JP2023549042A

JP2023549042A - 接合およびｃｒｉｓｐｒ／ｃａｓシステムを組み合わせた標的抗菌性プラスミド並びにその使用

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Publication number: JP2023549042A
Application number: JP2023522380A
Authority: JP
Inventors: レステルラン，クリスチャン; ビゴ，サラ
Original assignee: Centre National de la Recherche Scientifique CNRS
Current assignee: Centre National de la Recherche Scientifique CNRS
Priority date: 2020-10-13
Filing date: 2021-10-12
Publication date: 2023-11-22
Also published as: EP4229199A1; CN116391040A; WO2022079020A1; KR20230082676A; US20240016855A1

Abstract

薬剤耐性菌の出現は、抗生物質の効力を失わせ、現在利用可能な処置の成功を制限する。本発明者らは、株特異的な抗菌活性を発揮するＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムを送達するために細菌接合を使用する標的抗菌性プラスミド（ＴＡＰ）に基づく革新的な方策を開発した。ＴＡＰは、適切な標的スペーサー配列を同定するカスタムアルゴリズム（ＣＳＴＢ）を使用して、任意の特定のゲノムまたはプラスミドＤＮＡを対象とすることができるため、極めて汎用性がある。本発明者らは、ＴＡＰが標的ゲノムに致死性ＤＳＢを導入することによって株選択的な殺傷を誘導する能力を実証している。プラスミド保有カルバペネム耐性遺伝子を対象とするＴＡＰは、効果的に株を薬剤に再感作させる。この研究は、他の非標的細菌群に影響を与えることなく、標的の耐性菌および／または病原菌を根絶するために使用できる、抗生物質処置の代替物の開発に向けた重要なステップに相当する。【選択図】なし

Description

本発明は、細菌学および医学の分野のものである。

薬剤耐性菌の世界的な増殖により、今後数十年に治療失敗による人の死亡の著しい増加を引き起こすことが予測されている。菌耐性が絶えず生じ、現在は抗生物質の発見率が低いことから、実際に抗生物質の使用の代わりに相当する革新的な抗菌の方策を開発する必要性が強調されている。また、抗生物質は一般に、細菌の増殖に不可欠な基本的なプロセスを標的としているので、特異性に欠ける。その結果、抗生物質は、不要な株と共生株とを区別することなく、処置される細菌群全体に影響を与え、また、薬剤耐性株の増殖を選択することにもなる。近年の報告において、規則的な間隔をもってクラスター化された短鎖反復回文配列（ＣＲＩＳＰＲ）および関連するＣａｓタンパク質の使用によって、特異的な抗菌活性をなす可能性が実証されている。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムは、Ｃａｓ９ヌクレアーゼによる染色体への二本鎖切断（ＤＳＢ）の誘導により、細菌の殺傷を行うことができる（Ｊｉｎｅｋｅｔａｌ２０１２，ＰＭＩＤ２２７４５２４９；Ｇａｓｉｕｎａｓｅｔａｌ２０１２，ＰＭＩＤ２２９４９６７１）。また、触媒不能Ｃａｓ９酵素（ｄＣａｓ９）を使用するとき、ＣＲＩＳＰＲ干渉（ＣＲＩＳＰＲｉ）により、特定の遺伝子の発現を阻害することもできる（Ｑｉｅｔａｌ２０１３；Ｂｉｋａｒｄｅｔａｌ２０１３；ＰＭＩＤ２３４５２８６０ＰＭＩＤ２３７６１４３７）。ＣＲＩＳＰＲ標的化は、約１６～２０個のヌクレオチドの標的特異的ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）配列に基づき、これによりＣａｓヌクレアーゼを相補的ＤＮＡ配列に動員することができる（Ｊｉｎｅｋｅｔａｌ２０１２；Ａｎｄｅｒｓｅｔａｌ２０１４；ＰＭＩＤ２２７４５２４９ＰＭＩＤ２５０７９３１８）。ＣＲＩＳＰＲ標的化は、特にオフターゲット活性が制限される細菌において、極めて特異的であるしかし、実用的な抗菌性ツールとして使用するためには、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ遺伝子を標的細菌に送達する必要がある。細菌ＤＮＡ接合は、長いＤＮＡセグメントを様々な細菌種に伝達する可能性をまさに示している（伝達特異性は考えられる接合システムの宿主範囲に依存する）。

本発明は特許請求の範囲によって規定される。特に、本発明は、標的抗菌性プラスミドおよび特に治療目的のためのその使用に関する。

図１ａ－ｅは、Ｆプラスミド機構によるＴＡＰの伝達が標的のＥ．ｃｏｌｉ株の殺傷を媒介することを示す。（ａ）ＴＡＰモジュールは、弱い恒常的プロモーターＢＢａ＿Ｊ２３１０７から発現される野生型（ｃａｓ９）または触媒不能のｃａｓ９（ｄｃａｓ９）遺伝子、および強い恒常的プロモーターＢａ＿Ｊ２３１１９から発現されるｇＲＮＡモジュールから構成されるＣＲＩＳＰＲシステム、Ｆプラスミドの伝達起点（ｏｒｉＴ_Ｆ）、ｐＢＢＲ１の複製起点（ｏｒｉＶ）、ならびに一式の耐性カセット（Ａｐ：アンピシリン、Ｋｎ：カナマイシン、Ｃｍ：クロラムフェニコール、Ｓｔ：ストレプトマイシン、Ｇｍ：ゲンタマイシン）、広範な宿主範囲の合成ＢｉｏＦａｂプロモーターから高度に発現されるｓｆｇｆｐまたはｍｃｈｅｒｒｙ遺伝子を有する任意のカセットからなる。（ｂ）ＴＡＰの抗菌方策の模式図を示す。ドナー株は、ＴＡＰをレシピエント株に伝達するためにＦプラスミド接合機構を産生する。標的のレシピエントは、殺傷または遺伝子発現阻害を誘導するＣＲＩＳＰＲ（ｉ）システムによって認識される配列を有する。スペーサー認識配列を欠く非標的のレシピエントは、ＣＲＩＳＰＲ（ｉ）活性に影響されない。（ｃ）フローサイトメトリーによって推定したＴＡＰ伝達のヒストグラムは、ＴＡＰ_ｋｎ－Ｃａｓ９－ｎｓｐ－ＧＦＰおよびＴＡＰ_ｋｎ－Ｃａｓ９－ｌａｃＺ２－ＧＦＰが３時間の交配後にレシピエント細胞に同様の効率で伝達されることを示す。ドナーはＴＡＰ－Ｃａｓ９－ｎｓｐ（ＬＹ１３７１）またはＴＡＰ－Ｃａｓ９－ｌａｃＺ２（ＬＹ１３８０）、レシピエントはＨＵ－ｍＣｈｅｒｒｙｌａｃ＋（ＬＹ２４８）である。（ｄ）プレーティングアッセイによって推定された生存トランスコンジュガントの濃度のヒストグラムは、ＴＡＰ－Ｃａｓ９－ｌａｃＺ２の獲得に関連した生存率低下を示す。各棒の上には、生存トランスコンジュガントの対応するパーセンテージ（比率Ｔ／Ｒ＋Ｔ）を示す。（ｅ）３時間の交配にわたるレシピエント個体群数の増加率を示す。ドナーはＴＡＰ－Ｃａｓ９－ｎｓｐ（ＬＹ１３６９）またはＴＡＰ－Ｃａｓ９－ｌａｃＺ２（ＬＹ１３７０）、レシピエントはｌａｃ＋（ＬＹ８２７）である。（ｃ～ｅ）平均値およびＳＤは３回の独立した実験から計算する。図２ａ－ｄは、ＴＡＰ獲得後のＥ．ｃｏｌｉの殺傷のリアルタイムにおける可視化を示す。（ａ～ｂ）トランスコンジュガント、（ａ）細菌の長さ、および（ｂ）核様体の長さの単一細胞でタイムラプスの定量を示す。平均値およびＳＤを示す（ｎ個の細胞を分析）。ＴＡＰの獲得時間（赤色破線は０分）は、トランスコンジュガント細胞における緑色蛍光の１５％の増加に対応する。（ｃ～ｄ）トランスコンジュガント、（ｃ）細胞の長さ、および（ｄ）ＲｅｃＡ－ＧＦＰ蛍光信号の歪度の単一細胞でタイムラプスの定量を示す。平均値およびＳＤを示す（ｎ個の細胞を分析）。ＴＡＰの獲得時間（赤色破線は０分）は、トランスコンジュガント細胞における緑色蛍光の３０％の増加に対応する。図３ａ－ｃは、ＴＡＰシステムが標的および非標的のＥ．ｃｏｌｉレシピエント細胞の混合物において標的レシピエントを特異的に殺傷することを示す。（ａ）ドナーからｌａｃ＋およびｌａｃ－のレシピエント個体群の混合物へのＴＡＰ_ｋｎ－Ｃａｓ９－ｎｓｐまたはＴＡＰ_ｋｎ－Ｃａｓ９－ｌａｃＺ２伝達における生存トランスコンジュガント細胞およびトランスコンジュガントのパーセンテージ（比率Ｔ／Ｒ＋Ｔ）を示す。（ｂ）６時間の交配にわたるｌａｃ＋およびｌａｃ－のレシピエント個体群数の増加率の定量を示す。平均値およびＳＤは４回の独立した実験から計算する。ドナーはＴＡＰ－Ｃａｓ９－ｎｓｐ（ＬＹ１３６９）またはＴＡＰ－Ｃａｓ９－ｌａｃＺ２（ＬＹ１３７０）、レシピエントはｌａｃ＋（ＬＹ８２７）およびｌａｃ－（ＬＹ８４８）である。（ｃ）単一細胞の定量により、標的のｌａｃ＋トランスコンジュガント細胞における細胞の長さの増加を示すが、非標的のｌａｃ－トランスコンジュガント細胞における細胞の長さの増加は示さない。ＴＡＰの獲得時間（赤色破線は０分）は、トランスコンジュガント細胞における緑色蛍光の１５％の増加に対応する。細胞の長さの平均値をＳＤとともに示す（ｎ個の細胞を分析）。ドナーはＴＡＰ－Ｃａｓ９－ｌａｃＺ２（ＬＹ１３８０）、レシピエントはＨＵ－ｍＣｈｅｒｒｙｌａｃ＋（ＬＹ２４８）およびＤｎａＮ－ｍＣｈｅｒｒｙｌａｃ－（ＬＹ１４２３）である。図４ａ－ｄは、ＴＡＰがｐＯＸＡ４８保有レシピエント細胞を再感作し、抵抗拡散を妨害することを示す。（ａ）ＴＡＰ媒介の抗耐性の方策の模式図を示す。ｂｌａ_{ＯＸＡ４８}プロモーターを標的とするＴＡＰ－Ｃａｓ９－ＯＸＡ４８を、ドナーからｐＯＸＡ－４８ａプラスミドを有するアンピシリン耐性レシピエント細胞に伝達する。ＴＡＰ－Ｃａｓ９－ＯＸＡ４８の獲得によって、プラスミドに二本鎖切断（ＤＳＢ）が誘導される一方、ＴＡＰ－ｄＣａｓ９－ＯＸＡ４８はｂｌａ_{ＯＸＡ４８}遺伝子の発現を阻害する。両方のＴＡＰが、トランスコンジュガント細胞をアンピシリンに感作させる。（ｂ）ヒストグラムは、ＴＡＰ_ｋｎ－Ｃａｓ９－ＯＸＡ４８、ＴＡＰ_ｋｎ－ｄＣａｓ９－ＯＸＡ４８、およびＴＡＰ_ｋｎ－Ｃａｓ９－ＯＸＡ４８－ＰｅｍＩを獲得した後のトランスコンジュガント細胞におけるアンピシリン耐性の低下を示す。トランスコンジュガントのパーセンテージ（比率Ｔ／Ｒ＋Ｔ）を示す。（ｃ）ヒストグラムは、レシピエントからｐＯＸＡ－４８ａを伝達すること（上部模式図に示すように）によってアンピシリン耐性を獲得するドナー細胞の発生頻度を示す。（ｄ）ヒストグラムは、ＴＡＰ（ＴＡＰ－ｔｒａｎｓｃ．＃２）を受け取った（上部の模式図に示すように）Ｒ＃２プラスミド非含有野生型レシピエントへのｐＯＸＡ－４８ａ伝達によるアンピシリン耐性獲得の発生頻度を示す。平均値およびＳＤは少なくとも３回の独立した実験から計算する。ドナーはＴＡＰ－ｄＣａｓ９－ｎｓｐ（ＬＹ１５２４）、ＴＡＰ－Ｃａｓ９－ｎｓｐ（ＬＹ１３６９）、ＴＡＰ－ｄＣａｓ９－ＯＸＡ４８（ＬＹ１５２３）、ＴＡＰ－ＣＡＳ９－ＯＸＡ４８（ＬＹ１５２２）またはＴＡＰ－ＰｅｍＩ－ＣＡＳ９－ＯＳＡ４８（ＬＹ１５４９）であり、レシピエントはＲ＃１野生型／ｐＯＸＡ－４８ａ（ＬＹ１５０７）およびＲ＃２野生型（ＬＹ９４５）である。図５ａ－ｄは、多菌種のレシピエント個体群内におけるＴＡＰの効率的かつ株特異的な殺傷を示す。（ａ）Ｅ．ｃｏｌｉ（ＬＹ１３６９）ドナーからＣ．ｒｏｄｅｎｔｉｕｍ、Ｅ．ｃｌｏａｃａｅ、Ｅ．ｃｏｌｉのＥＰＥＣまたはＨＳレシピエントへのＴＡＰ－Ｃａｓ９－ｎｓｐ伝達の効率を示す。ヒストグラムは、Ｃ．ｒｏｄｅｎｔｉｕｍ、Ｅ．ｃｌｏａｃａｅ、Ｅ．ｃｏｌｉのＥＰＥＣレシピエントについて２４時間の接合後、およびＥ．ｃｏｌｉのＨＳレシピエントについて３時間の接合後のトランスコンジュガントのパーセンテージ（Ｔ／Ｒ＋Ｔ）を示す。平均値およびＳＤは少なくとも３回の独立した実験から計算する。（ｂ）ＣＳＴＢアルゴリズムで同定された特定のスペーサーを有するＴＡＰを各レシピエント細胞に対して試験した。異なるレシピエント株におけるＴＡＰ伝達の変動に対応するため、ヒストグラムは、ＴＡＰ_Ｋｎ－Ｃａｓ９－ｎｓｐに対して得られた生存トランスコンジュガントによってノーマライズした生存トランスコンジュガントの相対存在量を示す。アスタリスクの上の括弧内の数字は、トランスコンジュガントの検出限界が１０^－８より低いことによるレプリケートを示す。平均値およびＳＤは３回の独立した実験から計算する。（ｃ）ドナーとの交配前にプレーティングアッセイによって推定されたレシピエントの割合を示す。各レシピエント株について、３回の独立した実験から計算した平均値およびＳＤを示す。（ｄ）特定のスペーサーを有する各ＴＡＰを、Ｅ．ｃｏｌｉドナーとすべてのレシピエント菌種を含むレシピエント個体群との間の接合によって試験した。ヒストグラムは、３時間の交配後の混合個体群における生存トランスコンジュガントの割合を示す。アスタリスクの上の括弧内の数字は、トランスコンジュガントの検出限界が１０^－８より低いことによるレプリケートを示す。平均値およびＳＤは３回の独立した実験から計算する。ドナーはＴＡＰ－Ｃａｓ９－ｎｓｐ（ＬＹ１３６９）、ＴＡＰ－Ｃａｓ９－Ｃｒ１（ＬＹ１５９７）、ＴＡＰ－Ｃａｓ９－Ｅｃｌ（ＬＹ１５６６）、ＴＡＰ－Ｃａｓ９－ＥＰＥＣ（ＬＹ１６１８）、ＴＡＰ－Ｃａｓ９－ＥＥＣ（ＬＹ１６６５）であり、レシピエントはＣ．ｒｏｄｅｎｔｉｕｍ（ＬＹ７２０）、Ｅ．ｃｌｏａｃａｅ（ＬＹ１４１０）、Ｅ．ｃｏｌｉのＥＰＥＣ（ＬＹ１６１５）またはＨＳ（ＬＹ１６０１）である。

薬剤耐性菌の世界的な出現は、抗生物質の手段の効力を失わせることにつながり、現在利用可能な処置の成功を大きく制限する。本明細書において、本発明者らは、株特異的な抗菌活性を発揮するＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムを送達するために細菌接合を使用する標的抗菌性プラスミド（ＴＡＰ）に基づく革新的な方策を開発した。ＴＡＰは、適切な標的スペーサー配列を同定するカスタムアルゴリズム（ＣＳＴＢ）を使用して、任意の特定のゲノムまたはプラスミドＤＮＡを対象とすることができるため、極めて汎用性がある。本発明者らは、ＴＡＰが標的ゲノムに致死性ＤＳＢを導入することによって株選択的な殺傷を誘導する能力を実証している。プラスミド保有カルバペネム耐性遺伝子を対象とするＴＡＰは、効果的に株を薬剤に再感作させる。この研究は、他の非標的細菌群に影響を与えることなく、標的の耐性菌および／または病原菌を根絶するために使用できる、抗生物質処置の代替物の開発に向けた重要なステップに相当する。

（主な定義）
本明細書において使用するように、「ポリペプチド」、「ペプチド」、および「タンパク質」という用語は、任意の長さのアミノ酸のポリマーを指すように、互換的に使用される。また、該用語は、例えばジスルフィド結合形成、グリコシル化、脂質化、リン酸化、または標識成分とのコンジュゲーションなど、修飾されたアミノ酸ポリマーを包含する。ポリペプチドは、遺伝子治療の文脈で記載するとき、それぞれのインタクトなポリペプチド、または、インタクトなタンパク質の望ましい生化学的機能を保持する任意のフラグメントもしくは遺伝子学的に操作したその誘導体を指す。

本明細書において使用するように、「由来する」という表現は、第１の成分（例えば第１のポリペプチド）または第１の成分の情報が別の第２の成分（例えば第１のポリペプチドとは異なる第２のポリペプチド）を単離する、導き出す、または作製するために使用されるプロセスを指す。

本明細書において使用するように、「核酸配列」という用語は、デオキシリボヌクレオチドもしくはリボヌクレオチドを含む任意の長さのヌクレオチドの重合形態、またはその類似体を指す。核酸配列は、メチル化ヌクレオチドなどの修飾したヌクレオチド、およびヌクレオチド類似体を含み得、非ヌクレオチド成分によって割り込まれ得る。ヌクレオチド構造の修飾は、存在する場合、ポリマーの形成前または後になされ得る。

本明細書で使用するように、「プラスミド」という用語は、さらなる（外来）ＤＮＡを容易に受け入れることができ、適切な宿主細胞に容易に導入することが可能である、通常は細菌由来の二本鎖ＤＮＡの自己完結型分子を指す。プラスミドベクターは、多くの場合、コーディングＤＮＡおよびプロモーターＤＮＡを含み、外来ＤＮＡの挿入に適した１つ以上の制限部位を有する。プロモーターＤＮＡおよびコーディングＤＮＡは、同じ遺伝子または異なる遺伝子からのものであり得、同じ生物体または異なる生物体からのものであり得る。典型的に、プラスミドは、所望の長さのサイズ、好適には少なくとも約５ｋｂ、好ましくは少なくとも約１０ｋｂ、より好ましくは少なくとも約２０または３０ｋｂ、さらにより好ましくは少なくとも約４０または５０ｋｂのサイズを有する。プラスミドのサイズの上限は、所望に応じて選ぶことができ、好適には約３００ｋｂ、好ましくは約３５０または４００ｋｂである。一部の実施形態において、サイズの上限は、４５０または５００ｋｂなどさらに高くなる。

本明細書において使用するように、「接合」という用語は、細胞間の直接的な接触を介した、１つの原核細胞から他の原核細胞への核酸の直接的な伝達を指す。接合後に伝達ＤＮＡを持つ細胞は、「エキソコンジュガント（ｅｘｏｃｏｎｊｕｇａｎｔ）」、「エクスコンジュガント（ｅｘｃｏｎｊｕｇａｎｔ）」、または「トランスコンジュガント」と称される。

本明細書において使用するように、「原核生物Ｆ因子分配システム」という用語は、細胞分裂時に娘Ｆ因子の適切な分離および忠実な分配を保証する能動的な配置プロセスを指す。この分配システムは機能的に別個の３つの領域を含み、そのうちの２つ（ｓｏｐＡおよびｓｏｐＢ）はトランスにおいて作用する遺伝子産物をコードするが、第３の領域（ｓｏｐＣ）はシスにおいて機能する。本明細書において使用するように、「Ｆ因子」または「原核生物Ｆ因子」は、原核生物に見出される稔性因子を指す。これは、細菌が他の細菌との接合を媒介することを可能にする約１００ｋｂの小片のエピソームＤＮＡである。Ｆ因子の「分配システム」は、両方の娘細胞が親プラスミドのコピーを確実に受け継ぐシステムを指す。

本明細書において使用するように、「ドナー細菌細胞」という用語は、レシピエント細菌細胞に伝達されるために用いられる接合性プラスミドを含む細菌細胞を指す。

本明細書において使用するように、「レシピエント細菌細胞」という用語は、ドナー細菌細胞の接合性プラスミドを最後に受け取る細菌細胞を意味する。

本明細書において使用するように、「プロバイオティクス」という用語は、十分な量で取り込まれ、従来の栄養上の効果を超えて健康、快適性、およびウェルネスにポジティブな効果を及ぼす、生存微生物を指すことを意味する。プロバイオティクス微生物は、「適切な量で投与したとき宿主に健康上の恩恵を与える生存微生物」として定義されている（ＦＡＯ／ＷＨＯ、２００１）。

本明細書において使用するように、「生存可能なプロバイオティクス細胞」という用語は、代謝的に活性であって、対象の胃腸管に定着することができる微生物を意味する。

本明細書において使用するように、「組換えプラスミド」または「合成プラスミド」という用語は、分子生物学のプロトコルを使用して自然における種々の生物体から得られた核酸配列を組み合わせた、人工的に構築したプラスミドを指す。

本明細書において使用するように、「接合性プラスミド」という用語は、細胞間の直接的な接触を介して、１つのドナー細菌細胞から１つのレシピエント細菌細胞へ直接的に伝達されるプラスミドを指す。自然起源の多数の接合性プラスミドが知られており、これらは、限られた菌種内（狭い宿主範囲）または多くの菌種間（広い宿主範囲）で関連遺伝子を伝達することができる。

本明細書において使用するように、「標的抗菌性プラスミド」または「ＴＡＰ」という用語は、細胞内でＤＮＡ複製の自律的単位として機能する、すなわち、それ自身の制御下で複製することができ、（ｉ）複製起点、（ｉｉ）伝達起点、（ｉｉｉ）ヌクレアーゼをコードする核酸配列、および（ｉｖ）ガイドＲＮＡ分子をコードする１つ以上の核酸配列を含む、合成接合性プラスミドを指す。本発明において、本発明の標的抗菌性プラスミドは、レシピエント細菌細胞を標的として、その表現型を改変する、および／またはそれを殺傷する。

本明細書において使用するように、「コピー数」という用語は、細菌細胞におけるプラスミドの数である。これは、ドナー細菌細胞に細胞につき単一コピーを超えて存在する組換え発現コンストラクトの特性を表すと理解されるであろう。大部分のプラスミドは、プラスミド／染色体分子の比率を表す「複数コピー数」、「低コピー数」、または「高コピー数」という用語によって分類される。

本明細書において使用するように、「複製起点」または「ｏｒｉＶ」という用語は、プラスミドの複製に必要とされるヌクレオチドの領域を包含するように用いられる。

本明細書において使用するように、「範囲」または「宿主範囲」という用語は、一般に、特定のプラスミド（天然または組換え）が複製できる種々の細菌種の数および多様性の両方のパラメータを指す。これら２つのパラメータのうち、当業者は、生物体の多様性が一般に宿主範囲をより規定するものと考え得る。例えば、プラスミドが１つの群の多くの菌種、例えばＥｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅにおいて複製される場合、狭い宿主範囲のものと考えられ得る。比較して、プラスミドが数菌種でのみ複製されることが報告されているが、それらの菌種が系統的に多様な群からのものである場合、そのプラスミドは広範な宿主範囲のものと考えられ得る。本明細書に記載するように、両方の型のプラスミドが本発明において有用性を見出し得る。

本明細書において使用するように、「伝達起点」または「ｏｒｉＴ」という用語は、１つのドナー細胞から宿主へのプラスミドの伝達を可能にするために必要とされるヌクレオチドの領域を包含するように用いられる。伝達起点は、伝達プロセスが開始されるベクターの部位を表す。また、これは、遺伝学的に、伝達されるＤＮＡに対するシスにおいて必要とされる領域として規定される。接合特異的なＤＮＡ複製は、プラスミドのトランスファー因子もコードするｏｒｉＴ領域内で開始される。典型的に、ｏｒｉＴは約４０～５００ｂｐの長さであり、ＤＮＡ伝達に関与するタンパク質と結合する固有の屈曲および直接の逆方向反復を含む。ｏｒｉＴは、機能的に定義された３つのドメイン、つまりニックドメイン、伝達ドメイン、および終止ドメインからなる。鎖および配列特異的な切断部位であるｎｉｃ部位自体は、リラクサーゼによって切断および追放される。多くの場合、リラクサーゼは、リラクサーゼをｎｉｃ部位に誘導し、反応の特異性を確保する補助タンパク質を必要とする。これまでに同定されたｎｉｃ部位の配列から、ＩｎｃＦ、ＩｎｃＰ、およびＩｎｃＱ、ならびにｐＭＶ１５８などの特定のグラム陽性のプラスミドに代表される４つの配列の可能性が明らかにされている。さらに、このプロセスに不可欠である、ＤＮＡにおいて高次構造を形成するｏｒｉＴ内の複数の部位に結合するタンパク質が通常存在する。また、このタンパク質は、リラクソームの輸送機構への固定における機能も有していると認められる。

本明細書において使用するように、「ヌクレアーゼ」という用語は、核酸配列の切断、例えば、二本鎖ＤＮＡ配列の一本鎖または二本鎖切断を誘導するタンパク質（すなわち、酵素）を含む。

本明細書において使用するように、「ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓヌクレアーゼ」という用語は、当技術におけるその一般的な意味を有しており、規則的な間隔をもってクラスター化された短鎖反復回文配列（ＣＲＩＳＰＲ）およびＣａｓ遺伝子によってコードされる関連ヌクレアーゼを含む原核生物ＤＮＡのセグメントを指す。細菌において、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ遺伝子座は、可動遺伝因子（ウイルス、転位因子、および接合性プラスミド）に対する、ＲＮＡによってガイドされる適応免疫系をコードする。３つの型のＣＲＩＳＰＲシステムが同定されている。ＣＲＩＳＰＲクラスターは、先行する可動因子に相補的な配列である、スペーサーを含む。ＣＲＩＳＰＲクラスターは、成熟ＣＲＩＳＰＲ（規則的な間隔をもってクラスター化された短鎖反復回文配列）ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）に転写されてプロセシングされる。ＣＲＩＳＰＲ／ＣａｓヌクレアーゼのＣａｓ９およびＣｐｆ１は、ＩＩ型およびＶ型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムに属し、標的ＤＮＡを切断するという強力なエンドヌクレアーゼ活性を有する。Ｃａｓ９は、約２０個のヌクレオチドの固有の標的配列（スペーサーと呼ばれる）を含む成熟ｃｒＲＮＡ、およびｃｒＲＮＡ前駆体のリボヌクレアーゼＩＩＩ支援プロセシングのためのガイドとしても機能するトランス活性化型低分子ＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）によってガイドされる。ｃｒＲＮＡ：ｔｒａｃｒＲＮＡ二本鎖は、ｃｒＲＮＡのスペーサーと標的ＤＮＡの相補配列（プロトスペーサーと呼ばれる）との間の相補塩基対を介してＣａｓ９を標的ＤＮＡに誘導する。Ｃａｓ９は、トリヌクレオチド（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓではＮＧＧ）のプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）を認識して、切断部位（ＰＡＭから上流の３つ目または４つ目のヌクレオチド）を特定する。

本明細書において使用するように、「Ｃａｓ９」または「Ｃａｓ９ヌクレアーゼ」という用語は、Ｃａｓ９タンパク質またはそのフラグメント（例えば、Ｃａｓ９の活性もしくは不活性ＤＮＡ切断ドメイン、および／またはＣａｓ９のｇＲＮＡ結合ドメインを含むタンパク質）を含むＲＮＡによってガイドされるヌクレアーゼを指す。また、Ｃａｓ９ヌクレアーゼは、ｃａｓｎ１ヌクレアーゼまたはＣＲＩＳＰＲ（規則的な間隔をもってクラスター化された短鎖反復回文配列）関連ヌクレアーゼと呼ばれることがある。ＣＲＩＳＰＲは、可動遺伝因子（ウイルス、転位因子、および接合性プラスミド）に対する防御を提供する適応免疫系である。ＣＲＩＳＰＲクラスターは、先行する可動因子に相補的な配列であるスペーサーを含み、侵入する核酸を標的とする。ＣＲＩＳＰＲクラスターは、ＣＲＩＳＰＲＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）に転写されてプロセシングされる。ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲシステムにおいて、ｃｒＲＮＡ前駆体の正しいプロセシングは、トランスコード型低分子ＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）、内在性リボヌクレアーゼ３（ｒｎｃ）、およびＣａｓ９タンパク質を必要とする。ｔｒａｃｒＲＮＡは、ｃｒＲＮＡ前駆体のリボヌクレアーゼ３支援プロセシングのためのガイドとして機能する。その後、Ｃａｓ９／ｃｒＲＮＡ／ｔｒａｃｒＲＮＡは、スペーサーに相補的な直線状または円形のｄｓＤＮＡ標的をエンドヌクレアーゼにより切断する。ｃｒＲＮＡに相補的でない標的鎖は、まずエンドヌクレアーゼにより切断され、その後３’－５’エキソヌクレアーゼによりトリミングされる。自然において、ＤＮＡ結合および切断は、典型的にタンパク質および両方のＲＮＡを必要とする。しかしながら、シングルガイドＲＮＡ（「ｓｇＲＮＡ」または単に「ｇＲＮＡ」）は、ｃｒＲＮＡおよびｔｒａｃｒＲＮＡの両方の態様を単一のＲＮＡ種に組み込むよう操作され得る。例えば、ＪｉｎｅｋＭ．、ＣｈｙｌｉｎｓｋｉＫ．、ＦｏｎｆａｒａＩ．、ＨａｕｅｒＭ．、ＤｏｕｄｎａＪ．Ａ．、ＣｈａｒｐｅｎｔｉｅｒＥ．Ｓｃｉｅｎｃｅ３３７：８１６－８２１（２０１２）が参照され、その内容全体が参照することによって本明細書に援用される。Ｃａｓ９は、ＣＲＩＳＰＲ反復配列における短いモチーフ（ＰＡＭまたはプロトスペーサー隣接モチーフ）を認識して、自己対非自己の区別を促す。Ｃａｓ９ヌクレアーゼ配列および構造は当業者に周知である（例えば、“ＣｏｍｐｌｅｔｅｇｅｎｏｍｅｓｅｑｕｅｎｃｅｏｆａｎＭ１ｓｔｒａｉｎｏｆＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓｐｙｏｇｅｎｅｓ．” Ｆｅｒｒｅｔｔｉｅｔａｌ．，Ｊ．Ｊ．，ＭｃＳｈａｎＷ．Ｍ．，ＡｊｄｉｃＤ．Ｊ．，ＳａｖｉｃＤ．Ｊ．，ＳａｖｉｃＧ．，ＬｙｏｎＫ．，ＰｒｉｍｅａｕｘＣ．，ＳｅｚａｔｅＳ．，ＳｕｖｏｒｏｖＡ．Ｎ．，ＫｅｎｔｏｎＳ．，ＬａｉＨ．Ｓ．，ＬｉｎＳ．Ｐ．，ＱｉａｎＹ．，ＪｉａＨ．Ｇ．，ＮａｊａｒＦ．Ｚ．，ＲｅｎＱ．，ＺｈｕＨ．，ＳｏｎｇＬ．，ＷｈｉｔｅＪ．，ＹｕａｎＸ．，ＣｌｉｆｔｏｎＳ．Ｗ．，ＲｏｅＢ．Ａ．，ＭｃＬａｕｇｈｌｉｎＲ．Ｅ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９８：４６５８－４６６３（２００１）；“ＣＲＩＳＰＲＲＮＡｍａｔｕｒａｔｉｏｎｂｙｔｒａｎｓ－ｅｎｃｏｄｅｄｓｍａｌｌＲＮＡａｎｄｈｏｓｔｆａｃｔｏｒＲＮａｓｅＩＩＩ．” ＤｅｌｔｃｈｅｖａＥ．，ＣｈｙｌｉｎｓｋｉＫ．，ＳｈａｒｍａＣ．Ｍ．，ＧｏｎｚａｌｅｓＫ．，ＣｈａｏＹ．，ＰｉｒｚａｄａＺ．Ａ．，ＥｃｋｅｒｔＭ．Ｒ．，ＶｏｇｅｌＪ．，ＣｈａｒｐｅｎｔｉｅｒＥ．，Ｎａｔｕｒｅ４７１：６０２－６０７（２０１１）；および“Ａｐｒｏｇｒａｍｍａｂｌｅｄｕａｌ－ＲＮＡ－ｇｕｉｄｅｄＤＮＡｅｎｄｏｎｕｃｌｅａｓｅｉｎａｄａｐｔｉｖｅｂａｃｔｅｒｉａｌｉｍｍｕｎｉｔｙ．” ＪｉｎｅｋＭ．，ＣｈｙｌｉｎｓｋｉＫ．，ＦｏｎｆａｒａＩ．，ＨａｕｅｒＭ．，ＤｏｕｄｎａＪ．Ａ．，ＣｈａｒｐｅｎｔｉｅｒＥ．Ｓｃｉｅｎｃｅ３３７：８１６－８２１（２０１２）が参照され、それらのそれぞれの内容全体が参照することによって本明細書に援用される。）Ｃａｓ９のオルソログは、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓおよびＳ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓを含むが、これらに限定されない様々な菌種において記述されている。さらなる好適なＣａｓ９ヌクレアーゼおよび配列は、この開示に基づいて当業者に明らかになり、そうしたＣａｓ９ヌクレアーゼおよび配列は、Ｃｈｙｌｉｎｓｋｉ、Ｒｈｕｎ、およびＣｈａｒｐｅｎｔｉｅｒの「ＴｈｅｔｒａｃｒＲＮＡａｎｄＣａｓ９ｆａｍｉｌｉｅｓｏｆｔｙｐｅＩＩＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓｉｍｍｕｎｉｔｙｓｙｓｔｅｍｓ」（２０１３）ＲＮＡＢｉｏｌｏｇｙ１０：５、７２６－７３７（その内容全体が参照することによって本明細書に援用される）に公開される生物体および遺伝子座からのＣａｓ９配列を含む。一部の実施形態において、「Ｃａｓ９」という用語は、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍｕｌｃｅｒａｎｓ（ＮＣＢＩＲｅｆｓ：ＮＣ＿０１５６８３．１，ＮＣ＿０１７３１７．１）、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍｄｉｐｈｔｈｅｒｉａ（ＮＣＢＩＲｅｆｓ：ＮＣ＿０１６７８２．１，ＮＣ＿０１６７８６．１）、Ｓｐｉｒｏｐｌａｓｍａｓｙｒｐｈｉｄｉｃｏｌａ（ＮＣＢＩＲｅｆ：ＮＣ＿０２１２８４．１）、Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａｉｎｔｅｒｍｅｄｉａ（ＮＣＢＩＲｅｆ：ＮＣ＿０１７８６１．１）、Ｓｐｉｒｏｐｌａｓｍａｔａｉｗａｎｅｎｓｅ（ＮＣＢＩＲｅｆ：ＮＣ＿０２１８４６．１）、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓｉｎｉａｅ（ＮＣＢＩＲｅｆ：ＮＣ＿０２１３１４．１）、Ｂｅｌｌｉｅｌｌａｂａｌｔｉｃａ（ＮＣＢＩＲｅｆ：ＮＣ＿０１８０１０．１）、ＰｓｙｃｈｒｏｆｌｅｘｕｓｔｏｒｑｕｉｓＩ（ＮＣＢＩＲｅｆ：ＮＣ＿０１８７２１．１）、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ（ＮＣＢＩＲｅｆ：ＹＰ＿８２０８３２．１）、Ｌｉｓｔｅｒｉａｉｎｎｏｃｕａ（ＮＣＢＩＲｅｆ：ＮＰ＿４７２０７３．１）、Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒｊｅｊｕｎｉ（ＮＣＢＩＲｅｆ：ＹＰ＿００２３４４９００．１）、またはＮｅｉｓｓｅｒｉａ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ（ＮＣＢＩＲｅｆ：ＹＰ＿００２３４２１００．１）からのＣａｓ９を指す。

本明細書において使用するように、「欠損ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓヌクレアーゼ」または「ＣＲＩＳＰＲ／ｄＣａｓ」という用語は、少なくとも１つのヌクレアーゼドメインを喪失したＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓヌクレアーゼを指す。

本明細書において使用するように、「ガイドＲＮＡ分子」という用語は、一般に、ＣＲＩＳＰＲタンパク質と結合し、ＣＲＩＳＰＲタンパク質を標的ＤＮＡ内の特定の位置に標的化することができるＲＮＡ分子（または集合的にＲＮＡ分子の群）を指す。ガイドＲＮＡは、２つのセグメント、つまりＤＮＡ標的ガイドセグメントとタンパク質結合セグメントとを含むことができる。ＤＮＡ標的セグメントは、標的配列に相補的な（またはストリンジェントな条件下で少なくともハイブリダイズできる）ヌクレオチド配列を含む。タンパク質結合セグメントは、Ｃａｓ９またはＣａｓ９関連ポリペプチドなどのＣＲＩＳＰＲタンパク質と相互作用する。これらの２つのセグメントは、同じＲＮＡ分子、または２つ以上の別個のＲＮＡ分子に位置し得る。２つのセグメントが別個のＲＮＡ分子にあるとき、ＤＮＡ標的ガイドセグメントを含む分子はＣＲＩＳＰＲＲＮＡ（「ｃｒＲＮＡ」）と呼ばれ、タンパク質結合セグメント含む分子はトランス活性化ＲＮＡ（「ｔｒａｃｒＲＮＡ」）と呼ばれる。典型的に、ｃｒＲＮＡは、少なくとも１つのスペーサー配列、およびスペーサー配列の５’末端に連結された少なくとも１つの反復配列またはその一部を含む。本発明のｃｒＲＮＡの設計は、該ｃｒＲＮＡが使用されるＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムに基づいて変化することになる。本発明のｃｒＲＮＡは合成され、人によって作製され、自然において見受けられない。典型的には、ｃｒＲＮＡは、５’から３’へと、反復配列（全長またはその一部（「ハンドル」））、スペーサー配列、および反復配列（全長またはその一部）を含み得る。一部の実施形態において、ｃｒＲＮＡは、５’から３’へと、反復配列（全長またはその一部（「ハンドル」）、およびスペーサー配列を含み得る。ｔｒａｃｒ核酸は、５'から３'へと、バルジ、ネクサスヘアピン、および末端ヘアピン、および任意で、５'末端において、上部ステムを含む（Ｂｒｉｎｅｒｅｔａｌ．（２０１４）ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｅｌｌ．５６（２）：３３３－３３９を参照されたい）。ｔｒａｃｒＲＮＡは、成熟または未成熟のｃｒＲＮＡの反復部分にハイブリダイズして機能し、Ｃａｓ９タンパク質を標的部位に動員し、構造再編成を誘導することによってＣａｓ９の触媒活性を促進し得る。ｔｒａｃｒＲＮＡの配列はＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムに特異的であり、可変であり得る。プラスミドが、ＩＩ型ｃｒＲＮＡに加えて異種ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムを含むように操作されるとき、既知であるまたは後に同定される任意のｔｒａｃｒ核酸を使用することができる。一部の実施形態において、ｔｒａｃｒ核酸は、本発明のｃｒＲＮＡと融合させて、単一のガイド核酸を形成する。

本明細書において使用するように、「標的核酸配列」、「標的配列」または「標的領域」という用語は、本明細書において使用するように、本明細書に開示するようなＣＲＩＳＰＲシステムを使用して結合することが望まれる特定の配列またはその相補的配列を意味する。より具体的には、「標的核酸鎖」は、本明細書に開示するようなガイドＲＮＡと塩基対を形成する標的核酸の鎖を指す。すなわち、ｃｒＲＮＡおよびガイド配列とハイブリダイズする標的核酸の鎖は、「標的核酸鎖」と呼ばれる。ガイド配列と相補的でない標的核酸の他方の鎖は、「非相補鎖」と呼ばれる。二本鎖標的核酸（例えば、ＤＮＡ）の場合、適切なＰＡＭ部位がある限り、各鎖を「標的核酸鎖」として、ｃｒＲＮＡおよびガイドＲＮＡを設計し、本発明の方法の実施に使用することができる。

本明細書において使用するように、「二本鎖切断」または「ＤＳＢ」という用語は、核酸分子、例えばＤＮＡ分子における２つの切断、つまり核酸分子の第１の鎖における第１の切断、および核酸分子の第２の鎖における第２の切断を指す。

本明細書において使用するように、「プロモーター」という用語は、細胞において核酸の転写を媒介するＤＮＡ配列を含むように用いられる。

本明細書において使用するように、「恒常的プロモーター」という用語は、任意の活性化する生物的または非生物的調節因子の非存在下で遺伝子発現を可能にする永続的な活性状態にあるプロモーターを記述するように使用される。当業者は、「強い恒常的プロモーター」および「弱い恒常的プロモーター」といった用語の意味をよく認識している。それでも、本明細書において規定するような「弱い恒常的プロモーター」という用語は、強い恒常的プロモーターの１０倍以下の発現レベルを有するプロモーターを指す。例えば、ユビキチンプロモーター（その第１のイントロンを有する）は、一般に強い恒常的プロモーターであることが知られており、第１のイントロンを欠失させると、プロモーターの発現が１０倍低下して、弱い恒常的プロモーターとなることも知られている。

本明細書において使用するように、「作動可能に連結」という用語は、連結の位置および近接性が、関連する複製を保証し、トランス作用性転写因子および他の細胞因子によって認識されるのに十分かつ適切であって、それによってポリペプチドをコードする核酸が適切な条件下で効率的に発現される、核酸間の連結を記述するために用いられる。

本明細書において使用するように、「相補性」という用語は、核酸が従来のワトソン－クリック塩基対形成または他の従来のものでない型のいずれかによって他の核酸配列と水素結合を形成する能力を指す。相補性パーセントは、第２の核酸配列と水素結合を形成できる（例えば、ワトソン－クリック塩基対形成）核酸分子内の残基のパーセンテージを示す（例えば、１０のうち５、６、７、８、９、１０は、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、および１００％相補的である）。「完全に相補的」は、核酸配列の近接した残基のすべてが、第２の核酸配列内の同じ数の近接した残基と水素結合することを意味する。「実質的に相補的」は、本明細書において使用するように、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、３０、３５、４０、４５、５０以上のヌクレオチドの領域にわたって少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％である相補性の程度を指すか、または、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする２つの核酸を指す。

本明細書において使用するように、「制限酵素」という用語は、特定の塩基配列においてＤＮＡの分子を内部で切断する、細菌によって産生される一群の酵素のいずれかを意味するように理解されるであろう。制限酵素の例は、ＢｓｐＥＩ、ＳｐａＩ、ＢｇｌＩＩ、ＮｓｉＩ、ＮｏｔＩ、ＳａｃＩ、ＳｐｅＩ、およびＡｌｗＮＩを含み得る。

本明細書において使用するように、「制限部位」という用語は、制限酵素によって認識されるＤＮＡ分子内の塩基配列を意味するように理解されるであろう。

本明細書において使用するように、「クローニング」という用語は、ＤＮＡ分子をプラスミドにライゲーションするプロセスを指す。

本明細書において使用するように、「選択する」という用語は、目的のプラスミド（本発明のプラスミドなど）を含むドナー細胞またはレシピエント細菌細胞などの細胞を同定および単離することを指す。

本明細書において使用するように、「選択マーカー遺伝子」という用語は、表現型によって選択マーカー遺伝子を含む細胞の正または負の選択を可能にするようにその遺伝子を含む細胞に表現型を提供するポリペプチドをコードする遺伝子を指す。選択マーカー遺伝子は、形質転換細胞と非形質転換細胞とを区別するために使用され得る。

本明細書において使用するように、「約」という用語は、所与の値の２０％、好ましくは１０％、より好ましくは７％、およびさらにより好ましくは３％の逸脱と規定される。

本明細書において使用するように、「抗生物質」という用語は、他の微生物の増殖に対して拮抗性である微生物によって産生される従来の抗生物質を指し、また、より一般的には、微生物を殺傷するか、または増殖を阻害することができる抗菌剤を包含し、自然起源の抗生物質の化学合成タイプおよび変異体を含む。

本明細書において使用するように、「カルバペネム」という用語は、一群のβ－ラクタム抗生物質であって、β－ラクタム構造の１位の硫黄原子が炭素原子に置換されており、不飽和が導入されており、したがって大部分のβ－ラクタマーゼに耐性がある分子構造を有し、広範な抗菌活性スペクトルを有するものを示す。カルバペネムは、大部分の細菌のβ－ラクタマーゼに対するその耐性を考慮すると、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ（Ｅ．ｃｏｌｉ）およびＫｌｅｂｓｉｅｌｌａｐｎｅｕｍｏｎｉａｅなど、多くの細菌感染症に対する最終手段の抗生物質の１つである。

本明細書において使用するように、「抗生物質耐性遺伝子」という用語は、抗生物質耐性を付与する生成物をコードする遺伝子または機能性ＲＮＡを転写する遺伝子を包含する。例えば、抗生物質耐性遺伝子は、上述の４つの耐性機序のいずれかに寄与する遺伝子またはそのコード部分であり得る。抗生物質耐性遺伝子は、例えば、（１）抗生物質を分解する酵素、（２）抗生物質を修飾する酵素、（３）排出ポンプなどのポンプ、または（４）抗生物質の効果を抑制する突然変異した標的、をコードし得る。

本明細書において使用するように、「食品」という用語は、液体（すなわち、飲料）、固体または半固体の食餌用組成物、特に、追加の栄養摂取または食品補助組成物を必要としない総合食品組成物（代替食品）を指す。

本明細書において使用するように、「患者」または「対象」という用語は、ヒトまたは動物（動物は臨床における効力のモデルとして特に有用である）を指す。一部の実施形態において、対象は、細菌感染症に感受性のあるヒトまたは他の任意の動物（例えば、鳥類および哺乳類）（例えば、ネコおよびイヌなどの飼育動物、ウマ、ウシ、ブタ、ニワトリ等の家畜および農場動物）であり得る。典型的には、上述の対象は、非霊長類（例えば、ラクダ、ロバ、シマウマ、ウシ、ブタ、ウマ、ヤギ、ヒツジ、ネコ、イヌ、ネズミ、およびマウス）ならびに霊長類（例えば、サル、チンパンジー、およびヒト）を含む哺乳類である。一部の実施形態において、対象は非ヒト動物である。一部の実施形態において、対象は農場動物またはペットである。一部の実施形態において、対象はヒトである。一部の実施形態において、対象はヒトの乳幼児である。一部の実施形態において、対象はヒトの子供である。一部の実施形態において、対象はヒトの成人である。一部の実施形態において、対象はヒトの高齢者である。一部の実施形態において、対象はヒトの早産児である。

本明細書において使用するように、「処置」または「処置する」という用語は、疾患にかかるリスクを有するまたは疾患にかかったと疑われる患者、および病気であるまたは疾患もしくは医学的状態に罹患していると診断された患者の処置を含む、予防または抑止処置、および根治または疾患修飾処置の両方を指し、臨床における再発の抑制を含む。処置は、障害もしくは再発の障害を抑止、治癒、その発症を遅延する、その重篤度を軽くする、もしくはその１つ以上の症状を改善するため、またはそうした処置が存在しない場合に予想される生存を超えて患者の生存を延長するため、医学的障害を有するまたは最終的にそうした障害に罹患し得る患者に行うことができる。「治療レジメン」は、病気の処置のパターン、例えば治療時に使用する投薬のパターンを意味する。治療レジメンは、誘導レジメンおよび維持レジメンを含むことができる。「誘導レジメン」または「誘導期間」という表現は、疾患の初期の処置に使用する治療レジメン（または治療レジメンの一部）を指す。誘導レジメンの全体的な目的は、処置レジメンの初期期間に高レベルの薬剤を患者に提供することである。誘導レジメンは、「負荷レジメン」を（部分的または全体的に）使用することができ、これは、医師が維持レジメン時に使用し得るものより多い用量の薬剤を投与すること、医師が維持レジメン時に薬剤を投与し得るより頻回で薬剤を投与すること、またはその両方を含むことができる。「維持レジメン」または「維持期間」という表現は、例えば患者を長期間（数か月または数年）寛解の状態に維持するため、病気の処置時に患者のメンテナンスに使用される治療レジメン（または治療レジメンの一部）を指す。維持レジメンは、持続的治療（例えば、薬剤を一定の間隔で、例えば毎週、毎月、毎年等投与すること）、または断続的治療（例えば、中断を含む処置、断続的処置、再発における処置、もしくは所定の特定の条件［例えば痛み、疾患の徴候等］を満たした上での処置）を用いることができる。

本明細書において使用するように、「治療有効量」という用語は、治療効果および／または有益な効果であり得る所望の効果を生じさせるのに十分なドナー細菌細胞の量を指す。有効量は、年齢、対象の一般的な状態、処置する状態の重症度、投与する特定の薬剤、処置の期間、任意の同時処置の性質、使用する薬学的に許容される担体、ならびに当業者の知識および専門知識内の同様の要因によって変化するであろう。必要に応じて、任意の個々の場合における「有効量」は、関連するテキストおよび文献を参照して、ならびに／または慣例的な実験法を使用して、当業者によって決定することができる。一部の実施形態において、宿主細菌および／またはその組成物の有効量は、約１０^５～約１０^１０コロニー形成単位（ＣＦＵ）であり得る。一部の実施形態において、有効量は、約１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％、およびそれら内の任意の値または範囲で、細菌レシピエントの細胞負荷を低減する量とすることができる。

本明細書において使用するように、「医薬組成物」という用語は、担体および／または賦形剤などの他の薬剤を伴う、本明細書に記載する組成物、またはその薬学的に許容される塩を指す。本明細書において提供されるような医薬組成物は、典型的に、薬学的に許容される担体を含む。

本明細書において使用するように、「薬学的に許容される担体」という用語は、所望の特定の剤形に適するような、任意およびすべての溶媒、希釈剤、または他の液体ビヒクル、分散または懸濁補助剤、界面活性剤、等張剤、増粘剤または乳化剤、保存剤、固体結合剤、および潤滑剤および同様のものを含む。レミントン薬科学（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ－Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，ＳｉｘｔｅｅｎｔｈＥｄｉｔｉｏｎ，Ｅ．Ｗ．Ｍａｒｔｉｎ（ＭａｃｋＰｕｂｌｉｓｈｉｎｇＣｏ．，Ｅａｓｔｏｎ，Ｐａ．，１９８０））は、医薬組成物の製剤化に使用される様々な担体、およびその調製のための周知技術を公開している。

（標的抗菌性プラスミド）
本発明の第１の目的は、（ｉ）複製起点、（ｉｉ）伝達起点、（ｉｉｉ）ヌクレアーゼをコードする、遺伝子学的に操作した核酸配列、および（ｉｖ）ガイドＲＮＡ分子をコードする、１つ以上の遺伝子学的に操作した核酸配列を含む、標的抗菌性プラスミド（ＴＡＰ）に関する。

（（ｉ）複製起点）
一部の実施形態において、複製起点は、典型的に宿主特異的であり、プラスミドの宿主範囲を決定している。複製起点が得られ得る広範な範囲（「広宿主域（ｐｒｏｍｉｓｃｕｏｕｓ）」）のプラスミドの例は、Ｒ６Ｋ、ＲＫ２、ｐ１５Ａ、およびＲＳＦ１０１０を含むが、これらに限定されない。例えば、本発明のプラスミドはすべてのグラム陰性細菌において機能し、Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ属、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ属、Ａｅｒｏｍｏｎａｓ属、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ属、Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ属、Ａｎａｂａｅｎａ属、Ａｚｏｒｉｚｏｂｉｕｍ属、Ｂａｒｔｏｎｅｌｌａ属、Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ属、Ｂｒｕｃｅｌｌａ属、Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ属、Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ属、Ｃａｕｌｏｂａｃｔｅｒ属、Ｃｈｒｏｍａｔｉｕｍ属、Ｃｏｍａｍｏｎａｓ属、Ｃｙｔｏｐｈａｇａ属、Ｄｅｉｎｏｃｏｃｃｕｓ属、Ｅｒｗｉｎｉａ属、Ｅｒｙｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ属、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ属、Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ属、Ｈｙｐｈｏｍｉｃｒｏｂｉｕｍ属、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ属、Ｍｅｔｈａｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ属、Ｍｅｔｈｙｌｂａｃｔｅｒｉｕｍ属、Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｉｌｌｕｓ属、Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒ属、Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ属、Ｍｅｔｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ属、Ｍｅｔｈｙｌｏｃｙｓｔｉｓ属、Ｍｅｔｈｙｌｏｍｉｃｒｏｂｉｕｍ属、Ｍｅｔｈｙｌｏｍｏｎａｓ属、Ｍｅｔｈｙｌｏｐｈｉｌｕｓ属、Ｍｅｔｈｙｌｏｓｉｎｕｓ属、Ｍｙｘｏｃｏｃｃｕｓ属、Ｐａｎｔｏｅａ属、Ｐａｒａｃｏｃｃｕｓ属、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ属、Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ属、Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ属、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ属、Ｓｈｉｇｅｌｌａ属、Ｓｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｓ、およびＶｉｂｒｉｏ属において特に有用であることが期待される。

一部の実施形態において、複製起点は、クロンテックラボラトリーズ社（ＰａｌｏＡｌｔｏ，Ｃａｌｉｆ．）から販売されている、ｐＥＢＦＰ－Ｎ１、ｐＥＣＦＰ－Ｎ１、ｐＥＧＦＰ－Ｎ１、ｐＥＧＦＰ－Ｎ２、ｐＥＧＦＰ－Ｎ３、ｐＥＹＦＰ－Ｎ１、ｐＥＢＥＰ－Ｃ１、ｐＥＣＦＰ－Ｃ１、ｐＥＧＦＰ－Ｃ１、ｐＥＧＦＰ－Ｃ２、ｐＥＧＦＰ－Ｃ３、ｐＥＹＦＰ－Ｃ１、ｐＥＧＦＰ－Ｆ、ｐＣＭＳ－ＥＧＦＰ、ｐＩＩＲＥＳ２－ＥＧＦＰ、ｐｄ２ＥＣＦＰ－Ｎ１、ｐｄ２ＥＧＦＰ－Ｎ１、ｐｄ２ＥＹＦＰ－Ｎ１、ｐｄ１ＥＧＦＰ－Ｎ１、ストラタジーン社（ＬａＪｏｌｌａ，Ｃａｌｉｆ．）から販売されているｐＣＭＶ－Ｓｃｒｉｐｔ、ｐＣＭＶ－Ｔａｇ、ｐＤｕａｌ、ｐＢＫ－ＣＭＶ、およびｐＢＫ－ＲＳＶ、ならびにプロメガ社（Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓ．）から販売されているｐＴＡＲＧＥＴ、ｐＣＩ、およびｐＣＩ－Ｎｅｏプラスミドからなる群より選択される１つのプラスミドの複製起点である。

一部の実施形態において、複製起点は、ｐＢＢＲ１プラスミドの複製起点である。一部の実施形態において、複製起点は、配列番号１の核酸配列からなる。
配列番号１＞ｏｒｉＶ－ｐＢＢＲ１
ｇｃｔｔａｔｃｔｃｃａｔｇｃｇｇｔａｇｇｇｇｔｇｃｃｇｃａｃｇｇｔｔｇｃｇｇｃａｃｃａｔｇｃｇｃａａｔｃａｇｃｔｇｃａａｃｔｔｔｔｃｇｇｃａｇｃｇｃｇａｃａａｃａａｔｔａｔｇｃｇｔｔｇｃｇｔａａａａｇｔｇｇｃａｇｔｃａａｔｔａｃａｇａｔｔｔｔｃｔｔｔａａｃｃｔａｃｇｃａａｔｇａｇｃｔａｔｔｇｃｇｇｇｇｇｇｔｇｃｃｇｃａａｔｇａｇｃｔｇｔｔｇｃｇｔａｃｃｃｃｃｃｔｔｔｔｔｔａａｇｔｔｇｔｔｇａｔｔｔｔｔａａｇｔｃｔｔｔｃｇｃａｔｔｔｃｇｃｃｃｔａｔａｔｃｔａｇｔｔｃｔｔｔｇｇｔｇｃｃｃａａａｇａａｇｇｇｃａｃｃｃｃｔｇｃｇｇｇｇｔｔｃｃｃｃｃａｃｇｃｃｔｔｃｇｇｃｇｃｇｇｃｔｃｃｃｃｃｔｃｃｇｇｃａａａａａｇｔｇｇｃｃｃｃｔｃｃｇｇｇｇｃｔｔｇｔｔｇａｔｃｇａｃｔｇｃｇｃｇｇｃｃｔｔｃｇｇｃｃｔｔｇｃｃｃａａｇｇｔｇｇｃｇｃｔｇｃｃｃｃｃｔｔｇｇａａｃｃｃｃｃｇｃａｃｔｃｇｃｃｇｃｃｇｔｇａｇｇｃｔｃｇｇｇｇｇｇｃａｇｇｃｇｇｇｃｇｇｇｃｔｔｃｇｃｃｃｔｔｃｇａｃｔｇｃｃｃｃｃａｃｔｃｇｃａｔａｇｇｃｔｔｇｇｇｔｃｇｔｔｃｃａｇｇｃｇｃｇｔｃａａｇｇｃｃａａｇｃｃｇｃｔｇｃｇｃｇｇｔｃｇｃｔｇｃｇｃｇａｇｃｃｔｔｇａｃｃｃｇｃｃｔｔｃｃａｃｔｔｇｇｔｇｔｃｃａａｃｃｇｇｃａａｇｃｇａａｇｃｇｃｇｃａｇｇｃｃｇｃａｇｇｃｃｇｇａｇｇｃｔｔｔｔｃｃｃｃａｇａｇａａａａｔｔａａａａａａａｔｔｇａｔｇｇｇｇｃａａｇｇｃｃｇｃａｇｇｃｃｇｃｇｃａｇｔｔｇｇａｇｃｃｇｇｔｇｇｇｔａｔｇｔｇｇｔｃｇａａｇｇｃｔｇｇｇｔａｇｃｃｇｇｔｇｇｇｃａａｔｃｃｃｔｇｔｇｇｔｃａａｇｃｔｃｇｔｇｇｇｃａｇｇｃｇｃａｇｃｃｔｇｔｃｃａｔｃａｇｃｔｔｇｔｃｃａｇｃａｇｇｇｔｔｇｔｃｃａｃｇｇｇｃｃｇａｇｃｇａａｇｃｇａｇｃｃａｇｃｃｇｇｔｇｇｃｃｇｃ

（（ｉｉ）伝達起点）
一部の実施形態において、伝達起点は、広宿主域ＩｎｃＰプラスミドのＲＰ４およびＲ７５１に由来する。一部の実施形態において、伝達起点は、ＲＰ４プラスミドのｏｒｉＴである。一部の実施形態において、本発明の伝達起点は、配列番号２の核酸配列からなる。
配列番号２＞ｏｒｉＴ－ＲＫ２
ｇｇｇｃａｇｇａｔａｇｇｔｇａａｇｔａｇｇｃｃｃａｃｃｃｇｃｇａｇｃｇｇｇｔｇｔｔｃｃｔｔｃｔｔｃａｃｔｇｔｃｃｃｔｔａｔｔｃｇｃａｃｃｔｇｇｃｇｇｔｇｃｔｃａａｃｇｇｇａａｔｃｃｔｇｃｔｃｔｇｃｇａｇｇｃｔｇｇｃｃｇ

一部の実施形態において、伝達起点は、ドナー細菌細胞に含まれる接合性Ｆプラスミドからの伝達タンパク質Ｔｒａによってプラスミドを動員可能にするためのＦプラスミドのｏｒｉＴＦである。一部の実施形態において、本発明の伝達起点は、配列番号３の核酸配列からなる。
配列番号３ｏｒｉＴ－Ｆ
ａｇｇｃｔｃａａｃａｇｇｔｔｇｇｔｇｇｔｔｃｔｃａｃｃａｃｃａａａａｇｃａｃｃａｃａｃｃｃｃａｃｇｃａａａａａｃａａｇｔｔｔｔｔｇｃｔｇａｔｔｔｔｔｃｔｔｔａｔａａａｔａｇａｇｔｇｔｔａｔｇａａａａａｔｔａｇｔｔｔｃｔｃｔｔａｃｔｃｔｃｔｔｔａｔｇａｔａｔｔｔａａａａａａｇｃｇｇｔｇｔｃｇｇｃｇｃｇｇｃｔａｃａａｃａａｃｇｃｇｃｃｇａｃａｃｃｇｔｔｔｔｇｔａｇｇｇｇｔｇｇｔａｃｔｇａｃｔａｔｔｔｔｔａｔａａａａａａｃａｔｔａｔｔｔｔａｔａｔｔａｇｇｇｇｔｇｃｔｇｃｔａｇｃｇｇｃｇｃｇｇｔｇｔｇｔｔｔｔｔｔｔａｔａｇｇａｔａｃｃｇｃｔａｇｇｇｇｃｇｃｔｇｃｔａｇｃｇｇｔｇｃｇ

（（ｉｉｉ）ヌクレアーゼ）
一部の実施形態において、本発明のプラスミドはＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼをコードする。本発明において、様々なＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓヌクレアーゼを使用することができる。好適なＣＲＩＳＰＲ／ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓヌクレアーゼの非限定的な例は、Ｃａｓ３、Ｃａｓ４、Ｃａｓ５、Ｃａｓ５ｅ（またはＣａｓＤ）、Ｃａｓ６、Ｃａｓ６ｅ、Ｃａｓ６ｆ、Ｃａｓ７、Ｃａｓ８ａ１、Ｃａｓ８ａ２、Ｃａｓ８ｂ、Ｃａｓ８ｃ、Ｃａｓ９、Ｃａｓ１０、Ｃａｓ１０ｄ、ＣａｓＦ、ＣａｓＧ、ＣａｓＨ、Ｃｓｙ１、Ｃｓｙ２、Ｃｓｙ３、Ｃｓｅ１（またはＣａｓＡ）、Ｃｓｅ２（またはＣａｓＢ）、Ｃｓｅ３（またはＣａｓＥ）、Ｃｓｅ４（またはＣａｓＣ）、Ｃｓｃ１、Ｃｓｃ２、Ｃｓａ５、Ｃｓｎ２、Ｃｓｍ２、Ｃｓｍ３、Ｃｓｍ４、Ｃｓｍ５、Ｃｓｍ６、Ｃｍｒ１、Ｃｍｒ３、Ｃｍｒ４、Ｃｍｒ５、Ｃｍｒ６、Ｃｓｂ１、Ｃｓｂ２、Ｃｓｂ３、Ｃｓｘ１７、Ｃｓｘ１４、Ｃｓｘ１０、Ｃｓｘ１６、ＣｓａＸ、Ｃｓｘ３、Ｃｓｚ１、Ｃｓｘ１５、Ｃｓｆ１、Ｃｓｆ２、Ｃｓｆ３、Ｃｓｆ４、およびＣｕ１９６６を含む。例えば、国際公開第２０１４１４４７６１号、国際公開第２０１４１４４５９２号、国際公開第２０１３１７６７７２号、米国特許出願公開第２０１４０２７３２２６号明細書、および米国特許出願公開第２０１４０２７３２３３号明細書が参照され、これらの内容はその全体が参照することによって本明細書に援用される。

一部の実施形態において、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓヌクレアーゼは、Ｃａｓ９タンパク質に由来する。Ｃａｓ９タンパク質は、なかでも、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓｐｙｏｇｅｎｅｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ属菌種、Ｎｏｃａｒｄｉｏｐｓｉｓｄａｓｓｏｎｖｉｌｌｅｉ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓｐｒｉｓｔｉｎａｅｓｐｉｒａｌｉｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓｖｉｒｉｄｏｃｈｒｏｍｏｇｅｎｅｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓｖｉｒｉｄｏｃｈｒｏｍｏｇｅｎｅｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｓｐｏｒａｎｇｉｕｍｒｏｓｅｕｍ、Ｓｔｒｅｐｔｏｓｐｏｒａｎｇｉｕｍｒｏｓｅｕｍ、Ａｌｉｃｙｃｌｏｂａｃｉｌｌｕｓａｃｉｄｏｃａｌｄａｒｉｕｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓｐｓｅｕｄｏｍｙｃｏｉｄｅｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｅｌｅｎｉｔｉｒｅｄｕｃｅｎｓ、Ｅｘｉｇｕｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｓｉｂｉｒｉｃｕｍ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓｓａｌｉｖａｒｉｕｓ、Ｍｉｃｒｏｓｃｉｌｌａｍａｒｉｎａ、Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａｌｅｓｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｐｏｌａｒｏｍｏｎａｓｎａｐｈｔｈａｌｅｎｉｖｏｒａｎｓ、Ｐｏｌａｒｏｍｏｎａｓ属菌種、Ｃｒｏｃｏｓｐｈａｅｒａｗａｔｓｏｎｉｉ、Ｃｙａｎｏｔｈｅｃｅ属菌種、Ｍｉｃｒｏｃｙｓｔｉｓａｅｒｕｇｉｎｏｓａ、Ｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ属菌種、Ａｃｅｔｏｈａｌｏｂｉｕｍａｒａｂａｔｉｃｕｍ、Ａｍｍｏｎｉｆｅｘｄｅｇｅｎｓｉｉ、Ｃａｌｄｉｃｅｌｕｌｏｓｉｒｕｐｔｏｒｂｅｃｓｃｉｉ、ＣａｎｄｉｄａｔｕｓＤｅｓｕｌｆｏｒｕｄｉｓ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍｂｏｔｕｌｉｎｕｍ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍｄｉｆｆｉｃｉｌｅ、Ｆｉｎｅｇｏｌｄｉａｍａｇｎａ、Ｎａｔｒａｎａｅｒｏｂｉｕｓｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ、Ｐｅｌｏｔｏｍａｃｕｌｕｍｔｈｅｒｍｏｐｒｏｐｉｏｎｉｃｕｍ、Ａｃｉｄｉｔｈｉｏｂａｃｉｌｌｕｓｃａｌｄｕｓ、Ａｃｉｄｉｔｈｉｏｂａｃｉｌｌｕｓｆｅｒｒｏｏｘｉｄａｎｓ、Ａｌｌｏｃｈｒｏｍａｔｉｕｍｖｉｎｏｓｕｍ、Ｍａｒｉｎｏｂａｃｔｅｒ属菌種、Ｎｉｔｒｏｓｏｃｏｃｃｕｓｈａｌｏｐｈｉｌｕｓ、Ｎｉｔｒｏｓｏｃｏｃｃｕｓｗａｔｓｏｎｉ、Ｐｓｅｕｄｏａｌｔｅｒｏｍｏｎａｓｈａｌｏｐｌａｎｋｔｉｓ、Ｋｔｅｄｏｎｏｂａｃｔｅｒｒａｃｅｍｉｆｅｒ、Ｍｅｔｈａｎｏｈａｌｏｂｉｕｍｅｖｅｓｔｉｇａｔｕｍ、Ａｎａｂａｅｎａｖａｒｉａｂｉｌｉｓ、Ｎｏｄｕｌａｒｉａｓｐｕｍｉｇｅｎａ、Ｎｏｓｔｏｃ属菌種、Ａｒｔｈｒｏｓｐｉｒａｍａｘｉｍａ、Ａｒｔｈｒｏｓｐｉｒａｐｌａｔｅｎｓｉｓ、Ａｒｔｈｒｏｓｐｉｒａ属菌種、Ｌｙｎｇｂｙａ属菌種、Ｍｉｃｒｏｃｏｌｅｕｓｃｈｔｈｏｎｏｐｌａｓｔｅｓ、Ｏｓｃｉｌｌａｔｏｒｉａ属菌種、Ｐｅｔｒｏｔｏｇａｍｏｂｉｌｉｓ、Ｔｈｅｒｍｏｓｉｐｈｏａｆｒｉｃａｎｕｓ、またはＡｃａｒｙｏｃｈｌｏｒｉｓｍａｒｉｎａに由来し得る。

一部の実施形態において、Ｃａｓ９ヌクレアーゼは、野生型Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓｐｙｏｇｅｎｅｓ配列と同一のヌクレオチド配列を有することができる。一部の実施形態において、Ｃａｓ９ヌクレアーゼは、配列番号４に示すアミノ酸配列を含む。
配列番号４＞Ｃａｓ９配列
ＭＤＫＫＹＳＩＧＬＡＩＧＴＮＳＶＧＷＡＶＩＴＤＥＹＫＶＰＳＫＫＦＫＶＬＧＮＴＤＲＨＳＩＫＫＮＬＩＧＡＬＬＦＤＳＧＥＴＡＥＡＴＲＬＫＲＴＡＲＲＲＹＴＲＲＫＮＲＩＣＹＬＱＥＩＦＳＮＥＭＡＫＶＤＤＳＦＦＨＲＬＥＥＳＦＬＶＥＥＤＫＫＨＥＲＨＰＩＦＧＮＩＶＤＥＶＡＹＨＥＫＹＰＴＩＹＨＬＲＫＫＬＶＤＳＴＤＫＡＤＬＲＬＩＹＬＡＬＡＨＭＩＫＦＲＧＨＦＬＩＥＧＤＬＮＰＤＮＳＤＶＤＫＬＦＩＱＬＶＱＴＹＮＱＬＦＥＥＮＰＩＮＡＳＧＶＤＡＫＡＩＬＳＡＲＬＳＫＳＲＲＬＥＮＬＩＡＱＬＰＧＥＫＫＮＧＬＦＧＮＬＩＡＬＳＬＧＬＴＰＮＦＫＳＮＦＤＬＡＥＤＡＫＬＱＬＳＫＤＴＹＤＤＤＬＤＮＬＬＡＱＩＧＤＱＹＡＤＬＦＬＡＡＫＮＬＳＤＡＩＬＬＳＤＩＬＲＶＮＴＥＩＴＫＡＰＬＳＡＳＭＩＫＲＹＤＥＨＨＱＤＬＴＬＬＫＡＬＶＲＱＱＬＰＥＫＹＫＥＩＦＦＤＱＳＫＮＧＹＡＧＹＩＤＧＧＡＳＱＥＥＦＹＫＦＩＫＰＩＬＥＫＭＤＧＴＥＥＬＬＶＫＬＮＲＥＤＬＬＲＫＱＲＴＦＤＮＧＳＩＰＨＱＩＨＬＧＥＬＨＡＩＬＲＲＱＥＤＦＹＰＦＬＫＤＮＲＥＫＩＥＫＩＬＴＦＲＩＰＹＹＶＧＰＬＡＲＧＮＳＲＦＡＷＭＴＲＫＳＥＥＴＩＴＰＷＮＦＥＥＶＶＤＫＧＡＳＡＱＳＦＩＥＲＭＴＮＦＤＫＮＬＰＮＥＫＶＬＰＫＨＳＬＬＹＥＹＦＴＶＹＮＥＬＴＫＶＫＹＶＴＥＧＭＲＫＰＡＦＬＳＧＥＱＫＫＡＩＶＤＬＬＦＫＴＮＲＫＶＴＶＫＱＬＫＥＤＹＦＫＫＩＥＣＦＤＳＶＥＩＳＧＶＥＤＲＦＮＡＳＬＧＴＹＨＤＬＬＫＩＩＫＤＫＤＦＬＤＮＥＥＮＥＤＩＬＥＤＩＶＬＴＬＴＬＦＥＤＲＥＭＩＥＥＲＬＫＴＹＡＨＬＦＤＤＫＶＭＫＱＬＫＲＲＲＹＴＧＷＧＲＬＳＲＫＬＩＮＧＩＲＤＫＱＳＧＫＴＩＬＤＦＬＫＳＤＧＦＡＮＲＮＦＭＱＬＩＨＤＤＳＬＴＦＫＥＤＩＱＫＡＱＶＳＧＱＧＤＳＬＨＥＨＩＡＮＬＡＧＳＰＡＩＫＫＧＩＬＱＴＶＫＶＶＤＥＬＶＫＶＭＧＲＨＫＰＥＮＩＶＩＥＭＡＲＥＮＱＴＴＱＫＧＱＫＮＳＲＥＲＭＫＲＩＥＥＧＩＫＥＬＧＳＱＩＬＫＥＨＰＶＥＮＴＱＬＱＮＥＫＬＹＬＹＹＬＱＮＧＲＤＭＹＶＤＱＥＬＤＩＮＲＬＳＤＹＤＶＤＨＩＶＰＱＳＦＬＫＤＤＳＩＤＮＫＶＬＴＲＳＤＫＮＲＧＫＳＤＮＶＰＳＥＥＶＶＫＫＭＫＮＹＷＲＱＬＬＮＡＫＬＩＴＱＲＫＦＤＮＬＴＫＡＥＲＧＧＬＳＥＬＤＫＡＧＦＩＫＲＱＬＶＥＴＲＱＩＴＫＨＶＡＱＩＬＤＳＲＭＮＴＫＹＤＥＮＤＫＬＩＲＥＶＫＶＩＴＬＫＳＫＬＶＳＤＦＲＫＤＦＱＦＹＫＶＲＥＩＮＮＹＨＨＡＨＤＡＹＬＮＡＶＶＧＴＡＬＩＫＫＹＰＫＬＥＳＥＦＶＹＧＤＹＫＶＹＤＶＲＫＭＩＡＫＳＥＱＥＩＧＫＡＴＡＫＹＦＦＹＳＮＩＭＮＦＦＫＴＥＩＴＬＡＮＧＥＩＲＫＲＰＬＩＥＴＮＧＥＴＧＥＩＶＷＤＫＧＲＤＦＡＴＶＲＫＶＬＳＭＰＱＶＮＩＶＫＫＴＥＶＱＴＧＧＦＳＫＥＳＩＬＰＫＲＮＳＤＫＬＩＡＲＫＫＤＷＤＰＫＫＹＧＧＦＤＳＰＴＶＡＹＳＶＬＶＶＡＫＶＥＫＧＫＳＫＫＬＫＳＶＫＥＬＬＧＩＴＩＭＥＲＳＳＦＥＫＮＰＩＤＦＬＥＡＫＧＹＫＥＶＫＫＤＬＩＩＫＬＰＫＹＳＬＦＥＬＥＮＧＲＫＲＭＬＡＳＡＧＥＬＱＫＧＮＥＬＡＬＰＳＫＹＶＮＦＬＹＬＡＳＨＹＥＫＬＫＧＳＰＥＤＮＥＱＫＱＬＦＶＥＱＨＫＨＹＬＤＥＩＩＥＱＩＳＥＦＳＫＲＶＩＬＡＤＡＮＬＤＫＶＬＳＡＹＮＫＨＲＤＫＰＩＲＥＱＡＥＮＩＩＨＬＦＴＬＴＮＬＧＡＰＡＡＦＫＹＦＤＴＴＩＤＲＫＲＹＴＳＴＫＥＶＬＤＡＴＬＩＨＱＳＩＴＧＬＹＥＴＲＩＤＬＳＱＬＧＧＤ

一部の実施形態において、ＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼは、他の菌種、例えば、ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓなどの他のＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ属菌種、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓａｅｒｕｇｉｎｏｓａ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ、または他の配列決定された細菌ゲノムおよび古細菌、または他の原核生物の微生物からの配列とすることができる。あるいは、野生型ＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓｐｙｏｇｅｎｅｓのＣａｓ９配列を改変することができる。あるいは、Ｃａｓ９ヌクレアーゼ配列は、例えば、アドジーン社（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＭＡ）のｐＸ３３０、ｐＸ２６０、またはｐＭＪ９２０などの市販のベクター内に含まれる配列であり得る。一部の実施形態において、Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼは、Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＫＭ０９９２３１．１ＧＬ６６９１９３７５７、ＫＭ０９９２３２．１、ＧＬ６６９１９３７６１、もしくはＫＭ０９９２３３．１ＧＬ６６９１９３７６５のＣａｓ９エンドヌクレアーゼ配列、またはｐＸ３３０、ｐＸ２６０、もしくはｐＭＪ９２０（Ａｄｄｇｅｎｅ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＭＡ）のＣａｓ９アミノ酸配列のいずれかの変異体またはフラグメントであるアミノ酸配列を有し得る。

一部の実施形態において、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓヌクレアーゼは、突然変異体ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓヌクレアーゼ、すなわち１つ以上の点突然変異、挿入、欠失、トランケーションを有するタンパク質、融合タンパク質、またはこれらの組合せからなる。一部の実施形態において、突然変異体は、ＲＮＡガイドＤＮＡ結合活性を有するが、そのヌクレアーゼ活性部位の一方または両方を欠く。一部の実施形態において、突然変異体は、野生型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓヌクレアーゼのアミノ酸配列と少なくとも５０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。

一部の実施形態において、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓヌクレアーゼは、野生型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓヌクレアーゼ（Ｃａｓ９など）の突然変異体またはそのフラグメントである。一部の実施形態において、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓヌクレアーゼは、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓの突然変異体Ｃａｓ９タンパク質である。一部の実施形態において、本発明のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓヌクレアーゼは、欠損Ｃａｓ９、すなわち、Ｄ１０ＡおよびＨ８４０Ａからなる群より選択される少なくとも１つの突然変異を有するＳ．ｐｙｏｇｅｎｅｓのＣａｓ９である。一部の実施形態において、本発明の塩基編集酵素は、欠損ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓヌクレアーゼを含む。配列認識機序は、非欠損ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓヌクレアーゼと同じである。典型的に、本発明の欠損ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓヌクレアーゼは、少なくとも１つのＲＮＡ結合ドメインを含む。ＲＮＡ結合ドメインは、以下に規定するようなガイドＲＮＡ分子と相互作用する。しかしながら、本発明の欠損ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓヌクレアーゼは、ヌクレアーゼ活性のない改変タイプである。したがって、欠損ＣＲＩＳＰＲ／ＣａｓヌクレアーゼはガイドＲＮＡ分子を特異的に認識して、塩基編集酵素をその標的ＤＮＡ配列にガイドする。

一部の実施形態において、本発明のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓヌクレアーゼは、ニッカーゼ、より具体的にはＣａｓ９ニッカーゼ、すなわち、Ｄ１０ＡおよびＨ８４０Ａからなる群より選択される１つの突然変異を有するＳ．ｐｙｏｇｅｎｅｓのＣａｓ９である。一部の実施形態において、本発明のニッカーゼは、配列番号５または６に示すアミノ酸配列を含む。
配列番号５＞Ｄ１０Ａ突然変異を有するＳ．ｐｙｏｇｅｎｅｓｎＣａｓ９タンパク質配列
ＭＤＫＫＹＳＩＧＬ［（Ａ）］ＩＧＴＮＳＶＧＷＡＶＩＴＤＥＹＫＶＰＳＫＫＦＫＶＬＧＮＴＤＲＨＳＩＫＫＮＬＩＧＡＬＬＦＤＳＧＥＴＡＥＡＴＲＬＫＲＴＡＲＲＲＹＴＲＲＫＮＲＩＣＹＬＱＥＩＦＳＮＥＭＡＫＶＤＤＳＦＦＨＲＬＥＥＳＦＬＶＥＥＤＫＫＨＥＲＨＰＩＦＧＮＩＶＤＥＶＡＹＨＥＫＹＰＴＩＹＨＬＲＫＫＬＶＤＳＴＤＫＡＤＬＲＬＩＹＬＡＬＡＨＭＩＫＦＲＧＨＦＬＩＥＧＤＬＮＰＤＮＳＤＶＤＫＬＦＩＱＬＶＱＴＹＮＱＬＦＥＥＮＰＩＮＡＳＧＶＤＡＫＡＩＬＳＡＲＬＳＫＳＲＲＬＥＮＬＩＡＱＬＰＧＥＫＫＮＧＬＦＧＮＬＩＡＬＳＬＧＬＴＰＮＦＫＳＮＦＤＬＡＥＤＡＫＬＱＬＳＫＤＴＹＤＤＤＬＤＮＬＬＡＱＩＧＤＱＹＡＤＬＦＬＡＡＫＮＬＳＤＡＩＬＬＳＤＩＬＲＶＮＴＥＩＴＫＡＰＬＳＡＳＭＩＫＲＹＤＥＨＨＱＤＬＴＬＬＫＡＬＶＲＱＱＬＰＥＫＹＫＥＩＦＦＤＱＳＫＮＧＹＡＧＹＩＤＧＧＡＳＱＥＥＦＹＫＦＩＫＰＩＬＥＫＭＤＧＴＥＥＬＬＶＫＬＮＲＥＤＬＬＲＫＱＲＴＦＤＮＧＳＩＰＨＱＩＨＬＧＥＬＨＡＩＬＲＲＱＥＤＦＹＰＦＬＫＤＮＲＥＫＩＥＫＩＬＴＦＲＩＰＹＹＶＧＰＬＡＲＧＮＳＲＦＡＷＭＴＲＫＳＥＥＴＩＴＰＷＮＦＥＥＶＶＤＫＧＡＳＡＱＳＦＩＥＲＭＴＮＦＤＫＮＬＰＮＥＫＶＬＰＫＨＳＬＬＹＥＹＦＴＶＹＮＥＬＴＫＶＫＹＶＴＥＧＭＲＫＰＡＦＬＳＧＥＱＫＫＡＩＶＤＬＬＦＫＴＮＲＫＶＴＶＫＱＬＫＥＤＹＦＫＫＩＥＣＦＤＳＶＥＩＳＧＶＥＤＲＦＮＡＳＬＧＴＹＨＤＬＬＫＩＩＫＤＫＤＦＬＤＮＥＥＮＥＤＩＬＥＤＩＶＬＴＬＴＬＦＥＤＲＥＭＩＥＥＲＬＫＴＹＡＨＬＦＤＤＫＶＭＫＱＬＫＲＲＲＹＴＧＷＧＲＬＳＲＫＬＩＮＧＩＲＤＫＱＳＧＫＴＩＬＤＦＬＫＳＤＧＦＡＮＲＮＦＭＱＬＩＨＤＤＳＬＴＦＫＥＤＩＱＫＡＱＶＳＧＱＧＤＳＬＨＥＨＩＡＮＬＡＧＳＰＡＩＫＫＧＩＬＱＴＶＫＶＶＤＥＬＶＫＶＭＧＲＨＫＰＥＮＩＶＩＥＭＡＲＥＮＱＴＴＱＫＧＱＫＮＳＲＥＲＭＫＲＩＥＥＧＩＫＥＬＧＳＱＩＬＫＥＨＰＶＥＮＴＱＬＱＮＥＫＬＹＬＹＹＬＱＮＧＲＤＭＹＶＤＱＥＬＤＩＮＲＬＳＤＹＤＶＤＨＩＶＰＱＳＦＬＫＤＤＳＩＤＮＫＶＬＴＲＳＤＫＮＲＧＫＳＤＮＶＰＳＥＥＶＶＫＫＭＫＮＹＷＲＱＬＬＮＡＫＬＩＴＱＲＫＦＤＮＬＴＫＡＥＲＧＧＬＳＥＬＤＫＡＧＦＩＫＲＱＬＶＥＴＲＱＩＴＫＨＶＡＱＩＬＤＳＲＭＮＴＫＹＤＥＮＤＫＬＩＲＥＶＫＶＩＴＬＫＳＫＬＶＳＤＦＲＫＤＦＱＦＹＫＶＲＥＩＮＮＹＨＨＡＨＤＡＹＬＮＡＶＶＧＴＡＬＩＫＫＹＰＫＬＥＳＥＦＶＹＧＤＹＫＶＹＤＶＲＫＭＩＡＫＳＥＱＥＩＧＫＡＴＡＫＹＦＦＹＳＮＩＭＮＦＦＫＴＥＩＴＬＡＮＧＥＩＲＫＲＰＬＩＥＴＮＧＥＴＧＥＩＶＷＤＫＧＲＤＦＡＴＶＲＫＶＬＳＭＰＱＶＮＩＶＫＫＴＥＶＱＴＧＧＦＳＫＥＳＩＬＰＫＲＮＳＤＫＬＩＡＲＫＫＤＷＤＰＫＫＹＧＧＦＤＳＰＴＶＡＹＳＶＬＶＶＡＫＶＥＫＧＫＳＫＫＬＫＳＶＫＥＬＬＧＩＴＩＭＥＲＳＳＦＥＫＮＰＩＤＦＬＥＡＫＧＹＫＥＶＫＫＤＬＩＩＫＬＰＫＹＳＬＦＥＬＥＮＧＲＫＲＭＬＡＳＡＧＥＬＱＫＧＮＥＬＡＬＰＳＫＹＶＮＦＬＹＬＡＳＨＹＥＫＬＫＧＳＰＥＤＮＥＱＫＱＬＦＶＥＱＨＫＨＹＬＤＥＩＩＥＱＩＳＥＦＳＫＲＶＩＬＡＤＡＮＬＤＫＶＬＳＡＹＮＫＨＲＤＫＰＩＲＥＱＡＥＮＩＩＨＬＦＴＬＴＮＬＧＡＰＡＡＦＫＹＦＤＴＴＩＤＲＫＲＹＴＳＴＫＥＶＬＤＡＴＬＩＨＱＳＩＴＧＬＹＥＴＲＩＤＬＳＱＬＧＧＤ
配列番号６＞Ｈ８４０Ａ突然変異を有するＳ．ｐｙｏｇｅｎｅｓｎＣａｓ９タンパク質配列
ＭＤＫＫＹＳＩＧＬＤＩＧＴＮＳＶＧＷＡＶＩＴＤＥＹＫＶＰＳＫＫＦＫＶＬＧＮＴＤＲＨＳＩＫＫＮＬＩＧＡＬＬＦＤＳＧＥＴＡＥＡＴＲＬＫＲＴＡＲＲＲＹＴＲＲＫＮＲＩＣＹＬＱＥＩＦＳＮＥＭＡＫＶＤＤＳＦＦＨＲＬＥＥＳＦＬＶＥＥＤＫＫＨＥＲＨＰＩＦＧＮＩＶＤＥＶＡＹＨＥＫＹＰＴＩＹＨＬＲＫＫＬＶＤＳＴＤＫＡＤＬＲＬＩＹＬＡＬＡＨＭＩＫＦＲＧＨＦＬＩＥＧＤＬＮＰＤＮＳＤＶＤＫＬＦＩＱＬＶＱＴＹＮＱＬＦＥＥＮＰＩＮＡＳＧＶＤＡＫＡＩＬＳＡＲＬＳＫＳＲＲＬＥＮＬＩＡＱＬＰＧＥＫＫＮＧＬＦＧＮＬＩＡＬＳＬＧＬＴＰＮＦＫＳＮＦＤＬＡＥＤＡＫＬＱＬＳＫＤＴＹＤＤＤＬＤＮＬＬＡＱＩＧＤＱＹＡＤＬＦＬＡＡＫＮＬＳＤＡＩＬＬＳＤＩＬＲＶＮＴＥＩＴＫＡＰＬＳＡＳＭＩＫＲＹＤＥＨＨＱＤＬＴＬＬＫＡＬＶＲＱＱＬＰＥＫＹＫＥＩＦＦＤＱＳＫＮＧＹＡＧＹＩＤＧＧＡＳＱＥＥＦＹＫＦＩＫＰＩＬＥＫＭＤＧＴＥＥＬＬＶＫＬＮＲＥＤＬＬＲＫＱＲＴＦＤＮＧＳＩＰＨＱＩＨＬＧＥＬＨＡＩＬＲＲＱＥＤＦＹＰＦＬＫＤＮＲＥＫＩＥＫＩＬＴＦＲＩＰＹＹＶＧＰＬＡＲＧＮＳＲＦＡＷＭＴＲＫＳＥＥＴＩＴＰＷＮＦＥＥＶＶＤＫＧＡＳＡＱＳＦＩＥＲＭＴＮＦＤＫＮＬＰＮＥＫＶＬＰＫＨＳＬＬＹＥＹＦＴＶＹＮＥＬＴＫＶＫＹＶＴＥＧＭＲＫＰＡＦＬＳＧＥＱＫＫＡＩＶＤＬＬＦＫＴＮＲＫＶＴＶＫＱＬＫＥＤＹＦＫＫＩＥＣＦＤＳＶＥＩＳＧＶＥＤＲＦＮＡＳＬＧＴＹＨＤＬＬＫＩＩＫＤＫＤＦＬＤＮＥＥＮＥＤＩＬＥＤＩＶＬＴＬＴＬＦＥＤＲＥＭＩＥＥＲＬＫＴＹＡＨＬＦＤＤＫＶＭＫＱＬＫＲＲＲＹＴＧＷＧＲＬＳＲＫＬＩＮＧＩＲＤＫＱＳＧＫＴＩＬＤＦＬＫＳＤＧＦＡＮＲＮＦＭＱＬＩＨＤＤＳＬＴＦＫＥＤＩＱＫＡＱＶＳＧＱＧＤＳＬＨＥＨＩＡＮＬＡＧＳＰＡＩＫＫＧＩＬＱＴＶＫＶＶＤＥＬＶＫＶＭＧＲＨＫＰＥＮＩＶＩＥＭＡＲＥＮＱＴＴＱＫＧＱＫＮＳＲＥＲＭＫＲＩＥＥＧＩＫＥＬＧＳＱＩＬＫＥＨＰＶＥＮＴＱＬＱＮＥＫＬＹＬＹＹＬＱＮＧＲＤＭＹＶＤＱＥＬＤＩＮＲＬＳＤＹＤＶＤ［（Ａ）］ＩＶＰＱＳＦＬＫＤＤＳＩＤＮＫＶＬＴＲＳＤＫＮＲＧＫＳＤＮＶＰＳＥＥＶＶＫＫＭＫＮＹＷＲＱＬＬＮＡＫＬＩＴＱＲＫＦＤＮＬＴＫＡＥＲＧＧＬＳＥＬＤＫＡＧＦＩＫＲＱＬＶＥＴＲＱＩＴＫＨＶＡＱＩＬＤＳＲＭＮＴＫＹＤＥＮＤＫＬＩＲＥＶＫＶＩＴＬＫＳＫＬＶＳＤＦＲＫＤＦＱＦＹＫＶＲＥＩＮＮＹＨＨＡＨＤＡＹＬＮＡＶＶＧＴＡＬＩＫＫＹＰＫＬＥＳＥＦＶＹＧＤＹＫＶＹＤＶＲＫＭＩＡＫＳＥＱＥＩＧＫＡＴＡＫＹＦＦＹＳＮＩＭＮＦＦＫＴＥＩＴＬＡＮＧＥＩＲＫＲＰＬＩＥＴＮＧＥＴＧＥＩＶＷＤＫＧＲＤＦＡＴＶＲＫＶＬＳＭＰＱＶＮＩＶＫＫＴＥＶＱＴＧＧＦＳＫＥＳＩＬＰＫＲＮＳＤＫＬＩＡＲＫＫＤＷＤＰＫＫＹＧＧＦＤＳＰＴＶＡＹＳＶＬＶＶＡＫＶＥＫＧＫＳＫＫＬＫＳＶＫＥＬＬＧＩＴＩＭＥＲＳＳＦＥＫＮＰＩＤＦＬＥＡＫＧＹＫＥＶＫＫＤＬＩＩＫＬＰＫＹＳＬＦＥＬＥＮＧＲＫＲＭＬＡＳＡＧＥＬＱＫＧＮＥＬＡＬＰＳＫＹＶＮＦＬＹＬＡＳＨＹＥＫＬＫＧＳＰＥＤＮＥＱＫＱＬＦＶＥＱＨＫＨＹＬＤＥＩＩＥＱＩＳＥＦＳＫＲＶＩＬＡＤＡＮＬＤＫＶＬＳＡＹＮＫＨＲＤＫＰＩＲＥＱＡＥＮＩＩＨＬＦＴＬＴＮＬＧＡＰＡＡＦＫＹＦＤＴＴＩＤＲＫＲＹＴＳＴＫＥＶＬＤＡＴＬＩＨＱＳＩＴＧＬＹＥＴＲＩＤＬＳＱＬＧＧＤ

一部の実施形態において、Ｃａｓ９タンパク質をコードする核酸配列は、配列番号７の核酸配列からなる。
配列番号７＞Ｃａｓ９（ａｄｄｇｅｎｅ＃４４２５０）
ａｔｇｇａｔａａｇａａａｔａｃｔｃａａｔａｇｇｃｔｔａｇａｔａｔｃｇｇｃａｃａａａｔａｇｃｇｔｃｇｇａｔｇｇｇｃｇｇｔｇａｔｃａｃｔｇａｔｇａａｔａｔａａｇｇｔｔｃｃｇｔｃｔａａａａａｇｔｔｃａａｇｇｔｔｃｔｇｇｇａａａｔａｃａｇａｃｃｇｃｃａｃａｇｔａｔｃａａａａａａａａｔｃｔｔａｔａｇｇｇｇｃｔｃｔｔｔｔａｔｔｔｇａｃａｇｔｇｇａｇａｇａｃａｇｃｇｇａａｇｃｇａｃｔｃｇｔｃｔｃａａａｃｇｇａｃａｇｃｔｃｇｔａｇａａｇｇｔａｔａｃａｃｇｔｃｇｇａａｇａａｔｃｇｔａｔｔｔｇｔｔａｔｃｔａｃａｇｇａｇａｔｔｔｔｔｔｃａａａｔｇａｇａｔｇｇｃｇａａａｇｔａｇａｔｇａｔａｇｔｔｔｃｔｔｔｃａｔｃｇａｃｔｔｇａａｇａｇｔｃｔｔｔｔｔｔｇｇｔｇｇａａｇａａｇａｃａａｇａａｇｃａｔｇａａｃｇｔｃａｔｃｃｔａｔｔｔｔｔｇｇａａａｔａｔａｇｔａｇａｔｇａａｇｔｔｇｃｔｔａｔｃａｔｇａｇａａａｔａｔｃｃａａｃｔａｔｃｔａｔｃａｔｃｔｇｃｇａａａａａａａｔｔｇｇｔａｇａｔｔｃｔａｃｔｇａｔａａａｇｃｇｇａｔｔｔｇｃｇｃｔｔａａｔｃｔａｔｔｔｇｇｃｃｔｔａｇｃｇｃａｔａｔｇａｔｔａａｇｔｔｔｃｇｔｇｇｔｃａｔｔｔｔｔｔｇａｔｔｇａｇｇｇａｇａｔｔｔａａａｔｃｃｔｇａｔａａｔａｇｔｇａｔｇｔｇｇａｃａａａｃｔａｔｔｔａｔｃｃａｇｔｔｇｇｔａｃａａａｃｃｔａｃａａｔｃａａｔｔａｔｔｔｇａａｇａａａａｃｃｃｔａｔｔａａｃｇｃａａｇｔｇｇａｇｔａｇａｔｇｃｔａａａｇｃｇａｔｔｃｔｔｔｃｔｇｃａｃｇａｔｔｇａｇｔａａａｔｃａａｇａｃｇａｔｔａｇａａａａｔｃｔｃａｔｔｇｃｔｃａｇｃｔｃｃｃｃｇｇｔｇａｇａａｇａａａａａｔｇｇｃｔｔａｔｔｔｇｇｇａａｔｃｔｃａｔｔｇｃｔｔｔｇｔｃａｔｔｇｇｇｔｔｔｇａｃｃｃｃｔａａｔｔｔｔａａａｔｃａａａｔｔｔｔｇａｔｔｔｇｇｃａｇａａｇａｔｇｃｔａａａｔｔａｃａｇｃｔｔｔｃａａａａｇａｔａｃｔｔａｃｇａｔｇａｔｇａｔｔｔａｇａｔａａｔｔｔａｔｔｇｇｃｇｃａａａｔｔｇｇａｇａｔｃａａｔａｔｇｃｔｇａｔｔｔｇｔｔｔｔｔｇｇｃａｇｃｔａａｇａａｔｔｔａｔｃａｇａｔｇｃｔａｔｔｔｔａｃｔｔｔｃａｇａｔａｔｃｃｔａａｇａｇｔａａａｔａｃｔｇａａａｔａａｃｔａａｇｇｃｔｃｃｃｃｔａｔｃａｇｃｔｔｃａａｔｇａｔｔａａａｃｇｃｔａｃｇａｔｇａａｃａｔｃａｔｃａａｇａｃｔｔｇａｃｔｃｔｔｔｔａａａａｇｃｔｔｔａｇｔｔｃｇａｃａａｃａａｃｔｔｃｃａｇａａａａｇｔａｔａａａｇａａａｔｃｔｔｔｔｔｔｇａｔｃａａｔｃａａａａａａｃｇｇａｔａｔｇｃａｇｇｔｔａｔａｔｔｇａｔｇｇｇｇｇａｇｃｔａｇｃｃａａｇａａｇａａｔｔｔｔａｔａａａｔｔｔａｔｃａａａｃｃａａｔｔｔｔａｇａａａａａａｔｇｇａｔｇｇｔａｃｔｇａｇｇａａｔｔａｔｔｇｇｔｇａａａｃｔａａａｔｃｇｔｇａａｇａｔｔｔｇｃｔｇｃｇｃａａｇｃａａｃｇｇａｃｃｔｔｔｇａｃａａｃｇｇｃｔｃｔａｔｔｃｃｃｃａｔｃａａａｔｔｃａｃｔｔｇｇｇｔｇａｇｃｔｇｃａｔｇｃｔａｔｔｔｔｇａｇａａｇａｃａａｇａａｇａｃｔｔｔｔａｔｃｃａｔｔｔｔｔａａａａｇａｃａａｔｃｇｔｇａｇａａｇａｔｔｇａａａａａａｔｃｔｔｇａｃｔｔｔｔｃｇａａｔｔｃｃｔｔａｔｔａｔｇｔｔｇｇｔｃｃａｔｔｇｇｃｇｃｇｔｇｇｃａａｔａｇｔｃｇｔｔｔｔｇｃａｔｇｇａｔｇａｃｔｃｇｇａａｇｔｃｔｇａａｇａａａｃａａｔｔａｃｃｃｃａｔｇｇａａｔｔｔｔｇａａｇａａｇｔｔｇｔｃｇａｔａａａｇｇｔｇｃｔｔｃａｇｃｔｃａａｔｃａｔｔｔａｔｔｇａａｃｇｃａｔｇａｃａａａｃｔｔｔｇａｔａａａａａｔｃｔｔｃｃａａａｔｇａａａａａｇｔａｃｔａｃｃａａａａｃａｔａｇｔｔｔｇｃｔｔｔａｔｇａｇｔａｔｔｔｔａｃｇｇｔｔｔａｔａａｃｇａａｔｔｇａｃａａａｇｇｔｃａａａｔａｔｇｔｔａｃｔｇａａｇｇａａｔｇｃｇａａａａｃｃａｇｃａｔｔｔｃｔｔｔｃａｇｇｔｇａａｃａｇａａｇａａａｇｃｃａｔｔｇｔｔｇａｔｔｔａｃｔｃｔｔｃａａａａｃａａａｔｃｇａａａａｇｔａａｃｃｇｔｔａａｇｃａａｔｔａａａａｇａａｇａｔｔａｔｔｔｃａａａａａａａｔａｇａａｔｇｔｔｔｔｇａｔａｇｔｇｔｔｇａａａｔｔｔｃａｇｇａｇｔｔｇａａｇａｔａｇａｔｔｔａａｔｇｃｔｔｃａｔｔａｇｇｔａｃｃｔａｃｃａｔｇａｔｔｔｇｃｔａａａａａｔｔａｔｔａａａｇａｔａａａｇａｔｔｔｔｔｔｇｇａｔａａｔｇａａｇａａａａｔｇａａｇａｔａｔｃｔｔａｇａｇｇａｔａｔｔｇｔｔｔｔａａｃａｔｔｇａｃｃｔｔａｔｔｔｇａａｇａｔａｇｇｇａｇａｔｇａｔｔｇａｇｇａａａｇａｃｔｔａａａａｃａｔａｔｇｃｔｃａｃｃｔｃｔｔｔｇａｔｇａｔａａｇｇｔｇａｔｇａａａｃａｇｃｔｔａａａｃｇｔｃｇｃｃｇｔｔａｔａｃｔｇｇｔｔｇｇｇｇａｃｇｔｔｔｇｔｃｔｃｇａａａａｔｔｇａｔｔａａｔｇｇｔａｔｔａｇｇｇａｔａａｇｃａａｔｃｔｇｇｃａａａａｃａａｔａｔｔａｇａｔｔｔｔｔｔｇａａａｔｃａｇａｔｇｇｔｔｔｔｇｃｃａａｔｃｇｃａａｔｔｔｔａｔｇｃａｇｃｔｇａｔｃｃａｔｇａｔｇａｔａｇｔｔｔｇａｃａｔｔｔａａａｇａａｇａｃａｔｔｃａａａａａｇｃａｃａａｇｔｇｔｃｔｇｇａｃａａｇｇｃｇａｔａｇｔｔｔａｃａｔｇａａｃａｔａｔｔｇｃａａａｔｔｔａｇｃｔｇｇｔａｇｃｃｃｔｇｃｔａｔｔａａａａａａｇｇｔａｔｔｔｔａｃａｇａｃｔｇｔａａａａｇｔｔｇｔｔｇａｔｇａａｔｔｇｇｔｃａａａｇｔａａｔｇｇｇｇｃｇｇｃａｔａａｇｃｃａｇａａａａｔａｔｃｇｔｔａｔｔｇａａａｔｇｇｃａｃｇｔｇａａａａｔｃａｇａｃａａｃｔｃａａａａｇｇｇｃｃａｇａａａａａｔｔｃｇｃｇａｇａｇｃｇｔａｔｇａａａｃｇａａｔｃｇａａｇａａｇｇｔａｔｃａａａｇａａｔｔａｇｇａａｇｔｃａｇａｔｔｃｔｔａａａｇａｇｃａｔｃｃｔｇｔｔｇａａａａｔａｃｔｃａａｔｔｇｃａａａａｔｇａａａａｇｃｔｃｔａｔｃｔｃｔａｔｔａｔｃｔｃｃａａａａｔｇｇａａｇａｇａｃａｔｇｔａｔｇｔｇｇａｃｃａａｇａａｔｔａｇａｔａｔｔａａｔｃｇｔｔｔａａｇｔｇａｔｔａｔｇａｔｇｔｃｇａｔｃａｃａｔｔｇｔｔｃｃａｃａａａｇｔｔｔｃｃｔｔａａａｇａｃｇａｔｔｃａａｔａｇａｃａａｔａａｇｇｔｃｔｔａａｃｇｃｇｔｔｃｔｇａｔａａａａａｔｃｇｔｇｇｔａａａｔｃｇｇａｔａａｃｇｔｔｃｃａａｇｔｇａａｇａａｇｔａｇｔｃａａａａａｇａｔｇａａａａａｃｔａｔｔｇｇａｇａｃａａｃｔｔｃｔａａａｃｇｃｃａａｇｔｔａａｔｃａｃｔｃａａｃｇｔａａｇｔｔｔｇａｔａａｔｔｔａａｃｇａａａｇｃｔｇａａｃｇｔｇｇａｇｇｔｔｔｇａｇｔｇａａｃｔｔｇａｔａａａｇｃｔｇｇｔｔｔｔａｔｃａａａｃｇｃｃａａｔｔｇｇｔｔｇａａａｃｔｃｇｃｃａａａｔｃａｃｔａａｇｃａｔｇｔｇｇｃａｃａａａｔｔｔｔｇｇａｔａｇｔｃｇｃａｔｇａａｔａｃｔａａａｔａｃｇａｔｇａａａａｔｇａｔａａａｃｔｔａｔｔｃｇａｇａｇｇｔｔａａａｇｔｇａｔｔａｃｃｔｔａａａａｔｃｔａａａｔｔａｇｔｔｔｃｔｇａｃｔｔｃｃｇａａａａｇａｔｔｔｃｃａａｔｔｃｔａｔａａａｇｔａｃｇｔｇａｇａｔｔａａｃａａｔｔａｃｃａｔｃａｔｇｃｃｃａｔｇａｔｇｃｇｔａｔｃｔａａａｔｇｃｃｇｔｃｇｔｔｇｇａａｃｔｇｃｔｔｔｇａｔｔａａｇａａａｔａｔｃｃａａａａｃｔｔｇａａｔｃｇｇａｇｔｔｔｇｔｃｔａｔｇｇｔｇａｔｔａｔａａａｇｔｔｔａｔｇａｔｇｔｔｃｇｔａａａａｔｇａｔｔｇｃｔａａｇｔｃｔｇａｇｃａａｇａａａｔａｇｇｃａａａｇｃａａｃｃｇｃａａａａｔａｔｔｔｃｔｔｔｔａｃｔｃｔａａｔａｔｃａｔｇａａｃｔｔｃｔｔｃａａａａｃａｇａａａｔｔａｃａｃｔｔｇｃａａａｔｇｇａｇａｇａｔｔｃｇｃａａａｃｇｃｃｃｔｃｔａａｔｃｇａａａｃｔａａｔｇｇｇｇａａａｃｔｇｇａｇａａａｔｔｇｔｃｔｇｇｇａｔａａａｇｇｇｃｇａｇａｔｔｔｔｇｃｃａｃａｇｔｇｃｇｃａａａｇｔａｔｔｇｔｃｃａｔｇｃｃｃｃａａｇｔｃａａｔａｔｔｇｔｃａａｇａａａａｃａｇａａｇｔａｃａｇａｃａｇｇｃｇｇａｔｔｃｔｃｃａａｇｇａｇｔｃａａｔｔｔｔａｃｃａａａａａｇａａａｔｔｃｇｇａｃａａｇｃｔｔａｔｔｇｃｔｃｇｔａａａａａａｇａｃｔｇｇｇａｔｃｃａａａａａａａｔａｔｇｇｔｇｇｔｔｔｔｇａｔａｇｔｃｃａａｃｇｇｔａｇｃｔｔａｔｔｃａｇｔｃｃｔａｇｔｇｇｔｔｇｃｔａａｇｇｔｇｇａａａａａｇｇｇａａａｔｃｇａａｇａａｇｔｔａａａａｔｃｃｇｔｔａａａｇａｇｔｔａｃｔａｇｇｇａｔｃａｃａａｔｔａｔｇｇａａａｇａａｇｔｔｃｃｔｔｔｇａａａａａａａｔｃｃｇａｔｔｇａｃｔｔｔｔｔａｇａａｇｃｔａａａｇｇａｔａｔａａｇｇａａｇｔｔａａａａａａｇａｃｔｔａａｔｃａｔｔａａａｃｔａｃｃｔａａａｔａｔａｇｔｃｔｔｔｔｔｇａｇｔｔａｇａａａａｃｇｇｔｃｇｔａａａｃｇｇａｔｇｃｔｇｇｃｔａｇｔｇｃｃｇｇａｇａａｔｔａｃａａａａａｇｇａａａｔｇａｇｃｔｇｇｃｔｃｔｇｃｃａａｇｃａａａｔａｔｇｔｇａａｔｔｔｔｔｔａｔａｔｔｔａｇｃｔａｇｔｃａｔｔａｔｇａａａａｇｔｔｇａａｇｇｇｔａｇｔｃｃａｇａａｇａｔａａｃｇａａｃａａａａａｃａａｔｔｇｔｔｔｇｔｇｇａｇｃａｇｃａｔａａｇｃａｔｔａｔｔｔａｇａｔｇａｇａｔｔａｔｔｇａｇｃａａａｔｃａｇｔｇａａｔｔｔｔｃｔａａｇｃｇｔｇｔｔａｔｔｔｔａｇｃａｇａｔｇｃｃａａｔｔｔａｇａｔａａａｇｔｔｃｔｔａｇｔｇｃａｔａｔａａｃａａａｃａｔａｇａｇａｃａａａｃｃａａｔａｃｇｔｇａａｃａａｇｃａｇａａａａｔａｔｔａｔｔｃａｔｔｔａｔｔｔａｃｇｔｔｇａｃｇａａｔｃｔｔｇｇａｇｃｔｃｃｃｇｃｔｇｃｔｔｔｔａａａｔａｔｔｔｔｇａｔａｃａａｃａａｔｔｇａｔｃｇｔａａａｃｇａｔａｔａｃｇｔｃｔａｃａａａａｇａａｇｔｔｔｔａｇａｔｇｃｃａｃｔｃｔｔａｔｃｃａｔｃａａｔｃｃａｔｃａｃｔｇｇｔｃｔｔｔａｔｇａａａｃａｃｇｃａｔｔｇａｔｔｔｇａｇｔｃａｇｃｔａｇｇａｇｇｔｇａｃｔａａ

一部の実施形態において、欠損Ｃａｓ９タンパク質をコードする核酸配列は、配列番号８の核酸配列からなる。
配列番号８＞ｄＣａｓ９（ａｄｄｇｅｎｅ＃４４２４９）
ａｔｇｇａｔａａｇａａａｔａｃｔｃａａｔａｇｇｃｔｔａ（ｇｃｔ）ａｔｃｇｇｃａｃａａａｔａｇｃｇｔｃｇｇａｔｇｇｇｃｇｇｔｇａｔｃａｃｔｇａｔｇａａｔａｔａａｇｇｔｔｃｃｇｔｃｔａａａａａｇｔｔｃａａｇｇｔｔｃｔｇｇｇａａａｔａｃａｇａｃｃｇｃｃａｃａｇｔａｔｃａａａａａａａａｔｃｔｔａｔａｇｇｇｇｃｔｃｔｔｔｔａｔｔｔｇａｃａｇｔｇｇａｇａｇａｃａｇｃｇｇａａｇｃｇａｃｔｃｇｔｃｔｃａａａｃｇｇａｃａｇｃｔｃｇｔａｇａａｇｇｔａｔａｃａｃｇｔｃｇｇａａｇａａｔｃｇｔａｔｔｔｇｔｔａｔｃｔａｃａｇｇａｇａｔｔｔｔｔｔｃａａａｔｇａｇａｔｇｇｃｇａａａｇｔａｇａｔｇａｔａｇｔｔｔｃｔｔｔｃａｔｃｇａｃｔｔｇａａｇａｇｔｃｔｔｔｔｔｔｇｇｔｇｇａａｇａａｇａｃａａｇａａｇｃａｔｇａａｃｇｔｃａｔｃｃｔａｔｔｔｔｔｇｇａａａｔａｔａｇｔａｇａｔｇａａｇｔｔｇｃｔｔａｔｃａｔｇａｇａａａｔａｔｃｃａａｃｔａｔｃｔａｔｃａｔｃｔｇｃｇａａａａａａａｔｔｇｇｔａｇａｔｔｃｔａｃｔｇａｔａａａｇｃｇｇａｔｔｔｇｃｇｃｔｔａａｔｃｔａｔｔｔｇｇｃｃｔｔａｇｃｇｃａｔａｔｇａｔｔａａｇｔｔｔｃｇｔｇｇｔｃａｔｔｔｔｔｔｇａｔｔｇａｇｇｇａｇａｔｔｔａａａｔｃｃｔｇａｔａａｔａｇｔｇａｔｇｔｇｇａｃａａａｃｔａｔｔｔａｔｃｃａｇｔｔｇｇｔａｃａａａｃｃｔａｃａａｔｃａａｔｔａｔｔｔｇａａｇａａａａｃｃｃｔａｔｔａａｃｇｃａａｇｔｇｇａｇｔａｇａｔｇｃｔａａａｇｃｇａｔｔｃｔｔｔｃｔｇｃａｃｇａｔｔｇａｇｔａａａｔｃａａｇａｃｇａｔｔａｇａａａａｔｃｔｃａｔｔｇｃｔｃａｇｃｔｃｃｃｃｇｇｔｇａｇａａｇａａａａａｔｇｇｃｔｔａｔｔｔｇｇｇａａｔｃｔｃａｔｔｇｃｔｔｔｇｔｃａｔｔｇｇｇｔｔｔｇａｃｃｃｃｔａａｔｔｔｔａａａｔｃａａａｔｔｔｔｇａｔｔｔｇｇｃａｇａａｇａｔｇｃｔａａａｔｔａｃａｇｃｔｔｔｃａａａａｇａｔａｃｔｔａｃｇａｔｇａｔｇａｔｔｔａｇａｔａａｔｔｔａｔｔｇｇｃｇｃａａａｔｔｇｇａｇａｔｃａａｔａｔｇｃｔｇａｔｔｔｇｔｔｔｔｔｇｇｃａｇｃｔａａｇａａｔｔｔａｔｃａｇａｔｇｃｔａｔｔｔｔａｃｔｔｔｃａｇａｔａｔｃｃｔａａｇａｇｔａａａｔａｃｔｇａａａｔａａｃｔａａｇｇｃｔｃｃｃｃｔａｔｃａｇｃｔｔｃａａｔｇａｔｔａａａｃｇｃｔａｃｇａｔｇａａｃａｔｃａｔｃａａｇａｃｔｔｇａｃｔｃｔｔｔｔａａａａｇｃｔｔｔａｇｔｔｃｇａｃａａｃａａｃｔｔｃｃａｇａａａａｇｔａｔａａａｇａａａｔｃｔｔｔｔｔｔｇａｔｃａａｔｃａａａａａａｃｇｇａｔａｔｇｃａｇｇｔｔａｔａｔｔｇａｔｇｇｇｇｇａｇｃｔａｇｃｃａａｇａａｇａａｔｔｔｔａｔａａａｔｔｔａｔｃａａａｃｃａａｔｔｔｔａｇａａａａａａｔｇｇａｔｇｇｔａｃｔｇａｇｇａａｔｔａｔｔｇｇｔｇａａａｃｔａａａｔｃｇｔｇａａｇａｔｔｔｇｃｔｇｃｇｃａａｇｃａａｃｇｇａｃｃｔｔｔｇａｃａａｃｇｇｃｔｃｔａｔｔｃｃｃｃａｔｃａａａｔｔｃａｃｔｔｇｇｇｔｇａｇｃｔｇｃａｔｇｃｔａｔｔｔｔｇａｇａａｇａｃａａｇａａｇａｃｔｔｔｔａｔｃｃａｔｔｔｔｔａａａａｇａｃａａｔｃｇｔｇａｇａａｇａｔｔｇａａａａａａｔｃｔｔｇａｃｔｔｔｔｃｇａａｔｔｃｃｔｔａｔｔａｔｇｔｔｇｇｔｃｃａｔｔｇｇｃｇｃｇｔｇｇｃａａｔａｇｔｃｇｔｔｔｔｇｃａｔｇｇａｔｇａｃｔｃｇｇａａｇｔｃｔｇａａｇａａａｃａａｔｔａｃｃｃｃａｔｇｇａａｔｔｔｔｇａａｇａａｇｔｔｇｔｃｇａｔａａａｇｇｔｇｃｔｔｃａｇｃｔｃａａｔｃａｔｔｔａｔｔｇａａｃｇｃａｔｇａｃａａａｃｔｔｔｇａｔａａａａａｔｃｔｔｃｃａａａｔｇａａａａａｇｔａｃｔａｃｃａａａａｃａｔａｇｔｔｔｇｃｔｔｔａｔｇａｇｔａｔｔｔｔａｃｇｇｔｔｔａｔａａｃｇａａｔｔｇａｃａａａｇｇｔｃａａａｔａｔｇｔｔａｃｔｇａａｇｇａａｔｇｃｇａａａａｃｃａｇｃａｔｔｔｃｔｔｔｃａｇｇｔｇａａｃａｇａａｇａａａｇｃｃａｔｔｇｔｔｇａｔｔｔａｃｔｃｔｔｃａａａａｃａａａｔｃｇａａａａｇｔａａｃｃｇｔｔａａｇｃａａｔｔａａａａｇａａｇａｔｔａｔｔｔｃａａａａａａａｔａｇａａｔｇｔｔｔｔｇａｔａｇｔｇｔｔｇａａａｔｔｔｃａｇｇａｇｔｔｇａａｇａｔａｇａｔｔｔａａｔｇｃｔｔｃａｔｔａｇｇｔａｃｃｔａｃｃａｔｇａｔｔｔｇｃｔａａａａａｔｔａｔｔａａａｇａｔａａａｇａｔｔｔｔｔｔｇｇａｔａａｔｇａａｇａａａａｔｇａａｇａｔａｔｃｔｔａｇａｇｇａｔａｔｔｇｔｔｔｔａａｃａｔｔｇａｃｃｔｔａｔｔｔｇａａｇａｔａｇｇｇａｇａｔｇａｔｔｇａｇｇａａａｇａｃｔｔａａａａｃａｔａｔｇｃｔｃａｃｃｔｃｔｔｔｇａｔｇａｔａａｇｇｔｇａｔｇａａａｃａｇｃｔｔａａａｃｇｔｃｇｃｃｇｔｔａｔａｃｔｇｇｔｔｇｇｇｇａｃｇｔｔｔｇｔｃｔｃｇａａａａｔｔｇａｔｔａａｔｇｇｔａｔｔａｇｇｇａｔａａｇｃａａｔｃｔｇｇｃａａａａｃａａｔａｔｔａｇａｔｔｔｔｔｔｇａａａｔｃａｇａｔｇｇｔｔｔｔｇｃｃａａｔｃｇｃａａｔｔｔｔａｔｇｃａｇｃｔｇａｔｃｃａｔｇａｔｇａｔａｇｔｔｔｇａｃａｔｔｔａａａｇａａｇａｃａｔｔｃａａａａａｇｃａｃａａｇｔｇｔｃｔｇｇａｃａａｇｇｃｇａｔａｇｔｔｔａｃａｔｇａａｃａｔａｔｔｇｃａａａｔｔｔａｇｃｔｇｇｔａｇｃｃｃｔｇｃｔａｔｔａａａａａａｇｇｔａｔｔｔｔａｃａｇａｃｔｇｔａａａａｇｔｔｇｔｔｇａｔｇａａｔｔｇｇｔｃａａａｇｔａａｔｇｇｇｇｃｇｇｃａｔａａｇｃｃａｇａａａａｔａｔｃｇｔｔａｔｔｇａａａｔｇｇｃａｃｇｔｇａａａａｔｃａｇａｃａａｃｔｃａａａａｇｇｇｃｃａｇａａａａａｔｔｃｇｃｇａｇａｇｃｇｔａｔｇａａａｃｇａａｔｃｇａａｇａａｇｇｔａｔｃａａａｇａａｔｔａｇｇａａｇｔｃａｇａｔｔｃｔｔａａａｇａｇｃａｔｃｃｔｇｔｔｇａａａａｔａｃｔｃａａｔｔｇｃａａａａｔｇａａａａｇｃｔｃｔａｔｃｔｃｔａｔｔａｔｃｔｃｃａａａａｔｇｇａａｇａｇａｃａｔｇｔａｔｇｔｇｇａｃｃａａｇａａｔｔａｇａｔａｔｔａａｔｃｇｔｔｔａａｇｔｇａｔｔａｔｇａｔｇｔｃｇａｔ（ｇｃｃ）ａｔｔｇｔｔｃｃａｃａａａｇｔｔｔｃｃｔｔａａａｇａｃｇａｔｔｃａａｔａｇａｃａａｔａａｇｇｔｃｔｔａａｃｇｃｇｔｔｃｔｇａｔａａａａａｔｃｇｔｇｇｔａａａｔｃｇｇａｔａａｃｇｔｔｃｃａａｇｔｇａａｇａａｇｔａｇｔｃａａａａａｇａｔｇａａａａａｃｔａｔｔｇｇａｇａｃａａｃｔｔｃｔａａａｃｇｃｃａａｇｔｔａａｔｃａｃｔｃａａｃｇｔａａｇｔｔｔｇａｔａａｔｔｔａａｃｇａａａｇｃｔｇａａｃｇｔｇｇａｇｇｔｔｔｇａｇｔｇａａｃｔｔｇａｔａａａｇｃｔｇｇｔｔｔｔａｔｃａａａｃｇｃｃａａｔｔｇｇｔｔｇａａａｃｔｃｇｃｃａａａｔｃａｃｔａａｇｃａｔｇｔｇｇｃａｃａａａｔｔｔｔｇｇａｔａｇｔｃｇｃａｔｇａａｔａｃｔａａａｔａｃｇａｔｇａａａａｔｇａｔａａａｃｔｔａｔｔｃｇａｇａｇｇｔｔａａａｇｔｇａｔｔａｃｃｔｔａａａａｔｃｔａａａｔｔａｇｔｔｔｃｔｇａｃｔｔｃｃｇａａａａｇａｔｔｔｃｃａａｔｔｃｔａｔａａａｇｔａｃｇｔｇａｇａｔｔａａｃａａｔｔａｃｃａｔｃａｔｇｃｃｃａｔｇａｔｇｃｇｔａｔｃｔａａａｔｇｃｃｇｔｃｇｔｔｇｇａａｃｔｇｃｔｔｔｇａｔｔａａｇａａａｔａｔｃｃａａａａｃｔｔｇａａｔｃｇｇａｇｔｔｔｇｔｃｔａｔｇｇｔｇａｔｔａｔａａａｇｔｔｔａｔｇａｔｇｔｔｃｇｔａａａａｔｇａｔｔｇｃｔａａｇｔｃｔｇａｇｃａａｇａａａｔａｇｇｃａａａｇｃａａｃｃｇｃａａａａｔａｔｔｔｃｔｔｔｔａｃｔｃｔａａｔａｔｃａｔｇａａｃｔｔｃｔｔｃａａａａｃａｇａａａｔｔａｃａｃｔｔｇｃａａａｔｇｇａｇａｇａｔｔｃｇｃａａａｃｇｃｃｃｔｃｔａａｔｃｇａａａｃｔａａｔｇｇｇｇａａａｃｔｇｇａｇａａａｔｔｇｔｃｔｇｇｇａｔａａａｇｇｇｃｇａｇａｔｔｔｔｇｃｃａｃａｇｔｇｃｇｃａａａｇｔａｔｔｇｔｃｃａｔｇｃｃｃｃａａｇｔｃａａｔａｔｔｇｔｃａａｇａａａａｃａｇａａｇｔａｃａｇａｃａｇｇｃｇｇａｔｔｃｔｃｃａａｇｇａｇｔｃａａｔｔｔｔａｃｃａａａａａｇａａａｔｔｃｇｇａｃａａｇｃｔｔａｔｔｇｃｔｃｇｔａａａａａａｇａｃｔｇｇｇａｔｃｃａａａａａａａｔａｔｇｇｔｇｇｔｔｔｔｇａｔａｇｔｃｃａａｃｇｇｔａｇｃｔｔａｔｔｃａｇｔｃｃｔａｇｔｇｇｔｔｇｃｔａａｇｇｔｇｇａａａａａｇｇｇａａａｔｃｇａａｇａａｇｔｔａａａａｔｃｃｇｔｔａａａｇａｇｔｔａｃｔａｇｇｇａｔｃａｃａａｔｔａｔｇｇａａａｇａａｇｔｔｃｃｔｔｔｇａａａａａａａｔｃｃｇａｔｔｇａｃｔｔｔｔｔａｇａａｇｃｔａａａｇｇａｔａｔａａｇｇａａｇｔｔａａａａａａｇａｃｔｔａａｔｃａｔｔａａａｃｔａｃｃｔａａａｔａｔａｇｔｃｔｔｔｔｔｇａｇｔｔａｇａａａａｃｇｇｔｃｇｔａａａｃｇｇａｔｇｃｔｇｇｃｔａｇｔｇｃｃｇｇａｇａａｔｔａｃａａａａａｇｇａａａｔｇａｇｃｔｇｇｃｔｃｔｇｃｃａａｇｃａａａｔａｔｇｔｇａａｔｔｔｔｔｔａｔａｔｔｔａｇｃｔａｇｔｃａｔｔａｔｇａａａａｇｔｔｇａａｇｇｇｔａｇｔｃｃａｇａａｇａｔａａｃｇａａｃａａａａａｃａａｔｔｇｔｔｔｇｔｇｇａｇｃａｇｃａｔａａｇｃａｔｔａｔｔｔａｇａｔｇａｇａｔｔａｔｔｇａｇｃａａａｔｃａｇｔｇａａｔｔｔｔｃｔａａｇｃｇｔｇｔｔａｔｔｔｔａｇｃａｇａｔｇｃｃａａｔｔｔａｇａｔａａａｇｔｔｃｔｔａｇｔｇｃａｔａｔａａｃａａａｃａｔａｇａｇａｃａａａｃｃａａｔａｃｇｔｇａａｃａａｇｃａｇａａａａｔａｔｔａｔｔｃａｔｔｔａｔｔｔａｃｇｔｔｇａｃｇａａｔｃｔｔｇｇａｇｃｔｃｃｃｇｃｔｇｃｔｔｔｔａａａｔａｔｔｔｔｇａｔａｃａａｃａａｔｔｇａｔｃｇｔａａａｃｇａｔａｔａｃｇｔｃｔａｃａａａａｇａａｇｔｔｔｔａｇａｔｇｃｃａｃｔｃｔｔａｔｃｃａｔｃａａｔｃｃａｔｃａｃｔｇｇｔｃｔｔｔａｔｇａａａｃａｃｇｃａｔｔｇａｔｔｔｇａｇｔｃａｇｃｔａｇｇａｇｇｔｇａｃｔａａ

一部の実施形態において、ヌクレアーゼをコードする核酸配列は、弱い恒常的プロモーターと作動可能に連結される。一部の実施形態において、ヌクレアーゼをコードする核酸配列は、配列番号９の核酸配列を有する弱い恒常的プロモーターＢＢａ＿Ｊ２３１０７と作動可能に連結される。
配列番号９＞ＢＢａ＿Ｊ２３１０７プロモーター
ｔｔｔａｃｇｇｃｔａｇｃｔｃａｇｃｃｃｔａｇｇｔａｔｔａｔｇｃｔａｇｃＡＧＡＴＣＴａａａｇａｇｇａｇａａａ

（（ｉｖ）ガイドＲＮＡ分子）
一部の実施形態において、本発明のプラスミドは、ガイドＲＮＡ分子をコードする、２、３、３、４、５、６、７、８、９、または１０個の核酸配列を含む。

一部の実施形態において、本発明のプラスミドによってコードされるガイドＲＮＡ分子は、スペーサー配列（すなわち、ｃｒＲＮＡ）およびトランス活性化ＲＮＡ（「ｔｒａｃｒＲＮＡ」）配列を含む。

一部の実施形態において、スペーサー配列は、レシピエント細菌細胞内に存在する任意の特定の標的配列に相補的である。典型的に、スペーサー配列は、当技術において周知である任意のカスタムアルゴリズムによって設計され、典型的には、実施例に記載されるカスタムアルゴリズムＣＳＴＢによって設計される。

一部の実施形態において、スペーサー配列は、病原性または微生物の代謝の他の態様に関与する遺伝子を標的とする。一部の実施形態において、スペーサー配列は、細菌の代謝に関与する遺伝子、より具体的にはバイオフィルム産生に関与する遺伝子の標的領域に相補的である。

一部の実施形態において、スペーサー配列は、抗生物質耐性遺伝子を標的とする。例えば、β－ラクタマーゼをコードする耐性遺伝子（ｂｌａ遺伝子）は、広範な種々のβ－ラクタム抗生物質に対する耐性を与えるものが多く存在する。一部の実施形態において、本発明のプラスミドは、それぞれ１つ以上のβ－ラクタマーゼ遺伝子の標的配列に十分に相補的なスペーサー配列を含む１つ以上のＲＮＡガイド分子を転写している。例えば、１つ以上のＲＮＡガイド分子は、ＮＤＭ、ＶＩＭ、ＩＭＰ、ＫＰＣ、ＯＸＡ、ＴＥＭ、ＳＨＶ、ＣＴＸ、ＯＫＰ、ＬＥＮ、ＧＥＳ、ＭＩＲ、ＡＣＴ、ＡＣＣ、ＣＭＹ、ＬＡＴ、およびＦＯＸからなる群より選択される遺伝子の１つ以上またはすべてを標的とし得る特に、１つ以上のＲＮＡガイド分子は、β－ラクタムファミリーの抗生物質耐性遺伝子の標的配列に十分に相補的なスペーサー配列を含み、これは、ＮＤＭ－１、－２、－１０の標的配列と十分に相補的な第１のスペーサー配列、ＶＩＭ－１、－２、－４、－１２、－１９、－２６、－２７－３３、３４の標的配列と十分に相補的な第２のスペーサー、ＩＭＰ－３２、－３８、－４８の標的配列と十分に相補的な第３のスペーサー、ＫＰＣ－１、－２、－３、－４、－６、－７、－８、－１１、－１２、－１４、－１５、－１６、－１７の標的配列と十分に相補的な第４のスペーサー、ＯＸＡ－４８の標的配列と十分に相補的な第５のスペーサー、ＴＥＭ－１、－１Ｂ、－３、－１３９、－１６２、－１８３、－１９２、－１９７、－１９８、－２０９の標的配列と十分に相補的な第６のスペーサー、ＳＨＶおよびその変異体の標的配列と十分に相補的な第７のスペーサー、ＣＴＸおよびその変異体の標的配列と十分に相補的な第８のスペーサー、の１つ以上またはすべてを含む。

一部の実施形態において、スペーサー配列は、標的配列にＤＳＢを生じさせるように設計されている。例えば、標的配列が細菌の染色体またはプラスミドなどの染色体またはレプリコン（例えばプラスミド）上に位置する場合、ＤＳＢは染色体またはレプリコンの分解、ひいては喪失をもたらし得る。標的配列が細菌の染色体上に位置する場合、レシピエントはＤＳＢの結果として直接的に死滅し得る。さらに、一部の天然プラスミドは、細胞がプラスミドを失った場合にのみ毒性となる殺傷機能を持ち、これは分裂する細胞におけるプラスミドの忠実な継承を確実にするための自然な機序である。抗生物質耐性遺伝子の標的配列を持つプラスミドが、こうした殺傷機能をも持っており、生じたＤＳＢの結果としてプラスミドが失われた場合、細胞は死滅し得る。

一部の実施形態において、スペーサー配列は、表Ａから選択される核酸配列によってコードされる。

一部の実施形態において、スペース配列をコードする核酸配列は、本発明のプラスミドにおける上述のスペーサー配列の迅速なクローニングを可能にするように、各端部において制限部位に隣接する。

一部の実施形態において、ガイドＲＮＡ分子のｔｒａｃｒＲＮＡ配列は、配列番号２５の核酸配列によってコードされる。
配列番号２５＞ｔｒａｃｒＲＮＡ配列
ｇｔｔｔｔａｇａｇｃｔａｇａａａｔａｇｃａａｇｔｔａａａａｔａａｇｇｃｔａｇｔｃｃｇｔｔａｔｃａａｃｔｔｇａａａａａｇｔｇｇｃａｃｃｇａｇｔｃｇｇｔｇｃ

一部の実施形態において、ガイドＲＮＡ分子をコードする核酸配列は、強い恒常的プロモーターと作動可能に連結される。一部の実施形態において、ガイドＲＮＡ分子をコードする核酸配列は、配列番号２６の核酸配列を有する強い恒常的プロモーターＢＢａ＿Ｊ２３１１９と作動可能に連結される。
配列番号２６＞ＢＢａ＿Ｊ２３１１９プロモーター
ｔｔｇａｃａｇｃｔａｇｃｔｃａｇｔｃｃｔａｇｇｔａｔａａｔａｃｔａｇｔ

（（ｖ）任意の選択マーカー遺伝子）
一部の実施形態において、本発明のプラスミドは、任意で１つ以上の選択マーカーを含む。本発明のプラスミドを含む形質転換細胞は、様々な正および／または負の選択マーカーによって実際に選択され得る。

例えば、正の選択マーカーは、アミノ酸などの必須栄養素が存在しない場合に増殖を可能にする遺伝子とすることができる。様々な好適な正／負の選択ペアが当技術において利用可能である。例えば、当技術で知られている様々なアミノ酸類似体を負の選択として使用することができる一方、（アミノ酸類似体に対する）最少培地における増殖を正の選択として使用することができ得る。

また、視覚的に検出可能なマーカーも本発明における使用に適しており、蛍光標識細胞分取（ＦＡＣＳ）またはやマイクロ流体などの技術を使用して、正負の選択およびスクリーニングを行い得る。検出可能なマーカーの例は、様々な酵素、補欠分子族、蛍光マーカー、発光マーカー、生物発光マーカーおよび同様のものを含む。好適な蛍光タンパク質の例は、黄色蛍光タンパク質（ＹＦＰ）、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、シアン蛍光タンパク質（ＣＦＰ）、ウンベリフェロン、フルオレセイン、フルオレセインイソチオシアネート、ローダミン、ジクロロトリアジニルアミン（ｄｉｃｈｉｏｒｏｔｒｉａｚｉｎｙｌａｍｉｎｅ）フルオレセイン、ダンシルクロリド、フィコエリスリンおよび同様のものを含むが、これらに限定されない。好適な生物発光マーカーの例は、ルシフェラーゼ（例えば、細菌、ホタル、クリックビートル等）、ルシフェリン、エクオリンおよび同様のものを含むが、これらに限定されない。視覚的に検出可能な信号を有する好適な酵素システムの例は、ガラクトシダーゼ、グルコリニダーゼ（ｇｌｕｃｏｒｉｎｉｄａｓｅ）、ホスファターゼ、ペルオキシダーゼ、コリンエステラーゼおよび同様のものを含むが、これらに限定されない。

一部の実施形態において、正の選択マーカーは、化合物に対する耐性を付与する遺伝子であり、該化合物は遺伝子が存在しない場合に細胞にとって致死的となり得る。例えば、抗生物質耐性遺伝子を発現する細胞は抗生物質の存在下で生存するが、その遺伝子を有しない細胞は生存しないことになる。好適な抗生物質耐性遺伝子は、アンピシリン耐性遺伝子、ネオマイシン耐性遺伝子、ブラストサイジン耐性遺伝子、ハイグロマイシン耐性遺伝子、ピューロマイシン耐性遺伝子、クロラムフェニコール耐性遺伝子、アプラマイシン耐性遺伝子および同様のものを含むが、これらに限定されない。

（（ｖｉ）特異的なプラスミド）
一部の実施形態において、本発明のプラスミドは、配列番号２７または２８に示す核酸配列からなる。
配列番号２７＞ＴＡＰ_Ｋｎ－Ｃａｓ９－ｎｓｐ
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配列番号２８＞ＴＡＰ_Ｋｎ－ｄＣａｓ９－ｎｓｐ
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（（ｖｉｉ）プラスミドを作製する方法）
本発明のプラスミドは、本技術分野内の従来の分子生物学、および組換えＤＮＡ技術を使用して作製され得る。そうした技術は文献において十分に説明されている。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ、Ｆｒｉｔｓｃｈ、およびＭａｎｉａｔｉｓ、「ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ：ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ」、第２版（１９８９）ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙＰｒｅｓｓ、ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒ、ＮｅｗＹｏｒｋ（本明細書においては「Ｓａｍｂｒｏｏｋ等、１９８９」）、「ＤＮＡＣｌｏｎｉｎｇ：ＡＰｒａｃｔｉｃａｌＡｐｐｒｏａｃｈ」、ＩおよびＩＩ巻（Ｄ．Ｎ．Ｇｌｏｖｅｒ編、１９８５）、Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌ等（編）、「ＣｕｒｒｅｎｔＰｒｏｔｏｃｏｌｓｉｎＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ」、ＪｏｈｎＷｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．（１９９４）を参照されたい。

（ドナー細菌細胞）
本発明のさらなる目的は、本発明における所定のコピー数の標的抗菌性プラスミドを含むドナー細菌細胞である。

また、本発明のドナー細菌細胞は、接合伝達遺伝子を含んでおり、したがって典型的に所定のコピー数の接合性プラスミドを含む。接合伝達（ｔｒａ）遺伝子は、多くの接合性細菌プラスミドにおいて特徴が記述されている。遺伝子モジュール同士の間の互換性により、グラム陽性菌種およびグラム陰性菌種を含む、接合伝達を受けやすい宿主の範囲が付与される。本発明における使用に適した、特徴が記述されているｔｒａ遺伝子の例は、（１）Ｆ（Ｆｉｒｔｈ，Ｎ．，Ｉｐｐｅｎ－Ｉｈｌｅｒ，Ｋ．ａｎｄＳｋｕｒｒａｙ，Ｒ．Ａ．１９９６，ＳｔｒｕｃｔｕｒｅａｎｄｆｕｎｃｔｉｏｎｏｆＦｆａｃｔｏｒａｎｄｍｅｃｈａｎｉｓｍｏｆｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ．Ｉｎ：ＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉａｎｄＳａｌｍｏｎｅｌｌａ，Ｎｅｉｄｈａｒｄｅｔａｌ．，ｅｄｓ．，ＡＳＭＰｒｅｓｓ，ＷａｓｈｉｎｇｔｏｎＤ．Ｃ．）、（２）ＲＰ４（Ｎｕｎｅｚ，Ｂ．，Ａｖｉｌａ，Ｐ．ａｎｄｄｅｌａＣｒｕｚ，１９９７，ＧｅｎｅｓｉｎｖｏｌｖｅｄｉｎｃｏｎｊｕｇａｔｉｖｅＤＮＡｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ．Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ．２４：１１５７－１１６８）、および（３）Ｔｉ（Ｆｅｒｒａｎｄ，Ｓ．Ｋ．，Ｈｗａｎｇ，Ｉ．ａｎｄＣｏｏｋ，Ｄ．Ｍ．１９９６，ＴｈｅｔｒａｒｅｇｉｏｎｏｆＮｏｐａｌｉｎｅｔｙｐｅＴｉｐｌａｓｍｉｄｉｓａｃｈｉｍｅｒａｗｉｔｈｅｌｅｍｅｎｔｓｒｅｌａｔｅｄｔｏｔｈｅｔｒａｎｓｆｅｒｓｙｓｔｅｍｓｏｆＲＳＦ１０１０，ＲＰ４ａｎｄＦ．Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７８：４２３３－４２４７）からのｔｒａ遺伝子である。

一部の実施形態において、本発明のドナー細菌細胞は、所定のコピー数のＦ因子、およびプラスミドＦの伝達起点を含む所定のコピー数の標的抗菌性プラスミドを含む。

一部の実施形態において、本発明のドナー細菌細胞は、所定のコピー数のＲＰ４プラスミド、およびプラスミドＲＰ４の伝達起点を含む所定のコピー数の標的抗菌性プラスミドを含む。

一部の実施形態において、ドナー細菌細胞は、Ａｃｉｄｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ科、Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔａｃｅａｅ科、Ａｃｔｉｎｏｐｏｌｙｓｐｏｒａｃｅａｅ科、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ科、Ｇｏｒｄｏｎｉａｃｅａｅ科、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ科、Ｎｏｃａｒｄｉａｃｅａｅ科、Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ科、Ｃｅｌｌｕｌｏｍｏｎａｄａｃｅａｅ科、Ｄｅｍｅｑｕｉｎａｃｅａｅ科、Ｍｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ科、Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃａｃｅａｅ科、Ｐｒｏｍｉｃｒｏｍｏｎｏｓｐｏｒａｃｅａｅ科、Ａａｒｏｂａｃｔｅｒａｃｅａｅ科、Ｍｉｃｒｏｍｏｎｏｓｐｏｒａｃｅａｅ科、Ｎｏｃａｒｄｉｏｉｄａｃｅａｅ科、Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ科、Ａｃｔｉｎｏｓｙｎｎｅｍａｔａｃｅａｅ科、Ｐｓｅｕｄｏｎｏｃａｒｄｉａｃｅａｅ科、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｔａｃｅａｅ科、Ｎｏｃａｒｄｉｏｐｓａｃｅａｅ科、Ｓｔｒｅｐｔｏｓｐｏｒａｎｇｉａｃｅａｅ科、Ｔｈｅｒｍｏｍｏｎｏｓｐｏｒａｃｅａｅ科、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ科、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄａｃｅａｅ科、Ｍａｒｉｎｉｌａｂｉｌｉａｃｅａｅ科、Ｍｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｄａｃｅａｅ科、Ｃｙｃｌｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ科、Ｃｙｔｏｐｈａｇａｃｅａｅ科、Ｆｌａｍｍｅｏｖｉｒｇａｃｅａｅ科、Ｒｈｏｄｏｔｈｅｒｍａｃｅａｅ科、Ｂｌａｔｔａｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ科、Ｃｒｙｏｍｏｒｐｈａｃｅａｅ科、Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ科、Ｓｃｈｌｅｉｆｅｒｉａｃｅａｅ科、Ｃｈｉｔｉｎｏｐｈａｇａｃｅａｅ科、Ｓａｐｒｏｓｐｉｒａｃｅａｅ科、Ｓｐｈｉｎｇｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ科、Ｃｈｌａｍｙｄｉａｃｅａｅ科、Ｐａｒａｃｈｌａｍｙｄｉａｃｅａｅ科、Ｓｉｍｋａｎｉａｃｅａｅ科、Ｗａｄｄｌｉａｃｅａｅ科、Ｂａｃｉｌｌａｃｅａｅ科、Ｌｉｓｔｅｒｉａｃｅａｅ科、Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌａｃｅａｅ科、Ｐｌａｎｏｃｏｃｃａｃｅａｅ科、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃａｃｅａｅ科、Ａｅｒｏｃｏｃｃａｃｅａｅ科、Ｃａｒｎｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ科、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃａｃｅａｅ科、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌａｃｅａｅ科、Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃａｃｅａｅ科、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃａｃｅａｅ科、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉａｃｅａｅ科、Ｅｕｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ科、Ｈｅｌｉｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ科、Ｐｅｐｔｏｃｏｃｃａｃｅａｅ科、Ｒｕｍｉｎｏｃｏｃｃａｃｅａｅ科、Ｃａｕｌｏｂａｃｔｅｒａｃｅａｅ科、Ｈｙｐｈｏｍｏｎａｄａｃｅａｅ科、Ｂｒａｄｙｒｈｉｚｏｂｉａｃｅａｅ科、Ｂｒｕｃｅｌｌａｃｅａｅ科、Ｈｙｐｈｏｍｉｃｒｏｂｉａｃｅａｅ科、Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ科、Ｒｈｉｚｏｂｉａｃｅａｅ科、Ｘａｎｔｈｏｂａｃｔｅｒａｃｅａｅ科、Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒａｃｅａｅ科、Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒａｃｅａｅ科、Ｒｈｏｄｏｓｐｉｒｉｌｌａｃｅａｅ科、Ａｌｃａｌｉｇｅｎａｃｅａｅ科、Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａｃｅａｅ科、Ｃｏｍａｍｏｎａｄａｃｅａｅ科、Ｏｘａｌｏｂａｃｔｅｒａｃｅａｅ科、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａｃｅａｅ科、Ｓｐｉｒｉｌｌａｃｅａｅ科、Ｒｈｏｄｏｃｙｃｌａｃｅａｅ科、Ｄｅｓｕｌｆｏｂａｃｔｅｒａｃｅａｅ科、Ｃｙｓｔｏｂａｃｔｅｒａｃｅａｅ科、Ｍｙｘｏｃｏｃｃａｃｅａｅ科、Ｎａｎｎｏｃｙｓｔａｃｅａｅ科、Ｐｈａｓｅｌｉｃｙｓｔｉｄａｃｅａｅ科、Ｐｏｌｙａｎｇｉａｃｅａｅ科、Ｓａｎｄａｒａｃｉｎａｃｅａｅ科、Ｓｙｎｔｒｏｐｈａｃｅａｅ科、Ｓｙｎｔｒｏｐｈｏｂａｃｔｅｒａｃｅａｅ科、Ｓｙｎｔｒｏｐｈｏｒｈａｂｄａｃｅａｅ科、Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒａｃｅａｅ科、Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒａｃｅａｅ科、Ａｃｉｄｉｔｈｉｏｂａｃｉｌｌａｃｅａｅ科、Ａｅｒｏｍｏｎａｄａｃｅａｅ科、Ｓｕｃｃｉｎｉｖｉｂｒｉｏｎａｃｅａｅ科、Ａｌｔｅｒｏｍｏｎａｄａｃｅａｅ科、Ｃｅｌｅｒｉｎａｔａｎｔｉｍｏｎａｄａｃｅａｅ科、Ｃｏｌｗｅｌｌｉａｃｅａｅ科、Ｆｅｒｒｉｍｏｎａｄａｃｅａｅ科、Ｉｄｉｏｍａｒｉｎａｃｅａｅ科、Ｍｏｒｉｔｅｌｌａｃｅａｅ科、Ｐｓｅｕｄｏａｌｔｅｒｏｍｏｎａｄａｃｅａｅ科、Ｐｓｙｃｈｒｏｍｏｎａｄａｃｅａｅ科、Ｓｈｅｗａｎｅｌｌａｃｅａｅ科、Ｃｈｒｏｍａｔｉａｃｅａｅ科、Ｅｃｔｏｔｈｉｏｒｈｏｄｏｓｐｉｒａｃｅａｅ科、Ｇｒａｎｕｌｏｓｉｃｏｃｃａｃｅａｅ科、Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ科、Ｃｏｘｉｅｌｌａｃｅａｅ科、Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａｃｅａｅ科、Ａｌｃａｎｉｖｏｒａｃａｃｅａｅ科、Ｈａｈｅｌｌａｃｅａｅ科、Ｈａｌｏｍｏｎａｄａｃｅａｅ科、Ｌｉｔｏｒｉｃｏｌａｃｅａｅ科、Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａｃｅａｅ科、Ｍｏｒａｘｅｌｌａｃｅａｅ科、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｄａｃｅａｅ科、Ｖｉｂｒｉｏｎａｃｅａｅ科、Ｎｅｖｓｋｉａｃｅａｅ科、Ｓｉｎｏｂａｃｔｅｒａｃｅａｅ科、ｔｈｏｍｏｎａｄａｃｅａｅ科、Ｂｒａｃｈｙｓｐｉｒａｃｅａｅ科、Ｂｒｅｖｉｎｅｍａｔａｃｅａｅ科、Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａｃｅａｅ科、Ｓｐｉｒｏｃｈａｅｔａｃｅａｅ科、Ｈａｌｏｐｌａｓｍａｔａｃｅａｅ科、およびＭｙｃｏｐｌａｓｍａｔａｃｅａｅ科からなる群より選択される。

一部の実施形態において、ドナー細菌細胞は、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓａｍｂｏｆａｃｉｅｎｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓａｖｅｒｍｉｔｉｌｉｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓｃａｐｒｅｏｌｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓｃａｒｃｉｎｏｓｔａｔｉｃｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓｃｅｒｖｉｎｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓｃｌａｖｕｌｉｇｅｒｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓｄａｖａｗｅｎｓｉｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓｆｒａｄｉａｅ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓｇｒｉｓｅｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓｈｙｇｒｏｓｃｏｐｉｃｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓｌａｖｅｎｄｕｌａｅ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓｌｉｖｉｄａｎｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓｎａｔａｌｅｎｓｉｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓｎｏｕｒｓｅｉ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓｋａｎａｍｙｃｅｔｉｃｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓｎｏｄｏｓｕｍ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓｔｓｕｋｕｂａｅｎｓｉｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ属菌種、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓｃｉｎｎａｍｏｎｅｎｓｉｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓｐｌａｔｅｎｓｉｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓｒｉｍｏｓｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓｓｐｅｃｔａｂｉｌｉｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓｖｅｒｔｉｃｉｌｌｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓｖｅｎｅｚｕｅｌａｅ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓｖｉｏｌａｃｅｏｎｉｇｅｒ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓｖｉｏｌａｃｅｏｒｕｂｅｒ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓｍｏｂａｒａｅｎｓｉｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓｐｅｕｃｅｔｉｃｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓｃｏｅｒｕｌｅｏｒｕｂｉｄｕｓ、Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｓｂｏｖｉｓ、Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｓｂｏｗｄｅｎｉｉ、Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｓｃａｎｉｓ、Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｓｃａｔｕｌｉ、Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｓｃｏｌｅｏｃａｎｉｓ、Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｓｅｕｒｏｐａｅｕｓ、Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｓｆｕｎｋｅｉ、Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｓｇｅｏｒｇｉａｅ、Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｓｈｏｎｇｋｏｎｇｅｎｓｉｓ、Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｓｉｓｒａｅｌｉｉ、Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｓｍａｒｉｍａｍｍａｌｉｕｍ、Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｓｍｅｙｅｒｉ、Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｓｏｒｉｃｏｌａ、Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｓｓｌａｃｋｉｉ、Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｓｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎｉ、Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｓｓｕｉｓ、Ａｃｔｉｎｏｐｌａｎｅｓｔｅｉｃｈｏｍｙｃｅｔｉｃｕｓ、Ａｃｔｉｎｏｓｙｎｎｅｍａｐｒｅｔｉｏｓｕｍ、Ｐｓｅｕｄｏｎｏｃａｒｄｉａａｕｔｏｔｒｏｐｈｉｃａ、Ａｍｙｃｏｌａｔｏｐｓｉｓｍｅｄｉｔｅｒａｎｅｉ、Ａｍｙｃｏｌａｔｏｐｓｉｓｏｒｉｅｎｔａｌｉｓ、Ｓａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａｅｒｉｔｈａｒａｅａ、Ｓａｃｃｈａｒｏｐｏｙｌｓｐｏｒａｈｉｒｓｕｔａ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓａｅｒｕｇｉｎｏｓａ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓｐｕｔｉｄａ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓｓｙｒｉｎｇａｅ、Ｘａｎｔｏｍｏｎａｓｏｒｙｓａｅ、Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａｃｅｎｏｃｅｐａｃｉａ、Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｕｂｔｉｌｉｓ、Ｂａｃｉｌｌｌｕｓｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ、Ｍｉｘｏｃｏｃｃｕｓｘａｎｔｕｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓｃａｓｅｉ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓｂｒｅｖｉｓ、Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓｌａｃｔｉｓ、Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍｃａｓｅｉ、Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍｏｘｙｄａｎｓ、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｂｉｆｉｄｕｍ、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｕｍｌｏｎｇｕｍ、Ｃｏｍｍａｍｏｎａｓ属菌種、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ、Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ属菌種、Ｓｅｒｒａｔｉａｍａｒｅｓｃｅｎｓ、Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍｔｒｉｆｏｌｉｉ、Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍｒａｄｉｏｂａｃｔｅｒ、Ｓｐｏｒａｎｇｉｕｍｃｅｌｌｕｌｏｓｕｍ、Ｃｈｏｎｄｒｏｍｙｃｅｓｃｒｏｃａｔｕｓ、Ｇｌｕｃｏｎｏｂａｃｔｅｒｏｘｙｄａｎｓ、Ｍｉｃｒｏｍｏｎｏｓｐｏｒａｇｒｉｓｅａ、Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ属菌種、Ｍｉｃｒｏｍｏｎｏｓｐｏｒａｒｈｏｄｏｒａｎｇｅａ、Ｍｉｃｒｏｍｏｎｏｓｐｏｒａｚｉｏｎｅｎｓｉｓ、Ｍｉｃｒｏｍｏｎｏｓｐｏｒａｐｕｒｐｕｒｅａ、Ｍｉｃｒｏｍｏｎｏｓｐｏｒａｉｎｙｏｅｎｓｉｓ、Ｍｉｃｒｏｍｏｎｏｓｐｏｒａｓａｇａｍｉｅｎｓｉｓ、Ｐａｌｎｏｍｏｎｏｓｐｏｒａｐａｒｏｎｔｏｓｐｏｒａ、Ｄａｃｔｙｌｏｓｐｏｒａｎｇｉｕｍｍａｔｓｕｚａｋｉｅｎｓｅ、Ｎｏｃａｒｄｉａｌａｃｔａｍｄｕｒａｎｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓｃｏｌｉｓｔｉｎｕｓ、Ｐｌａｎｏｂｉｓｐｏｒａｒｏｓｅａ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓａｒｅｎａｅ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓｋａｓｕｇａｅｎｓｉｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓｍｉｔａｋａｅｎｓｉｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓｂｉｋｉｎｉｅｎｓｉｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓａｌｂｏｎｉｇｅｒ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓｔｅｎｅｂｒａｒｉｕｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓｃｉｒｃｕｌａｎｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓｒｉｂｏｓｉｄｉｆｉｃｕｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓｃｏｌｉｓｔｉｎｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓｔｅｎｊｉｍａｒｉｅｎｓｉｓ、およびＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓｐａｃｔｕｍからなる群より選択される。

一部の実施形態において、本発明のドナー細菌細胞は非病原性である。ドナー細菌細胞は、実際に、ヒトを含む温血動物の身体に関連する数千の非病原性細菌のいずれか１つであり得る。好ましくは、身体の非滅菌部分（例えば、皮膚、消化管、泌尿生殖器領域、口、鼻道、喉および上気道、耳および目）に定着する非病原性細菌がドナー細菌細胞として利用され、本発明の方法は、これらの身体の部分における細菌感染症を処置するために使用される。特に好ましいドナー細菌種の例は、（１）Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉの非病原性株（Ｅ．ｃｏｌｉＦ１８およびＥ．ｃｏｌｉＮｉｓｓｌｅ１９１７株）、（２）Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓの様々な菌種（Ｌ．ｃａｓｅｉ、Ｌ．ｐｌａｎｔａｒｕｍ、Ｌ．ｐａｒａｃａｓｅｉ、Ｌ．ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ、Ｌ．ｆｅｒｍｅｎｔｕｍ、Ｌ．ｚｅａｅ、およびＬ．ｇａｓｓｅｒｉなど）、（３）他の非病原性またはプロバイオティクスの皮膚、またはＧＩ定着細菌、例えば、Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ、Ｂｉ．ｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉａ、Ｅｕｂａｃｔｅｒｉａ、ならびに、（４）死滅する運命にあるが、なおプラスミドを伝達することができる無核細胞である細菌ミニ細胞（例えば、Ａｄｌｅｒｅｔａｌ（１９７０）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ，ＳｃｉＵＳＡ５７；３２１－３２６；Ｆｒａｚｅｒｅｔａｌ．（１９７５）ＣｕｒｒｅｎｔＴｏｐｉｃｓｉｎＭｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙａｎｄＩｍｍｕｎｏｌｏｇｙ６９：１－８４；ＣｕｒｔｉｓｓＩＩＩによる米国特許第４，９６８，６１９号明細書）を含むが、これらに限定されない。

一部の実施形態において、ドナー細菌細胞はプロバイオティクス細胞である。一部の実施形態において、本発明のプロバイオティクス細胞は、生存可能なプロバイオティクス細胞である。一部の実施形態において、本発明のプロバイオティクス細菌株は、食品グレードの細菌、すなわち食品に使用され、一般に食品における使用に安全であるとみなされている細菌から選択される。一部の実施形態において、プロバイオティクス細菌株はグラム陰性株である。一部の実施形態において、プロバイオティクス細菌株はＥｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａａｅ科のメンバーである。一部の実施形態において、プロバイオティクス細菌株はＥ．ｃｏｌｉ株である。一部の実施形態において、本発明の教示に従って使用するためのプロバイオティクスＥ．ｃｏｌｉ株は、プロバイオティクス活性を発揮する非病原性Ｅ．ｃｏｌｉ株を含む。プロバイオティクスＥ．ｃｏｌｉ株の例は、プロバイオティクスＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ株ＢＵ－２３０－９８（ＡＴＣＣ寄託番号２０２２２６（ＤＳＭ１２７９９））であり、これは、既知である市販のプロバイオティクスＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ株Ｍ－１７の単離菌である。非病原性の例は、Ｅ．ｃｏｌｉのＮｉｓｓｌｅ１９１７である。プロバイオティクスとして知られていなかったＥ．ｃｏｌｉ株の例は、実験用のＥ．ｃｏｌｉＫ１２株である。

本発明のプラスミドは、当業者に既知の任意の方法によってドナー細菌細胞に導入することができる。形質転換の例の方法は、コンピテント細胞のエレクトロポレーションを介した形質転換、コンピテント細胞による受動的取り込み、コンピテント細胞の化学的形質転換、ならびに核酸の細胞への導入をもたらす任意の他の電気的、化学的、物理的（機械的）および／または生物学的機序（それらの任意の組合わせを含む）を含む。原核生物体を形質転換するための手順は、当技術において周知かつルーチンであり、文献において記載されている（例えば、Ｊｉａｎｇｅｔａｌ．２０１３．Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．３１：２３３－２３９；Ｒａｎｅｔａｌ．ＮａｔｕｒｅＰｒｏｔｏｃｏｌｓ８：２２８１－２３０８（２０１３）を参照されたい）。

（方法）
本発明はまた、複数のレシピエント細菌細胞を殺傷するための方法であって、上述の複数のレシピエント細菌細胞を、本発明における所定のコピー数の標的抗菌性プラスミドを含む複数のドナー細菌細胞に曝露することを含み、上述の標的抗菌性プラスミドは、上述の複数のレシピエント細菌細胞にヌクレアーゼおよび１つ以上のガイドＲＮＡ分子を発現するように構成され、上述の複数のレシピエント細菌細胞における上述のヌクレアーゼおよびガイドＲＮＡ分子の伝達および発現が上述の複数のレシピエント細菌細胞にとって致死的である、方法に関する。

典型的に、レシピエント細菌細胞は、対象の身体にわたってだが、特に皮膚、または消化管、泌尿生殖器領域、口、鼻道、喉および上気道、目および耳において分散した病原性細菌である。標的化および根絶の特定の目的は、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓａｅｒｕｇｉｎｏｓａ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、および他の菌種の病原性株、Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ属菌種、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ属菌種、およびＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓである。また、その他も本明細書に記載され、さらにその他は当業者に直ちに明らかになるであろうが、典型的に、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍｄｉｆｆｉｃｉｌｅ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍｔｅｔａｎｉ、Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒｐｙｌｏｒｉ、Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｎｕｃｌｅａｔｕｍ、Ｇａｒｄｎｅｒｅｌｌａｖａｇｉｎｉｔｉｓ、Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ、Ａｇｇｒｅｇａｔｉｂａｃｔｅｒａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔｅｍｃｏｍｉｔａｎｓ、Ｌｉｓｔｅｒｉａｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓａｕｒｅｕｓ、Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒｊｅｊｕｎｉ、Ｖｉｂｒｉｏｖｕｌｎｉｆｉｃｕｓ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａｔｙｐｈｉ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍｂｏｔｕｌｉｎｕｍ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｌｅｐｒａｅ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｌｅｐｒｏｍａｔｏｓｉｓ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍｄｉｐｔｈｅｒｉａｅ、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒｂａｕｍａｎｎｉｉ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓｍｕｔａｎｓ；Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓａｕｒｅｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓａｇａｌａｃｔｉａｅ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓｐｎｅｕｍｏｎｉａを含むがこれらに限定されないＢ群ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｉ；Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓｆａｅｃａｌｉｓを含むがこれに限定されないＥｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ属菌種を含む。

本発明の方法は、様々な細菌感染症または細菌が関連する望ましくない状態を処置することに特に適する。一部の実施形態において、細菌感染症は、消化管の感染、泌尿生殖器の感染、呼吸器の感染、例えば鼻炎、扁桃炎、咽頭炎、気管支炎、肺炎、内臓の感染、例えば、腎炎、肝炎、腹膜炎、心内膜炎、髄膜炎、骨髄炎、目や耳の感染、ならびに皮膚および皮下の感染、下痢、皮膚障害、毒素ショック症候群、菌血症、敗血症、ならびに結核である。一部の実施形態において、感染症は、グラム陽性細菌またはグラム陰性細菌によって引き起こされる。一部の実施形態において、細菌感染症は、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ、Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ、Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ、Ｃｈｌａｍｙｄｉａ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ、Ｖｉｂｒｉｏ、Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ、Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｓ、Ｂａｃｔｅｒｉｏｉｄｅｓ、Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ、Ｂｏｒｒｅｌｉａ、Ｂｒｕｃｅｌｌａ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｄｉｐｌｏｃｏｃｃｕｓ、Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ、Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ、Ｌｉｓｔｅｒｉａ、Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ、Ｐｒｏｔｅｕｓ、Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａ、Ｓｈｉｇｅｌｌａ、Ｓｐｈａｅｒｏｐｈｏｒｕｓ、Ｙｅｒｓｉｎｉａ、またはこれらの組合せからなる群より選択される細菌によって引き起こされる。細菌性呼吸器感染症を引き起こす細菌の例は、Ｃｈｌａｍｙｄｉａ属菌種（例えば、Ｃｈｌａｍｙｄｉａｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ属菌種、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ、Ｌｅｇｉｏｎａｌｌａｃｅａｅ科、ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉａ（例えば、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）、Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａｃｅａｅ科、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ属菌種、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ（例えば、メチシリン耐性ＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓａｕｒｅｕｓおよびＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓｐｙｒｏｇｅｎｅｓ）、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ（例えば、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓｅｎｔｅｒｉｔｉｄｉｓ、ＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓＦａｓｃｉａｅ、およびＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）を含むが、これらに限定されない。腸管感染症を引き起こす細菌の例は、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄａｃｅａｅ科、Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ属菌種、Ｃｈｌａｍｙｄｉａ属菌種、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ、Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ科（例えば、Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ属菌種、Ｅｄｗａｒｄｓｉｅｌｌａ、Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒａｅｒｏｇｅｎｅｓ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ属菌種、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ属菌種、およびＳｈｉｇｅｌｌａｆｌｅｘｎｅｒｉ）、Ｇａｒｄｉｎｅｌｌａ科、Ｌｉｓｔｅｒｉａ属菌種、Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａｃｅａｅ科、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ属菌種、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ（例えば、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓｅｎｔｅｒｉｔｉｄｉｓ、ＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓＦａｓｃｉａｅ、およびＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ科を含むが、これらに限定されない。これらの使用の他の代表的な例は、（１）Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ属菌種によって引き起こされる結膜炎、およびＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓａｅｒｕｇｉｎｏｓａによって引き起こされる角膜潰瘍、（２）Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓａｅｒｕｇｉｎｏｓａによって引き起こされる外耳炎、（３）多くのグラム陽性球菌およびグラム陰性桿菌によって引き起こされる慢性副鼻腔炎、（４）Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓａｅｒｕｇｉｎｏｓａに関連する嚢胞性線維症、（５）Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒｐｙｌｏｒｉ（潰瘍）、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ、Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ、およびＳｈｉｇｅｌｌａ属菌種によって引き起こされる腸炎、（６）多くの菌種に対する予防処置として、外科的および非外科的な開放創、（７）Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓａｅｒｕｇｉｎｏｓａまたは他のグラム陰性病原体を除去するため、熱傷、（８）Ｐｒｏｐｉｏｎｏｂａｃｔｅｒａｃｎｅｓによって引き起こされるざ瘡、（９）メチシリン耐性Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓａｕｒｅｕｓ（ＭＳＲＡ）によって引き起こされる鼻および皮膚感染、（１０）主にグラム陽性嫌気性細菌によって引き起こされる体臭（すなわち、デオドラントでの使用）、（１１）Ｇａｒｄｎｅｒｅｌｌａｖａｇｉｎａｌｉｓおよび他の嫌気性生物に関連する細菌性膣炎、ならびに（１２）様々な生物体によって引き起こされる歯肉炎および／またはう歯の処置を含む。

本発明はまた、排除を必要とする対象における感染症を排除するために抗生物質の臨床における効力を高めるための方法における使用のための本発明のドナー細菌細胞の使用、すなわち、本発明のドナー細菌細胞が、独立した抗生物質処置と比較して、細菌の排除および感染症からの回復を改善することを意味する本発明のドナー細菌細胞の使用、に関する。

本発明のさらなる目的は、抗生物質耐性遺伝子を含む細菌細胞によって引き起こされる対象における感染症を処置するための方法に関し、該方法は、治療有効量の抗生物質を、抗生物質耐性遺伝子を標的とし、それによって抗生物質耐性遺伝子を不活化し、細菌細胞を上述の抗生物質に感作させることに適した１つ以上のガイドＲＮＡ分子をコードする所定のコピー数の標的抗菌性プラスミドを含む治療有効量の細菌ドナー細胞と組み合わせて、対象に投与することを含む。

特に、１つ以上の抗生物質耐性遺伝子を標的とするドナー細菌細胞と抗生物質との組合せにより、処置を開始する前に感染によって誘発された損傷を修復する宿主の能力を高めることができる。したがって、本発明の組合せは、病的状態を減少させ得る。本発明において、ドナー細菌細胞は、１つ以上の抗生物質耐性遺伝子を標的とし、細菌感染を排除するために抗生物質の活性を増強する。「増強する」という用語は、本明細書において使用するように、抗生物質の少なくとも１つの生物学的効果または活性を高めるまたは増加させて、（ｉ）所定の濃度もしくは量の抗生物質が、増強されていないときの同じ濃度もしくは量の抗生物質からもたらされるであろう生物学的効果もしくは活性よりも、抗生物質が増強されているときに大きな生物学的効果もしくは活性をもたらすか、または（ｉｉ）抗生物質が増強されていないときよりも、抗生物質が増強されているときに、特定の生物学的効果もしくは活性を得るために、より低い濃度もしくは量の抗生物質が必要とされる、または（ｉｉｉ）（ｉ）および（ｉｉ）の両方となることを意味する。特に、抗生物質と組み合わせたドナー細菌細胞は、－１－抗生物質にアクセスできない特定の微小環境（すなわち、一部の細胞の細胞内コンパートメント）に影響を与え、ドナー細菌細胞と組み合わせたときに抗生物質が作動可能になり得る、－２－感染症の抗生物質処置からの回復段階（組織の修復、感染組織の生理的機能の回復）に影響を与え得る、－３－副作用（例えば、腸、皮膚、呼吸器などの細菌叢組成の変化）を抑え得る、ならびに－４－抗生物質耐性（多くの場合、細菌叢細菌による耐性の獲得のため）の発症を抑制し得る。

一部の実施形態において、抗生物質は、アミノグリコシド、β－ラクタム、キノロンまたはフルオロキノロン、マクロライド、スルホンアミド、スルファメトキサゾール（ｓｕｌｆａｍｅｔｈａｘｏｚｏｌｅ）、テトラサイクリン、ストレプトグラミン、オキサゾリジノン（リネゾリドなど）、リファマイシン、グリコペプチド、ポリミキシン、リポペプチド抗生物質からなる群より選択される。特に、抗生物質は、β－ラクタムの中から選択される。すべてのβ－ラクタムのメンバーは、β－ラクタム環およびカルボキシル基を有しており、それらの薬物動態および作用機序の両方において５５の類似性が生じている。臨床において有用なβ－ラクタムの大部分は、セファマイシンおよびオキサセフェムを含むペニシリン群またはセファロスポリン群のいずれかに属している。また、β－ラクタムはカルバペネムおよびモノバクタムも含む。一般的に言って、β－ラクタムは細菌の細胞壁合成を阻害する。より具体的には、これらの抗生物質は、細胞壁のペプチドグリカン網に「切れ目」を生じさせ、細菌の原形質がその保護網から周囲の低張媒体に流入することが可能になる。そして、液体がネイキッドな６５プロトプラスト（その壁のない細胞）内にたまり、やがて破裂して生物体の死をもたらす。β－ラクタムは、機構的には、酵素標的部位のヒドロキシル基に結合している開環ラクタム環のカルボキシルと安定なエステルを形成することによってＤ－アラニル－Ｄ－アラニントランスペプチダーゼ活性を阻害することによって作用する。β－ラクタムは極めて有効であり、典型的に低毒性である。これらの薬剤は、グループとして、多くのグラム陽性、グラム陰性、および嫌気性の生物体に対して活性である。このカテゴリーに該当する薬剤は、２－（３－アラニル）クラバム、２－ヒドロキシメチルクラバム、７－メトキシセファロスポリン、エピチエナマイシン、アセチル－チエナマイシン、アモキシシリン、アパルシリン、アスポキシシリン、アジドシリン、アズロシリン、アズトレオナム、バカンピシリン、ビアペネム（ｂｌａｐｅｎｅｍ）、カルベニシリン、カルフェシリン、カリンダシリン、カルペチマイシンＡおよびＢ、セファセトリル、セファクロール、セファドロキシル、セファレキシン、セファログリシン、セファロリジン、セファロチン、セファマンドール、セファピリン、セファトリジン、セファゼドン、セファゾリン、セフブペラゾン、セフカペン、セフジニル、セフジトレン、セフェピム、セフェタメト、セフィキシム、セフィネノキシム、セフィネタゾール、セフミノクス、セフモレキシン、セフォジジム、セフォニシド、セフォペラゾン、セフォラミド、セフォセリス、セフォタキシム、セフォテタン、セフォチアム、セフォキシチン、セフォゾプラン、セフピラミド、セフピロム、セフポドキシム、セフプロジル、セフキノム、セフラジン、セフロキサジン、セフスロジン、セフタジジム、セフテラム、セフテゾール、セフチブテン、セフチゾキシム、セフトリアキソン、セフロキシム、セファロスポリンＣ、セファマイシンＡ、セファマイシンＣ、セファロチン、キチノボリンＡ、キチノボリンＢ、キチノボリンＣ、シクラシリン、クロメトシリン、クロキサシリン、サイクロセリン、デオキシプルラシドマイシンＢおよびＣ、ジクロキサシリン、ジヒドロプルラシドマイシンＣ、エピシリン、エピチエナマイシンＤ、ＥおよびＦ、エルタペネム、ファロペネム、フロモキセフ、フルクロキサシリン、ヘタシリン、イミペネム、レナンピシリン、ロラカルベフ、メシリナム、メロペネム、メタンピシリン、メチシリン（メチシリン（ｍｅｔｈｉｃｉｌｌｉｎ）とも呼ばれる）、メズロシリン、モキサラクタム、ナフシリン、ノルチエナマイシン、オキサシリン、パニペネム、ペナメシリン、ペニシリンＧ、ＮおよびＶ、フェネチシリン、ピペラシリン、ポバンピシリン、ピブセファレキシン、ポブメシリナム、ピブメシリナム、プルラシドマイシンＢ、ＣおよびＤ、プロピシリン、サルモキシシリン、スルバクタム、スルタミシリン、タランピシリン、テモシリン、テルコナゾール、チエナマイシン、ならびにチカルシリンを含む。より具体的には、カルバペネムは、例えば、承認された抗生物質であるイミペネム、メロペネム、エルタペネム、ドリペネム、パニペネム／ベタミプロン、ビアペネム、ならびに実験における抗生物質であるラズペネム、テビペネム、レナペネム、およびトモペネムを含む。

ドナー細菌細胞が作製されると、そうした処置を必要とする個人の１つ以上の選択された病原体に対して防御するために使用される。防御の対象となる細胞個体群または組織に応じて、局所、経口、経鼻、経肺／気管支（例えば、吸入器を介して）、経眼、経直腸、経泌尿生殖器、皮下、腹腔内および静脈内である、本発明のドナー細菌細胞の投与モードが考慮される。ドナー細菌細胞は、好ましくは、処置される患者のために選択された投与モードに適した送達ビヒクルにおいて、医薬製剤として供給される。

例えば、ドナー細菌細胞を消化管または鼻道に送達するために、好ましい投与モードは、経口摂取もしくは経鼻エアロゾルによって、または摂食（単独もしくは対象の飼料もしくは食品に組み込まれる）によって行われる。一部の実施形態において、本発明のドナー細菌細胞は、ゲルカプセル剤において、または食品もしくは飲料に振りかけるためにバルクにおいて、粉末凍結乾燥製剤として供給することができる。ドナー細菌細胞は、局所投与のため、患部の皮膚表面に広げるように軟膏剤またはクリーム剤として製剤化され得る。また、軟膏またはクリームの製剤は、坐剤などの他の標準的な製剤とともに、経直腸または経膣の送達に適している。局所、経膣、または経直腸の投与に適切な製剤は、医薬品化学者に周知である。

また、本発明のドナー細菌細胞の他の使用も考慮される。これらには、農業および園芸の用途、例えば、（１）病原性細菌を排除するために肉または他の食品に使用すること、（２）生物汚染度を低下させるため、または特定の病原性生物体（例えば、サルモネラ菌）を減少もしくは排除するために動物用飼料（ニワトリ、ウシ）において使用すること、（３）プロテウス菌および他の生物体に起因する「魚臭さ」を防ぐために魚において使用すること、ならびに、（４）しおれるのを防ぐために切り花において使用すること、を含む。

（組成物）
本発明のさらなる目的は、本発明の所定量のドナー細菌細胞を含む組成物に関する。

一部の実施形態において、本発明の組成物は医薬組成物である。ドナー細菌細胞を含む医薬製剤は、投与のしやすさ、および投与量の均一性のために、投与単位剤形で製剤化される。投与単位剤形は、本明細書において使用するように、処置を受ける患者に適切な医薬製剤の物理的に別個の単位を指す。各投与量は、選択された医薬担体と関連して所望の抗菌効果を生じるように計算された量のドナー細菌含む必要がある。適切な投与単位を決定するための手順は当業者に周知である。投与単位は、患者の体重に基づいて比例的に増減させてもよい。標的細胞個体群または組織において病原性細菌を根絶するための適切な濃度は、当技術で知られているような、投与量濃度曲線計算によって決定され得る。局所で投与するための本発明の医薬組成物は、例えば、エアロゾル、クリーム剤、軟膏剤、ローション剤、または粉剤などの局所使用に適した剤形とすることができる。本明細書において提供される医薬組成物は、吸入による投与のために製剤化され得る。例えば、組成物は、エアロゾル、ミスト、または粉末としての剤形であってもよい。したがって、本明細書に記載する組成物は、加圧パックまたはネブライザーからのエアロゾルスプレー形の剤形で、例えばジクロロジフルオロメタン、トリクロロフルオロメタン、ジクロロテトラフルオロエタン、二酸化炭素、または他の好適なガスなどの好適な噴霧剤を使用して送達することができる。加圧エアロゾルを使用する場合、投与単位は、一定量を送達するためのバルブを設けることによって決定され得る。

一部の実施形態において、本発明のドナー細菌細胞は、該ドナー細菌細胞を摂取（すなわち、経口）によって対象に投与するとき、胃に対して保護するためにカプセル化されている。したがって、一部の実施形態において、本発明のドナー細菌細胞は、その生存時間を有意に向上させるためにカプセル化形態で組成物に製剤化される。そうした場合、カプセルの存在により、消化管における微生物の分解を特に遅延または抑止し得る。本実施形態の組成物は、腸溶コーティングした徐放性のカプセル剤または錠剤にカプセル化することができるということが理解され得る。腸溶コーティングにより、カプセル剤／錠剤が消化管を通過するとき、小腸に達する時間までカプセル剤／錠剤を未変化（すなわち未溶解）に保つことができる。生存細菌細胞をカプセル化する方法は、当技術において周知である（例えば、ＧｅｎｅｒａｌＭｉｌｌｓＩｎｃ．の米国特許、例えば米国特許第６，７２３，３５８号明細書などを参照されたい）。例えば、アルギン酸塩およびＨｉ－Ｍａｉｚｅ（登録商標）デンプンを用いてマイクロカプセル化し、その後、凍結乾燥することによって、乳製品における細菌細胞の有効期間を延ばすことに成功したことが判明している［例えば、Ｋａｉｌａｓａｐａｔｈｙｅｔａｌ，ＣｕｒｒＩｓｓｕｅｓＩｎｔｅｓｔＭｉｃｒｏｂｉｏｌ．２００２Ｓｅｐｔｅｍｂｅｒ；３（２）：３９－４８を参照されたい］。また、カプセル化は、Ａｍｏｒｐｈｏｐｈａｌｌｕｓｋｏｎｊａｃから抽出された繊維などのグルコマンナン繊維で行うことができる。あるいは、生存可能なプロバイオティクスをゴマ油エマルションに封入することもまた使用してもよい［例えば、Ｈｏｕｅｔａｌ，Ｊ．ＤａｉｒｙＳｃｉ．８６：４２４－４２８を参照されたい］。一部の実施形態において、腸溶コーティングのための薬剤は、好ましくはＥｕｄｒａｇｉｔ（登録商標）ポリマーなどのメタクリル酸－アクリル酸アルキルのコポリマーである。ポリ（メタ）クリレートは、コーティング材料として特に適していると判明している。ＥＵＤＲＡＧＩＴ（登録商標）は、アクリル酸およびメタクリル酸のエステルに由来するコポリマーの商標名であり、これらの特性は官能基によって決定される。個々のＥＵＤＲＡＧＩＴ（登録商標）のグレードは、中性、アルカリ性、または酸性の基の割合、したがって物理化学的な特性が異なる。種々のＥＵＤＲＡＧＩＴ（登録商標）ポリマーをうまく使用して組み合わせることで、様々な薬学的かつ技術的な用途における薬剤の制御放出において理想的な解決策を提供する。ＥＵＤＲＡＧＩＴ（登録商標）は、徐放性の錠剤およびペレットのコーティングのための機能的なフィルムを提供する。このポリマーは、Ｐｈ．Ｅｕｒ．、ＵＳＰ／ＮＦ、ＤＭＦ、およびＪＰＥなどの国際的な薬局方に記載されている。ＥＵＤＲＡＧＩＴ（登録商標）ポリマーは、薬剤の制御放出の可能性、つまり、消化管の標的化（胃での耐性、結腸での放出）、保護コーティング（食味および臭気のマスキング、水分からの保護）、ならびに薬剤の遅延放出（徐放性製剤）を提供することができる。ＥＵＤＲＡＧＩＴ（登録商標）ポリマーは、水溶液、水性分散剤、有機溶液、および固体の物質を含む、広範囲の種々の濃度および物理的な剤形で利用可能である。ＥＵＤＲＡＧＩＴ（登録商標）ポリマーの薬学的特性は、その官能基の化学的な特性によって決定される。

一部の実施形態において、本発明のドナー細菌細胞は、食品組成物の形態で対象に投与される。したがって、本発明のさらなる１つの態様は、本発明の所定量のドナー細菌細胞を含む食品組成物に関する。一部の実施形態において、本発明のドナー細菌細胞を含む食品組成物は、完全食品組成物、食品補助剤、およびニュートラシューティカルズ組成物および同様のものから選択される。本発明の組成物は、食品成分および／または飼料成分として使用してもよい。一部の実施形態において、本発明のドナー細菌細胞を含む食品組成物は、少なくとも１つのプレバイオティクスを含む。「プレバイオティクス」は、腸管において本発明のドナー細菌細胞の増殖を促進するために用いられる食品物質を意味する。プレバイオティクスは、オリゴ糖類からなる群より選択することができ、任意でフルクトース、ガラクトース、マンノース、ダイズ、ならびに／またはイヌリン、および／もしくは食物繊維を含む。

本発明のドナー細菌細胞を含む組成物は、典型的に、担体またはビヒクルを含む。「担体」または「ビヒクル」は投与に適した物質を意味し、非毒性で、組成物のいかなる成分とも有害に相互作用しない、当技術において知られている任意のそうした物質、例えばいずれかの液体、ゲル、溶媒、液体希釈剤、可溶化剤、または同様のものを含む。許容される担体の例は、例えば、水、塩溶液、アルコール、シリコーン、ワックス、ワセリン、植物油、ポリエチレングリコール、プロピレングリコール、リポソーム、糖、ゼラチン、ラクトース、アミロース、ステアリン酸マグネシウム、タルク、界面活性剤、ケイ酸、粘性パラフィン、香油、脂肪酸モノグリセリドおよびジグリセリド、ペトロエスラル脂肪酸エステル（ｐｅｔｒｏｅｔｈｒａｌｆａｔｔｙａｃｉｄｅｓｔｅｒ）、ヒドロキシルメチルセルロース、ポリビニルピロリドン、および同様のものを含む。一部の実施形態において、本発明のドナー細菌細胞を含む組成物は、保護性の親水コロイド（ガム、タンパク質、加工デンプンなど）、結合剤、フィルム形成剤、カプセル化剤／材料、壁／シェルの材料、マトリックス化合物、コーティング剤、乳化剤、界面活性剤、可溶化剤（油、脂肪、ワックス、レシチン等）、吸着剤、担体、充填剤、共化合物（ｃｏ－ｃｏｍｐｏｕｎｄ）、分散剤、湿潤剤、加工助剤（溶媒）、流動化剤、食味マスキング剤、増量剤、ゼリー化剤、ゲル形成剤、抗酸化剤、および抗菌剤を含む。また、組成物は、水、任意の由来のゼラチン、植物性ガム、リグニンスルホン酸塩、タルク、糖、デンプン、アラビアガム、植物油、ポリアルキレングリコール、着香料、保存剤、安定剤、乳化剤、緩衝剤、潤滑剤、着色剤、湿潤剤、充填剤および同様のものを含むが、これらに限定されない、薬学的な添加剤およびアジュバント、賦形剤、および希釈剤を含んでもよい。すべての場合において、こうしたさらなる成分は、意図するレシピエントに適切であることを考慮して選択されるであろう。

本発明を以下の図面および実施例によってさらに記載する。しかしながら、これらの実施例および図面は、本発明の範囲を限定するとしていかようにも解釈されるべきでない。

（方法）
細菌株、プラスミド、プライマー、および増殖培養条件
細菌株の構築および増殖の手順
プラスミドのクローニングを、ギブソン・アセンブリ（Ｇｉｂｓｏｎｅｔａｌ．，２００９）によって行い、サンガーシークエンシング（ＥｕｒｏｆｉｎｓＧｅｎｏｍｉｃｓ）によって検証した。染色体突然変異をファージＰ１の形質導入によって伝達して最終株を作製した。株を、Ｌｕｒｉａ－Ｂｅｒｔａｎｉ（ＬＢ）ブロス、グルコース（０．２％）およびカザミノ酸（０．４％）を添加したＭ９培地（Ｍ９－ＣＡＳＡ）、またはグルコース（０．２％）およびカザミノ酸（０．４％）を添加したＭ６３培地（Ｍ６３）において３７℃で増殖させた。培地に、適宜、５０μｇ／ｍｌカナマイシン（Ｋａｎ）、２０μｇ／ｍｌクロラムフェニコール（Ｃｍ）、１０μｇ／ｍｌテトラサイクリン（Ｔｃ）、２０μｇ／ｍｌナリジクス酸（Ｎａｌ）、２０μｇ／ｍｌストレプトマイシン（Ｓｔ）、１００μｇ／ｍｌアンピシリン（Ａｐ）、１０μｇ／ｍｌゲンタマイシン（Ｇｍ）、５０μｇ／ｍｌリファンピシン（Ｒｉｆ）の抗生物質を添加した。ＬＡＣ表現型のスクリーニングのため、４０μｇ／ｍｌの５－ブロモ－４－クロロ－３－インドリル－β－ｄ－ガラクトピラノシド（Ｘ－Ｇａｌ）および４０μＭのイソプロピルβ－Ｄ－１－チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）を適宜加えた。

ＴＡＰの構築およびＴＡＰにおけるスペーサー配列のワンステップのクローニング変更
ｐＥＧＬ１２９のスペーサーをＳａｐＩ－スペーサー－ＳａｐＩＤＮＡ配列によって置換することにより行ったＴＡＰのスペーサー配列の変更を除き、プラスミドの構築を、ＩＶＡクローニング（Ｇａｒｃｉａ－Ｎａｆｒｉａｅｔａｌ．，２０１６）によって行った。ｎｓｐ（非特異的）スペーサー配列は、ＳａｐＩ消化によりＤＮＡ非付着末端を遊離することができる２つのＳａｐＩ制限部位に隣接している。ｎｓｐスペーサーを置換するために、ＴＡＰ－Ｃａｓ９－ｎｓｐまたはＴＡＰ－ｄＣａｓ９－ｎｓｐプラスミドのＳａｐＩ制限によって生じた非付着末端に相補的な配列を有する２つのオリゴヌクレオチドをアニールすることによって、新しいスペーサーを構築する。新しいスペーサーフラグメントとＴＡＰバックボーンとのライゲーション生成物で、ＤＨ５α株またはＴＢ２８株を形質転換した。構築物をＰＣＲ反応およびシークエンシングによって検証した。

コンゴレッドアッセイ
カーリ産生コロニーアッセイ
プラスミドを含むまたは含まないＥ．ｃｏｌｉ株のＯｍｐＲ２３４をコンゴレッド培地（１０ｇバクトトリプトン、５ｇ酵母エキス、１８ｇバクト寒天、４０μｇ／ｍｌコンゴレッド、および２０μｇ／ｍｌクーマシーブリリアントブルーＧ）に播種し、３０℃で４日間インキュベートした。Ｍ８０実態顕微鏡（Ｌｅｉｃａ）でコロニーをｘ１０倍の拡大率で可視化した。デジタル画像を、実体顕微鏡に接続されたＩＣ８０－ＨＤ一体型カメラで撮影し、ＬＡＳｖ４．８ソフトウェア（Ｌｅｉｃａ）で操作した。

液体凝集試験
プラスミドを含むまたは含まないＥ．ｃｏｌｉ株のＯｍｐＲ２３４の一晩の培養物は、２５μｇ／ｍのコンゴレッドを添加した１ｍｌのＭ９－ＣＡＳＡ培地でＡ_６００が０．０５になるように希釈した。培養物をかく拌せずに３０℃で２４時間培養し、画像を撮影した。

接合アッセイ
ＬＢで培養したドナー株およびレシピエント株の一晩の培養物を、Ａ_６００が０．０５になるように希釈し、Ａ_６００が０．７から０．９の間に達するまで培養した。５０μｌのドナーおよび１５０μｌのレシピエントの培養物を、エッペンドルフチューブに入れ、１：３のドナー対レシピエント比を得るように混合した。０分の時間において、１００μｌの混合物を１ｍｌのＬＢに希釈し、段階希釈し、ドナー、レシピエント、およびトランスコンジュガント細胞を選択する抗生物質を添加したＬＢ寒天に播種した。残りの１００μｌを３７℃で１時間３０分インキュベートした。１ｍｌのＬＢを穏やかに加え、チューブを３７℃でさらに１時間３０分、４時間３０分、または２２時間３０分インキュベートした。その後、接合混合物をボルテックスにかけ、段階希釈し、０分の時間で播種した。

長期接合実験
接合混合物を調製し、かく拌せずに３７℃でインキュベートした。２４時間毎に、１００μｌの混合物を１ｍｌのＬＢに希釈し、３７℃で再インキュベートした。残りの混合物をボルテックスにかけ、段階希釈し、ドナー、レシピエント、およびトランスコンジュガント細胞を選択する抗生物質を添加したＬＢ寒天に播種した。１日目および７日目において、ＲＡＰ－ｄＣａｓ９－ＯＸＡ４８を保有するドナーと混合した、得られたアンピシリン耐性レシピエントの１００個のクローンを、ＴｃまたはＫｎを添加したＬＢ寒天に画線状に塗布し、Ｆ－Ｔｎ１０またはＴＡＰ－ｄＣａｓ９－ＯＸＡ４８プラスミドそれぞれの存在を評価した。

多菌種接合
ＬＢで培養したドナー株およびレシピエント株の一晩の培養物を、Ａ_６００が０．０５になるように希釈し、Ａ_６００が０．７から０．９の間に達するまで培養した。Ｃ．ｒｏｄｅｎｔｉｕｍ、Ｅ．ｃｌｏａｃａｅ、Ｅ．ｃｏｌｉＥＰＥＣ、およびＥ．ｃｏｌｉＨＳのレシピエント株を等しい割合で混合することによってレシピエント混合物を調製する。この混合物を段階希釈し、各レシピエントを選択するために抗生物質を添加したＬＢ寒天に播種した。１００μｌのドナーと１００μｌのレシピエントとの混合物をエッペンドルフチューブに加えて、交配を行った。０分の時間において、１００μｌの混合物を１ｍｌのＬＢに希釈し、段階希釈し、ドナー、レシピエント、およびトランスコンジュガントを選択するために抗生物質を添加したＬＢ寒天に播種した。残りの１００μｌを３７℃で１時間３０分インキュベートした。１ｍｌのＬＢを穏やかに加えて、チューブを３７℃でさらに１時間３０分インキュベートした。その後、接合混合物をボルテックスにかけ、段階希釈し、ドナー、レシピエント、およびトランスコンジュガントを選択するために抗生物質を添加したＬＢ寒天に播種した。図において、接合の効率は、トランスコンジュガント細胞の最終濃度（ＣＦＵ／ｍｌ）として、または比率（Ｔ／Ｒ＋Ｔ）から計算されるトランスコンジュガント細胞のパーセンテージとしてのいずれかで表されている。

形質転換アッセイ
ＬＢで培養した一晩の培養物を、１／１００に希釈し、Ａ_６００が０．４から０．６の間に含まれるまで培養した。細胞を塩化ルビジウムで処理し、９０μｌの得られたコンピテント細胞をヒートショックによって１００ｎｇのプラスミドで形質転換した。表現型発現のために３７℃で１時間インキュベートした後、細胞を５０００ｒｐｍ５分間遠心分離し、１００μｌのＬＢに再懸濁し、適切な抗生物質を添加したＬＢプレートに１０μｌの段階希釈液を配置した。

生細胞の顕微鏡イメージングおよび解析
タイムラプス実験
Ｍ９－ＣＡＳＡ（Ｅ．ｃｏｌｉ同士の間）またはＭ６３（Ｅ．ｃｏｌｉとＣ．ｒｏｄｅｎｔｉｕｍとの間）におけるドナー細胞およびレシピエント細胞の一晩の培養物を、Ａ_６００が０．０５になるように希釈し、Ａ_６００が０．７から０．９の間に含まれるまで培養した。２５μｌのドナーおよび７５μｌのレシピエントをエッペンドルフチューブに混合し、５０μｌの混合物をＢ０４Ａマイクロ流体チャンバー（ＯＮＩＸ，ＣｅｌｌＡＳＩＣ（登録商標））にロードした。イメージング処理にわたって、栄養素補給を１ｐｓｉで維持し、温度を３７℃に維持した。細胞を１０分毎に３時間イメージングした。

画像取得
従来の広視野蛍光顕微鏡イメージングを、×１００／１．４５オイルプランアポラムダフェーズ対物レンズ、ＦＬａｓｈ４Ｖ２ＣＭＯＳカメラ（Ｈａｍａｍａｔｓｕ）を備えたＥｃｌｉｐｓｅＴｉ－Ｅ顕微鏡（Ｎｉｋｏｎ）において、画像取得にＮＩＳソフトウェアを使用して行った。４８８ｎｍおよび５６０ｎｍの励起波長において５０％のパワーのＦｌｕｏＬＥＤＳｐｅｃｔｒａＸ光源を使用して、取得を行った。露出設定は、ＡＰから生成されるｓｆＧＦＰでは５０ｍｓおよびＴｍＣｈｅｒｒｙでは５０ｍｓ、ＲｅｃＡ－ＧＦＰでは１００ｍｓ、ＨＵ－ｍＣｈｅｒｒｙでは１００ｍｓ、ＤｎａＮ－ｍＣｈｅｒｒｙでは１００ｍｓであった。

画像分析
定量的な画像分析を、ＭｉｃｒｏｂｅＪプラグインを備えたＦｉｊｉソフトウェア（Ｄｕｃｒｅｔｅｔａｌ．，２０１６）を使用して行った。細胞検出を最適化するため、ＭｉｃｒｏｂｅＪの手動編集インターフェースを使用し、平均蛍光強度、歪度、および細胞長のパラメータを自動的に抽出してプロットした。ＴＡＰ（ｓｆＧＦＰまたはｍＣｈ）により与えられる蛍光信号の増加を分析することによって、ＴＡＰ取得のタイミング（時間ｔ＝０）を定義した。トランスコンジュガント細胞において１５％のｓｆＧＦＰまたは３０％のｍＣｈｅｒｒｙの蛍光の増加を観察したときに、プラスミドの取得を確認した。その後、各細胞の蛍光プロファイルを、定義したｔ＝０に従ってアライメントし、図２ａ、図２ｂ、図２ｃ、図２ｄ、図３ｃに示すグラフを作成した。

フローサイトメトリー
接合アッセイの項に記載したように、接合を０．１μｍのろ過ＬＢ中で行った。９０分および１８０分の時間において、接合混合物を０．１μｍのろ過ＬＢ中でＡ_６００が０．０３になるように希釈し、Ａｔｔｕｎｅ（登録商標）ＮｘＴアコースティックフォーカシングサイトメーターにおいて２５μｌ／分の流速で分析した。前方散乱（ＦＳＣ）、側方散乱（ＳＳＣ）、ならびに蛍光信号ＢＬ１（ｓｆＧＦＰ）およびＹＬ２（ｍＣｈｅｒｒｙ）を適切なＰＭＴ設定で取得し、Ａｔｔｕｎｅ（登録商標）ＮｘＴ分析ソフトウェアで表した。ＴＡＰからのＣａｓ９またはｄＣａｓ９の恒常的発現において毒性がないことを検証するため、ｃａｓ９もしくはｄｃａｓ９を含む、またはいずれのｃａｓ９遺伝子も含まないＥ．ｃｏｌｉのＭＳ３８８／ＴＡＰの増殖を比較した。これらの株を０．１μｍのろ過ＬＢ中で一晩培養し、０．１μｍのろ過ＬＢ中でＡ_６００が０．０５になるように希釈した。これらを８時間培養し、０、２、４、６、および８時間におけるプレーティングアッセイによってＡ_６００およびＣＦＵ／ｍＬを推定した。並行して、１時間、２時間、および５時間３０分において、株を、Ａｔｔｕｎｅ（登録商標）ＮｘＴアコースティックフォーカシングサイトメーターにおいて２５μｌ／分の流速で分析した。前方散乱（ＦＳＣ）を取得し、Ａｔｔｕｎｅ（登録商標）ＮｘＴソフトウェアで表した。

ＴＡＰエスケープ変異体の分析
Ｅ．ｃｏｌｉ
３１個のＴＡＰエスケープ変異体をＸ－ＧａｌおよびＩＰＴＧを添加した培地において画線状に塗布し、それらのＬＡＣの表現型を決定した。ＬＡＣ＋表現型を示すＴＡＰエスケープ変異体を「青色」、その他を「白色」として分類した。標的ｌａｃＺ２遺伝子座を改変する点突然変異または欠失の獲得を決定するため、野生株のｌａｃＺ２遺伝子座を包含する７４８ｐｂのフラグメントを増幅するＯＬ２４０およびＯＬ６５４を用いてＰＣＲを実施した。ｌａｃＺ２遺伝子座の欠失は示さないが、ＴＡＰＣＲＩＳＰＲシステムが活性化しているエスケープ変異体については、ＰＣＲ産物をシークエンシングして、突然変異を同定した。また、ＯＬ６５５およびＯＬ６５６を用いてＰＣＲを行い、ｌａｃＺ２周りの大きなフラグメントを増幅して、これまでに記載されたように大きな欠失を観察した（ＣｕｉａｎｄＢｉｋａｒｄ，２０１６）。エスケープ変異体から抽出したＴＡＰの活性を測定するため、接合アッセイの項に記載したように、ＴＡＰエスケープ変異体とＥ．ｃｏｌｉのＭＳ３８８ｌａｃ＋株との間で接合を行った。並行して、エスケープ変異体からＭａｃｈｅｒｙＮａｇｅｌのＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ（登録商標）プラスミドキットによって抽出したＴＡＰの活性を、形質転換アッセイの項に記載したようにｌａｃ＋株およびｌａｃ－株に形質転換することによって検証した。ＣＲＩＳＰＲシステムを不活性化する突然変異を同定するために、７つの不活性ＴＡＰをシークエンシングした。

Ｃ．ｒｏｄｅｎｔｉｕｍ
２０個のＴＡＰ－Ｃａｓ９－Ｃｒ１－エスケープ変異体について、ＯＬ６８６およびＯＬ６８７を用いてＰＣＲを行い、染色体遺伝子座の欠失を判定した。Ｃ．ｒｏｄｅｎｔｉｕｍのＴＡＰ－エスケープ変異体からのＴＡＰのＣＲＩＳＰＲ活性を検証するため、Ｃ．ｒｏｄｅｎｔｉｕｍ突然変異体とＥ．ｃｏｌｉのＭＳ３８８株の間で接合を５時間行い、新しいＥ．ｃｏｌｉＴＡＰドナーを作製した。その後、これらの新しいドナーと新たなＣ．ｒｏｄｅｎｔｉｕｍレシピエントとの間で接合を２４時間行い、レシピエントおよびトランスコンジュガントを選択するために播種した。Ｃ．ｒｏｄｅｎｔｉｕｍのエスケープ変異体から単離したＴＡＰの活性を確認するため、ＴＡＰを、ＭａｃｈｅｒｙＮａｇｅｌのＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ（登録商標）プラスミドキットによって抽出し、１０％スクロースで処理した野生型Ｃ．ｒｏｄｅｎｔｉｕｍ細胞にエレクトロポレーション（２，５ｋＶ）によって形質転換した。３７℃で１時間インキュベートした後、Ｋａｎを添加したまたは添加しないＬＢ寒天に細胞を播種して、形質転換効率を評価した。エスケーパークローンから単離された２つの不活性なＴＡＰ－Ｃａｓ９－Ｃｒ１および２つの不活性なＴＡＰ－Ｃａｓ９－Ｃｒ２２をシークエンシングした。

ＣＳＴＢアルゴリズム
ＣＳＴＢウェブサービスは、広範囲の細菌ゲノムおよびプラスミドにわたってＣＲＩＳＰＲモチーフを比較分析することができる。現在、モチーフとされているのは、１８～２３個の塩基対の長さのＮＧＧアンカー配列である。ＣＳＴＢのバックエンドデータベースは、ＲｅｆＳｅｑのリリース９９（０３／１２／２０）で代表または基準として表示された２９１４個の全ゲノムに存在するこれらのＣＲＩＳＰＲモチーフのすべての出現を索引付けしている。さらに、対象とされる７つの細菌ゲノムおよび５つのプラスミドが追加された。細菌ゲノムにおける別個のモチーフの平均数は５５９２３（最小５７１９および最大２７２９５７０）である。ゲノムはＮＣＢＩの分類法（０７／２２／２０）に従って分類されている。各ゲノムは、以下の手順を使用して対応する完全なｆａｓｔａを処理することによって、モチーフのデータベースに挿入される。まず、ＣＲＩＳＰＲモチーフの正規表現を満たす語をすべて検出し、その染色体座標をモチーフのデータベースに格納する。次に、開発された１塩基のエンコードにつき２ビットのソフトウェア［ｈｔｔｐｓ：／／ｇｉｔｈｕｂ．ｃｏｍ／ｇｌａｕｎａｙ／ｃｒｉｓｐｒ－ｓｅｔ］を使用して、すべての固有の語を整数表現に変換する。その後、これらの整数は、ゲノムごとに固有のフラットファイルに分類される。ＣＲＩＳＰＲモチーフの索引付けを整数とすることで、いくつかの生物体にわたる一式のモチーフを計算上効率的に比較することができる。最後に、当初のｆａｓｔａファイルをｂｌａｓｔデータベースに追加する。関連するすべてのソフトウェアは、ｈｔｔｐｓ：／／ｇｉｔｈｕｂ．ｃｏｍ／ＭＭＳＢ－ＭＯＢＩ／ＣＳＴＢ＿ｄａｔａｂａｓｅ＿ｍａｎａｇｅｒにて自由にアクセスすることができる。ＣＳＴＢ入力インターフェースは、検索可能な２９１４個のゲノムを２つの分類樹として表示する。左側のツリーでは、ゲノムが同一／類似のＣＲＩＳＰＲモチーフを備える必要がある菌種を選択することができる。この一式のゲノムは、標的ＣＲＩＳＰＲモチーフを定義している。一方、右側のツリーでは、標的のモチーフと共通するモチーフを有しない、「除外」された生物体を選択することができる。ユーザの選択を満たす一式のモチーフは、「除外」された生物体に見受けられるモチーフの共通部分から差し引いた、選択された生物体に見受けられるモチーフの集合に実質的に等しいことになる。計算時間は選択のサイズに従って数秒から数分の範囲であり、完了するとＥメールが送信される。

すべての解答としてのＣＲＩＳＰＲモチーフは、ｓｇＲＮＡ配列、および選択した各生物体におけるそれらの出現頻度の双方向性の表で示されている。この表は、モチーフ数および配列組成に対する選別およびフィルタリング機能を有する。これにより、目的のモチーフを容易に選択することができる。一式の解答全体、または選択したモチーフのみの詳細情報をダウンロードすることができる。この詳細情報は、標的生物体における各ｓｇＲＮＡモチーフの座標を列で示した表形式ファイルで提供される。あるいは、ユーザはゲノムに基づいた手法を使用して結果を探究することができる。したがって、各標的ゲノムは図示される。この図は、選択されたゲノムにおける解答のｓｇＲＮＡモチーフの分布全体の円形ヒストグラムである。この図は、ｓｇＲＮＡ分布の局所的な内訳を表示するように双方向性である。ＣＳＴＢウェブサイトは、ｈｔｔｐｓ：／／ｃｓｔｂ．ｉｂｃｐ．ｆｒにて自由にアクセスすることができる。

（結果）
標的抗菌性プラスミド（ＴＡＰ）モジュール設計
ＴＡＰは、合成ｐＳＥＶＡプラスミドコレクション（参考文献７）に由来し、ｐＢＢＲ１の複製起点、選択した耐性遺伝子カセット、およびＦプラスミドのｏｒｉＴ_Ｆ伝達起点を有する（図１ａ）。ＴＡＰは、その結果、ドナー細胞に含まれる接合性Ｆ－Ｔｎ１０ヘルパープラスミドからトランスにおいて生成される接合機構によって動員される（図１ｂ）（参考文献８、９）。Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓｐｙｏｇｅｎｅｓの野生型ｃａｓ９遺伝子（ＣＲＩＳＰＲ活性のため）または触媒不能のｄｃａｓ９遺伝子（ＣＲＩＳＰＲｉ活性のため）と、ｔｒａｃｒＲＮＡ定常足場および標的特異的ｃｒＲＮＡスペーサー配列から構成されるガイドｇＲＮＡ配列とを挿入した（図１ａ）。ワンステップのクローニングでｃｒＲＮＡスペーサー配列を変更することでによって、任意の特定の染色体またはプラスミドＤＮＡに対するＴＡＰの標的化を再プログラムすることができる。また、ＴＡＰは、任意で、顕微鏡観察およびフローサイトメトリーアッセイにおいてプラスミド伝達蛍光レポーターとして機能するように、広範な宿主範囲の合成ＢｉｏＦａｂプロモーターから高度に発現されるスーパーフォールダー緑色蛍光（ｓｆｇｆｐ）またはｍｃｈｅｒｒｙ遺伝子（参考文献１０）のいずれかも有する（図１ａ）。

ＴＡＰＣＲＩＳＰＲおよびＣＲＩＳＰＲｉの活性の検証
ＴＡＰが効果的かつ特異的なＣａｓ９媒介の殺傷（ＣＲＩＳＰＲ）またはｄＣａｓ９媒介の遺伝子発現阻害（ＣＲＩＳＰＲｉ）を誘導する能力を扱った。まず、ＴＡＰがＣａｓ９媒介の殺傷を誘導する能力を、Ｅ．ｃｏｌｉのｌａｃＺ遺伝子を標的とする、これまでに記載したｌａｃＺ２スペーサーを使用して、確認した（参考文献１１）。ＴＡＰ－Ｃａｓ９－ｌａｃＺ２プラスミドでｌａｃ＋ＭＧ１６５５野生株を形質転換すると、標的のｌａｃＺ遺伝子座を欠失させた同質遺伝子のｌａｃ－株よりも効率が約１０００倍低くなった。一方、Ｅ．ｃｏｌｉのゲノムを標的としない非特異的（ｎｓｐ）ｃｒＲＮＡスペーサーを含むＴＡＰ－Ｃａｓ９－ｎｓｐプラスミドは、ｌａｃ＋株およびｌａｃ－株の両方で同等の効率で形質転換された。次に、ＴＡＰがｄＣａｓ９媒介のＣＲＩＳＰＲｉ活性を誘導する能力を、ＭＧ１６５５Ｅ．ｃｏｌｉ突然変異株ＯｍｐＲ２３４（参考文献１３）において細胞表面のカーリ線毛（参考文献１２）の産生を促すｃｓｇＢプロモーターを標的とするｃｓｇＢスペーサーを使用することによって検証した。寒天プレート上でのコンゴレッド（ＣＲ）染色および液体培地での凝集塊形成を、カーリ産生の直接的な読み出し情報として使用した（参考文献１３、１４）。ＴＡＰ－ｄＣａｓ９－ｃｓｇＢは、ＣＲの存在下で白色コロニーを形成すること、および凝集塊を形成できないことによって反映されるように、ＯｍｐＲ２３４株によるカーリ産生を効果的に阻害する。一方、非特異的なＴＡＰ－ｄＣａｓ９－ｎｓｐは、ＯｍｐＲ２３４株のカーリ形成または凝集に影響を与えない。また、ＴＡＰからＣａｓ９またはｄＣａｓ９を恒常的に生成しても、増殖異常または細胞形態の伸長を引き起こさないことを確認し、一部のシステムで報告された毒性作用とは対照的であった（参考文献１５～１８）。これらの結果は、Ｃａｓ９媒介の殺傷またはｄＣａｓ９媒介の遺伝子発現阻害を誘導するＴＡＰの能力が効果的であり、スペーサー配列による正確な標的化に依存していることを実証している。

ＴＡＰ媒介の標的レシピエント細胞の殺傷
次に、ＴＡＰが接合によって伝達されて、Ｅ．ｃｏｌｉのレシピエント細胞において抗菌活性を誘導する能力を扱った。接合を、Ｆ－Ｔｎ１０ヘルパープラスミドとＴＡＰ－Ｃａｓ９－ｎｓｐまたはＴＡＰ－Ｃａｓ９－ｌａｃＺ２動員プラスミドとを含むＥ．ｃｏｌｉのＭＧ１６５５ドナー株を使用して行った。フローサイトメトリー分析を使用して、染色体にコードされた赤色蛍光ヒストン様タンパク質ＨＵ－ｍＣｈｅｒｒｙを産生するｌａｃ＋レシピエント株への、これらのＴＡＰ（ｓｆＧＦＰ緑色蛍光レポーターを有する）の伝達効率を定量した。赤色および緑色の蛍光を合わせて示すトランスコンジュガントの定量によって、ＴＡＰ－Ｃａｓ９－ｎｓｐおよびＴＡＰ－Ｃａｓ９－ｌａｃＺ２が両方とも、３時間の交配後にレシピエント細胞個体群の約６５％に伝達されることが示された（図１ｃ）。予想されたように、ＴＡＰ伝達にはドナー株にＦ－Ｔｎ１０プラスミドが存在することが必要であった。最も重要な点として、接合混合物の並行プレーティングにより、ＴＡＰ－Ｃａｓ９－ｌａｃＺ２トランスコンジュガントの生存率がＴＡＰ－Ｃａｓ９－ｎｓｐトランスコンジュガントと比較して約３．５ｌｏｇ減少したことが明らかになった（図１ｄ）。また、この殺傷活性は、ＴＡＰ－Ｃａｓ９－ｎｓｐドナーでは約２０倍増加したのに比較して、ＴＡＰ－Ｃａｓ９－ｌａｃＺ２ドナー株との３時間の交配時に、レシピエント細胞総数の増加がないことによっても反映されている（図１ｅ）。重要な点として、標的のｌａｃＺ遺伝子座を欠く同質遺伝子のｌａｃ－レシピエント株を使用したとき、いずれのＴＡＰでも殺傷作用が観察されない。これらの結果は、ＴＡＰ－Ｃａｓ９－ｎｓｐおよびＴＡＰ－Ｃａｓ９－ｌａｃＺ２がＦ－Ｔｎ１０接合機構を介して同等の効率で伝達されることを示す。しかし、ＴＡＰ－Ｃａｓ９－ｎｓｐではなくＴＡＰ－Ｃａｓ９－ｌａｃＺ２の獲得が、トランスコンジュガント細胞の生存率の低下に関連している。

生細胞顕微鏡を使用して、ＴＡＰを獲得した際のレシピエント細胞の細胞応答の特徴を記述した（図２）。これらの実験において、ＴＡＰは、ドナー細胞およびトランスコンジュガント細胞に緑色蛍光を付与するｓｆＧＦＰレポーターシステムを有する。ｌａｃ＋レシピエント細胞は核様体会合タンパク質のＨＵ－ｍＣｈｅｒｒｙを産生し、その局在化によって全体的な染色体構成が明らかになる。予想されるように、赤色のレシピエント細胞におけるｓｆＧＦＰ緑色蛍光の生成によって報告されたＴＡＰ－Ｃａｓ９－ｎｓｐの獲得は、増殖、細胞形態、または核様体構成に影響を与えない（図示せず）。一方、ＴＡＰ－Ｃａｓ９－ｌａｃＺ２の獲得は、不定形のＤＮＡバルクへと成長する核様体の急速な崩壊を誘発し、その後、細胞の繊維化、および時には細胞の溶解が続く（図２ａ～図２ｂ）。さらに、ＤＮＡ損傷誘導に応答して細胞内の大きな構造体に重合することが報告されているＲｅｃＡ－ＧＦＰ融合物の局在パターンをレシピエント細胞において分析した（参考文献１９）。これらの実験において、ＴＡＰは、ドナー細胞およびトランスコンジュガント細胞に赤色蛍光を付与するｍＣｈｅｒｒｙレポーターシステムを有する。画像分析は、ＴＡＰ－Ｃａｓ９－ｎｓｐ（図示せず）ではなく、ＴＡＰ－Ｃａｓ９－ｌａｃＺ２（図示せず）の獲得後に、細胞の繊維化（図２ｃ）、および蛍光歪度分析を使用して定量したＲｅｃＡ－ＧＦＰ重合（図２ｄ、方法参照）が続くことを明らかにしている。核様体の崩壊、細胞の繊維化、およびＲｅｃＡ－ＧＦＰ束形成によって、ＴＡＰ－Ｃａｓ９－ｌａｃＺ２獲得後にトランスコンジュガントの死滅をもたらすＣＲＩＳＰＲ媒介のＤＳＢ誘導が続くことが確認される。

Ｅ．ｃｏｌｉ混合レシピエント個体群内におけるＴＡＰ媒介の選択的殺傷
標的のｌａｃ＋Ｅ．ｃｏｌｉ株および非標的のｌａｃ－Ｅ．ｃｏｌｉ株から構成される混合レシピエント個体群内におけるＴＡＰ媒介の殺傷の特異性を検証した。ＴＡＰ－Ｃａｓ９－ｌａｃＺ２を使用したとき、生存ｌａｃ＋トランスコンジュガントはｌａｃ－トランスコンジュガントと比較して約４ｌｏｇ倍減少したことが観察されるが、ＴＡＰ－Ｃａｓ９－ｎｓｐでは差が観察されない（図３ａ）。また、ＴＡＰ－Ｃａｓ９－ｌａｃＺ２特異的殺傷活性は、６時間の交配時に、標的のｌａｃ＋レシピエントの総個体群数が停滞し、非標的のｌａｃ－の個体群数が増殖できることによっても反映されている（図３ｂ）。生細胞顕微鏡イメージングを行ったところ、ｌａｃ＋およびｌａｃ－のレシピエントが、それぞれ核様体に関連するＨＵ－ｍＣｈｅｒｒｙおよびレプリソームに関連するＤＮＡクランプＤｎａＮ－ｍＣｈｅｒｒｙの典型的な局在パターンで識別された。タイムラプス分析は、両方の株が緑色蛍光の増加によって示されるプラスミドを受け取るが、標的のｌａｃ＋トランスコンジュガントのみがＣａｓ９媒介のＤＮＡ損傷誘導の徴候である細胞繊維化を示すことを示している（図３ｃ）。これらの結果は、個々のレシピエント株を使用するときに得られた効果を再現しており、ＴＡＰが混合個体群内の標的株を選択的に殺傷することを実証している。

ＴＡＰエスケープ変異体の分析
ＴＡＰ－Ｃａｓ９－ｌａｃＺ２の伝達は、ｌａｃ＋トランスコンジュガント細胞における生存率の約３．５ｌｏｇの低下に関連するが、ＴＡＰを獲得しても生存できる一部のトランスコンジュガント細胞を認めた（図１ｄ）。ＴＡＰ－Ｃａｓ９－ｌａｃＺ２活性を回避した３１個のクローンの遺伝子型判定およびシーケンス分析により、２タイプのエスケープ変異体を明らかにした。３分の１（３１個のうち１２個）は、プラスミド保有ｃａｓ９遺伝子にトランスポザーゼまたはＩＳ挿入を獲得しており、したがってＣＲＩＳＰＲシステムを不活性化している。３分の２は、すでに記載されているように小さいもしくは大きい欠失によって（３１個のうち１２個）（参考文献１１）、またはＣａｓ９－ｇＲＮＡ複合体による認識の鍵となることが示されるＰＡＭのシード領域の点突然変異（３１個のうち７個）（参考文献２０）によってのいずれかで、標的のｌａｃＺ染色体遺伝子座を改変する突然変異を獲得している。

カルバペネム耐性個体群を対象とするＴＡＰ
接合性プラスミドは、細菌における多剤耐性の拡散に大きく寄与しており（参考文献２１）、カルバペネム耐性を付与するプラスミドは、臨床における深刻な懸念となっている（参考文献２２）。ＩｎｃＬ／ＭｐＯＸＡ－４８ａプラスミドは、カルバペネムならびに他のβラクタム、例えばイミペネムおよびペニシリンなどに耐性を付与するＯＸＡ－４８カルバペネマーゼをコードするｂｌａ_{ＯＸＡ－４８}遺伝子を有する（参考文献２３）。ｐＯＸＡ－４８ａを標的とするＴＡＰを設計し、プラスミド保有個体群をアンピシリンに感作させるその能力を評価した。ｂｌａ_{ＯＸＡ－４８}遺伝子の５’末端を標的とするＯＸＡ４８スペーサーを使用して、ｐＯＸＡ－４８ａにＣａｓ９媒介のＤＳＢを誘導するＴＡＰ－Ｃａｓ９－ＯＸＡ４８、およびＣＲＩＳＰＲｉによってｂｌａ_{ＯＸＡ－４８}遺伝子の転写を阻害するＴＡＰ－ｄＣａｓ９－ＯＸＡ４８を構築した（図４Ａ）。ｐＯＸＡ－４８ａ保有Ｅ．ｃｏｌｉレシピエントにＴＡＰ－Ｃａｓ９－ＯＸＡ４８およびＴＡＰ－ｄＣａｓ９－ＯＸＡ４８プラスミドを伝達することで、アンピシリン耐性レベルの約４．５ｌｏｇの低下をもたらすが、ＴＡＰ－Ｃａｓ９－ｎｓｐおよびＴＡＰ－ｄＣａｓ９－ｎｓｐは効果を有しない（図４ｂ）。予想外に、ＴＡＰ－ｄＣａｓ９－ＯＸＡ４８と比較してＴＡＰ－Ｃａｓ９－ＯＸＡ４８を使用するとき、有意に少ない生存トランスコンジュガントがアンピシリン選択なしで得られることを観察している（図４ｂ）。試験したすべての４つのプラスミドは、ｐＯＸＡ－４８ａプラスミド非含有Ｅ．ｃｏｌｉレシピエントによって同様の発生頻度で獲得されることから、ＴＡＰ－Ｃａｓ９－ＯＸＡ４８の伝達能力の低下の可能性は排除した。しかしながら、ｐＯＸＡ－４８ａのプラスミド配列の分析によって、プラスミドを受け継がない娘細胞の増殖を阻害することでプラスミドの安定性に関与するｐｅｍＩＫ毒素－抗毒素（ＴＡ）システムの存在が明らかになった（参考文献２４～２６）。実際に、プラスミドの喪失のためｐｅｍＩＫの発現が停止することによって、不安定なＰｅｍＩ抗毒素が急速に枯渇し、より安定なＰｅｍＫ毒素の毒性活性を抑制できなくなる。この調節は、ｐＳＨＶ－１８プラスミドが有する抗生物質耐性を治すＣＲＩＳＰＲ関連ファージ治療を使用して報告された（参考文献２６）。そこで、生存ＴＡＰ－Ｃａｓ９－ＯＸＡ４８トランスコンジュガントの減少が観察されたのは、Ｃａｓ９の切断によって標的となったｐＯＸＡ－４８ａを失った細胞におけるＰｅｍＫの毒性活性によるものであり得ることを仮定した。この可能性は、恒常的に発現する抗毒素ｐｅｍＩ遺伝子をＴＡＰ－Ｃａｓ９－ＯＸＡ４８に挿入することによって確認され、これにより、アンピシリン耐性の阻害を保持しながら、トランスコンジュガントの生存率の約１．５ｌｏｇの増加をもたらした（図４ｂ）。

さらに、ＴＡＰドナーと接合したｐＯＸＡ－４８ａを有する株の耐性の長期的な進展を調査した。ＴＡＰ－ｄＣａｓ９－ｎｓｐは影響を与えなかったが、ＴＡＰ－ｄＣａｓ９－ＯＸＡ４８の伝達およびそれにより生じたレシピエント個体群のアンピシリンに対する再感作は２４時間後に平衡に達することが観察された。この時点から、安定な９０％のレシピエントがＴＡＰ－ｄＣａｓ９－ＯＸＡ４８を受け取り、アンピシリンに感作するようになった。残りの１０％のアンピシリン耐性レシピエント細胞は、Ｆ－Ｔｎ１０プラスミドのみの獲得からもたらされ得、したがってレシピエント細胞におけるＦコード排除システムが確立され、その後の接合事象おいてＴＡＰを獲得することが永久にできないことを仮定した。この仮説は、共培養の１日後および７日後の個体群に存在するすべてのアンピシリン耐性レシピエントが、Ｆ－Ｔｎ１０を含むがＴＡＰ－ｄＣａｓ９ＯＸＡ４７は含まないことを示すことによって確認された。動員可能なＴＡＰの伝達効率を調整する１つの方法は、Ｆプラスミドの伝達起点を欠失させることによって、Ｆプラスミドの伝達を阻止することであり得る。まず、これにより、Ｆプラスミドのみを獲得すること、および結果的にレシピエント細胞における排除機序が確立されることを防ぎ得る。次に、ＴＡＰのみを受け取ったレシピエント細胞は、Ｆコード接合機構がないため、他のレシピエント細菌にＴＡＰを伝達することができなくなり得る。この状況において、ＴＡＰはより緩やかに、しかし潜在的には個体群内のすべてのレシピエント細胞に拡散すると予想される。

ｐＯＸＡ－４８ａはＥｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅの中で広まる自律接合性プラスミドであり、ｐＯＸＡ－４８ａを含むレシピエントが交配時にアンピシリン耐性をＴＡＰドナーに伝達し得る可能性を高めている。アンピシリン耐性は、ＴＡＰ－ｄＣａｓ９－ｎｓｐまたはＴＡＰ－Ｃａｓ９－ｎｓｐを有するドナーの約０．２％および０．１２％に実際に伝達されることが観察された（図４ｃ）。しかしながら、ＴＡＰ－ｄＣａｓ９－ＯＸＡ４８またはＴＡＰ－Ｃａｓ９－ＯＸＡ４８を有するドナーは、アンピシリン耐性を獲得しない（図４ｃ）。ｐＯＸＡ４８の伝達効率が細胞内のＴＡＰの存在に影響されないと仮定すると、この結果は、ＯＸＡ４８を対象とするＴＡＰが、たとえｐＯＸＡ４８プラスミドを獲得したとしても、耐性の発生を妨害することを示唆している。プラスミド非含有レシピエントの野生型株（Ｒ＃２）を接合混合物中に加えて同様の接合実験を行うことによって、この可能性を試験した（図４ｄの模式図参照）。ＴＡＰ－Ｃａｓ９－ｎｓｐまたはＴＡＰ－ｄＣａｓ９－ｎｓｐを受け取ったＲ＃２細胞の中で、それぞれ約０．２４％および０．１５％がアンピシリン耐性となった。しかしながら、ＴＡＰ－Ｃａｓ９－ＯＸＡ４８またはＴＡＰ－ｄＣａｓ９－ＯＸＡ４８を受け取ったＲ＃２細胞では、アンピシリン耐性は観察されない（図４ｄ）。これらの結果は、全体として、ｂｌａ_{ＯＸＡ－４８}遺伝子にＴＡＰを誘導することが、ｐＯＸＡ－４８ａ保有株をアンピシリンに感作するために効果的な方策であることを実証する。さらに、ＴＡＰはまた、ドナーおよび他のプラスミド非含有レシピエントが耐性を生じることを防ぐことで、薬剤耐性の拡散を妨害すると認められる。

ＣＳＴＢソフトウェア：多菌種の細菌個体群内の特定株を標的にする
他の細菌株に影響を与えず、特定の細菌種に対して抗菌活性を生じるＴＡＰを設計するためには、標的生物体のゲノムに存在するが、他の非標的菌株のゲノムには存在しないスペーサー配列を適切に同定する必要がある。この課題を達成するためのこうしたツールは存在しなかったので、広範囲の細菌ゲノムおよびプラスミドにわたる約１８～２３ヌクレオチド（ｎｔ）の長さのスペーサー配列の比較分析を可能にする「細菌用Ｃｒｉｓｐｒ検索ツール」のＣＳＴＢアルゴリズムを開発した。ＣＳＴＢのバックエンドデータベースは、ＮＣＢＩ分類法に従って分類された２９１９個の全ゲノムに存在するこれらのモチーフのすべての出現を索引付けしている。ＣＳＴＢは、標的の染色体またはプラスミドＤＮＡにおける固有の部位または複数の部位に対してＴＡＰをリプログラムするために適切なスペーサー配列を同定することができる。

ＣＳＴＢアルゴリズムに、データベースに存在する他のいずれの細菌ゲノムも標的とせず、付着／消滅（Ａ／Ｅ）病原体のＣｉｔｒｏｂａｃｔｅｒｒｏｄｅｎｔｉｕｍ株ＩＣＣ１６８（Ｃｒスペーサー）、または腸管病原性Ｅ．ｃｏｌｉＥＰＥＣ株Ｅ２３４８／６９（ＥＰＥＣスペーサー）、または院内病原体のＥｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒｃｌｏａｃａｅ（Ｅｃｌスペーサー）、またはそれら３つ（ＥＥＣスペーサー）を標的とするスペーサー配列を生成するように依頼した。Ｃ．ｒｏｄｅｎｔｉｕｍを対象とするＴＡＰは、固有の遺伝子座を標的とするＣｒ１スペーサー、またはゲノムにわたって分布する２２の遺伝子座を標的とするＣｒ２２スペーサーを有する。Ｅ．ｃｏｌｉドナーからＴＡＰ－Ｃａｓ９－Ｃｒ１を伝達すると、Ｃ．ｒｏｄｅｎｔｉｕｍのトランスコンジュガント細胞の生存率が４ｌｏｇ低下する。生細胞顕微鏡で観察したところ、ＴＡＰ－Ｃａｓ９－Ｃｒ１獲得によりＣ．ｒｏｄｅｎｔｉｕｍの繊維化および溶解が誘導される一方、ＴＡＰ－Ｃａｓ９－ｎｓｐでは増殖異常が誘導されないことが明らかになった。これは、Ｅ．ｃｏｌｉで観察されたように、Ｃａｓ９による単一のＤＳＢの誘導がＣ．ｒｏｄｅｎｔｉｕｍにとって致死的であることを示している。同様に、ＴＡＰ－Ｃａｓ９－Ｃｒ２２によって２２の染色体遺伝子座を標的とすると、同等のトランスコンジュガントの殺傷効率がもたらされる。しかしながら、複数の標的化は、トランスコンジュガントがＴＡＰ活性を回避する機序の寄与を不均衡にする。Ｃｒ１の単一の標的を回避した２０個のクローンの分析によって、標的の染色体遺伝子座の欠失またはＴＡＰにおけるＣＲＩＳＰＲシステムの不活性化のいずれかが同等の割合であることが明らかになった。一方、Ｃｒ２２の複数の標的を回避したクローンの大部分（２０個のうち１９個）は、ＴＡＰのＣＲＩＳＰＲシステムを不活性化する突然変異を有する。これは、同じ要求内で２２個の標的の染色体部位の突然変異が起こることが可能であるとしても極めてまれであるという予測と一致する。

Ｆ接合機構によるＴＡＰ伝達は、ＭＧ１６５５Ｅ．ｃｏｌｉ実験株に対して極めて効率的であり、３時間の交配において最大９０％の効率を達成した（図１）。非実験株でＴＡＰ－Ｃａｓ９－ｎｓｐの伝達効率を定量し、ＭＧ１６５５Ｅ．ｃｏｌｉと比較して、ＴＡＰ獲得頻度が全体的に約７～９００倍低下しており、レシピエント間の差異を観察した（図５ａ）。この変動に対応するため、ＴＡＰ－Ｃａｓ９－Ｃｒ１、－Ｅｃｌ、－ＥＰＥＣ、および－ＥＥＣで得られた生存トランスコンジュガントの発生頻度を、対応する細菌株におけるＴＡＰ－Ｃａｓ９－ｎｓｐトランスコンジュガントの発生頻度に対してノーマライズした（図５ｂ）。ＴＡＰ－Ｃａｓ９－Ｃｒ１はＣ．ｒｏｄｅｎｔｉｕｍ、ＴＡＰ－Ｃａｓ９－ＥｃｌはＥ．ｃｌｏａｃａｅ、ＴＡＰ－Ｃａｓ９－ＥＰＥＣはＥ．ｃｏｌｉのＥＰＥＣにのみトランスコンジュガントの生存率低下を誘導する一方、ＴＡＰ－ＣＡＳ９－ＥＥＣは３つの病原株を標的にすることを定量した。コントロールとして、いずれのスペーサーもそのゲノムを標的としない共生Ｅ．ｃｏｌｉのＨＳのレシピエントは、これらの抗菌性ＴＡＰのいずれにも影響されないことを示す（図５ｂ）。これらの結果は、ＣＳＴＢアルゴリズムによって生成されたスペーサー配列によって、単一菌種のレシピエント個体群に対する効率的かつ株特異的な抗菌活性のためにＴＡＰを適切にリプログラミングすることができることを実証している。また、所定の１つのＴＡＰが同時にいくつかの菌種を標的とできることも実証している。

次に、同等の割合の３つの病原株および共生Ｅ．ｃｏｌｉのＨＳから構成される多菌種のレシピエント個体群内において、ＴＡＰが株特異的な抗菌活性を誘導する能力を扱った（図５ｃ）。ＴＡＰ－Ｃａｓ９－ｎｓｐとの３時間の交配後に得られるトランスコンジュガントの割合は様々であり（図５ｄ）、異なるレシピエント株の中でのＴＡＰ伝達の効率を反映している（図５ａ）。多菌種のレシピエント混合物内において、Ｃ．ｒｏｄｅｎｔｉｕｍトランスコンジュガントの生存率はＴＡＰ－Ｃａｓ９－Ｃｒ１によって、Ｅ．ｃｌｏａｃａｅの生存率はＴＡＰ－Ｃａｓ９－Ｅｃｌによって、Ｅ．ｃｏｌｉのＥＰＥＣの生存率はＴＡＰ－Ｃａｓ９－ＥＰＥＣによって著しく低下する一方、３菌種すべてが三重標的のＴＡＰ－Ｃａｓ９－ＥＥＣに影響されることを観察した。コントロールの共生Ｅ．ｃｏｌｉのＨＳのトランスコンジュガントにおける生存率は、いずれの抗菌ＴＡＰにも影響されない（図５ｄ）。これらの結果は、ＴＡＰが非標的菌種に影響を与えることなく、多菌種混合のレシピエント個体群内で選択的殺傷を達成することを検証している。抗菌性ＴＡＰはトランスコンジュガント個体群の生存率に選択的に影響を与えるが、病原性レシピエント株へのＴＡＰ伝達の効率が抑えられていること、および接合混合物内の競争においてこれらの株の適応度が異なることから、その活性は各菌種のレシピエント総数によって有意に反映されていない。

（検討）
ｉｎｓｉｔｕで細菌叢を操作するツールは、現在、その黎明期にある。本明細書において、ＴＡＰの抗菌方策がｉｎｖｉｔｒｏの多菌種個体群内において効率的かつ株特異的な抗菌活性を発揮する能力を実証している。ＴＡＰの選択的殺傷活性は、試験した菌種における約４ｌｏｇの生存率低下をもたらす。ｐＯＸＡ４８ａカルバペネム耐性プラスミドを標的とするＴＡＰは、株の薬剤に対する感受性を４～５ｌｏｇ増加させる。現在開発中のＣＲＩＳＰＲ送達方法の多くは、宿主範囲が本質的に狭いバクテリオファージの使用に焦点を置いている（参考文献２７）。また、いくつかの近年の研究は、Ｅ．ｃｏｌｉ（参考文献２６、２８～３０）またはＳ．ｅｎｔｅｒｉｃａ（参考文献３１）をｉｎｖｉｔｒｏで標的とするＣＲＩＳＰＲシステムを送達するために、広範な宿主範囲のＲＫ２接合システムを使用することに成功している。これらの手法に対するこの方策の重要な一利点は、他の菌種を標的にすることなく、目的の１つまたは複数の細菌株に対してＴＡＰを特異的に再標的化するために使用する必要があるｇＲＮＡを適切に同定することができる、ＣＳＴＢアルゴリズムによってもたらされる汎用性である。ＣＲＩＳＰＲモチーフの同定に特化した数多くのプログラムが利用可能であるにもかかわらず、ＣＳＴＢはこれまでのところ同等のものがない（参考文献３２）。ＴＡＰは、ワンステップのクローニングでスペーサー配列を変更することによって、迅速かつ容易にリプログラムすることができる（方法参照）。ＴＡＰの他の利点は、広範囲のＥｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅにおいて活性であるプロモーターからＣＲＩＳＰＲシステム（および蛍光レポーター）を恒常的に発現させることである。外部誘導原が不要なため、ＴＡＰの手法がｉｎｖｉｖｏにおける自然の細菌群の改変にさらに適したものとなっている。

また、この研究はＴＡＰの効率が主に２つの主要な制限要因によって決定されることを明らかにしている。第１の制限要因は、プラスミド保有ｃａｓ９遺伝子を不活性化する突然変異、または標的配列を改変する突然変異を獲得するエスケープクローンの発生頻度が約１０^－４～１０^－５であることである。Ｃ．ｒｏｄｅｎｔｉｕｍにおいて示すように、標的細菌のゲノムにおける複数の部位を標的とすることによって、後者の回避機序を防ぐことができる。また、必須遺伝子の突然変異は多くの場合、宿主細菌にとって致死的であるので、必須遺伝子を標的とすることが他の方策となり得る（参考文献３３）。第２の制限パラメータは、標的株へのＴＡＰの伝達効率である。これまでのところ、接合を使用する抗菌性（参考文献２８、３４）または抗薬剤（参考文献２９、３０、３５）の方法論のすべては、広範な宿主範囲を示すが、伝達効率は低い（１０^－４～１０^－５）、ｉｎｃＰＲＫ２接合システムに基づいている。Ｈａｍｉｌｔｏｎらは、ｉｎｖｉｔｒｏにおいてガラスビーズを使用した、伝達効率を増加させる人工的な方法を示している（参考文献３１）。本明細書において、近縁のＥｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅへの比較的効率的なＴＡＰ伝達（１０^－１～１０^２）を媒介するヘルパープラスミドとしてＦプラスミドを使用する。したがって、ＴＡＰは、臨床上関連する種々の病原性細菌または耐性菌（Ｅ．ｃｏｌｉ、Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ、Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ、Ｙｅｒｓｉｎｉａ、Ｓｈｉｇｅｌｌａ、Ｓｅｒｒａｔｉａ等）を標的とするのに適切であると認められる。系統的に離れた菌種を標的とするためにＴＡＰを使用するには、伝達能力を高めた広範な宿主範囲の接合システムを開発する必要があり得る。こうしたスーパースプレッダープラスミド突然変異体は、Ｔｎシークエンシング手法によって単離に成功しており（参考文献３６、３７）、ＴＡＰが対象にできる細菌の範囲を広げるために価値のある選択肢に相当し得る。

ｉｎｖｉｔｒｏにおける本概念の証明をｉｎｓｉｔｕの場に移行することは、細菌叢の組成をｉｎｓｉｔｕで特異的であるように操作するための、抗生物質なしの方策の開発に向けた、重要な一歩に相当し得る。ＴＡＰは、感染した宿主もしくは環境から有害な病原性株および耐性株を阻害するために、または病原性エフェクター遺伝子もしくはバイオフィルム形成に関与する遺伝子を阻害することによって抗病原性の方策として、使用することができる。臨床または環境の場におけるＴＡＰ手法の今後の応用性には、遺伝子組換え、ＣＲＩＳＰＲ、および生物学的封じ込めに対する急速に発展する規制を考慮する必要があり得る（参考文献３８～４０）。

（参考文献）
本願において、種々の参考文献によって、本発明が属する技術の現状が記載されている。これらの参考文献の開示は、本明細書において言及によって本開示に援用される。
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Claims

（ｉ）複製起点、（ｉｉ）伝達起点、（ｉｉｉ）ヌクレアーゼをコードする、遺伝子学的に操作した核酸配列、および（ｉｖ）ガイドＲＮＡ分子をコードする、１つ以上の遺伝子学的に操作した核酸配列を含む、標的抗菌性プラスミド（ＴＡＰ）。
前記複製起点は、ｐＢＢＲ１プラスミドの複製起点であり、より具体的には配列番号１の核酸配列からなる、請求項１に記載のプラスミド。
前記伝達起点は、ＲＰ４プラスミドのｏｒｉＴであり、より具体的には配列番号２の核酸配列からなる、請求項１に記載のプラスミド。
前記伝達起点は、ＦプラスミドのｏｒｉＴＦであり、より具体的には配列番号３の核酸配列からなる、請求項１に記載の方法。
ＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼ、より具体的にはＣａｓ９タンパク質に由来するＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓヌクレアーゼをコードする、請求項１に記載のプラスミド。
前記Ｃａｓ９ヌクレアーゼは、配列番号４に示すアミノ酸配列を含む、請求項５に記載のプラスミド。
前記Ｃａｓ９タンパク質をコードする核酸配列は、配列番号７の核酸配列からなる、請求項５に記載のプラスミド。
前記ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓヌクレアーゼは欠損Ｃａｓ９である、請求項５に記載のプラスミド。
前記欠損Ｃａｓ９は、配列番号５または配列番号６に示すアミノ酸配列を含むＣａｓニッカーゼである、請求項８に記載のプラスミド。
前記欠損Ｃａｓ９タンパク質をコードする核酸配列は、配列番号８の核酸配列からなる、請求項９に記載のプラスミド。
前記ヌクレアーゼをコードする核酸配列は、弱い恒常的プロモーターと作動可能に連結され、より具体的には配列番号９の核酸配列を有する弱い恒常的プロモーターＢＢａ＿Ｊ２３１０７と作動可能に連結される、請求項１に記載のプラスミド。
ガイドＲＮＡ分子をコードする、２、３、３、４、５、６、７、８、９、または１０個の核酸配列を含む、請求項１に記載のプラスミド。
本発明のプラスミドによってコードされる前記ガイドＲＮＡ分子は、スペーサー配列（すなわち、ｃｒＲＮＡ）およびトランス活性化ＲＮＡ（「ｔｒａｃｒＲＮＡ」）配列を含む、請求項１に記載のプラスミド。
前記スペーサー配列は、抗生物質耐性遺伝子を標的とする、または標的配列にＤＳＢを生じさせるように設計されている、請求項１３に記載のプラスミド。
前記スペーサー配列は、表Ａから選択される核酸配列によってコードされる、請求項１３に記載のプラスミド。
前記ガイドＲＮＡ分子をコードする核酸配列は、強い恒常的プロモーターと作動可能に連結され、より具体的には配列番号２６の核酸配列を有する強い恒常的プロモーターＢＢａ＿Ｊ２３１１９と作動可能に連結される、請求項１に記載のプラスミド。
任意で１つ以上の選択マーカーを含む、請求項１に記載のプラスミド。
配列番号２７または２８に示す核酸配列からなる、請求項１に記載のプラスミド。
所定のコピー数の請求項１に記載の標的抗菌性プラスミドを含む、ドナー細菌細胞。
所定のコピー数の接合性プラスミドをも含む、請求項１９に記載のドナー細菌細胞。
所定のコピー数のＦ因子、および、所定のコピー数である、Ｆプラスミドの伝達起点を含む標的抗菌性プラスミドを含む、請求項２０に記載のドナー細菌細胞。
所定のコピー数のＲＰ４プラスミド、および、所定のコピー数である、ＲＰ４プラスミドの伝達起点を含む標的抗菌性プラスミドを含む、請求項２０に記載のドナー細菌細胞。
非病原性である、より具体的にはプロバイオティクス細胞である、請求項１９に記載のドナー細菌細胞。
複数のレシピエント細菌細胞を殺傷するための方法であって、前記複数のレシピエント細菌細胞を、所定のコピー数の請求項１に記載の標的抗菌性プラスミドを含む複数のドナー細菌細胞に曝露することを含み、前記標的抗菌性プラスミドは、前記複数のレシピエント細菌細胞においてヌクレアーゼおよび１つ以上のガイドＲＮＡ分子を発現するように構成され、前記複数のレシピエント細菌細胞における前記ヌクレアーゼおよびガイドＲＮＡ分子の伝達および発現が前記複数のレシピエント細菌細胞にとって致死的である、方法。
前記レシピエント細菌細胞は病原性細菌である、請求項２４に記載の方法。
様々な細菌感染症または細菌が関連する望ましくない状態を処置するための請求項２４に記載の方法。
抗生物質耐性遺伝子を含む細菌細胞によって引き起こされる対象における感染症を処置するための方法であって、治療有効量の抗生物質を、前記抗生物質耐性遺伝子を標的とし、それによって前記抗生物質耐性遺伝子を不活化し、前記細菌細胞を前記抗生物質に感作させることに適した１つ以上のガイドＲＮＡ分子をコードする所定のコピー数の標的抗菌性プラスミドを含む治療有効量の細菌ドナー細胞と組み合わせて、前記対象に投与することを含む、方法。
所定量の請求項１９に記載のドナー細菌細胞を含む組成物。