Glu Lys Ile Glu Lys Ile Leu Thr Phe Arg Ile 435 440 445 Pro Tyr Tyr Val Gly Pro Leu Ala Arg Gly Asn Ser Arg Phe Ala Trp 450 455 460 Met Thr Arg Lys Ser Glu Glu Thr Ile Thr Pro Trp Asn Phe Glu Glu 465 470 475 480 Val Val Asp Lys Gly Ala Ser Ala Gln Ser Phe Ile Glu Arg Met Thr 485 490 495 Asn Phe Asp Lys Asn Leu Pro Asn Glu Lys Val Leu Pro Lys His Ser 500 505 510 Leu Leu Tyr Glu Tyr Phe Thr Val Tyr Asn Glu Leu Thr Lys Val Lys 515 520 525 Tyr Val Thr Glu Gly Met Arg Lys Pro Ala Phe Leu Ser Gly Glu Gln 530 535 540 Lys Lys Ala Ile Val Asp Leu Leu Phe Lys Thr Asn Arg Lys Val Thr 545 550 555 560 Val Lys Gln Leu Lys Glu Asp Tyr Phe Lys Lys Ile Glu Cys Phe Asp 565 570 575 Ser Val Glu Ile Ser Gly Val Glu Asp Arg Phe Asn Ala Ser Leu Gly 580 585 590 Thr Tyr His Asp Leu Leu Lys Ile Ile Lys Asp Lys Asp Phe Leu Asp 595 600 605 Asn Glu Glu Asn Glu Asp Ile Leu Glu Asp Ile Val Leu Thr Leu Thr 610 615 620 Leu Phe Glu Asp Arg Glu Met Ile Glu Glu Arg Leu Lys Thr Tyr Ala 625 630 635 640 His Leu Phe Asp Asp Lys Val Met Lys Gln Leu Lys Arg Arg Arg Tyr 645 650 655 Thr Gly Trp Gly Arg Leu Ser Arg Lys Leu Ile Asn Gly Ile Arg Asp 660 665 670 Lys Gln Ser Gly Lys Thr Ile Leu Asp Phe Leu Lys Ser Asp Gly Phe 675 680 685 Ala Asn Arg Asn Phe Met Gln Leu Ile His Asp Asp Ser Leu Thr Phe 690 695 700 Lys Glu Asp Ile Gln Lys Ala Gln Val Ser Gly Gln Gly Asp Ser Leu 705 710 715 720 His Glu His Ile Ala Asn Leu Ala Gly Ser Pro Ala Ile Lys Lys Gly 725 730 735 Ile Leu Gln Thr Val Lys Val Val Asp Glu Leu Val Lys Val Met Gly 740 745 750 Arg His Lys Pro Glu Asn Ile Val Ile Glu Met Ala Arg Glu Asn Gln 755 760 765 Thr Thr Gln Lys Gly Gln Lys Asn Ser Arg Glu Arg Met Lys Arg Ile 770 775 780 Glu Glu Gly Ile Lys Glu Leu Gly Ser Gln Ile Leu Lys Glu His Pro 785 790 795 800 Val Glu Asn Thr Gln Leu Gln Asn Glu Lys Leu Tyr Leu Tyr Tyr Leu 805 810 815 Gln Asn Gly Arg Asp Met Tyr Val Asp Gln Glu Leu Asp Ile Asn Arg 820 825 830 Leu Ser Asp Tyr Asp Val Asp Ala Ile Val Pro Gln Ser Phe Leu Lys 835 840 845 Asp Asp Ser Ile Asp Asn Lys Val Leu Thr Arg Ser Asp Lys Asn Arg 850 855 860 Gly Lys Ser Asp Asn Val Pro Ser Glu Glu Val Val Lys Lys Met Lys 865 870 875 880 Asn Tyr Trp Arg Gln Leu Leu Asn Ala Lys Leu Ile Thr Gln Arg Lys 885 890 895 Phe Asp Asn Leu Thr Lys Ala Glu Arg Gly Gly Leu Ser Glu Leu Asp 900 905 910 Lys Ala Gly Phe Ile Lys Arg Gln Leu Val Glu Thr Arg Gln Ile Thr 915 920 925 Lys His Val Ala Gln Ile Leu Asp Ser Arg Met Asn Thr Lys Tyr Asp 930 935 940 Glu Asn Asp Lys Leu Ile Arg Glu Val Lys Val Ile Thr Leu Lys Ser 945 950 955 960 Lys Leu Val Ser Asp Phe Arg Lys Asp Phe Gln Phe Tyr Lys Val Arg 965 970 975 Glu Ile Asn Asn Tyr His His Ala His Asp Ala Tyr Leu Asn Ala Val 980 985 990 Val Gly Thr Ala Leu Ile Lys Lys Tyr Pro Lys Leu Glu Ser Glu Phe 995 1000 1005 Val Tyr Gly Asp Tyr Lys Val Tyr Asp Val Arg Lys Met Ile Ala 1010 1015 1020 Lys Ser Glu Gln Glu Ile Gly Lys Ala Thr Ala Lys Tyr Phe Phe 1025 1030 1035 Tyr Ser Asn Ile Met Asn Phe Phe Lys Thr Glu Ile Thr Leu Ala 1040 1045 1050 Asn Gly Glu Ile Arg Lys Arg Pro Leu Ile Glu Thr Asn Gly Glu 1055 1060 1065 Thr Gly Glu Ile Val Trp Asp Lys Gly Arg Asp Phe Ala Thr Val 1070 1075 1080 Arg Lys Val Leu Ser Met Pro Gln Val Asn Ile Val Lys Lys Thr 1085 1090 1095 Glu Val Gln Thr Gly Gly Phe Ser Lys Glu Ser Ile Leu Pro Lys 1100 1105 1110 Arg Asn Ser Asp Lys Leu Ile Ala Arg Lys Lys Asp Trp Asp Pro 1115 1120 1125 Lys Lys Tyr Gly Gly Phe Asp Ser Pro Thr Val Ala Tyr Ser Val 1130 1135 1140 Leu Val Val Ala Lys Val Glu Lys Gly Lys Ser Lys Lys Leu Lys 1145 1150 1155 Ser Val Lys Glu Leu Leu Gly Ile Thr Ile Met Glu Arg Ser Ser 1160 1165 1170 Phe Glu Lys Asn Pro Ile Asp Phe Leu Glu Ala Lys Gly Tyr Lys 1175 1180 1185 Glu Val Lys Lys Asp Leu Ile Ile Lys Leu Pro Lys Tyr Ser Leu 1190 1195 1200 Phe Glu Leu Glu Asn Gly Arg Lys Arg Met Leu Ala Ser Ala Gly 1205 1210 1215 Glu Leu Gln Lys Gly Asn Glu Leu Ala Leu Pro Ser Lys Tyr Val 1220 1225 1230 Asn Phe Leu Tyr Leu Ala Ser His Tyr Glu Lys Leu Lys Gly Ser 1235 1240 1245 Pro Glu Asp Asn Glu Gln Lys Gln Leu Phe Val Glu Gln His Lys 1250 1255 1260 His Tyr Leu Asp Glu Ile Ile Glu Gln Ile Ser Glu Phe Ser Lys 1265 1270 1275 Arg Val Ile Leu Ala Asp Ala Asn Leu Asp Lys Val Leu Ser Ala 1280 1285 1290 Tyr Asn Lys His Arg Asp Lys Pro Ile Arg Glu Gln Ala Glu Asn 1295 1300 1305 Ile Ile His Leu Phe Thr Leu Thr Asn Leu Gly Ala Pro Ala Ala 1310 1315 1320 Phe Lys Tyr Phe Asp Thr Thr Ile Asp Arg Lys Arg Tyr Thr Ser 1325 1330 1335 Thr Lys Glu Val Leu Asp Ala Thr Leu Ile His Gln Ser Ile Thr 1340 1345 1350 Gly Leu Tyr Glu Thr Arg Ile Asp Leu Ser Gln Leu Gly Gly Asp 1355 1360 1365 Gly Ser Pro Lys Lys Lys Arg Lys Val Ser Ser Asp Tyr Lys Asp 1370 1375 1380 His Asp Gly Asp Tyr Lys Asp His Asp Ile Asp Tyr Lys Asp Asp 1385 1390 1395 Asp Asp Lys 1400 <210> 27 <211> 4836 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic Nls-FokI-dCas9-nls polynucleotide <400> 27 atgcctaaga agaagcggaa ggtgagcagc caacttgtga agtctgaact cgaggagaaa 60 aaatcagagt tgagacacaa gttgaagtac gtgccacacg aatacatcga gcttatcgag 120 atcgccagaa acagtaccca ggataggatc cttgagatga aagtcatgga gttctttatg 180 aaggtctacg gttatagagg aaagcacctt ggcggtagca gaaagcccga tggcgccatc 240 tatactgtcg gatctcctat cgattatggg gtgatcgtgg ataccaaagc ttactcaggc 300 gggtacaact tgcccatagg acaagccgac gagatgcagc ggtatgtcga agagaaccag 360 acgcgcaaca agcacatcaa ccccaatgaa tggtggaaag tgtacccaag tagtgtgact 420 gagttcaagt tcctgtttgt ctccggccac tttaagggca attataaagc tcagctcact 480 agactcaatc acatcacaaa ctgcaacgga gctgtgttgt cagtggagga gctcctgatt 540 ggaggcgaga tgatcaaagc cggcaccctt acactggagg aggtgcggcg gaagttcaac 600 aatggagaga tcaacttcgg tggcggtgga tccgataaaa agtattctat tggtttagcc 660 atcggcacta attccgttgg atgggctgtc ataaccgatg aatacaaagt accttcaaag 720 aaatttaagg tgttggggaa cacagaccgt cattcgatta aaaagaatct tatcggtgcc 780 ctcctattcg atagtggcga aacggcagag gcgactcgcc tgaaacgaac cgctcggaga 840 aggtatacac gtcgcaagaa ccgaatatgt tacttacaag aaatttttag caatgagatg 900 gccaaagttg acgattcttt ctttcaccgt ttggaagagt ccttccttgt cgaagaggac 960 aagaaacatg aacggcaccc catctttgga aacatagtag atgaggtggc atatcatgaa 1020 aagtacccaa cgatttatca cctcagaaaa aagctagttg actcaactga taaagcggac 1080 ctgaggttaa tctacttggc tcttgcccat atgataaagt tccgtgggca ctttctcatt 1140 gagggtgatc taaatccgga caactcggat gtcgacaaac tgttcatcca gttagtacaa 1200 acctataatc agttgtttga agagaaccct ataaatgcaa gtggcgtgga tgcgaaggct 1260 attcttagcg cccgcctctc taaatcccga cggctagaaa acctgatcgc acaattaccc 1320 ggagagaaga aaaatgggtt gttcggtaac cttatagcgc tctcactagg cctgacacca 1380 aattttaagt cgaacttcga cttagctgaa gatgccaaat tgcagcttag taaggacacg 1440 tacgatgacg atctcgacaa tctactggca caaattggag atcagtatgc ggacttattt 1500 ttggctgcca aaaaccttag cgatgcaatc ctcctatctg acatactgag agttaatact 1560 gagattacca aggcgccgtt atccgcttca atgatcaaaa ggtacgatga acatcaccaa 1620 gacttgacac ttctcaaggc cctagtccgt cagcaactgc ctgagaaata taaggaaata 1680 ttctttgatc agtcgaaaaa cgggtacgca ggttatattg acggcggagc gagtcaagag 1740 gaattctaca agtttatcaa acccatatta gagaagatgg atgggacgga agagttgctt 1800 gtaaaactca atcgcgaaga tctactgcga aagcagcgga ctttcgacaa cggtagcatt 1860 ccacatcaaa tccacttagg cgaattgcat gctatactta gaaggcagga ggatttttat 1920 ccgttcctca aagacaatcg tgaaaagatt gagaaaatcc taacctttcg cataccttac 1980 tatgtgggac ccctggcccg agggaactct cggttcgcat ggatgacaag aaagtccgaa 2040 gaaacgatta ctccatggaa ttttgaggaa gttgtcgata aaggtgcgtc agctcaatcg 2100 ttcatcgaga ggatgaccaa ctttgacaag aatttaccga acgaaaaagt attgcctaag 2160 cacagtttac tttacgagta tttcacagtg tacaatgaac tcacgaaagt taagtatgtc 2220 actgagggca tgcgtaaacc cgcctttcta agcggagaac agaagaaagc aatagtagat 2280 ctgttattca agaccaaccg caaagtgaca gttaagcaat tgaaagagga ctactttaag 2340 aaaattgaat gcttcgattc tgtcgagatc tccggggtag aagatcgatt taatgcgtca 2400 cttggtacgt atcatgacct cctaaagata attaaagata aggacttcct ggataacgaa 2460 gagaatgaag atatcttaga agatatagtg ttgactctta ccctctttga agatcgggaa 2520 atgattgagg aaagactaaa aacatacgct cacctgttcg acgataaggt tatgaaacag 2580 ttaaagaggc gtcgctatac gggctgggga cgattgtcgc ggaaacttat caacgggata 2640 agagacaagc aaagtggtaa aactattctc gattttctaa agagcgacgg cttcgccaat 2700 aggaacttta tgcagctgat ccatgatgac tctttaacct tcaaagagga tatacaaaag 2760 gcacaggttt ccggacaagg ggactcattg cacgaacata ttgcgaatct tgctggttcg 2820 ccagccatca aaaagggcat actccagaca gtcaaagtag tggatgagct agttaaggtc 2880 atgggacgtc acaaaccgga aaacattgta atcgagatgg cacgcgaaaa tcaaacgact 2940 cagaaggggc aaaaaaacag tcgagagcgg atgaagagaa tagaagaggg tattaaagaa 3000 ctgggcagcc agatcttaaa ggagcatcct gtggaaaata cccaattgca gaacgagaaa 3060 ctttacctct attacctaca aaatggaagg gacatgtatg ttgatcagga actggacata 3120 aaccgtttat ctgattacga cgtcgatgcc attgtacccc aatccttttt gaaggacgat 3180 tcaatcgaca ataaagtgct tacacgctcg gataagaacc gagggaaaag tgacaatgtt 3240 ccaagcgagg aagtcgtaaa gaaaatgaag aactattggc ggcagctcct aaatgcgaaa 3300 ctgataacgc aaagaaagtt cgataactta actaaagctg agaggggtgg cttgtctgaa 3360 cttgacaagg ccggatttat taaacgtcag ctcgtggaaa cccgccaaat cacaaagcat 3420 gttgcacaga tactagattc ccgaatgaat acgaaatacg acgagaacga taagctgatt 3480 cgggaagtca aagtaatcac tttaaagtca aaattggtgt cggacttcag aaaggatttt 3540 caattctata aagttaggga gataaataac taccaccatg cgcacgacgc ttatcttaat 3600 gccgtcgtag ggaccgcact cattaagaaa tacccgaagc tagaaagtga gtttgtgtat 3660 ggtgattaca aagtttatga cgtccgtaag atgatcgcga aaagcgaaca ggagataggc 3720 aaggctacag ccaaatactt cttttattct aacattatga atttctttaa gacggaaatc 3780 actctggcaa acggagagat acgcaaacga cctttaattg aaaccaatgg ggagacaggt 3840 gaaatcgtat gggataaggg ccgggacttc gcgacggtga gaaaagtttt gtccatgccc 3900 caagtcaaca tagtaaagaa aactgaggtg cagaccggag ggttttcaaa ggaatcgatt 3960 cttccaaaaa ggaatagtga taagctcatc gctcgtaaaa aggactggga cccgaaaaag 4020 tacggtggct tcgatagccc tacagttgcc tattctgtcc tagtagtggc aaaagttgag 4080 aagggaaaat ccaagaaact gaagtcagtc aaagaattat tggggataac gattatggag 4140 cgctcgtctt ttgaaaagaa ccccatcgac ttccttgagg cgaaaggtta caaggaagta 4200 aaaaaggatc tcataattaa actaccaaag tatagtctgt ttgagttaga aaatggccga 4260 aaacggatgt tggctagcgc cggagagctt caaaagggga acgaactcgc actaccgtct 4320 aaatacgtga atttcctgta tttagcgtcc cattacgaga agttgaaagg ttcacctgaa 4380 gataacgaac agaagcaact ttttgttgag cagcacaaac attatctcga cgaaatcata 4440 gagcaaattt cggaattcag taagagagtc atcctagctg atgccaatct ggacaaagta 4500 ttaagcgcat acaacaagca cagggataaa cccatacgtg agcaggcgga aaatattatc 4560 catttgttta ctcttaccaa cctcggcgct ccagccgcat tcaagtattt tgacacaacg 4620 atagatcgca aacgatacac ttctaccaag gaggtgctag acgcgacact gattcaccaa 4680 tccatcacgg gattatatga aactcggata gatttgtcac agcttggggg tgacggatcc 4740 cccaagaaga agaggaaagt ctcgagcgac tacaaagacc atgacggtga ttataaagat 4800 catgacatcg attacaagga tgacgatgac aagtga 4836 <210> 28 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 28 gagctggacg gcgacgtaaa cgg 23 <210> 29 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 29 cgccggacac gctgaacttg tgg 23 <210> 30 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 30 ccggcaagct gcccgtgccc tgg 23 <210> 31 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 31 ggtcagggtg gtcacgaggg tgg 23 <210> 32 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 32 cgaggagctg ttcaccgggg tgg 23 <210> 33 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 33 ccgtccagct cgaccaggat ggg 23 <210> 34 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 34 cgaggagctg ttcaccgggg tgg 23 <210> 35 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 35 gccgtccagc tcgaccagga tgg 23 <210> 36 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 36 ccggcaagct gcccgtgccc tgg 23 <210> 37 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 37 gtaggtcagg gtggtcacga ggg 23 <210> 38 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 38 gggcgaggag ctgttcaccg ggg 23 <210> 39 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 39 ccgtccagct cgaccaggat ggg 23 <210> 40 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 40 agggcgagga gctgttcacc ggg 23 <210> 41 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 41 ccgtccagct cgaccaggat ggg 23 <210> 42 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 42 aagggcgagg agctgttcac cgg 23 <210> 43 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 43 ccgtccagct cgaccaggat ggg 23 <210> 44 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 44 aagggcgagg agctgttcac cgg 23 <210> 45 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 45 gccgtccagc tcgaccagga tgg 23 <210> 46 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 46 cagcgtgtcc ggcgagggcg agg 23 <210> 47 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 47 cttcagggtc agcttgccgt agg 23 <210> 48 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 48 gggcgaggag ctgttcaccg ggg 23 <210> 49 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 49 cgtcgccgtc cagctcgacc agg 23 <210> 50 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 50 agggcgagga gctgttcacc ggg 23 <210> 51 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 51 cgtcgccgtc cagctcgacc agg 23 <210> 52 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 52 aagggcgagg agctgttcac cgg 23 <210> 53 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 53 cgtcgccgtc cagctcgacc agg 23 <210> 54 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 54 ctgaagttca tctgcaccac cgg 23 <210> 55 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 55 gtggtcacga gggtgggcca ggg 23 <210> 56 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 56 aagttcagcg tgtccggcga ggg 23 <210> 57 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 57 cttcagggtc agcttgccgt agg 23 <210> 58 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 58 caagttcagc gtgtccggcg agg 23 <210> 59 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 59 cttcagggtc agcttgccgt agg 23 <210> 60 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 60 ggtgcccatc ctggtcgagc tgg 23 <210> 61 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 61 cgccggacac gctgaacttg tgg 23 <210> 62 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 62 gagctggacg gcgacgtaaa cgg 23 <210> 63 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 63 ggcatcgccc tcgccctcgc cgg 23 <210> 64 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 64 ggagcgcacc atcttcttca agg 23 <210> 65 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 65 ctcgaacttc acctcggcgc ggg 23 <210> 66 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 66 ctgaagttca tctgcaccac cgg 23 <210> 67 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 67 gtcagggtgg tcacgagggt ggg 23 <210> 68 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 68 ggccacaagt tcagcgtgtc cgg 23 <210> 69 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 69 cttcagggtc agcttgccgt agg 23 <210> 70 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 70 ctcgtgacca ccctgaccta cgg 23 <210> 71 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 71 cgtgctgctt catgtggtcg ggg 23 <210> 72 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 72 ccggcaagct gcccgtgccc tgg 23 <210> 73 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 73 gctgaagcac tgcacgccgt agg 23 <210> 74 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 74 agcgtgtccg gcgagggcga ggg 23 <210> 75 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 75 ggtggtgcag atgaacttca ggg 23 <210> 76 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 76 cagcgtgtcc ggcgagggcg agg 23 <210> 77 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 77 ggtggtgcag atgaacttca ggg 23 <210> 78 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 78 caccggggtg gtgcccatcc tgg 23 <210> 79 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 79 cgccggacac gctgaacttg tgg 23 <210> 80 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 80 ggcgagggcg atgccaccta cgg 23 <210> 81 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 81 gggcacgggc agcttgccgg tgg 23 <210> 82 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 82 ctcgtgacca ccctgaccta cgg 23 <210> 83 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 83 agaagtcgtg ctgcttcatg tgg 23 <210> 84 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 84 caactacaag acccgcgccg agg 23 <210> 85 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 85 cgatgccctt cagctcgatg cgg 23 <210> 86 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 86 cccatcctgg tcgagctgga cgg 23 <210> 87 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 87 ggcatcgccc tcgccctcgc cgg 23 <210> 88 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 88 caagttcagc gtgtccggcg agg 23 <210> 89 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 89 ggtggtgcag atgaacttca ggg 23 <210> 90 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 90 gagctggacg gcgacgtaaa cgg 23 <210> 91 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 91 gaccaggatg ggcaccaccc cgg 23 <210> 92 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 92 accatcttct tcaaggacga cgg 23 <210> 93 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 93 cgctcctgga cgtagccttc ggg 23 <210> 94 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 94 ggcgagggcg atgccaccta cgg 23 <210> 95 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 95 cgccggacac gctgaacttg tgg 23 <210> 96 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 96 ttcaagtccg ccatgcccga agg 23 <210> 97 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 97 gtcgtgctgc ttcatgtggt cgg 23 <210> 98 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 98 ttcaagtccg ccatgcccga agg 23 <210> 99 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 99 tcgtgctgct tcatgtggtc ggg 23 <210> 100 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 100 ggccacaagt tcagcgtgtc cgg 23 <210> 101 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 101 cgtcgccgtc cagctcgacc agg 23 <210> 102 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 102 ctcgtgacca ccctgaccta cgg 23 <210> 103 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 103 ccagggcacg ggcagcttgc cgg 23 <210> 104 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 104 cagccacaac gtctatatca tgg 23 <210> 105 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 105 tgtactccag cttgtgcccc agg 23 <210> 106 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 106 ggccacaagt tcagcgtgtc cgg 23 <210> 107 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 107 gccgtccagc tcgaccagga tgg 23 <210> 108 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 108 ggccacaagt tcagcgtgtc cgg 23 <210> 109 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 109 ccgtccagct cgaccaggat ggg 23 <210> 110 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 110 aagttcagcg tgtccggcga ggg 23 <210> 111 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 111 cgtcgccgtc cagctcgacc agg 23 <210> 112 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 112 cgcgccgagg tgaagttcga ggg 23 <210> 113 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 113 gccgtcgtcc ttgaagaaga tgg 23 <210> 114 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 114 ccggcaagct gcccgtgccc tgg 23 <210> 115 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 115 cttcagggtc agcttgccgt agg 23 <210> 116 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 116 caagttcagc gtgtccggcg agg 23 <210> 117 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 117 gccgtccagc tcgaccagga tgg 23 <210> 118 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 118 caagttcagc gtgtccggcg agg 23 <210> 119 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 119 ccgtccagct cgaccaggat ggg 23 <210> 120 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 120 aagttcagcg tgtccggcga ggg 23 <210> 121 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 121 ccgtccagct cgaccaggat ggg 23 <210> 122 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 122 agcgtgtccg gcgagggcga ggg 23 <210> 123 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 123 cgtcgccgtc cagctcgacc agg 23 <210> 124 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 124 ctgaagttca tctgcaccac cgg 23 <210> 125 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 125 ggcatcgccc tcgccctcgc cgg 23 <210> 126 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 126 cagcgtgtcc ggcgagggcg agg 23 <210> 127 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 127 gccgtccagc tcgaccagga tgg 23 <210> 128 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 128 ggccacaagt tcagcgtgtc cgg 23 <210> 129 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 129 gaccaggatg ggcaccaccc cgg 23 <210> 130 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 130 agcgtgtccg gcgagggcga ggg 23 <210> 131 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 131 ccgtccagct cgaccaggat ggg 23 <210> 132 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 132 caactacaag acccgcgccg agg 23 <210> 133 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 133 gcgctcctgg acgtagcctt cgg 23 <210> 134 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 134 caactacaag acccgcgccg agg 23 <210> 135 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 135 cgctcctgga cgtagccttc ggg 23 <210> 136 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 136 gctgaagggc atcgacttca agg 23 <210> 137 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 137 cctcgaactt cacctcggcg cgg 23 <210> 138 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 138 caagttcagc gtgtccggcg agg 23 <210> 139 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 139 gaccaggatg ggcaccaccc cgg 23 <210> 140 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 140 aagttcagcg tgtccggcga ggg 23 <210> 141 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 141 gaccaggatg ggcaccaccc cgg 23 <210> 142 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 142 gaagggcatc gacttcaagg agg 23 <210> 143 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 143 cctcgaactt cacctcggcg cgg 23 <210> 144 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 144 caactacaag acccgcgccg agg 23 <210> 145 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 145 ctggacgtag ccttcgggca tgg 23 <210> 146 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 146 ggagcgcacc atcttcttca agg 23 <210> 147 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 147 agaagtcgtg ctgcttcatg tgg 23 <210> 148 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 148 caagttcagc gtgtccggcg agg 23 <210> 149 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 149 cgtcgccgtc cagctcgacc agg 23 <210> 150 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 150 catgcccgaa ggctacgtcc agg 23 <210> 151 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 151 agaagtcgtg ctgcttcatg tgg 23 <210> 152 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 152 caactacaag acccgcgccg agg 23 <210> 153 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 153 tgaagaagat ggtgcgctcc tgg 23 <210> 154 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 154 ggtgaaccgc atcgagctga agg 23 <210> 155 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 155 cctcgaactt cacctcggcg cgg 23 <210> 156 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 156 ttcaagtccg ccatgcccga agg 23 <210> 157 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 157 gcttcatgtg gtcggggtag cgg 23 <210> 158 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 158 ccgcgccgag gtgaagttcg agg 23 <210> 159 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 159 gccgtcgtcc ttgaagaaga tgg 23 <210> 160 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 160 ggtgaaccgc atcgagctga agg 23 <210> 161 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 161 ctcgaacttc acctcggcgc ggg 23 <210> 162 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 162 gtgaaccgca tcgagctgaa ggg 23 <210> 163 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 163 cctcgaactt cacctcggcg cgg 23 <210> 164 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 164 caagatccgc cacaacatcg agg 23 <210> 165 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 165 gatgccgttc ttctgcttgt cgg 23 <210> 166 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 166 gtgaaccgca tcgagctgaa ggg 23 <210> 167 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 167 ctcgaacttc acctcggcgc ggg 23 <210> 168 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 168 caaggaggac ggcaacatcc tgg 23 <210> 169 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 169 tcagctcgat gcggttcacc agg 23 <210> 170 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 170 catgcccgaa ggctacgtcc agg 23 <210> 171 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 171 gtcgtgctgc ttcatgtggt cgg 23 <210> 172 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 172 caaggaggac ggcaacatcc tgg 23 <210> 173 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 173 cagctcgatg cggttcacca ggg 23 <210> 174 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 174 aaggaggacg gcaacatcct ggg 23 <210> 175 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 175 tcagctcgat gcggttcacc agg 23 <210> 176 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 176 aagttcagcg tgtccggcga ggg 23 <210> 177 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 177 gccgtccagc tcgaccagga tgg 23 <210> 178 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 178 catgcccgaa ggctacgtcc agg 23 <210> 179 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 179 tcgtgctgct tcatgtggtc ggg 23 <210> 180 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 180 aaggaggacg gcaacatcct ggg 23 <210> 181 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 181 cagctcgatg cggttcacca ggg 23 <210> 182 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 182 aggaggacgg caacatcctg ggg 23 <210> 183 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 183 tcagctcgat gcggttcacc agg 23 <210> 184 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 184 atccgccaca acatcgagga cgg 23 <210> 185 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 185 gatgccgttc ttctgcttgt cgg 23 <210> 186 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 186 cagcgtgtcc ggcgagggcg agg 23 <210> 187 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 187 cgtcgccgtc cagctcgacc agg 23 <210> 188 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 188 ccggcaagct gcccgtgccc tgg 23 <210> 189 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 189 cagggtcagc ttgccgtagg tgg 23 <210> 190 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 190 catgcccgaa ggctacgtcc agg 23 <210> 191 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 191 cgtgctgctt catgtggtcg ggg 23 <210> 192 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 192 aggaggacgg caacatcctg ggg 23 <210> 193 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 193 cagctcgatg cggttcacca ggg 23 <210> 194 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 194 caacatcctg gggcacaagc tgg 23 <210> 195 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 195 cgatgccctt cagctcgatg cgg 23 <210> 196 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 196 gctgaagggc atcgacttca agg 23 <210> 197 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 197 gtcgccctcg aacttcacct cgg 23 <210> 198 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 198 ccagaagtac gagcgccgcc cgg 23 <210> 199 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 199 tggcaggtga gtgaggctgc agg 23 <210> 200 <211> 62 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic RFN target site oligonucleotide <400> 200 ccgggcggcg ctcgtacttc tggccactgg gcgagcgtct ggcaggtgag tgaggctgca 60 gg 62 <210> 201 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 201 gaatacccat ctgtcagctt cgg 23 <210> 202 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 202 ggcggaacct gagaggcgta agg 23 <210> 203 <211> 62 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic RFN target site oligonucleotide <400> 203 ccgaagctga cagatgggta ttctttgacg gggggtaggg gcggaacctg agaggcgtaa 60 gg 62 <210> 204 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 204 aatattcaag cagcaggcac agg 23 <210> 205 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 205 ctcgcgcagg aggctgcagc ggg 23 <210> 206 <211> 62 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic RFN target site oligonucleotide <400> 206 cctgtgcctg ctgcttgaat atttccgcct tttagggtgc tcgcgcagga ggctgcagcg 60 gg 62 <210> 207 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 207 cccaaagcct ggccagggag tgg 23 <210> 208 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 208 gccccacagg gcttgaagcc cgg 23 <210> 209 <211> 62 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic RFN target site oligonucleotide <400> 209 ccactccctg gccaggcttt ggggaggcct ggagtcatgg ccccacaggg cttgaagccc 60 gg 62 <210> 210 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 210 ccctacttcc gctttcacct tgg 23 <210> 211 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 211 ggaatccctt ctgcagcacc tgg 23 <210> 212 <211> 62 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic RFN target site oligonucleotide <400> 212 ccaaggtgaa agcggaagta gggccttcgc gcacctcatg gaatcccttc tgcagcacct 60 gg 62 <210> 213 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 213 cgctccagag ccgtgcgaat ggg 23 <210> 214 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 214 tggaggcaag agggcggctt tgg 23 <210> 215 <211> 62 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic RFN target site oligonucleotide <400> 215 cccattcgca cggctctgga gcggcggctg cacaaccagt ggaggcaaga gggcggcttt 60 gg 62 <210> 216 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 216 cgaggagact ggggactgta ggg 23 <210> 217 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 217 ccagctgctg ccttgcctcc agg 23 <210> 218 <211> 62 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic RFN target site oligonucleotide <400> 218 ccctacagtc cccagcctcc tcgtcccatg cctccgtctc cagctgctgc cttgcctcca 60 gg 62 <210> 219 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 219 catagctact gattggtggt ggg 23 <210> 220 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 220 ccggcccctc cccagtcagg ggg 23 <210> 221 <211> 62 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic RFN target site oligonucleotide <400> 221 cccaccacca atcagtagct atggcgagcc ctgctgtctc cggcccctcc ccagtcaggg 60 gg 62 <210> 222 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 222 ggaaacgtct agatgctcaa cgg 23 <210> 223 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 223 caaaatgtcg ttcgtggcag tgg 23 <210> 224 <211> 62 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic RFN target site oligonucleotide <400> 224 ccgttgagca tctagacgtt tccttggctc ttctggcgcc aaaatgtcgt tcgtggcagg 60 gg 62 <210> 225 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 225 ctgttgctgg ccatgccaag cgg 23 <210> 226 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 226 cctgggggcg ggcacctcaa tgg 23 <210> 227 <211> 62 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic RFN target site oligonucleotide <400> 227 ccgcttggca tggccagcaa cagcagctcc tgcccgacac ctgggggcgg gcacctcaat 60 gg 62 <210> 228 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 228 ttcggagcga aaaccaagac agg 23 <210> 229 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 229 gagtcccccg ccttcagaag agg 23 <210> 230 <211> 62 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic RFN target site oligonucleotide <400> 230 cctgtcttgg ttttcgctcc gaaggtaaaa gaaatcattg agtcccccgc cttcagaaga 60 gg 62 <210> 231 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 231 ggcccggtcg actccgggcc cgg 23 <210> 232 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 232 tgctgggaat cagcagtgtt tgg 23 <210> 233 <211> 62 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic RFN target site oligonucleotide <400> 233 ccgggcccgg agtcgaccgg gccgaggcgg aggcgggcct gctgggaatc agcagtgttt 60 gg 62 <210> 234 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 234 gggtgggggg agtttgctcc tgg 23 <210> 235 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 235 tccctcttta gccagagccg ggg 23 <210> 236 <211> 62 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic RFN target site oligonucleotide <400> 236 ccaggagcaa actcccccca ccccctttcc aaagcccatt ccctctttag ccagagccgg 60 gg 62 <210> 237 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 237 gccgccggcc ggggaggagg tgg 23 <210> 238 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 238 ggcgagccgc gggcaggggc cgg 23 <210> 239 <211> 62 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic RFN target site oligonucleotide <400> 239 ccacctcctc cccggccggc ggcggacagt ggacgcggcg gcgagccgcg ggcaggggcc 60 gg 62 <210> 240 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 240 ccgtctgcac accccggctc tgg 23 <210> 241 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 241 ctcggccacc acagggaagc tgg 23 <210> 242 <211> 62 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic RFN target site oligonucleotide <400> 242 ccagagccgg ggtgtgcaga cggcagtcac tagggggcgc tcggccacca cagggaagct 60 gg 62 <210> 243 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 243 ggctgtggga agccagcaac 20 <210> 244 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 244 aagccagggg ccaactggag 20 <210> 245 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 245 gcgcgggaat tacagataaa ttaaaa 26 <210> 246 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 246 aggtcccatc ctctcataca tacca 25 <210> 247 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 247 accgcccctt ggcaccac 18 <210> 248 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 248 cggagctcat ctgcttcctg t 21 <210> 249 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 249 ggagcagctg gtcagagggg 20 <210> 250 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 250 gggaaggggg acactgggga 20 <210> 251 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 251 gccctacatc tgctctccct cca 23 <210> 252 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 252 gggccgggaa agagttgctg 20 <210> 253 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 253 gccctacatc tgctctccct cca 23 <210> 254 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 254 gggccgggaa agagttgctg 20 <210> 255 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 255 ggggagggag gctccaggtt 20 <210> 256 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 256 ggcacaatgg ctcccaagca 20 <210> 257 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 257 ccttacccct cccctcactc a 21 <210> 258 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 258 agaagggcgg gccagacagt 20 <210> 259 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 259 atatccttct aggtagcggg cagtagcc 28 <210> 260 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 260 tctcggggga gagcggtaaa 20 <210> 261 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 261 cccaggaaaa gtgccagctc a 21 <210> 262 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 262 tgatggtcac cccaactgga 20 <210> 263 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 263 aaggcggcgc tggcttttt 19 <210> 264 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 264 ccagcacaac ttactcgcac ttga 24 <210> 265 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 265 gggatgcagg gacggtcaag 20 <210> 266 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 266 gccgccccat ccctagagaa a 21 <210> 267 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 267 tccagatggc acattgtcag 20 <210> 268 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 268 agggagcagg aaagtgaggt 20 <210> 269 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 269 agagaagtcg aggaagagag ag 22 <210> 270 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 270 cagcagaaag ttcatggttt cg 22 <210> 271 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 271 tccagatggc acattgtcag 20 <210> 272 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 272 agggagcagg aaagtgaggt 20 <210> 273 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 273 cgatggctcc caagaaacgc 20 <210> 274 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 274 gcaggtagaa tgcacagccg 20 <210> 275 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 275 gcccagagtc aaggaacacg 20 <210> 276 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 276 aggtagtgct tgagaccgcc 20 <210> 277 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 277 catccatcgg cgctttggtc 20 <210> 278 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 278 ccgggaaaga gttgctgcac 20 <210> 279 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 279 ctccccgtct gcagtccatc 20 <210> 280 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 280 cctgcaggga catgtggtga 20 <210> 281 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 281 tagggctaga ggggtgaggc 20 <210> 282 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 282 ccgaggtgaa acaagctgcc 20 <210> 283 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 283 atgagggctc cagatggcac 20 <210> 284 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 284 ttcacccagc ttccctgtgg 20 <210> 285 <211> 1752 <212> DNA <213> Planomicrobium okeanokoites <400> 285 atgtttttga gtatggtttc taaaataaga actttcggtt gggttcaaaa tccaggtaaa 60 tttgagaatt taaaacgagt agttcaagta tttgatagaa attctaaagt acataatgaa 120 gtgaaaaata taaagatacc aaccctagtc aaagaaagta agatccaaaa agaactagtt 180 gctattatga atcaacatga tttgatttat acatataaag agttagtagg aacaggaact 240 tcaatacgtt cagaagcacc atgcgatgca attattcaag caacaatagc agatcaagga 300 aataaaaaag gctatatcga taattggtca tctgacggtt ttttgcgttg ggcacatgct 360 ttaggattta ttgaatatat aaataaaagt gattcttttg taataactga tgttggactt 420 gcttactcta aatcagctga cggcagcgcc attgaaaaag agattttgat tgaagcgata 480 tcatcttatc ctccagcgat tcgtatttta actttgctag aagatggaca acatttgaca 540 aagtttgatc ttggcaagaa tttaggtttt agtggagaaa gtggatttac ttctctaccg 600 gaaggaattc ttttagatac tctagctaat gctatgccta aagataaagg cgaaattcgt 660 aataattggg aaggatcttc agataagtac gcaagaatga taggtggttg gctggataaa 720 ctaggattag taaagcaagg aaaaaaagaa tttatcattc ctactttggg taagccggac 780 aataaagagt ttatatccca cgcttttaaa attactggag aaggtttgaa agtactgcgt 840 cgagcaaaag gctctacaaa atttacacgt gtacctaaaa gagtatattg ggaaatgctt 900 gctacaaacc taaccgataa agagtatgta agaacaagaa gagctttgat tttagaaata 960 ttaatcaaag ctggatcatt aaaaatagaa caaatacaag acaacttgaa gaaattagga 1020 tttgatgaag ttatagaaac tattgaaaat gatatcaaag gcttaattaa cacaggtata 1080 tttatagaaa tcaaagggcg attttatcaa ttgaaagacc atattcttca atttgtaata 1140 cctaatcgtg gtgtgactaa gcaactagtc aaaagtgaac tggaggagaa gaaatctgaa 1200 cttcgtcata aattgaaata tgtgcctcat gaatatattg aattaattga aattgccaga 1260 aattccactc aggatagaat tcttgaaatg aaggtaatgg aattttttat gaaagtttat 1320 ggatatagag gtaaacattt gggtggatca aggaaaccgg acggagcaat ttatactgtc 1380 ggatctccta ttgattacgg tgtgatcgtg gatactaaag cttatagcgg aggttataat 1440 ctgccaattg gccaagcaga tgaaatgcaa cgatatgtcg aagaaaatca aacacgaaac 1500 aaacatatca accctaatga atggtggaaa gtctatccat cttctgtaac ggaatttaag 1560 tttttatttg tgagtggtca ctttaaagga aactacaaag ctcagcttac acgattaaat 1620 catatcacta attgtaatgg agctgttctt agtgtagaag agcttttaat tggtggagaa 1680 atgattaaag ccggcacatt aaccttagag gaagtgagac ggaaatttaa taacggcgag 1740 ataaactttt aa 1752 <210> 286 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic target binding site oligonucleotide <400> 286 ggtgagtgag tgtgtgcgtg tgg 23 <210> 287 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic target binding site oligonucleotide <400> 287 gggcgatgcc acctacgg 18 <210> 288 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic target binding site oligonucleotide <400> 288 gagggcgatg ccacctacgg 20 <210> 289 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic target binding site oligonucleotide <400> 289 gcgagggcga tgccacctac gg 22 <210> 290 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic target binding site oligonucleotide <400> 290 ggcgagggcg atgccaccta cgg 23 <210> 291 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic target binding site oligonucleotide <400> 291 gggcgagggc gatgccacct acgg 24 <210> 292 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic target binding site oligonucleotide <400> 292 gagggcgagg gcgatgccac ctacgg 26 <210> 293 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic target binding site oligonucleotide <400> 293 gcgcgggcga gggcgatgcc acctacgg 28 <210> 294 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic target binding site oligonucleotide <400> 294 gcacgggcag cttgccggtg g 21 <210> 295 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic target binding site oligonucleotide <400> 295 gggcacgggc agcttgccgg tgg 23 <210> 296 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic target binding site oligonucleotide <400> 296 gccgttcttc tgcttgtcgg 20 <210> 297 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic target binding site oligonucleotide <400> 297 gatgccgttc ttctgcttgt cgg 23 <210> 298 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic target binding site oligonucleotide <400> 298 gtgcagatga acttcaggg 19 <210> 299 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic target binding site oligonucleotide <400> 299 ggtgcagatg aacttcaggg 20 <210> 300 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic target binding site oligonucleotide <400> 300 ggtggtgcag atgaacttca ggg 23 <210> 301 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic target binding site oligonucleotide <400> 301 gaggagctgt tcaccgggg 19 <210> 302 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic target binding site oligonucleotide <400> 302 gcgaggagct gttcaccggg g 21 <210> 303 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic target binding site oligonucleotide <400> 303 gggcgaggag ctgttcaccg ggg 23 <210> 304 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic target binding site oligonucleotide <400> 304 gtggggggag tttgctcctg g 21 <210> 305 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic target binding site oligonucleotide <400> 305 gggtgggggg agtttgctcc tgg 23 <210> 306 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic target binding site oligonucleotide <400> 306 gagtgagtgt gtgcgtgtgg 20 <210> 307 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic target binding site oligonucleotide <400> 307 ggtgagtgag tgtgtgcgtg tgg 23 <210> 308 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic target binding site oligonucleotide <400> 308 gtccgagcag aagaagaagg g 21 <210> 309 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic target binding site oligonucleotide <400> 309 gagtccgagc agaagaagaa ggg 23 <210> 310 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic target binding site oligonucleotide <400> 310 gatgtagtgt ttccacaggg 20 <210> 311 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic target binding site oligonucleotide <400> 311 gcagatgtag tgtttccaca ggg 23 <210> 312 <211> 67 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 312 gaagctggag gaggaagggc ctgagtccga gcagaagaag aagggctccc atcacatcaa 60 ccggtgg 67 <210> 313 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 313 gaagctggag gagga 15 <210> 314 <211> 11 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 314 tcaaccggtg g 11 <210> 315 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 315 gaagctggag gaggaagg 18 <210> 316 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 316 gggctcccat cacatcaacc ggtgg 25 <210> 317 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 317 gaagctggag gaggaagggc ctga 24 <210> 318 <211> 14 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 318 gaagctggag gagg 14 <210> 319 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 319 gaagctggag gaggaagggc ccatcacatc aaccggtgg 39 <210> 320 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 320 gaagctggag gaggaagggc tcgcacacat caaccggtgg 40 <210> 321 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 321 gaagctggag gaggaagggc cttccatcac atcaaccggt gg 42 <210> 322 <211> 46 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 322 gaagctggag gaggaagggc ctgagtccca tcacatcaac cggtgg 46 <210> 323 <211> 52 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 323 gaagctggag gaggaagggc ctgagtccga gtcccatcac atcaaccggt gg 52 <210> 324 <211> 58 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 324 gaagctggag gaggaagggc ctgagtccga gcagaagtcc catcacatca accggtgg 58 <210> 325 <211> 59 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 325 gaagctggag gaggaagggc ctgagtcctg ccgtttgtag ccatcacatc aaccggtgg 59 <210> 326 <211> 61 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 326 gaagctggag gaggaagggc ctgagtccga gcagaagagc tcccatcaca tcaaccggtg 60 g 61 <210> 327 <211> 61 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 327 gaagctggag gaggaagggc ctgagtccga gcagaagaac tcccatcaca tcaaccggtg 60 g 61 <210> 328 <211> 64 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 328 gaagctggag gaggaagggc ctgagtccga gcagaagaag ggctcccatc acatcaaccg 60 gtgg 64 <210> 329 <211> 65 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 329 gaagctggag gaggaagggc ctgagtccga gcagaagaaa gggctcccat cacatcaacc 60 ggtgg 65 <210> 330 <211> 67 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 330 gaagctggag gaggaagggc ctgagtccga gcagaagaac agaagggctc ccatcacatc 60 aaccggt 67 <210> 331 <211> 67 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 331 gaagctggag gaggaagggc ctgagtccga gcagaagaag aagggctccc atcacatcaa 60 ccggtgg 67 <210> 332 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 332 gaagctggag gaggaagggc ctgagtccga g 31 <210> 333 <211> 11 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 333 gaagctggag g 11 <210> 334 <211> 11 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 334 gaagctggag g 11 <210> 335 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 335 gaagctggag gaggaagggc ctgagtgg 28 <210> 336 <211> 41 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 336 gaagctggag gaggaagggc tcccatcaca tcaaccggtg g 41 <210> 337 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 337 gaagctggag gaggaagggc ctgagtccat cacatcaacc ggtgg 45 <210> 338 <211> 46 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 338 gaagctggag gaggaagggc ctgagtccca tcacatcaac cggtgg 46 <210> 339 <211> 49 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 339 gaagctggag gaggaagggc ctgagtccga gcatcacatc aaccggtgg 49 <210> 340 <211> 53 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 340 gaagctggag gaggaagggc ctgagtccga gctcccatca catcaaccgg tgg 53 <210> 341 <211> 61 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 341 gaagctggag gaggaagggc ctgagtccga gcagaagggc tcccatcaca tcaaccggtg 60 g 61 <210> 342 <211> 64 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 342 gaagctggag gaggaagggc ctgagtccga gcagaagaag ggctcccatc acatcaaccg 60 gtgg 64 <210> 343 <211> 65 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 343 gaagctggag gaggaagggc ctgagtccga gcagaaagaa gggctcccat cacatcaacc 60 ggtgg 65 <210> 344 <211> 67 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 344 gaagctggag gaggaagggc ctgagtccga gcagaagaac agaagggctc ccatcacatc 60 aaccggt 67 <210> 345 <211> 187 <212> DNA <213> Aequorea victoria <400> 345 tcgtgaccac cctgacctac ggcgtgcagt gcttcagccg ctaccccgac cacatgaagc 60 agcacgactt cttcaagtcc gccatgcccg aaggctacgt ccaggagcgc accatcttct 120 tcaaggagac ggcaactaca agacccgcgc cgaggtgaag ttcgagggcg acaccctggt 180 gaaccgc 187 <210> 346 <211> 184 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 346 tcgtgaccac cctgacctac gtgcagtgct tcagccgcta ccccgaccac atgaagcagc 60 acgacttctt caagtccgcc atgcccgaag gctacgtcca ggagcgcacc atcttcttca 120 aggacgacgg caactacaag acccgcgcga ggtgaagttc gagggcgaca ccctggtgaa 180 ccgc 184 <210> 347 <211> 159 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 347 tcgtgaccac cctgacctca gccgctaccc cgaccacatg aagcagcacg acttcttcaa 60 gtccgccatg cccgaaggct acgtccagga gcgcaccatc ttcttcaagg acgacggcaa 120 ctacaagacc cgcgccgagg cgacaccctg gtgaaccgc 159 <210> 348 <211> 154 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 348 tcgtgaccac cctgacctac ggcgtgcagt gcttcagccg ctaccccgac cacatgaagc 60 agcacgactt cttcaagtcc gccatgcccg aaggctacgt ccaggagcgc accatcttct 120 tcaaggagac ggcaactaca ccctggtgaa ccgc 154 <210> 349 <211> 181 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 349 tcgtgaccac cctgaccgtg cagtgcttca gccgctaccc cgaccacatg aagcagcacg 60 acttcttcaa gtccgccatg cccgaaggct acgtccagga gcgcaccatc ttcttcaagg 120 acgacggcaa ctacaagacc cgcgcgaggg tcttgttcga gggcgacacc ctggtgaacc 180 g 181 <210> 350 <211> 53 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 350 tcgtgaccac cctgacctac gtgaagttcg agggcgacac cctggtgaac cgc 53 <210> 351 <211> 187 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 351 tcgtgaccac cctgacctac gcctcggcgc gggtcttgta gttgccgtcg tccttgaaga 60 agatggtgcg ctcctggacg tagccttcgg gcatggcgga cttgaagaag tcgtgctgct 120 tcatgtgtcg gggtagcggc tgaagcactg cacgctgaag ttcgagggcg acaccctggt 180 gaaccgc 187 <210> 352 <211> 146 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 352 tcggcgcggg tcttgtagtt gccgtcgtcc ttgaagaaga tggtgcgctc ctggacgtag 60 ccttcgggca tggcggactt gaagaagtcg tgctgcttca tgtggtcggg gtagcggctg 120 aagcactgca caccctggtg aaccgc 146 <210> 353 <211> 41 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 353 tcgtgaccac cctgttcgag ggcgacaccc tggtgaaccg c 41 <210> 354 <211> 92 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 354 caggagacga agagcccggg cggcgctcgt acttctggcc actgggcgag cgtctggcag 60 gtgagtgagg ctgcaggcat tgacgtctcc tc 92 <210> 355 <211> 92 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 355 caggagacga agagcccggg cggcgctcgt acttctggcc actggcgaag cgtctggcag 60 gtgagtgagg ctgcaggcat tgacgtctcc tc 92 <210> 356 <211> 80 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 356 caggagacga agagcccggg cggcgctcgt acttctggcc tctggcaggt gagtgaggct 60 gcaggcattg acgtctcctc 80 <210> 357 <211> 80 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 357 caggagacga agagcccggg cggcgctcgt acttctagcg tctggcaggt gagtgaggct 60 gcaggcattg acgtctcctc 80 <210> 358 <211> 76 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 358 caggagacga agagcccggg cggcgctcgt acttcgtctg gcaggtgagt gaggctgcag 60 gcattgacgt ctcctc 76 <210> 359 <211> 75 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 359 caggagacga agagcccggg cggcgctcgt acttctggcc actgtgagtg aggctgcagg 60 cattgacgtc tcctc 75 <210> 360 <211> 73 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 360 caggagacga agagcccggg cggcgctcgt acttctggca ggtgagtgag gctgcaggca 60 ttgacgtctc ctc 73 <210> 361 <211> 69 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 361 caggagacga agagcccggg cggcgctcgt ctggcaggtg agtgaggctg caggcattga 60 cgtctcctc 69 <210> 362 <211> 58 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 362 caggagacga agagcccgtc tggcaggtga gtgaggctgc aggcattgac gtctcctc 58 <210> 363 <211> 46 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 363 accggcggca gcaggtgagt gaggctgcag gcattgacgt ctcctc 46 <210> 364 <211> 92 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 364 tgggagagtg gatttccgaa gctgacagat gggtattctt tgaggggggg taggggcgga 60 acctgagagg cgtaaggcgt tgtgaaccct gg 92 <210> 365 <211> 86 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 365 tgggagagtg gatttccgaa gctgacagat gggtattctt tgagtagggg cggaacctga 60 gaggcgtaag gcgttgtgaa ccctgg 86 <210> 366 <211> 84 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 366 tgggagagtg gatttccgaa gctgacagat gggtatgggg ggtaggggcg gaacctgaga 60 ggcgtaaggc gttgtgaacc ctgg 84 <210> 367 <211> 84 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 367 tgggagagtg gatttccgaa gctgacagat gggtattctt ggtaggggcg gaacctgaga 60 ggcgtaaggc gttgtgaacc ctgg 84 <210> 368 <211> 82 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 368 tgggagagtg gatttccgaa gctgacagat gggtattctt tgagggggga acctgagagg 60 cgtaaggcgt tgtgaaccct gg 82 <210> 369 <211> 80 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 369 tgggagagtg gatttccgaa gctgacagat gggtattctt tgggcggaac ctgagaggcg 60 taaggcgttg tgaaccctgg 80 <210> 370 <211> 70 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 370 tgggagagtg gatttccgaa gctgacagat ggggcggaac ctgagaggcg taaggcgttg 60 tgaaccctgg 70 <210> 371 <211> 92 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 371 caagctggac tctggccact ccctggccag gctttgggga ggcctggagt catggcccca 60 cagggcttga agcccggggg gccgccattg ac 92 <210> 372 <211> 76 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 372 caagctggac tctggccact ccctggccag gctttatggc cccacagggc ttgaagcccg 60 gggggccgcc attgac 76 <210> 373 <211> 92 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 373 agagagtcgc cgtctccaag gtgaaagcgg aagtagggcc ttcgcgcacc tcatggaatc 60 ccttctgcag cacctggatc gcttttccga gc 92 <210> 374 <211> 84 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 374 agagagtcgc cgtctccaag gtgaaagcgg aagtagcgca cctcatggaa tcccttctgc 60 agcacctgga tcgcttttcc gagc 84 <210> 375 <211> 83 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 375 agagagtcgc cgtctccaag gtgaaagcgg aagtagggcc ctcatggaat cccttctgca 60 gcacctggat cgcttttccg agc 83 <210> 376 <211> 82 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 376 agagagtcgc cgtctccaag gtgaaagcgg aagtaggccc tcatggaatc ccttctgcag 60 cacctggatc gcttttccga gc 82 <210> 377 <211> 82 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 377 agagagtcgc cgtctccaag gtgaaagcgg aagtagggcc tcatggaatc ccttctgcag 60 cacctggatc gcttttccga gc 82 <210> 378 <211> 82 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 378 agagagtcgc cgtctccaag gtgaaagcgg aagtagcacc tcatggaatc ccttctgcag 60 cacctggatc gcttttccga gc 82 <210> 379 <211> 81 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 379 agagagtcgc cgtctccaag gtgaaagcgg aaacgcacct catggaatcc cttctgcagc 60 acctggatcg cttttccgag c 81 <210> 380 <211> 78 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 380 agagagtcgc cgtctccaag gtgaaagcgg aagtagggcc ttcgcgcatt ctgcagcacc 60 tggatcgctt ttccgagc 78 <210> 381 <211> 77 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 381 agagagtcgc cgtctccaag gtgaaagcgg aagcctcatg gaatcccttc tgcagcacct 60 ggatcgcttt tccgagc 77 <210> 382 <211> 61 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 382 agagagtcgc cgtctccaag catggaatcc cttctgcagc acctggatcg cttttccgag 60 c 61 <210> 383 <211> 92 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 383 tttggtcggc atggccccat tcgcacggct ctggagcggc ggctgcacaa ccagtggagg 60 caagagggcg gctttgggcg gggtccagtt cc 92 <210> 384 <211> 89 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 384 tttggtcggc atggccccat tcgcacggct ctggagcggc ggcgcaacca gtggaggcaa 60 gagggcggct ttgggcgggg tccagttcc 89 <210> 385 <211> 88 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 385 tttggtcggc atggccccat tcgcacggct ctggagcggc ggctaaccag tggaggcaag 60 agggcggctt tgggcggggt ccagttcc 88 <210> 386 <211> 84 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 386 tttggtcggc atggccccat tcgcacggct ctggagcggc ggccagtgga ggcaagaggg 60 cggctttggg cggggtccag ttcc 84 <210> 387 <211> 83 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 387 tttggtcggc atggccccat tcgcacggct ctggagcggc ggctgtggag gcaagagggc 60 ggctttgggc ggggtccagt tcc 83 <210> 388 <211> 81 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 388 tttggtcggc atggccccat tcgcacggct ctggagcggc ggctggaggc aagagggcgg 60 ctttgggcgg ggtccagttc c 81 <210> 389 <211> 80 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 389 tttggtcggc atggccccat tcgcacggct ctggagcggc gggagaggca agagggcggc 60 tttgggcggg gtccagttcc 80 <210> 390 <211> 79 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 390 tttggtcggc atggccccat tcgcacggct ctggagcggc ggcgaggcaa gagggcggct 60 ttgggcgggg tccagttcc 79 <210> 391 <211> 78 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 391 tttggtcggc atggccccat tcgcacggct ctggagcggc ggctggcaag agggcggctt 60 tgggcggggt ccagttcc 78 <210> 392 <211> 77 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 392 tttggtcggc atggccccat tcgcacggct ctggagcggc ggcggcaaga gggcggcttt 60 gggcggggtc cagttcc 77 <210> 393 <211> 74 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 393 tttggtcggc atggccccat tcgcacggct ctggagtgga ggcaagaggg cggctttggg 60 cggggtccag ttcc 74 <210> 394 <211> 69 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 394 tttggtcggc atggccccat tcgcacggct ctggaggcaa gagggcggct ttgggcgggg 60 tccagttcc 69 <210> 395 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 395 tttggtcggc atggccccgt cactgt 26 <210> 396 <211> 260 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 396 tttggtcggc atggccccat tcgcacggct ctggagcggc ggcacactat tgcaatgaaa 60 ataaatttcc tttattagct agaagtgaga tctgaagggg cttcatgatg tccccataat 120 ttttggcaga gggaaaaaga tctcagtggt atttgtgagc cagggcattg gccacaccag 180 ccaccacctt ttgataggca gcctgcacct gaggagtgcg agtggaggca agagggcggc 240 tttgggcggg gtccagttcc 260 <210> 397 <211> 92 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 397 gttcaactcg atgaccccac caccaatcag tagctatggc gagccctgct gtctccggcc 60 cctccccagt cagggggccc ccagtgtggg ga 92 <210> 398 <211> 85 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 398 gttcaactcg atgaccccac caccaatcag tagctatcct gctgtctccg gcccctcccc 60 agtcaggggg cccccagtgt gggga 85 <210> 399 <211> 79 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 399 gttcaactcg atgaccccac caccaatcag tagctatgtc tccggcccct ccccagtcag 60 ggggccccca gtgtgggga 79 <210> 400 <211> 75 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 400 gttcaactcg atgaccccac caccaatcag tagctatggc gagccccccc agtcaggggg 60 cccccagtgt gggga 75 <210> 401 <211> 74 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 401 gttcaactcg atgaccccac caccaacctg ctgtctccgg cccctcccca gtcagggggc 60 ccccagtgtg ggga 74 <210> 402 <211> 92 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 402 tggctgaagg cacttccgtt gagcatctag acgtttcctt ggctcttctg gcgccaaaat 60 gtcgttcgtg gcaggggtta ttcggcggct gg 92 <210> 403 <211> 83 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 403 tggctgaagg cacttccgtt gagcatctag acgtttcctt ggcgccaaaa tgtcgttcgt 60 ggcaggggtt attcggcggc tgg 83 <210> 404 <211> 76 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 404 tggctgaagg cacttccgtt gagcatctat tctggcgcca aaatgtcgtt cgtggcaggg 60 gttattcggc ggctgg 76 <210> 405 <211> 76 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 405 tggctgaagg cacttccgtt gagcatctag acgtttcctt ggatgtcgtt cgtggcaggg 60 gttattcggc ggctgg 76 <210> 406 <211> 68 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 406 tggctgaagg cacttccgtt gagcatctag acgtttgtcg ttcgtggcag gggttattcg 60 gcggctgg 68 <210> 407 <211> 92 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 407 cccttctgac tgtggccgct tggcatggcc agcaacagca gctcctgccc gacacctggg 60 ggcgggcacc tcaatgggta cccggtgcct cc 92 <210> 408 <211> 86 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 408 cccttctgac tgtggccgct tggcatggcc agcaacacct gcccgacacc tgggggcggg 60 cacctcaatg ggtacccggt gcctcc 86 <210> 409 <211> 85 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 409 cccttctgac tgtggccgct tggcatggcc agcaacactg cccgacacct gggggcgggc 60 acctcaatgg gtacccggtg cctcc 85 <210> 410 <211> 80 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 410 cccttctgac tgtggccgct tggcatggcc agcagcccga cacctggggg cgggcacctc 60 aatgggtacc cggtgcctcc 80 <210> 411 <211> 78 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 411 cccttctgac tgtggccgct tggcatggcc aggcccgaca cctgggggcg ggcacctcaa 60 tgggtacccg gtgcctcc 78 <210> 412 <211> 92 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 412 tcagaaatag ggggtccagg agcaaactcc ccccaccccc tttccaaagc ccattccctc 60 tttagccaga gccggggtgt gcagacggca gt 92 <210> 413 <211> 92 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 413 tcagaaatag ggggtccagg agcaaactcc ccccaccccc tttccaaaaa gcccattccc 60 tctttagcca gagccggggt gtgcagacgg ca 92 <210> 414 <211> 89 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 414 tcagaaatag ggggtccagg agcaaactcc ccccaccccc tttccgccca ttccctcttt 60 agccagagcc ggggtgtgca gacggcagt 89 <210> 415 <211> 87 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 415 tcagaaatag ggggtccagg agcaaactcc ccccaccccc ttagcccatt ccctctttag 60 ccagagccgg ggtgtgcaga cggcagt 87 <210> 416 <211> 87 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 416 tcagaaatag ggggtccagg agcaaactcc ccccaccccc aaagcccatt ccctctttag 60 ccagagccgg ggtgtgcaga cggcagt 87 <210> 417 <211> 86 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 417 tcagaaatag ggggtccagg agcaaactcc ccccacccca aagcccattc cctctttagc 60 cagagccggg gtgtgcagac ggcagt 86 <210> 418 <211> 85 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 418 tcagaaatag ggggtccagg agcaaactcc ccccaccccc tttccattcc ctctttagcc 60 agagccgggg tgtgcagacg gcagt 85 <210> 419 <211> 84 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 419 tcagaaatag ggggtccagg agcaaactcc ccccaccccc tttcattccc tctttagcca 60 gagccggggt gtgcagacgg cagt 84 <210> 420 <211> 83 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 420 tcagaaatag ggggtccagg agcaaactcc ccccacaaag cccattccct ctttagccag 60 agccggggtg tgcagacggc agt 83 <210> 421 <211> 78 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 421 tcagaaatag ggggtccagg agcaaactcc ccccacccat tccctcttta gccagagccg 60 gggtgtgcag acggcagt 78 <210> 422 <211> 75 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 422 tcagaaatag ggggtccagg agcaaaccaa agcccattcc ctctttagcc agagccgggg 60 tgtgcagacg gcagt 75 <210> 423 <211> 74 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 423 tcagaaatag ggggtccagg agcaaactcc ccccaccccc tctttagcca gagccggggt 60 gtgcagacgg cagt 74 <210> 424 <211> 72 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 424 tcagaaatag ggggtccagg agcaaactcc ccccaccccc tttagccaga gccggggtgt 60 gcagacggca gt 72 <210> 425 <211> 68 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 425 tcagaaatag ggggtccagg caaagcccat tccctcttta gccagagccg gggtgtgcag 60 acggcagt 68 <210> 426 <211> 57 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 426 tcagaaatag ggggtccagg agctctttag ccagagccgg ggtgtgcaga cggcagt 57 <210> 427 <211> 92 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 427 ccccagcccc agctaccacc tcctccccgg ccggcggcgg acagtggacg cggcggcgag 60 ccgcgggcag gggccggagc ccgcgcccgg ag 92 <210> 428 <211> 84 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 428 ccccagcccc agctaccacc tcctccccgg ccggcgtgga cgcggcggcg agccgcgggc 60 aggggccgga gcccgcgccc ggag 84 <210> 429 <211> 79 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 429 ccccagcccc agctaccacc tcctccccgg ccggacgcgg cggcgagccg cgggcagggg 60 ccggagcccg cgcccggag 79 <210> 430 <211> 79 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 430 ccccagcccc agctaccacc tcctccccgg ctggacgcgg cggcgagccg cgggcagggg 60 ccggagcccg cgcccggag 79 <210> 431 <211> 76 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 431 ccccagcccc agctaccacc tcctccccgg ccggcggcgg acagccgcgg gcaggggccg 60 gagcccgcgc ccggag 76 <210> 432 <211> 75 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 432 ccccagcccc agctaccacc tcctccccgg acgcggcggc gagccgcggg caggggccgg 60 agcccgcgcc cggag 75 <210> 433 <211> 49 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 433 ccccagcccc agctaccacc tcctccccgg ccggagcccg cgcccgaag 49 <210> 434 <211> 63 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 434 ccccagcccc agctaccacc tcctccccgg ccggcggcgg acagtggagg gggtcggggc 60 tcg 63 <210> 435 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 435 ccccagcccc agctaccacc tcctccccgg ccggag 36 <210> 436 <211> 55 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 436 ccccagcccc agctaccacc tcctccccgg ccggcggcgg ggtggagggg gtcgg 55 <210> 437 <211> 60 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 437 ccccagcccc agctaccacc tcctccccgg ccggcggcgg acacacacgc ggcgtcgcac 60 <210> 438 <211> 53 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 438 ccccagcccc agctaccacc tcctccccgg ccggcggcct gaaacttttc gtc 53 <210> 439 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 439 ccggagcgcg gcgtggaggg ggtcggggct 30 <210> 440 <211> 92 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 440 ccattccctc tttagccaga gccggggtgt gcagacggca gtcactaggg ggcgctcggc 60 caccacaggg aagctgggtg aatggagcga gc 92 <210> 441 <211> 89 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 441 ccattccctc tttagccaga gccggggtgt gcagacggca cttagggggc gctcggccac 60 cacagggaag ctgggtgaat ggagcgagc 89 <210> 442 <211> 88 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 442 ccattccctc tttagccaga gccggggtgt gcagacggca ctagggggcg ctcggccacc 60 acagggaagc tgggtgaatg gagcgagc 88 <210> 443 <211> 87 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 443 ccattccctc tttagccaga gccggggtgt gcagacggca gtcagggcgc tcggccacca 60 cagggaagct gggtgaatgg agcgagc 87 <210> 444 <211> 87 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 444 ccattccctc tttagccaga gccggggtgt gcagacggca tagggggcgc tcggccacca 60 cagggaagct gggtgaatgg agcgagc 87 <210> 445 <211> 84 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 445 ccattccctc tttagccaga gccggggtgt gcagacctag ggggcgctcg gccaccacag 60 ggaagctggg tgaatggagc gagc 84 <210> 446 <211> 83 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 446 ccattccctc tttagccaga gccggggtgt gcagacggca gggcgctcgg ccaccacagg 60 gaagctgggt gaatggagcg agc 83 <210> 447 <211> 83 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 447 ccattccctc tttagccaga gccggggtgt gcagactagg gggcgctcgg ccaccacagg 60 gaagctgggt gaatggagcg agc 83 <210> 448 <211> 82 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 448 ccattccctc tttagccaga gccggggtgt gcagctaggg ggcgctcggc caccacaggg 60 aagctgggtg aatggagcga gc 82 <210> 449 <211> 81 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 449 ccattccctc tttagccaga gccggggtgt gcagaagggg gcgctcggcc accacaggga 60 agctgggtga atggagcgag c 81 <210> 450 <211> 81 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 450 ccattccctc tttagccaga gccggggtgt gcactagggg gcgctcggcc accacaggga 60 agctgggtga atggagcgag c 81 <210> 451 <211> 79 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 451 ccattccctc tttagccaga gccggggtgt gcagacggca gttcggccac cacagggaag 60 ctgggtgaat ggagcgagc 79 <210> 452 <211> 78 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 452 ccattccctc tttagccaga gccggggtgt ctagggggcg ctcggccacc acagggaagc 60 tgggtgaatg gagcgagc 78 <210> 453 <211> 77 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 453 ccattccctc tttagccaga gccggggtgt gcaggggcgc tcggccacca cagggaagct 60 gggtgaatgg agcgagc 77 <210> 454 <211> 76 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 454 ccattccctc tttagccaga gccggggtgt gcagggcgct cggccaccac agggaagctg 60 ggtgaatgga gcgagc 76 <210> 455 <211> 76 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 455 ccattccctc tttagccaga gccggggtgt gcagacggca gtcactacac agggaagctg 60 ggtgaatgga gcgagc 76 <210> 456 <211> 76 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 456 ccattccctc tttagccaga gccggggtgt gcagacggct cggccaccac agggaagctg 60 ggtgaatgga gcgagc 76 <210> 457 <211> 75 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 457 ccattccctc tttagccaga gccggggtgt gcagacgctc ggccaccaca gggaagctgg 60 gtgaatggag cgagc 75 <210> 458 <211> 73 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 458 ccattccctc tttagccaga gccggggtgg gggcgctcgg ccaccacagg gaagctgggt 60 gaatggagcg agc 73 <210> 459 <211> 71 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 459 ccattccctc tttagccaga gccggggtgt gcgctcggcc accacaggga agctgggtga 60 atggagcgag c 71 <210> 460 <211> 71 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 460 ccattccctc tttagccaga gccggggtgt gcagacggca gtcacaggga agctgggtga 60 atggagcgag c 71 <210> 461 <211> 71 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 461 ccattccctc tttagccaga gccggggtgt gcagacggcc accacaggga agctgggtga 60 atggagcgag c 71 <210> 462 <211> 69 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 462 ccattccctc tttagccaga gccggggtgt gcagacggca gtcagggaag ctgggtgaat 60 ggagcgagc 69 <210> 463 <211> 68 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 463 ccattccctc tttagccaga gccggggtgt gcaggccacc acagggaagc tgggtgaatg 60 gagcgagc 68 <210> 464 <211> 68 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 464 ccattccctc tttagccaga gccggggtgt gcagaccacc acagggaagc tgggtgaatg 60 gagcgagc 68 <210> 465 <211> 65 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 465 ccattccctc tttagccaga gccggggtgt gcagaccaca gggaagctgg gtgaatggag 60 cgagc 65 <210> 466 <211> 58 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 466 ccattccctc ttagtgactg ctcggccacc acagggaagc tgggtgaatg gagcgagc 58

Claims (16)

  1. 촉매적으로 불활성인 CRISPR-관련 9(dCas9)의 아미노 말단에, 선택적으로 개재 링커(intervening linker)를 개재해서, 융합된 FokI 촉매적 도메인 서열을 포함하는, RNA-안내 FokI 뉴클레아제(RNA-guided FokI Nuclease: RFN) 융합 단백질.
  2. 제1항에 있어서, 2 내지 30개의 아미노산의 링커를 포함하는, 융합 단백질.
  3. 제2항에 있어서, 상기 링커는 Gly4Ser을 포함하는 것인, 융합 단백질.
  4. 제1항에 있어서, 상기 FokI 촉매적 도메인은 서열번호 4의 아미노산 388 내지 583 또는 408 내지 583을 포함하는 것인, 융합 단백질.
  5. 제1항에 있어서, 상기 dCas9는 D10, E762, H983 또는 D986; 및 H840 또는 N863에서의 돌연변이를 포함하는 것인, 융합 단백질.
  6. 제5항에 있어서, 상기 dCas9는
    (i) D10A 또는 D10N; 및
    (ii) H840A, H840Y 또는 H840N
    에서의 돌연변이를 포함하는 것인, 융합 단백질.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항의 융합 단백질을 암호화하는 핵산.
  8. 제7항의 핵산을 포함하는 벡터.
  9. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항의 융합 단백질을 발현시키는 숙주 세포.
  10. 세포 내 게놈 서열에서 서열-특이적 파손을 유도하는 방법으로서, 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항의 RNA-안내 FokI 뉴클레아제(RFN) 융합 단백질 및 바람직하게는 0 내지 31개의 뉴클레오타이드만큼 떨어진 2개의 표적 게놈 서열에 대해 RFN을 보내는 안내 RNA를, 상기 세포 내에서 발현시키거나 또는 상기 세포와 접촉시키는 단계를 포함하되, 바람직하게는 상기 2개의 표적 서열은 각각 3' 말단에서 PAM 서열을 갖는 것인, 세포 내 게놈 서열에서 서열-특이적 파손을 유도하는 방법.
  11. 제10항에 있어서, 상기 2개의 표적 게놈 서열은 10 내지 20개의 염기쌍만큼 떨어져 있고, 바람직하게는 13 내지 17개의 염기쌍만큼 떨어져 있는 것인, 세포 내 게놈 서열에서 서열-특이적 파손을 유도하는 방법.
  12. 제10항에 있어서, 상기 안내 RNA는
    (a) 2개의 단일 안내 RNA, 또는
    (b) tracrRNA와 2개의 crRNA
    이되, 상기 2개의 단일 안내 RNA 중 하나의 단일 안내 RNA는 제1 가닥을 표적화하고, 다른 하나의 안내 RNA는 상보성 가닥을 표적화하며, FokI는 각각의 가닥을 절단하여 마주보는 DNA 가닥 상에 한 쌍의 틈을 생성함으로써 이중-가닥 파손을 유발하고,
    상기 2개의 crRNA 중 하나의 crRNA는 제1 가닥을 표적화하고, 다른 하나의 crRNA는 상보성 가닥을 표적화하며, FokI는 각각의 가닥을 절단하여 마주보는 DNA 가닥 상에 한 쌍의 틈을 생성함으로써 이중-가닥 파손을 유발하는 것인, 세포 내 게놈 서열에서 서열-특이적 파손을 유도하는 방법.
  13. 제10항에 있어서, 각각의 상기 2개의 안내 RNA는 표적 게놈 서열의 17 내지 20개의 뉴클레오타이드에 대해 상보적인 상보성 영역을 포함하는 것인, 세포 내 게놈 서열에서 서열-특이적 파손을 유도하는 방법.
  14. 제10항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 2개의 표적 서열 사이에 삽입결실 돌연변이가 유도되는 것인, 세포 내 게놈 서열에서 서열-특이적 파손을 유도하는 방법.
  15. 제10항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 세포 내 RNA-안내 게놈 편집의 특이성이 증가되는 것인, 세포 내 게놈 서열에서 서열-특이적 파손을 유도하는 방법.
  16. 세포 내 RNA-안내 게놈 편집의 특이성을 증가시키는 방법으로서, 상기 세포를 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항의 RNA-안내 FokI 뉴클레아제(RFN) 융합 단백질과 접촉시키는 단계를 포함하는, 세포 내 RNA-안내 게놈 편집의 특이성을 증가시키는 방법.
KR1020157029177A 2013-03-15 2014-03-14 Rna-안내 게놈 편집의 특이성을 증가시키기 위한 rna-안내 foki 뉴클레아제(rfn)의 용도 KR102210322B1 (ko)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1020217002429A KR102271292B1 (ko) 2013-03-15 2014-03-14 Rna-안내 게놈 편집의 특이성을 증가시키기 위한 rna-안내 foki 뉴클레아제(rfn)의 용도

Applications Claiming Priority (9)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201361799647P 2013-03-15 2013-03-15
US61/799,647 2013-03-15
US201361838148P 2013-06-21 2013-06-21
US201361838178P 2013-06-21 2013-06-21
US61/838,178 2013-06-21
US61/838,148 2013-06-21
US201361921007P 2013-12-26 2013-12-26
US61/921,007 2013-12-26
PCT/US2014/028630 WO2014144288A1 (en) 2013-03-15 2014-03-14 Using rna-guided foki nucleases (rfns) to increase specificity for rna-guided genome editing

Related Child Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020217002429A Division KR102271292B1 (ko) 2013-03-15 2014-03-14 Rna-안내 게놈 편집의 특이성을 증가시키기 위한 rna-안내 foki 뉴클레아제(rfn)의 용도

Publications (2)

Publication Number Publication Date
KR20150132395A true KR20150132395A (ko) 2015-11-25
KR102210322B1 KR102210322B1 (ko) 2021-02-01

Family

ID=51537665

Family Applications (8)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020157029177A KR102210322B1 (ko) 2013-03-15 2014-03-14 Rna-안내 게놈 편집의 특이성을 증가시키기 위한 rna-안내 foki 뉴클레아제(rfn)의 용도
KR1020157029171A KR102210323B1 (ko) 2013-03-15 2014-03-14 Rna-안내 게놈 편집을 위해 특이성을 증가시키기 위한 절단된 안내 rna(tru-grnas)의 이용
KR1020217002428A KR102405549B1 (ko) 2013-03-15 2014-03-14 Rna-안내 게놈 편집을 위해 특이성을 증가시키기 위한 절단된 안내 rna(tru-grnas)의 이용
KR1020237038728A KR20230157540A (ko) 2013-03-15 2014-03-14 Rna-안내 게놈 편집을 위해 특이성을 증가시키기 위한 절단된 안내 rna(tru-grnas)의 이용
KR1020157029170A KR102210319B1 (ko) 2013-03-15 2014-03-14 특정 게놈 좌위에 대한 유전적 및 후성적 조절 단백질의 rna-안내 표적화
KR1020227018265A KR102602047B1 (ko) 2013-03-15 2014-03-14 Rna-안내 게놈 편집을 위해 특이성을 증가시키기 위한 절단된 안내 rna(tru-grnas)의 이용
KR1020217002429A KR102271292B1 (ko) 2013-03-15 2014-03-14 Rna-안내 게놈 편집의 특이성을 증가시키기 위한 rna-안내 foki 뉴클레아제(rfn)의 용도
KR1020217002427A KR102271291B1 (ko) 2013-03-15 2014-03-14 특정 게놈 좌위에 대한 유전적 및 후성적 조절 단백질의 rna-안내 표적화

Family Applications After (7)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020157029171A KR102210323B1 (ko) 2013-03-15 2014-03-14 Rna-안내 게놈 편집을 위해 특이성을 증가시키기 위한 절단된 안내 rna(tru-grnas)의 이용
KR1020217002428A KR102405549B1 (ko) 2013-03-15 2014-03-14 Rna-안내 게놈 편집을 위해 특이성을 증가시키기 위한 절단된 안내 rna(tru-grnas)의 이용
KR1020237038728A KR20230157540A (ko) 2013-03-15 2014-03-14 Rna-안내 게놈 편집을 위해 특이성을 증가시키기 위한 절단된 안내 rna(tru-grnas)의 이용
KR1020157029170A KR102210319B1 (ko) 2013-03-15 2014-03-14 특정 게놈 좌위에 대한 유전적 및 후성적 조절 단백질의 rna-안내 표적화
KR1020227018265A KR102602047B1 (ko) 2013-03-15 2014-03-14 Rna-안내 게놈 편집을 위해 특이성을 증가시키기 위한 절단된 안내 rna(tru-grnas)의 이용
KR1020217002429A KR102271292B1 (ko) 2013-03-15 2014-03-14 Rna-안내 게놈 편집의 특이성을 증가시키기 위한 rna-안내 foki 뉴클레아제(rfn)의 용도
KR1020217002427A KR102271291B1 (ko) 2013-03-15 2014-03-14 특정 게놈 좌위에 대한 유전적 및 후성적 조절 단백질의 rna-안내 표적화

Country Status (12)

Country Link
US (15) US9567604B2 (ko)
EP (9) EP3865586A1 (ko)
JP (11) JP6657069B2 (ko)
KR (8) KR102210322B1 (ko)
CN (6) CN105408483A (ko)
AU (10) AU2014228981B2 (ko)
BR (1) BR112015023489B1 (ko)
CA (4) CA2907198C (ko)
ES (1) ES2713503T3 (ko)
IL (2) IL289396B2 (ko)
WO (4) WO2014144761A2 (ko)
ZA (1) ZA201506814B (ko)

Families Citing this family (349)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2008027558A2 (en) 2006-08-31 2008-03-06 Codon Devices, Inc. Iterative nucleic acid assembly using activation of vector-encoded traits
CN103517990A (zh) 2010-10-07 2014-01-15 通用医疗公司 癌症生物标志物
CN103502448B (zh) 2010-11-12 2017-03-29 Gen9股份有限公司 核酸合成的方法和设备
US10457935B2 (en) 2010-11-12 2019-10-29 Gen9, Inc. Protein arrays and methods of using and making the same
EP3461896B1 (en) 2011-07-15 2023-11-29 The General Hospital Corporation Methods of transcription activator like effector assembly
EP3613852A3 (en) 2011-07-22 2020-04-22 President and Fellows of Harvard College Evaluation and improvement of nuclease cleavage specificity
LT2944693T (lt) 2011-08-26 2019-08-26 Gen9, Inc. Kompozicijos ir būdai, skirti nukleorūgščių didelio tikslumo sąrankai
US11021737B2 (en) 2011-12-22 2021-06-01 President And Fellows Of Harvard College Compositions and methods for analyte detection
GB201122458D0 (en) 2011-12-30 2012-02-08 Univ Wageningen Modified cascade ribonucleoproteins and uses thereof
WO2013139861A1 (en) 2012-03-20 2013-09-26 Luc Montagnier Methods and pharmaceutical compositions of the treatment of autistic syndrome disorders
US9150853B2 (en) 2012-03-21 2015-10-06 Gen9, Inc. Methods for screening proteins using DNA encoded chemical libraries as templates for enzyme catalysis
LT2841601T (lt) 2012-04-24 2019-07-10 Gen9, Inc. Nukleorūgščių rūšiavimo būdai ir multipleksinis preparatyvinis in vitro klonavimas
EP3597741A1 (en) 2012-04-27 2020-01-22 Duke University Genetic correction of mutated genes
DK3401400T3 (da) 2012-05-25 2019-06-03 Univ California Fremgangsmåder og sammensætninger til rna-styret mål-dna-modifikation og til rna-styret transskriptionsmodulering
US9890364B2 (en) 2012-05-29 2018-02-13 The General Hospital Corporation TAL-Tet1 fusion proteins and methods of use thereof
EP3483311A1 (en) 2012-06-25 2019-05-15 Gen9, Inc. Methods for nucleic acid assembly and high throughput sequencing
EP2906602B1 (en) 2012-10-12 2019-01-16 The General Hospital Corporation Transcription activator-like effector (tale) - lysine-specific demethylase 1 (lsd1) fusion proteins
JP6620018B2 (ja) 2012-12-06 2019-12-11 シグマ−アルドリッチ・カンパニー・リミテッド・ライアビリティ・カンパニーＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ Ｃｏ．， ＬＬＣ Ｃｒｉｓｐｒに基づくゲノム修飾および制御
WO2014093709A1 (en) 2012-12-12 2014-06-19 The Broad Institute, Inc. Methods, models, systems, and apparatus for identifying target sequences for cas enzymes or crispr-cas systems for target sequences and conveying results thereof
MX2015007550A (es) 2012-12-12 2017-02-02 Broad Inst Inc Suministro, modificación y optimización de sistemas, métodos y composiciones para la manipulación de secuencias y aplicaciones terapéuticas.
CN113005148A (zh) 2013-01-16 2021-06-22 爱默蕾大学 Cas9-核酸复合物及其相关用途
EP3623463B1 (en) 2013-02-07 2021-10-20 The General Hospital Corporation Tale transcriptional activators
US10138509B2 (en) 2013-03-12 2018-11-27 President And Fellows Of Harvard College Method for generating a three-dimensional nucleic acid containing matrix
EP2971167B1 (en) 2013-03-14 2019-07-31 Caribou Biosciences, Inc. Compositions and methods of nucleic acid-targeting nucleic acids
US10760064B2 (en) 2013-03-15 2020-09-01 The General Hospital Corporation RNA-guided targeting of genetic and epigenomic regulatory proteins to specific genomic loci
WO2014204578A1 (en) 2013-06-21 2014-12-24 The General Hospital Corporation Using rna-guided foki nucleases (rfns) to increase specificity for rna-guided genome editing
CA2907198C (en) 2013-03-15 2019-12-10 The General Hospital Corporation Using rna-guided foki nucleases (rfns) to increase specificity for rna-guided genome editing
CN105518146B (zh) 2013-04-04 2022-07-15 哈佛学院校长同事会 利用CRISPR/Cas系统的基因组编辑的治疗性用途
KR102282990B1 (ko) 2013-06-04 2021-07-28 프레지던트 앤드 펠로우즈 오브 하바드 칼리지 Rna-가이드된 전사 조절
US20140356956A1 (en) * 2013-06-04 2014-12-04 President And Fellows Of Harvard College RNA-Guided Transcriptional Regulation
EP3725885A1 (en) 2013-06-17 2020-10-21 The Broad Institute, Inc. Functional genomics using crispr-cas systems, compositions methods, screens and applications thereof
AU2014281028B2 (en) 2013-06-17 2020-09-10 Massachusetts Institute Of Technology Delivery and use of the CRISPR-Cas systems, vectors and compositions for hepatic targeting and therapy
EP4245853A3 (en) 2013-06-17 2023-10-18 The Broad Institute, Inc. Optimized crispr-cas double nickase systems, methods and compositions for sequence manipulation
JP6702858B2 (ja) 2013-06-17 2020-06-03 ザ・ブロード・インスティテュート・インコーポレイテッド ウイルス成分を使用して障害および疾患をターゲティングするためのＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系および組成物の送達、使用および治療上の適用
EP3011029B1 (en) 2013-06-17 2019-12-11 The Broad Institute, Inc. Delivery, engineering and optimization of tandem guide systems, methods and compositions for sequence manipulation
JP2016528890A (ja) 2013-07-09 2016-09-23 プレジデント アンド フェローズ オブ ハーバード カレッジ ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系を用いるゲノム編集の治療用の使用
US20150044192A1 (en) 2013-08-09 2015-02-12 President And Fellows Of Harvard College Methods for identifying a target site of a cas9 nuclease
US20150044772A1 (en) * 2013-08-09 2015-02-12 Sage Labs, Inc. Crispr/cas system-based novel fusion protein and its applications in genome editing
US9359599B2 (en) 2013-08-22 2016-06-07 President And Fellows Of Harvard College Engineered transcription activator-like effector (TALE) domains and uses thereof
WO2015026887A1 (en) 2013-08-22 2015-02-26 E. I. Du Pont De Nemours And Company A soybean u6 polymerase iii promoter and methods of use
US9322037B2 (en) * 2013-09-06 2016-04-26 President And Fellows Of Harvard College Cas9-FokI fusion proteins and uses thereof
US9228207B2 (en) 2013-09-06 2016-01-05 President And Fellows Of Harvard College Switchable gRNAs comprising aptamers
US9737604B2 (en) 2013-09-06 2017-08-22 President And Fellows Of Harvard College Use of cationic lipids to deliver CAS9
ES2681622T3 (es) 2013-09-18 2018-09-14 Kymab Limited Métodos, células y organismos
WO2015066119A1 (en) 2013-10-30 2015-05-07 North Carolina State University Compositions and methods related to a type-ii crispr-cas system in lactobacillus buchneri
US9834791B2 (en) 2013-11-07 2017-12-05 Editas Medicine, Inc. CRISPR-related methods and compositions with governing gRNAS
US9068179B1 (en) 2013-12-12 2015-06-30 President And Fellows Of Harvard College Methods for correcting presenilin point mutations
WO2015089364A1 (en) 2013-12-12 2015-06-18 The Broad Institute Inc. Crystal structure of a crispr-cas system, and uses thereof
EP3080271B1 (en) * 2013-12-12 2020-02-12 The Broad Institute, Inc. Systems, methods and compositions for sequence manipulation with optimized functional crispr-cas systems
US9994831B2 (en) 2013-12-12 2018-06-12 The Regents Of The University Of California Methods and compositions for modifying a single stranded target nucleic acid
SG10201804973TA (en) 2013-12-12 2018-07-30 Broad Inst Inc Compositions and Methods of Use of Crispr-Cas Systems in Nucleotide Repeat Disorders
CN111206032A (zh) 2013-12-12 2020-05-29 布罗德研究所有限公司 用于基因组编辑的crispr-cas系统和组合物的递送、用途和治疗应用
EP3985124A1 (en) * 2013-12-26 2022-04-20 The General Hospital Corporation Multiplex guide rnas
US10787654B2 (en) 2014-01-24 2020-09-29 North Carolina State University Methods and compositions for sequence guiding Cas9 targeting
MX2016010285A (es) 2014-02-11 2017-01-11 Univ Colorado Regents Ingenieria genetica multiplexada habilitada por crispr.
WO2015134812A1 (en) 2014-03-05 2015-09-11 Editas Medicine, Inc. Crispr/cas-related methods and compositions for treating usher syndrome and retinitis pigmentosa
US11141493B2 (en) 2014-03-10 2021-10-12 Editas Medicine, Inc. Compositions and methods for treating CEP290-associated disease
US11339437B2 (en) 2014-03-10 2022-05-24 Editas Medicine, Inc. Compositions and methods for treating CEP290-associated disease
DK3116997T3 (da) 2014-03-10 2019-08-19 Editas Medicine Inc Crispr/cas-relaterede fremgangsmåder og sammensætninger til behandling af lebers kongenitale amaurose 10 (lca10)
US11242525B2 (en) 2014-03-26 2022-02-08 Editas Medicine, Inc. CRISPR/CAS-related methods and compositions for treating sickle cell disease
CN106460003A (zh) 2014-04-08 2017-02-22 北卡罗来纳州立大学 用于使用crispr相关基因rna引导阻遏转录的方法和组合物
BR112016028023A2 (pt) 2014-05-30 2017-08-22 Univ Leland Stanford Junior Composições e métodos de administração de tratamentos para infecções virais latentes
AU2015280069B2 (en) 2014-06-23 2021-08-12 The General Hospital Corporation Genomewide unbiased identification of dsbs evaluated by sequencing (guide-seq)
US20150376587A1 (en) * 2014-06-25 2015-12-31 Caribou Biosciences, Inc. RNA Modification to Engineer Cas9 Activity
US20170198268A1 (en) * 2014-07-09 2017-07-13 Gen9, Inc. Compositions and Methods for Site-Directed DNA Nicking and Cleaving
US10676754B2 (en) 2014-07-11 2020-06-09 E I Du Pont De Nemours And Company Compositions and methods for producing plants resistant to glyphosate herbicide
AU2015298571B2 (en) 2014-07-30 2020-09-03 President And Fellows Of Harvard College Cas9 proteins including ligand-dependent inteins
US9932566B2 (en) 2014-08-07 2018-04-03 Agilent Technologies, Inc. CIS-blocked guide RNA
US10450584B2 (en) 2014-08-28 2019-10-22 North Carolina State University Cas9 proteins and guiding features for DNA targeting and genome editing
CN108064129A (zh) 2014-09-12 2018-05-22 纳幕尔杜邦公司 玉米和大豆中复合性状基因座的位点特异性整合位点的产生和使用方法
WO2016049258A2 (en) * 2014-09-25 2016-03-31 The Broad Institute Inc. Functional screening with optimized functional crispr-cas systems
WO2016054106A1 (en) * 2014-09-29 2016-04-07 The Regents Of The University Of California SCAFFOLD RNAs
US20180250424A1 (en) * 2014-10-10 2018-09-06 Editas Medicine, Inc. Compositions and methods for promoting homology directed repair
US9816080B2 (en) 2014-10-31 2017-11-14 President And Fellows Of Harvard College Delivery of CAS9 via ARRDC1-mediated microvesicles (ARMMs)
CA2963820A1 (en) 2014-11-07 2016-05-12 Editas Medicine, Inc. Methods for improving crispr/cas-mediated genome-editing
US11352666B2 (en) 2014-11-14 2022-06-07 Institute For Basic Science Method for detecting off-target sites of programmable nucleases in a genome
JP6621820B2 (ja) * 2014-11-14 2019-12-18 インスティチュート フォー ベーシック サイエンスＩｎｓｔｉｔｕｔｅ Ｆｏｒ Ｂａｓｉｃ Ｓｃｉｅｎｃｅ ゲノムでプログラマブルヌクレアーゼの非標的位置を検出する方法
CN104531633A (zh) * 2014-11-18 2015-04-22 李云英 Cas9-scForkI融合蛋白及其应用
EP3222728B1 (en) 2014-11-19 2021-07-14 Institute for Basic Science Method for regulating gene expression using cas9 protein expressed from two vectors
JP7068821B2 (ja) 2014-12-03 2022-05-17 アジレント・テクノロジーズ・インク 化学修飾を有するガイドｒｎａ
CN107208079B (zh) * 2014-12-05 2021-06-29 应用干细胞有限公司 整合转基因的位点定向crispr/重组酶组合物和方法
KR102656470B1 (ko) 2014-12-10 2024-04-09 리전츠 오브 더 유니버스티 오브 미네소타 질환을 치료하기 위한 유전적으로 변형된 세포, 조직 및 장기
WO2016094867A1 (en) * 2014-12-12 2016-06-16 The Broad Institute Inc. Protected guide rnas (pgrnas)
WO2016094872A1 (en) * 2014-12-12 2016-06-16 The Broad Institute Inc. Dead guides for crispr transcription factors
EP3234133B1 (en) * 2014-12-18 2020-11-11 Integrated DNA Technologies, Inc. Crispr-based compositions and methods of use
US20180179523A1 (en) * 2014-12-18 2018-06-28 Integrated Dna Technologies, Inc. Crispr-based compositions and methods of use
US10190106B2 (en) * 2014-12-22 2019-01-29 Univesity Of Massachusetts Cas9-DNA targeting unit chimeras
US11208638B2 (en) 2015-01-12 2021-12-28 The Regents Of The University Of California Heterodimeric Cas9 and methods of use thereof
WO2016123243A1 (en) * 2015-01-28 2016-08-04 The Regents Of The University Of California Methods and compositions for labeling a single-stranded target nucleic acid
HRP20231022T1 (hr) 2015-01-28 2023-12-08 Caribou Biosciences, Inc. Hibridni polinukleotidi crispr dna/rna i načini uporabe
US10676726B2 (en) 2015-02-09 2020-06-09 Duke University Compositions and methods for epigenome editing
KR102630802B1 (ko) 2015-02-18 2024-01-31 아이오와 스테이트 유니버시티 리서치 파운데이션, 인코퍼레이티드 증가된 단백질 함량 및 스트레스에 대한 저항성을 위한 nf-yc4 프로모터 내 전사 리프레서 결합 부위의 변형
CA2978314A1 (en) 2015-03-03 2016-09-09 The General Hospital Corporation Engineered crispr-cas9 nucleases with altered pam specificity
CN107567499A (zh) 2015-03-27 2018-01-09 纳幕尔杜邦公司 大豆u6核小rna基因启动子及其在植物小rna基因的组成型表达中的用途
AU2016246450B2 (en) 2015-04-06 2022-03-17 Agilent Technologies, Inc. Chemically modified guide RNAs for CRISPR/Cas-mediated gene regulation
AU2016253150B2 (en) 2015-04-24 2022-04-21 Editas Medicine, Inc. Evaluation of Cas9 molecule/guide RNA molecule complexes
EP3294896A1 (en) 2015-05-11 2018-03-21 Editas Medicine, Inc. Optimized crispr/cas9 systems and methods for gene editing in stem cells
JP2018516563A (ja) 2015-05-29 2018-06-28 ノース カロライナ ステート ユニバーシティＮｏｒｔｈ Ｃａｒｏｌｉｎａ Ｓｔａｔｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｃｒｉｓｐｒ核酸を用いて、細菌、古細菌、藻類、および、酵母をスクリーニングする方法
GB2543873A (en) 2015-05-29 2017-05-03 Agenovir Corp Compositions and methods for cell targeted HPV treatment
US10117911B2 (en) 2015-05-29 2018-11-06 Agenovir Corporation Compositions and methods to treat herpes simplex virus infections
EP3303634B1 (en) 2015-06-03 2023-08-30 The Regents of The University of California Cas9 variants and methods of use thereof
EP3302525A2 (en) 2015-06-05 2018-04-11 Novartis AG Methods and compositions for diagnosing, treating, and monitoring treatment of shank3 deficiency associated disorders
AU2016276702B2 (en) 2015-06-09 2022-07-28 Editas Medicine, Inc. CRISPR/CAS-related methods and compositions for improving transplantation
CA2987078A1 (en) * 2015-06-10 2016-12-15 Firmenich Sa Cell lines for screening odorant and aroma receptors
CA2985714C (en) 2015-06-12 2024-02-06 Lonza Walkersville, Inc. Methods for nuclear reprogramming using synthetic transcription factors
WO2016205276A1 (en) 2015-06-15 2016-12-22 North Carolina State University Methods and compositions for efficient delivery of nucleic acids and rna-based antimicrobials
WO2016205759A1 (en) 2015-06-18 2016-12-22 The Broad Institute Inc. Engineering and optimization of systems, methods, enzymes and guide scaffolds of cas9 orthologs and variants for sequence manipulation
CN108290933A (zh) 2015-06-18 2018-07-17 布罗德研究所有限公司 降低脱靶效应的crispr酶突变
WO2017004261A1 (en) 2015-06-29 2017-01-05 Ionis Pharmaceuticals, Inc. Modified crispr rna and modified single crispr rna and uses thereof
WO2017004279A2 (en) * 2015-06-29 2017-01-05 Massachusetts Institute Of Technology Compositions comprising nucleic acids and methods of using the same
JP7044373B2 (ja) 2015-07-15 2022-03-30 ラトガース，ザ ステート ユニバーシティ オブ ニュージャージー ヌクレアーゼ非依存的な標的化遺伝子編集プラットフォームおよびその用途
EP3325018A4 (en) * 2015-07-22 2019-04-24 Duke University HIGH EFFICIENCY SCREENING OF REGULATORY ELEMENT FUNCTION USING EPIGENOUS EDITING TECHNOLOGIES
EP4339287A3 (en) 2015-07-31 2024-05-22 Regents Of The University Of Minnesota Modified cells and methods of therapy
US20180230450A1 (en) * 2015-08-03 2018-08-16 President And Fellows Of Harvard College Cas9 Genome Editing and Transcriptional Regulation
WO2017024047A1 (en) * 2015-08-03 2017-02-09 Emendobio Inc. Compositions and methods for increasing nuclease induced recombination rate in cells
CA2996001A1 (en) 2015-08-25 2017-03-02 Duke University Compositions and methods of improving specificity in genomic engineering using rna-guided endonucleases
US9512446B1 (en) 2015-08-28 2016-12-06 The General Hospital Corporation Engineered CRISPR-Cas9 nucleases
US9926546B2 (en) 2015-08-28 2018-03-27 The General Hospital Corporation Engineered CRISPR-Cas9 nucleases
CN108350449B (zh) 2015-08-28 2022-05-31 通用医疗公司 工程化的CRISPR-Cas9核酸酶
US10526590B2 (en) 2015-08-31 2020-01-07 Agilent Technologies, Inc. Compounds and methods for CRISPR/Cas-based genome editing by homologous recombination
WO2017044776A1 (en) * 2015-09-10 2017-03-16 Texas Tech University System Single-guide rna (sgrna) with improved knockout efficiency
CN108350453A (zh) * 2015-09-11 2018-07-31 通用医疗公司 核酸酶dsb的完全查询和测序(find-seq)
AU2016326711B2 (en) 2015-09-24 2022-11-03 Editas Medicine, Inc. Use of exonucleases to improve CRISPR/Cas-mediated genome editing
WO2017058751A1 (en) 2015-09-28 2017-04-06 North Carolina State University Methods and compositions for sequence specific antimicrobials
KR20180053748A (ko) 2015-09-30 2018-05-23 더 제너럴 하스피탈 코포레이션 시퀀싱(circle-seq)에 의한 절단 반응의 포괄적인 시험관내 보고
BR112018007070A2 (pt) 2015-10-06 2019-06-04 Aict método, composição e kit para a preparação de uma planta a partir de um protoplasto, planta regenerada e composição para clivagem de dna
EP4089175A1 (en) 2015-10-13 2022-11-16 Duke University Genome engineering with type i crispr systems in eukaryotic cells
CN108513575A (zh) 2015-10-23 2018-09-07 哈佛大学的校长及成员们 核碱基编辑器及其用途
ES2699848T3 (es) 2015-10-23 2019-02-13 Caribou Biosciences Inc Acido nucleico CRISPR clase 2 de tipo cruzado modificado que se dirige a ácidos nucleicos
GB2559526B (en) 2015-11-03 2021-02-17 Harvard College Method and apparatus for volumetric imaging of a three-dimensional nucleic acid containing matrix
WO2017081288A1 (en) 2015-11-11 2017-05-18 Lonza Ltd Crispr-associated (cas) proteins with reduced immunogenicity
US11542495B2 (en) 2015-11-20 2023-01-03 Sage Science, Inc. Preparative electrophoretic method for targeted purification of genomic DNA fragments
WO2017090724A1 (ja) * 2015-11-25 2017-06-01 国立大学法人 群馬大学 Ｄｎａメチル化編集用キットおよびｄｎａメチル化編集方法
WO2017106251A1 (en) * 2015-12-14 2017-06-22 President And Fellows Of Harvard College Cas discrimination using tuned guide rna
WO2017112620A1 (en) 2015-12-22 2017-06-29 North Carolina State University Methods and compositions for delivery of crispr based antimicrobials
WO2017115268A1 (en) * 2015-12-28 2017-07-06 Novartis Ag Compositions and methods for the treatment of hemoglobinopathies
KR20180095719A (ko) 2016-01-11 2018-08-27 더 보드 어브 트러스티스 어브 더 리랜드 스탠포드 주니어 유니버시티 키메라 단백질 및 면역요법 방법
US9856497B2 (en) 2016-01-11 2018-01-02 The Board Of Trustee Of The Leland Stanford Junior University Chimeric proteins and methods of regulating gene expression
WO2017136794A1 (en) 2016-02-03 2017-08-10 Massachusetts Institute Of Technology Structure-guided chemical modification of guide rna and its applications
EP3414327B1 (en) 2016-02-10 2020-09-30 The Regents of The University of Michigan Detection of nucleic acids
US20190249172A1 (en) 2016-02-18 2019-08-15 The Regents Of The University Of California Methods and compositions for gene editing in stem cells
US10538750B2 (en) 2016-02-29 2020-01-21 Agilent Technologies, Inc. Methods and compositions for blocking off-target nucleic acids from cleavage by CRISPR proteins
JP7140386B2 (ja) 2016-03-15 2022-09-21 アプス， インコーポレイテッド 増加した二本鎖ｒｎａ産生のための方法及び組成物
JP2019515654A (ja) 2016-03-16 2019-06-13 ザ ジェイ． デヴィッド グラッドストーン インスティテューツ 肥満及び／又は糖尿病を処置するための方法及び組成物、並びに候補処置薬剤を識別するための方法及び組成物
EP3219799A1 (en) 2016-03-17 2017-09-20 IMBA-Institut für Molekulare Biotechnologie GmbH Conditional crispr sgrna expression
US11512311B2 (en) 2016-03-25 2022-11-29 Editas Medicine, Inc. Systems and methods for treating alpha 1-antitrypsin (A1AT) deficiency
EP3433363A1 (en) 2016-03-25 2019-01-30 Editas Medicine, Inc. Genome editing systems comprising repair-modulating enzyme molecules and methods of their use
CN106701765A (zh) * 2016-04-11 2017-05-24 广东赤萌医疗科技有限公司 用于hiv感染治疗的多核苷酸及其制备药物应用
US11236313B2 (en) 2016-04-13 2022-02-01 Editas Medicine, Inc. Cas9 fusion molecules, gene editing systems, and methods of use thereof
US20190127713A1 (en) * 2016-04-13 2019-05-02 Duke University Crispr/cas9-based repressors for silencing gene targets in vivo and methods of use
CN116200465A (zh) 2016-04-25 2023-06-02 哈佛学院董事及会员团体 用于原位分子检测的杂交链反应方法
CN107326046A (zh) * 2016-04-28 2017-11-07 上海邦耀生物科技有限公司 一种提高外源基因同源重组效率的方法
RU2021106817A (ru) 2016-05-20 2021-04-06 Регенерон Фармасьютикалс, Инк. Способы преодоления иммунологической толерантности с использованием множества направляющих рнк
EP3604527B1 (en) * 2016-06-02 2021-05-12 Sigma-Aldrich Co., LLC Using programmable dna binding proteins to enhance targeted genome modification
US20190100732A1 (en) 2016-06-02 2019-04-04 Yissum Research Development Company Of The Hebrew University Of Jerusalem Ltd. Assay for the removal of methyl-cytosine residues from dna
US10767175B2 (en) 2016-06-08 2020-09-08 Agilent Technologies, Inc. High specificity genome editing using chemically modified guide RNAs
US20190177710A1 (en) * 2016-06-15 2019-06-13 Toolgen Incorporated Method For Screening Target Specific Nuclease Using Multi-Target System Of On-Target And Off-Target And Use Thereof
AU2017280353B2 (en) 2016-06-24 2021-11-11 Inscripta, Inc. Methods for generating barcoded combinatorial libraries
MX2019000088A (es) * 2016-06-27 2019-08-29 Broad Inst Inc Composiciones y metodos para detectar y tratar la diabetes.
CN109477130B (zh) * 2016-07-01 2022-08-30 微软技术许可有限责任公司 通过迭代dna编辑的存储
US20180004537A1 (en) 2016-07-01 2018-01-04 Microsoft Technology Licensing, Llc Molecular State Machines
US11359234B2 (en) 2016-07-01 2022-06-14 Microsoft Technology Licensing, Llc Barcoding sequences for identification of gene expression
CN109477086A (zh) * 2016-07-13 2019-03-15 陈奇涵 一种基因组dna特异性编辑方法和应用
CA3030783A1 (en) * 2016-07-13 2018-01-18 Vertex Pharmaceuticals Incorporated Methods, compositions and kits for increasing genome editing efficiency
CA3031414A1 (en) * 2016-07-26 2018-02-01 The General Hospital Corporation Variants of crispr from prevotella and francisella 1 (cpf1)
KR101961332B1 (ko) * 2016-07-28 2019-03-22 기초과학연구원 Cas9 단백질 및 가이드 RNA를 포함하는 안질환 치료용 약학 조성물
CN109803530A (zh) 2016-07-29 2019-05-24 瑞泽恩制药公司 包含引起c-截短的原纤维蛋白-1表达的突变的小鼠
BR112019001887A2 (pt) 2016-08-02 2019-07-09 Editas Medicine Inc composições e métodos para o tratamento de doença associada a cep290
WO2018027078A1 (en) 2016-08-03 2018-02-08 President And Fellows Of Harard College Adenosine nucleobase editors and uses thereof
CA3033327A1 (en) 2016-08-09 2018-02-15 President And Fellows Of Harvard College Programmable cas9-recombinase fusion proteins and uses thereof
WO2018030457A1 (ja) 2016-08-10 2018-02-15 武田薬品工業株式会社 真核細胞のゲノムの標的部位を改変する方法及び標的部位における検出対象核酸配列の存在又は非存在を検出する方法
WO2018034554A1 (ko) * 2016-08-19 2018-02-22 주식회사 툴젠 인위적으로 조작된 신생혈관형성 조절 시스템
AU2017313912B2 (en) * 2016-08-19 2024-01-04 Whitehead Institute For Biomedical Research Methods of editing DNA methylation
KR20220145913A (ko) 2016-08-24 2022-10-31 상가모 테라퓨틱스, 인코포레이티드 가공된 표적 특이적 뉴클레아제
WO2018039438A1 (en) 2016-08-24 2018-03-01 President And Fellows Of Harvard College Incorporation of unnatural amino acids into proteins using base editing
IL264639B2 (en) 2016-08-24 2024-01-01 Sangamo Therapeutics Inc Regulation of globulin gene expression using transgenic nucleases with zinc neurites
WO2018048194A1 (ko) * 2016-09-07 2018-03-15 울산대학교 산학협력단 dCas9 단백질 및 표적 핵산 서열에 결합하는 gRNA를 이용한 핵산 검출의 민감도 및 특이도 향상용 조성물 및 방법
EP3510152A4 (en) * 2016-09-07 2020-04-29 Flagship Pioneering, Inc. METHODS AND COMPOSITIONS FOR MODULATING GENE EXPRESSION
CN107880132B (zh) * 2016-09-30 2022-06-17 北京大学 一种融合蛋白及使用其进行同源重组的方法
AU2017335890B2 (en) 2016-09-30 2024-05-09 The Regents Of The University Of California RNA-guided nucleic acid modifying enzymes and methods of use thereof
US10669539B2 (en) 2016-10-06 2020-06-02 Pioneer Biolabs, Llc Methods and compositions for generating CRISPR guide RNA libraries
US11242542B2 (en) 2016-10-07 2022-02-08 Integrated Dna Technologies, Inc. S. pyogenes Cas9 mutant genes and polypeptides encoded by same
WO2018068053A2 (en) 2016-10-07 2018-04-12 Integrated Dna Technologies, Inc. S. pyogenes cas9 mutant genes and polypeptides encoded by same
KR20240064734A (ko) 2016-10-14 2024-05-13 더 제너럴 하스피탈 코포레이션 후성적으로 조절되는 부위-특이적 뉴클레아제
KR20240007715A (ko) 2016-10-14 2024-01-16 프레지던트 앤드 펠로우즈 오브 하바드 칼리지 핵염기 에디터의 aav 전달
EP3529359B1 (en) 2016-10-18 2023-12-13 Regents of the University of Minnesota Tumor infiltrating lymphocytes for use in therapy
US20180245065A1 (en) 2016-11-01 2018-08-30 Novartis Ag Methods and compositions for enhancing gene editing
US20180282722A1 (en) * 2016-11-21 2018-10-04 Massachusetts Institute Of Technology Chimeric DNA:RNA Guide for High Accuracy Cas9 Genome Editing
EP3545085A4 (en) 2016-11-22 2020-10-28 Integrated Dna Technologies, Inc. CRISPR / CPF1 SYSTEMS AND METHODS
CN110291198A (zh) 2016-12-08 2019-09-27 因特利亚治疗公司 经修饰的指导rna
US11293022B2 (en) 2016-12-12 2022-04-05 Integrated Dna Technologies, Inc. Genome editing enhancement
AU2017378427A1 (en) 2016-12-14 2019-06-20 Ligandal, Inc. Methods and compositions for nucleic acid and protein payload delivery
US10745677B2 (en) 2016-12-23 2020-08-18 President And Fellows Of Harvard College Editing of CCR5 receptor gene to protect against HIV infection
CA3047330A1 (en) * 2016-12-28 2018-07-05 Ionis Pharmaceuticals, Inc. Modified crispr rna and uses thereof
EP3565608A4 (en) 2017-01-05 2020-12-16 Rutgers, The State University of New Jersey TARGETED GENEDITATION PLATFORM INDEPENDENT OF DNA DOUBLE STRAND BREAKAGE AND USES THEREOF
ES2949801T3 (es) 2017-01-09 2023-10-03 Whitehead Inst Biomedical Res Métodos para alterar la expresión génica mediante la perturbación de multímeros de factores de transcripción que estructuran bucles reguladores
JP2020505062A (ja) * 2017-01-17 2020-02-20 インスティテュート フォー ベーシック サイエンスＩｎｓｔｉｔｕｔｅ Ｆｏｒ Ｂａｓｉｃ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｄｎａ一本鎖切断による塩基編集非標的位置確認方法
RU2021133626A (ru) 2017-01-23 2022-01-31 Регенерон Фармасьютикалз, Инк. Варианты hsd17b13 и их применения
TW201839136A (zh) 2017-02-06 2018-11-01 瑞士商諾華公司 治療血色素異常症之組合物及方法
KR20190116282A (ko) 2017-02-10 2019-10-14 지머젠 인코포레이티드 복수의 숙주를 위한 다중 dna 구조체의 조립 및 편집을 위한 모듈식 범용 플라스미드 디자인 전략
US11518991B2 (en) 2017-02-24 2022-12-06 Georg-August-Universitaet Goettingen Stiftung Oeffentlichen Rechts, Universitaetsmedizin Method for re-expression of different hypermethylated genes involved in fibrosis, like hypermethylated RASAL1 and use thereof in treatment of fibrosis as well as kit of parts for re-expression of hypermethylated genes including RASAL1 in a subject
EP3592853A1 (en) 2017-03-09 2020-01-15 President and Fellows of Harvard College Suppression of pain by gene editing
JP2020510439A (ja) 2017-03-10 2020-04-09 プレジデント アンド フェローズ オブ ハーバード カレッジ シトシンからグアニンへの塩基編集因子
WO2018170184A1 (en) 2017-03-14 2018-09-20 Editas Medicine, Inc. Systems and methods for the treatment of hemoglobinopathies
SG11201908658TA (en) 2017-03-23 2019-10-30 Harvard College Nucleobase editors comprising nucleic acid programmable dna binding proteins
CN108660161B (zh) * 2017-03-31 2023-05-09 中国科学院脑科学与智能技术卓越创新中心 基于CRISPR/Cas9技术的制备无嵌合基因敲除动物的方法
WO2018187779A1 (en) 2017-04-07 2018-10-11 Sage Science, Inc. Systems and methods for detection of genetic structural variation using integrated electrophoretic dna purification
WO2018195545A2 (en) 2017-04-21 2018-10-25 The General Hospital Corporation Variants of cpf1 (cas12a) with altered pam specificity
EP3612204A4 (en) 2017-04-21 2021-01-27 The General Hospital Corporation INDUCTIBLE, ADJUSTABLE AND MULTIPLEX HUMAN GENERATION CONTROL USING CRISPR-CPF1
WO2018201086A1 (en) 2017-04-28 2018-11-01 Editas Medicine, Inc. Methods and systems for analyzing guide rna molecules
EP3622070A2 (en) 2017-05-10 2020-03-18 Editas Medicine, Inc. Crispr/rna-guided nuclease systems and methods
US11560566B2 (en) 2017-05-12 2023-01-24 President And Fellows Of Harvard College Aptazyme-embedded guide RNAs for use with CRISPR-Cas9 in genome editing and transcriptional activation
CN110997728A (zh) 2017-05-25 2020-04-10 通用医疗公司 二分型碱基编辑器(bbe)结构和ii-型-cas9锌指编辑
EP3635102A1 (en) 2017-06-05 2020-04-15 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. B4galt1 variants and uses thereof
CN108977442B (zh) * 2017-06-05 2023-01-06 广州市锐博生物科技有限公司 用于dna编辑的系统及其应用
WO2018227114A1 (en) 2017-06-09 2018-12-13 Editas Medicine, Inc. Engineered cas9 nucleases
KR102634727B1 (ko) 2017-06-14 2024-02-07 위스콘신 얼럼나이 리서어치 화운데이션 변형된 가이드 rna, crispr-리보뉴클레오프로테인 복합체 및 사용 방법
AU2018283405A1 (en) 2017-06-15 2020-01-16 The Regents Of The University Of California Targeted non-viral DNA insertions
US10011849B1 (en) 2017-06-23 2018-07-03 Inscripta, Inc. Nucleic acid-guided nucleases
US9982279B1 (en) 2017-06-23 2018-05-29 Inscripta, Inc. Nucleic acid-guided nucleases
JP2020530307A (ja) 2017-06-30 2020-10-22 インティマ・バイオサイエンス，インコーポレーテッド 遺伝子治療のためのアデノ随伴ウイルスベクター
US20200140896A1 (en) 2017-06-30 2020-05-07 Novartis Ag Methods for the treatment of disease with gene editing systems
WO2019014230A1 (en) * 2017-07-11 2019-01-17 Sigma-Aldrich Co. Llc USE OF DOMAINS OF PROTEINS INTERACTING WITH NUCLEOSOMES TO IMPROVE THE TARGETED MODIFICATION OF THE GENOME
EP3652312A1 (en) 2017-07-14 2020-05-20 Editas Medicine, Inc. Systems and methods for targeted integration and genome editing and detection thereof using integrated priming sites
US11732274B2 (en) 2017-07-28 2023-08-22 President And Fellows Of Harvard College Methods and compositions for evolving base editors using phage-assisted continuous evolution (PACE)
SG11201912235PA (en) 2017-07-31 2020-01-30 Regeneron Pharma Cas-transgenic mouse embryonic stem cells and mice and uses thereof
MX2020001177A (es) 2017-07-31 2020-09-25 Regeneron Pharma Animales no humanos reporteros de crispr y usos de los mismos.
US20190032156A1 (en) 2017-07-31 2019-01-31 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Methods and compositions for assessing crispr/cas-induced recombination with an exogenous donor nucleic acid in vivo
US11897920B2 (en) 2017-08-04 2024-02-13 Peking University Tale RVD specifically recognizing DNA base modified by methylation and application thereof
EP3666898A4 (en) 2017-08-08 2021-03-24 Peking University GENE INACTIVATION PROCESS
WO2019040650A1 (en) 2017-08-23 2019-02-28 The General Hospital Corporation GENETICALLY MODIFIED CRISPR-CAS9 NUCLEASES HAVING MODIFIED PAM SPECIFICITY
US11319532B2 (en) 2017-08-30 2022-05-03 President And Fellows Of Harvard College High efficiency base editors comprising Gam
MX2020003589A (es) 2017-09-29 2020-07-22 Regeneron Pharma Animales no humanos que comprenden un locus ttr humanizado y metodos de uso.
EP3694993A4 (en) 2017-10-11 2021-10-13 The General Hospital Corporation METHOD OF DETECTING A SITE-SPECIFIC AND UNDESIRED GENOMIC DESAMINATION INDUCED BY BASE EDITING TECHNOLOGIES
CN111757937A (zh) 2017-10-16 2020-10-09 布罗德研究所股份有限公司 腺苷碱基编辑器的用途
CN107602707B (zh) * 2017-10-17 2021-04-23 湖北大学 一种特异性调节枯草芽孢杆菌外源基因表达的dcas9-ω融合蛋白及其应用
KR102503130B1 (ko) 2017-10-27 2023-02-24 더 리전트 오브 더 유니버시티 오브 캘리포니아 내인성 t 세포 수용체의 표적화된 대체
US20210180053A1 (en) 2017-11-01 2021-06-17 Novartis Ag Synthetic rnas and methods of use
WO2019099943A1 (en) 2017-11-16 2019-05-23 Astrazeneca Ab Compositions and methods for improving the efficacy of cas9-based knock-in strategies
CN111684069A (zh) * 2017-12-22 2020-09-18 G+Flas生命科学有限公司 嵌合基因组工程分子和方法
CN109504711A (zh) * 2018-02-14 2019-03-22 复旦大学 基于CRISPR/cas9和过氧化物酶APEX2系统识别分析特异性基因组位点相互作用DNA的方法
WO2019161340A1 (en) 2018-02-19 2019-08-22 Yale University Phosphopeptide-encoding oligonucleotide libraries and methods for detecting phosphorylation-dependent molecular interactions
CA3089331A1 (en) 2018-03-19 2019-09-26 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Transcription modulation in animals using crispr/cas systems
CA3096274A1 (en) 2018-04-06 2019-10-10 Children's Medical Center Corporation Compositions and methods for somatic cell reprogramming and modulating imprinting
JP7460539B2 (ja) 2018-04-17 2024-04-02 ザ ジェネラル ホスピタル コーポレイション 核酸を結合、修飾、および切断する物質の基質選択性および部位のためのｉｎ ｖｉｔｒｏでの高感度アッセイ
BR112020021229A2 (pt) 2018-04-19 2021-02-02 The Regents Of The University Of California composições e métodos para edição de genes
CN108588123A (zh) * 2018-05-07 2018-09-28 南京医科大学 CRISPR/Cas9载体组合在制备基因敲除猪的血液制品中的应用
EP3794130A4 (en) 2018-05-16 2022-07-27 Synthego Corporation METHODS AND SYSTEMS FOR DESIGN AND USE OF GUIDE RNA
US10227576B1 (en) 2018-06-13 2019-03-12 Caribou Biosciences, Inc. Engineered cascade components and cascade complexes
CN110592141B (zh) * 2018-06-13 2023-07-07 中国科学院上海有机化学研究所 用于调控基因编辑效率的化合物及其应用
JP2021530212A (ja) 2018-07-13 2021-11-11 ザ リージェンツ オブ ザ ユニバーシティ オブ カリフォルニアThe Regents Of The University Of California レトロトランスポゾンベースの送達媒体及びその使用方法
CN112703250A (zh) 2018-08-15 2021-04-23 齐默尔根公司 CRISPRi在高通量代谢工程中的应用
SG11202101801RA (en) 2018-08-23 2021-03-30 Sangamo Therapeutics Inc Engineered target specific base editors
US20210198642A1 (en) 2018-09-07 2021-07-01 Astrazeneca Ab Compositions and methods for improved nucleases
EP3861120A4 (en) 2018-10-01 2023-08-16 North Carolina State University RECOMBINANT TYPE I CRISPR-CAS SYSTEM
US11407995B1 (en) 2018-10-26 2022-08-09 Inari Agriculture Technology, Inc. RNA-guided nucleases and DNA binding proteins
US11434477B1 (en) 2018-11-02 2022-09-06 Inari Agriculture Technology, Inc. RNA-guided nucleases and DNA binding proteins
US11739320B2 (en) 2018-11-05 2023-08-29 Wisconsin Alumni Research Foundation Gene correction of Pompe disease and other autosomal recessive disorders via RNA-guided nucleases
EP3894550A4 (en) 2018-12-14 2023-01-04 Pioneer Hi-Bred International, Inc. NEW CRISPR-CAS SYSTEMS FOR GENOME EDITING
AU2019403015B2 (en) 2018-12-20 2024-01-18 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Nuclease-mediated repeat expansion
US20220106584A1 (en) 2019-01-14 2022-04-07 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) Methods and kits for generating and selecting a variant of a binding protein with increased binding affinity and/or specificity
EP3921417A4 (en) 2019-02-04 2022-11-09 The General Hospital Corporation ADENINE DNA BASE EDITOR VARIANTS WITH REDUCED OFF-TARGET RNA EDITING
US20220145330A1 (en) 2019-02-10 2022-05-12 The J. David Gladstone Institutes, a testamentary trust established under the Will of J. David Glads Modified mitochondrion and methods of use thereof
EP4219700A1 (en) 2019-03-07 2023-08-02 The Regents of the University of California Crispr-cas effector polypeptides and methods of use thereof
ES2970541T3 (es) 2019-03-18 2024-05-29 Regeneron Pharma Plataforma de cribado CRISPR/CAS para identificar modificadores genéticos de la siembra o agregación de tau
AU2020241856B2 (en) 2019-03-18 2024-06-27 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. CRISPR/Cas dropout screening platform to reveal genetic vulnerabilities associated with tau aggregation
DE112020001342T5 (de) 2019-03-19 2022-01-13 President and Fellows of Harvard College Verfahren und Zusammensetzungen zum Editing von Nukleotidsequenzen
KR20210148154A (ko) 2019-04-03 2021-12-07 리제너론 파마슈티칼스 인코포레이티드 세이프 하버 좌위 내로의 항체 코딩 서열의 삽입을 위한 방법 및 조성물
WO2020206134A1 (en) 2019-04-04 2020-10-08 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Methods for scarless introduction of targeted modifications into targeting vectors
CA3133360A1 (en) 2019-04-04 2020-10-08 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Non-human animals comprising a humanized coagulation factor 12 locus
JP2022528722A (ja) 2019-04-12 2022-06-15 アストラゼネカ・アクチエボラーグ 改善された遺伝子編集のための組成物及び方法
US11891618B2 (en) 2019-06-04 2024-02-06 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Mouse comprising a humanized TTR locus with a beta-slip mutation and methods of use
AU2020289581A1 (en) 2019-06-07 2021-11-18 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Non-human animals comprising a humanized albumin locus
JP2022536606A (ja) 2019-06-14 2022-08-18 リジェネロン・ファーマシューティカルズ・インコーポレイテッド タウオパチーのモデル
EP3783104A1 (en) * 2019-08-20 2021-02-24 Kemijski Institut Coiled-coil mediated tethering of crispr-cas and exonucleases for enhanced genome editing
CN114616002A (zh) 2019-09-13 2022-06-10 瑞泽恩制药公司 使用由脂质纳米颗粒递送的crispr/cas系统在动物中进行的转录调控
US11987791B2 (en) 2019-09-23 2024-05-21 Omega Therapeutics, Inc. Compositions and methods for modulating hepatocyte nuclear factor 4-alpha (HNF4α) gene expression
LT3812472T (lt) 2019-10-21 2023-03-10 Albert-Ludwigs-Universität Freiburg Objektyviai nešališkas tyrimas in vitro sąlygomis, skirtas vienos arba daugiau tikslinių programuojamų nukleazių ląstelėje nespecifinės sąveikos aktyvumui profiliuoti (abnoba-seq)
US11331333B2 (en) 2019-11-08 2022-05-17 Georg-August-Universität Göttingen Stiftung Öffentichen Rechts, Universitätsmadizin Treatment of aberrant fibroblast proliferation
IL292605A (en) 2019-11-08 2022-07-01 Regeneron Pharma CRISPR and AAV strategies for the treatment of x-linked childhood retinoschisis
WO2021108363A1 (en) 2019-11-25 2021-06-03 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Crispr/cas-mediated upregulation of humanized ttr allele
US20230042198A1 (en) * 2019-11-25 2023-02-09 La Jolla Institute For Immunology Methods and Compositions for Modulationg Heterochromatin Dysfunction, Genomic Instability, and Associate Conditions
EP4073249A1 (en) 2019-12-11 2022-10-19 Intellia Therapeutics, Inc. Modified guide rnas for gene editing
CN111088357B (zh) * 2019-12-31 2022-09-20 深圳大学 针对escc的肿瘤标志物及其应用
EP4093864A4 (en) * 2020-01-24 2024-04-10 The General Hospital Corporation UNCONSTRAINED GENOME TARGETING WITH GENETICALLY MODIFIED CRISPR-CAS9 VARIANTS NEARLY PAM-FREE
EP4093863A4 (en) * 2020-01-24 2024-04-10 The General Hospital Corporation CRISPR-CAS ENZYMES WITH IMPROVED ON-TARGET ACTIVITY
EP4114946A1 (en) 2020-03-04 2023-01-11 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Methods and compositions for sensitization of tumor cells to immune therapy
WO2021195079A1 (en) 2020-03-23 2021-09-30 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Non-human animals comprising a humanized ttr locus comprising a v30m mutation and methods of use
AU2021253959A1 (en) * 2020-04-09 2022-11-17 Verve Therapeutics, Inc. Base editing of PCSK9 and methods of using same for treatment of disease
WO2021224633A1 (en) 2020-05-06 2021-11-11 Orchard Therapeutics (Europe) Limited Treatment for neurodegenerative diseases
EP4146804A1 (en) 2020-05-08 2023-03-15 The Broad Institute Inc. Methods and compositions for simultaneous editing of both strands of a target double-stranded nucleotide sequence
US20230279438A1 (en) 2020-05-13 2023-09-07 Inserm (Institut National De La Santé Et La Recherche Médicale) Base editing approaches for the treatment of betahemoglobinopathies
WO2021246165A1 (ja) * 2020-06-03 2021-12-09 国立大学法人広島大学 Ｏａｓｉｓ遺伝子の脱メチル化のための核酸及びそれを用いた脱メチル化方法
WO2022008935A1 (en) 2020-07-10 2022-01-13 Horizon Discovery Limited Method for producing genetically modified cells
KR20230051223A (ko) 2020-08-11 2023-04-17 이슘 리서치 디벨롭먼트 컴퍼니 오브 더 히브루 유니버시티 오브 예루살렘, 엘티디. Wwox 연관 질병의 치료 방법
KR102674574B1 (ko) * 2020-09-02 2024-06-13 한국과학기술연구원 Cas9을 위한 신규 tracrRNA 시스템
JP2023549042A (ja) 2020-10-13 2023-11-22 サントル ナショナル ドゥ ラ ルシェルシュ シアンティフィック 接合およびｃｒｉｓｐｒ／ｃａｓシステムを組み合わせた標的抗菌性プラスミド並びにその使用
RU2762831C1 (ru) * 2020-10-26 2021-12-23 Федеральное государственное бюджетное научное учреждение "Всероссийский научно-исследовательский институт сельскохозяйственной биотехнологии" (ФГБНУ ВНИИСБ) Молекула рнк-проводника для геномного редактирования протомоторной области гена vrn-a1 однодольных зерновых с применением системы crispr/cas9
CN112430622A (zh) * 2020-10-26 2021-03-02 扬州大学 一种FokI和dCpf1融合蛋白表达载体及其介导的定点基因编辑方法
WO2022120022A1 (en) 2020-12-02 2022-06-09 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Crispr sam biosensor cell lines and methods of use thereof
KR20220082186A (ko) 2020-12-10 2022-06-17 한세준 유,무선 충전이 가능한 보조배터리형 uv-led살균기
WO2022148955A1 (en) 2021-01-05 2022-07-14 Horizon Discovery Limited Method for producing genetically modified cells
US20240052372A1 (en) 2021-02-25 2024-02-15 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) Allele-specific genome editing of the nr2e3 mutation g56r
KR20220124652A (ko) 2021-03-03 2022-09-14 중앙대학교 산학협력단 CRISPR/Cas9 시스템을 이용한 유전체 단일염기 편집 방법 및 이의 용도
CN113846019B (zh) * 2021-03-05 2023-08-01 海南师范大学 一种海洋微拟球藻靶向表观基因组遗传调控方法
EP4095243A1 (en) 2021-05-25 2022-11-30 European Molecular Biology Laboratory System for hybridization-based precision genome cleavage and editing, and uses thereof
JP2024518793A (ja) 2021-05-27 2024-05-02 アストラゼネカ・アクチエボラーグ 向上した安定性を有するｃａｓ９エフェクタータンパク質
TW202317764A (zh) 2021-06-10 2023-05-01 美商英特利亞醫療公司 用於基因編輯之包含內部連接子之經修飾引導rna
EP4377459A2 (en) 2021-07-30 2024-06-05 Tune Therapeutics, Inc. Compositions and methods for modulating expression of frataxin (fxn)
WO2023010135A1 (en) 2021-07-30 2023-02-02 Tune Therapeutics, Inc. Compositions and methods for modulating expression of methyl-cpg binding protein 2 (mecp2)
WO2023023635A1 (en) 2021-08-20 2023-02-23 Wisconsin Alumni Research Foundation Nonviral generation of genome edited chimeric antigen receptor t cells
WO2023039586A1 (en) 2021-09-10 2023-03-16 Agilent Technologies, Inc. Guide rnas with chemical modification for prime editing
WO2023052366A1 (en) 2021-09-28 2023-04-06 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) Base editing approaches for the treatment of beta-hemoglobinopathies
CN118119707A (zh) 2021-09-30 2024-05-31 阿斯利康(瑞典)有限公司 抑制剂增加CRISPR/Cas插入效率的用途
AU2022371414A1 (en) 2021-10-20 2024-05-02 University Of Copenhagen Isolated glial progenitor cells for use in the competition treatment of age-related white matter loss
CN118251491A (zh) 2021-10-28 2024-06-25 瑞泽恩制药公司 用于敲除C5的CRISPR/Cas相关方法及组合物
CA3237482A1 (en) 2021-11-03 2023-05-11 The J. David Gladstone Institutes, A Testamentary Trust Established Under The Will Of J. David Gladstone Precise genome editing using retrons
CA3237303A1 (en) 2021-11-03 2023-05-11 Intellia Therapeutics, Inc. Polynucleotides, compositions, and methods for genome editing
WO2023099591A1 (en) 2021-12-01 2023-06-08 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) Methods for increasing fetal hemoglobin content by editing the +55-kb region of the erythroid-specific bcl11a enhancer
WO2023108047A1 (en) 2021-12-08 2023-06-15 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Mutant myocilin disease model and uses thereof
US20230279442A1 (en) 2021-12-15 2023-09-07 Versitech Limited Engineered cas9-nucleases and method of use thereof
WO2023137471A1 (en) 2022-01-14 2023-07-20 Tune Therapeutics, Inc. Compositions, systems, and methods for programming t cell phenotypes through targeted gene activation
WO2023137472A2 (en) 2022-01-14 2023-07-20 Tune Therapeutics, Inc. Compositions, systems, and methods for programming t cell phenotypes through targeted gene repression
WO2023141487A1 (en) * 2022-01-20 2023-07-27 Inari Agriculture Technology, Inc. Improved soybean explant preparation and transformation
WO2023141602A2 (en) 2022-01-21 2023-07-27 Renagade Therapeutics Management Inc. Engineered retrons and methods of use
WO2023144104A1 (en) 2022-01-25 2023-08-03 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) Base editing approaches for the treatment of βeta-thalassemia
WO2023150620A1 (en) 2022-02-02 2023-08-10 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Crispr-mediated transgene insertion in neonatal cells
WO2023152351A1 (en) 2022-02-14 2023-08-17 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) Treatment of liver cancers by disrupting the beta-catenin/tcf-4 binding site located upstream of meg3 in the dlk1/dio3 locus
WO2023212677A2 (en) 2022-04-29 2023-11-02 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Identification of tissue-specific extragenic safe harbors for gene therapy approaches
WO2023220603A1 (en) 2022-05-09 2023-11-16 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Vectors and methods for in vivo antibody production
WO2023217888A1 (en) 2022-05-10 2023-11-16 Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale Base editing approaches for correcting the cd39 (cag>tag) mutation in patients suffering from βeta-thalassemia
WO2023235725A2 (en) 2022-05-31 2023-12-07 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Crispr-based therapeutics for c9orf72 repeat expansion disease
WO2023235726A2 (en) 2022-05-31 2023-12-07 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Crispr interference therapeutics for c9orf72 repeat expansion disease
WO2023250511A2 (en) 2022-06-24 2023-12-28 Tune Therapeutics, Inc. Compositions, systems, and methods for reducing low-density lipoprotein through targeted gene repression
WO2024015881A2 (en) 2022-07-12 2024-01-18 Tune Therapeutics, Inc. Compositions, systems, and methods for targeted transcriptional activation
WO2024020346A2 (en) 2022-07-18 2024-01-25 Renagade Therapeutics Management Inc. Gene editing components, systems, and methods of use
WO2024018056A1 (en) 2022-07-22 2024-01-25 Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale Base editing approaches for correcting the ivs2-1 (g>a) mutation in patients suffering from βeta-thalassemia
WO2024026474A1 (en) 2022-07-29 2024-02-01 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Compositions and methods for transferrin receptor (tfr)-mediated delivery to the brain and muscle
WO2024040254A2 (en) 2022-08-19 2024-02-22 Tune Therapeutics, Inc. Compositions, systems, and methods for regulation of hepatitis b virus through targeted gene repression
WO2024044723A1 (en) 2022-08-25 2024-02-29 Renagade Therapeutics Management Inc. Engineered retrons and methods of use
WO2024047247A1 (en) 2022-09-02 2024-03-07 Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale Base editing approaches for the treatment of amyotrophic lateral sclerosis
WO2024064642A2 (en) 2022-09-19 2024-03-28 Tune Therapeutics, Inc. Compositions, systems, and methods for modulating t cell function
WO2024073606A1 (en) 2022-09-28 2024-04-04 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Antibody resistant modified receptors to enhance cell-based therapies
WO2024084025A1 (en) 2022-10-21 2024-04-25 Keygene N.V. Rna transfection in plant cells with modified rna
US20240182561A1 (en) 2022-11-04 2024-06-06 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Calcium voltage-gated channel auxiliary subunit gamma 1 (cacng1) binding proteins and cacng1-mediated delivery to skeletal muscle
US20240173426A1 (en) 2022-11-14 2024-05-30 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Compositions and methods for fibroblast growth factor receptor 3-mediated delivery to astrocytes
CN115820603B (zh) * 2022-11-15 2024-07-05 吉林大学 一种基于dCasRx-NSUN6单基因特异性M5C修饰编辑方法
WO2024121354A1 (en) 2022-12-08 2024-06-13 Keygene N.V. Duplex sequencing with covalently closed dna ends
CN116376975B (zh) * 2023-02-27 2024-05-14 中国科学院脑科学与智能技术卓越创新中心 激活异染色质基因的方法及应用

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20070020627A1 (en) * 2002-06-11 2007-01-25 The Scripps Research Institute Artificial transcription factors
US20110236894A1 (en) * 2008-09-26 2011-09-29 Immune Disease Institute, Inc. Selective oxidation of 5-methylcytosine by tet-family proteins

Family Cites Families (139)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4603044A (en) 1983-01-06 1986-07-29 Technology Unlimited, Inc. Hepatocyte Directed Vesicle delivery system
US4957773A (en) 1989-02-13 1990-09-18 Syracuse University Deposition of boron-containing films from decaborane
US5436150A (en) 1992-04-03 1995-07-25 The Johns Hopkins University Functional domains in flavobacterium okeanokoities (foki) restriction endonuclease
JP4118327B2 (ja) 1994-08-20 2008-07-16 ゲンダック・リミテッド Ｄｎａ認識のための結合タンパク質におけるまたはそれに関連する改良
US6503717B2 (en) 1999-12-06 2003-01-07 Sangamo Biosciences, Inc. Methods of using randomized libraries of zinc finger proteins for the identification of gene function
US6534261B1 (en) 1999-01-12 2003-03-18 Sangamo Biosciences, Inc. Regulation of endogenous gene expression in cells using zinc finger proteins
US20020164575A1 (en) 1999-09-14 2002-11-07 Sangamo Biosciences, Inc., A Delaware Corporation Gene identification
DE60126483T2 (de) 2000-04-28 2007-12-06 Sangamo BioSciences, Inc., Richmond Gezielte Modifikation der Chromatinstruktur
AU2001257331A1 (en) 2000-04-28 2001-11-12 Sangamo Biosciences, Inc. Methods for designing exogenous regulatory molecules
US20030198627A1 (en) 2001-09-01 2003-10-23 Gert-Jan Arts siRNA knockout assay method and constructs
WO2003072788A1 (en) 2002-02-21 2003-09-04 The Wistar Institute Of Anatomy And Biology Methods and compositions for reversibly controlling expression of target genes in cells
WO2004099366A2 (en) 2002-10-23 2004-11-18 The General Hospital Corporation Context sensitive parallel optimization of zinc finger dna binding domains
US7021555B2 (en) 2004-01-06 2006-04-04 Zoo Med Laboratories, Inc. Spraying/misting for plants and animals
US7919277B2 (en) 2004-04-28 2011-04-05 Danisco A/S Detection and typing of bacterial strains
US20080131962A1 (en) 2006-05-25 2008-06-05 Sangamo Biosciences, Inc. Engineered cleavage half-domains
AU2006214064B2 (en) 2005-02-18 2012-04-26 J. Craig Venter Institute, Inc. Proteins and nucleic acids from meningitis/sepsis-associated escherichia coli
US20100055793A1 (en) * 2005-07-25 2010-03-04 Johns Hopkins University Site-specific modification of the human genome using custom-designed zinc finger nucleases
SG10201508995QA (en) 2005-07-26 2015-11-27 Sangamo Biosciences Inc Targeted integration and expression of exogenous nucleic acid sequences
EP2325332B1 (en) 2005-08-26 2012-10-31 DuPont Nutrition Biosciences ApS Use of CRISPR associated genes (CAS)
DK2426220T3 (en) 2006-05-19 2016-09-26 Dupont Nutrition Biosci Aps Labeled microorganisms, and methods for labeling
ES2610811T3 (es) 2006-06-16 2017-05-03 Dupont Nutrition Biosciences Aps Bacteria Streptococcus thermophilus
US9201063B2 (en) 2006-11-16 2015-12-01 General Electric Company Sequential analysis of biological samples
WO2008093152A1 (en) * 2007-02-01 2008-08-07 Cellectis Obligate heterodimer meganucleases and uses thereof
DK2126130T3 (en) 2007-03-02 2015-06-29 Dupont Nutrition Biosci Aps CULTURES WITH IMPROVED phage resistance
US8153863B2 (en) 2007-03-23 2012-04-10 New York University Transgenic plants expressing GLK1 and CCA1 having increased nitrogen assimilation capacity
JP5258874B2 (ja) 2007-04-10 2013-08-07 キアゲン ゲゼルシャフト ミット ベシュレンクテル ハフツング Ｒｎａ干渉タグ
WO2008151032A2 (en) 2007-05-31 2008-12-11 Washington University In St. Louis Arrays and methods comprising m. smithii gene products
CA2700162C (en) 2007-09-25 2018-08-14 Pastoral Greenhouse Gas Research Ltd Cell-permeabilising peptides and polypeptides for microbial cells
FR2925918A1 (fr) 2007-12-28 2009-07-03 Pasteur Institut Typage et sous-typage moleculaire de salmonella par identification des sequences nucleotidiques variables des loci crispr
FR2930264B1 (fr) 2008-04-18 2013-02-22 Gervais Danone Sa Nouvelle souche de lactobacillus paracasei subsp. paracasei dotee de proprietes antimicrobiennes et immunomodulatrices.
JP2010017178A (ja) 2008-06-11 2010-01-28 Sumitomo Chemical Co Ltd Ｄｎａを定量又は検出する方法
JP2010017179A (ja) 2008-06-11 2010-01-28 Sumitomo Chemical Co Ltd Ｄｎａを定量又は検出する方法
WO2010011961A2 (en) 2008-07-25 2010-01-28 University Of Georgia Research Foundation, Inc. Prokaryotic rnai-like system and methods of use
JP2010068800A (ja) 2008-08-19 2010-04-02 Sumitomo Chemical Co Ltd Ｄｎａを定量又は検出する方法
JP2010048566A (ja) 2008-08-19 2010-03-04 Sumitomo Chemical Co Ltd Ｄｎａを定量又は検出する方法
US20100076057A1 (en) 2008-09-23 2010-03-25 Northwestern University TARGET DNA INTERFERENCE WITH crRNA
WO2010046648A2 (en) 2008-10-21 2010-04-29 Animal Health Trust Diagnostic test for streptococcus equi
WO2010054108A2 (en) 2008-11-06 2010-05-14 University Of Georgia Research Foundation, Inc. Cas6 polypeptides and methods of use
RU2570562C2 (ru) 2008-11-07 2015-12-10 ДюПон НЬЮТРИШН БАЙОСАЙЕНСИЗ АпС Последовательности crispr бифидобактерий
CA2852487C (en) 2008-11-11 2017-01-31 Alimentary Health Limited Bifidobacterium longum strain ah1714
GB2466177A (en) 2008-12-03 2010-06-16 Arab Science & Technology Found Bacteriophage selection and breeding
WO2010066907A1 (en) 2008-12-12 2010-06-17 Danisco A/S Genetic cluster of strains of streptococcus thermophilus having unique rheological properties for dairy fermentation
KR20100093626A (ko) 2009-02-17 2010-08-26 서강대학교산학협력단 슈도모나스 애루지노사에 대한 파아지 치료
AU2010245304B2 (en) 2009-04-27 2015-06-04 Pacific Biosciences Of California, Inc. Real-time sequencing methods and systems
US8609421B2 (en) 2009-06-12 2013-12-17 Pacific Biosciences Of California, Inc. Single-molecule real-time analysis of protein synthesis
US20120178647A1 (en) 2009-08-03 2012-07-12 The General Hospital Corporation Engineering of zinc finger arrays by context-dependent assembly
EP2480674A1 (en) 2009-09-25 2012-08-01 BASF Plant Science Company GmbH Plants having enhanced yield-related traits and a method for making the same
US9677125B2 (en) 2009-10-21 2017-06-13 General Electric Company Detection of plurality of targets in biological samples
US20110269119A1 (en) 2009-10-30 2011-11-03 Synthetic Genomics, Inc. Encoding text into nucleic acid sequences
US8962281B2 (en) 2010-02-08 2015-02-24 Sangamo Biosciences, Inc. Engineered cleavage half-domains
WO2011101696A1 (en) * 2010-02-18 2011-08-25 Cellectis Improved meganuclease recombination system
US20120027786A1 (en) 2010-02-23 2012-02-02 Massachusetts Institute Of Technology Genetically programmable pathogen sense and destroy
US10087431B2 (en) 2010-03-10 2018-10-02 The Regents Of The University Of California Methods of generating nucleic acid fragments
EP2545161B1 (en) 2010-03-12 2015-09-23 Brookhaven Science Associates, LLC Method of using enterobacter sp. 638
EP2569425B1 (en) 2010-05-10 2016-07-06 The Regents of The University of California Endoribonuclease compositions and methods of use thereof
WO2011159369A1 (en) 2010-06-14 2011-12-22 Iowa State University Research Foundation, Inc. Nuclease activity of tal effector and foki fusion protein
NZ607870A (en) 2010-10-20 2015-09-25 Dupont Nutrition Biosci Aps Lactococcus crispr-cas sequences
JP2013544082A (ja) 2010-10-27 2013-12-12 セレクティス 二本鎖破断−誘導変異誘発の効率を増大させる方法
KR101556359B1 (ko) 2011-01-03 2015-10-01 주식회사 툴젠 디자인된 tal 이펙터 뉴클레아제를 통한 게놈 엔지니어링
WO2012097353A1 (en) 2011-01-14 2012-07-19 Life Technologies Corporation Methods, compositions, and kits for detecting rare cells
US20140113376A1 (en) 2011-06-01 2014-04-24 Rotem Sorek Compositions and methods for downregulating prokaryotic genes
EP2543255B2 (en) 2011-07-04 2022-12-28 DSM IP Assets B.V. Anti-listerial mixed culture and method for producing cheese
EP3461896B1 (en) 2011-07-15 2023-11-29 The General Hospital Corporation Methods of transcription activator like effector assembly
GB201122458D0 (en) 2011-12-30 2012-02-08 Univ Wageningen Modified cascade ribonucleoproteins and uses thereof
DK2836226T3 (en) 2012-02-24 2017-09-18 Hutchinson Fred Cancer Res COMPOSITIONS AND PROCEDURES FOR TREATING HEMOGLOBINOPATHY
AU2013225950B2 (en) 2012-02-29 2018-02-15 Sangamo Therapeutics, Inc. Methods and compositions for treating huntington's disease
WO2013141680A1 (en) 2012-03-20 2013-09-26 Vilnius University RNA-DIRECTED DNA CLEAVAGE BY THE Cas9-crRNA COMPLEX
US9637739B2 (en) 2012-03-20 2017-05-02 Vilnius University RNA-directed DNA cleavage by the Cas9-crRNA complex
JP6352250B2 (ja) 2012-05-02 2018-07-04 ダウ アグロサイエンシィズ エルエルシー リンゴ酸デヒドロゲナーゼの標的改変
AU2013259647B2 (en) 2012-05-07 2018-11-08 Corteva Agriscience Llc Methods and compositions for nuclease-mediated targeted integration of transgenes
US11120889B2 (en) 2012-05-09 2021-09-14 Georgia Tech Research Corporation Method for synthesizing a nuclease with reduced off-site cleavage
DK3401400T3 (da) * 2012-05-25 2019-06-03 Univ California Fremgangsmåder og sammensætninger til rna-styret mål-dna-modifikation og til rna-styret transskriptionsmodulering
US9102936B2 (en) 2012-06-11 2015-08-11 Agilent Technologies, Inc. Method of adaptor-dimer subtraction using a CRISPR CAS6 protein
EP2674501A1 (en) 2012-06-14 2013-12-18 Agence nationale de sécurité sanitaire de l'alimentation,de l'environnement et du travail Method for detecting and identifying enterohemorrhagic Escherichia coli
US10025647B2 (en) * 2012-06-30 2018-07-17 Intel Corporation Memory poisoning with hints
JP2015527889A (ja) 2012-07-25 2015-09-24 ザ ブロード インスティテュート， インコーポレイテッド 誘導可能なｄｎａ結合タンパク質およびゲノム撹乱ツール、ならびにそれらの適用
CN104823055B (zh) 2012-10-09 2017-12-05 力保科学公司 支链氨基酸的nmr定量
EP2906602B1 (en) 2012-10-12 2019-01-16 The General Hospital Corporation Transcription activator-like effector (tale) - lysine-specific demethylase 1 (lsd1) fusion proteins
US20150315576A1 (en) 2012-11-01 2015-11-05 Massachusetts Institute Of Technology Genetic device for the controlled destruction of dna
JP6620018B2 (ja) 2012-12-06 2019-12-11 シグマ−アルドリッチ・カンパニー・リミテッド・ライアビリティ・カンパニーＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ Ｃｏ．， ＬＬＣ Ｃｒｉｓｐｒに基づくゲノム修飾および制御
US20140186843A1 (en) 2012-12-12 2014-07-03 Massachusetts Institute Of Technology Methods, systems, and apparatus for identifying target sequences for cas enzymes or crispr-cas systems for target sequences and conveying results thereof
MX2015007550A (es) 2012-12-12 2017-02-02 Broad Inst Inc Suministro, modificación y optimización de sistemas, métodos y composiciones para la manipulación de secuencias y aplicaciones terapéuticas.
PT2896697E (pt) 2012-12-12 2015-12-31 Massachusetts Inst Technology Engenharia de sistemas, métodos e composições guia otimizadas para a manipulação de sequências
WO2014093709A1 (en) 2012-12-12 2014-06-19 The Broad Institute, Inc. Methods, models, systems, and apparatus for identifying target sequences for cas enzymes or crispr-cas systems for target sequences and conveying results thereof
US8993233B2 (en) 2012-12-12 2015-03-31 The Broad Institute Inc. Engineering and optimization of systems, methods and compositions for sequence manipulation with functional domains
CN105658796B (zh) 2012-12-12 2021-10-26 布罗德研究所有限公司 用于序列操纵的crispr-cas组分系统、方法以及组合物
PT2898075E (pt) 2012-12-12 2016-06-16 Harvard College Manipulação e otimização de sistemas, métodos e composições de enzima melhorados para manipulação de sequências
WO2014093694A1 (en) 2012-12-12 2014-06-19 The Broad Institute, Inc. Crispr-cas nickase systems, methods and compositions for sequence manipulation in eukaryotes
WO2014093701A1 (en) 2012-12-12 2014-06-19 The Broad Institute, Inc. Functional genomics using crispr-cas systems, compositions, methods, knock out libraries and applications thereof
US8697359B1 (en) 2012-12-12 2014-04-15 The Broad Institute, Inc. CRISPR-Cas systems and methods for altering expression of gene products
RU2678001C2 (ru) 2012-12-13 2019-01-22 ДАУ АГРОСАЙЕНСИЗ ЭлЭлСи Способы обнаружения днк для сайт-специфической нуклеазной активности
EP3553174A1 (en) 2012-12-17 2019-10-16 President and Fellows of Harvard College Rna-guided human genome engineering
AR094098A1 (es) * 2012-12-19 2015-07-08 Dow Agrosciences Llc Transformacion de soja mejorada para una produccion eficaz de eventos transgenicos de alto rendimiento
CN105142396A (zh) 2013-01-14 2015-12-09 重组股份有限公司 缺角家畜
US20140212869A1 (en) 2013-01-25 2014-07-31 Agilent Technologies, Inc. Nucleic Acid Proximity Assay Involving the Formation of a Three-way junction
CN103233028B (zh) 2013-01-25 2015-05-13 南京徇齐生物技术有限公司 一种无物种限制无生物安全性问题的真核生物基因打靶方法及螺旋结构dna序列
WO2014124226A1 (en) 2013-02-07 2014-08-14 The Rockefeller University Sequence specific antimicrobials
EP3623463B1 (en) 2013-02-07 2021-10-20 The General Hospital Corporation Tale transcriptional activators
WO2014127287A1 (en) 2013-02-14 2014-08-21 Massachusetts Institute Of Technology Method for in vivo tergated mutagenesis
CA2901676C (en) 2013-02-25 2023-08-22 Sangamo Biosciences, Inc. Methods and compositions for enhancing nuclease-mediated gene disruption
EP2922393B2 (en) 2013-02-27 2022-12-28 Helmholtz Zentrum München - Deutsches Forschungszentrum für Gesundheit und Umwelt (GmbH) Gene editing in the oocyte by cas9 nucleases
AU2014224432B2 (en) 2013-03-08 2019-10-24 Oxford Nanopore Technologies Limited Enzyme stalling method
WO2014143381A1 (en) 2013-03-09 2014-09-18 Agilent Technologies, Inc. Methods of in vivo engineering of large sequences using multiple crispr/cas selections of recombineering events
EP2971167B1 (en) 2013-03-14 2019-07-31 Caribou Biosciences, Inc. Compositions and methods of nucleic acid-targeting nucleic acids
CA2906747A1 (en) 2013-03-15 2014-09-18 Regents Of The University Of Minnesota Engineering plant genomes using crispr/cas systems
US11332719B2 (en) 2013-03-15 2022-05-17 The Broad Institute, Inc. Recombinant virus and preparations thereof
US20140273230A1 (en) 2013-03-15 2014-09-18 Sigma-Aldrich Co., Llc Crispr-based genome modification and regulation
CA2907198C (en) 2013-03-15 2019-12-10 The General Hospital Corporation Using rna-guided foki nucleases (rfns) to increase specificity for rna-guided genome editing
US9234213B2 (en) 2013-03-15 2016-01-12 System Biosciences, Llc Compositions and methods directed to CRISPR/Cas genomic engineering systems
US10760064B2 (en) 2013-03-15 2020-09-01 The General Hospital Corporation RNA-guided targeting of genetic and epigenomic regulatory proteins to specific genomic loci
US20140349400A1 (en) 2013-03-15 2014-11-27 Massachusetts Institute Of Technology Programmable Modification of DNA
WO2014204578A1 (en) 2013-06-21 2014-12-24 The General Hospital Corporation Using rna-guided foki nucleases (rfns) to increase specificity for rna-guided genome editing
CA2908512C (en) 2013-04-05 2023-10-24 Dow Agrosciences Llc Methods and compositions for integration of an exogenous sequence within the genome of plants
US20150056629A1 (en) 2013-04-14 2015-02-26 Katriona Guthrie-Honea Compositions, systems, and methods for detecting a DNA sequence
CN111500630A (zh) 2013-04-16 2020-08-07 瑞泽恩制药公司 大鼠基因组的靶向修饰
CN103224947B (zh) 2013-04-28 2015-06-10 陕西师范大学 一种基因打靶系统
US10604771B2 (en) 2013-05-10 2020-03-31 Sangamo Therapeutics, Inc. Delivery methods and compositions for nuclease-mediated genome engineering
US9873907B2 (en) 2013-05-29 2018-01-23 Agilent Technologies, Inc. Method for fragmenting genomic DNA using CAS9
US20150067922A1 (en) 2013-05-30 2015-03-05 The Penn State Research Foundation Gene targeting and genetic modification of plants via rna-guided genome editing
EP3011029B1 (en) 2013-06-17 2019-12-11 The Broad Institute, Inc. Delivery, engineering and optimization of tandem guide systems, methods and compositions for sequence manipulation
CN103343120B (zh) 2013-07-04 2015-03-04 中国科学院遗传与发育生物学研究所 一种小麦基因组定点改造方法
EP3022304B1 (en) 2013-07-19 2018-12-26 Larix Biosciences LLC Methods and compositions for producing double allele knock outs
US20150044772A1 (en) 2013-08-09 2015-02-12 Sage Labs, Inc. Crispr/cas system-based novel fusion protein and its applications in genome editing
AU2014312123A1 (en) 2013-08-29 2016-03-17 Temple University Of The Commonwealth System Of Higher Education Methods and compositions for RNA-guided treatment of HIV infection
US9322037B2 (en) 2013-09-06 2016-04-26 President And Fellows Of Harvard College Cas9-FokI fusion proteins and uses thereof
US9074199B1 (en) 2013-11-19 2015-07-07 President And Fellows Of Harvard College Mutant Cas9 proteins
US9546384B2 (en) 2013-12-11 2017-01-17 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Methods and compositions for the targeted modification of a mouse genome
WO2015089364A1 (en) 2013-12-12 2015-06-18 The Broad Institute Inc. Crystal structure of a crispr-cas system, and uses thereof
WO2015089419A2 (en) 2013-12-12 2015-06-18 The Broad Institute Inc. Delivery, use and therapeutic applications of the crispr-cas systems and compositions for targeting disorders and diseases using particle delivery components
US20150191744A1 (en) 2013-12-17 2015-07-09 University Of Massachusetts Cas9 effector-mediated regulation of transcription, differentiation and gene editing/labeling
EP3985124A1 (en) 2013-12-26 2022-04-20 The General Hospital Corporation Multiplex guide rnas
EP3105327A4 (en) 2014-02-12 2017-10-18 Thomas Jefferson University Compositions and methods of using microrna inhibitors
DK3116997T3 (da) 2014-03-10 2019-08-19 Editas Medicine Inc Crispr/cas-relaterede fremgangsmåder og sammensætninger til behandling af lebers kongenitale amaurose 10 (lca10)
CN106170550A (zh) 2014-04-03 2016-11-30 麻省理工学院 用于产生导引rna的方法和组合物
MA41349A (fr) 2015-01-14 2017-11-21 Univ Temple Éradication de l'herpès simplex de type i et d'autres virus de l'herpès associés guidée par arn
HRP20231022T1 (hr) 2015-01-28 2023-12-08 Caribou Biosciences, Inc. Hibridni polinukleotidi crispr dna/rna i načini uporabe
CA2978314A1 (en) 2015-03-03 2016-09-09 The General Hospital Corporation Engineered crispr-cas9 nucleases with altered pam specificity
US9512446B1 (en) 2015-08-28 2016-12-06 The General Hospital Corporation Engineered CRISPR-Cas9 nucleases
US9926546B2 (en) 2015-08-28 2018-03-27 The General Hospital Corporation Engineered CRISPR-Cas9 nucleases

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20070020627A1 (en) * 2002-06-11 2007-01-25 The Scripps Research Institute Artificial transcription factors
US20110236894A1 (en) * 2008-09-26 2011-09-29 Immune Disease Institute, Inc. Selective oxidation of 5-methylcytosine by tet-family proteins

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Cell, Vol.152, pp.1173-1183 (2013.02.28) 1부.* *

Also Published As

Publication number Publication date
CN105247066B (zh) 2020-10-20
WO2014144592A2 (en) 2014-09-18
EP3467125A1 (en) 2019-04-10
CA3161835A1 (en) 2014-09-25
KR20150131251A (ko) 2015-11-24
US20210130850A1 (en) 2021-05-06
CA2906724A1 (en) 2014-09-18
EP3744842A1 (en) 2020-12-02
JP2020120661A (ja) 2020-08-13
CA2906553A1 (en) 2014-09-25
EP2970986A2 (en) 2016-01-20
WO2014144592A3 (en) 2014-12-31
EP3865586A1 (en) 2021-08-18
JP7379572B2 (ja) 2023-11-14
US11168338B2 (en) 2021-11-09
AU2020207840A1 (en) 2020-08-13
KR20220080012A (ko) 2022-06-14
BR112015023489A2 (pt) 2017-10-10
AU2020201465B2 (en) 2022-05-12
EP3741868B1 (en) 2024-05-22
EP2971125A4 (en) 2016-08-24
AU2014228981A1 (en) 2015-10-01
AU2021203370B2 (en) 2023-07-27
IL289396B2 (en) 2023-12-01
IL241671B (en) 2022-03-01
AU2020207840B2 (en) 2022-07-21
US20170152508A1 (en) 2017-06-01
CA2907198A1 (en) 2014-09-18
JP7053706B2 (ja) 2022-04-12
EP2971125B1 (en) 2020-05-06
US11920152B2 (en) 2024-03-05
WO2014144761A3 (en) 2015-10-29
EP3741868A1 (en) 2020-11-25
CN113563476A (zh) 2021-10-29
JP6622183B2 (ja) 2019-12-18
US20220090145A1 (en) 2022-03-24
KR20210013304A (ko) 2021-02-03
AU2014228981B2 (en) 2019-11-28
JP2021118726A (ja) 2021-08-12
JP2023061983A (ja) 2023-05-02
AU2020201465A1 (en) 2020-03-19
EP2970208A2 (en) 2016-01-20
ES2713503T3 (es) 2019-05-22
EP2970986B1 (en) 2020-05-06
EP2971041B1 (en) 2018-11-28
EP2971041A4 (en) 2016-09-07
EP2971125A2 (en) 2016-01-20
CN112301024A (zh) 2021-02-02
AU2014239665A1 (en) 2015-10-01
US20180208921A1 (en) 2018-07-26
US20160010076A1 (en) 2016-01-14
JP2024012446A (ja) 2024-01-30
KR102271291B1 (ko) 2021-07-02
CA2906553C (en) 2022-08-02
US10844403B2 (en) 2020-11-24
JP2021192624A (ja) 2021-12-23
EP3988667A1 (en) 2022-04-27
AU2022252788A1 (en) 2022-11-03
EP3467125B1 (en) 2023-08-30
KR20210013303A (ko) 2021-02-03
US11634731B2 (en) 2023-04-25
CN105408497A (zh) 2016-03-16
US20160024524A1 (en) 2016-01-28
JP2016512264A (ja) 2016-04-25
CA2907198C (en) 2019-12-10
AU2017204909A1 (en) 2017-08-31
EP2970986A4 (en) 2016-09-07
WO2014152432A2 (en) 2014-09-25
JP6657069B2 (ja) 2020-03-04
JP6878554B2 (ja) 2021-05-26
IL289396A (en) 2022-02-01
IL289396B1 (en) 2023-08-01
EP2971041A1 (en) 2016-01-20
EP2971125B2 (en) 2023-11-22
CN105408497B (zh) 2019-09-13
US10415059B2 (en) 2019-09-17
US10138476B2 (en) 2018-11-27
KR102210319B1 (ko) 2021-02-01
KR102210323B1 (ko) 2021-02-01
JP6980380B2 (ja) 2021-12-15
JP7126588B2 (ja) 2022-08-26
ZA201506814B (en) 2018-11-28
AU2014227653A2 (en) 2015-11-12
KR102210322B1 (ko) 2021-02-01
US20170327805A1 (en) 2017-11-16
AU2014227653B2 (en) 2017-04-20
JP2022106710A (ja) 2022-07-20
KR102602047B1 (ko) 2023-11-15
AU2019204675A1 (en) 2019-07-18
KR102405549B1 (ko) 2022-06-08
WO2014144288A1 (en) 2014-09-18
AU2017204909B2 (en) 2019-04-04
KR20210013302A (ko) 2021-02-03
AU2019204675B2 (en) 2021-03-11
KR102271292B1 (ko) 2021-07-02
AU2014227653A1 (en) 2015-10-01
US20180340189A1 (en) 2018-11-29
EP2970208A4 (en) 2016-11-30
WO2014152432A3 (en) 2015-10-29
JP2016512691A (ja) 2016-05-09
JP2020031637A (ja) 2020-03-05
US20190376090A1 (en) 2019-12-12
US9885033B2 (en) 2018-02-06
CN105247066A (zh) 2016-01-13
CN110540991A (zh) 2019-12-06
CN110540991B (zh) 2023-10-24
BR112015023489B1 (pt) 2022-06-07
CN105408483A (zh) 2016-03-16
US20200071730A1 (en) 2020-03-05
AU2014239665B2 (en) 2020-04-30
US9567604B2 (en) 2017-02-14
AU2022209254A1 (en) 2022-08-18
JP6960438B2 (ja) 2021-11-05
US20140295556A1 (en) 2014-10-02
US10119133B2 (en) 2018-11-06
AU2021203370A1 (en) 2021-06-24
US10544433B2 (en) 2020-01-28
US20200224222A1 (en) 2020-07-16
JP2020039350A (ja) 2020-03-19
US20160024523A1 (en) 2016-01-28
WO2014144761A2 (en) 2014-09-18
KR20230157540A (ko) 2023-11-16
US10378027B2 (en) 2019-08-13
US11098326B2 (en) 2021-08-24
JP2016517276A (ja) 2016-06-16
US9567603B2 (en) 2017-02-14
US20140295557A1 (en) 2014-10-02
KR20150131250A (ko) 2015-11-24
US20230407341A1 (en) 2023-12-21

Similar Documents

Publication Publication Date Title
KR102210322B1 (ko) Rna-안내 게놈 편집의 특이성을 증가시키기 위한 rna-안내 foki 뉴클레아제(rfn)의 용도
KR102598856B1 (ko) 변경된 PAM 특이성을 갖는 조작된 CRISPR-Cas9 뉴클레아제
EP3004339B1 (en) New compact scaffold of cas9 in the type ii crispr system
US10011850B2 (en) Using RNA-guided FokI Nucleases (RFNs) to increase specificity for RNA-Guided Genome Editing
KR102647766B1 (ko) 클래스 ii, 타입 v crispr 시스템
KR20190059966A (ko) Ｓ. 피오게네스 ｃａｓ９ 돌연변이 유전자 및 이에 의해 암호화되는 폴리펩티드
Class et al. Patent application title: NEW COMPACT SCAFFOLD OF CAS9 IN THE TYPE II CRISPR SYSTEM Inventors: Philippe Duchateau (Draveil, FR) Philippe Duchateau (Draveil, FR) Claudia Bertonati (Paris, FR)

Legal Events

Date Code Title Description
A201 Request for examination
E902 Notification of reason for refusal
E701 Decision to grant or registration of patent right
A107 Divisional application of patent
GRNT Written decision to grant