KR20230082676A - 표적-항균-플라스미드 조합 접합 및 crispr/cas 시스템 및 그의 용도 - Google Patents

표적-항균-플라스미드 조합 접합 및 crispr/cas 시스템 및 그의 용도 Download PDF

Info

Publication number
KR20230082676A
KR20230082676A KR1020237015556A KR20237015556A KR20230082676A KR 20230082676 A KR20230082676 A KR 20230082676A KR 1020237015556 A KR1020237015556 A KR 1020237015556A KR 20237015556 A KR20237015556 A KR 20237015556A KR 20230082676 A KR20230082676 A KR 20230082676A
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
lys
leu
plasmid
glu
asp
Prior art date
Application number
KR1020237015556A
Other languages
English (en)
Inventor
크리스티앙 레스떼르린
사라 비고
Original Assignee
쌍트르 나시오날 드 라 르쉐르쉐 싸이엉띠피끄(쎄.엔.에르.에스.)
위니베르시테 끌로드 베르나르 리옹 Ⅰ
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 쌍트르 나시오날 드 라 르쉐르쉐 싸이엉띠피끄(쎄.엔.에르.에스.), 위니베르시테 끌로드 베르나르 리옹 Ⅰ filed Critical 쌍트르 나시오날 드 라 르쉐르쉐 싸이엉띠피끄(쎄.엔.에르.에스.)
Publication of KR20230082676A publication Critical patent/KR20230082676A/ko

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
    • A61K35/66—Microorganisms or materials therefrom
    • A61K35/74—Bacteria
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A61K31/7088—Compounds having three or more nucleosides or nucleotides
    • A61K31/713—Double-stranded nucleic acids or oligonucleotides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/70—Vectors or expression systems specially adapted for E. coli
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/16—Hydrolases (3) acting on ester bonds (3.1)
    • C12N9/22—Ribonucleases RNAses, DNAses
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/10—Type of nucleic acid
    • C12N2310/20—Type of nucleic acid involving clustered regularly interspaced short palindromic repeats [CRISPRs]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/50—Physical structure
    • C12N2310/51—Physical structure in polymeric form, e.g. multimers, concatemers
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2320/00—Applications; Uses
    • C12N2320/30—Special therapeutic applications
    • C12N2320/32—Special delivery means, e.g. tissue-specific
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2330/00—Production
    • C12N2330/50—Biochemical production, i.e. in a transformed host cell
    • C12N2330/51—Specially adapted vectors
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2800/00—Nucleic acids vectors
    • C12N2800/10—Plasmid DNA
    • C12N2800/101—Plasmid DNA for bacteria
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2800/00—Nucleic acids vectors
    • C12N2800/80—Vectors containing sites for inducing double-stranded breaks, e.g. meganuclease restriction sites

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)

Abstract

약물-내성 박테리아의 범세계적인 출현은 우리의 항생제 무기고 효능의 손실을 야기하고 현재 이용가능한 치료의 성공을 심각하게 제한한다. 여기에서, 본 발명자들은 균주-특이적 항균 활성을 발휘하는 CRISPR/Cas 시스템을 전달하기 위해 박테리아 접합을 사용하는 표적-항균-플라스미드(TAPs: Targeted-Antibacterial-Plasmids)에 기반하는 혁신적인 전략을 개발하였다. TAP는 적절한 표적화 스페이서 를 식별하는 맞춤형 알고리즘(CSTB)을 사용하여 임의의 특정 게놈 또는 플라스미드 DNA를 겨냥할 수 있기 때문에 고도로 다용도적이다. 본 발명자들은 표적 게놈 내로 치명적인 DSB를 도입함으로써 균주-선택적 살상을 유도하는 TAP 능력을 입증한다. 플라스미드-유래 카바페넴(plasmid-born carbapenem) 내성 유전자에 대한 TAP는 균주가 약물에 대해 효율적으로 다시 민감하게 되도록 한다. 본 연구는 다른 비-표적 박테리아 공동체에 영향을 미치지 않고 표적 내성 및/또는 병원체 박테리아를 근절하는 데 사용될 수 있는 항생제 치료의 대안 개발을 향한 필수적인 단계를 나타낸다.

Description

표적-항균-플라스미드 조합 접합 및 CRISPR/CAS 시스템 및 그의 용도
본 발명은 세균학 및 의학의 분야이다.
약물-내성 박테리아의 전세계적인 확산이 향후 수십 년간 치료 실패로 인한 인간 사망의 극적인 증가를 야기할 것으로 예측된다. 박테리아 저항성의 지속적인 출현 및 현재의 낮은 항생제 발견율은 항생제 사용에 대한 진정한 대안을 나타내는 혁신적인 항균 전략의 개발의 필요성을 강조한다. 게다가, 항생제가 박테리아 증식에 필수적인 기본적인 과정을 표적으로 하기 때문에 항생제는 일반적으로 특이성을 결여한다. 결과적으로, 항생제는 원치않는 균주와 공생하는 균주를 구별하지 않고 치료된 박테리아 집단 전체에 영향을 미치고, 또한 약물-내성 균주 증식을 선택한다. 최근의 보고서는 뭉쳐서 주기적으로 간격을 띠는 짧은 회문구조 반복(CRISPR: Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats) 및 연관 Cas 단백질을 사용함으로써 특정한 항균 활성을 달성할 수 있는 가능성을 입증하고 있다. CRISPR/Cas 시스템은 Cas9 뉴클레아제에 의한 염색체로의 이중-가닥 절단(DSB: double-stranded break)의 유도를 통해 박테리아 살상을 달성할 수 있다(Jinek et al 2012, PMID22745249; Gasiunas et al 2012, PMID22949671). 사멸 촉매 Cas9 효소(dCas9)를 사용하는 경우, 특정 유전자의 발현이 또한 CRISPR 간섭(CRISPRi: CRISPR interference)을 통해서도 억제될 수 있다(Qi et al 2013; Bikard et al 2013; PMID23452860 PMID23761437). CRISPR 표적화는 약 16 내지 20개의 뉴클레오티드 표적-특이적 가이드 RNA(gRNA) 시퀀스에 의존하며, 이는 상보적인 DNA 시퀀스에 대한 Cas 뉴클레아제의 모집을 가능하게 한다(Jinek et al 2012; Anders et al 2014; PMID22745249 PMID 25079318). CRISPR 표적화는 특히 표적-외 활성이 제한되는 박테리아에서 고도로 특이적이다. 그러나, 실용적인 항균 도구로서 사용되기 위해서는, CRISPR/Cas 유전자가 표적 박테리아에 전달되어야 할 필요가 있다. 박테리아 DNA 접합은 바로 (고려되는 접합 시스템의 숙주-범위에 따른 전달 특이성으로) 길이가 긴 DNA 단편을 다양한 박테리아 종으로 전달할 수 있는 가능성을 제공한다.
본 발명은 특허청구범위에 의해 정의된다. 특히, 본 발명은 표적-항균-플라스미드 및 특히 치료 목적을 위한 이들의 용도에 관한 것이다.
약물-내성 박테리아의 범세계적인 출현은 우리의 항생제 무기고 효능의 손실을 야기하고 현재 이용가능한 치료의 성공을 심각하게 제한한다. 여기에서, 본 발명자들은 균주-특이적 항균 활성을 발휘하는 CRISPR/Cas 시스템을 전달하기 위해 박테리아 접합을 사용하는 표적-항균-플라스미드(TAPs: Targeted-Antibacterial-Plasmids)에 기반하는 혁신적인 전략을 개발하였다. TAP는 적절한 표적화 스페이서 시퀀스를 식별하는 맞춤형 알고리즘(CSTB)을 사용하여 임의의 특정 게놈 또는 플라스미드 DNA를 겨냥할 수 있기 때문에 고도로 다용도적이다. 본 발명자들은 표적 게놈 내로 치명적인 DSB를 도입함으로써 균주-선택적 살상을 유도하는 TAP 능력을 입증한다. 플라스미드-유래 카바페넴(plasmid-born carbapenem) 내성 유전자에 대한 TAP는 균주가 약물에 대해 효율적으로 다시 민감하게 되도록 한다. 본 연구는 다른 비-표적 박테리아 공동체에 영향을 미치지 않고 표적 내성 및/또는 병원체 박테리아를 근절하는 데 사용될 수 있는 항생제 치료의 대안 개발을 향한 필수적인 단계를 나타낸다.
주요 정의:
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 용어 "폴리펩티드", "펩티드" 및 "단백질"들은 임의의 길이의 아미노산의 중합체를 의미하도록 상호호환적으로 사용된다. 이 용어들은 또한 변형된 아미노산 중합체; 예를 들어, 이황화 결합 형성, 글리코실화, 리피드화, 포스포릴화 또는 표지 성분과의 접합을 포함한다. 유전자 요법의 맥락에서 논의되는 경우에서의 폴리펩티드는 각각 무손상의 폴리펩티드 또는 이의 임의의 단편 또는 유전적으로 조작된 유도체를 의미하며, 이는 무손상의 단백질의 원하는 생화학적 기능을 보유한다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 표현 "에서 파생되는"은 제1 성분(예를 들어, 제1 폴리펩티드) 또는 제1 성분으로부터의 정보가 상이한 제2 성분(예를 들어, 제1 폴리펩티드와 상이한 제2 폴리펩티드)를 단리하거나 파생하거나 제조하기 위해 사용되는 과정을 의미한다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 용어 "핵산 시퀀스"는 디옥시리보뉴클레오티드 또는 리보뉴클레오티드 또는 이의 유사체를 포함하는 임의의 길이의 뉴클레오티드의 중합체 형태를 의미한다. 핵산 시퀀스는 메틸화 뉴클레오티드 및 뉴클레오티드 유사체와 같은 변형 뉴클레오티드를 포함할 수 있고, 비-뉴클레오티드 성분에 의해 중단될 수 있다. 존재하는 경우, 뉴클레오티드 구조에 대한 변형은 중합체의 조립 이전 또는 이후에 부여될 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 용어 "플라스미드"는 추가의(외래의) DNA를 쉽게 수용할 수 있고 적합한 숙주 세포 내로 도입될 수 있는, 일반적으로 박테리아 기원의 이중-가닥 DNA의 자족형 분자(self-contained molecule)를 의미한다. 플라스미드 벡터는 종종 암호화 DNA(coding DNA) 및 프로모터 DNA(promoter DNA)를 포함하고 외래 DNA(foreign DNA)를 삽입하기에 적합한 하나 이상의 제한 부위를 갖는다. 프로모터 DNA 및 암호화 DNA는 동일한 유전자로부터 또는 상이한 유전자로부터 나올 수 있으며, 동일하거나 상이한 유기체로부터 나올 수 있다. 전형적으로, 플라스미드는 원하는 길이, 적합하게는 적어도 약 5 kb, 바람직하게는 적어도 약 10 kb, 보다 바람직하게는 적어도 약 20 또는 30 kb, 보다 더 바람직하게는 적어도 약 40 또는 50 kb의 크기를 갖는다. 플라스미드의 크기 상한은 원하는 바 대로 선택될 수 있고, 적합하게는 약 300 kb, 바람직하게는 약 350 또는 400 kb이다. 일부 구현예에서, 크기 상한은 450 또는 500 kb와 같이보다 더 높다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 용어 "접합(conjugation)"은 세포들 간의 직접적인 접촉을 통해 하나의 원핵 세포로부터 다른 원핵 세포로의 핵산의 직접적인 전달을 의미한다. 접합 후 전달된 DNA를 운반하는 세포는 "외부접합체(exoconjugant)", "접합완료체(exconjugant)" 또는 "트랜스접합체(transconjugant)"로 칭해진다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 용어 "원핵 F 인자 분할 시스템(prokaryotic F factor partitioning system)"은 세포 분열에서 딸 F 인자(daughter F factors)의 적절한 분리 및 충실한 분포를 보장하는 능동적 위치 결정 과정을 의미한다. 이러한 분할 시스템은 3개의 기능적으로 구별되는 영역들을 포함하고: 이들 중 2개(sopA 및 sopB)는 트랜스(trans)에서 작용하는 유전자 산물을 암호화하는 반면, 제3 영역(sopC)은 시스(cis)에서 기능한다. 본 명세서에서 사용되는 바와 같이, "F 인자" 또는 "원핵 F 인자"는 원핵생물에서 발견되는 성 인자(fertility factor)를 의미한다. 이는 박테리아가 다른 박테리아와의 접합을 매개할 수 있는 에피솜 DNA(episomal DNA)의 약 100 Kb 조각이다. F 인자 "분할 시스템"은 딸 세포들 2개 모두가 부모 플라스미드의 하나의 사본을 물려받는다는 것을 보장하는 시스템을 의미한다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 용어 "공여체 박테리아 세포(donor bacterial cell)"는 수신체 박테리아 세포 내로 전달되도록 의도되는 접합 플라스미드를 포함하는 박테리아 세포를 의미한다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 용어 "수신체 박테리아 세포(recipient bacterial cell)"는 공여체 박테리아 세포의 접합 플라스미드를 최종적으로 수신하는 박테리아 세포를 의미한다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 용어 "프로바이오틱(probiotic)"은 충분한 양으로 통합되는 경우, 전통적인 영양 효과를 넘어서 건강, 편안함 및 웰니스(wellness)에 긍정적인 효과를 발휘하는 살아있는 미생물을 의미한다. 프로바이오틱 미생물은 "적정량으로 투여되는 경우 숙주에 건강상의 이점을 부여하는 살아있는 미생물"로 정의되었다(FAO/WHO 2001).
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 용어 "생존 프로바이오틱 세포(viable probiotic cell)"는 대사적으로 활성이고 대상체의 위장관에 집락할 수 있는 미생물을 의미한다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 용어 "재조합 플라스미드(recombinant plasmid)" 또는 "합성 플라스미드(synthetic plasmid)"는 분자 생물학 프로토콜을 사용하여 천연의 상이한 유기체들로부터 수득된 핵산 시퀀스들을 조합하는 인위적으로 구성된 플라스미드를 의미한다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 용어 "접합 플라스미드(conjugative plasmid)"는 세포들 간의 직접적인 접촉을 통해 하나의 공여체 박테리아 세포에서 하나의 수신체 박테리아 세포로 직접적으로 전달되는 플라스미드를 의미한다. 제한된 종들 내에서(협폭 숙주 범위) 또는 많은 종들 사이에서(광폭 숙주 범위) 관련 유전자를 전달할 수 있는 다수의 천연적으로 발생하는 접합 플라스미드들이 공지되어 있다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 용어 "표적-항균-플라스미드(Targeted-Antibacterial-Plasmid)" 또는 "TAP"는 세포 내에서 DNA 복제의 자율적인 단위로 기능하는, 즉 그 자체의 제어 하에서 복제를 할 수 있고 i) 복제 기원, ii) 전달 기원, iii) 뉴클레아제를 암호화하는 핵산 시퀀스 및 iv) 가이드 RNA 분자를 암호화하는 하나 이상의 핵산 시퀀스를 포함하는 합성 접합 플라스미드를 의미한다. 본 발명에 따르면 본 발명의 표적-항균-플라스미드는 수신체 박테리아 세포를 표적하여 세포의 표현형을 변형하고/하거나 세포를 살상한다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 용어 "사본 수(copy number)"는 박테리아 세포 내의 플라스미드의 수이다. 이는 공여체 박테리아 세포에 존재하는 재조합 발현 구조물의 특성을 세포 당 단일 사본 이상으로 기술하는 것으로 이해될 수 있다. 대부분의 플라스미드는 플라스미드/염색체 분자의 비율을 기술하는 용어 "복수의 사본 수", "낮은 사본 수" 또는 "높은 사본 수"들로 분류된다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 용어 "복제 기원(origin of replication)" 또는 " oriV "는 플라스미드의 복제에 필요한 뉴클레오티드의 영역을 포함하는 것으로 의도된다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 용어 "범위(range)" 또는 "숙주 범위(host range)"는 일반적으로 특정 플라스미드(천연 또는 재조합)가 복제할 수 있는 상이한 박테리아 종의 수 및 다양성 둘 모두의 매개변수를 의미한다. 이들 2가지 매개변수들 중, 당해 기술분야에서 통상의 기술자는 일반적으로 숙주 범위를 보다 많이 정의하는 유기체의 다양성을 일반적으로 숙주 범위를 보다 더 정의하는 것으로 간주할 것이다. 예를 들어, 플라스미드가 하나의 군, 예를 들어, 엔테로박테리아과(Enterobacteriaceae)의 많은 종에서 복제하는 경우, 이는 협폭의 숙주 범위인 것으로 고려될 수 있다. 비교에 의해, 플라스미드가 단지 몇몇 종에서만 복제하나, 이들 종들이 계통발생학적으로 다양한 군들에서 나오는 것으로 보고되는 경우, 그 플라스미드는 광폭 숙주 범위로 고려될 수 있다. 본 명세서에서 논의되는 바와 같이 두 유형의 플라스미드는 본 발명에서 유용성을 찾을 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 용어 "전달의 기원(origin of transfer)" 또는 " oriT "는 하나의 공여체 세포로부터 숙주로의 플라스미드의 전달을 허용하는 데 필요한 뉴클레오티드의 영역을 포함하는 것으로 의도된다. 전달 기원은 전달 과정이 개시되는 벡터 상의 부위를 나타낸다. 이는 또한 유전학적으로 전달되어야 할 DNA에 대해 시스에서 요구되는 영역으로 정의된다. 접합-특이적 DNA 복제는 플라스미드 전달 인자를 또한 암호화하는 oriT 영역 내에서 개시된다. 전형적으로, oriT는 길이가 대략 40 내지 500 bp이고 DNA 전달에 관련되는 단백질을 결합하는 고유의 굽힘 및 직접적이고 역전된 반복을 포함한다. oriT는 3개의 기능적으로 정의된 도메인들: 절단 도메인(nicking domain), 전달 도메인(transfer domain) 및 종결 도메인(termination domain)으로 이루어진다. 가닥-특이적 및 서열-특이적 절단 부위인 nic 부위 자체는 이완효소(relaxase)에 의해 절단되고 재결합된다. 대부분의 경우에서, 이완효소는 이완효소를 nic 부위로 향하게 하고 반응의 특이성을 보장하는 보조 단백질을 필요로 한다. 지금까지 확인된 nic 부위의 시퀀스는 IncF, IncP와 IncQ 그리고 pMV158와 같은 특정한 그램-양성 플라스미드로 대표되는 4개의 가능한 시퀀스들을 나타낸다. 게다가, 일반적으로 DNA에서 고차 구조(higher-order structure)를 형성하는 oriT 내의 다수의 부위들을 결합하는 단백질이 존재하며, 이는 과정에 필수적이다. 이러한 단백질은 또한 릴렉소좀(relaxosome)을 수송 조직(transport machinery)에 고정시키는 기능을 갖는 것으로 보인다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 용어 "뉴클레아제(nuclease)"는 핵산 시퀀스에 절단, 예를 들어, 이중-가닥 DNA 시퀀스에서 단일 가닥 또는 이중 가닥 절단을 유도하는 단백질(즉 효소)을 포함한다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 용어 "CRISPR/Cas 뉴클레아제(CRISPR/Cas nuclease)"는 당해 기술분야에서 그의 일반적인 의미를 가지며 뭉쳐서 주기적으로 간격을 띠는 짧은 회문구조 반복(CRISPR) 및 Cas 유전자에 의해 암호화된 관련 뉴클레아제를 포함하는 원핵생물 DNA의 단편을 의미한다. 박테리아에서 CRISPR/Cas 유전자좌는 이동성 유전 인자(바이러스, 전위 인자(transposable elements) 및 접합 플라스미드)에 대한 RNA-가이드 적응 면역계를 암호화한다. 3가지 유형의 CRISPR 시스템이 확인되었다. CRISPR 클러스터는 선행의 이동인자에 상보적인 시퀀스인 스페이서를 포함한다. CRISPR 클러스터는 성숙한 CRISPR(Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats) RNA(crRNA)로 전사 및 프로세싱된다. CRISPR/Cas 뉴클레아제 Cas9 및 Cpf1은 II형 및 V형 CRISPR/Cas 시스템에 속하며 표적 DNA를 절단하는 강력한 엔도뉴클레아제(endonuclease) 활성을 갖는다. Cas9는 약 20개의 뉴클레오티드의 독특한 표적 시퀀스(스페이서라고 함) 및 또한 전구-crRNA의 리보뉴클레아제 III-보조 프로세싱을 위한 가이드 역할을 하는 트랜스-활성화 작은 RNA(tracrRNA: trans-activating small RNA)를 포함하는 성숙한 crRNA에 의해 가이드된다. crRNA:tracrRNA 듀플렉스는 crRNA 상의 스페이서와 표적 DNA 상의 상보적인 시퀀스(프로토스페이서(protospacer)라고 함) 사이의 상보적인 염기 대합(base pairing)을 통해 Cas9을 표적 DNA로 유도한다. Cas9는 트리뉴클레오티드(스트렙토코쿠스 피요게네스(S. Pyogenes) Cass9에 대해서는 NGG) 프로토스페이서 인접 모티프(PAM: protospacer adjacent motif)를 인식하여 절단 부위(PAM으로부터 상류로 세번째 및 네번째 뉴클레오티드)를 특정한다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 용어 "Cas9" 또는 "Cas9 뉴클레아제(Cas9 nuclease)"는 Cas9 단백질 또는 그의 단편(예를 들어, Cas9의 활성 또는 비활성 DNA 절단 도메인(DNA cleavage domain) 및/또는 Cas9의 gRNA 결합 도메인을 포함하는 단백질)을 포함하는 RNA-가이드 뉴클레아제를 의미한다. Cas9 뉴클레아제는 또한 종종 casn1 뉴클레아제 또는 CRISPR(뭉쳐서 주기적으로 간격을 띠는 짧은 회문구조 반복)-관련 뉴클레아제로도 언급된다. CRISPR은 이동성 유전 인자(바이러스, 전위 인자 및 접합 플라스미드)에 대한 보호를 제공하는 적응 면역계이다. CRISPR 클러스터는 선행의 이동인자에 상보적인 시퀀스인 스페이서 및 표적 침입 핵산을 포함한다. CRISPR 클러스터는 CRISPR RNA(crRNA)로 전사되고 프로세싱된다. II형 CRISPR 시스템에서 전구-crRNA를 정확하게 프로세싱하기 위해서는 트랜스-암호화된 작은 RNA(tracrRNA), 내인성 리보뉴클레아제 3 (rnc) 및 Cas9 단백질이 필요하다. tracrRNA는 전구-crRNA의 리보뉴클레아제 3-보조 프로세싱에 대한 가이드로서 제공된다. 후속하여, Cas9/crRNA/tracrRNA는 스페이서에 상보적인 선형 또는 환형 dsDNA 표적을 엔도뉴클레오분해적으로(endonucleolytically) 절단한다. crRNA에 대해 상보적이지 않은 표적 가닥이 먼저 엔도뉴클레오분해적으로 절단되고, 계속해서 3'-5' 엑소뉴클레오분해적으로(exonucleolytically) 트리밍한다. 사실상, DNA-결합 및 절단은 전형적으로 단백질 및 두 RNA들을 필요로 한다. 그러나, 단일 가이드 RNA("sgRNA" 또는 간단히 "gRNA")는 crRNA 및 tracrRNA 둘 모두의 양태들이 단일 RNA 종 내로 통합되도록 조작될 수 있다. 예를 들어, 전체 내용이 본 명세서에 참조로 통합되는 Jinek M., Chylinski K., Fonfara I., Hauer M., Doudna J. A., Charpentier E. Science 337:816-821(2012) 참조. Cas9는 CRISPR 반복 시퀀스 내의 짧은 모티프(PAM 또는 프로토스페이서 인접 모티프)를 인식하여 자기 대 비-자기를 구별하는 데 도움을 준다. Cas9 뉴클레아제 시퀀스 및 구조는 당해 기술분야에서 통상의 기술자에게 충분히 공지되어 있다(예를 들어, 각각의 전체 내용이 본 명세서에 참조로 통합되는 "Complete genome sequence of an M1 strain of Streptococcus pyogenes." Ferretti et al., J. J., McShan W. M., Ajdic D. J., Savic D. J., Savic G., Lyon K., Primeaux C., Sezate S., Suvorov A. N., Kenton S., Lai H. S., Lin S. P., Qian Y., Jia H. G., Najar F. Z., Ren Q., Zhu H., Song L., White J., Yuan X., Clifton S. W., Roe B. A., McLaughlin R. E., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 98:4658-4663(2001); "CRISPR RNA maturation by trans-encoded small RNA and host factor RNase III." Deltcheva E., Chylinski K., Sharma C. M., Gonzales K., Chao Y., Pirzada Z. A., Eckert M. R., Vogel J., Charpentier E., Nature 471:602-607(2011); 및 "A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity." Jinek M., Chylinski K., Fonfara I., Hauer M., Doudna J. A., Charpentier E. Science 337:816-821(2012) 참조). Cas9 동원체(orthologs)는 스트렙토코쿠스 피요게네스 및 스트렙토코쿠스 써모필루스(S. thermophilus)를 포함하나, 이들로 제한되지 않는 여러 종들에서 기술되었다. 부가의 적합한 Cas9 뉴클레아제 및 시퀀스는 본 개시내용에 기초하여 당해 기술분야에서 통상의 기술자에게 명백할 것이며, 이러한 Cas9 뉴클레아제 및 시퀀스는 전체 내용이 본 명세서에 참조로 통합되는 Chylinski, Rhun, and Charpentier, "The tracrRNA and Cas9 families of type II CRISPR-Cas immunity systems" (2013) RNA Biology 10:5, 726-737에 기술된 유기체 및 위치로부터의 Cas9 시퀀스를 포함한다. 일부 구현예에서, 용어 "Cas9"는 하기로부터의 Cas9을 의미한다: 코리네박테리움 울서란스(Corynebacterium ulcerans)(NCBI Refs: NC_015683.1, NC_017317.1); 코리네박테리움 디프테리아(Corynebacterium diphtheria)(NCBI Refs: NC_016782.1, NC_016786.1); 스피로플라스마 시르피디콜라(Spiroplasma syrphidicola)(NCBI Ref: NC_021284.1); 프레보텔라 인터메디아(Prevotella intermedia)(NCBI Ref: NC_017861.1); 스피로플라스마 타이와넨세(Spiroplasma taiwanense)(NCBI Ref: NC_021846.1); 스트렙토코쿠스 이니아에(Streptococcus iniae)(NCBI Ref: NC_021314.1); 벨리엘라 발티카(Belliella baltica)(NCBI Ref: NC_018010.1); 사이크로플렉서스 토르퀴스(Psychroflexus torquisI)(NCBI Ref: NC_018721.1); 스트렙토코쿠스 써모필루스(Streptococcus thermophilus)(NCBI Ref: YP_820832.1); 리스테리아 인노쿠아(Listeria innocua)(NCBI Ref: NP_472073.1); 캄필로박터 제주니(Campylobacter jejuni)(NCBI Ref: YP_002344900.1); 또는 나이세리아 메닌지티디스(Neisseria. meningitidis)(NCBI Ref: YP_002342100.1).
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 용어 "결함 CRISPR/Cas 뉴클레아제(defective CRISPR/Cas nuclease)" 또는 "CRISPR/dCas9"는 적어도 하나의 뉴클레아제 도메인이 손실된 CRISPR/Cas 뉴클레아제를 의미한다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 용어 "가이드 RNA 분자(guide RNA molecule)"는 일반적으로 CRISPR 단백질에 결합하고 CRISPR 단백질을 표적 DNA 분자 내의 특정 위치로 표적할 수 있는 RNA 분자(또는 집합적으로 RNA 분자의 군)를 의미한다. 가이드 RNA는 2개의 세그먼트: DNA-표적화 가이드 세그먼트 및 단백질-결합 세그먼트를 포함할 수 있다. DNA-표적화 세그먼트는 표적 시퀀스와 상보적인(또는 적어도 엄격한 조건 하에서 하이브리드화할 수 있는) 뉴클레오티드 시퀀스를 포함한다. 단백질-결합 세그먼트는 Cas9 또는 Cas9 연관 폴리펩티드와 같은 CRISPR 단백질과 상호작용한다. 이들 두 세그먼트들은 동일한 RNA 분자 내에 또는 둘 이상의 분리된 RNA 분자들 내에 위치될 수 있다. 두 세그먼트들이 분리된 RNA 분자들 내에 존재하는 경우, DNA-표적화 가이드 세그먼트를 포함하는 분자는 CRISPR RNA("crRNA")로 언급되는 반면, 단백질-결합 세그먼트를 포함하는 분자는 트랜스-활성화 RNA("tracrRNA")로 언급된다. 전형적으로 crRNA는 적어도 하나의 스페이서 시퀀스 및 스페이서 시퀀스의 5' 말단에 연결된 적어도 하나의 반복 시퀀스 또는 그의 일부를 포함한다. 본 발명의 crRNA의 설계는 crRNA가 사용될 CRISPR-Cas 시스템에 따라 달라질 수 있다. 본 발명의 crRNA는 인간에 의해 만들어졌으며 자연에서 발견되지 않는 합성된 것이다. 전형적으로, crRNA는, 5'에서 3'로, 반복 시퀀스(전장 또는 그의 일부("손잡이(handle)"), 스페이서 시퀀스 및 반복 시퀀스(전장 또는 그의 일부)를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, crRNA는, 5'에서 3'로, 반복 시퀀스(전장 또는 그의 일부("손잡이") 및 스페이서 시퀀스를 포함할 수 있다. tracr 핵산은 5'에서 3'로 팽대부(bulge), 넥서스 헤어핀(nexus hairpin) 및 말단 헤어핀(terminal hairpins)을, 임의선택적으로, 5' 말단에 상부 스템(upper stem)을 포함한다(Briner et al. (2014) Molecular Cell. 56(2):333-339 참조). tracrRNA는 성숙 또는 미성숙 crRNA의 반복 부분에 하이브리드화하는 기능을 하며, Cas9 단백질을 표적 부위로 모집하고, 구조 재배열을 유도함으로써 Cas9의 촉매 활성을 조장할 수 있다. tracrRNA에 대한 시퀀스는 CRISPR-Cas II형 시스템에 특이적이며 가변적일 수 있다. 파스미드(phasmid)가 II형 crRNA에 더해 이종의 II형 CRISPR-Cas 시스템을 포함하도록 조작되는 경우, 공지된 또는 나중에 동정된 임의의 tracr 핵산이 사용될 수 있다. 일부 구현예에서, tracr 핵산이 본 발명의 crRNA에 융합되어 단일 가이드 핵산을 형성한다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 용어 "표적 핵산 시퀀스(target nucleic acid sequence)", "표적 시퀀스(target sequence)" 또는 "표적 영역(target region)"은, 본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 본 명세서에서 기술되는 바와 같은 CRISPR 시스템을 사용하여 결합하기를 원하는 특정한 시퀀스 또는 이의 상보체를 의미한다. 보다 구체적으로 "표적 핵산 가닥(target nucleic acid strand)"은 본 명세서에서 기술되는 바와 같은 가이드 RNA와 염기-대합에 적용되는 표적 핵산의 하나의 가닥을 의미한다. 즉, crRNA 및 가이드 시퀀스와 하이브리드화하는 표적 핵산의 가닥은 "표적 핵산 가닥"으로 언급된다. 가이드 시퀀스에 상보적이지 않은 표적 핵산의 다른 가닥은 "비-상보적 가닥(non-complementary strand)"으로 언급된다. 이중-가닥 표적 핵산(예를 들어, DNA)의 경우, 각 가닥은 crRNA 및 가이드 RNA를 설계하고 적합한 PAM 부위가 존재하는 한 본 발명의 방법을 실시하는데 사용되는 "표적 핵산 가닥"일 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 용어 "이중 가닥 절단(double strand break)" 또는 "DSB"는 핵산 분자, 예를 들어 DNA 분자에서의 2개의 절단: 핵산 분자의 제1 가닥에서의 첫 번째 절단 및 핵산 분자의 제2 가닥에서의 두 번째 절단을 의미한다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 용어 "프로모터(promoter)"는 세포에서 핵산의 전사를 매개하는 DNA 시퀀스를 포함하는 것으로 의도된다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 용어 "구성 프로모터(constitutive promoter)"는 임의의 활성화 생물 또는 비생물적 조절 인자의 부재 중에서 유전자 발현을 허용하는 활성의 영구적인 상태에 있는 프로모터를 기술하는 데 사용된다. 이러한 용어들의 의미는 "강한 구성 프로모터(strong constitutive promoters)" 및 "약한 구성 프로모터(weak constitutive promoters)"로 당해 기술분야에서 통상의 기술자에게 충분히 공지되어 있다. 그럼에도 불구하고, 본 명세서에서 정의되는 바와 같은 용어 "약한 구성 프로모터"는 강한 구성 프로모터보다 10배 이하인 발현 수준을 갖는 프로모터를 의미한다. 예를 들어, 유비퀴틴 프로모터(ubiquitin promoter)(그의 제1 인트론을 수반)는 일반적으로 강한 구성 프로모터인 것으로 공지되어 있고, 또한 제1 인트론의 결손은 프로모터의 발현을 10배 약화시켜 약한 구성 프로모터가 되는 것으로 공지되어 있다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 용어 "작동가능하게 연결된(operatively linked)"은 연결의 위치와 근접성이 결합된 복제를 보장하고 트랜스-작용 전사 인자(trans-acting transcription factors) 및 다른 세포 인자에 인식되기에 충분하고 적절하고 그에 의해 폴리펩티드-암호화 핵산이 적절한 조건 하에서 효율적으로 발현되는 핵산들 간의 연결을 기술하는 것으로 의도된다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 용어 "상보성(complementarity)"은 전통적인 Watson-Crick 염기-대합 또는 다른 비-전통적인 유형들에 의해 다른 핵산 시퀀스와 수소 결합(들)을 형성하는 핵산의 능력을 의미한다. 상보성 백분율은 제2 핵산 시퀀스와 수소 결합(예를 들어, Watson-Crick 염기 대합)을 형성할 수 있는 핵산 분자 중의 잔기들의 백분율(예를 들어, 10개 중의 5, 6, 7, 8, 9, 10개는 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 및 100% 상보적임)을 나타낸다. "완전히 상보적인(perfectly complementary)"은 핵산 시퀀스의 인접 잔기들 전부가 제2 핵산 시퀀스 중의 동일한 수의 인접 잔기들과 수소 결합을 할 것이라는 것을 의미한다. 본 명세서에서 사용되는 바와 같은 "실질적으로 상보적인(substantially complementary)"은 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 30, 35, 40, 45, 50 또는 그 이상의 뉴클레오티드들의 영역에 걸쳐 적어도 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, 99% 또는 100%인 상보성의 정도를 의미하거나 엄격한 조건 하에서 하이브리드화하는 2개의 핵산들을 의미한다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 용어 "제한 효소(restriction enzyme)"는 박테리아에 의해 생산된, 특정 염기 시퀀스에서 내부적으로 DNA의 분자를 절단하는 임의의 효소의 군을 의미하는 것으로 이해될 수 있다. 제한 효소의 예는 하기들을 포함할 수 있다: BspEI; SpaI, BglII; NsiI; NotI; SacI; SpeI; 및 AlwNI.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 용어 "제한 부위(restriction site)"는 제한 효소에 의해 인식되는 DNA 분자 중의 염기의 시퀀스를 의미하는 것으로 이해될 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 용어 "복제(cloning)"는 DNA 분자를 플라스미드 내로 결합하는 과정을 의미한다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "선택(selecting)"은 (본 발명의 플라스미드와 같은) 관심 대상의 플라스미드를 포함하는 공여체 세포 또는 수신체 박테리아 세포와 같은 세포의 동정 및 단리를 의미한다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 용어 "선택 마커 유전자(selection marker gene)"는 유전자를 포함하는 세포에 표현형을 제공하여 양성이든 음성이든 표현형이 선택 마커 유전자를 포함하는 세포의 선택을 허용하도록 하는 폴리펩티드를 암호화하는 유전자를 의미한다. 선택 마커 유전자는 형질전환된 세포와 비-형질전환된 세포를 구별하기 위해 사용될 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 용어 "약(about)"은 주어진 값의 20%, 바람직하게는 10%, 보다 바람직하게는 7%, 보다 더 바람직하게는 3%의 편차를 정의한다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 용어 "항생제(antibiotic)"는 미생물에 의해 생산되고 다른 미생물의 성장에 길항하는 전통적인 항생제를 의미하고 또한 보다 일반적으로 천연적으로 발생하는 항생제의 화학적으로 합성된 버전과 변종을 포함하여 미생물을 살상하거나 미생물의 성장을 억제할 수 있는 항균제를 포함한다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 용어 "카바페넴(carbapenem)"은 β-락탐 구조의 위치 1의 황 원자가 탄소 원자로 치환되고, 불포화가 도입되고, 따라서 대부분의 β-락타마아제(β-lactamases)에 내성을 부여하는 분자 구조를 갖는 β-락탐 항생제의 부류를 의미하며, 이들은 광폭 스펙트럼의 항균 활성을 가지고 있다. 대부분의 박테리아 β-락타마아제에 대한 내성을 고려할 때, 카바페넴은 대장균(E. coli) 및 클렙시엘라 뉴모니아(Klebsiella pneumoniae)와 같은 많은 박테리아 감염에 대한 마지막 수단의 항생제 중의 하나이다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 용어 "항생제 내성 유전자(antibiotic resistance gene)"는 항생제 내성을 부여하는 생성물을 암호화하거나 기능성 RNA를 전사하는 유전자를 포함한다. 예를 들어, 항생제 내성 유전자는 위에서 기술된 4가지 저항 메카니즘들 중의 임의의 것에 기여하는 유전자 또는 그의 암호화 부분일 수 있다. 항생제 내성 유전자는 예를 들어 (1) 항생제를 분해하는 효소, (2) 항생제를 개질하는 효소, (3) 배출 펌프(efflux pump)와 같은 펌프 또는 (4) 항생제의 영향을 억제하는 돌연변이된 표적을 암호화할 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 용어 "식품(food)"은 액체(즉 음료), 고체 또는 반-고체 음식 조성물, 특히 총 식품 조성물(대체식)을 의미하며, 이는 추가의 영양 섭취 또는 식품 보충 조성물을 필요로 하지 않는다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 용어 "환자(patient)" 또는 "대상체(subject)"는 인간 또는 동물(임상 효능을 위한 모델로서 특히 유용한 동물)을 의미한다. 일부 구현예에서, 대상체는 박테리아 감염에 민감한 인간 또는 임의의 다른 동물(예를 들어, 조류 및 포유동물)(예를 들어 고양이, 개 등과 같은 가축; 말, 소, 돼지, 닭 등과 같은 축산 및 농장 동물)일 수 있다. 전형적으로 상기 대상체는 비-영장류(예를 들어, 낙타, 당나귀, 얼룩말, 소, 돼지, 말, 염소, 양, 고양이, 개, 랫트 및 마우스) 및 영장류(예를 들어, 원숭이, 침팬지 및 인간)를 포함하는 포유동물이다. 일부 구현예에서, 대상체는 비-인간 동물이다. 일부 구현예에서, 대상체는 농장 동물 또는 애완동물이다. 일부 구현예에서, 대상체는 인간이다. 일부 구현예에서, 대상체는 인간 유아이다. 일부 구현예에서, 대상체는 인간 어린아이이다. 일부 구현예에서, 대상체는 인간 성인이다. 일부 구현예에서, 대상체는 노인이다. 일부 구현예에서, 대상체는 인간 미숙아이다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 용어 "치료(treatment)" "치료하다(treat)"는 앓거나 질환 또는 의학적 상태로 고통받는 것으로 진단된 환자 뿐만 아니라 질환을 앓을 위험에 있거나 질환을 앓는 것으로 의심되는 환자의 치료를 포함하여 치유 또는 질환 변경 처리와 마찬가지로 예방 또는 예방적 처치 둘 모두를 의미하며, 임상적 재발의 억제를 포함한다. 치료는 의학적 장애를 앓거나 궁극적으로 장애를 획득할 수 있는 환자에 적용되어 장애 또는 재발하는 장애의 하나 이상의 증상을 방지하거나, 치료하거나, 발병을 지연시키거나, 중증도를 감소시키거나, 개선하거나 또는 이러한 치료가 부재일 때 예상되는 것 이상의 환자의 생존을 연장하도록 할 수 있다. "치료 요법(therapeutic regimen)"에 대해서는 이는 병의 치료의 패턴, 예를 들어, 치료 동안 사용되는 투여량(dosing)의 패턴을 의미한다. 치료 요법은 유도 요법 및 유지 요법을 포함할 수 있다. 문구 "유도 요법(induction regimen)" 또는 "유도 기간(induction period)"은 질환의 초기 치료에 사용되는 치료 요법(또는 치료 요법의 일부)를 의미한다. 유도 요법의 일반적인 목적은 치료 요법의 초기 기간 동안 환자에게 높은 수준의 약물을 제공하는 것이다. 유도 요법은 (부분적으로 또는 전체적으로) "부하 요법(loading regimen)"을 이용할 수 있으며, 이는 의사가 유지 요법 동안 이용할 수 있는 것 보다 더 많은 투여량의 약물을 투여하는 것, 의사가 유지 요법 동안 약물을 투여하는 것 보다 더 빈번하게 약물을 투여하는 것 또는 둘 모두를 포함할 수 있다. 문구 "유지 요법(maintenance regimen)" 또는 "유지 기간(maintenance period)"은 예를 들어, 장기간(수 개월 또는 수 년) 동안 환자가 차도를 보이도록 병의 치료 동안 환자의 유지를 위해 사용되는 치료 요법(또는 치료 요법의 일부)을 의미한다. 유지 요법은 지속 요법(continuous therapy)(예를 들어, 규칙적인 간격, 예를 들어, 매주, 매월, 매년 등에서 약물을 투여) 또는 간헐 요법(intermittent therapy)(예를 들어, 단속적인 치료(interrupted treatment), 간헐 치료(intermittent treatment), 재발 시 치료(treatment at relapse) 또는 특별히 예정된 기준[예를 들어, 통증, 질환 발현 등]의 달성에 의한 치료)을 이용할 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 용어 "치료학적 유효량(therapeutically effective amount)"은 치료 및/또는 유익한 효과일 수 있는 원하는 효과를 생성하기에 충분한 공여체 박테리아 세포의 양을 의미한다. 유효량은 연령, 대상체의 일반적인 상태, 치료되는 상태의 중증도, 투여되는 특정 물질, 치료의 지속기간, 임의의 동시 치료의 속성, 사용되는 약제학적으로 수용가능한 담체 및 당해 기술분야에서 통상의 기술자의 지식과 경험 이내의 유사한 요소들에 따라 달라질 수 있다. 적절한 경우, 임의의 개별적인 경우에서 "유효량"은 관련 텍스트 및 문헌을 참조하여 그리고/또는 통상적인 실험을 사용하여 당해 기술분야에서 통상의 기술자에 의해 결정될 수 있다. 일부 구현예에서, 숙주 박테리아 및/또는 그의 조성물의 유효량은 약 105 내지 약 1010 콜로니 형성 단위(CFU: colony forming units)일 수 있다. 일부 구현예에서, 유효량은 박테리아 수용 세포 부하(bacterial recipient cell load)를 약 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 및 그 안의 임의의 값 또는 범위로 감소시키는 양일 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 용어 "약제학적 조성물(pharmaceutical composition)"은 담체 및/또는 부형제와 같은 다른 물질과 함께 본 명세서에서 기술되는 조성물 또는 그의 약제학적으로 수용가능한 염을 의미한다. 함께 제공되는 바와 같은 약제학적 조성물은 전형적으로 약제학적으로 수용가능한 담체를 포함한다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 용어 "약제학적으로 수용가능한 담체(pharmaceutically acceptable carrier)"는 원하는 특정한 투여 형태에 적합하도록 임의의 그리고 모든 용매, 희석제 또는 다른 액체 비히클, 분산 보조제 또는 현탁 보조제, 표면활성화제, 등장제, 증점제 또는 에멀젼화제, 보존제, 고체 결합제, 윤활제 등을 포함한다. Remington's Pharmaceutical-Sciences, Sixteenth Edition, E. W. Martin (Mack Publishing Co., Easton, Pa., 1980)에는 약제학적 조성물을 제형화하는 데 사용되는 여러 담체들 및 약제학적 조성물을 제조하기 위한 공지된 기술들이 개시되어 있다.
표적-항균 플라스미드
본 발명의 제1 목적은 i) 복제 기원, ii) 전달 기원, iii) 뉴클레아제를 암호화하는 유전학적으로-조작된 핵산 시퀀스 및 iv) 가이드 RNA 분자를 암호화하는 하나 이상의 유전학적으로-조작된 핵산 시퀀스(들)를 포함하는 표적-항균-플라스미드(TAP)에 관한 것이다.
i) 복제 기원
일부 구현예에서, 복제 기원은 전형적으로 숙주 특이적이고 플라스미드의 숙주 범위를 지배한다. 복제 기원이 수득될 수 있는 광범위한("무차별적인") 플라스미드의 예에는 하기들이 포함되나, 이들로 제한되는 것은 아니다: R6K, RK2, p15A and RSF1010. 예를 들어 본 발명의 플라스미드는 모든 그람 음성 박테리아에서 기능할 수 있고 특히 아세토박터(Acetobacter), 아시네토박터(Acinetobacter), 아에로모나스(Aeromonas), 아그로박테리움(Agrobacterium), 알칼리게네스(Alcaligenes), 아나바에나(Anabaena), 아조라이조비움(Azorizobium), 바르토넬라(Bartonella), 보르데텔라(Bordetella), 브루셀라(Brucella), 버크홀데리아(Burkholderia), 캄필로박터(Campylobacter), 카울로박터(Caulobacter), 크로마티움(Chromatium), 코마모나스(Comamonas), 사이토파가(Cytophaga), 데이노코쿠스(Deinococcus), 에르위니아(Erwinia), 에리트로박터(Erythrobacter), 에쉐리키아(Escherichia), 플라보박테리움(Flavobacterium), 하이포미크로비움(Hyphomicrobium), 클렙시엘라(Klebsiella), 메타노박테리움(Methanobacterium), 메틸박테리움(Methylbacterium), 메틸로바실러스(Methylobacillus), 메틸로박터(Methylobacter), 메틸로박테리움(Methylobacterium), 메틸로코쿠스(Methylococcus), 메틸로시스티스(Methylocystis), 메틸로마이크로비움(Methylomicrobium), 메틸로모나스(Methylomonas), 메틸로필루스(Methylophilus), 메틸로시누스(Methylosinus), 믹소코쿠스(Myxococcus), 판토에아(Pantoea), 파라코쿠스(Paracoccus), 슈도모나스(Pseudomonas), 라이조비움(Rhizobium), 로도박터(Rhodobacter), 살모넬라(Salmonella), 시겔라(Shigella), 스핑고모나스(Sphingomonas) 및 비브리오(Vibrio) 속들에서 유용할 것으로 예상된다.
일부 구현예에서, 복제 기원은 Clontech Laboratories Inc.(Palo Alto, Calif.)에 의해 판매되는 pEBFP-N1, pECFP-N1, pEGFP-N1, pEGFP-N2, pEGFP-N3, pEYFP-N1, pEBEP-C1, pECFP-C1, pEGFP-C1, pEGFP-C2, pEGFP-C3, pEYFP-C1, pEGFP-F, pCMS-EGFP, pIIRES2-EGFP, pd2ECFP-N1, pd2EGFP-N1, pd2EYFP-N1 및 pd1EGFP-N1; Stratagene(La Jolla, Calif.)에 의해 판매되는 pCMV-Script, pCMV-Tag, pDual, pBK-CMV 및 pBK-RSV; 그리고 Promega Corporation(Madison, Wis.)에 의해 판매되는 pTARGET®, pCI 및 pCI-Neo 플라스미드들로 이루어지는 군으로부터 선택되는 하나의 플라스미드의 복제 기원(replication origin)이다.
일부 구현예에서, 복제 기원은 pBBR1 플라스미드의 복제 기원이다. 일부 구현예에서, 복제 기원은 시퀀스 동정 번호: 1의 핵산 시퀀스로 이루어진다.
시퀀스 동정 번호 :1 > oriV-pBBR1
gcttatctccatgcggtaggggtgccgcacggttgcggcaccatgcgcaatcagctgcaacttttcggcagcgcgacaacaattatgcgttgcgtaaaagtggcagtcaattacagattttctttaacctacgcaatgagctattgcggggggtgccgcaatgagctgttgcgtaccccccttttttaagttgttgatttttaagtctttcgcatttcgccctatatctagttctttggtgcccaaagaagggcacccctgcggggttcccccacgccttcggcgcggctccccctccggcaaaaagtggcccctccggggcttgttgatcgactgcgcggccttcggccttgcccaaggtggcgctgcccccttggaacccccgcactcgccgccgtgaggctcggggggcaggcgggcgggcttcgcccttcgactgcccccactcgcataggcttgggtcgttccaggcgcgtcaaggccaagccgctgcgcggtcgctgcgcgagccttgacccgccttccacttggtgtccaaccggcaagcgaagcgcgcaggccgcaggccggaggcttttccccagagaaaattaaaaaaattgatggggcaaggccgcaggccgcgcagttggagccggtgggtatgtggtcgaaggctgggtagccggtgggcaatccctgtggtcaagctcgtgggcaggcgcagcctgtccatcagcttgtccagcagggttgtccacgggccgagcgaagcgagccagccggtggccgc
ii) 전달 기원
일부 구현예에서, 전달 기원은 무차별 IncP 플라스미드 RP4 및 R751에서 파생된다. 일부 구현예에서, 전달 기원은 RP4 플라스미드의 oriT이다. 일부 구현예에서, 본 발명의 전달 기원은 시퀀스 동정 번호: 2의 핵산 시퀀스로 이루어진다.
시퀀스 동정 번호: 2 > oriT-RK2
gggcaggataggtgaagtaggcccacccgcgagcgggtgttccttcttcactgtcccttattcgcacctggcggtgctcaacgggaatcctgctctgcgaggctggccg
일부 구현예에서, 전달 기원은 공여체 박테리아 세포에 포함되는 접합성 F 플라스미드로부터 전달 단백질 Tra에 의해 플라스미드를 이동가능하게 하는 F 플라스미드의 oriTF이다. 일부 구현예에서, 본 발명의 전달 기원은 시퀀스 동정 번호: 3의 핵산 시퀀스로 이루어진다.
시퀀스 동정 번호: 3 oriT-F
aggctcaacaggttggtggttctcaccaccaaaagcaccacaccccacgcaaaaacaagtttttgctgatttttctttataaatagagtgttatgaaaaattagtttctcttactctctttatgatatttaaaaaagcggtgtcggcgcggctacaacaacgcgccgacaccgttttgtaggggtggtactgactatttttataaaaaacattattttatattaggggtgctgctagcggcgcggtgtgtttttttataggataccgctaggggcgctgctagcggtgcg
iii) 뉴클레아제
일부 구현예에서, 본 발명의 플라스미드는 CRISPR-연관 엔도뉴클레아제를 암호화한다. 다양한 CRISPR/Cas 뉴클레아제가 본 발명에서 사용될 수 있다. 적합한 CRISPR/CRISPR/Cas 뉴클레아제의 비-제한적인 예에는 Cas3, Cas4, Cas5, Cas5e(또는 CasD), Cas6, Cas6e, Cas6f, Cas7, Cas8a1, Cas8a2, Cas8b, Cas8c, Cas9, Cas10, Cas10d, CasF, CasG, CasH, Csy1, Csy2, Csy3, Cse1(또는 CasA), Cse2(또는 CasB), Cse3(또는 CasE), Cse4(또는 CasC), Csc1, Csc2, Csa5, Csn2, Csm2, Csm3, Csm4, Csm5, Csm6, Cmr1, Cmr3, Cmr4, Cmr5, Cmr6, Csb1, Csb2, Csb3, Csx17, Csx14, Csx10, Csx16, CsaX, Csx3, Csz1, Csx15, Csf1, Csf2, Csf3, Csf4 및 Cu1966이 포함된다. 예를 들어, 내용이 그 전체로 본 명세서에 참조로 통합되는 WO2014144761 WO2014144592, WO2013176772, US20140273226 및 US20140273233 참조.
일부 구현예에서, CRISPR/Cas 뉴클레아제는 Cas9 단백질에서 파생된다. Cas9 단백질은 그 중에서도 스트렙토코쿠스 피요게네스, 스트렙토코쿠스 써모필루스, 스트렙토코쿠스 종(Streptococcus sp.), 노카르디옵시스 다손빌레이(Nocardiopsis dassonvillei), 스트렙토마이세스 프리스티나에스피랄리스(Streptomyces pristinaespiralis), 스트렙토마이세스 비리도크로모게네스(Streptomyces viridochromogenes), 스트렙토스포란기움 로세움(Streptosporangium roseum), 알리사이클로바실러스 아시도칼다리우스(Alicyclobacillus acidocaldarius), 바실러스 슈도마이코이데스(Bacillus pseudomycoides), 바실러스 셀레니티레두선스(Bacillus selenitireducens), 엑시구오박테리움 시비리쿰(Exiguobacterium sibiricum), 락토바실러스 델브루엑키이(Lactobacillus delbrueckii), 락토바실러스 살리바리우스(Lactobacillus salivarius), 마이크로실라 마리나(Microscilla marina), 버크홀데리알레스 박테리움(Burkholderiales bacterium), 폴라로모나스 나프탈레니보란스(Polaromonas naphthalenivorans), 폴라로모나스 종(Polaromonas sp.), 크로코스파에라 왓소니이(Crocosphaera watsonii), 시아노테세 종(Cyanothece sp.), 마이크로시스티스 아에루기노사(Microcystis aeruginosa), 시네코쿠스 종(Synechococcus sp.), 아세토할로비움 아라바티쿰(Acetohalobium arabaticum), 암모니펙스 데겐시이(Ammonifex degensii), 칼디셀루로시룹토르 벡시이(Caldicelulosiruptor becscii), 칸디다투스 데술포루디스(Candidatus Desulforudis), 클로스트리디움 보툴리눔(Clostridium botulinum), 클로스트리디움 디피실(Clostridium difficile), 파인골디아 마그나(Finegoldia magna), 나트라나에로비우스 써모필루스(Natranaerobius thermophilus), 펠로토마쿨룸 써모프로피오니쿰(Pelotomaculum thermopropionicum), 아시디티오바실러스 칼두스(Acidithiobacillus caldus), 아시디티오오바실러스 페로옥시단스(Acidithiobacillus ferrooxidans), 알로크로마티움 비노숨(Allochromatium vinosum), 마리노박터 종(Marinobacter sp.), 니트로소코쿠스 할로필루스(Nitrosococcus halophilus), 니트로소코쿠스 왓소니(Nitrosococcus watsoni), 슈도알테로모나스 할로플랑크티스(Pseudoalteromonas haloplanktis), 테도노박터 라세미퍼(Ktedonobacter racemifer), 메타노할로비움 에베스티가툼(Methanohalobium evestigatum), 아나바에나 바리아빌리스(Anabaena variabilis), 노둘라리아 스푸미게나(Nodularia spumigena), 노스톡 종(Nostoc sp.), 아트로스피라 막시마(Arthrospira maxima), 아트로스피라 플라텐시스(Arthrospira platensis), 아트로스피라 종(Arthrospira sp.), 룽비야 종(Lyngbya sp.), 마이크로콜레우스 크토노플라스테스(Microcoleus chthonoplastes), 오실라토리아 종(Oscillatoria sp.), 페트로토가 모빌리스(Petrotoga mobilis), 써모시포 아프리카누스(Thermosipho africanus) 또는 아카리요클로리스 마리나(Acaryochloris marina)에서 나올 수 있다.
일부 구현예에서, Cas9 뉴클레아제는 야생형 스트렙토코쿠스 피요게네스 시퀀스와 동일한 뉴클레오티드 시퀀스를 가질 수 있다. 일부 구현예에서, Cas9 뉴클레아제는 시퀀스 동정 번호: 4에서 규정되는 바와 같은 아미노산 시퀀스를 포함한다.
시퀀스 동정 번호:4 > Cas9 시퀀스
YLNAVVGTALIKK　YPKLESEFVYGDYKVYDVRKMIAKSEQEIGKATAKYFFYSNIMNFFKTEI　TLANGEIRKRPLIETNGETGEIVWDKGRDFATVRKVLSMPQVNIVKKTEV　QTGGFSKESILPKRNSDKLIARKKDWDPKKYGGFDSPTVAYSVLVVAKVE　KGKSKKLKSVKELLGITIMERSSFEKNPIDFLEAKGYKEVKKDLIIKLPK　YSLFELENGRKRMLASAGELQKGNELALPSKYVNFLYLASHYEKLKGSPE　DNEQKQLFVEQHKHYLDEIIEQISEFSKRVILADANLDKVLSAYNKHRDK　PIREQAENIIHLFTLTNLGAPAAFKYFDTTIDRKRYTSTKEVLDATLIHQ　SITGLYETRIDLSQLGGD
일부 구현예에서, CRISPR-연관 엔도뉴클레아제는 다른 종, 예를 들어 써모필루스와 같은 다른 스트렙토코쿠스 종; 슈도모나스 아에루기노사, 대장균 또는 다른 시퀀싱된 박테리아 게놈 및 아케이아(archaea) 또는 원핵 미생물로부터의 시퀀스일 수 있다. 대안으로, 야생형 스트렙토코쿠스 피요게네스 Cas9 시퀀스는 변형될 수 있다. 대안으로, Cas9 뉴클레아제 시퀀스는, 예를 들어, Addgene(Cambridge, MA)으로부터의 pX330, pX260 또는 pMJ920과 같은 상용적으로 획득가능한 벡터 내에 포함되는 시퀀스일 수 있다. 일부 구현예에서, Cas9 엔도뉴클레아제는 Genbank 수탁 번호 KM099231.1 GL669193757; KM099232.1; GL669193761; 또는 KM099233.1 GL669193765들의 Cas9 엔도뉴클레아제 또는 pX330, pX260 또는 pMJ920(Addgene, Cambridge, MA)의 Cas9 아미노산 시퀀스들 중의 임의의 것의 변종 또는 단편인 아미노산 시퀀스를 가질 수 있다.
일부 구현예에서, CRISPR/Cas 뉴클레아제는 돌연변이 CRISPR/Cas 뉴클레아제 즉 하나 이상의 점 돌연변이, 삽입, 결실, 절두, 융합 단백질 또는 이들의 조합을 갖는 단백질로 이루어진다. 일부 구현예에서, 돌연변이는 RNA-가이드된 DNA 결합 활성을 갖지만, 그의 뉴클레아제 활성 부위들 중 하나 또는 2개를 결여한다. 일부 구현예에서, 돌연변이는 CRISPR/Cas 뉴클레아제의 야생형 아미노산 시퀀스와 적어도 50% 동일성을 갖는 아미노산 시퀀스를 포함한다.
일부 구현예에서, CRISPR/Cas 뉴클레아제는 야생형 CRISPR/Cas 뉴클레아제(Cas9과 같은) 또는 그의 단편의 돌연변이이다. 일부 구현예에서, CRISPR/Cas 뉴클레아제는 스트렙토코쿠스 피요게네스로부터의 돌연변이 Cas9 단백질이다. 일부 구현예에서, 본 발명의 CRISPR/Cas 뉴클레아제는 결함 Cas9, 즉 D10A 및 H840A로 이루어지는 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 돌연변이를 갖는 스타필로코쿠스 파이로게네스로부터의 Cas9이다. 일부 구현예에서, 본 발명의 염기-교정 효소(base-editing enzyme)는 결함 CRISPR/Cas 뉴클레아제를 포함한다. 시퀀스 인식 메카니즘은 비-결함 CRISPR/Cas 뉴클레아제에 대한 것과 동일하다. 전형적으로, 본 발명의 결함 CRISPR/Cas 뉴클레아제는 적어도 하나의 RNA 결합 도메인을 포함한다. RNA 결합 도메인은 이후 정의되는 바와 같은 가이드 RNA 분자와 상호작용한다. 그러나, 본 발명의 결함 CRISPR/Cas 뉴클레아제는 뉴클레아제 활성을 수반하지 않는 변형 버전이다. 따라서, 결함 CRISPR/Cas 뉴클레아제는 가이드 RNA 분자를 특이적으로 인식하고 따라서 염기-교정 효소를 그의 표적 DNA 시퀀스로 가이드한다.
일부 구현예에서, 본 발명의 CRISPR/Cas 뉴클레아제는 니카제(nickase) 보다 구체적으로는 Cas9 니카제 즉 D10A 및 H840A로 이루어지는 군으로부터 선택되는 하나의 돌연변이를 갖는 스트렙토코쿠스 피요게네스로부터의 Cas9 이다. 일부 구현예에서, 본 발명의 니카제는 시퀀스 동정 번호: 5 또는 시퀀스 동정 번호: 6에서 규정되는 바와 같은 아미노산 시퀀스를 포함한다.
시퀀스 동정 번호: 5 > D10A 돌연변이를 갖는 S. 피요게네스 nCas9 단백질 시퀀스
MDKKYSIGL A IGTNSVGWAVITDEYKVPSKKFKVLGNTDRHSIKKNLIGALLFDSGETAEATRLKRTARRRYTRRKNRICYLQEIFSNEMAKVDDSFFHRLEESFLVEEDKKHERHPIFGNIVDEVAYHEKYPTIYHLRKKLVDSTDKADLRLIYLALAHMIKFRGHFLIEGDLNPDNSDVDKLFIQLVQTYNQLFEENPINASGVDAKAILSARLSKSRRLENLIAQLPGEKKNGLFGNLIALSLGLTPNFKSNFDLAEDAKLQLSKDTYDDDLDNLLAQIGDQYADLFLAAKNLSDAILLSDILRVNTEITKAPLSASMIKRYDEHHQDLTLLKALVRQQLPEKYKEIFFDQSKNGYAGYIDGGASQEEFYKFIKPILEKMDGTEELLVKLNREDLLRKQRTFDNGSIPHQIHLGELHAILRRQEDFYPFLKDNREKIEKILTFRIPYYVGPLARGNSRFAWMTRKSEETITPWNFEEVVDKGASAQSFIERMTNFDKNLPNEKVLPKHSLLYEYFTVYNELTKVKYVTEGMRKPAFLSGEQKKAIVDLLFKTNRKVTVKQLKEDYFKKIECFDSVEISGVEDRFNASLGTYHDLLKIIKDKDFLDNEENEDILEDIVLTLTLFEDREMIEERLKTYAHLFDDKVMKQLKRRRYTGWGRLSRKLINGIRDKQSGKTILDFLKSDGFANRNFMQLIHDDSLTFKEDIQKAQVSGQGDSLHEHIANLAGSPAIKKGILQTVKVVDELVKVMGRHKPENIVIEMARENQTTQKGQKNSRERMKRIEEGIKELGSQILKEHPVENTQLQNEKLYLYYLQNGRDMYVDQELDINRLSDYDVDHIVPQSFLKDDSIDNKVLTRSDKNRGKSDNVPSEEVVKKMKNYWRQLLNAKLITQRKFDNLTKAERGGLSELDKAGFIKRQLVETRQITKHVAQILDSRMNTKYDENDKLIREVKVITLKSKLVSDFRKDFQFYKVREINNYHHAHDAYLNAVVGTALIKKYPKLESEFVYGDYKVYDVRKMIAKSEQEIGKATAKYFFYSNIMNFFKTEITLANGEIRKRPLIETNGETGEIVWDKGRDFATVRKVLSMPQVNIVKKTEVQTGGFSKESILPKRNSDKLIARKKDWDPKKYGGFDSPTVAYSVLVVAKVEKGKSKKLKSVKELLGITIMERSSFEKNPIDFLEAKGYKEVKKDLIIKLPKYSLFELENGRKRMLASAGELQKGNELALPSKYVNFLYLASHYEKLKGSPEDNEQKQLFVEQHKHYLDEIIEQISEFSKRVILADANLDKVLSAYNKHRDKPIREQAENIIHLFTLTNLGAPAAFKYFDTTIDRKRYTSTKEVLDATLIHQSITGLYETRIDLSQLGGD
시퀀스 동정 번호:6 > H840A 돌연변이를 갖는 S. 피요게네스 nCas9 단백질 시퀀스
MDKKYSIGLDIGTNSVGWAVITDEYKVPSKKFKVLGNTDRHSIKKNLIGALLFDSGETAEATRLKRTARRRYTRRKNRICYLQEIFSNEMAKVDDSFFHRLEESFLVEEDKKHERHPIFGNIVDEVAYHEKYPTIYHLRKKLVDSTDKADLRLIYLALAHMIKFRGHFLIEGDLNPDNSDVDKLFIQLVQTYNQLFEENPINASGVDAKAILSARLSKSRRLENLIAQLPGEKKNGLFGNLIALSLGLTPNFKSNFDLAEDAKLQLSKDTYDDDLDNLLAQIGDQYADLFLAAKNLSDAILLSDILRVNTEITKAPLSASMIKRYDEHHQDLTLLKALVRQQLPEKYKEIFFDQSKNGYAGYIDGGASQEEFYKFIKPILEKMDGTEELLVKLNREDLLRKQRTFDNGSIPHQIHLGELHAILRRQEDFYPFLKDNREKIEKILTFRIPYYVGPLARGNSRFAWMTRKSEETITPWNFEEVVDKGASAQSFIERMTNFDKNLPNEKVLPKHSLLYEYFTVYNELTKVKYVTEGMRKPAFLSGEQKKAIVDLLFKTNRKVTVKQLKEDYFKKIECFDSVEISGVEDRFNASLGTYHDLLKIIKDKDFLDNEENEDILEDIVLTLTLFEDREMIEERLKTYAHLFDDKVMKQLKRRRYTGWGRLSRKLINGIRDKQSGKTILDFLKSDGFANRNFMQLIHDDSLTFKEDIQKAQVSGQGDSLHEHIANLAGSPAIKKGILQTVKVVDELVKVMGRHKPENIVIEMARENQTTQKGQKNSRERMKRIEEGIKELGSQILKEHPVENTQLQNEKLYLYYLQNGRDMYVDQELDINRLSDYDVD A IVPQSFLKDDSIDNKVLTRSDKNRGKSDNVPSEEVVKKMKNYWRQLLNAKLITQRKFDNLTKAERGGLSELDKAGFIKRQLVETRQITKHVAQILDSRMNTKYDENDKLIREVKVITLKSKLVSDFRKDFQFYKVREINNYHHAHDAYLNAVVGTALIKKYPKLESEFVYGDYKVYDVRKMIAKSEQEIGKATAKYFFYSNIMNFFKTEITLANGEIRKRPLIETNGETGEIVWDKGRDFATVRKVLSMPQVNIVKKTEVQTGGFSKESILPKRNSDKLIARKKDWDPKKYGGFDSPTVAYSVLVVAKVEKGKSKKLKSVKELLGITIMERSSFEKNPIDFLEAKGYKEVKKDLIIKLPKYSLFELENGRKRMLASAGELQKGNELALPSKYVNFLYLASHYEKLKGSPEDNEQKQLFVEQHKHYLDEIIEQISEFSKRVILADANLDKVLSAYNKHRDKPIREQAENIIHLFTLTNLGAPAAFKYFDTTIDRKRYTSTKEVLDATLIHQSITGLYETRIDLSQLGGD
일부 구현예에서, Cas9 단백질을 암호화하는 핵산 시퀀스는 시퀀스 동정 번호: 7의 핵산 시퀀스로 이루어진다.
시퀀스 동정 번호: 7> Cas9 (addgene #44250)
atggataagaaatactcaataggcttagatatcggcacaaatagcgtcggatgggcggtgatcactgatgaatataaggttccgtctaaaaagttcaaggttctgggaaatacagaccgccacagtatcaaaaaaaatcttataggggctcttttatttgacagtggagagacagcggaagcgactcgtctcaaacggacagctcgtagaaggtatacacgtcggaagaatcgtatttgttatctacaggagattttttcaaatgagatggcgaaagtagatgatagtttctttcatcgacttgaagagtcttttttggtggaagaagacaagaagcatgaacgtcatcctatttttggaaatatagtagatgaagttgcttatcatgagaaatatccaactatctatcatctgcgaaaaaaattggtagattctactgataaagcggatttgcgcttaatctatttggccttagcgcatatgattaagtttcgtggtcattttttgattgagggagatttaaatcctgataatagtgatgtggacaaactatttatccagttggtacaaacctacaatcaattatttgaagaaaaccctattaacgcaagtggagtagatgctaaagcgattctttctgcacgattgagtaaatcaagacgattagaaaatctcattgctcagctccccggtgagaagaaaaatggcttatttgggaatctcattgctttgtcattgggtttgacccctaattttaaatcaaattttgatttggcagaagatgctaaattacagctttcaaaagatacttacgatgatgatttagataatttattggcgcaaattggagatcaatatgctgatttgtttttggcagctaagaatttatcagatgctattttactttcagatatcctaagagtaaatactgaaataactaaggctcccctatcagcttcaatgattaaacgctacgatgaacatcatcaagacttgactcttttaaaagctttagttcgacaacaacttccagaaaagtataaagaaatcttttttgatcaatcaaaaaacggatatgcaggttatattgatgggggagctagccaagaagaattttataaatttatcaaaccaattttagaaaaaatggatggtactgaggaattattggtgaaactaaatcgtgaagatttgctgcgcaagcaacggacctttgacaacggctctattccccatcaaattcacttgggtgagctgcatgctattttgagaagacaagaagacttttatccatttttaaaagacaatcgtgagaagattgaaaaaatcttgacttttcgaattccttattatgttggtccattggcgcgtggcaatagtcgttttgcatggatgactcggaagtctgaagaaacaattaccccatggaattttgaagaagttgtcgataaaggtgcttcagctcaatcatttattgaacgcatgacaaactttgataaaaatcttccaaatgaaaaagtactaccaaaacatagtttgctttatgagtattttacggtttataacgaattgacaaaggtcaaatatgttactgaaggaatgcgaaaaccagcatttctttcaggtgaacagaagaaagccattgttgatttactcttcaaaacaaatcgaaaagtaaccgttaagcaattaaaagaagattatttcaaaaaaatagaatgttttgatagtgttgaaatttcaggagttgaagatagatttaatgcttcattaggtacctaccatgatttgctaaaaattattaaagataaagattttttggataatgaagaaaatgaagatatcttagaggatattgttttaacattgaccttatttgaagatagggagatgattgaggaaagacttaaaacatatgctcacctctttgatgataaggtgatgaaacagcttaaacgtcgccgttatactggttggggacgtttgtctcgaaaattgattaatggtattagggataagcaatctggcaaaacaatattagattttttgaaatcagatggttttgccaatcgcaattttatgcagctgatccatgatgatagtttgacatttaaagaagacattcaaaaagcacaagtgtctggacaaggcgatagtttacatgaacatattgcaaatttagctggtagccctgctattaaaaaaggtattttacagactgtaaaagttgttgatgaattggtcaaagtaatggggcggcataagccagaaaatatcgttattgaaatggcacgtgaaaatcagacaactcaaaagggccagaaaaattcgcgagagcgtatgaaacgaatcgaagaaggtatcaaagaattaggaagtcagattcttaaagagcatcctgttgaaaatactcaattgcaaaatgaaaagctctatctctattatctccaaaatggaagagacatgtatgtggaccaagaattagatattaatcgtttaagtgattatgatgtcgatcacattgttccacaaagtttccttaaagacgattcaatagacaataaggtcttaacgcgttctgataaaaatcgtggtaaatcggataacgttccaagtgaagaagtagtcaaaaagatgaaaaactattggagacaacttctaaacgccaagttaatcactcaacgtaagtttgataatttaacgaaagctgaacgtggaggtttgagtgaacttgataaagctggttttatcaaacgccaattggttgaaactcgccaaatcactaagcatgtggcacaaattttggatagtcgcatgaatactaaatacgatgaaaatgataaacttattcgagaggttaaagtgattaccttaaaatctaaattagtttctgacttccgaaaagatttccaattctataaagtacgtgagattaacaattaccatcatgcccatgatgcgtatctaaatgccgtcgttggaactgctttgattaagaaatatccaaaacttgaatcggagtttgtctatggtgattataaagtttatgatgttcgtaaaatgattgctaagtctgagcaagaaataggcaaagcaaccgcaaaatatttcttttactctaatatcatgaacttcttcaaaacagaaattacacttgcaaatggagagattcgcaaacgccctctaatcgaaactaatggggaaactggagaaattgtctgggataaagggcgagattttgccacagtgcgcaaagtattgtccatgccccaagtcaatattgtcaagaaaacagaagtacagacaggcggattctccaaggagtcaattttaccaaaaagaaattcggacaagcttattgctcgtaaaaaagactgggatccaaaaaaatatggtggttttgatagtccaacggtagcttattcagtcctagtggttgctaaggtggaaaaagggaaatcgaagaagttaaaatccgttaaagagttactagggatcacaattatggaaagaagttcctttgaaaaaaatccgattgactttttagaagctaaaggatataaggaagttaaaaaagacttaatcattaaactacctaaatatagtctttttgagttagaaaacggtcgtaaacggatgctggctagtgccggagaattacaaaaaggaaatgagctggctctgccaagcaaatatgtgaattttttatatttagctagtcattatgaaaagttgaagggtagtccagaagataacgaacaaaaacaattgtttgtggagcagcataagcattatttagatgagattattgagcaaatcagtgaattttctaagcgtgttattttagcagatgccaatttagataaagttcttagtgcatataacaaacatagagacaaaccaatacgtgaacaagcagaaaatattattcatttatttacgttgacgaatcttggagctcccgctgcttttaaatattttgatacaacaattgatcgtaaacgatatacgtctacaaaagaagttttagatgccactcttatccatcaatccatcactggtctttatgaaacacgcattgatttgagtcagctaggaggtgactaa
일부 구현예에서, 결함 Cas9 단백질을 암호화하는 핵산 시퀀스는 시퀀스 동정 번호: 8의 핵산 시퀀스로 이루어진다.
시퀀스 동정 번호:8 > dCas9 (addgene #44249)
atggataagaaatactcaataggcttagctatcggcacaaatagcgtcggatgggcggtgatcactgatgaatataaggttccgtctaaaaagttcaaggttctgggaaatacagaccgccacagtatcaaaaaaaatcttataggggctcttttatttgacagtggagagacagcggaagcgactcgtctcaaacggacagctcgtagaaggtatacacgtcggaagaatcgtatttgttatctacaggagattttttcaaatgagatggcgaaagtagatgatagtttctttcatcgacttgaagagtcttttttggtggaagaagacaagaagcatgaacgtcatcctatttttggaaatatagtagatgaagttgcttatcatgagaaatatccaactatctatcatctgcgaaaaaaattggtagattctactgataaagcggatttgcgcttaatctatttggccttagcgcatatgattaagtttcgtggtcattttttgattgagggagatttaaatcctgataatagtgatgtggacaaactatttatccagttggtacaaacctacaatcaattatttgaagaaaaccctattaacgcaagtggagtagatgctaaagcgattctttctgcacgattgagtaaatcaagacgattagaaaatctcattgctcagctccccggtgagaagaaaaatggcttatttgggaatctcattgctttgtcattgggtttgacccctaattttaaatcaaattttgatttggcagaagatgctaaattacagctttcaaaagatacttacgatgatgatttagataatttattggcgcaaattggagatcaatatgctgatttgtttttggcagctaagaatttatcagatgctattttactttcagatatcctaagagtaaatactgaaataactaaggctcccctatcagcttcaatgattaaacgctacgatgaacatcatcaagacttgactcttttaaaagctttagttcgacaacaacttccagaaaagtataaagaaatcttttttgatcaatcaaaaaacggatatgcaggttatattgatgggggagctagccaagaagaattttataaatttatcaaaccaattttagaaaaaatggatggtactgaggaattattggtgaaactaaatcgtgaagatttgctgcgcaagcaacggacctttgacaacggctctattccccatcaaattcacttgggtgagctgcatgctattttgagaagacaagaagacttttatccatttttaaaagacaatcgtgagaagattgaaaaaatcttgacttttcgaattccttattatgttggtccattggcgcgtggcaatagtcgttttgcatggatgactcggaagtctgaagaaacaattaccccatggaattttgaagaagttgtcgataaaggtgcttcagctcaatcatttattgaacgcatgacaaactttgataaaaatcttccaaatgaaaaagtactaccaaaacatagtttgctttatgagtattttacggtttataacgaattgacaaaggtcaaatatgttactgaaggaatgcgaaaaccagcatttctttcaggtgaacagaagaaagccattgttgatttactcttcaaaacaaatcgaaaagtaaccgttaagcaattaaaagaagattatttcaaaaaaatagaatgttttgatagtgttgaaatttcaggagttgaagatagatttaatgcttcattaggtacctaccatgatttgctaaaaattattaaagataaagattttttggataatgaagaaaatgaagatatcttagaggatattgttttaacattgaccttatttgaagatagggagatgattgaggaaagacttaaaacatatgctcacctctttgatgataaggtgatgaaacagcttaaacgtcgccgttatactggttggggacgtttgtctcgaaaattgattaatggtattagggataagcaatctggcaaaacaatattagattttttgaaatcagatggttttgccaatcgcaattttatgcagctgatccatgatgatagtttgacatttaaagaagacattcaaaaagcacaagtgtctggacaaggcgatagtttacatgaacatattgcaaatttagctggtagccctgctattaaaaaaggtattttacagactgtaaaagttgttgatgaattggtcaaagtaatggggcggcataagccagaaaatatcgttattgaaatggcacgtgaaaatcagacaactcaaaagggccagaaaaattcgcgagagcgtatgaaacgaatcgaagaaggtatcaaagaattaggaagtcagattcttaaagagcatcctgttgaaaatactcaattgcaaaatgaaaagctctatctctattatctccaaaatggaagagacatgtatgtggaccaagaattagatattaatcgtttaagtgattatgatgtcgatgccattgttccacaaagtttccttaaagacgattcaatagacaataaggtcttaacgcgttctgataaaaatcgtggtaaatcggataacgttccaagtgaagaagtagtcaaaaagatgaaaaactattggagacaacttctaaacgccaagttaatcactcaacgtaagtttgataatttaacgaaagctgaacgtggaggtttgagtgaacttgataaagctggttttatcaaacgccaattggttgaaactcgccaaatcactaagcatgtggcacaaattttggatagtcgcatgaatactaaatacgatgaaaatgataaacttattcgagaggttaaagtgattaccttaaaatctaaattagtttctgacttccgaaaagatttccaattctataaagtacgtgagattaacaattaccatcatgcccatgatgcgtatctaaatgccgtcgttggaactgctttgattaagaaatatccaaaacttgaatcggagtttgtctatggtgattataaagtttatgatgttcgtaaaatgattgctaagtctgagcaagaaataggcaaagcaaccgcaaaatatttcttttactctaatatcatgaacttcttcaaaacagaaattacacttgcaaatggagagattcgcaaacgccctctaatcgaaactaatggggaaactggagaaattgtctgggataaagggcgagattttgccacagtgcgcaaagtattgtccatgccccaagtcaatattgtcaagaaaacagaagtacagacaggcggattctccaaggagtcaattttaccaaaaagaaattcggacaagcttattgctcgtaaaaaagactgggatccaaaaaaatatggtggttttgatagtccaacggtagcttattcagtcctagtggttgctaaggtggaaaaagggaaatcgaagaagttaaaatccgttaaagagttactagggatcacaattatggaaagaagttcctttgaaaaaaatccgattgactttttagaagctaaaggatataaggaagttaaaaaagacttaatcattaaactacctaaatatagtctttttgagttagaaaacggtcgtaaacggatgctggctagtgccggagaattacaaaaaggaaatgagctggctctgccaagcaaatatgtgaattttttatatttagctagtcattatgaaaagttgaagggtagtccagaagataacgaacaaaaacaattgtttgtggagcagcataagcattatttagatgagattattgagcaaatcagtgaattttctaagcgtgttattttagcagatgccaatttagataaagttcttagtgcatataacaaacatagagacaaaccaatacgtgaacaagcagaaaatattattcatttatttacgttgacgaatcttggagctcccgctgcttttaaatattttgatacaacaattgatcgtaaacgatatacgtctacaaaagaagttttagatgccactcttatccatcaatccatcactggtctttatgaaacacgcattgatttgagtcagctaggaggtgactaa
일부 구현예에서, 뉴클레아제를 암호화하는 핵산 시퀀스는 약한 구성 프로모터에 작동가능하게 연결된다. 일부 구현예에서, 뉴클레아제를 암호화하는 핵산 시퀀스는 시퀀스 동정 번호: 9의 핵산 시퀀스를 갖는 약한 구성 BBa_J23107 프로모터에 작동가능하게 연결된다.
시퀀스 동정 번호:9> BBa_J23107 프로모터
tttacggctagctcagccctaggtattatgctagcAGATCTaaagaggagaaa
iv) 가이드 RNA 분자
일부 구현예에서, 본 발명의 플라스미드는 가이드 RNA 분자를 암호화하는 2, 3, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개의 핵산 시퀀스를 포함한다.
일부 구현예에서, 본 발명의 플라스미드에 의해 암호화되는 가이드 RNA 분자(들)는 스페이서 시퀀스(즉 crRNA) 및 트랜스-활성화 RNA("tracrRNA") 시퀀스를 포함한다.
일부 구현예에서, 스페이서 시퀀스는 수신체 박테리아 세포에 존재하는 임의의 특정 표적 시퀀스에 대해 상보적이다. 전형적으로 스페이서 시퀀스는 당해 기술분야에서 충분히 공지된 임의의 맞춤형 알고리즘에 의해 그리고 전형적으로는 실시예에서 기술되는 바와 같은 맞춤형 알고리즘 CSTB에 의해 설계된다.
일부 구현예에서, 스페이서 시퀀스는 미생물 대사의 병원성 또는 다른 양태에 관여하는 유전자를 표적한다. 일부 구현예에서, 스페이서 시퀀스는 박테리아 대사에 관여하는 유전자, 보다 구체적으로는 생물막 생산에 관여하는 유전자의 표적 영역에 대해 상보적이다.
일부 구현예에서, 스페이서 시퀀스는 항생제 내성 유전자를 표적한다. 예를 들어, 큰 범위의 상이한 베타-락탐 항생제에 내성을 부여하는 베타-락타마아제(bla 유전자)를 암호화하는 많은 내성 유전자가 존재한다. 일부 구현예에서, 본 발명의 플라스미드는 각각이 하나 이상의 베타-락타마아제 유전자의 표적 시퀀스에 대해 충분히 상보적인 스페이서 시퀀스를 포함하는 하나 이상의 RNA 가이드 분자들을 전사한다. 예를 들어, 하나 이상의 RNA 가이드 분자들은 하기들로 이루어지는 군으로부터 선택되는 유전자들 중의 하나 이상 또는 전부를 표적할 수 있다: NDM, VIM, IMP, KPC, OXA, TEM, SHV, CTX, OKP, LEN, GES, MIR, ACT, ACC, CMY, LAT 및 FOX. 특히, 하나 이상의 RNA 가이드 분자들은 하기들 중의 하나 이상 또는 전부를 포함하여 항균 내성 유전자의 베타 락탐족의 표적 시퀀스들에 대해 충분히 상보적인 스페이서 시퀀스를 포함할 수 있다: NDM-1, NDM-2, NDM-10에 대한 표적 시퀀스들에 대해 충분히 상보적인 제1 스페이서 시퀀스; VIM-1, VIM-2, VIM-4, VIM-12, VIM-19, VIM-26, VIM-27, VIM-33, VIM-34에 대한 표적 시퀀스들에 대해 충분히 상보적인 제2 스페이서 시퀀스; IMP-32, IMP-38, IMP-48에 대한 표적 시퀀스들에 대해 충분히 상보적인 제3 스페이서 시퀀스; KPC-1, KPC-2, KPC-3, KPC-4, KPC-6, KPC-7, KPC-8, KPC-11, KPC-12, KPC-14, KPC-15, KPC-16, KPC-17에 대한 표적 시퀀스들에 대해 충분히 상보적인 제4 스페이서 시퀀스; OXA-48에 대한 표적 시퀀스들에 대해 충분히 상보적인 제5 스페이서 시퀀스; TEM-1, TEM-1B, TEM-3, TEM-139, TEM-162, TEM-183, TEM-192, TEM-197, TEM-198, TEM-209에 대한 표적 시퀀스들에 대해 충분히 상보적인 제6 스페이서 시퀀스, SHV와 그의 변종에 대한 표적 시퀀스들에 대해 충분히 상보적인 제7 스페이서 시퀀스; 및 CTX와 그의 변종에 대한 표적 시퀀스들에 대해 충분히 상보적인 제8 스페이서 시퀀스.
일부 구현예에서, 스페이스 시퀀스는 표적 시퀀스에서 DSB를 생성하도록 설계된다. 예를 들어, 표적 시퀀스가 박테리아 염색체 또는 플라스미드와 같은 염색체 또는 레플리콘(replicon)(예를 들어 플라스미드) 상에 위치하는 경우, DSB는 분해될 수 있고 따라서 염색체 또는 레플리콘의 손실을 초래할 수 있다. 표적 시퀀스가 박테리아 염색체 상에 위치되는 경우 수신체는 DSB의 결과로서 직접적으로 사멸할 수 있다. 추가적으로, 일부 천연 플라스미드는 세포가 플라스미드를 상실하는 경우에만 독성이 되는 살상 기능을 지니며, 이는 세포를 분할하는 데 있어서 플라스미드의 충실한 유전을 보장하기 위한 천연의 메카니즘이다. 항생제 내성 유전자의 표적 시퀀스를 지니는 플라스미드가 또한 그러한 살상 기능을 지니고, 그리고 플라스미드가 생성된 DSB의 결과로서 플라스미드가 손실되는 경우, 세포는 사멸될 수 있다.
일부 구현예에서, 스페이서 시퀀스는 표 1에서 선택되는 핵산 시퀀스에 의해 암호화된다.
Figure pct00001
일부 구현예에서, 스페이서 시퀀스를 암호화하는 핵산 시퀀스는 본 발명의 플라스미드에서 상기 스페이서 시퀀스의 신속한 복제를 허용하도록 제한 부위에 의해 각 말단에 플랭킹된다.
일부 구현예에서, 가이드 RNA 분자(들)의 tracrRNA 시퀀스는 시퀀스 동정 번호: 25의 핵산 시퀀스에 의해 암호화된다.
시퀀스 동정 번호: 25 > tracrRNA 시퀀스
gttttagagctagaaatagcaagttaaaataaggctagtccgttatcaacttgaaaaagtggcaccgagtcggtgc
일부 구현예에서, 가이드 RNA 분자를 암호화하는 핵산 시퀀스(들)는 강한 구성 프로모터에 작동가능하게 연결된다. 일부 구현예에서, 가이드 RNA 분자를 암호화하는 핵산 시퀀스(들)는 시퀀스 동정 번호: 26의 핵산 시퀀스를 갖는 강한 구성 BBa_J23119 프로모터에 작동가능하게 연결된다.
시퀀스 동정 번호:26 > BBa_J23119 프로모터
ttgacagctagctcagtcctaggtataatactagt
v) 임의선택적인 선택 마커 유전자
일부 구현예에서, 본 발명의 플라스미드는 임의선택적으로 하나 이상의 선택 마커를 포함한다. 본 발명의 플라스미드를 포함하는 형질전환된 세포는 실제로 다양한 양성 및/또는 음성 선택 마커로 선택될 수 있다.
예를 들어, 양성 선택 마커는 아미노산과 같은 필수 영양소의 부재 중에서 성장할 수 있는 유전자일 수 있다. 여러 가지의 적합한 양성/음성 선택 쌍들이 당해 기술분야에서 획득가능하다. 예를 들어, 당해 기술분야에서 공지된 다양한 아미노산 유사체가 음성 선택으로서 사용될 수 있는 한편, (아미노산 유사체에 대한) 최소 배지 상의 성장은 양성 선택으로서 사용될 수 있다.
시각적으로 검출가능한 마커가 또한 본 발명에서 사용되기에 적합하고, 형광활성세포분류(FACS: fluorescence activated cell sorting) 또는 미세유체공학(microfluidics)과 같은 기술을 사용하여 양성으로 및 음성으로 선택 및/또는 스크리닝될 수 있다. 검출가능한 마커의 예에는 다양한 효소, 보결 기(prosthetic group), 형광 마커, 발광 마커, 생물발광 마커 등이 포함된다. 적합한 형광 단백질의 예에는 황색 형광 단백질(YFP), 녹색 형광 단백질(GFP), 청록색 형광 단백질(CFP: cyan fluorescence protein), 움벨리페론(umbelliferone), 플루오레세인(fluorescein), 플루오레세인 이소티오시아네이트(fluorescein isothiocyanate), 로다민(rhodamine), 디클로로트리아지닐아민 플루오레세인(dichiorotriazinylamine fluorescein), 단실 클로라이드(dansyl chloride), 피코에리트린(phycoerythrin) 등이 포함되나, 이들로 제한되는 것은 아니다. 적합한 생물발광 마커의 예에는 루시페라아제(luciferase)(예를 들어, 박테리아, 반딧불이, 방아벌레 등), 루시페린(luciferin), 에쿼린(aequorin) 등이 포함되나, 이들로 제한되는 것은 아니다. 시각적으로 검출가능한 신호를 갖는 적합한 효소 시스템의 예에는 갈락토시다아제(galactosidases), 글루쿠로니다아제(glucorinidase), 포스파타아제(phosphatases), 퍼옥시다아제(peroxidases), 콜린에스테라아제(cholinesterases) 등이 포함되나, 이들로 제한되는 것은 아니다.
일부 구현예에서, 양성 선택 마커는 유전자의 부재 중에서 세포에 대해 치명적일 수 있는 화합물에 대해 내성을 부여하는 유전자이다. 예를 들어, 항생제 내성 유전자를 발현하는 세포는 항생제의 존재 중에서 생존할 수 있는 반면, 유전자를 결여하는 세포는 그렇지 않을 것이다. 적합한 항생제 내성 유전자에는 암피실린-내성 유전자, 네오마이신-내성 유전자, 블라스티시딘-내성 유전자, 하이그로마이신-내성 유전자, 퓨로마이신-내성 유전자, 클로람페니콜-내성 유전자, 아프라마이신-내성 유전자 등과 같은 유전자가 포함되나, 이들로 제한되는 것은 아니다.
vi) 특정 플라스미드:
일부 구현예에서, 본 발명의 플라스미드는 시퀀스 동정 번호: 27 또는 28에서 규정되는 바와 같은 핵산 시퀀스로 이루어진다.
시퀀스 동정 번호: 27> TAPKn-Cas9-nsp
atctttgacagctagctcagtcctaggtataatactagtgaagagcACCGGTgctcttcgttttagagctagaaatagcaagttaaaataaggctagtccgttatcaacttgaaaaagtggcaccgagtcggtgctttttttgaagcttgggcccgaacaaaaaaaaaccccgcccctgacagggcggggttttttttgtttgtcggtgaactggatccttaccagctgggcgcgccccccctacgggcttgctctccgggcttcgccctgcgcggtcgctgcgctcccttgccagcccgtggatatgtggacgatggccgcgagcggccaccggctggctcgcttcgctcggcccgtggacaaccctgctggacaagctgatggacaggctgcgcctgcccacgagcttgaccacagggattgcccaccggctacccagccttcgaccacatacccaccggctccaactgcgcggcctgcggccttgccccatcaatttttttaattttctctggggaaaagcctccggcctgcggcctgcgcgcttcgcttgccggttggacaccaagtggaaggcgggtcaaggctcgcgcagcgaccgcgcagcggcttggccttgacgcgcctggaacgacccaagcctatgcgagtgggggcagtcgaagggcgaagcccgcccgcctgccccccgagcctcacggcggcgagtgcgggggttccaagggggcagcgccaccttgggcaaggccgaaggccgcgcagtcgatcaacaagccccggaggggccactttttgccggagggggagccgcgccgaaggcgtgggggaaccccgcaggggtgcccttctttgggcaccaaagaactagatatagggcgaaatgcgaaagacttaaaaatcaacaacttaaaaaaggggggtacgcaacagctcattgcggcaccccccgcaatagctcattgcgtaggttaaagaaaatctgtaattgactgccacttttacgcaacgcataattgttgtcgcgctgccgaaaagttgcagctgattgcgcatggtgccgcaaccgtgcggcacccctaccgcatggagataagcatggccacgcagtccagagaaatcggcattcaagccaagaacaagcccggtcactgggtgcaaacggaacgcaaagcgcatgaggcgtgggccgggcttattgcgaggaaacccacggcggcaatgctgctgcatcacctcgtggcgcagatgggccaccagaacgccgtggtggtcagccagaagacactttccaagctcatcggacgttctttgcggacggtccaatacgcagtcaaggacttggtggccgagcgctggatctccgtcgtgaagctcaacggccccggcaccgtgtcggcctacgtggtcaatgaccgcgtggcgtggggccagccccgcgaccagttgcgcctgtcggtgttcagtgccgccgtggtggttgatcacgacgaccaggacgaatcgctgttggggcatggcgacctgcgccgcatcccgaccctgtatccgggcgagcagcaactaccgaccggccccggcgaggagccgcccagccagcccggcattccgggcatggaaccagacctgccagccttgaccgaaacggaggaatgggaacggcgcgggcagcagcgcctgccgatgcccgatgagccgtgttttctggacgatggcgagccgttggagccgccgacacgggtaacgctgccgcgccggtagggcatgcaaacagggacgcaccgctagcagcgcccctagcggtatcctataaaaaaacacaccgcgccgctagcagcacccctaatataaaataatgttttttataaaaatagtcagtaccacccctacaaaacggtgtcggcgcgttgttgtagccgcgccgacaccgcttttttaaatatcataaagagagtaagagaaactaatttttcataacactctatttataaagaaaaatcagcaaaaacttgtttttgcgtggggtgtggtgcttttggtggtgagaaccaccaacctgttgagcctttttgtggagcgcgcggaccgcggtccagagagcgttcaccgacaaacaacagataaaacgaaaggcccagtctttcgactgagcctttcgttttatttgatgcctggagatccttactcgagttagtcacctcctagctgactcaaatcaatgcgtgtttcataaagaccagtgatggattgatggataagagtggcatctaaaacttcttttgtagacgtatatcgtttacgatcaattgttgtatcaaaatatttaaaagcagcgggagctccaagattcgtcaacgtaaataaatgaataatattttctgcttgttcacgtattggtttgtctctatgtttgttatatgcactaagaactttatctaaattggcatctgctaaaataacacgcttagaaaattcactgatttgctcaataatctcatctaaataatgcttatgctgctccacaaacaattgtttttgttcgttatcttctggactacccttcaacttttcataatgactagctaaatataaaaaattcacatatttgcttggcagagccagctcatttcctttttgtaattctccggcactagccagcatccgtttacgaccgttttctaactcaaaaagactatatttaggtagtttaatgattaagtcttttttaacttccttatatcctttagcttctaaaaagtcaatcggatttttttcaaaggaacttctttccataattgtgatccctagtaactctttaacggattttaacttcttcgatttccctttttccaccttagcaaccactaggactgaataagctaccgttggactatcaaaaccaccatatttttttggatcccagtcttttttacgagcaataagcttgtccgaatttctttttggtaaaattgactccttggagaatccgcctgtctgtacttctgttttcttgacaatattgacttggggcatggacaatactttgcgcactgtggcaaaatctcgccctttatcccagacaatttctccagtttccccattagtttcgattagagggcgtttgcgaatctctccatttgcaagtgtaatttctgttttgaagaagttcatgatattagagtaaaagaaatattttgcggttgctttgcctatttcttgctcagacttagcaatcattttacgaacatcataaactttataatcaccatagacaaactccgattcaagttttggatatttcttaatcaaagcagttccaacgacggcatttagatacgcatcatgggcatgatggtaattgttaatctcacgtactttatagaattggaaatcttttcggaagtcagaaactaatttagattttaaggtaatcactttaacctctcgaataagtttatcattttcatcgtatttagtattcatgcgactatccaaaatttgtgccacatgcttagtgatttggcgagtttcaaccaattggcgtttgataaaaccagctttatcaagttcactcaaacctccacgttcagctttcgttaaattatcaaacttacgttgagtgattaacttggcgtttagaagttgtctccaatagtttttcatctttttgactacttcttcacttggaacgttatccgatttaccacgatttttatcagaacgcgttaagaccttattgtctattgaatcgtctttaaggaaactttgtggaacaatgtgatcgacatcataatcacttaaacgattaatatctaattcttggtccacatacatgtctcttccattttggagataatagagatagagcttttcattttgcaattgagtattttcaacaggatgctctttaagaatctgacttcctaattctttgataccttcttcgattcgtttcatacgctctcgcgaatttttctggcccttttgagttgtctgattttcacgtgccatttcaataacgatattttctggcttatgccgccccattactttgaccaattcatcaacaacttttacagtctgtaaaataccttttttaatagcagggctaccagctaaatttgcaatatgttcatgtaaactatcgccttgtccagacacttgtgctttttgaatgtcttctttaaatgtcaaactatcatcatggatcagctgcataaaattgcgattggcaaaaccatctgatttcaaaaaatctaatattgttttgccagattgcttatccctaataccattaatcaattttcgagacaaacgtccccaaccagtataacggcgacgtttaagctgtttcatcaccttatcatcaaagaggtgagcatatgttttaagtctttcctcaatcatctccctatcttcaaataaggtcaatgttaaaacaatatcctctaagatatcttcattttcttcattatccaaaaaatctttatctttaataatttttagcaaatcatggtaggtacctaatgaagcattaaatctatcttcaactcctgaaatttcaacactatcaaaacattctatttttttgaaataatcttcttttaattgcttaacggttacttttcgatttgttttgaagagtaaatcaacaatggctttcttctgttcacctgaaagaaatgctggttttcgcattccttcagtaacatatttgacctttgtcaattcgttataaaccgtaaaatactcataaagcaaactatgttttggtagtactttttcatttggaagatttttatcaaagtttgtcatgcgttcaataaatgattgagctgaagcacctttatcgacaacttcttcaaaattccatggggtaattgtttcttcagacttccgagtcatccatgcaaaacgactattgccacgcgccaatggaccaacataataaggaattcgaaaagtcaagattttttcaatcttctcacgattgtcttttaaaaatggataaaagtcttcttgtcttctcaaaatagcatgcagctcacccaagtgaatttgatggggaatagagccgttgtcaaaggtccgttgcttgcgcagcaaatcttcacgatttagtttcaccaataattcctcagtaccatccattttttctaaaattggtttgataaatttataaaattcttcttggctagctcccccatcaatataacctgcatatccgttttttgattgatcaaaaaagatttctttatacttttctggaagttgttgtcgaactaaagcttttaaaagagtcaagtcttgatgatgttcatcgtagcgtttaatcattgaagctgataggggagccttagttatttcagtatttactcttaggatatctgaaagtaaaatagcatctgataaattcttagctgccaaaaacaaatcagcatattgatctccaatttgcgccaataaattatctaaatcatcatcgtaagtatcttttgaaagctgtaatttagcatcttctgccaaatcaaaatttgatttaaaattaggggtcaaacccaatgacaaagcaatgagattcccaaataagccatttttcttctcaccggggagctgagcaatgagattttctaatcgtcttgatttactcaatcgtgcagaaagaatcgctttagcatctactccacttgcgttaatagggttttcttcaaataattgattgtaggtttgtaccaactggataaatagtttgtccacatcactattatcaggatttaaatctccctcaatcaaaaaatgaccacgaaacttaatcatatgcgctaaggccaaatagattaagcgcaaatccgctttatcagtagaatctaccaatttttttcgcagatgatagatagttggatatttctcatgataagcaacttcatctactatatttccaaaaataggatgacgttcatgcttcttgtcttcttccaccaaaaaagactcttcaagtcgatgaaagaaactatcatctactttcgccatctcatttgaaaaaatctcctgtagataacaaatacgattcttccgacgtgtataccttctacgagctgtccgtttgagacgagtcgcttccgctgtctctccactgtcaaataaaagagcccctataagattttttttgatactgtggcggtctgtatttcccagaaccttgaactttttagacggaaccttatattcatcagtgatcaccgcccatccgacgctatttgtgccgatatctaagcctattgagtatttcttatccatagatCCTTTCTCCTCTTTAGATCTgctagcataatacctagggctgagctagccgtaaaTGAGGTTTCAGCAAAAAACCcctcaagacccgtttagaggccccaaggggttatgctagttattgctcagcggattaattattagaaaaattcatccagcatcagatgaaattgcagtttgttcatatccggattatcaatgccatatttctgaaacagacgtttttgcaggctcgggctaaattcgcccaggcagttccacagaatggccagatcctgataacgatccgcaatgcccacacggcccacatcaatgcagccaatcagtttgccttcatcgaaaatcaggttatccaggctaaaatcgccgtgggtcaccacgctatccgggctaaacggcagcagtttatgcatttctttccacacctgttccaccggccagccgttacgttcatcatcaaaatcgctcgcatccaccaggccgttgttcatacggctctgcgcctgggccagacgaaacacacgatcgctgttaaacgggcagttgcacaccggaatgctatgcagacgacgcagaaacacggccagcgcatccacaatgttttcgccgctatccggatattcttccagcacctgaaacgcggttttgcccggaatcgcggtggtcagcagccacgcatcatccggggtgcgaataaaatgtttaatggtcggcagcggcataaattcggtcagccagttcagacgcaccatttcatcggtcacatcgttcgccacgctgcctttgccatgtttcagaaacagttccggcgcatccggtttgccatacagacgataaatggtcgcgccgctctgacccacgttatcacgcgcccatttatagccatacagatccgcatccatgttgctgttcagacgcggacggctacagctcgtttcacgctgaatatggctcataacaccccttgtattactgtttatgtaagcagacagttttattgttcatgatgatatatttttatcttgtgcaatgtaacatcagagattttgagacacaaatttaaatcgtaattattggggacccctggattctcaccaataaaaaacgcccggcggcaaccgagcgttctgaacaaatccagatggagttctgaggtcattactggatctatcaacaggagtccaagactagtcgccagggttttcccagtcacgacgcggccgcaagcttgcatgcctgcaggtcgactctagaggatccccgggtaccgagctcgaattcgcgcggccgcggcctaggcggcctcctgtgtgaaattgttatccgctttaattaa
시퀀스 동정 번호:28 > TAPKn-dCas9-nsp
atctttgacagctagctcagtcctaggtataatactagtgaagagcACCGGTgctcttcgttttagagctagaaatagcaagttaaaataaggctagtccgttatcaacttgaaaaagtggcaccgagtcggtgctttttttgaagcttgggcccgaacaaaaaaaaaccccgcccctgacagggcggggttttttttgtttgtcggtgaactggatccttaccagctgggcgcgccccccctacgggcttgctctccgggcttcgccctgcgcggtcgctgcgctcccttgccagcccgtggatatgtggacgatggccgcgagcggccaccggctggctcgcttcgctcggcccgtggacaaccctgctggacaagctgatggacaggctgcgcctgcccacgagcttgaccacagggattgcccaccggctacccagccttcgaccacatacccaccggctccaactgcgcggcctgcggccttgccccatcaatttttttaattttctctggggaaaagcctccggcctgcggcctgcgcgcttcgcttgccggttggacaccaagtggaaggcgggtcaaggctcgcgcagcgaccgcgcagcggcttggccttgacgcgcctggaacgacccaagcctatgcgagtgggggcagtcgaagggcgaagcccgcccgcctgccccccgagcctcacggcggcgagtgcgggggttccaagggggcagcgccaccttgggcaaggccgaaggccgcgcagtcgatcaacaagccccggaggggccactttttgccggagggggagccgcgccgaaggcgtgggggaaccccgcaggggtgcccttctttgggcaccaaagaactagatatagggcgaaatgcgaaagacttaaaaatcaacaacttaaaaaaggggggtacgcaacagctcattgcggcaccccccgcaatagctcattgcgtaggttaaagaaaatctgtaattgactgccacttttacgcaacgcataattgttgtcgcgctgccgaaaagttgcagctgattgcgcatggtgccgcaaccgtgcggcacccctaccgcatggagataagcatggccacgcagtccagagaaatcggcattcaagccaagaacaagcccggtcactgggtgcaaacggaacgcaaagcgcatgaggcgtgggccgggcttattgcgaggaaacccacggcggcaatgctgctgcatcacctcgtggcgcagatgggccaccagaacgccgtggtggtcagccagaagacactttccaagctcatcggacgttctttgcggacggtccaatacgcagtcaaggacttggtggccgagcgctggatctccgtcgtgaagctcaacggccccggcaccgtgtcggcctacgtggtcaatgaccgcgtggcgtggggccagccccgcgaccagttgcgcctgtcggtgttcagtgccgccgtggtggttgatcacgacgaccaggacgaatcgctgttggggcatggcgacctgcgccgcatcccgaccctgtatccgggcgagcagcaactaccgaccggccccggcgaggagccgcccagccagcccggcattccgggcatggaaccagacctgccagccttgaccgaaacggaggaatgggaacggcgcgggcagcagcgcctgccgatgcccgatgagccgtgttttctggacgatggcgagccgttggagccgccgacacgggtaacgctgccgcgccggtagggcatgcaaacagggacgcaccgctagcagcgcccctagcggtatcctataaaaaaacacaccgcgccgctagcagcacccctaatataaaataatgttttttataaaaatagtcagtaccacccctacaaaacggtgtcggcgcgttgttgtagccgcgccgacaccgcttttttaaatatcataaagagagtaagagaaactaatttttcataacactctatttataaagaaaaatcagcaaaaacttgtttttgcgtggggtgtggtgcttttggtggtgagaaccaccaacctgttgagcctttttgtggagcgcgcggaccgcggtccagagagcgttcaccgacaaacaacagataaaacgaaaggcccagtctttcgactgagcctttcgttttatttgatgcctggagatccttactcgagttagtcacctcctagctgactcaaatcaatgcgtgtttcataaagaccagtgatggattgatggataagagtggcatctaaaacttcttttgtagacgtatatcgtttacgatcaattgttgtatcaaaatatttaaaagcagcgggagctccaagattcgtcaacgtaaataaatgaataatattttctgcttgttcacgtattggtttgtctctatgtttgttatatgcactaagaactttatctaaattggcatctgctaaaataacacgcttagaaaattcactgatttgctcaataatctcatctaaataatgcttatgctgctccacaaacaattgtttttgttcgttatcttctggactacccttcaacttttcataatgactagctaaatataaaaaattcacatatttgcttggcagagccagctcatttcctttttgtaattctccggcactagccagcatccgtttacgaccgttttctaactcaaaaagactatatttaggtagtttaatgattaagtcttttttaacttccttatatcctttagcttctaaaaagtcaatcggatttttttcaaaggaacttctttccataattgtgatccctagtaactctttaacggattttaacttcttcgatttccctttttccaccttagcaaccactaggactgaataagctaccgttggactatcaaaaccaccatatttttttggatcccagtcttttttacgagcaataagcttgtccgaatttctttttggtaaaattgactccttggagaatccgcctgtctgtacttctgttttcttgacaatattgacttggggcatggacaatactttgcgcactgtggcaaaatctcgccctttatcccagacaatttctccagtttccccattagtttcgattagagggcgtttgcgaatctctccatttgcaagtgtaatttctgttttgaagaagttcatgatattagagtaaaagaaatattttgcggttgctttgcctatttcttgctcagacttagcaatcattttacgaacatcataaactttataatcaccatagacaaactccgattcaagttttggatatttcttaatcaaagcagttccaacgacggcatttagatacgcatcatgggcatgatggtaattgttaatctcacgtactttatagaattggaaatcttttcggaagtcagaaactaatttagattttaaggtaatcactttaacctctcgaataagtttatcattttcatcgtatttagtattcatgcgactatccaaaatttgtgccacatgcttagtgatttggcgagtttcaaccaattggcgtttgataaaaccagctttatcaagttcactcaaacctccacgttcagctttcgttaaattatcaaacttacgttgagtgattaacttggcgtttagaagttgtctccaatagtttttcatctttttgactacttcttcacttggaacgttatccgatttaccacgatttttatcagaacgcgttaagaccttattgtctattgaatcgtctttaaggaaactttgtggaacaatggcatcgacatcataatcacttaaacgattaatatctaattcttggtccacatacatgtctcttccattttggagataatagagatagagcttttcattttgcaattgagtattttcaacaggatgctctttaagaatctgacttcctaattctttgataccttcttcgattcgtttcatacgctctcgcgaatttttctggcccttttgagttgtctgattttcacgtgccatttcaataacgatattttctggcttatgccgccccattactttgaccaattcatcaacaacttttacagtctgtaaaataccttttttaatagcagggctaccagctaaatttgcaatatgttcatgtaaactatcgccttgtccagacacttgtgctttttgaatgtcttctttaaatgtcaaactatcatcatggatcagctgcataaaattgcgattggcaaaaccatctgatttcaaaaaatctaatattgttttgccagattgcttatccctaataccattaatcaattttcgagacaaacgtccccaaccagtataacggcgacgtttaagctgtttcatcaccttatcatcaaagaggtgagcatatgttttaagtctttcctcaatcatctccctatcttcaaataaggtcaatgttaaaacaatatcctctaagatatcttcattttcttcattatccaaaaaatctttatctttaataatttttagcaaatcatggtaggtacctaatgaagcattaaatctatcttcaactcctgaaatttcaacactatcaaaacattctatttttttgaaataatcttcttttaattgcttaacggttacttttcgatttgttttgaagagtaaatcaacaatggctttcttctgttcacctgaaagaaatgctggttttcgcattccttcagtaacatatttgacctttgtcaattcgttataaaccgtaaaatactcataaagcaaactatgttttggtagtactttttcatttggaagatttttatcaaagtttgtcatgcgttcaataaatgattgagctgaagcacctttatcgacaacttcttcaaaattccatggggtaattgtttcttcagacttccgagtcatccatgcaaaacgactattgccacgcgccaatggaccaacataataaggaattcgaaaagtcaagattttttcaatcttctcacgattgtcttttaaaaatggataaaagtcttcttgtcttctcaaaatagcatgcagctcacccaagtgaatttgatggggaatagagccgttgtcaaaggtccgttgcttgcgcagcaaatcttcacgatttagtttcaccaataattcctcagtaccatccattttttctaaaattggtttgataaatttataaaattcttcttggctagctcccccatcaatataacctgcatatccgttttttgattgatcaaaaaagatttctttatacttttctggaagttgttgtcgaactaaagcttttaaaagagtcaagtcttgatgatgttcatcgtagcgtttaatcattgaagctgataggggagccttagttatttcagtatttactcttaggatatctgaaagtaaaatagcatctgataaattcttagctgccaaaaacaaatcagcatattgatctccaatttgcgccaataaattatctaaatcatcatcgtaagtatcttttgaaagctgtaatttagcatcttctgccaaatcaaaatttgatttaaaattaggggtcaaacccaatgacaaagcaatgagattcccaaataagccatttttcttctcaccggggagctgagcaatgagattttctaatcgtcttgatttactcaatcgtgcagaaagaatcgctttagcatctactccacttgcgttaatagggttttcttcaaataattgattgtaggtttgtaccaactggataaatagtttgtccacatcactattatcaggatttaaatctccctcaatcaaaaaatgaccacgaaacttaatcatatgcgctaaggccaaatagattaagcgcaaatccgctttatcagtagaatctaccaatttttttcgcagatgatagatagttggatatttctcatgataagcaacttcatctactatatttccaaaaataggatgacgttcatgcttcttgtcttcttccaccaaaaaagactcttcaagtcgatgaaagaaactatcatctactttcgccatctcatttgaaaaaatctcctgtagataacaaatacgattcttccgacgtgtataccttctacgagctgtccgtttgagacgagtcgcttccgctgtctctccactgtcaaataaaagagcccctataagattttttttgatactgtggcggtctgtatttcccagaaccttgaactttttagacggaaccttatattcatcagtgatcaccgcccatccgacgctatttgtgccgatagctaagcctattgagtatttcttatccatagatCCTTTCTCCTCTTTAGATCTgctagcataatacctagggctgagctagccgtaaaTGAGGTTTCAGCAAAAAACCcctcaagacccgtttagaggccccaaggggttatgctagttattgctcagcggattaattattagaaaaattcatccagcatcagatgaaattgcagtttgttcatatccggattatcaatgccatatttctgaaacagacgtttttgcaggctcgggctaaattcgcccaggcagttccacagaatggccagatcctgataacgatccgcaatgcccacacggcccacatcaatgcagccaatcagtttgccttcatcgaaaatcaggttatccaggctaaaatcgccgtgggtcaccacgctatccgggctaaacggcagcagtttatgcatttctttccacacctgttccaccggccagccgttacgttcatcatcaaaatcgctcgcatccaccaggccgttgttcatacggctctgcgcctgggccagacgaaacacacgatcgctgttaaacgggcagttgcacaccggaatgctatgcagacgacgcagaaacacggccagcgcatccacaatgttttcgccgctatccggatattcttccagcacctgaaacgcggttttgcccggaatcgcggtggtcagcagccacgcatcatccggggtgcgaataaaatgtttaatggtcggcagcggcataaattcggtcagccagttcagacgcaccatttcatcggtcacatcgttcgccacgctgcctttgccatgtttcagaaacagttccggcgcatccggtttgccatacagacgataaatggtcgcgccgctctgacccacgttatcacgcgcccatttatagccatacagatccgcatccatgttgctgttcagacgcggacggctacagctcgtttcacgctgaatatggctcataacaccccttgtattactgtttatgtaagcagacagttttattgttcatgatgatatatttttatcttgtgcaatgtaacatcagagattttgagacacaaatttaaatcgtaattattggggacccctggattctcaccaataaaaaacgcccggcggcaaccgagcgttctgaacaaatccagatggagttctgaggtcattactggatctatcaacaggagtccaagactagtcgccagggttttcccagtcacgacgcggccgcaagcttgcatgcctgcaggtcgactctagaggatccccgggtaccgagctcgaattcgcgcggccgcggcctaggcggcctcctgtgtgaaattgttatccgctttaattaa
vii) 플라스미드를 생산하는 방법
본 발명의 플라스미드는 당해 기술분야의 통상의 분자 생물학 및 재조합 DNA 기술을 사용하여 제조될 수 있다. 이러한 기술은 문헌에서 충분히 설명되어 있다. 예를 들어, Sambrook, Fritsch & Maniatis, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition (1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York (herein "Sambrook et al., 1989"); DNA Cloning: A Practical Approach, Volumes I and II (D.N. Glover ed. 1985); F.M. Ausubel et al. (eds.), Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc. (1994) 참조.
공여체 박테리아 세포:
본 발명의 추가의 목적은 일정한 사본 수의 본 발명의 표적-항균-플라스미드를 포함하는 공여체 박테리아 세포이다.
본 발명의 공여체 박테리아 세포는 또한 접합 전달 유전자를 포함하고 따라서 전형적으로 일정한 사본 수의 접합 플라스미드를 포함한다. 접합 전달(tra) 유전자는 많은 접합 박테리아 플라스미드에서 특정되었다. 접합 전달에 민감한 숙주들의 범위를 부여하는 유전자 모듈들 간의 상호호환성은 그램-양성 및 그램-음성 종을 포함한다. 본 발명에서 사용하기에 적합한 특정된 tra 유전자의 예로는 하기로부터의 tra 유전자가 있다: (1) F(Firth, N., Ippen-Ihler, K. and Skurray, R. A. 1996, Structure and function of F factor and mechanism of conjugation. In: Escherichia coli and Salmonella, Neidhard et al., eds., ASM Press, Washington D.C.); (2) RP4(Nunez, B., Avila, P. and de la Cruz, 1997, Genes involved in conjugative DNA processing. Mol. Microbial. 24: 1157-1168); 및 (3) Ti(Ferrand, S. K., Hwang, I. and Cook, D. M. 1996, The tra region of Nopaline type Ti plasmid is a chimera with elements related to the transfer systems of RSF1010, RP4 and F. J. Bacteriol. 178: 4233-4247).
일부 구현예에서, 본 발명의 공여체 박테리아 세포는 일정한 사본 수의 F 인자 및 일정한 사본 수의 플라스미드 F의 전달 기원을 포함하는 표적-항균-플라스미드를 포함한다.
일부 구현예에서, 본 발명의 공여체 박테리아 세포는 일정한 사본 수의 RP4 플라스미드 및 일정한 사본 수의 플라스미드 RP4의 전달 기원을 포함하는 표적-항균-플라스미드를 포함한다.
일부 구현예에서, 공여체 박테리아 세포는 아시도박테리아세아(Acidobacteriaceae), 악티노마이세타세아(Actinomycetaceae), 악티노폴리스포라세아(Actinopolysporaceae), 코리네박테리아세아(Corynebacteriaceae), 고르도니아세아(Gordoniaceae), 마이코박테리아세아(Mycobacteriaceae), 노카르디아세아(Nocardiaceae), 브레비박테리아세아(Brevibacteriaceae), 셀룰로모나다세아(Cellulomonadaceae), 데메퀴나세아(Demequinaceae), 마이크로박테리아세아(Microbacteriaceae), 마이크로코카세아(Micrococcaceae), 프로미크로모노스포라세아(Promicromonosporaceae), 아크로박테라세아(Aarobacteraceae), 마이크로모노스포라세아(Micromonosporaceae), 노카르디아세아(Nocardioidaceae), 프로피오니박테리아세아(Propionibacteriaceae), 악티노신넴마타세아(Actinosynnemataceae), 슈도노카르디아세아(Pseudonocardiaceae), 스트렙토마이세타세아(Streptomycetaceae), 노카르디옵사세아(Nocardiopsaceae), 스트렙토스포란기아세아(Streptosporangiaceae), 써모모노스포라세아(Thermomonosporaceae), 비피도박테리아세아(Bifidobacteriaceae), 박테로이다세아(Bacteroidaceae), 마리닐라빌리아세아(Marinilabiliaceae), 모르피로모나다세아(Morphyromonadaceae), 사이클로박테리아세아(Cyclobacteriaceae), 사이포파가세아(Cytophagaceae), 플람메오비르가세아(Flammeovirgaceae), 로도써마세아(Rhodothermaceae), 블라타박테리아세아(BlattabacteriaceaeBlattabacteriaceae), 크라이오모르파세아(Cryomorphaceae), 플라보박테리아세아(Flavobacteriaceae), 쉴레이페리아세아(Schleiferiaceae), 키티노파가세아(Chitinophagaceae), 사프로스피라세아(Saprospiraceae), 스핑고박테리아세아(Sphingobacteriaceae), 클라미디아세아(Chlamydiaceae), 파라클라미디아세아(Parachlamydiaceae), 심카니아세아(Simkaniaceae), 와딜라세아(Waddliaceae), 바실라세아(Bacillaceae), 리스테리아세아(Listeriaceae), 파에니바실라세아(Paenibacillaceae), 플란노코카세아(Planococcaceae), 스타필로코카세아(Staphylococcaceae), 아에로코카세아(Aerococcaceae), 카르보박테리아세아(Carnobacteriaceae), 엔테로코카세아(Enterococcaceae), 락토바실라세아(Lactobacillaceae), 류코노스토카세아(Leuconostocaceae), 스트렙토코카세아(Streptococcaceae), 크로스트리디아세아(Clostridiaceae), 유박테리아세아(Eubacteriaceae), 헬리오빅테리아세아(Heliobacteriaceae), 펩토코카세아(Peptococcaceae), 루미노코카세아(Ruminococcaceae), 카울로박테라세아(Caulobacteraceae), 하이포모나다세아(Hyphomonadaceae), 브라디리조비아세아(Bradyrhizobiaceae), 브루셀라세아(Brucellaceae). 하이포마이크로비아세아(Hyphomicrobiaceae), 메틸로박테리아세아(Methylobacteriaceae), 리조비아세아(Rhizobiaceae), 크산토박테라세아(Xanthobacteraceae), 로도박테라세아(Rhodobacteraceae), 아세토박테라세아(Acetobacteraceae), 로도스피릴라세아(Rhodospirillaceae), 알칼리게나세아(Alcaligenaceae), 버크홀데리아세아(Burkholderiaceae), 코마모나다세아(Comamonadaceae), 옥살로박테라세아(Oxalobacteraceae), 나이세리아세아(Neisseriaceae), 스피릴라세아(Spirillaceae), 로도사이클라세아(Rhodocyclaceae), 디술포박테라세아(Desulfobacteraceae), 시스토박테라세아(Cystobacteraceae), 믹소코카세아(Myxococcaceae), 난노시스타세아(Nannocystaceae), 파셀리시스티다세아(Phaselicystidaceae), 폴리앙기아세아(Polyangiaceae), 산다라시나세아(Sandaracinaceae), 신트로파세아(Syntrophaceae), 신트로포박테라세아(Syntrophobacteraceae), 신트로포랍다세아(Syntrophorhabdaceae), 캄필로박테라세아(Campylobacteraceae), 헬리코박테라세아(Helicobacteraceae), 아시디티오바실라세아(Acidithiobacillaceae), 아에로모나다세아(Aeromonadaceae), 숙시니비브리오나세아(Succinivibrionaceae), 알테로모나다세아(Alteromonadaceae), 셀레리나탄티모나다세아(Celerinatantimonadaceae), 콜웰리아세아(Colwelliaceae), 페리모나다세아(Ferrimonadaceae), 이디오마리나세아(Idiomarinaceae), 모리텔라세아(Moritellaceae), 슈도알테로모나다세아(Pseudoalteromonadaceae), 사이크로모나다세아(Psychromonadaceae), 쉐바넬리아세아(Shewanellaceae), 크로마티아세아(Chromatiaceae), 엑토티오로도스피라세아(Ectothiorhodospiraceae), 그라뉼로시코카세아(Granulosicoccaceae), 엔테로박테리아세아(Enterobacteriaceae), 콕시엘라세아(Coxiellaceae), 레지오넬라세아(Legionellaceae), 알카니보라카세아(Alcanivoracaceae), 하헬라세아(Hahellaceae), 할로모나다세아(Halomonadaceae), 리토리콜라세아(Litoricolaceae), 파스튜렐라세아(Pasteurellaceae), 모락셀라세아(Moraxellaceae), 슈도모나다세아(Pseudomonadaceae), 비브리오나세아(Vibrionaceae), 네브스키아세아(Nevskiaceae), 시노박테라세아(Sinobacteraceae), 토모나다세아(thomonadaceae), 브라키스피라세아(Brachyspiraceae), 브레비네마타세아(Brevinemataceae), 렙토스피라세아(Leptospiraceae), 스피로키타세아(Spirochaetaceae), 할로플라스마타세아(Haloplasmataceae) 및 마이코플라스마타세아(Mycoplasmataceae) 과들로 이루어지는 군으로부터 선택된다.
일부 구현예에서, 공여체 박테리아 세포는 스트렙토마이세스 암보파시엔스(Streptomyces ambofaciens), 스트렙토마이세스 아베르미틸리스(Streptomyces avermitilis), 스트렙토마이세스 카프레올루스(Streptomyces capreolus), 스트렙토마이세스 카르시노스타티쿠스(Streptomyces carcinostaticus), 스트렙토마이세스 세르비누스(Streptomyces cervinus), 스트렙토마이세스 클라불리게루스(Streptomyces clavuligerus), 스트렙토마이세스 다바웬시스(Streptomyces davawensis), 스트렙토마이세스 프라디에(Streptomyces fradiae), 스트렙토마이세스 그리세우스(Streptomyces griseus), 스트렙토마이세스 하이그로스코피쿠스(Streptomyces hygroscopicus), 스트렙토마이세스 라벤둘레(Streptomyces lavendulae), 스트렙토마이세스 리비단스(Streptomyces lividans), 스트렙토마이세스 나탈렌시스(Streptomyces natalensis), 스트렙토마이세스 노우르세이(Streptomyces noursei), 스트렙토마이세스 가나마이세티쿠스(Streptomyces kanamyceticus), 스트렙토마이세스 노도숨(Streptomyces nodosum), 스트렙토마이세스 츠쿠바엔시스(Streptomyces tsukubaensis), 스트렙토마이세스 종(Streptomyces sp.), 스트렙토마이세스 코엘리컬러(Streptomyces coelicolor), 스트렙토마이세스 신나모넨시스(Streptomyces cinnamonensis), 스트렙토마이세스 플라텐시스(Streptomyces platensis), 스트렙토마이세스 리모수스(Streptomyces rimosus), 스트렙토마이세스 스펙타빌리스(Streptomyces spectabilis), 스트렙토마이세스 베르티실루스(Streptomyces verticillus), 스트렙토마이세스 베네주엘레(Streptomyces venezuelae), 스트렙토마이세스 비올라세오니거(Streptomyces violaceoniger), 스트렙토마이세스 비올라세오루베르(Streptomyces violaceoruber), 스트렙토마이세스 모바랜시스(Streptomyces mobaraensis), 스트렙토마이세스 페우세티쿠스(Streptomyces peuceticus), 스트렙토마이세스 코에룰레오루비두스(Streptomyces coeruleorubidus), 악티노마이세스 보비스(Actinomyces bovis), 악티노마이세스 보우데니이(Actinomyces bowdenii), 악티노마이세스 카니스(Actinomyces canis), 악티노마이세스 카툴리(Actinomyces catuli), 악티노마이세스 콜레오카니스(Actinomyces coleocanis), 악티노마이세스 유로파에우스(Actinomyces europaeus), 악티노마이세스 푼케이(Actinomyces funkei), 악티노마이세스 게오르기에(Actinomyces georgiae), 악티노마이세스 홍콩겐시스(Actinomyces hongkongensis), 악티노마이세스 이스라엘리이(Actinomyces israelii), 악티노마이세스 마리맘말리움(Actinomyces marimammalium), 악티노마이세스 메이에리(Actinomyces meyeri), 악티노마이세스 오리콜라(Actinomyces oricola), 악티노마이세스 슬락키이(Actinomyces slackii), 악티노마이세스 스트렙토마이시니(Actinomyces streptomycini), 악티노마이세스 수이스(Actinomyces suis), 악티노플라네스 테이코마이세티쿠스(Actinoplanes teichomyceticus), 악티노신네마 프레티오숨(Actinosynnema pretiosum), 슈도노카르디아 오토트로피카(Pseudonocardia autotrophica), 아미콜라톱시스 메디테라네이(Amycolatopsis mediteranei), 아미콜라톱시스 오리엔탈리스(Amycolatopsis orientalis), 사카로폴리스포라 에리타라에(Saccharopolyspora eritharaea), 사카로폴리스포라 히르수타(Saccharopoylspora hirsuta), 슈도모나스 아에루기노사(Pseudomonas aeruginosa), 슈도모나스 푸티다(Pseudomonas putida), 슈도모나스 시린게(Pseudomonas syringae), 크산토모나스 오리세(Xantomonas orysae), 버크홀데리아 세노파시아(Burkholderia cenocepacia), 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis), 바실러스 리케니포르미스(Bacilllus licheniformis), 바실러스 메가테리움(Bacillus megaterium), 믹소코쿠스 크산투스(Mixococcus xantus), 락토바실러스 아시도필루스(Lactobacillus acidophilus), 락토바실러스 카제이(Lactobacillus casei), 락토바실러스 브레비스(Lactobacillus brevis), 락토코쿠스 락티스(Lactococcus lactis), 브레비박테리움 카제이(Brevibacterium casei), 브레비박테리움 옥시단스(Brevibacterium oxydans), 비피도박테리움 비피둠(Bifidobacterium bifidum), 비피도박테리움 롱굼(Bifidobacterum longum), 코마모나스 종(Commamonas sp.), 코리네박테리움 글루타미쿰(Corynebacterium glutamicum), 로도코쿠스 종(Rhodococcus sp.), 세라티아 마레센스(Serratia marescens), 리조비움 트리폴리이(Rhizobium trifolii), 리조비움 라디오박터(Rhizobium radiobacter), 스포란지움 셀룰로숨(Sporangium cellulosum), 콘드로마이세스 크로카투스(Chondromyces crocatus), 글루코노박터 옥시단스(Gluconobacter oxydans), 마이크로모노스포라 그리세(Micromonospora grisea), 마이크로코쿠스 종(Micrococcus sp.), 마이크로모노스포라 로도랑게(Micromonospora rhodorangea), 마이크로모노스포라 지오넨시스(Micromonospora zionensis), 마이크로모노스포라 푸르푸레(Micromonospora purpurea), 마이크로모노스포라 인요엔시스(Micromonospora inyoensis), 마이크로모노스포라 사가미엔시스(Micromonospora sagamiensis), 팔노모노스포라 파롱토스포라(Palnomonospora parontospora), 닥틸로스포란지움 마츠자키엔세(Dactylosporangium matsuzakiense), 노카르디아 락탐두란스(Nocardia lactamdurans), 바실러스 콜리스티누스(Bacillus colistinus), 플라노비스포라 로세(Planobispora rosea), 스트렙토마이세스 아레네(Streptomyces arenae), 스트렙토마이세스 안티비오티쿠스(Streptomyces antibioticus), 스트렙토마이세스 카수가엔시스(Streptomyces kasugaensis), 스트렙토마이세스 미타카엔시스(Streptomyces mitakaensis), 스트렙토마이세스 비키니엔시스(Streptomyces bikiniensis), 스트렙토마이세스 알보니거(Streptomyces alboniger), 스트렙토마이세스 테네브라리우스(Streptomyces tenebrarius), 바실러스 서큘란스(Bacillus circulans), 스트렙토마이세스 리보시디피쿠스(Streptomyces ribosidificus), 바실러스 콜리스티누스(Bacillus colistinus), 스트렙토마이세스 텐지마리엔시스(Streptomyces tenjimariensis) 및 스트렙토마이세스 팍툼(Streptomyces pactum)으로 이루어지는 군으로부터 선택된다.
일부 구현예에서, 본 발명의 공여체 박테리아 세포는 비-병원성이다. 공여체 박테리아 세포는 실제로 인간을 포함하여 온혈 동물의 신체와 연관되는 수 천의 비-병원성 박테리아들 중의 임의의 하나일 수 있다. 바람직하게는, 신체의 비-멸균 부위(예를 들어, 피부, 소화관, 비뇨생식기 부위, 입, 비강, 목 및 상기도, 귀 및 눈)에 집락하는 비-병원성 박테리아가 공여체 박테리아 세포로서 활용되고, 본 발명의 방법은 신체의 이들 부분의 박테리아 감염을 치료하는 데 사용된다. 특히 바람직한 공여체 박테리아 종의 예에는 하기들이 포함되나, 이들로 제한되는 것은 아니다: (1) 대장균의 비-병원성 균주(E. coli F18 및 E. coli strain Nissle 1917), (2) 여러 종의 락토바실러스(락토바실러스 카제이, 락토바실러스 플란타룸(L. plantarum), 락토바실러스 파라카제이(L. paracasei), 락토바실러스 아시도필루스, 락토바실러스 페르멘툼(L. fermentum), 락토바실러스 제에(L. zeae) 및 락토바실러스 가세리(L. gasseri)와 같은), (3) 락토코쿠스(Lactococcus), 비피도박테리아(Bifidobacteria), 유박테리아(Eubacteria)와 같은 다른 비병원성 또는 프로바이오틱 피부 집락 박테리아 또는 위장 집락 박테리아(GI colonizing bacteria) 및 (4) 사멸할 운명이나 여전히 플라스미드를 전달할 수 있는 핵양체 세포인 박테리아 미니-세포(예를 들어, Adler et al (1970) Proc. Nat. Acad, Sci USA 57; 321-326; Frazer et al. (1975) Current Topics in Microbiology and Immunology 69: 1-84; Curtiss III에 허여된 미국 특허 제4,968,619호 참조).
일부 구현예에서, 공여체 박테리아 세포는 프로바이오틱 세포이다. 일부 구현예에서, 본 발명의 프로바이오틱 세포는 생존 프로바이오틱 세포이다. 일부 구현예에서, 본 발명의 프로바이오틱 박테리아 균주는 식품 등급 박테리아 즉 식품에서 사용되고 일반적으로 식품으로 사용하기에 안전한 것으로 고려되는 박테리아로부터 선택된다. 일부 구현예에서, 프로바이오틱 박테리아 균주는 그램 음성 균주이다. 일부 구현예에서, 프로바이오틱 박테리아 균주는 엔테로박테리아세아 과의 구성원이다. 일부 구현예에서, 프로바이오틱 박테리아 균주는 대장균 균주이다. 일부 구현예에서 본 발명의 교시에 따른 용도를 위한 프로바이오틱 대장균 균주에는 프로바이오틱 활성을 발휘하는 비-병원성 대장균 균주를 포함한다. 프로바이오틱 대장균 균주의 예로는 프로바이오틱 대장균 균주 BU-230-98, ATCC 기탁 번호 제202226호(DSM 12799)가 있으며, 이는 공지된, 상용적으로 획득가능한 프로바이오틱 대장균 균주 M-17의 단리물이다. 비 병원성의 예로는 E. coli Nissle 1917이 있다. 프로바이오틱으로 알려져 있지 않은 대장균 균주의 예로는 실험실 대장균 균주 K12가 있다.
본 발명의 플라스미드는 당해 기술분야에서 통상의 기술자에게 공지된 임의의 방법에 의해 공여체 박테리아 세포 내로 도입될 수 있다. 형질전환의 예시적인 방법에는 활성화 세포(competent cell)의 전기천공을 통한 형질전환, 활성화 세포에 의한 수동 섭취, 활성화 세포의 화학적 형질전환 뿐만 아니라 핵산을 세포 내로 도입하는 결과를 가져오는 임의의 다른 전기적, 화학적, 물리적(기계적) 및/또는 생물학적 메카니즘과 이들의 임의의 조합을 포함된다. 원핵 생물을 형질전환시키기 위한 절차는 당해 기술분야에서 충분히 공지되어 있고 통상적이며 문헌을 통해 기술되어 있다(예를 들어, Jiang et al. 2013. Nat. Biotechnol. 31:233-239; Ran et al. Nature Protocols 8:2281-2308 (2013) 참조).
방법:
본 발명은 또한 복수의 수신체 박테리아 세포 내에서 뉴클레아제 및 하나 이상의 가이드 RNA 분자를 발현하도록 구성되는 일정한 사본 수의 본 발명의 표적-항균-플라스미드를 포함하는 복수의 공여체 박테리아 세포에 상기 복수의 수신체 박테리아 세포를 노출시키는 것을 포함하며 여기에서 상기 복수의 수신체 박테리아 세포 내의 상기 뉴클레아제 및 가이드 RNA 분자가 상기 복수의 수신체 박테리아 세포에 치명적인, 상기 복수의 수신체 박테리아 세포를 죽음에 이르게 하는 방법에 관한 것이다.
전형적으로, 수신체 박테리아 세포는 대상체의 신체 전체에 걸쳐서, 그러나 특히 피부 상 또는 소화관, 비뇨생식기 부위, 입, 비강, 목 및 상기도, 눈 및 귀 안에 분산되어 있는 병원성 박테리아이다. 슈도모나스 아에루기노사, 대장균, 스타필로코쿠스 뉴모니아(Staphylococcus pneumoniae) 및 다른 종들, 엔테로박터 종(Enterobacter spp.), 엔테로코쿠스 종(Enterococcus spp.) 및 마이코박테리움 튜베르쿨로시스(Mycobacterium tuberculosis)의 병원성 균주가 특히 관심 대상이다.
다른 것들 또한 본 명세서에서 기술되며, 여전히 다른 것들이 당해 기술분야에서 통상의 기술자에게는 쉽게 이해될 것이나 전형적으로는 클로스트리디움 디피실, 대장균, 클로스트리디움 테타니(Clostridium tetani), 헬리코박터 파이로리(Helicobacter pylori), 푸소박테리움 뉴클레아툼(Fusobacterium nucleatum), 가드네렐라 바기니티스(Gardnerella vaginitis), 포르피로모나스 깅기발리스(Porphyromonas gingivalis), 아그레가티박터 악티노마이세템코미탄스(Aggregatibacter actinomycetemcomitans), 리스테리아 모노사이토게네스(Listeria monocytogenes), 스타필로코쿠스 아우레우스(Staphylococcus aureus), 캄필로박터 제주니(Campylobacter jejuni), 비브리오 벌니피쿠스(Vibrio vulnificus), 살모넬라 티피(Salmonella typhi), 클로스트리디움 보툴리눔, 마이코박테리움 튜베르쿨로시스, 마이코박테리움 레프라에(Mycobacterium leprae), 마이코박테리움 레프로마토시스(Mycobacterium lepromatosis), 코리네박테리움 디프테리아, 클렙시엘라 뉴모니아, 아시네토박터 바우만니이(Acinetobacter baumannii), 스트렙토코쿠스 뮤탄스(Streptococcus mutans), 스타필로코쿠스 아우레우스를 포함하나 이로 제한되지 않는 B군 스트렙토코치(group B streptococci), 스트렙토코쿠스 아갈락티에(Streptococcus agalactiae), 스트렙토코쿠스 뉴모니아(Streptococcus pneumonia), 엔테로코쿠스 패칼리스(Enterococcus faecalis)를 포함하나 이로 제한되지 않는 엔테로코쿠스 종이 포함된다.
본 발명의 방법은 다양한 박테리아 감염 또는 박테리아와 연관되는 바람직하지 않은 상태를 치료하는 데 특히 적합하다. 일부 구현예에서, 박테리아 감염은 위장관의 감염, 비뇨생기기관의 감염, 예를 들어 비염, 편도선염, 인후염, 기관지염, 폐렴 같은 호흡기관의 감염, 예를 들어 신염, 간염, 복막염, 심내막염, 뇌수막염, 골수염 같은 내부 장기의 감염, 눈 귀의 감염 뿐만 아니라 피부 및 피하 감염, 설사, 피부 장애, 독성쇼크 증후군, 균혈증, 패혈증 및 결핵이다. 일부 구현예에서, 감염은 그램-양성 박테리아 또는 그램-음성 박테리아에 의해 야기된다. 일부 구현예에서, 박테리아 감염은 스타필로코쿠스(Staphylococcus), 스트렙토코쿠스(Streptococcus), 슈도모나스(Pseudomonas), 에스테리키아(Escherichia), 살모넬라(Salmonella), 헬리코박터(Helicobacter), 나이세리아(Neisseria), 캄필로박터(Campylobacter), 클라미디아(Chlamydia), 클로스트리디움(Clostridium), 비브리오(Vibrio), 트레포네마(Treponema), 마이코박테리움(Mycobacterium), 클렙시엘라(Klebsiella), 악티노마이세스(Actinomyces), 박테리오이데스(Bacterioides), 브로데텔라(Bordetella), 보렐리아(Borrelia), 브루셀라(Brucella), 코리네박테리움(Corynebacterium), 디플로코쿠스(Diplococcus), 엔테로박터(Enterobacter), 푸소박테리움(Fusobacterium), 렙토스피라(Leptospira), 리스테리아(Listeria), 파스튜렐라(Pasteurella), 프로테우스(Proteus), 리케챠(Rickettsia), 시겔라(Shigella), 스패로포루스(Sphaerophorus), 예르시니아(Yersinia) 또는 이들의 조합으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 박테리아에 의해 야기된다. 박테리아 호흡기관 감염을 야기하는 박테리아의 예에는 클라미디아 종(예를 들어, 클라미디아 뉴모니아(Chlamydia pneumoniae)), 클렙시엘라 종(Klebsiella species), 해모필루스 인플루엔자(Haemophilus influenzae), 레지오넬라 과(Legionallaceae family), 마이코박테리아(mycobacteria)(예를 들어, 마이코박테리움 튜베르쿨로시스(Mycobacterium tuberculosis), 파스튜렐라 과(Pasteurellaceae family), 슈도모나스 종, 스타필로코쿠스(예를 들어, 메티실린 내성 스타필로코쿠스 아우레우스 및 스타필로코쿠스 파이로게네스), 스트렙토코쿠스(예를 들어, 스트렙토코쿠스 엔테리티디스(Streptococcus enteritidis), 스트렙토코쿠스 파시에(Streptococcus Fasciae) 및 스트렙토코쿠스 뉴모니아)가 포함되나, 이들로 제한되는 것은 아니다. 장내 감염을 야기하는 박테리아의 예에는 박테로이다세아 과, 캄필로박터 종, 클라미디아 종, 클로스트리디움, 엔테로박테리아세아 과(예를 들어, 시트로박터 종(Citrobacter species), 에드워드시엘라(Edwardsiella), 엔테로박터 에로게네스(Enterobacter aerogenes), 대장균, 클렙시엘라 종, 살모넬라 종(Salmonella species) 및 시겔라 플렉스네리(Shigella flexneri)), 가르디넬라 과(Gardinella family), 리스테리아 종, 파스튜렐라 과, 슈도모나스 종, 스트렙토코쿠스(예를 들어, 스트렙토코쿠스 엔테리티디스, 스트렙토코쿠스 파시에 및 스트렙토코쿠스 뉴모니아), 헬리코박터 과가 포함되나, 이들로 제한되는 것은 아니다. 이러한 용도의 다른 대표적인 예에는 (1) 해모필루스 종에 의해 야기되는 결막염 및 슈도모나스 아에루기노사에 의해 야기되는 각막궤양; (2) 슈도모나스 아에루기노사에 의해 야기되는 외이도염(otititis extema); (3) 여러 그램-양성 구균(Gram-positive cocci) 및 그램-음성 막대균(Gram-negative rods)에 의해 야기되는 만성 부비강염; (4) 슈도모나스 아에루기노사와 연관되는 낭포성 섬유증; (5) 헬리코박터 파이로리(궤양), 대장균, 살모넬라 티피뮤리움(Salmonella typhimurium), 캄필로박터 및 시겔라 종에 의해 야기되는 장염; (6) 많은 종들에 대한 예방적인 수단으로서 외과적 및 비-외과적 둘 모두의 개방성 상처; (7) 슈도모나스 아에루기노사 또는 다른 그램-음성 병독소를 제거하기 위한 소작(burns); (8) 프로피오니박터 아크네(Propionobacter acnes)에 의해 야기되는 여드름; (9) 메티실린 내성 스타필로코쿠스 아우레우스(MSRA)에 의해 야기되는 코 및 피부 감염; (10) 주로 그램-양성의 혐기성 박테리아에 의해 야기되는 체취(즉, 체취제거제에서의 용도); (11) 가드네렐라 바기날리스(Gardnerella vaginalis) 및 다른 혐기성 균과 연관되는 세균성 질염; 및 (12) 여러 유기체에 의해 야기되는 치은염 및/또는 충치의 치료가 포함된다.
본 발명은 또한 치료를 필요로 하는 대상체에서의 감염을 제거하기 위한 항생제의 임상 효능을 향상시키기 위한 방법에서 사용하기 위한 본 발명의 공여체 박테리아 세포의 용도에 관한 것으로, 즉 본 발명의 공여체 박테리아 세포가 단독의 항생제 치료에 비해 박테리아의 제거 및 감염으로부터의 회복을 향상시킨다.
본 발명의 추가의 목적은 항생제 내성 유전자를 포함하는 박테리아 세포에 의해 야기되는 대상체에서의 감염을 치료하는 방법에 관한 것이며, 여기에서 본 방법은 항생제 내성 유전자를 표적하기에 적합한 하나 이상의 가이드 RNA 분자를 암호화하는 일정한 사본 수의 표적-항균-플라스미드를 포함하는 박테리아 공여체 세포의 치료학적 유효량과 함께 항생제의 치료학적 유효량을 대상체에 투여하고, 그에 의해 항생제 내성 유전자를 비활성화하고 박테리아 세포를 상기 항생제에 대해 민감하게 하는 것을 포함한다.
특히, 하나 이상의 항생제 내성 유전자(들)을 표적하는 공여체 박테리아 세포와 항생제의 조합은 치료 개시 이전의 감염에 의해 유도되는 손상을 수복하는 숙주의 능력을 향상시킬 수 있다. 따라서 본 발명의 조합은 이환율(morbidity)을 감소시킬 수 있다. 본 발명에 따르면, 하나 이상의 항생제 내성 유전자(들)을 표적하는 공여체 박테리아 세포는 박테리아 감염에 대한 항생제의 활성을 강화시킨다. 용어 "강화하다(potentiate)"는, 본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 항생제의 적어도 하나의 생물학적 영향 또는 활성을 향상시키거나 증가시켜 (i) 강화되지 않은 경우에 동일한 농도 또는 양의 항생제로부터 야기될 수 있는 생물학적 영향 또는 활성에 비해 항생제가 강화되는 경우에 주어진 농도 또는 양의 항생제가 더 큰 생물학적 영향 또는 활성의 결과를 가져오거나; (ii) 항생제가 강화되지 않은 경우에 비해 항생제가 강화된 경우 특정한 생물학적 영향 또는 활성을 달성하는 데 더 적은 농도 또는 양의 항생제가 필요하거나; (iii) (i)과 (ii) 둘 모두가 되도록 하는 것을 의미한다. 특히, 공여체 박테리아 세포가 항생제와 조합되어: -1- 공여체 박테리아 세포와 조합되는 경우 항생제에 접근가능하지 않은 특정한 영역(specific niche)(즉 동일한 세포의 세포 내 구간(intracellular compartments))에 영향을 주어 항생제가 작용하도록 할 수 있고; -2- 감염의 항생제 치료로부터의 수복 단계(조직 수복, 감염된 조직의 생리학적 기능의 회복)에 대해 영향을 줄 수 있고; -3- 부작용(예를 들어 장, 피부, 호흡기관 등에서의 미생물총의 변화)을 제한할 수 있고 그리고 -4- (종종 미생물총 박테리아에 의한 내성의 획득으로 인한) 항생제 내성의 발달을 억제할 수 있다.
일부 구현예에서, 항생제는 아미노글리코시드(aminoglycosides), 베타-락탐(beta-lactams), 퀴놀론(quinolones) 또는 플루오로퀴놀론(fluoroquinolones), 마크롤리드(macrolides), 술폰아미드(sulfonamides), 술파메톡사졸(sulfamethaxozoles), 테트라사이클린(tetracyclines), 스트렙토그라민(streptogramins), 옥사졸리디논(oxazolidinones)(리네졸리드(linezolid)와 같은), 리파마이신(rifamycins), 글리코펩티드(glycopeptides), 폴리믹신(polymixins), 리포-펩티드(lipo-peptide) 항생제로 이루어지는 군으로부터 선택된다. 특히, 항생제는 베타-락탐 중에서 선택된다. 베타-락탐의 모든 구성원은 베타-락탐 고리 및 카르복실 기를 보유하여, 이들의 약동학 및 작용 기전 둘 모두에서 55가지의 유사성을 야기한다. 임상적으로 유용한 베타-락탐 대부분은 페니실린 군 또는 세팔로스포린(cephalosporin) 군들 중 어느 하나에 속하며, 세파마이신(cefamycins) 및 옥사세펨(oxacephems)을 포함한다. 베타-락탐은 또한 카바페넴(carbapenems) 및 모노박탐(monobactams)을 포함한다. 일반적으로 말해서, 베타-락탐은 박테리아 세포벽 합성을 억제한다. 보다 구체적으로, 이들 항생제는 박테리아 원형질이 그의 보호망으로부터 주변 저삼투압성 매질(hypotonic medium)로 흐를 수 있게 하는 세포벽의 펩티도글리칸 망(peptidoglycan net)에서의 '절단'을 야기한다. 계속해서 유체는 네이크드 65 원형질(naked 65 protoplast)(그의 벽이 없는 세포)에 축적되고, 결국 파열되어 유기체의 사멸을 유도한다. 기계론적으로, 베타-락탐은 효소 표적 부위의 하이드록실 기에 부착된 개방 락탐 고리의 카르복실과 안정한 에스테르를 형성함으로써 D-알라닐-D-알라닌(D-alanyl-D-alanine) 트랜스펩티다아제 활성을 억제함으로써 작용한다. 베타-락탐은 매우 효과적이고 전형적으로 독성이 낮다. 하나의 군으로서, 이러한 약물은 여러 그램-양성, 그램-음성 및 혐기성 유기체에 대해 활성이다. 이 범주에 속하는 약물에는 2-(3-알라닐)클라밤(2-(3-alanyl)clavam), 2-하이드록시메틸클라밤(2-hydroxymethylclavam), 7-메톡시세팔로스포린(7-methoxycephalosporin), 에피-티에나마이신(epi-thienamycin), 아세틸-티에나마이신(acetyl-thienamycin), 아목실린(amoxicillin), 아팔실린(apalcillin), 아스폭시실린(aspoxicillin), 아지도실린(azidocillin), 아즐로실린(azlocillin), 아즈트레오남(aztreonam), 바캄피실린(bacampicillin), 블라페넴(blapenem), 카르베니실린(carbenicillin), 카르페실린(carfecillin), 카르인다실린(carindacillin), 카르페티마이신 에이(carpetimycin A) 및 카르페티마이신 비, 세파세트릴(cefacetril), 세파클로르(cefaclor), 세파트록실(cefadroxil), 세팔렉신(cefalexin), 세팔로글리신(cefaloglycin), 세팔로리딘(cefaloridine), 세팔로틴(cefalotin), 세파만돌(cefamandole), 세파피린(cefapirin), 세파트리진(cefatrizine), 세파제돈(cefazedone), 세파졸린(cefazolin), 세프부페라존(cefbuperazone), 세프카펜(cefcapene), 세프디니르(cefdinir), 세프디토렌(cefditoren), 세페핌(cefepime), 세페타메트(cefetamet), 세픽심(cefixime), 세피넨옥심(cefinenoxime), 세피네타졸(cefinetazole), 세프미녹스(cefminox), 세프몰렉신(cefmolexin), 세포디짐(cefodizime), 세포니시드(cefonicid), 세포페라존(cefoperazone), 세포라미드(ceforamide), 세포셀리스(cefoselis), 세포탁심(cefotaxime), 세포테탄(cefotetan), 세포티암(cefotiam), 세폭시틴(cefoxitin), 세포조프란(cefozopran), 세프피라미드(cefpiramide), 세프피롬(cefpirome), 세프포독심(cefpodoxime), 세프프로질(cefprozil), 세프퀴놈(cefquinome), 세프라딘(cefradine), 세프록사딘(cefroxadine), 세프술로딘(cefsulodin), 세프타지딤(ceftazidime), 세프테람(cefteram), 세프테졸(ceftezole), 세프티부텐(ceftibuten), 세프티족심(ceftizoxime), 세프트리악손(ceftriaxone), 세푸록심(cefuroxime), 세팔로스포린 씨(cephalosporin C), 세파마이신 에이(cephamycin A), 세파마이신 씨(cephamycin C), 세팔로틴(cephalothin), 키티노보린 에이(chitinovorin A), 키티노보린 비(chitinovorin B), 키티노보린 씨(chitinovorin C), 시클라실린(ciclacillin), 클로메토실린(clometocillin), 클록사실린(cloxacillin), 사이클로세린(cycloserine), 디옥시 플루라시도마이신 비(deoxy pluracidomycin B) 및 디옥시 플루라시도마이신 씨, 디클록사실린(dicloxacillin), 디하이드로 플루라시도마이신 씨(dihydro pluracidomycin C), 에피실린(epicillin), 에피티에나마이신 디(epithienamycin D), 에피티에나마이신 이 및 에피티에나마이신 에프, 에르타페넴(ertapenem), 파로페넴(faropenem), 플로목세프(flomoxef), 플루클록사실린(flucloxacillin), 헤타실린(hetacillin), 이미페넴(imipenem), 레남피실린(lenampicillin), 롤라카르베프(loracarbef), 메실리남(mecillinam), 메로페넴(meropenem), 메탐피실린(metampicillin), 메티실린(meticillin)(또한 메치실린(methicillin)이라고도 함), 메즐로실린(mezlocillin), 목살락탐(moxalactam), 나프실린(nafcillin), 노르티티에나마이신(northienamycin), 옥사실린(oxacillin), 파니페넴(panipenem), 페나메실린(penamecillin), 페니실린 지(penicillin G), 페니실린 엔 및 페니실린 브이, 페네티실린(phenethicillin), 피페라실린(piperacillin), 포밤피실린(povampicillin), 피브세팔렉신(pivcefalexin), 포브메실리남(povmecillinam), 피브메실리남(pivmecillinam), 플루라시도마이신 비(pluracidomycin B), 플루라시도마이신 씨 및 플루라시도마이신 디, 프로피실린(propicillin), 사르목시실린(sarmoxicillin), 술박탐(sulbactam), 술타미실린(sultamicillin), 탈람피실린(talampicillin), 테모실린(temocillin), 테르코나졸(terconazole), 티에나마이신(thienamycin) 및 티카르실린(ticarcillin)이 포함된다. 보다 구체적으로, 카바페넴에는 예를 들어 승인된 항생제 이미페넴, 메로페넴, 에르타페넴, 도리페넴(Doripenem), 파니페넴/베타미프론(Panipenem/betamipron), 비아페넴(Biapenem) 및 실험실 항생제 라주페넴(Razupenem), 테비페넴(Tebipenem), 레나페넴(Lenapenem) 및 토모페넴(Tomopenem)이 포함된다.
일단 공여체 박테리아 세포가 생산되면, 세포는 그러한 치료를 필요로 하는 개체의 하나 이상의 선택된 병원체에 대해 보호하는 데 사용된다. 보호를 위해 표적 세포 집단 또는 조직에 따라, 본 발명의 공여체 박테리아 세포의 다음의 투여 모드가 고려된다: 국소, 입, 코, 폐/기관지(예를 들어, 흡입을 통해), 눈, 직장, 비뇨생식기관, 피하, 복강 및 정맥내. 공여체 박테리아 세포는 바람직하게는 치료되는 환자를 위해 선택된 투여 모드에 적합한 전달 비히클에 약제학적 제제로서 공급된다.
예를 들어, 공여체 박테리아 세포를 위장관에 또는 비강 통로로 전달하기 위해, 경구 섭취 또는 비강 에어로졸에 의하거나, 또는 급이(feeding)(단독으로 또는 대상체의 사료 또는 식품에 혼입되어)에 의한 투여 모드가 바람직하다. 일부 구현예에서, 본 발명의 공여체 박테리아 세포는 분말, 동결건조 제제로서 젤 캡슐에, 또는 식품 또는 음료 내로의 살포를 위해 벌크로 공급될 수 있다. 국소 적용을 위해서는, 공여체 박테리아 세포는 감염된 피부 표면 상에 펼칠 수 있도록 연고 또는 크림으로서 제형화될 수 있다. 연고 또는 크림 제형은 또한 좌약과 같은 다른 표준 제형과 함께 직장 또는 질 전달에 적합하다. 국소, 질 또는 직장 투여를 위한 적절한 제형은 의약 화학자에 충분히 공지되어 있다.
본 발명의 공여체 박테리아 세포에 대한 다른 용도가 또한 고려된다. 이러한 용도에는 하기와 같은 농업 및 원예업이 포함된다: (1) 육류 또는 다른 식품에 사용하여 병원성 박테리아를 제거하는 것; (2) 동물 사료(닭, 소)에 사용하여 생물 부담을 감소시키거나 또는 특정 병원성 유기체(예를 들어, 살모넬라)를 감소 또는 제거하는 것; (3) 어류에 사용하여 프로테우스(Proteus) 및 다른 유기체에 의해 야기되는 "생선비린내"를 방지하는 것; 및 (4) 절화(cut flowers)에 사용하여 시들음을 방지하는 것.
조성물:
본 발명의 추가의 목적은 일정량의 본 발명의 공여체 박테리아 세포를 포함하는 조성물에 관한 것이다.
일부 구현예에서, 본 발명의 조성물은 약제학적 조성물이다. 공여체 박테리아 세포를 포함하는 약제학적 제제는 투여의 용이성 및 투여량의 균일성을 위해 투여량 단위 형태(dosage unit form)로 제형화된다. 투여량 단위 형태는, 본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 치료를 받는 환자에 적합한 약제학적 제제의 물리적으로 이산된 단위를 의미한다. 각 투여량은 선택된 약제학적 담체와 함께 소정의 항균 효과를 생성하도록 계산된 일정량의 공여체 박테리아를 포함한다. 적절한 투여량 단위를 결정하기 위한 절차는 당해 기술분야에서 통상의 기술자에게 충분히 공지되어 있다. 투여량 단위는 환자의 체중에 기반하여 비례적으로 증가 또는 감소될 수 있다. 표적 세포 집단 또는 조직에서의 병원성 박테리아의 박멸을 달성하기 위한 적절한 농도는 당해 기술분야에서 공지된 바와 같은 투여량 농도 곡선 계산에 의해 결정될 수 있다. 국소적 적용을 위한 본 발명의 약제학적 조성물은, 예를 들어, 에어로졸, 크림, 연고, 로션 또는 산포제(dusting powder)와 같은 국소 사용에 적합한 형태일 수 있다. 본 명세서에서 제공되는 약제학적 조성물은 흡입에 의한 투여를 위해 제형화될 수 있다. 예를 들어, 조성물은 에어로졸, 미스트 또는 분말과 같은 형태일 수 있다. 따라서 본 명세서에서 기술되는 조성물은 예를 들어 디클로로디플루오로메탄(dichlorodifluoromethane), 트리클로로플루오로메탄(trichlorofluoromethane), 디클로로테트라플루오로에탄(dichlorotetrafluoroethane), 이산화탄소와 같은 적합한 추진제 또는 다른 적합한 가스와 함께 가압팩(pressurised packs) 또는 연무식 흡입기(nebuliser)로부터의 에어로졸 스프레이 분무(aerosol spray presentation)의 형태로 전달될 수 있다. 가압 에어로졸을 사용하는 경우, 투여량 단위는 계량된 양을 산출하기 위한 밸브를 제공함으로써 결정될 수 있다.
일부 구현예에서, 본 발명의 공여체 박테리아 세포는 공여체 박테리아 세포가 섭취에 의해(즉 경구로) 대상체에 투여되는 경우 위장에 대해 보호받도록 캡슐화된다. 따라서, 일부 구현예에서 본 발명의 공여체 박테리아 세포는 캡슐화된 형태로 조성물에 제형화되어 생존 시간을 유의미하게 개선되도록 한다. 이러한 경우에, 캡슐의 존재는 특히 위장관에서의 미생물의 분해를 지연 또는 방지할 수 있다. 본 구현예의 조성물이 장용-코팅(enterically-coated) 또는 시간-지연(time-released) 캡슐 또는 정제로 캡슐화될 수 있다는 것은 이해될 것이다. 장용 코팅은 캡슐/정제가 소장에 도달되는 것과 같은 시간이 될 때까지 위장관을 통과함에 따라 무손상으로(즉 용해되지 않은 상태로) 유지되도록 한다. 살아있는 박테리아 세포를 캡슐화하는 방법은 당해 기술분야에서 충분히 공지되어 있다(예를 들어, 미국 특허 제6,723,358호와 같이 General Mills Inc.에 허여된 미국 특허 참조). 예를 들어, 알긴산염 및 Hi-Maize™ 전분으로의 마이크로-캡슐화 후 동결-건조가 유제품 내의 박테리아 세포의 저장-수명을 연장하는 데 성공적인 것으로 입증되었다[예를 들어, Kailasapathy et al. Curr Issues Intest Microbiol. 2002 September; 3(2):39-48 참조]. 대안으로 아모르포팔루스 콘작(Amorphophallus konjac)으로부터 추출된 것과 같은 글루코만난 섬유로 캡슐화가 수행될 수 있다. 대안으로, 참기름 에멀젼 중의 생존 프로바이오틱의 포착이 또한 사용될 수 있다[예를 들어, Hou et al. J. Dairy Sci. 86:424-428 참조]. 일부 구현예에서, 장용 코팅을 위한 약제는 바람직하게는 유드라짓® 폴리머(Eudragit® polymers)와 같은 메타크릴산-알킬아크릴레이트 공중합체이다. 폴리(메트)아크릴레이트가 코팅 물질로서 특히 적합한 것으로 입증되었다. EUDRAGIT®은 아크릴산 및 메타크릴산의 에스테르로부터 파생된 공중합체에 대한 상표명이며, 그 특성은 관능 기들에 의해 결정된다. 개개 EUDRAGIT® 등급은 그의 중성, 염기성 또는 산성 기의 특성비율에서 그리고 그에 따라 물리화학적 특성에 있어서 상이하다. 상이한 EUDRAGIT® 폴리머의 숙련된 사용 및 조합은 다양한 제약 및 기술적 응용에서 제어 약물 방출을 위한 이상적인 해결책을 제공한다. EUDRAGIT®은 서방형 정제 및 펠릿 코팅을 위한 기능성 필름을 제공한다. 폴리머는 Ph.Eur., USP/NF, DMF 및 JPE와 같은 국제 약전들에 기술되어 있다. EUDRAGIT® 폴리머는 제어 약물 방출을 위한 하기의 가능성을 제공할 수 있다: 위장관 표적(위내성, 결장에서의 방출), 보호 코팅(맛 및 악취 차폐, 수분에 대한 보호) 및 지연 약물 방출(서방형 제형). EUDRAGIT® 폴리머는 수성 용액, 수성 분산액, 유기 용액 및 고체 물질을 포함하여 광범위한 상이한 농도 및 물리적인 형태로 획득가능하다. EUDRAGIT® 폴리머의 약제학적 특성은 그의 작용 기의 화학적 특성에 의해 결정된다.
일부 구현예에서, 본 발명의 공여체 박테리아 세포는 식품 조성물의 형태로 대상체에 투여된다. 따라서 본 발명의 하나의 추가의 양태는 일정량의 본 발명의 공여체 박테리아 세포를 포함하는 식품 조성물에 관한 것이다. 일부 구현예에서, 본 발명의 공여체 박테리아 세포를 포함하는 식품 조성물은 완전 식품 조성물, 식품 보충제, 기능식품 조성물 등으로부터 선택된다. 본 발명의 조성물은 식품 성분 및/또는 사료 성분으로서 사용될 수 있다. 일부 구현예에서, 본 발명의 공여체 박테리아 세포를 포함하는 식품 조성물은 적어도 하나의 프리바이오틱을 포함한다. "프리바이오틱(prebiotic)"은 장 내에서 본 발명의 공여체 박테리아 세포의 성장을 촉진하도록 의도된 식품 물질을 의미한다. 프리바이오틱은 올리고당으로 이루어지는 군으로부터 선택될 수 있고 임의선택적으로 프룩토스, 갈락토스, 만노스, 대두 및/또는 이눌린; 및/또는 식이섬유를 포함한다.
본 발명의 공여체 박테리아 세포를 포함하는 조성물은 전형적으로 담체 또는 비히클을 포함한다. "담체(carriers)" 또는 "비히클(vehicles)"은 투여를 위해 적합한 물질을 의미하고, 예를 들어, 비-독성이고 해로운 방법으로 조성물의 임의의 성분과 상호작용하지 않는 임의의 액체, 겔, 용매, 액체 희석제, 가용화제 등과 같이 당해 기술분야에서 공지된 임의의 이러한 물질을 포함한다. 수용가능한 담체의 예에는, 예를 들어, 물, 염 용액, 알코올, 규소 수지(silicone), 왁스, 석유 젤리(petroleum jelly), 식물성 오일, 폴리에틸렌 글리콜, 프로필렌 글리콜, 리포좀, 당, 젤라틴, 락토오스, 아밀로스, 마그네슘 스테아레이트, 활석, 계면활성제, 규산(silicic acid), 점성 파라핀, 향유(perfume oil), 지방산 모노글리세리드(fatty acid monoglycerides) 및 지방산 디글리세리드, 페트로에테르 지방산 에스테르(petroethral fatty acid esters), 하이드록시메틸-셀룰로오스(hydroxymethyl-cellulose), 폴리비닐피롤리돈(polyvinylpyrrolidone) 등이 포함된다. 일부 구현예에서, 본 발명의 공여체 박테리아 세포를 포함하는 조성물은 보호 하이드로콜로이드(검, 단백질, 변성 전분 등과 같은), 결합제, 필름형성제, 캡슐화제/물질, 벽/쉘 물질(wall/shell materials), 매트릭스 화합물(matrix compounds), 코팅, 유화제, 표면활성제, 가용화제(오일, 지방, 왁스, 레시틴 등), 흡착제, 담체, 충진제, 공-화합물(co-compounds), 분산제, 적심제(wetting agents), 가공조제(processing aids)(용매), 유동제(flowing agents), 미각차폐제(taste masking agents), 가중화제(weighting agents), 겔화제(jellifying agents), 겔형성제(gel forming agents), 항산화제 및 항미생물제가 포함한다. 조성물은 또한 물, 임의의 기원의 젤라틴, 식물성 검, 리그닌술포네이트(ligninsulfonate), 활석, 당, 전분, 아라비아 검, 식물성 오일, 폴리알킬렌 글리콜, 향미제(flavouring agents), 보존제, 안정화제, 에멀젼화제, 완충제, 윤활제, 착색제, 적심제, 충진제 등을 포함하나, 이들로 제한되지 않는 통상의 약제학적 첨가제 및 보조제, 부형제 및 희석제를 포함할 수 있다. 모든 경우에서, 이러한 추가의 성분은 의도된 수신체에 대한 적합성과 관련하여 선택될 수 있다.
본 발명은 다음의 도면 및 실시예에 의해 추가로 예시될 것이다. 그러나, 이러한 실시예 및 도면은 어떠한 방식으로도 본 발명의 범주를 제한하는 것으로 해석되지 않아야 한다.
도 1. F 플라스미드 조직(F plasmid machinery)에 의한 TAP 전달이 표적 대장균 균주의 살상을 매개한다. (a) TAP 모듈은 약한 구성 BBa_J23107 프로모터로부터 발현된 야생형(cas9) 또는 촉매적으로 사멸된 cas9(dcas9) 유전자 및 강한 구성 BBa_J23119 프로모터로부터 발현된 gRNA 모듈; F 플라스미드 전달 기원(oriT F); pBBR1 복제 기원(oriV) 및 한 세트의 내성 카세트(Ap, 암피실린; Kn, 가나마이신; Cm, 클로람페니콜; St, 스트렙토마이신; Gm, 겐타마이신), 광범위-숙주 범위 합성 BioFab 프로모터로부터 고도로 발현된 sfgfp 또는 mcherry 유전자를 운반하는 임의선택적인 카세트로 구성된 CRISPR 시스템으로 이루어진다. (b) TAP 항균 전략의 다이아그램. 공여체 균주는 F 플라스미드 접합 조직을 생성하여 TAP를 수신체 균주로 전달한다. 표적 수신체는 살상 또는 유전자 발현 억제를 유도하는 CRISPR(i) 시스템에 의해 인식되는 시퀀스를 운반한다. 스페이서 인식 시퀀스가 결여된 비-표적 수신체는 CRISPR(i) 활성에 대해 둔감하다. (c) 유세포 측정(flow cytometry)에 의해 추정된 TAP 전달의 막대 도표는 TAPkn-Cas9-nsp-GFP 및 TAPkn-Cas9-lacZ2-GFP가 짝짓기(mating) 3시간 후 수신체 세포에서 유사한 효율로 전달된다는 것을 나타내고 있다. 공여체 TAP-Cas9-nsp(LY1371) 또는 TAP-Cas9-lacZ2(LY1380), 수신체 HU-mCherry lac+(LY248). (d) 평판배양 분석(plating assays)에 의해 추정된 생존 트랜스접합체의 농도의 막대 도표는 TAP-Cas9-lacZ2의 획득과 연관된 생존력 손실을 나타내고 있다. 생존 트랜스접합체의 대응하는 백분율(T/R+T 비율)을 각 막대 상에 나타내었다. (e) 짝짓기 후 3시간에 걸쳐 수신체 집단의 배수-증가를 계수한다. 공여체 TAP-Cas9-nsp(LY1369) 또는 TAP-Cas9-lacZ2(LY1370), 수신체 lac+(LY827). (c 내지 e) 3개의 독립적인 실험들로부터 평균 및 표준편차가 계산되었다.
도 2. TAP의 획득 이후 대장균 살상의 실시간 시각화. (a 내지 b) 트랜스접합체 (a) 박테리아 및 (b) 핵양체 길이의 단일-세포 시간-경과 정량화(time-lapse quantification). 평균 및 표준편차를 표시하였다(n개의 세포가 분석됨). TAP 획득의 시간(0분에서 적색 파선)은 트랜스접합 세포에서 녹색 형광에서의 15% 증가에 해당한다. (c 내지 d) 트랜스접합체 (c) 세포 길이 및 (d) RecA-GFP 형광 신호의 편포도(skewness)의 단일-세포 시간 경과 정량화. 평균 및 표준편차를 표시하였다(n개의 세포가 분석됨). TAP 획득의 시간(0분에서 적색 파선)은 트랜스접합 세포에서 녹색 형광에서의 30% 증가에 해당한다.
도 3. TAP 시스템은 표적 및 비-표적 대장균 수신체 세포의 혼합물에서 표적 수신체를 특이적으로 살상한다. (a) 공여체로부터 혼합된 lac+ 및 lac- 수신체 집단으로의 TAPkn-Cas9-nsp 또는 TAPkn-Cas9-lacZ2 전달을 통한 생존 트랜스접합 세포 및 트랜스접합체의 백분율(T/R+T 비율). (b) lac+ 및 lac- 수신체 집단에서의 배수-증가의 정량화를 짝짓기 후 6시간에 걸쳐 계수한다. 4개의 독립적인 실험들로부터 평균 및 표준편차가 계산되었다. 공여체: TAP-Cas9-nsp(LY1369) 또는 TAP-Cas9-lacZ2(LY1370); 수신체 lac+(LY827) 및 lac-(LY848). (c) 세포 길이를 나타내는 단일-세포 정량화는 표적 lac+ 트랜스접합 세포에서 증가되나 비-표적 lac- 트랜스접합체에서는 그렇지 않다. TAP 획득의 시간(0분에서 적색 파선)은 트랜스접합 세포에서 녹색 형광에서의 15% 증가에 해당한다. 세포 길이 평균을 표준편차와 함께 표시하였다(n개의 세포들이 분석됨). 공여체 TAP-Cas9-lacZ2(LY1380); 수신체 HU-mCherry lac+(LY248) 및 DnaN-mCherry lac-(LY1423).
도 4. TAP는 pOXA48-운반 수신체 세포를 다시 민감하게 하고 내성 보급을 방해한다. (a) TAP-매개 항-내성 전략의 다이아그램. bla OXA48 프로모터를 표적하는 TAP-Cas9-OXA48이 공여체로부터 pOXA-48a 플라스미드를 지니는 암피실린 내성 수신체 세포로 전달된다. TAP-Cas9-OXA48의 획득은 플라스미드에 이중-가닥-절단(DSB)을 유도하는 반면, TAP-dCas9-OXA48은 bla OXA48 유전자 발현을 억제한다. TAP 둘 모두 트랜스접합 세포를 암피실린에 대해 민감하게 되도록 한다. (b) TAPkn-Cas9-OXA48, TAPkn-dCas9-OXA48 및 TAPkn-Cas9-OXA48-PemI의 획득 후 트랜스접합 세포에서의 암피실린 내성의 감소를 나타내는 막대 도표. 트랜스접합체의 백분율(T/R+T 비율)을 나타내었다. (c) (위의 다이아그램에 묘사된 바와 같이) 수신체로부터의 pOXA-48a의 전달을 통해 암피실린 내성을 획득하는 공여체 세포의 빈도를 나타내는 막대 도표. (d) 막대 도표는 (위의 다이아그램에 묘사된 바와 같이) TAP를 수신한 R#2 플라스미드-무함유 야생형 수신체(TAP-transc.#2)로의 pOXA-48a 전달을 통한 암피실린-내성 획득의 빈도를 나타내고 있다. 적어도 3개의 독립적인 실험들로부터 평균 및 표준편차가 계산되었다. 공여체 TAP-dCas9-nsp(LY1524), TAP-Cas9-nsp(LY1369), TAP-dCas9-OXA48(LY1523), TAP-Cas9-OXA48(LY1522) 또는 TAP-PemI-Cas9-OXA48(LY1549); 수신체 R#1 야생형 / pOXA-48a(LY1507) 및 R#2 야생형(LY945).
도 5. 다종의 수신체 집단 내의 TAP의 효율 및 균주-특이적 살상. (a) 대장균(LY1369) 공여체로부터 시트로박터 로덴티움(C. rodentium), 엔테로박터 클로아세(E. cloacae), 에쉬리키아 콜라이 이피이씨(E. coli EPEC) 또는 에쉬리키아 콜라이 에이취에스(E. coli HS) 수신체로의 TAP-Cas9-nsp 전달의 효율. 막대 도표는 시트로박터 로덴티움, 엔테로박터 클로아세, 에쉬리키아 콜라이 이피이씨 수신체에 대한 접합 24시간 후 및 에쉬리키아 콜라이 에이취에스 수신체에 대한 접합 3시간 후의 트랜스접합체의 백분율(T/R+T)을 나타내고; 적어도 3개의 독립적인 실험들로부터 평균과 표준편차가 계산되었다. (b) CSTB 알고리즘으로 식별된 특정한 스페이서를 운반하는 TAP가 각 수신체 세포에 대해 시험되었다. 상이한 수신체 균주에서의 TAP 전달의 가변성을 설명하기 위해, 막대 도표는 TAPKn-Cas9-nsp에 대해 수득된 생존 트랜스접합체에 의해 정규화된 생존 트랜스접합체의 상대적인 풍부도를 나타내고 있다. 별표 위의 괄호 내의 숫자는 10-8 미만의 트랜스접합체의 검출 한계를 갖는 복제물을 나타낸다. 3개의 독립적인 실험들로부터 평균 및 표준편차가 계산되었다. (c) 공여체와 짝짓기하기 이전에 평판배양 분석에 의해 추정된 수신체의 비율. 3개의 독립적인 실험들로부터 계산된 평균 및 표준편차를 각 수신체 균주에 대해 표시하였다. (d) 대장균 공여체와 모든 수신체 종들을 포함하는 수신체 집단 간의 접합을 통해 특정 스페이서를 운반하는 각 TAP가 시험되었다. 막대 도표는 짝짓기 3시간 후 혼합된 집단에서의 생존 트랜스접합체의 비율을 나타내고 있다. 별표 위의 괄호 내의 숫자는 10-8 미만의 트랜스접합체의 검출 한계를 갖는 복제물을 나타낸다. 3개의 독립적인 실험들로부터 평균 및 표준편차가 계산되었다. 공여체 TAP-Cas9-nsp(LY1369), TAP-Cas9-Cr1(LY1597), TAP-Cas9-Ecl(LY1566), TAP-Cas9-EPEC(LY1618), TAP-Cas9-EEC(LY1665); 수신체 시트로박터 로덴티움(LY720), 엔테로박터 클로아세(LY1410), 에쉬리키아 콜라이 이피이씨(LY1615) 또는 에쉬리키아 콜라이 에이취에스(LY1601).
실시예:
방법:
박테리아 균주, 플라스미드, 프라이머 및 성장 배양 조건.
박테리아 균주 구성 및 성장 과정. 깁슨 조립(Gibson Assembly)(Gibson et al., 2009)에 의해 플라스미드 복제를 수행하였고 생어 염기서열분석(Sanger sequencing)(Eurofins Genomics)에 의해 검증하였다. 염색체 돌연변이를 파아지 P1 형질도입에 의해 전달하여 최종 균주를 생성하였다. 37℃에서 글루코스(0.2%)와 카사미노산(casamino acid)(0.4%)(M9-CASA)으로 보충된 Luria-Bertani(LB) 배지 또는 글루코스(0.2%)와 카사미노산(0.4%)(M63)으로 보충된 M63 배지에서 균주를 성장시켰다. 적절한 경우, 배지를 하기의 항생제들로 보충하였다: 50 ㎍/㎖ 가나마이신(Kan), 20 ㎍/㎖ 클로르암페니콜(Cm), 10 ㎍/㎖ 테트라사이클린(Tc), 20 ㎍/㎖ 날리딕스산(Nal), 20 ㎍/㎖ 스트렙토마이신(St), 100 ㎍/㎖ 암피실린(Ap), 10 ㎍/㎖ 겐타마이신(Gm), 50 ㎍/㎖ 리팜피신(Rif). 적절한 경우 40 ㎍/㎖ 5-브로모-4-클로로-3-인돌릴-β-d-갈락토피라노시드(5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-d-galactopyranoside)(X-Gal) 및 40 μM 이소프로필 β-d-티오갈락토피라노시드(isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside)(IPTG)를 LAC 표현형의 스크리닝을 위해 첨가하였다.
TAP 구성 및 TAP 상의 스페이서 시퀀스의 1-단계-복제 변화
IVA 복제(Garcia-Nafria et al., 2016)에 의해 플라스미드 구성을 수행하였고, TAP에서 스페이서 시퀀스를 변화시킬 것으로 기대되었으며, 이는 pEGL129에서의 스페이서를 SapI-spacer-SapI DNA 시퀀스로 대체함으로써 수행되었다. SapI 소화에 의해 비-응집 DNA 말단의 유리를 가능하게 하는 2개의 SapI 제한 부위에 의해 nsp(비-특이적) 스페이서 시퀀스가 플랭킹되었다. nsp 스페이서를 대체하기 위해, TAP-Cas9-nsp 또는 TAP-dCas9-nsp 플라스미드의 SapI 제한에 의해 생성된 비-응집 말단에 상보적 시퀀스로 2개의 올리고뉴클레오티드를 서냉복원(annealing) 함으로써 새로운 스페이서가 구성되었다. 새로운 스페이서 단편과 TAP 골격 사이의 결합 생산을 DH5α 또는 TB28에 형질전환시켰다. 구성을 PCR 반응 및 서열분석으로 검증하였다.
콩고 레드 분석
E.coli에 대한 Curli 생산 콜로니 분석 플라스미드를 수반하거나 수반하지 않는 균주 OmpR234를 콩고 레드 매질(Congo Red medium)(10 g 박토 트립톤, 5 g 효모 추출물, 18 g 박토 한천(bacto agar), 40 ㎍/㎖ 콩고 레드 및 20 ㎍/㎖ 쿠마시 브릴리언트블루 지(Coomassie Brilliant blue G)) 상에 평판배양시키고 4일 동안 30℃에서 배양하였다. 콜로니를 M80 입체현미경(Leica)으로 x10 배율에서 시각화하였다. 디지털 이미지는 입체현미경에 결합되어 있으며 LASv4.8 소프트웨어(Leica)를 통해 작동되는 IC80-HD 통합 카메라로 캡처하였다.
액체 응집 시험. 플라스미드를 수반하거나 수반하지 않는 대장균 균주 OmpR234의 밤새도록 배양한 배양물을 25 ㎍/㎖의 콩고 레드로 보충된 1 ㎖ M9-CASA 배지에 A600이 0.05가 될 때까지 희석하였다. 배양물을 교반없이 30℃에서 24시간 동안 성장시키고, 이미지를 캡처하였다.
접합 분석
공여체 및 수신체 균주의 LB에서 성장된 밤새도록 배양된 배양물을 A600이 0.05가 될 때까지 희석하고 A600이 0.7 내지 0.9 사이에 도달될 때까지 성장시켰다. 50 ㎕의 공여체 및 150 ㎕의 수신체 배양물을 에펜도르프 시험관(Eppendorf tube) 내로 혼합시켜 넣어 1:3의 공여체 대 수신체 비율을 수득하였다. 시간 0분에서, 100 ㎕의 혼합물을 1 ㎖ LB 내로 희석하고, 연속 희석하고 항생제로 보충된 LB 한천(LB agar) 상에 평판배양하여 공여체, 수신체 및 트랜스접합 세포를 선택하였다. 잔여의 100 ㎕를 37℃에서 1시간 30분 동안 배양하였다. 1 ㎖의 LB를 조심해서 첨가하고 시험관을 37℃에서 추가 1시간 30분, 4시간 30분 또는 22시간 30분 동안 배양하였다. 계속해서 접합체 혼합물을 와류에 적용시키고, 연속 희석하고 시간 0분으로서 평판배양하였다.
장기 접합 실험. 접합 혼합물을 제조하고 교반 없이 37℃에서 배양하였다. 매 24시간 마다, 100 ㎕의 혼합물을 1 ㎖의 LB 내로 희석하고 37℃에서 재-배양하였다. 잔여의 혼합물을 와류에 적용시키고, 연속 희석하고 항생제로 보충된 LB 한천 상에 평판배양하여 공여체, 수신체 및 트랜스접합 세포를 선택하였다. 1일차 및 7일차에서, RAP-dCas9-OXA48 운반 공여체와 혼합된 결과의 암피실린 내성 수신체의 100개의 클론을 각각 F-Tn10 또는 TAP-dCas9-OXA48 플라스미드의 존재를 평가하기 위해 Tc 또는 Kn으로 보충된 LB 한천 상에 선조접종(streaking) 하였다.
다종 접합. LB에서 성장된 공여체 및 수신체 균주의 밤새도록 배양한 배양물을 A600이 0.05가 될 때까지 희석하고 A600이 0.7 내지 0.9에 도달할 때까지 성장시켰다. 시트로박터 로덴티움, 엔테로박터 클로아세, 에쉬리키아 콜라이 이피이씨 및 에쉬리키아 콜라이 에이취에스 수신체 균주를 동등한 비율로 혼합함으로써 수신체 혼합물을 제조하였다. 이 혼합물을 연속 희석하고 항생제로 보충된 LB 한천 상에 평판배양하여 각 수신체를 선택하였다. 100 ㎕의 공여체 및 100 ㎕의 수신체 혼합물을 에펜도르프 시험관에 첨가하여 짝짓기를 수행하였다. 시간 0분에서, 100 ㎕의 혼합물을 1 ㎖ LB 내로 희석하고, 연속 희석하고 항생제로 보충된 LB 한천 상에 평판배양하여 공여체, 수신체 및 트랜스접합 세포를 선택하였다. 잔여의 100 ㎕를 37℃에서 1시간 30분 동안 배양하였다. 1 ㎖의 LB를 조심해서 첨가하고 시험관을 37℃에서 추가 1시간 30분 동안 배양하였다. 계속해서 접합체 혼합물을 와류에 적용시키고, 연속 희석하고 항생제로 보충된 LB 한천 상에 평판배양하여 공여체, 수신체 및 트랜스접합체를 선택하였다. 도면에서, 접합의 효율을 접합 세포의 최종 농도(CFU/㎖)로서 또는 비율(T/R+T)로부터 계산된 트랜스접합 세포의 백분율로서 표현하였다.
형질전환 분석
LB에서 성장된 밤새도록 배양된 배양물을 1/100으로 희석하고 A600이 0.4 내지 0.6 사이에 포함될 때까지 성장시켰다. 세포들을 염화루비듐으로 처리하고 그 결과의 활성화 세포 90 ㎕를 100 ng의 플라스미드 및 열충격으로 형질전환시켰다. 표현형 발현을 위해 37℃에서 1시간 배양한 후, 세포를 5분 동안 5000 rpm에서 원심분리하고, 100 ㎕의 LB에 재현탁시키고, 연속 희석물 10 ㎕를 적절한 항생제로 보충된 LB 플레이트 상에 점적하였다.
생-세포 현미경 이미지화 및 분석
시간-경과 실험(time-lapse experiments). 공여체 및 수신체 세포의 M9-CASA(대장균 간) 또는 M63(대장균과 시트로박터 로덴티움 사이)에서의 밤새도록 배양한 배양물을 A600이 0.05가 될 때까지 희석하고 A600이 0.7 내지 0.9 사이에 포함될 때까지 성장시켰다. 25 ㎕의 공여체 및 75 ㎕의 수신체를 에펜도르프 시험관 내로 혼합시켜 넣고 혼합물 50 ㎕를 B04A 미세유체 챔버(B04A microfluidic chamber)(ONIX, CellASIC®)에 적재하였다. 이미지화 과정 전체를 통해 1 psi에서 영양 공급을 유지하고 온도를 37℃로 유지하였다. 세포를 3시간 동안 매 10분 마다 이미지화하였다.
이미지 획득(image acquisition). 이미지 획득을 위한 NIS 소프트웨어를 사용하여 그리고 x100/1.45 oil Plan Apo Lambda phase 대물렌즈, FLash4 V2 CMOS 카메라(Hamamatsu)가 장착된 Eclipse Ti-E 현미경(Nikon)으로 통상의 광각 형광 현미경 이미지화를 실행하였다. Fluo LED Spectra X 광원의 50% 출력을 사용하여 488 ㎚ 및 560 ㎚ 여기 파장에서 이미지 획득을 수행하였다. 노출 설정은 sfGFP에 대해 50 ㎳로 TAP로부터 생성된 mCherry에 대해서는 50 ㎳; RecA-GFP에 대해서는 100 ㎳; HU-mCherry에 대해서는 100 ㎳; DnaN-mCherry에 대해서는 100 ㎳이었다.
이미지 분석. MicrobeJ plugin을 수반하는 Fiji 소프트웨어를 사용하여 정량적 이미지 분석을 수행하였다(Ducret et al., 2016). MicrobeJ의 수동-편집 인터페이스(Manual-editing interface)를 사용하여 세포 검출을 최적화하고 평균 세기 형광(Mean intensity fluorescence), 편포도 및 세포 길이 매개변수를 자동적으로 추출하고 플로팅하였다. 본 발명자들은 TAP(sfGFP 또는 mCh)에 의해 부여되는 형광 신호의 증가를 분석함으로써 TAP 획득(시간 t = 0)의 타이밍을 정의하였다. 트랜스접합 세포에서 15% sfGFP 또는 30% mCherry 형광 증가가 관찰되는 경우에 플라스미드 획득이 검증되었다. 계속해서 각 세포의 형광 프로파일을 정의된 t = 0을 따라 정렬하여 도 2a, 2b, 2c, 2d, 3c들에 나타낸 그래프를 생성하였다.
유세포분석
0.1 ㎛ 여과 LB에서 접합 분석 부분에서 기술된 바와 같이 접합을 수행하였다. 시간 90분 및 180분에서, 접합 혼합물을 0.1 ㎛ 여과 LB에 A600이 0.03이 될 때까지 희석하고 Attune NxT 음향 집속 유세포분석기(Attune NxT acoustic focusing cytometer)로 25 ㎕/분의 유속에서 분석하였다. 전방 산란(FSC: Forward scattered), 측방 산란(SSC: Side scattered)과 마찬가지로 형광 신호 BL1(sfGFP) 및 YL2(mCherry)를 적절한 PMT 설정으로 획득하고 Attune™ NxT 분석 소프트웨어로 나타내었다. TAP로부터의 Cas9 또는 dCas9 구성 발현의 독성의 부재를 검증하기 위해, 본 발명자들은 cas9 또는 dcas9를 수반하거나 어떠한 cas9 유전자도 수반하지 않는 대장균 엠에스388/TAP(E. coli MS388/TAP)의 성장을 비교하였다. 이들 균주들을 0.1 ㎛ 여과 LB에서 밤새도록 성장시키고 0.1 ㎛ 여과 LB에 A600이 0.05가 될 때까지 희석하였다. 이들을 8시간 동안 성장시키고 0, 2, 4, 6 및 8시간에서 평판배양 분석에 의해 A600 및 CFU/㎖를 추정하였다. 병행해서, 1시간, 2시간 및 5시간 30분에서 균주를 Attune NxT 음향 집속 유세포분석기로 25 ㎕/분의 유속에서 분석하였다. 전방 산란(FSC)을 획득하고 Attune™ NxT 소프트웨어로 나타내었다.
TAP-탈출 돌연변이의 분석
대장균에서. 31개의 TAP-탈출 돌연변이들을 X-Gal 및 IPTG로 보충된 배지 상에 선조접종하여 이들의 LAC 표현형을 결정하였다. lac+ 표현형을 나타내는 TAP-탈출 돌연변이를 "블루(Blue)"로 그리고 다른 것을 "화이트(White)"로 분류하였다. 표적 lacZ2 유전자좌를 변형시키는 점 돌연변이 또는 결실의 획득을 결정하기 위해, 야생형 균주에서 lacZ2 유전자좌를 포함하는 748pb의 단편을 증폭하는 OL240 및 OL654로 PCR을 실현하였다. lacZ2 유전자좌의 결실을 나타내지 않으나 여전히 활성 TAP CRISPR 시스템을 갖는 탈출 돌연변이의 경우, PCR 산물이 서열분석되고 돌연변이가 동정되었다. OL655 및 OL656으로도 PCR을 수행하여 lacZ2 주위의 더 큰 단편을 증폭하고 이전에 기술된 바와 같은 큰 결실을 관찰하였다(Cui and Bikard, 2016). 탈출 돌연변이로부터 추출된 TAP의 활성을 결정하기 위해, TAP-탈출 돌연변이와 접합 분석 부분에서 기술된 바와 같은 대장균 MS388 lac+ 균주 간에 접합을 수행하였다. 병행하여, 탈출 돌연변이로부터 Machery Nagel NucleoSpin® Plasmid 킷트로 추출된 TAP의 활성은 형질전환 분석 부분에서 기술된 바와 같은 lac+ 및 lac- 균주의 형질전환에 의해 검증되었다. 7개의 비활성 TAP를 서열분석하여 CRISPR 시스템을 비활성화하는 돌연변이를 동정하였다.
시트로박터 로덴티움. 20개의 TAP-Cas9-Cr1-탈출 돌연변이의 경우, OL686 및 OL687로 PCR을 수행하여 염색체 유전자좌에서의 결실을 결정하였다. 시트로박터 로덴티움 TAP-탈출 돌연변이로부터 TAP의 CRISPR 활성을 검증하기 위해, 시트로박터 로덴티움 돌연변이와 대장균 MS388 균주 간에 5시간 동안 접합을 수행하여 신규한 대장균 TAP 공여체를 생성하였다. 계속해서 신규한 공여체와 신선한 시트로박터 로덴티움 수신체 간에 24시간 동안 접합을 수행하고 평판배양하여 수신체 및 트랜스접합체를 선택하였다. 시트로박터 로덴티움 탈출 돌연변이에서 단리된 TAP의 활성을 검증하기 위해, TAP를 Machery Nagel NucleoSpin® Plasmid 킷트로 추출하고 전기천공(25 ㎸)에 의해 10% 슈크로스로 처리된 야생형 시트로박터 로덴티움 세포에 형질전환시켰다. 37℃에서의 1시간의 배양 후, 세포를 가나마이신(Kan)으로 보충되거나 보충되지 않은 LB-한천 상에 평판배양하여 형질전환 효율을 평가하였다. 탈출 클론으로부터 단리된 2개의 비활성 TAP-Cas9-Cr1 및 2개의 비활성 TAP-Cas9-Cr22를 서열분석하였다.
CSTB 알고리즘
CSTB 웹 서비스는 광범위한 박테리아 게놈 및 플라스미드에 걸쳐 CRISPR 모티프의 비교 분석을 가능하게 한다. 현재 고려된 모티프는 18 내지 23개의 염기 쌍길이의 NGG-고정 시퀀스이다. CSTB 백-엔드 데이터베이스(CSTB back-end database)는 RefSeq의 99판(release 99)(03/12/20)에서 대표적인 또는 참조로서 표지된 2914개의 완전 게놈 중에 존재하는 이러한 CRISPR 모티프의 모든 발생을 색인한다. 게다가, 7종의 박테리아 게놈 및 5종의 관심 대상 플라스미드를 첨가하였다. 박테리아 게놈 중에서 구별되는 모티프의 평균 수는 55923(각각 최소 및 최대로 5719 및 2729570)이다. 게놈은 NCBI 분류체계(07/22/20)에 따라 분류하였다. 각 게놈은 아래의 절차를 사용하여 상응하는 완전한 fasta 처리에 의해 모티프의 데이터베이스에 삽입되었다. 먼저, CRISPR 모티프 정규식(regular expression)을 만족하는 모든 단어들을 검출하고 이들 염색체 좌표를 모티프의 데이터베이스에 저장하였다. 다음으로, 모든 고유한 단어들을 본 발명자들이 개발한 염기 당 2-비트 암호화 소프트웨어(2-bits per base encoding software)[https://github.com/glaunay/crispr-set]를 사용하여 정수 표현으로 변환하였다. 계속해서 이들 정수들을 게놈 당 고유한 플랫 파일(flat file)로 분류하였다. 정수로서의 CRISPR 모티프의 색인은 여러 유기체에 걸친 모티프의 세트를 컴퓨터를 사용한 효율적인 비교를 가능하게 한다. 마지막으로, 원래의 fasta 파일을 블라스트 데이터베이스(blast database)에 추가하였다. 모든 관련 소프트웨어는 https://github.com/MMSB-MOBI/CSTB_database_manager에서 무료로 접근할 수 있다. CSTB 입력 인터페이스는 2개의 계통수로서 검색하기 위해 이용가능한 2914개의 게놈을 디스플레이한다. 좌측 계통수를 사용하면 게놈이 동일/유사한 CRISPR 모티프를 특징으로 삼는 종을 선택할 수 있다. 이 게놈 세트는 표적 CRISPR 모티프를 정의한다. 한편, 우측 계통수는 "배제된" 유기체를 선택할 수 있으며, 이는 표적 유기체와 공통적인 모티프를 가져야 한다. 사용자 선택을 만족하는 모티프 세트는 "배제된" 유기체에서 발견된 모티프의 교차점에서 차감한 선택된 유기체에서 발견된 모티프의 합집합과 실질적으로 동등할 것이다. 계산 시간은 선택의 크기에 따라 수 초 내지 수 분의 범위이며, 완료 시 이메일이 전송된다.
모든 해답 CRISPR 모티프는 sgRNA 시퀀스의 상호작용 표와 각 선택된 유기체에서의 발생을 제시한다. 표에는 모티프 수 및 시퀀스 조성에 대한 정렬 및 필터링 기능이 있다. 이는 관심 대상의 모티프를 용이하게 선택할 수 있게 한다. 전체 해답 세트 또는 선택된 모티프에 대해서만 상세 정보를 다운로드할 수 있다. 이 상세 정보는 표적 유기체에서 각 sgRNA 모티프의 좌표를 특징으로 하는 선들을 갖는 표로 된 파일로 제공된다. 대안으로, 사용자는 게놈-기반 접근법을 사용하여 결과를 탐색할 수 있다. 따라서, 각 표적 게놈은 그래픽 뷰(graphical view)를 갖는다. 그래픽은 선택된 게놈에서 해답 sgRNA 모티프의 전체 분포에 대한 원형 히스토그램이다. 그래픽은 sgRNA 분포의 국부적 분석(local breakdown)을 표시하는 대화형이다. CSTB 웹 사이트는 https://cstb.ibcp.fr에서 무료로 접근할 수 있다.
결과:
표적-항균-플라스미드(TAP) 모듈러 설계
TAP는 합성 pSEVA 플라스미드 칼렉션에서 파생되고7, pBBR1 복제 기원, 내성 유전자 카세트의 선택 및 F 플라스미드의 전달 기원 oriTF를 운반한다( 도 1a ). TAP는 결과적으로 공여체 세포에 포함된 접합 F-Tn10 헬퍼 플라스미드로부터 트랜스로 생성된 접합 조직에 의해 이동가능하다( 도 1b )8,9. 본 발명자들은 스트렙토코쿠스 피요게네스 야생-형 cas9(CRISPR 활성을 위한) 또는 촉매적으로 사멸한 dcas9 유전자(CRISPRi 활성을 위한) 및 불변 tracrRNA 스캐폴드(constant tracrRNA scaffold)와 표적-특이적 crRNA 스페이서 시퀀스로 구성된 가이드 gRNA 시퀀스를 삽입하였다( 도 1a ). 1-단계-복제에서 crRNA 스페이서 시퀀스를 변경하면 임의의 특정 염색체 또는 플라스미드 DNA에 대한 TAP의 표적화를 재프로그래밍할 수 있다. 임의선택적으로, TAP는 또한 현미경 및 유세포 분석에서 플라스미드 전이 형광 리포터로 기능하도록 넓은-숙주 범위 합성 BioFab 프로모터10로부터 고도로 발현되는 슈퍼폴더 녹색 형광(sfgfp) 또는 mcherry 유전자를 운반한다( 도 1a ).
TAP CRISPR 및 CRISPRi 활성의 검증
본 발명자들은 효율적이고 특이적인 Cas9-매개 살상(CRISPR) 또는 dCas9-매개 유전자 발현 억제(CRISPRi)를 유도하는 TAP의 능력을 다루었다. 첫째, 대장균의 lacZ 유전자를 표적하는 앞서 기술된 lacZ2 스페이서를 이용하여 Cas9-매개 살상을 유도하는 TAP 능력을 확인하였다 11 . TAP-Cas9-lacZ2를 lac+ MG1655 야생형 균주에 형질전환시키는 것은 표적 lacZ 유전자좌를 결실한 동질 유전자 lac- 균주에서 보다 약 1000-배 덜 효율적이었다. 대조적으로, 대장균 게놈을 표적하지 않는 비-특이적(nsp) crRNA 스페이서를 포함하는 TAP-Cas9-nsp 플라스미드는 lac+ 및 lac- 균주 둘 모두에서 동등한 효율로 형질전환시켰다. 둘째, MG1655 대장균 돌연변이 균주 OmpR23413에서 세포-표면 curli fimbriae 12의 생산을 구동하는 csgB 프로모터를 표적하는 csgB 스페이서를 사용하여 dCas9-매개 CRISPRi 활성을 유도하는 TAP 능력을 검증하였다. curli 생산에 대한 직접적인 판독으로서 한천-플레이트에 대한 콩고 레드(CR: Congo Red) 염색 및 액체 배지에서의 응집 덩어리 형성을 사용하였다13,14. TAP-dCas9-csgB는 응집 덩어리를 형성하지 못하는 것 및 CR의 존재 중에서 백색 콜로니를 형성하는 것에 의해 반영되는 바와 같이 OmpR234 균주에 의한 curli 생산을 효과적으로 억제한다. 대조적으로, 비-특이적 TAP-dCas9-nsp는 OmpR234 균주에서의 curli 형성 또는 응집에 대해 어떠한 영향도 주지 않는다. 게다가, 본 발명자들은 TAP로부터의 Cas9 또는 dCas9의 구성 생산이 일부 시스템에서 보고된 독성 영향과는 대조적으로 성장 결함이나 연장된 세포 형태를 야기하지 않는다는 것을 확인했다15-18. 이러한 결과는 Cas9-매개 살상 또는 dCas9-매개 유전자 발현 억제를 유도하는 TAP 능력이 효율적이고 스페이서 시퀀스에 의한 정확한 표적화에 의존한다는 것을 입증하고 있다.
표적 수신체 세포의 TAP-매개 살상
다음으로, 본 발명자들은 접합에 의해 TAP의 능력이 전달되고 대장균 수신체 세포에서의 항균 활성을 유도하는 능력을 다루었다. F-Tn10 헬퍼 플라스미드 및 TAP-Cas9-nsp나 TAP-Cas9-lacZ2 가동 플라스미드를 포함하는 대장균 MG1655 공여체를 사용하여 접합을 수행하였다. 유세포 측정법 분석을 사용하여, 본 발명자들은 염색체 상에 암호화된 적색 형광 히스톤-유사 단백질 HU-mCherry를 생성하는 lac+ 수신체 균주로의 이러한 TAP(sfGFP 녹색 형광 리포터를 운반함)의 전달 효율을 정량하였다. 조합된 적색 및 녹색 형광을 나타내는 트랜스접합체의 정량은 TAP-Cas9-nsp 및 TAP-Cas9-lacZ2 둘 모두 짝짓기 3시간 이후 수신체 세포 집단의 약 65%가 전달되었다는 것을 나타내고 있다(도 1c). 예상되는 바와 같이, TAP 전달은 공여체 균주에서 F-Tn10 플라스미드의 존재를 필요로 한다. 가장 중요하게는, 접합 혼합물의 병렬 평판배양은 TAP-Cas9-nsp 트랜스접합물에 비해 TAP-Cas9-lacZ2 트랜스접합물의 생존력에서의 약 3.5 로그-배 감소(log decrease)를 나타내었다( 도 1d ). 이러한 살상 활성은 또한 TAP-Cas9-nsp 공여체에 대한 약 20-배 증가에 비해 TAP-Cas9-lacZ2 공여체 균주에 대한 짝짓기의 3시간 동안 총 수신체 세포 수가 증가하지 않았다는 것에 의해 반영된다( 도 1e ). 중요하게는, 표적 lacZ 유전자좌를 결여하는 동질 유전자 Lac- 수신체 균주를 사용하는 경우 어떠한 TAP에 대해서도 살상 효과가 관찰되지 않는다는 것이다. 이러한 결과는 TAP-Cas9-nsp 및 TAP-Cas9-lacZ2가 F-Tn10 접합 조직을 통해 동등한 효율로 전달된다는 것을 나타내고 있다. 그러나, TAP-Cas9-nsp가 아닌, TAP-Cas9-lacZ2의 획득은 트랜스접합 세포의 생존력 상실과 연관된다.
생-세포 현미경을 사용하여, 본 발명자들은 TAP의 획득에 대한 수신체 세포의 세포 반응을 특정하였다( 도 2 ). 이 실험에서, TAP은 공여체 및 트랜스접합 세포에 녹색 형광을 부여하는 sfGFP 리포터 시스템을 지닌다. lac+ 수신체 세포는 그의 편재화가 염색체의 전반적인 구조를 드러내는 핵양체-결합 단백질 HU-mCherry를 생산한다. 기대되는 바와 같이, 적색 수신체 세포에서 sfGFP 녹색 형광의 생산에 의해 보고된 TAP-Cas9-nsp의 획득은 성장, 세포 형태 또는 핵양체 조직(나타내지 않음)에 영향을 미치지 않는다. 대조적으로, TAP-Cas9-lacZ2의 획득은 비구조화된 DNA 벌크 내로 성장하는 핵양체의 신속한 해체를, 후속하여 세포 필라멘트화 및 때때로 세포 용해를 촉발한다( 도 2a 내지 도 2b ). 또한, 본 발명자들은 수신체 세포에서 DNA-손상 유도에 반응하여 큰 세포 내 구조로 중합되는 것으로 보고된 RecA-GFP 융합의 편재화 패턴을 분석하였다19. 이 실험에서, TAP는 공여체 및 트랜스접합 세포에 적색 형광을 부여하는 mCherry 리포터 시스템을 운반한다. 이미지 분석에 따르면, TAP-Cas9-nsp(나타내지 않음)가 아닌, TAP-Cas9-lacZ2(나타내지 않음)의 획득은 세포 필라멘트화( 도 2c ) 뿐만 아니라 형광 편포도 분석( 도 2d , 방법 참조)을 사용하여 정량화된 RecA-GFP 중합이 뒤따른다. 핵양체 해체, 세포 필라멘트화 및 RecA-GFP 번들 형성은 TAP-Cas9-lacZ2 획득에 이어 트랜슨접합체의 사멸을 초래하는 DSB의 CRISPR-매개 유도가 후속된다는 것을 확증한다.
혼합 대장균 수신체 집단에서의 TAP-매개 선택적 살상
본 발명자들은 표적 lac+ 및 비-표적 lac- 대장균 균주로 구성된 혼합 수신체 집단 내에서의 TAP-매개 살상의 특이성을 검증하였다. 본 발명자들은 TAP-Cas9-lacZ2를 사용하는 경우 lac- 트랜스접합체에 비해 생존 lac+ 트랜스접합체에서 약 4 로그-배 감소를 관찰한 반면, TAP-Cas9-nsp에 대해서는 차이가 관찰되지 않았다( 도 3a ). TAP-Cas9-lacZ2 특이적 살상 활성은 표적 lac+ 수신체 전체 집단의 정체에도 반영되는 반면, 비-표적 lac- 집단은 짝짓기의 6시간 동안 성장할 수 있다( 도 3b ). 본 발명자들은 lac+ 및 lac- 수신체가 핵양체 연관 HU-mCherry 및 레플리좀(replisome) 연관 DNA 클램프 DnaN-mCherry 각각의 전형적인 편재화 패턴에 의해 구별되는 생균 현미경 이미지화를 수행하였다. 시간-경과 분석에 따르면 두 균주 모두 녹색 형광의 증가에 의해 보고된 플라스미드를 수신하나, 표적 lac+ 트랜스접합체 만이 세포 필라멘트화, Cas9-매개 DNA-손상 유도의 징후를 나타낸다( 도 3c ). 이러한 결과는 개별 수신체 균주를 사용하는 경우에 수득되는 효과를 요약하고, TAP가 혼합 집단에서 표적 균주의 선택적 살상을 달성한다는 것을 입증하고 있다.
TAP-탈출 돌연변이의 분석
TAP-Cas9-lacZ2의 전달이 lac+ 트랜스접합 세포의 약 3.5 로그-배 생존력 손실과 연관되나, 본 발명자들은 TAP의 획득에도 불구하고 생존할 수 있는 트랜스접합체의 비율에 주목하였다( 도 1d ). TAP-Cas9-lacZ2 활성을 탈출하는 31개의 클론의 유전자형 분석 및 시퀀스 분석 결과 2가지 유형의 탈출 돌연변이들이 밝혀졌다. 1/3(31개 중의 12개)이 플라스미드-유래 cas9 유전자에서 유전자전위효소(transposase) 또는 IS 삽입을 획득하고, 따라서 CRISPR 시스템을 비활성화한다. 2/3는 이미 기술된 바와 같은 작거나 큰 결실에 의하거나(31개 중의 12개) Cas9-gRNA 복합체에 의한 인식을 위한 열쇠인 것으로 나타난 PAM의 시드 영역(seed region) 내의 단일 점 돌연변이에 의해(31개 중의 7개) 표적 lacZ 염색체 유전자좌를 변형시키는 돌연변이를 획득하였다.
카바페넴-내성 집단을 겨냥한 TAP
접합 플라스미드는 박테리아에서 다제내성의 확산에 대한 주요 기여인자이며21, 이는 중증 임상 관계인 카바페넴 내성을 부여한다22. IncL/M pOXA-48a 플라스미드는 카바페넴 및 이미페넴과 페니실린과 같은 다른 베타 락탐에 대해 내성을 부여하는 OXA-48 카바페넴 분해효소(carbapenemase)를 암호화하는 blaOXA-48 유전자를 운반한다23. 본 발명자들은 pOXA-48a를 표적하는 TAP를 설계하고 암피실린에 대한 플라스미드-운반 집단을 민감하게 하는 TAP의 능력을 평가하였다. blaOXA-48 유전자의 5'-말단을 표적하는 OXA48 스페이서를 사용하여, 본 발명자들은 pOXA-48a에 Cas9-매개 DSB를 유도하는 TAP-Cas9-OXA48 및 CRISPRi에 의한 blaOXA-48 유전자 전사를 억제하는 TAP-dCas9-OXA48을 구축하였다( 도 4a ). pOXA-48a-적재 대장균 수신체로의 TAP-Cas9-OXA48 및 TAP-dCas9-OXA48 플라스미드의 전달은 암피실린 내성 수준에서의 약 4.5 로그-배 감소를 초래하는 반면, TAP-Cas9-nsp 또는 TAP-dCas9-nsp는 효과가 없었다( 도 4b ). 예기치 않게도, TAP-dCas9-OXA48에 비해 TAP-Cas9-OXA48을 사용하는 경우 암피실린 선택 없이 유의미하게 더 적은 생존 트랜스접합체가 수득된다는 것을 알 수 있다( 도 4b ). 본 발명자들은 시험된 4개의 플라스미드들 모두 pOXA-48a 플라스미드-무함유 대장균 수신체에 의해 유사한 빈도로 획득되기 때문에 TAP-Cas9-OXA48 전달 능력이 감소할 가능성을 배제하였다. 그러나, pOXA-48a 플라스미드 시퀀스의 분석에 따르면 플라스미드를 유전하지 않는 딸 세포의 성장을 억제함으로써 플라스미드 안정성에 관여하는 pemIK 독소-항독소(TA: toxin-antitoxin)의 존재가 밝혀졌다24-26. 실제로, 플라스미드 손실로 인한 pemIK 발현의 저지는 불안정한 PemI 항독소의 신속한 고갈을 초래하며, 이는 보다 더 안정한 PemK 독소의 독성 활성을 더 이상 억누를 수 없을 수 있다. 이러한 조절은 pSHV-18 플라스미드에 의해 운반되는 항생제 내성을 치유하기 위해 CRISPR-연관 파지 요법을 사용하여 보고되었다26. 따라서 본 발명자들은 Cas9 분열에 의해 표적된 pOXA-48a가 손실된 세포에서의 PemK 독성 활성으로 인하여 생존 TAP-Cas9-OXA48 트랜스접합체의 감소가 관찰되었다는 가설을 세웠다. 이러한 가능성은 구성적으로 발현되는 항독소 pemI 유전자를 TAP-Cas9-OXA48에 삽입하는 것에 의해 확인되었으며, 이는 트랜스접합체 생존력을 약 1.5 로그-배 증가시키는 한편으로 암피실린 내성의 억제를 유지한다( 도 4b ).
본 발명자들은 TAP 공여체와 함께 pOXA-48a 접합을 운반하는 균주의 내성의 장기 진화를 추가로 조사하였다. 본 발명자들은 TAP-dCas9-nsp가 영향을 미치지 않는 동안, TAP-dCas9-OXA48의 전달 및 그 결과의 암피실린에 대한 수신체 집단의 다시 민감하게 하는 24시간 후에 평형에 도달하였다는 것을 관찰하였다. 이 지점으로부터, 수신체의 안정한 90%는 TAP-dCas9-OXA48을 수신하였고 암피실린에 민감하게 되었다. 본 발명자들은 암피실린-내성 수신체 세포의 잔여 10%가 F-Tn10 플라스미드 만의 획득에서 기인할 수 있고, 따라서 수신체 세포에서 F-암호화 배제 시스템(F-encoded exclusion system)의 확립 및 후속 접합 사건을 통해 TAP를 획득할 수 없는 영구적인 불능을 초래한다는 가설을 세웠다. 이러한 가설은 공-배양(co-culture)의 1일 및 7일 후 집단에 존재하는 모든 암피실린-내성 수신체가 F-Tn10을 포함하나 TAP-dCas9OXA47은 포함하지 않는다는 것을 나타냄으로써 확증되었다. 이동가능한 TAP의 전달 효율을 조절하기 위한 한 가지 방법은 F 플라스미드의 전달 기원의 결실에 의한 F 플라스미드의 전달을 방지하는 것일 수 있다. 먼저, 이는 F 플라스미드 만의 획득 및 그 결과로 일어나는 수신체 세포에서의 배제 메카니즘의 구축을 방지할 수 있다. 다음으로, TAP 만을 수신하는 수신체 세포는 F-암호화 접합 조직의 부재로 인한 TAP를 다른 수신체 박테리아로 전달할 수 없을 것이다. 이러한 상황에서, TAP는 보다 더 느리게 전파될 수 있으나, 잠재적으로 집단 내의 모든 수신체 세포에 전파될 것으로 기대된다.
pOXA-48a는 엔테로박테리아과 중에서 전파되는 독립적 접합 플라스미드로서, pOXA-48a를 포함하는 수신체가 짝짓기 동안 TAP-공여체에 암피실린 내성을 전달할 수 있다는 가능성을 높인다. 본 발명자들은 암피실린 내성이 TAP-dCas9-nsp 또는 TAP-Cas9-nsp를 전달하는 공여체의 약 0.2% 및 0.12%로 실제로 전달된다는 것을 관찰하였다( 도 4c ). 그러나, TAP-dCas9-OXA48 또는 TAP-Cas9-OXA48를 운반하는 공여체는 암피실린 내성을 획득할 수 없다( 도 4c ). pOXA48 전달이 세포에서 TAP의 존재에 민감하지 않다고 가정하면, 이러한 결과는, 심지어 pOXA48 플라스미드가 획득되더라도, OXA48에 대한 TAP가 내성 발달을 방해한다는 것을 시사한다. 본 발명자들은 접합 혼합물에서 추가의 플라스미드-무함유 수신체 야생형 균주(R#2)로 동일한 접합 실험을 수행함으로써 이러한 가능성을 시험하였다( 도 4d 에서의 다이아그램 참조). TAP-Cas9-nsp 또는 TAP-dCas9-nsp를 수신한 R#2 세포 중에서, 약 0.24%와 0.15%가 각각 암피실린 내성이 되었다. 그러나, TAP-Cas9-OXA48 또는 TAP-dCas9-OXA48을 수신한 R#2 세포에서는 암피실린 내성이 관찰되지 않았다( 도 4d ). 전체적으로, 이러한 결과는 blaOXA-48 유전자에 대해 TAP를 지향시키는 것이 pOXA-48a-운반 균주를 암피실린에 대해 민감하게 만드는 효율적인 전략이라는 것을 입증하고 있다. 게다가, TAP는 또한 공여체 및 다른 플라스미드-무포함 수신체가 내성을 발달시키는 것을 방지함으로써 약물-내성 보급을 방해하는 것으로 보인다.
CSTB 소프트웨어: 다종의 박테리아 집단 내 표적 특이적 균주
다른 박테리아 균주에 영향을 주지 않으면서, 특정 박테리아 종에 대해 항균 활성을 수행하는 TAP를 설계하는 것은 표적 유기체(들)의 게놈에는 존재하나, 다른 비-표적 균주의 게놈에는 존재하지 않는 스페이서 시퀀스의 강력한 식별을 필요로 한다. 이러한 작업을 달성하기 위한 도구가 없었기 때문에, 본 발명자들은 광범위한 박테리아 게놈 및 플라스미드에 걸쳐 약 18 내지 23 nt 길이의 스페이서 시퀀스를 비교 분석할 수 있는 "박테리아에 대한 크리스퍼 검색 도구(Crispr Search Tool for Bacteria)" CSTB 알고리즘을 개발하였다. CSTB 백-엔드 데이터베이스는 NCBI 분류체계에 따라 분류된 2919개의 완전 게놈 중에 존재하는 이러한 모티프의 모든 발생을 색인한다. CSTB를 사용하면 표적 염색체 또는 플라스미드 DNA의 고유한 또는 다중 사이트에 대해 TAP를 재프로그래밍하기 위한 적절한 스페이서 시퀀스를 식별할 수 있다.
본 발명자들은, 데이터베이스에 존재하는 임의의 다른 박테리아 게놈을 표적하지 않으면서, CSTB 알고리즘이 부착/소실(A/E: attachment/effacement) 병원성 시트로박터 로덴티움 균주 ICC168(Cr 스페이서) 또는 장병원성 대장균 EPEC 균주 E2348/69(EPEC 스페이서) 또는 병원에서 감염되는 병원성 엔테로박터 클로아세(Ecl 스페이서) 또는 이들 3개(EEC 스페이서)를 표적하는 스페이서 시퀀스를 생성하도록 요청하였다. 시트로박터 로덴티움에 대한 TAP는 고유한 유전자좌를 표적하는 Cr1 스페이서 또는 게놈 전반에 걸쳐 분포하는 22개 유전자좌를 표적하는 Cr22를 운반한다. 대장균 공여체로부터의 TAP-Cas9-Cr1의 전달은 시트로박터 로덴티움 트랜스접합 세포의 생존력을 4 로그-배 감소시킨다. 생-세포 현미경은 TAP-Cas9-Cr1 획득이 시트로박터 로덴티움 필라멘트화 및 해리를 유도하는 반면, TAP-Cas9-nsp에 의해서는 성장 결함이 유도되지 않았음을 나타내었다. 이는, 대장균에서 관찰된 바와 같이, Cas9에 의한 단일 DSB의 유도가 시트로박터 로덴티움에 치명적이라는 것을 표시하고 있다. 일관되게, TAP-Cas9-Cr22에 의해 22개의 염색체 유전자좌를 표적하는 것은 유사한 트랜스접합체 살상 효율을 초래한다. 그러나, 다중 표적화는 TAP 활성에 대한 트랜스접합체가 탈출하는 메카니즘의 기여를 불균형하게 한다. Cr1 단일 표적화에서 탈출하는 20개의 클론을 분석한 결과 표적 염색체 유전자좌의 결실 또는 TAP에 대한 CRISPR 시스템의 비활성화가 동등한 비율로 나타났다. 대조적으로, Cr22 다중 표적화를 탈출하는 클론의 대다수(20개 중의 19개)는 TAP CRISPR 시스템을 비활성화하는 돌연변이를 운반한다. 이는, 심지어 가능하다고는 해도, 동일한 세포 내에서 22개의 표적 염색체 부위의 돌연변이가 매우 드물다는 예측과 일치한다.
F 접합 조직을 통한 TAP 전달은 MG1655 대장균 실험실 균주가 짝짓기의 3시간에서 최대 90% 효율까지 도달하는 데 매우 효율적이다( 도 1 ). 본 발명자들은 비-실험실 균주에서의 TAP-Cas9-nsp 전달의 효율을 정량하였고 MG1655 대장균에 비하여 TAP 획득 빈도가 약 7-배 내지 900-배 감소하여 수신체들 간에서 차이를 관찰하였다( 도 5a ). 이러한 가변성을 설명하기 위해, 본 발명자들은 TAP-Cas9-Cr1, TAP-Cas9-Ecl, TAP-Cas9-EPEC 및 TAP-Cas9-EEC에 대해 수득된 생존 트랜스접합체의 빈도를 해당 박테리아 균주에서 TAP-Cas9-nsp 트랜스접합체의 빈도에 대해 정규화하였다( 도 5b ). 본 발명자들은 TAP-Cas9-Cr1이 시트로박터 로덴티움에서만, TAP-Cas9-Ecl이 엔테로박터 클로아세에서만, TAP-Cas9-EPEC가 대장균 EPEC에서만 트랜스접합체 생존력 손실을 유도하는 반면, TAP-Cas9-EEC는 3개의 병원성 균주를 표적한다는 것을 정량하였다. 대조로서, 본 발명자들은 게놈이 어떠한 스페이서에 의해서도 표적되지 않는 공생하는 에쉬리키아 콜라이 에이취에스 수신체가 이러한 항균 TAP의 어느 것에 의해서도 영향을 받지 않는다는 것을 제시한다( 도 5b ). 이러한 결과는 CSTB 알고리즘에 의해 생성된 스페이서 시퀀스가 단일-종 수신체 집단에 대한 효율적이고 균주-특이적 항균 활성을 위한 TAP의 강력한 재프로그래밍을 가능하게 한다는 것을 입증하고 있다. 이는 또한 하나의 주어진 TAP가 한 번에 여러 종들을 표적할 수 있다는 것을 입증하고 있다.
다음으로, 본 발명자들은 3가지 병원성 균주들 및 공생하는 에쉬리키아 콜라이 에이취에스로 동등한 비율로 구성된 다종 수신체 집단 내에서 균주-특이적 항균 활성을 유도하는 TAP의 능력을 다루었다( 도 5c ). TAP-Cas9-nsp로의 짝짓기 3시간 후 수득된 트랜스접합체의 비율이 변화하고( 도 5d ) 상이한 수신체 균주들 중에서 TAP 전달의 효율을 반영한다( 도 5a ). 본 발명자들은 다종의 수신체 혼합물 내에서, 시트로박터 로덴티움 트랜스접합체 생존력이 TAP-Cas9-Cr1에 의해, 엔테로박터 클로아세가 TAP-Cas9-Ecl에 의해 그리고 에쉬리키아 콜라이 이피이씨가 TAP-Cas9-EPEC에 의해 극적으로 감소되는 반면, 3가지 종들 모두는 3중-표적화 TAP-Cas9-EEC에 의해 영향을 받는다는 것을 관찰하였다. 대조용의 공생하는 에쉬리키아 콜라이 에이취에스의 트랜스접합체의 생존력은 항균 TAP의 어느 것에도 영향을 받지 않는다( 도 5d ). 이러한 결과는 TAP가 비-표적화 종들에 영향을 주지 않으면서 다종 혼합 수신체 집단 내에서 선택적인 살상을 달성한다는 것을 입증하고 있다. 항균성 TAP가 트랜스접합체 집단의 생존력에 선택적으로 영향을 미침에도 불구하고, 병원성 수신체 균주에 대한 TAP 전달의 제한된 효율 및 접합 혼합물 내에서의 이들 균주들의 차등적인 적합성으로 인해 각 종의 총 수신체 수에 유의미하게 반영되지는 않는다.
토의:
현장에서 미생물총 조작을 위한 도구는 현재 초기 단계에 있다. 여기에서 본 발명자들은 시험관 내에서 효율적이고 다종 집단 내의 균주-특이적 항균 활성을 발휘하는 TAP 항균 전략의 능력을 입증하고 있다. TAP의 선택적-살상 활성은 시험된 종들의 약 4 로그-배의 생존력 손실을 유도한다. pOXA48a 카바페넴 내성-플라스미드를 표적하는 TAP는 약제에 대한 균주 민감성을 4 내지 5 로그-배 증가를 초래한다. 현재 개발 중인 대부분의 CRISPR 전달 방법론은 본질적으로 협폭 숙주-범위를 갖는 박테리오파지의 사용에 초점을 맞추고 있다27. 게다가, 몇몇 최근의 연구는 광폭 숙주 범위 RK2 접합 시스템을 성공적으로 사용하여 시험관 내에서 대장균26,28 내지 30 또는 살모넬라 엔테리카(S. enterica)31를 표적하는 CRISPR 시스템을 전달한다. 이러한 접근법에 비해 본 발명자들의 전략의 한 가지 핵심 이점은 다른 종을 표적하지 않고, 관심 대상의 하나 또는 여러 박테리아 균주에 대해 TAP를 특이적으로 재-표적하는 데 사용되어야 하는 gRNA를 강력하게 식별할 수 있는 CSTB 알고리즘에 의해 부여되는 다용도적이다. CRISPR 모티프의 식별에 전용되는 다수의 프로그램들의 가용성에도 불구하고, 지금까지 CSTB 같은 것은 없었다32. TAP는 1-단계-복제에서 스페이서 시퀀스를 변경하여 신속하고 용이하게 재프로그래밍할 수 있다(방법 참조). TAP의 또 다른 이점은 광범위한 엔테로박테리아과에서 활성인 프로모터로부터의 CRISPR 시스템(및 형광 리포터)의 구성적 발현이다. 외부 유도자(external inductor)에 대한 요구사항이 없기 때문에 TAP 접근방식은 생체 내 천연 박테리아 공동체의 변형에 더 적합하다.
본 발명자들의 작업은 또한 TAP 효율이 2개의 주요 제한 인자에 의해 주로 결정된다는 것을 보여주고 있다. 첫 번째 제한 인자는 플라스미드-유래 cas9 유전자를 비활성화하는 돌연변이 또는 표적 시퀀스를 변형시키는 돌연변이를 획득하는 탈출 클론의 약 10-4 내지 10-5 빈도이다. 시트로박터 로덴티움에서 나타난 바와 같이, 표적 시퀀스를 변형시키는 돌연변이 탈출 메카니즘은 표적 박테리아의 게놈 상의 복수의 부위를 표적함으로써 회피될 수 있다. 다른 전략은 필수 유전자의 돌연변이가 숙주 박테리아에게 종종 치명적이기 때문에 필수 유전자를 표적하는 것이다33. 두 번째 제한 매개변수는 표적 균주(들)에 대한 TAP 전달의 효율이다. 지금까지, 지금까지, 접합을 사용하는 항균28, 또는 항-약물29,30,35 방법론 모두는 incP RK2 접합 시스템에 기반하고 있으며, 이는 광폭-숙주 범위를 제공하나, 전달 효율이 낮다(10-4 내지 10-5). 해밀턴과 그의 동료들은 시험관 내 유리 비드를 사용하여 전달 효율을 증가시키는 인공적인 방법을 입증하였다31. 여기에서, 본 발명자들은 밀접하게 연관된 엔테로박테리아과에 상대적으로 효율적인 TAP 전달(10-1 내지 102)을 매개하는 헬퍼 플라스미드로서 F 플라스미드를 사용한다. 따라서, TAP는 다양한 임상적으로 연관된 병원성 또는 내성 박테리아(대장균, 시트로박터, 엔테로박터, 클렙시엘라, 살모넬라, 예르시니아, 시겔라, 세라티아...)를 표적하기에 적합한 것으로 여겨진다. TAP를 사용하여 계통발생학적으로 원위의 종들을 표적하는 것은 전달 능력이 증가된 광폭-숙주 범위 접합 시스템의 개발을 필요로 한다. 이러한 초확산 플라스미드 돌연변이는 Tn-seq 접근법36,37을 통해 성공적으로 단리되었으며 TAP가 지향할 수 있는 박테리아의 범위를 넓히는 귀중한 선택을 나타낼 수 있다.
현재의 체외 개념 증명을 현장 설정으로 변환하는 것은 지시된 방식으로 미생물 조성의 현장 조작을 위한 비-항생제 전략의 개발을 향한 중요한 단계를 나타낼 수 있다. TAP는 감염된 숙주 또는 환경으로부터의 해로운 병원성 및 내성 균주의 억제를 위해 또는 독성 이펙터(effector) 유전자 또는 생물막 형성에 연관되는 유전자의 억제를 통한 항-독성 전략으로서 사용될 수 있다. 임상 또는 환경 설정에서의 TAP 접근법을 장래에 적용하려면 GMO, CRISPR 및 생화학적봉쇄(biocontainment)38-40에 대한 빠르게 진화하는 규정을 고려해야 한다.
참고문헌:
본 출원에서 여러 참고문헌들이 본 발명이 속하는 기술 분야를 설명한다. 이러한 참고문헌들의 개시는 본 출원에 참조로서 통합된다.
1. WHO. Global priority list of antibiotic - resistant bacteria to guide research, discovery, and development of new antibiotics. (2017).
2. Jinek, M. et al. A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity. Science (New York, N.Y.) 337, 816-821 (2012).
3. Gasiunas, G., Barrangou, R., Horvath, P. & Siksnys, V. Cas9-crRNA ribonucleoprotein complex mediates specific DNA cleavage for adaptive immunity in bacteria. Proc Natl Acad Sci U S A 109, E2579-2586 (2012).
4. Qi, L. S. et al. Repurposing CRISPR as an RNA-Guided Platform for Sequence-Specific Control of Gene Expression. Cell 152, 1173-1183 (2013).
5. Bikard, D. et al. Programmable repression and activation of bacterial gene expression using an engineered CRISPR-Cas system. Nucleic Acids Research 41, 7429-7437 (2013).
6. Anders, C., Niewoehner, O., Duerst, A. & Jinek, M. Structural basis of PAM-dependent target DNA recognition by the Cas9 endonuclease. Nature 513, 569-573 (2014).
7. Mart
Figure pct00002
nez-Garc
Figure pct00003
a, E., Aparicio, T., Go
Figure pct00004
i-Moreno, A., Fraile, S. & de Lorenzo, V. SEVA 2.0: an update of the Standard European Vector Architecture for de-/re-construction of bacterial functionalities. Nucleic Acids Res. 43, D1183-1189 (2015).
8. Nolivos, S. et al. Role of AcrAB-TolC multidrug efflux pump in drug-resistance acquisition by plasmid transfer. Science 364, 778-782 (2019).
9. Crisona, N. J. & Clark, A. J. Increase in conjugational transmission frequency of nonconjugative plasmids. Science 196, 186-187 (1977).
10. Mavridou, D. A. I., Gonzalez, D., Clements, A. & Foster, K. R. The pUltra plasmid series: A robust and flexible tool for fluorescent labeling of Enterobacteria. Plasmid 87-88, 65-71 (2016).
11. Cui, L. & Bikard, D. Consequences of Cas9 cleavage in the chromosome of Escherichia coli. Nucleic Acids Res. 44, 4243-4251 (2016).
12. Bhoite, S., van Gerven, N., Chapman, M. R. & Remaut, H. Curli Biogenesis: Bacterial Amyloid Assembly by the Type VIII Secretion Pathway. EcoSal Plus 8, (2019).
13. Vidal, O. et al. Isolation of an Escherichia coli K-12 mutant strain able to form biofilms on inert surfaces: involvement of a new ompR allele that increases curli expression. J. Bacteriol. 180, 2442-2449 (1998).
14. Serra, D. O. & Hengge, R. Experimental Detection and Visualization of the Extracellular Matrix in Macrocolony Biofilms. in c-di-GMP Signaling (ed. Sauer, K.) vol. 1657 133-145 (Springer New York, 2017).
15. Rock, J. M. et al. Programmable transcriptional repression in mycobacteria using an orthogonal CRISPR interference platform. Nature Microbiology 2, (2017).
16. Cho, S. et al. High-Level dCas9 Expression Induces Abnormal Cell Morphology in Escherichia coli. ACS Synthetic Biology 7, 1085-1094 (2018).
17. Zhang, S. & Voigt, C. A. Engineered dCas9 with reduced toxicity in bacteria: implications for genetic circuit design. Nucleic Acids Research (2018) doi:10.1093/nar/gky884.
18. Misra, C. S. et al. Determination of Cas9/dCas9 associated toxicity in microbes. http://biorxiv.org/lookup/doi/10.1101/848135 (2019) doi:10.1101/848135.
19. Lesterlin, C., Ball, G., Schermelleh, L. & Sherratt, D. J. RecA bundles mediate homology pairing between distant sisters during DNA break repair. Nature 506, 249-253 (2014).
20. Semenova, E. et al. Interference by clustered regularly interspaced short palindromic repeat (CRISPR) RNA is governed by a seed sequence. Proceedings of the National Academy of Sciences 108, 10098-10103 (2011).
21. Barlow, M. What antimicrobial resistance has taught us about horizontal gene transfer. Methods Mol. Biol. 532, 397-411 (2009).
22. Codjoe, F. & Donkor, E. Carbapenem Resistance: A Review. Medical Sciences 6, 1 (2017).
23. Poirel, L., Bonnin, R. A. & Nordmann, P. Genetic Features of the Widespread Plasmid Coding for the Carbapenemase OXA-48. Antimicrobial Agents and Chemotherapy 56, 559-562 (2012).
24. Hayes, F. Toxins-antitoxins: plasmid maintenance, programmed cell death, and cell cycle arrest. Science 301, 1496-1499 (2003).
25. Mnif, B. et al. Molecular characterization of addiction systems of plasmids encoding extended-spectrum beta-lactamases in Escherichia coli. J. Antimicrob. Chemother. 65, 1599-1603 (2010).
26. Citorik, R. J., Mimee, M. & Lu, T. K. Sequence-specific antimicrobials using efficiently delivered RNA-guided nucleases. Nature Biotechnology 32, 1141-1145 (2014).
27. Bikard, D. & Barrangou, R. Using CRISPR-Cas systems as antimicrobials. Curr. Opin. Microbiol. 37, 155-160 (2017).
28. Ji, W. et al. Specific gene repression by CRISPRi system transferred through bacterial conjugation. ACS Synth Biol 3, 929-931 (2014).
29. Dong, H., Xiang, H., Mu, D., Wang, D. & Wang, T. Exploiting a conjugative CRISPR/Cas9 system to eliminate plasmid harbouring the mcr-1 gene from Escherichia coli. Int. J. Antimicrob. Agents 53, 1-8 (2019).
30. Ruotsalainen, P., Penttinen, R., Mattila, S. & Jalasvuori, M. Midbiotics: conjugative plasmids for genetic engineering of natural gut flora. Gut Microbes 1-11 (2019) doi:10.1080/19490976.2019.1591136.
31. Hamilton, T. A. et al. Efficient inter-species conjugative transfer of a CRISPR nuclease for targeted bacterial killing. Nat Commun 10, 4544 (2019).
32. Alkhnbashi, O. S., Meier, T., Mitrofanov, A., Backofen, R. & Voß, B. CRISPR-Cas bioinformatics. Methods 172, 3-11 (2020).
33. Gomaa, A. A. et al. Programmable Removal of Bacterial Strains by Use of Genome-Targeting CRISPR-Cas Systems. mBio 5, (2014).
34. Citorik, R. J., Mimee, M. & Lu, T. K. Sequence-specific antimicrobials using efficiently delivered RNA-guided nucleases. Nat. Biotechnol. 32, 1141-1145 (2014).
35. Wang, P. et al. Eliminating mcr-1-harbouring plasmids in clinical isolates using the CRISPR/Cas9 system. Journal of Antimicrobial Chemotherapy 74, 2559-2565 (2019).
36. Yamaichi, Y. et al. High-resolution genetic analysis of the requirements for horizontal transmission of the ESBL plasmid from Escherichia coli O104:H4. Nucleic Acids Res. 43, 348-360 (2015).
37. Poidevin, M. et al. Mutation in ESBL Plasmid from Escherichia coli O104:H4 Leads Autoagglutination and Enhanced Plasmid Dissemination. Front Microbiol 9, 130 (2018).
38. Fellmann, C., Gowen, B. G., Lin, P.-C., Doudna, J. A. & Corn, J. E. Cornerstones of CRISPR-Cas in drug discovery and therapy. Nat Rev Drug Discov 16, 89-100 (2017).
39. Davison, J. & Ammann, K. New GMO regulations for old: Determining a new future for EU crop biotechnology. GM Crops Food 8, 13-34 (2017).
40. Brokowski, C. & Adli, M. CRISPR Ethics: Moral Considerations for Applications of a Powerful Tool. J Mol Biol 431, 88-101 (2019).
SEQUENCE LISTING <110> CENTRE NATIONAL DE LA RECHERCHE SCIENTIFIQUE (CNRS) UNIVERSITE CLAUDE BERNARD - LYON 1 <120> TARGETED-ANTIBACTERIAL-PLASMIDS COMBINING CONJUGATION AND CRISPR /CAS SYSTEMS AND USES THEREOF <130> IP20234280FR <160> 28 <170> PatentIn version 3.3 <210> 1 <211> 772 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> OriV of pBBR1 plasmid <400> 1 gcttatctcc atgcggtagg ggtgccgcac ggttgcggca ccatgcgcaa tcagctgcaa 60 cttttcggca gcgcgacaac aattatgcgt tgcgtaaaag tggcagtcaa ttacagattt 120 tctttaacct acgcaatgag ctattgcggg gggtgccgca atgagctgtt gcgtaccccc 180 cttttttaag ttgttgattt ttaagtcttt cgcatttcgc cctatatcta gttctttggt 240 gcccaaagaa gggcacccct gcggggttcc cccacgcctt cggcgcggct ccccctccgg 300 caaaaagtgg cccctccggg gcttgttgat cgactgcgcg gccttcggcc ttgcccaagg 360 tggcgctgcc cccttggaac ccccgcactc gccgccgtga ggctcggggg gcaggcgggc 420 gggcttcgcc cttcgactgc ccccactcgc ataggcttgg gtcgttccag gcgcgtcaag 480 gccaagccgc tgcgcggtcg ctgcgcgagc cttgacccgc cttccacttg gtgtccaacc 540 ggcaagcgaa gcgcgcaggc cgcaggccgg aggcttttcc ccagagaaaa ttaaaaaaat 600 tgatggggca aggccgcagg ccgcgcagtt ggagccggtg ggtatgtggt cgaaggctgg 660 gtagccggtg ggcaatccct gtggtcaagc tcgtgggcag gcgcagcctg tccatcagct 720 tgtccagcag ggttgtccac gggccgagcg aagcgagcca gccggtggcc gc 772 <210> 2 <211> 109 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> OriT of RP4 plasmid <400> 2 gggcaggata ggtgaagtag gcccacccgc gagcgggtgt tccttcttca ctgtccctta 60 ttcgcacctg gcggtgctca acgggaatcc tgctctgcga ggctggccg 109 <210> 3 <211> 290 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> oriT of F plasmid <400> 3 aggctcaaca ggttggtggt tctcaccacc aaaagcacca caccccacgc aaaaacaagt 60 ttttgctgat ttttctttat aaatagagtg ttatgaaaaa ttagtttctc ttactctctt 120 tatgatattt aaaaaagcgg tgtcggcgcg gctacaacaa cgcgccgaca ccgttttgta 180 ggggtggtac tgactatttt tataaaaaac attattttat attaggggtg ctgctagcgg 240 cgcggtgtgt ttttttatag gataccgcta ggggcgctgc tagcggtgcg 290 <210> 4 <211> 1368 <212> PRT <213> Streptococcus pyogenes <400> 4 Met Asp Lys Lys Tyr Ser Ile Gly Leu Ala Ile Gly Thr Asn Ser Val 1 5 10 15 Gly Trp Ala Val Ile Thr Asp Glu Tyr Lys Val Pro Ser Lys Lys Phe 20 25 30 Lys Val Leu Gly Asn Thr Asp Arg His Ser Ile Lys Lys Asn Leu Ile 35 40 45 Gly Ala Leu Leu Phe Asp Ser Gly Glu Thr Ala Glu Ala Thr Arg Leu 50 55 60 Lys Arg Thr Ala Arg Arg Arg Tyr Thr Arg Arg Lys Asn Arg Ile Cys 65 70 75 80 Tyr Leu Gln Glu Ile Phe Ser Asn Glu Met Ala Lys Val Asp Asp Ser 85 90 95 Phe Phe His Arg Leu Glu Glu Ser Phe Leu Val Glu Glu Asp Lys Lys 100 105 110 His Glu Arg His Pro Ile Phe Gly Asn Ile Val Asp Glu Val Ala Tyr 115 120 125 His Glu Lys Tyr Pro Thr Ile Tyr His Leu Arg Lys Lys Leu Val Asp 130 135 140 Ser Thr Asp Lys Ala Asp Leu Arg Leu Ile Tyr Leu Ala Leu Ala His 145 150 155 160 Met Ile Lys Phe Arg Gly His Phe Leu Ile Glu Gly Asp Leu Asn Pro 165 170 175 Asp Asn Ser Asp Val Asp Lys Leu Phe Ile Gln Leu Val Gln Thr Tyr 180 185 190 Asn Gln Leu Phe Glu Glu Asn Pro Ile Asn Ala Ser Gly Val Asp Ala 195 200 205 Lys Ala Ile Leu Ser Ala Arg Leu Ser Lys Ser Arg Arg Leu Glu Asn 210 215 220 Leu Ile Ala Gln Leu Pro Gly Glu Lys Lys Asn Gly Leu Phe Gly Asn 225 230 235 240 Leu Ile Ala Leu Ser Leu Gly Leu Thr Pro Asn Phe Lys Ser Asn Phe 245 250 255 Asp Leu Ala Glu Asp Ala Lys Leu Gln Leu Ser Lys Asp Thr Tyr Asp 260 265 270 Asp Asp Leu Asp Asn Leu Leu Ala Gln Ile Gly Asp Gln Tyr Ala Asp 275 280 285 Leu Phe Leu Ala Ala Lys Asn Leu Ser Asp Ala Ile Leu Leu Ser Asp 290 295 300 Ile Leu Arg Val Asn Thr Glu Ile Thr Lys Ala Pro Leu Ser Ala Ser 305 310 315 320 Met Ile Lys Arg Tyr Asp Glu His His Gln Asp Leu Thr Leu Leu Lys 325 330 335 Ala Leu Val Arg Gln Gln Leu Pro Glu Lys Tyr Lys Glu Ile Phe Phe 340 345 350 Asp Gln Ser Lys Asn Gly Tyr Ala Gly Tyr Ile Asp Gly Gly Ala Ser 355 360 365 Gln Glu Glu Phe Tyr Lys Phe Ile Lys Pro Ile Leu Glu Lys Met Asp 370 375 380 Gly Thr Glu Glu Leu Leu Val Lys Leu Asn Arg Glu Asp Leu Leu Arg 385 390 395 400 Lys Gln Arg Thr Phe Asp Asn Gly Ser Ile Pro His Gln Ile His Leu 405 410 415 Gly Glu Leu His Ala Ile Leu Arg Arg Gln Glu Asp Phe Tyr Pro Phe 420 425 430 Leu Lys Asp Asn Arg Glu Lys Ile Glu Lys Ile Leu Thr Phe Arg Ile 435 440 445 Pro Tyr Tyr Val Gly Pro Leu Ala Arg Gly Asn Ser Arg Phe Ala Trp 450 455 460 Met Thr Arg Lys Ser Glu Glu Thr Ile Thr Pro Trp Asn Phe Glu Glu 465 470 475 480 Val Val Asp Lys Gly Ala Ser Ala Gln Ser Phe Ile Glu Arg Met Thr 485 490 495 Asn Phe Asp Lys Asn Leu Pro Asn Glu Lys Val Leu Pro Lys His Ser 500 505 510 Leu Leu Tyr Glu Tyr Phe Thr Val Tyr Asn Glu Leu Thr Lys Val Lys 515 520 525 Tyr Val Thr Glu Gly Met Arg Lys Pro Ala Phe Leu Ser Gly Glu Gln 530 535 540 Lys Lys Ala Ile Val Asp Leu Leu Phe Lys Thr Asn Arg Lys Val Thr 545 550 555 560 Val Lys Gln Leu Lys Glu Asp Tyr Phe Lys Lys Ile Glu Cys Phe Asp 565 570 575 Ser Val Glu Ile Ser Gly Val Glu Asp Arg Phe Asn Ala Ser Leu Gly 580 585 590 Thr Tyr His Asp Leu Leu Lys Ile Ile Lys Asp Lys Asp Phe Leu Asp 595 600 605 Asn Glu Glu Asn Glu Asp Ile Leu Glu Asp Ile Val Leu Thr Leu Thr 610 615 620 Leu Phe Glu Asp Arg Glu Met Ile Glu Glu Arg Leu Lys Thr Tyr Ala 625 630 635 640 His Leu Phe Asp Asp Lys Val Met Lys Gln Leu Lys Arg Arg Arg Tyr 645 650 655 Thr Gly Trp Gly Arg Leu Ser Arg Lys Leu Ile Asn Gly Ile Arg Asp 660 665 670 Lys Gln Ser Gly Lys Thr Ile Leu Asp Phe Leu Lys Ser Asp Gly Phe 675 680 685 Ala Asn Arg Asn Phe Met Gln Leu Ile His Asp Asp Ser Leu Thr Phe 690 695 700 Lys Glu Asp Ile Gln Lys Ala Gln Val Ser Gly Gln Gly Asp Ser Leu 705 710 715 720 His Glu His Ile Ala Asn Leu Ala Gly Ser Pro Ala Ile Lys Lys Gly 725 730 735 Ile Leu Gln Thr Val Lys Val Val Asp Glu Leu Val Lys Val Met Gly 740 745 750 Arg His Lys Pro Glu Asn Ile Val Ile Glu Met Ala Arg Glu Asn Gln 755 760 765 Thr Thr Gln Lys Gly Gln Lys Asn Ser Arg Glu Arg Met Lys Arg Ile 770 775 780 Glu Glu Gly Ile Lys Glu Leu Gly Ser Gln Ile Leu Lys Glu His Pro 785 790 795 800 Val Glu Asn Thr Gln Leu Gln Asn Glu Lys Leu Tyr Leu Tyr Tyr Leu 805 810 815 Gln Asn Gly Arg Asp Met Tyr Val Asp Gln Glu Leu Asp Ile Asn Arg 820 825 830 Leu Ser Asp Tyr Asp Val Asp His Ile Val Pro Gln Ser Phe Leu Lys 835 840 845 Asp Asp Ser Ile Asp Asn Lys Val Leu Thr Arg Ser Asp Lys Asn Arg 850 855 860 Gly Lys Ser Asp Asn Val Pro Ser Glu Glu Val Val Lys Lys Met Lys 865 870 875 880 Asn Tyr Trp Arg Gln Leu Leu Asn Ala Lys Leu Ile Thr Gln Arg Lys 885 890 895 Phe Asp Asn Leu Thr Lys Ala Glu Arg Gly Gly Leu Ser Glu Leu Asp 900 905 910 Lys Ala Gly Phe Ile Lys Arg Gln Leu Val Glu Thr Arg Gln Ile Thr 915 920 925 Lys His Val Ala Gln Ile Leu Asp Ser Arg Met Asn Thr Lys Tyr Asp 930 935 940 Glu Asn Asp Lys Leu Ile Arg Glu Val Lys Val Ile Thr Leu Lys Ser 945 950 955 960 Lys Leu Val Ser Asp Phe Arg Lys Asp Phe Gln Phe Tyr Lys Val Arg 965 970 975 Glu Ile Asn Asn Tyr His His Ala His Asp Ala Tyr Leu Asn Ala Val 980 985 990 Val Gly Thr Ala Leu Ile Lys Lys Tyr Pro Lys Leu Glu Ser Glu Phe 995 1000 1005 Val Tyr Gly Asp Tyr Lys Val Tyr Asp Val Arg Lys Met Ile Ala 1010 1015 1020 Lys Ser Glu Gln Glu Ile Gly Lys Ala Thr Ala Lys Tyr Phe Phe 1025 1030 1035 Tyr Ser Asn Ile Met Asn Phe Phe Lys Thr Glu Ile Thr Leu Ala 1040 1045 1050 Asn Gly Glu Ile Arg Lys Arg Pro Leu Ile Glu Thr Asn Gly Glu 1055 1060 1065 Thr Gly Glu Ile Val Trp Asp Lys Gly Arg Asp Phe Ala Thr Val 1070 1075 1080 Arg Lys Val Leu Ser Met Pro Gln Val Asn Ile Val Lys Lys Thr 1085 1090 1095 Glu Val Gln Thr Gly Gly Phe Ser Lys Glu Ser Ile Leu Pro Lys 1100 1105 1110 Arg Asn Ser Asp Lys Leu Ile Ala Arg Lys Lys Asp Trp Asp Pro 1115 1120 1125 Lys Lys Tyr Gly Gly Phe Asp Ser Pro Thr Val Ala Tyr Ser Val 1130 1135 1140 Leu Val Val Ala Lys Val Glu Lys Gly Lys Ser Lys Lys Leu Lys 1145 1150 1155 Ser Val Lys Glu Leu Leu Gly Ile Thr Ile Met Glu Arg Ser Ser 1160 1165 1170 Phe Glu Lys Asn Pro Ile Asp Phe Leu Glu Ala Lys Gly Tyr Lys 1175 1180 1185 Glu Val Lys Lys Asp Leu Ile Ile Lys Leu Pro Lys Tyr Ser Leu 1190 1195 1200 Phe Glu Leu Glu Asn Gly Arg Lys Arg Met Leu Ala Ser Ala Gly 1205 1210 1215 Glu Leu Gln Lys Gly Asn Glu Leu Ala Leu Pro Ser Lys Tyr Val 1220 1225 1230 Asn Phe Leu Tyr Leu Ala Ser His Tyr Glu Lys Leu Lys Gly Ser 1235 1240 1245 Pro Glu Asp Asn Glu Gln Lys Gln Leu Phe Val Glu Gln His Lys 1250 1255 1260 His Tyr Leu Asp Glu Ile Ile Glu Gln Ile Ser Glu Phe Ser Lys 1265 1270 1275 Arg Val Ile Leu Ala Asp Ala Asn Leu Asp Lys Val Leu Ser Ala 1280 1285 1290 Tyr Asn Lys His Arg Asp Lys Pro Ile Arg Glu Gln Ala Glu Asn 1295 1300 1305 Ile Ile His Leu Phe Thr Leu Thr Asn Leu Gly Ala Pro Ala Ala 1310 1315 1320 Phe Lys Tyr Phe Asp Thr Thr Ile Asp Arg Lys Arg Tyr Thr Ser 1325 1330 1335 Thr Lys Glu Val Leu Asp Ala Thr Leu Ile His Gln Ser Ile Thr 1340 1345 1350 Gly Leu Tyr Glu Thr Arg Ile Asp Leu Ser Gln Leu Gly Gly Asp 1355 1360 1365 <210> 5 <211> 1368 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Nickase <400> 5 Met Asp Lys Lys Tyr Ser Ile Gly Leu Ala Ile Gly Thr Asn Ser Val 1 5 10 15 Gly Trp Ala Val Ile Thr Asp Glu Tyr Lys Val Pro Ser Lys Lys Phe 20 25 30 Lys Val Leu Gly Asn Thr Asp Arg His Ser Ile Lys Lys Asn Leu Ile 35 40 45 Gly Ala Leu Leu Phe Asp Ser Gly Glu Thr Ala Glu Ala Thr Arg Leu 50 55 60 Lys Arg Thr Ala Arg Arg Arg Tyr Thr Arg Arg Lys Asn Arg Ile Cys 65 70 75 80 Tyr Leu Gln Glu Ile Phe Ser Asn Glu Met Ala Lys Val Asp Asp Ser 85 90 95 Phe Phe His Arg Leu Glu Glu Ser Phe Leu Val Glu Glu Asp Lys Lys 100 105 110 His Glu Arg His Pro Ile Phe Gly Asn Ile Val Asp Glu Val Ala Tyr 115 120 125 His Glu Lys Tyr Pro Thr Ile Tyr His Leu Arg Lys Lys Leu Val Asp 130 135 140 Ser Thr Asp Lys Ala Asp Leu Arg Leu Ile Tyr Leu Ala Leu Ala His 145 150 155 160 Met Ile Lys Phe Arg Gly His Phe Leu Ile Glu Gly Asp Leu Asn Pro 165 170 175 Asp Asn Ser Asp Val Asp Lys Leu Phe Ile Gln Leu Val Gln Thr Tyr 180 185 190 Asn Gln Leu Phe Glu Glu Asn Pro Ile Asn Ala Ser Gly Val Asp Ala 195 200 205 Lys Ala Ile Leu Ser Ala Arg Leu Ser Lys Ser Arg Arg Leu Glu Asn 210 215 220 Leu Ile Ala Gln Leu Pro Gly Glu Lys Lys Asn Gly Leu Phe Gly Asn 225 230 235 240 Leu Ile Ala Leu Ser Leu Gly Leu Thr Pro Asn Phe Lys Ser Asn Phe 245 250 255 Asp Leu Ala Glu Asp Ala Lys Leu Gln Leu Ser Lys Asp Thr Tyr Asp 260 265 270 Asp Asp Leu Asp Asn Leu Leu Ala Gln Ile Gly Asp Gln Tyr Ala Asp 275 280 285 Leu Phe Leu Ala Ala Lys Asn Leu Ser Asp Ala Ile Leu Leu Ser Asp 290 295 300 Ile Leu Arg Val Asn Thr Glu Ile Thr Lys Ala Pro Leu Ser Ala Ser 305 310 315 320 Met Ile Lys Arg Tyr Asp Glu His His Gln Asp Leu Thr Leu Leu Lys 325 330 335 Ala Leu Val Arg Gln Gln Leu Pro Glu Lys Tyr Lys Glu Ile Phe Phe 340 345 350 Asp Gln Ser Lys Asn Gly Tyr Ala Gly Tyr Ile Asp Gly Gly Ala Ser 355 360 365 Gln Glu Glu Phe Tyr Lys Phe Ile Lys Pro Ile Leu Glu Lys Met Asp 370 375 380 Gly Thr Glu Glu Leu Leu Val Lys Leu Asn Arg Glu Asp Leu Leu Arg 385 390 395 400 Lys Gln Arg Thr Phe Asp Asn Gly Ser Ile Pro His Gln Ile His Leu 405 410 415 Gly Glu Leu His Ala Ile Leu Arg Arg Gln Glu Asp Phe Tyr Pro Phe 420 425 430 Leu Lys Asp Asn Arg Glu Lys Ile Glu Lys Ile Leu Thr Phe Arg Ile 435 440 445 Pro Tyr Tyr Val Gly Pro Leu Ala Arg Gly Asn Ser Arg Phe Ala Trp 450 455 460 Met Thr Arg Lys Ser Glu Glu Thr Ile Thr Pro Trp Asn Phe Glu Glu 465 470 475 480 Val Val Asp Lys Gly Ala Ser Ala Gln Ser Phe Ile Glu Arg Met Thr 485 490 495 Asn Phe Asp Lys Asn Leu Pro Asn Glu Lys Val Leu Pro Lys His Ser 500 505 510 Leu Leu Tyr Glu Tyr Phe Thr Val Tyr Asn Glu Leu Thr Lys Val Lys 515 520 525 Tyr Val Thr Glu Gly Met Arg Lys Pro Ala Phe Leu Ser Gly Glu Gln 530 535 540 Lys Lys Ala Ile Val Asp Leu Leu Phe Lys Thr Asn Arg Lys Val Thr 545 550 555 560 Val Lys Gln Leu Lys Glu Asp Tyr Phe Lys Lys Ile Glu Cys Phe Asp 565 570 575 Ser Val Glu Ile Ser Gly Val Glu Asp Arg Phe Asn Ala Ser Leu Gly 580 585 590 Thr Tyr His Asp Leu Leu Lys Ile Ile Lys Asp Lys Asp Phe Leu Asp 595 600 605 Asn Glu Glu Asn Glu Asp Ile Leu Glu Asp Ile Val Leu Thr Leu Thr 610 615 620 Leu Phe Glu Asp Arg Glu Met Ile Glu Glu Arg Leu Lys Thr Tyr Ala 625 630 635 640 His Leu Phe Asp Asp Lys Val Met Lys Gln Leu Lys Arg Arg Arg Tyr 645 650 655 Thr Gly Trp Gly Arg Leu Ser Arg Lys Leu Ile Asn Gly Ile Arg Asp 660 665 670 Lys Gln Ser Gly Lys Thr Ile Leu Asp Phe Leu Lys Ser Asp Gly Phe 675 680 685 Ala Asn Arg Asn Phe Met Gln Leu Ile His Asp Asp Ser Leu Thr Phe 690 695 700 Lys Glu Asp Ile Gln Lys Ala Gln Val Ser Gly Gln Gly Asp Ser Leu 705 710 715 720 His Glu His Ile Ala Asn Leu Ala Gly Ser Pro Ala Ile Lys Lys Gly 725 730 735 Ile Leu Gln Thr Val Lys Val Val Asp Glu Leu Val Lys Val Met Gly 740 745 750 Arg His Lys Pro Glu Asn Ile Val Ile Glu Met Ala Arg Glu Asn Gln 755 760 765 Thr Thr Gln Lys Gly Gln Lys Asn Ser Arg Glu Arg Met Lys Arg Ile 770 775 780 Glu Glu Gly Ile Lys Glu Leu Gly Ser Gln Ile Leu Lys Glu His Pro 785 790 795 800 Val Glu Asn Thr Gln Leu Gln Asn Glu Lys Leu Tyr Leu Tyr Tyr Leu 805 810 815 Gln Asn Gly Arg Asp Met Tyr Val Asp Gln Glu Leu Asp Ile Asn Arg 820 825 830 Leu Ser Asp Tyr Asp Val Asp His Ile Val Pro Gln Ser Phe Leu Lys 835 840 845 Asp Asp Ser Ile Asp Asn Lys Val Leu Thr Arg Ser Asp Lys Asn Arg 850 855 860 Gly Lys Ser Asp Asn Val Pro Ser Glu Glu Val Val Lys Lys Met Lys 865 870 875 880 Asn Tyr Trp Arg Gln Leu Leu Asn Ala Lys Leu Ile Thr Gln Arg Lys 885 890 895 Phe Asp Asn Leu Thr Lys Ala Glu Arg Gly Gly Leu Ser Glu Leu Asp 900 905 910 Lys Ala Gly Phe Ile Lys Arg Gln Leu Val Glu Thr Arg Gln Ile Thr 915 920 925 Lys His Val Ala Gln Ile Leu Asp Ser Arg Met Asn Thr Lys Tyr Asp 930 935 940 Glu Asn Asp Lys Leu Ile Arg Glu Val Lys Val Ile Thr Leu Lys Ser 945 950 955 960 Lys Leu Val Ser Asp Phe Arg Lys Asp Phe Gln Phe Tyr Lys Val Arg 965 970 975 Glu Ile Asn Asn Tyr His His Ala His Asp Ala Tyr Leu Asn Ala Val 980 985 990 Val Gly Thr Ala Leu Ile Lys Lys Tyr Pro Lys Leu Glu Ser Glu Phe 995 1000 1005 Val Tyr Gly Asp Tyr Lys Val Tyr Asp Val Arg Lys Met Ile Ala 1010 1015 1020 Lys Ser Glu Gln Glu Ile Gly Lys Ala Thr Ala Lys Tyr Phe Phe 1025 1030 1035 Tyr Ser Asn Ile Met Asn Phe Phe Lys Thr Glu Ile Thr Leu Ala 1040 1045 1050 Asn Gly Glu Ile Arg Lys Arg Pro Leu Ile Glu Thr Asn Gly Glu 1055 1060 1065 Thr Gly Glu Ile Val Trp Asp Lys Gly Arg Asp Phe Ala Thr Val 1070 1075 1080 Arg Lys Val Leu Ser Met Pro Gln Val Asn Ile Val Lys Lys Thr 1085 1090 1095 Glu Val Gln Thr Gly Gly Phe Ser Lys Glu Ser Ile Leu Pro Lys 1100 1105 1110 Arg Asn Ser Asp Lys Leu Ile Ala Arg Lys Lys Asp Trp Asp Pro 1115 1120 1125 Lys Lys Tyr Gly Gly Phe Asp Ser Pro Thr Val Ala Tyr Ser Val 1130 1135 1140 Leu Val Val Ala Lys Val Glu Lys Gly Lys Ser Lys Lys Leu Lys 1145 1150 1155 Ser Val Lys Glu Leu Leu Gly Ile Thr Ile Met Glu Arg Ser Ser 1160 1165 1170 Phe Glu Lys Asn Pro Ile Asp Phe Leu Glu Ala Lys Gly Tyr Lys 1175 1180 1185 Glu Val Lys Lys Asp Leu Ile Ile Lys Leu Pro Lys Tyr Ser Leu 1190 1195 1200 Phe Glu Leu Glu Asn Gly Arg Lys Arg Met Leu Ala Ser Ala Gly 1205 1210 1215 Glu Leu Gln Lys Gly Asn Glu Leu Ala Leu Pro Ser Lys Tyr Val 1220 1225 1230 Asn Phe Leu Tyr Leu Ala Ser His Tyr Glu Lys Leu Lys Gly Ser 1235 1240 1245 Pro Glu Asp Asn Glu Gln Lys Gln Leu Phe Val Glu Gln His Lys 1250 1255 1260 His Tyr Leu Asp Glu Ile Ile Glu Gln Ile Ser Glu Phe Ser Lys 1265 1270 1275 Arg Val Ile Leu Ala Asp Ala Asn Leu Asp Lys Val Leu Ser Ala 1280 1285 1290 Tyr Asn Lys His Arg Asp Lys Pro Ile Arg Glu Gln Ala Glu Asn 1295 1300 1305 Ile Ile His Leu Phe Thr Leu Thr Asn Leu Gly Ala Pro Ala Ala 1310 1315 1320 Phe Lys Tyr Phe Asp Thr Thr Ile Asp Arg Lys Arg Tyr Thr Ser 1325 1330 1335 Thr Lys Glu Val Leu Asp Ala Thr Leu Ile His Gln Ser Ile Thr 1340 1345 1350 Gly Leu Tyr Glu Thr Arg Ile Asp Leu Ser Gln Leu Gly Gly Asp 1355 1360 1365 <210> 6 <211> 1368 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Nickase <400> 6 Met Asp Lys Lys Tyr Ser Ile Gly Leu Asp Ile Gly Thr Asn Ser Val 1 5 10 15 Gly Trp Ala Val Ile Thr Asp Glu Tyr Lys Val Pro Ser Lys Lys Phe 20 25 30 Lys Val Leu Gly Asn Thr Asp Arg His Ser Ile Lys Lys Asn Leu Ile 35 40 45 Gly Ala Leu Leu Phe Asp Ser Gly Glu Thr Ala Glu Ala Thr Arg Leu 50 55 60 Lys Arg Thr Ala Arg Arg Arg Tyr Thr Arg Arg Lys Asn Arg Ile Cys 65 70 75 80 Tyr Leu Gln Glu Ile Phe Ser Asn Glu Met Ala Lys Val Asp Asp Ser 85 90 95 Phe Phe His Arg Leu Glu Glu Ser Phe Leu Val Glu Glu Asp Lys Lys 100 105 110 His Glu Arg His Pro Ile Phe Gly Asn Ile Val Asp Glu Val Ala Tyr 115 120 125 His Glu Lys Tyr Pro Thr Ile Tyr His Leu Arg Lys Lys Leu Val Asp 130 135 140 Ser Thr Asp Lys Ala Asp Leu Arg Leu Ile Tyr Leu Ala Leu Ala His 145 150 155 160 Met Ile Lys Phe Arg Gly His Phe Leu Ile Glu Gly Asp Leu Asn Pro 165 170 175 Asp Asn Ser Asp Val Asp Lys Leu Phe Ile Gln Leu Val Gln Thr Tyr 180 185 190 Asn Gln Leu Phe Glu Glu Asn Pro Ile Asn Ala Ser Gly Val Asp Ala 195 200 205 Lys Ala Ile Leu Ser Ala Arg Leu Ser Lys Ser Arg Arg Leu Glu Asn 210 215 220 Leu Ile Ala Gln Leu Pro Gly Glu Lys Lys Asn Gly Leu Phe Gly Asn 225 230 235 240 Leu Ile Ala Leu Ser Leu Gly Leu Thr Pro Asn Phe Lys Ser Asn Phe 245 250 255 Asp Leu Ala Glu Asp Ala Lys Leu Gln Leu Ser Lys Asp Thr Tyr Asp 260 265 270 Asp Asp Leu Asp Asn Leu Leu Ala Gln Ile Gly Asp Gln Tyr Ala Asp 275 280 285 Leu Phe Leu Ala Ala Lys Asn Leu Ser Asp Ala Ile Leu Leu Ser Asp 290 295 300 Ile Leu Arg Val Asn Thr Glu Ile Thr Lys Ala Pro Leu Ser Ala Ser 305 310 315 320 Met Ile Lys Arg Tyr Asp Glu His His Gln Asp Leu Thr Leu Leu Lys 325 330 335 Ala Leu Val Arg Gln Gln Leu Pro Glu Lys Tyr Lys Glu Ile Phe Phe 340 345 350 Asp Gln Ser Lys Asn Gly Tyr Ala Gly Tyr Ile Asp Gly Gly Ala Ser 355 360 365 Gln Glu Glu Phe Tyr Lys Phe Ile Lys Pro Ile Leu Glu Lys Met Asp 370 375 380 Gly Thr Glu Glu Leu Leu Val Lys Leu Asn Arg Glu Asp Leu Leu Arg 385 390 395 400 Lys Gln Arg Thr Phe Asp Asn Gly Ser Ile Pro His Gln Ile His Leu 405 410 415 Gly Glu Leu His Ala Ile Leu Arg Arg Gln Glu Asp Phe Tyr Pro Phe 420 425 430 Leu Lys Asp Asn Arg Glu Lys Ile Glu Lys Ile Leu Thr Phe Arg Ile 435 440 445 Pro Tyr Tyr Val Gly Pro Leu Ala Arg Gly Asn Ser Arg Phe Ala Trp 450 455 460 Met Thr Arg Lys Ser Glu Glu Thr Ile Thr Pro Trp Asn Phe Glu Glu 465 470 475 480 Val Val Asp Lys Gly Ala Ser Ala Gln Ser Phe Ile Glu Arg Met Thr 485 490 495 Asn Phe Asp Lys Asn Leu Pro Asn Glu Lys Val Leu Pro Lys His Ser 500 505 510 Leu Leu Tyr Glu Tyr Phe Thr Val Tyr Asn Glu Leu Thr Lys Val Lys 515 520 525 Tyr Val Thr Glu Gly Met Arg Lys Pro Ala Phe Leu Ser Gly Glu Gln 530 535 540 Lys Lys Ala Ile Val Asp Leu Leu Phe Lys Thr Asn Arg Lys Val Thr 545 550 555 560 Val Lys Gln Leu Lys Glu Asp Tyr Phe Lys Lys Ile Glu Cys Phe Asp 565 570 575 Ser Val Glu Ile Ser Gly Val Glu Asp Arg Phe Asn Ala Ser Leu Gly 580 585 590 Thr Tyr His Asp Leu Leu Lys Ile Ile Lys Asp Lys Asp Phe Leu Asp 595 600 605 Asn Glu Glu Asn Glu Asp Ile Leu Glu Asp Ile Val Leu Thr Leu Thr 610 615 620 Leu Phe Glu Asp Arg Glu Met Ile Glu Glu Arg Leu Lys Thr Tyr Ala 625 630 635 640 His Leu Phe Asp Asp Lys Val Met Lys Gln Leu Lys Arg Arg Arg Tyr 645 650 655 Thr Gly Trp Gly Arg Leu Ser Arg Lys Leu Ile Asn Gly Ile Arg Asp 660 665 670 Lys Gln Ser Gly Lys Thr Ile Leu Asp Phe Leu Lys Ser Asp Gly Phe 675 680 685 Ala Asn Arg Asn Phe Met Gln Leu Ile His Asp Asp Ser Leu Thr Phe 690 695 700 Lys Glu Asp Ile Gln Lys Ala Gln Val Ser Gly Gln Gly Asp Ser Leu 705 710 715 720 His Glu His Ile Ala Asn Leu Ala Gly Ser Pro Ala Ile Lys Lys Gly 725 730 735 Ile Leu Gln Thr Val Lys Val Val Asp Glu Leu Val Lys Val Met Gly 740 745 750 Arg His Lys Pro Glu Asn Ile Val Ile Glu Met Ala Arg Glu Asn Gln 755 760 765 Thr Thr Gln Lys Gly Gln Lys Asn Ser Arg Glu Arg Met Lys Arg Ile 770 775 780 Glu Glu Gly Ile Lys Glu Leu Gly Ser Gln Ile Leu Lys Glu His Pro 785 790 795 800 Val Glu Asn Thr Gln Leu Gln Asn Glu Lys Leu Tyr Leu Tyr Tyr Leu 805 810 815 Gln Asn Gly Arg Asp Met Tyr Val Asp Gln Glu Leu Asp Ile Asn Arg 820 825 830 Leu Ser Asp Tyr Asp Val Asp Ala Ile Val Pro Gln Ser Phe Leu Lys 835 840 845 Asp Asp Ser Ile Asp Asn Lys Val Leu Thr Arg Ser Asp Lys Asn Arg 850 855 860 Gly Lys Ser Asp Asn Val Pro Ser Glu Glu Val Val Lys Lys Met Lys 865 870 875 880 Asn Tyr Trp Arg Gln Leu Leu Asn Ala Lys Leu Ile Thr Gln Arg Lys 885 890 895 Phe Asp Asn Leu Thr Lys Ala Glu Arg Gly Gly Leu Ser Glu Leu Asp 900 905 910 Lys Ala Gly Phe Ile Lys Arg Gln Leu Val Glu Thr Arg Gln Ile Thr 915 920 925 Lys His Val Ala Gln Ile Leu Asp Ser Arg Met Asn Thr Lys Tyr Asp 930 935 940 Glu Asn Asp Lys Leu Ile Arg Glu Val Lys Val Ile Thr Leu Lys Ser 945 950 955 960 Lys Leu Val Ser Asp Phe Arg Lys Asp Phe Gln Phe Tyr Lys Val Arg 965 970 975 Glu Ile Asn Asn Tyr His His Ala His Asp Ala Tyr Leu Asn Ala Val 980 985 990 Val Gly Thr Ala Leu Ile Lys Lys Tyr Pro Lys Leu Glu Ser Glu Phe 995 1000 1005 Val Tyr Gly Asp Tyr Lys Val Tyr Asp Val Arg Lys Met Ile Ala 1010 1015 1020 Lys Ser Glu Gln Glu Ile Gly Lys Ala Thr Ala Lys Tyr Phe Phe 1025 1030 1035 Tyr Ser Asn Ile Met Asn Phe Phe Lys Thr Glu Ile Thr Leu Ala 1040 1045 1050 Asn Gly Glu Ile Arg Lys Arg Pro Leu Ile Glu Thr Asn Gly Glu 1055 1060 1065 Thr Gly Glu Ile Val Trp Asp Lys Gly Arg Asp Phe Ala Thr Val 1070 1075 1080 Arg Lys Val Leu Ser Met Pro Gln Val Asn Ile Val Lys Lys Thr 1085 1090 1095 Glu Val Gln Thr Gly Gly Phe Ser Lys Glu Ser Ile Leu Pro Lys 1100 1105 1110 Arg Asn Ser Asp Lys Leu Ile Ala Arg Lys Lys Asp Trp Asp Pro 1115 1120 1125 Lys Lys Tyr Gly Gly Phe Asp Ser Pro Thr Val Ala Tyr Ser Val 1130 1135 1140 Leu Val Val Ala Lys Val Glu Lys Gly Lys Ser Lys Lys Leu Lys 1145 1150 1155 Ser Val Lys Glu Leu Leu Gly Ile Thr Ile Met Glu Arg Ser Ser 1160 1165 1170 Phe Glu Lys Asn Pro Ile Asp Phe Leu Glu Ala Lys Gly Tyr Lys 1175 1180 1185 Glu Val Lys Lys Asp Leu Ile Ile Lys Leu Pro Lys Tyr Ser Leu 1190 1195 1200 Phe Glu Leu Glu Asn Gly Arg Lys Arg Met Leu Ala Ser Ala Gly 1205 1210 1215 Glu Leu Gln Lys Gly Asn Glu Leu Ala Leu Pro Ser Lys Tyr Val 1220 1225 1230 Asn Phe Leu Tyr Leu Ala Ser His Tyr Glu Lys Leu Lys Gly Ser 1235 1240 1245 Pro Glu Asp Asn Glu Gln Lys Gln Leu Phe Val Glu Gln His Lys 1250 1255 1260 His Tyr Leu Asp Glu Ile Ile Glu Gln Ile Ser Glu Phe Ser Lys 1265 1270 1275 Arg Val Ile Leu Ala Asp Ala Asn Leu Asp Lys Val Leu Ser Ala 1280 1285 1290 Tyr Asn Lys His Arg Asp Lys Pro Ile Arg Glu Gln Ala Glu Asn 1295 1300 1305 Ile Ile His Leu Phe Thr Leu Thr Asn Leu Gly Ala Pro Ala Ala 1310 1315 1320 Phe Lys Tyr Phe Asp Thr Thr Ile Asp Arg Lys Arg Tyr Thr Ser 1325 1330 1335 Thr Lys Glu Val Leu Asp Ala Thr Leu Ile His Gln Ser Ile Thr 1340 1345 1350 Gly Leu Tyr Glu Thr Arg Ile Asp Leu Ser Gln Leu Gly Gly Asp 1355 1360 1365 <210> 7 <211> 4107 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Cas9 (addgene #44250) <400> 7 atggataaga aatactcaat aggcttagat atcggcacaa atagcgtcgg atgggcggtg 60 atcactgatg aatataaggt tccgtctaaa aagttcaagg ttctgggaaa tacagaccgc 120 cacagtatca aaaaaaatct tataggggct cttttatttg acagtggaga gacagcggaa 180 gcgactcgtc tcaaacggac agctcgtaga aggtatacac gtcggaagaa tcgtatttgt 240 tatctacagg agattttttc aaatgagatg gcgaaagtag atgatagttt ctttcatcga 300 cttgaagagt cttttttggt ggaagaagac aagaagcatg aacgtcatcc tatttttgga 360 aatatagtag atgaagttgc ttatcatgag aaatatccaa ctatctatca tctgcgaaaa 420 aaattggtag attctactga taaagcggat ttgcgcttaa tctatttggc cttagcgcat 480 atgattaagt ttcgtggtca ttttttgatt gagggagatt taaatcctga taatagtgat 540 gtggacaaac tatttatcca gttggtacaa acctacaatc aattatttga agaaaaccct 600 attaacgcaa gtggagtaga tgctaaagcg attctttctg cacgattgag taaatcaaga 660 cgattagaaa atctcattgc tcagctcccc ggtgagaaga aaaatggctt atttgggaat 720 ctcattgctt tgtcattggg tttgacccct aattttaaat caaattttga tttggcagaa 780 gatgctaaat tacagctttc aaaagatact tacgatgatg atttagataa tttattggcg 840 caaattggag atcaatatgc tgatttgttt ttggcagcta agaatttatc agatgctatt 900 ttactttcag atatcctaag agtaaatact gaaataacta aggctcccct atcagcttca 960 atgattaaac gctacgatga acatcatcaa gacttgactc ttttaaaagc tttagttcga 1020 caacaacttc cagaaaagta taaagaaatc ttttttgatc aatcaaaaaa cggatatgca 1080 ggttatattg atgggggagc tagccaagaa gaattttata aatttatcaa accaatttta 1140 gaaaaaatgg atggtactga ggaattattg gtgaaactaa atcgtgaaga tttgctgcgc 1200 aagcaacgga cctttgacaa cggctctatt ccccatcaaa ttcacttggg tgagctgcat 1260 gctattttga gaagacaaga agacttttat ccatttttaa aagacaatcg tgagaagatt 1320 gaaaaaatct tgacttttcg aattccttat tatgttggtc cattggcgcg tggcaatagt 1380 cgttttgcat ggatgactcg gaagtctgaa gaaacaatta ccccatggaa ttttgaagaa 1440 gttgtcgata aaggtgcttc agctcaatca tttattgaac gcatgacaaa ctttgataaa 1500 aatcttccaa atgaaaaagt actaccaaaa catagtttgc tttatgagta ttttacggtt 1560 tataacgaat tgacaaaggt caaatatgtt actgaaggaa tgcgaaaacc agcatttctt 1620 tcaggtgaac agaagaaagc cattgttgat ttactcttca aaacaaatcg aaaagtaacc 1680 gttaagcaat taaaagaaga ttatttcaaa aaaatagaat gttttgatag tgttgaaatt 1740 tcaggagttg aagatagatt taatgcttca ttaggtacct accatgattt gctaaaaatt 1800 attaaagata aagatttttt ggataatgaa gaaaatgaag atatcttaga ggatattgtt 1860 ttaacattga ccttatttga agatagggag atgattgagg aaagacttaa aacatatgct 1920 cacctctttg atgataaggt gatgaaacag cttaaacgtc gccgttatac tggttgggga 1980 cgtttgtctc gaaaattgat taatggtatt agggataagc aatctggcaa aacaatatta 2040 gattttttga aatcagatgg ttttgccaat cgcaatttta tgcagctgat ccatgatgat 2100 agtttgacat ttaaagaaga cattcaaaaa gcacaagtgt ctggacaagg cgatagttta 2160 catgaacata ttgcaaattt agctggtagc cctgctatta aaaaaggtat tttacagact 2220 gtaaaagttg ttgatgaatt ggtcaaagta atggggcggc ataagccaga aaatatcgtt 2280 attgaaatgg cacgtgaaaa tcagacaact caaaagggcc agaaaaattc gcgagagcgt 2340 atgaaacgaa tcgaagaagg tatcaaagaa ttaggaagtc agattcttaa agagcatcct 2400 gttgaaaata ctcaattgca aaatgaaaag ctctatctct attatctcca aaatggaaga 2460 gacatgtatg tggaccaaga attagatatt aatcgtttaa gtgattatga tgtcgatcac 2520 attgttccac aaagtttcct taaagacgat tcaatagaca ataaggtctt aacgcgttct 2580 gataaaaatc gtggtaaatc ggataacgtt ccaagtgaag aagtagtcaa aaagatgaaa 2640 aactattgga gacaacttct aaacgccaag ttaatcactc aacgtaagtt tgataattta 2700 acgaaagctg aacgtggagg tttgagtgaa cttgataaag ctggttttat caaacgccaa 2760 ttggttgaaa ctcgccaaat cactaagcat gtggcacaaa ttttggatag tcgcatgaat 2820 actaaatacg atgaaaatga taaacttatt cgagaggtta aagtgattac cttaaaatct 2880 aaattagttt ctgacttccg aaaagatttc caattctata aagtacgtga gattaacaat 2940 taccatcatg cccatgatgc gtatctaaat gccgtcgttg gaactgcttt gattaagaaa 3000 tatccaaaac ttgaatcgga gtttgtctat ggtgattata aagtttatga tgttcgtaaa 3060 atgattgcta agtctgagca agaaataggc aaagcaaccg caaaatattt cttttactct 3120 aatatcatga acttcttcaa aacagaaatt acacttgcaa atggagagat tcgcaaacgc 3180 cctctaatcg aaactaatgg ggaaactgga gaaattgtct gggataaagg gcgagatttt 3240 gccacagtgc gcaaagtatt gtccatgccc caagtcaata ttgtcaagaa aacagaagta 3300 cagacaggcg gattctccaa ggagtcaatt ttaccaaaaa gaaattcgga caagcttatt 3360 gctcgtaaaa aagactggga tccaaaaaaa tatggtggtt ttgatagtcc aacggtagct 3420 tattcagtcc tagtggttgc taaggtggaa aaagggaaat cgaagaagtt aaaatccgtt 3480 aaagagttac tagggatcac aattatggaa agaagttcct ttgaaaaaaa tccgattgac 3540 tttttagaag ctaaaggata taaggaagtt aaaaaagact taatcattaa actacctaaa 3600 tatagtcttt ttgagttaga aaacggtcgt aaacggatgc tggctagtgc cggagaatta 3660 caaaaaggaa atgagctggc tctgccaagc aaatatgtga attttttata tttagctagt 3720 cattatgaaa agttgaaggg tagtccagaa gataacgaac aaaaacaatt gtttgtggag 3780 cagcataagc attatttaga tgagattatt gagcaaatca gtgaattttc taagcgtgtt 3840 attttagcag atgccaattt agataaagtt cttagtgcat ataacaaaca tagagacaaa 3900 ccaatacgtg aacaagcaga aaatattatt catttattta cgttgacgaa tcttggagct 3960 cccgctgctt ttaaatattt tgatacaaca attgatcgta aacgatatac gtctacaaaa 4020 gaagttttag atgccactct tatccatcaa tccatcactg gtctttatga aacacgcatt 4080 gatttgagtc agctaggagg tgactaa 4107 <210> 8 <211> 4107 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> dCas9 (addgene #44249) <400> 8 atggataaga aatactcaat aggcttagct atcggcacaa atagcgtcgg atgggcggtg 60 atcactgatg aatataaggt tccgtctaaa aagttcaagg ttctgggaaa tacagaccgc 120 cacagtatca aaaaaaatct tataggggct cttttatttg acagtggaga gacagcggaa 180 gcgactcgtc tcaaacggac agctcgtaga aggtatacac gtcggaagaa tcgtatttgt 240 tatctacagg agattttttc aaatgagatg gcgaaagtag atgatagttt ctttcatcga 300 cttgaagagt cttttttggt ggaagaagac aagaagcatg aacgtcatcc tatttttgga 360 aatatagtag atgaagttgc ttatcatgag aaatatccaa ctatctatca tctgcgaaaa 420 aaattggtag attctactga taaagcggat ttgcgcttaa tctatttggc cttagcgcat 480 atgattaagt ttcgtggtca ttttttgatt gagggagatt taaatcctga taatagtgat 540 gtggacaaac tatttatcca gttggtacaa acctacaatc aattatttga agaaaaccct 600 attaacgcaa gtggagtaga tgctaaagcg attctttctg cacgattgag taaatcaaga 660 cgattagaaa atctcattgc tcagctcccc ggtgagaaga aaaatggctt atttgggaat 720 ctcattgctt tgtcattggg tttgacccct aattttaaat caaattttga tttggcagaa 780 gatgctaaat tacagctttc aaaagatact tacgatgatg atttagataa tttattggcg 840 caaattggag atcaatatgc tgatttgttt ttggcagcta agaatttatc agatgctatt 900 ttactttcag atatcctaag agtaaatact gaaataacta aggctcccct atcagcttca 960 atgattaaac gctacgatga acatcatcaa gacttgactc ttttaaaagc tttagttcga 1020 caacaacttc cagaaaagta taaagaaatc ttttttgatc aatcaaaaaa cggatatgca 1080 ggttatattg atgggggagc tagccaagaa gaattttata aatttatcaa accaatttta 1140 gaaaaaatgg atggtactga ggaattattg gtgaaactaa atcgtgaaga tttgctgcgc 1200 aagcaacgga cctttgacaa cggctctatt ccccatcaaa ttcacttggg tgagctgcat 1260 gctattttga gaagacaaga agacttttat ccatttttaa aagacaatcg tgagaagatt 1320 gaaaaaatct tgacttttcg aattccttat tatgttggtc cattggcgcg tggcaatagt 1380 cgttttgcat ggatgactcg gaagtctgaa gaaacaatta ccccatggaa ttttgaagaa 1440 gttgtcgata aaggtgcttc agctcaatca tttattgaac gcatgacaaa ctttgataaa 1500 aatcttccaa atgaaaaagt actaccaaaa catagtttgc tttatgagta ttttacggtt 1560 tataacgaat tgacaaaggt caaatatgtt actgaaggaa tgcgaaaacc agcatttctt 1620 tcaggtgaac agaagaaagc cattgttgat ttactcttca aaacaaatcg aaaagtaacc 1680 gttaagcaat taaaagaaga ttatttcaaa aaaatagaat gttttgatag tgttgaaatt 1740 tcaggagttg aagatagatt taatgcttca ttaggtacct accatgattt gctaaaaatt 1800 attaaagata aagatttttt ggataatgaa gaaaatgaag atatcttaga ggatattgtt 1860 ttaacattga ccttatttga agatagggag atgattgagg aaagacttaa aacatatgct 1920 cacctctttg atgataaggt gatgaaacag cttaaacgtc gccgttatac tggttgggga 1980 cgtttgtctc gaaaattgat taatggtatt agggataagc aatctggcaa aacaatatta 2040 gattttttga aatcagatgg ttttgccaat cgcaatttta tgcagctgat ccatgatgat 2100 agtttgacat ttaaagaaga cattcaaaaa gcacaagtgt ctggacaagg cgatagttta 2160 catgaacata ttgcaaattt agctggtagc cctgctatta aaaaaggtat tttacagact 2220 gtaaaagttg ttgatgaatt ggtcaaagta atggggcggc ataagccaga aaatatcgtt 2280 attgaaatgg cacgtgaaaa tcagacaact caaaagggcc agaaaaattc gcgagagcgt 2340 atgaaacgaa tcgaagaagg tatcaaagaa ttaggaagtc agattcttaa agagcatcct 2400 gttgaaaata ctcaattgca aaatgaaaag ctctatctct attatctcca aaatggaaga 2460 gacatgtatg tggaccaaga attagatatt aatcgtttaa gtgattatga tgtcgatgcc 2520 attgttccac aaagtttcct taaagacgat tcaatagaca ataaggtctt aacgcgttct 2580 gataaaaatc gtggtaaatc ggataacgtt ccaagtgaag aagtagtcaa aaagatgaaa 2640 aactattgga gacaacttct aaacgccaag ttaatcactc aacgtaagtt tgataattta 2700 acgaaagctg aacgtggagg tttgagtgaa cttgataaag ctggttttat caaacgccaa 2760 ttggttgaaa ctcgccaaat cactaagcat gtggcacaaa ttttggatag tcgcatgaat 2820 actaaatacg atgaaaatga taaacttatt cgagaggtta aagtgattac cttaaaatct 2880 aaattagttt ctgacttccg aaaagatttc caattctata aagtacgtga gattaacaat 2940 taccatcatg cccatgatgc gtatctaaat gccgtcgttg gaactgcttt gattaagaaa 3000 tatccaaaac ttgaatcgga gtttgtctat ggtgattata aagtttatga tgttcgtaaa 3060 atgattgcta agtctgagca agaaataggc aaagcaaccg caaaatattt cttttactct 3120 aatatcatga acttcttcaa aacagaaatt acacttgcaa atggagagat tcgcaaacgc 3180 cctctaatcg aaactaatgg ggaaactgga gaaattgtct gggataaagg gcgagatttt 3240 gccacagtgc gcaaagtatt gtccatgccc caagtcaata ttgtcaagaa aacagaagta 3300 cagacaggcg gattctccaa ggagtcaatt ttaccaaaaa gaaattcgga caagcttatt 3360 gctcgtaaaa aagactggga tccaaaaaaa tatggtggtt ttgatagtcc aacggtagct 3420 tattcagtcc tagtggttgc taaggtggaa aaagggaaat cgaagaagtt aaaatccgtt 3480 aaagagttac tagggatcac aattatggaa agaagttcct ttgaaaaaaa tccgattgac 3540 tttttagaag ctaaaggata taaggaagtt aaaaaagact taatcattaa actacctaaa 3600 tatagtcttt ttgagttaga aaacggtcgt aaacggatgc tggctagtgc cggagaatta 3660 caaaaaggaa atgagctggc tctgccaagc aaatatgtga attttttata tttagctagt 3720 cattatgaaa agttgaaggg tagtccagaa gataacgaac aaaaacaatt gtttgtggag 3780 cagcataagc attatttaga tgagattatt gagcaaatca gtgaattttc taagcgtgtt 3840 attttagcag atgccaattt agataaagtt cttagtgcat ataacaaaca tagagacaaa 3900 ccaatacgtg aacaagcaga aaatattatt catttattta cgttgacgaa tcttggagct 3960 cccgctgctt ttaaatattt tgatacaaca attgatcgta aacgatatac gtctacaaaa 4020 gaagttttag atgccactct tatccatcaa tccatcactg gtctttatga aacacgcatt 4080 gatttgagtc agctaggagg tgactaa 4107 <210> 9 <211> 53 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> promoter <400> 9 tttacggcta gctcagccct aggtattatg ctagcagatc taaagaggag aaa 53 <210> 10 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> spacer sequence <400> 10 tagtccatta cggtcaatcc gccgtttgtt cccag 35 <210> 11 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> spacer sequence <400> 11 aaactgggaa caaacggcgg attgaccgta atgga 35 <210> 12 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> spacer sequence <400> 12 tagtcaccaa aaacacagcc gatag 25 <210> 13 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> spacer sequence <400> 13 aaactatcgg ctgtgttttt ggtga 25 <210> 14 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> spacer sequence <400> 14 tagttgtttt tcatgttgtc acccg 25 <210> 15 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> spacer sequence <400> 15 aaacgggtga caacatgaaa aacaa 25 <210> 16 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> spacer sequence <400> 16 tagttgtaat cacaatgatg aaaag 25 <210> 17 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> spacer sequence <400> 17 aaacttttca tcattgtgat tacaa 25 <210> 18 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> spacer sequence <400> 18 tagtagcgcc aaccgatatc accag 25 <210> 19 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> spacer sequence <400> 19 aaactggtga tatcggttgg cgcta 25 <210> 20 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> spacer sequence <400> 20 tagttgccat cactactgtg cg 22 <210> 21 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> spacer sequence <400> 21 aaacgcacag tagtgatggc aa 22 <210> 22 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> space sequence <400> 22 tagttggcgt tgaagacgac gg 22 <210> 23 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> spacer sequence <400> 23 aaaccgtcgt cttcaacgcc aa 22 <210> 24 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> spacer sequence <400> 24 tagtgatatc aaagtggtta tg 22 <210> 25 <211> 76 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> tracrRNA sequence <400> 25 gttttagagc tagaaatagc aagttaaaat aaggctagtc cgttatcaac ttgaaaaagt 60 ggcaccgagt cggtgc 76 <210> 26 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> promoter <400> 26 ttgacagcta gctcagtcct aggtataata ctagt 35 <210> 27 <211> 7631 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> TAPKn-Cas9-nsp <400> 27 atctttgaca gctagctcag tcctaggtat aatactagtg aagagcaccg gtgctcttcg 60 ttttagagct agaaatagca agttaaaata aggctagtcc gttatcaact tgaaaaagtg 120 gcaccgagtc ggtgcttttt ttgaagcttg ggcccgaaca aaaaaaaacc ccgcccctga 180 cagggcgggg ttttttttgt ttgtcggtga actggatcct taccagctgg gcgcgccccc 240 cctacgggct tgctctccgg gcttcgccct gcgcggtcgc tgcgctccct tgccagcccg 300 tggatatgtg gacgatggcc gcgagcggcc accggctggc tcgcttcgct cggcccgtgg 360 acaaccctgc tggacaagct gatggacagg ctgcgcctgc ccacgagctt gaccacaggg 420 attgcccacc ggctacccag ccttcgacca catacccacc ggctccaact gcgcggcctg 480 cggccttgcc ccatcaattt ttttaatttt ctctggggaa aagcctccgg cctgcggcct 540 gcgcgcttcg cttgccggtt ggacaccaag tggaaggcgg gtcaaggctc gcgcagcgac 600 cgcgcagcgg cttggccttg acgcgcctgg aacgacccaa gcctatgcga gtgggggcag 660 tcgaagggcg aagcccgccc gcctgccccc cgagcctcac ggcggcgagt gcgggggttc 720 caagggggca gcgccacctt gggcaaggcc gaaggccgcg cagtcgatca acaagccccg 780 gaggggccac tttttgccgg agggggagcc gcgccgaagg cgtgggggaa ccccgcaggg 840 gtgcccttct ttgggcacca aagaactaga tatagggcga aatgcgaaag acttaaaaat 900 caacaactta aaaaaggggg gtacgcaaca gctcattgcg gcaccccccg caatagctca 960 ttgcgtaggt taaagaaaat ctgtaattga ctgccacttt tacgcaacgc ataattgttg 1020 tcgcgctgcc gaaaagttgc agctgattgc gcatggtgcc gcaaccgtgc ggcaccccta 1080 ccgcatggag ataagcatgg ccacgcagtc cagagaaatc ggcattcaag ccaagaacaa 1140 gcccggtcac tgggtgcaaa cggaacgcaa agcgcatgag gcgtgggccg ggcttattgc 1200 gaggaaaccc acggcggcaa tgctgctgca tcacctcgtg gcgcagatgg gccaccagaa 1260 cgccgtggtg gtcagccaga agacactttc caagctcatc ggacgttctt tgcggacggt 1320 ccaatacgca gtcaaggact tggtggccga gcgctggatc tccgtcgtga agctcaacgg 1380 ccccggcacc gtgtcggcct acgtggtcaa tgaccgcgtg gcgtggggcc agccccgcga 1440 ccagttgcgc ctgtcggtgt tcagtgccgc cgtggtggtt gatcacgacg accaggacga 1500 atcgctgttg gggcatggcg acctgcgccg catcccgacc ctgtatccgg gcgagcagca 1560 actaccgacc ggccccggcg aggagccgcc cagccagccc ggcattccgg gcatggaacc 1620 agacctgcca gccttgaccg aaacggagga atgggaacgg cgcgggcagc agcgcctgcc 1680 gatgcccgat gagccgtgtt ttctggacga tggcgagccg ttggagccgc cgacacgggt 1740 aacgctgccg cgccggtagg gcatgcaaac agggacgcac cgctagcagc gcccctagcg 1800 gtatcctata aaaaaacaca ccgcgccgct agcagcaccc ctaatataaa ataatgtttt 1860 ttataaaaat agtcagtacc acccctacaa aacggtgtcg gcgcgttgtt gtagccgcgc 1920 cgacaccgct tttttaaata tcataaagag agtaagagaa actaattttt cataacactc 1980 tatttataaa gaaaaatcag caaaaacttg tttttgcgtg gggtgtggtg cttttggtgg 2040 tgagaaccac caacctgttg agcctttttg tggagcgcgc ggaccgcggt ccagagagcg 2100 ttcaccgaca aacaacagat aaaacgaaag gcccagtctt tcgactgagc ctttcgtttt 2160 atttgatgcc tggagatcct tactcgagtt agtcacctcc tagctgactc aaatcaatgc 2220 gtgtttcata aagaccagtg atggattgat ggataagagt ggcatctaaa acttcttttg 2280 tagacgtata tcgtttacga tcaattgttg tatcaaaata tttaaaagca gcgggagctc 2340 caagattcgt caacgtaaat aaatgaataa tattttctgc ttgttcacgt attggtttgt 2400 ctctatgttt gttatatgca ctaagaactt tatctaaatt ggcatctgct aaaataacac 2460 gcttagaaaa ttcactgatt tgctcaataa tctcatctaa ataatgctta tgctgctcca 2520 caaacaattg tttttgttcg ttatcttctg gactaccctt caacttttca taatgactag 2580 ctaaatataa aaaattcaca tatttgcttg gcagagccag ctcatttcct ttttgtaatt 2640 ctccggcact agccagcatc cgtttacgac cgttttctaa ctcaaaaaga ctatatttag 2700 gtagtttaat gattaagtct tttttaactt ccttatatcc tttagcttct aaaaagtcaa 2760 tcggattttt ttcaaaggaa cttctttcca taattgtgat ccctagtaac tctttaacgg 2820 attttaactt cttcgatttc cctttttcca ccttagcaac cactaggact gaataagcta 2880 ccgttggact atcaaaacca ccatattttt ttggatccca gtctttttta cgagcaataa 2940 gcttgtccga atttcttttt ggtaaaattg actccttgga gaatccgcct gtctgtactt 3000 ctgttttctt gacaatattg acttggggca tggacaatac tttgcgcact gtggcaaaat 3060 ctcgcccttt atcccagaca atttctccag tttccccatt agtttcgatt agagggcgtt 3120 tgcgaatctc tccatttgca agtgtaattt ctgttttgaa gaagttcatg atattagagt 3180 aaaagaaata ttttgcggtt gctttgccta tttcttgctc agacttagca atcattttac 3240 gaacatcata aactttataa tcaccataga caaactccga ttcaagtttt ggatatttct 3300 taatcaaagc agttccaacg acggcattta gatacgcatc atgggcatga tggtaattgt 3360 taatctcacg tactttatag aattggaaat cttttcggaa gtcagaaact aatttagatt 3420 ttaaggtaat cactttaacc tctcgaataa gtttatcatt ttcatcgtat ttagtattca 3480 tgcgactatc caaaatttgt gccacatgct tagtgatttg gcgagtttca accaattggc 3540 gtttgataaa accagcttta tcaagttcac tcaaacctcc acgttcagct ttcgttaaat 3600 tatcaaactt acgttgagtg attaacttgg cgtttagaag ttgtctccaa tagtttttca 3660 tctttttgac tacttcttca cttggaacgt tatccgattt accacgattt ttatcagaac 3720 gcgttaagac cttattgtct attgaatcgt ctttaaggaa actttgtgga acaatgtgat 3780 cgacatcata atcacttaaa cgattaatat ctaattcttg gtccacatac atgtctcttc 3840 cattttggag ataatagaga tagagctttt cattttgcaa ttgagtattt tcaacaggat 3900 gctctttaag aatctgactt cctaattctt tgataccttc ttcgattcgt ttcatacgct 3960 ctcgcgaatt tttctggccc ttttgagttg tctgattttc acgtgccatt tcaataacga 4020 tattttctgg cttatgccgc cccattactt tgaccaattc atcaacaact tttacagtct 4080 gtaaaatacc ttttttaata gcagggctac cagctaaatt tgcaatatgt tcatgtaaac 4140 tatcgccttg tccagacact tgtgcttttt gaatgtcttc tttaaatgtc aaactatcat 4200 catggatcag ctgcataaaa ttgcgattgg caaaaccatc tgatttcaaa aaatctaata 4260 ttgttttgcc agattgctta tccctaatac cattaatcaa ttttcgagac aaacgtcccc 4320 aaccagtata acggcgacgt ttaagctgtt tcatcacctt atcatcaaag aggtgagcat 4380 atgttttaag tctttcctca atcatctccc tatcttcaaa taaggtcaat gttaaaacaa 4440 tatcctctaa gatatcttca ttttcttcat tatccaaaaa atctttatct ttaataattt 4500 ttagcaaatc atggtaggta cctaatgaag cattaaatct atcttcaact cctgaaattt 4560 caacactatc aaaacattct atttttttga aataatcttc ttttaattgc ttaacggtta 4620 cttttcgatt tgttttgaag agtaaatcaa caatggcttt cttctgttca cctgaaagaa 4680 atgctggttt tcgcattcct tcagtaacat atttgacctt tgtcaattcg ttataaaccg 4740 taaaatactc ataaagcaaa ctatgttttg gtagtacttt ttcatttgga agatttttat 4800 caaagtttgt catgcgttca ataaatgatt gagctgaagc acctttatcg acaacttctt 4860 caaaattcca tggggtaatt gtttcttcag acttccgagt catccatgca aaacgactat 4920 tgccacgcgc caatggacca acataataag gaattcgaaa agtcaagatt ttttcaatct 4980 tctcacgatt gtcttttaaa aatggataaa agtcttcttg tcttctcaaa atagcatgca 5040 gctcacccaa gtgaatttga tggggaatag agccgttgtc aaaggtccgt tgcttgcgca 5100 gcaaatcttc acgatttagt ttcaccaata attcctcagt accatccatt ttttctaaaa 5160 ttggtttgat aaatttataa aattcttctt ggctagctcc cccatcaata taacctgcat 5220 atccgttttt tgattgatca aaaaagattt ctttatactt ttctggaagt tgttgtcgaa 5280 ctaaagcttt taaaagagtc aagtcttgat gatgttcatc gtagcgttta atcattgaag 5340 ctgatagggg agccttagtt atttcagtat ttactcttag gatatctgaa agtaaaatag 5400 catctgataa attcttagct gccaaaaaca aatcagcata ttgatctcca atttgcgcca 5460 ataaattatc taaatcatca tcgtaagtat cttttgaaag ctgtaattta gcatcttctg 5520 ccaaatcaaa atttgattta aaattagggg tcaaacccaa tgacaaagca atgagattcc 5580 caaataagcc atttttcttc tcaccgggga gctgagcaat gagattttct aatcgtcttg 5640 atttactcaa tcgtgcagaa agaatcgctt tagcatctac tccacttgcg ttaatagggt 5700 tttcttcaaa taattgattg taggtttgta ccaactggat aaatagtttg tccacatcac 5760 tattatcagg atttaaatct ccctcaatca aaaaatgacc acgaaactta atcatatgcg 5820 ctaaggccaa atagattaag cgcaaatccg ctttatcagt agaatctacc aatttttttc 5880 gcagatgata gatagttgga tatttctcat gataagcaac ttcatctact atatttccaa 5940 aaataggatg acgttcatgc ttcttgtctt cttccaccaa aaaagactct tcaagtcgat 6000 gaaagaaact atcatctact ttcgccatct catttgaaaa aatctcctgt agataacaaa 6060 tacgattctt ccgacgtgta taccttctac gagctgtccg tttgagacga gtcgcttccg 6120 ctgtctctcc actgtcaaat aaaagagccc ctataagatt ttttttgata ctgtggcggt 6180 ctgtatttcc cagaaccttg aactttttag acggaacctt atattcatca gtgatcaccg 6240 cccatccgac gctatttgtg ccgatatcta agcctattga gtatttctta tccatagatc 6300 ctttctcctc tttagatctg ctagcataat acctagggct gagctagccg taaatgaggt 6360 ttcagcaaaa aacccctcaa gacccgttta gaggccccaa ggggttatgc tagttattgc 6420 tcagcggatt aattattaga aaaattcatc cagcatcaga tgaaattgca gtttgttcat 6480 atccggatta tcaatgccat atttctgaaa cagacgtttt tgcaggctcg ggctaaattc 6540 gcccaggcag ttccacagaa tggccagatc ctgataacga tccgcaatgc ccacacggcc 6600 cacatcaatg cagccaatca gtttgccttc atcgaaaatc aggttatcca ggctaaaatc 6660 gccgtgggtc accacgctat ccgggctaaa cggcagcagt ttatgcattt ctttccacac 6720 ctgttccacc ggccagccgt tacgttcatc atcaaaatcg ctcgcatcca ccaggccgtt 6780 gttcatacgg ctctgcgcct gggccagacg aaacacacga tcgctgttaa acgggcagtt 6840 gcacaccgga atgctatgca gacgacgcag aaacacggcc agcgcatcca caatgttttc 6900 gccgctatcc ggatattctt ccagcacctg aaacgcggtt ttgcccggaa tcgcggtggt 6960 cagcagccac gcatcatccg gggtgcgaat aaaatgttta atggtcggca gcggcataaa 7020 ttcggtcagc cagttcagac gcaccatttc atcggtcaca tcgttcgcca cgctgccttt 7080 gccatgtttc agaaacagtt ccggcgcatc cggtttgcca tacagacgat aaatggtcgc 7140 gccgctctga cccacgttat cacgcgccca tttatagcca tacagatccg catccatgtt 7200 gctgttcaga cgcggacggc tacagctcgt ttcacgctga atatggctca taacacccct 7260 tgtattactg tttatgtaag cagacagttt tattgttcat gatgatatat ttttatcttg 7320 tgcaatgtaa catcagagat tttgagacac aaatttaaat cgtaattatt ggggacccct 7380 ggattctcac caataaaaaa cgcccggcgg caaccgagcg ttctgaacaa atccagatgg 7440 agttctgagg tcattactgg atctatcaac aggagtccaa gactagtcgc cagggttttc 7500 ccagtcacga cgcggccgca agcttgcatg cctgcaggtc gactctagag gatccccggg 7560 taccgagctc gaattcgcgc ggccgcggcc taggcggcct cctgtgtgaa attgttatcc 7620 gctttaatta a 7631 <210> 28 <211> 7631 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> TAPKn-dCas9-nsp <400> 28 atctttgaca gctagctcag tcctaggtat aatactagtg aagagcaccg gtgctcttcg 60 ttttagagct agaaatagca agttaaaata aggctagtcc gttatcaact tgaaaaagtg 120 gcaccgagtc ggtgcttttt ttgaagcttg ggcccgaaca aaaaaaaacc ccgcccctga 180 cagggcgggg ttttttttgt ttgtcggtga actggatcct taccagctgg gcgcgccccc 240 cctacgggct tgctctccgg gcttcgccct gcgcggtcgc tgcgctccct tgccagcccg 300 tggatatgtg gacgatggcc gcgagcggcc accggctggc tcgcttcgct cggcccgtgg 360 acaaccctgc tggacaagct gatggacagg ctgcgcctgc ccacgagctt gaccacaggg 420 attgcccacc ggctacccag ccttcgacca catacccacc ggctccaact gcgcggcctg 480 cggccttgcc ccatcaattt ttttaatttt ctctggggaa aagcctccgg cctgcggcct 540 gcgcgcttcg cttgccggtt ggacaccaag tggaaggcgg gtcaaggctc gcgcagcgac 600 cgcgcagcgg cttggccttg acgcgcctgg aacgacccaa gcctatgcga gtgggggcag 660 tcgaagggcg aagcccgccc gcctgccccc cgagcctcac ggcggcgagt gcgggggttc 720 caagggggca gcgccacctt gggcaaggcc gaaggccgcg cagtcgatca acaagccccg 780 gaggggccac tttttgccgg agggggagcc gcgccgaagg cgtgggggaa ccccgcaggg 840 gtgcccttct ttgggcacca aagaactaga tatagggcga aatgcgaaag acttaaaaat 900 caacaactta aaaaaggggg gtacgcaaca gctcattgcg gcaccccccg caatagctca 960 ttgcgtaggt taaagaaaat ctgtaattga ctgccacttt tacgcaacgc ataattgttg 1020 tcgcgctgcc gaaaagttgc agctgattgc gcatggtgcc gcaaccgtgc ggcaccccta 1080 ccgcatggag ataagcatgg ccacgcagtc cagagaaatc ggcattcaag ccaagaacaa 1140 gcccggtcac tgggtgcaaa cggaacgcaa agcgcatgag gcgtgggccg ggcttattgc 1200 gaggaaaccc acggcggcaa tgctgctgca tcacctcgtg gcgcagatgg gccaccagaa 1260 cgccgtggtg gtcagccaga agacactttc caagctcatc ggacgttctt tgcggacggt 1320 ccaatacgca gtcaaggact tggtggccga gcgctggatc tccgtcgtga agctcaacgg 1380 ccccggcacc gtgtcggcct acgtggtcaa tgaccgcgtg gcgtggggcc agccccgcga 1440 ccagttgcgc ctgtcggtgt tcagtgccgc cgtggtggtt gatcacgacg accaggacga 1500 atcgctgttg gggcatggcg acctgcgccg catcccgacc ctgtatccgg gcgagcagca 1560 actaccgacc ggccccggcg aggagccgcc cagccagccc ggcattccgg gcatggaacc 1620 agacctgcca gccttgaccg aaacggagga atgggaacgg cgcgggcagc agcgcctgcc 1680 gatgcccgat gagccgtgtt ttctggacga tggcgagccg ttggagccgc cgacacgggt 1740 aacgctgccg cgccggtagg gcatgcaaac agggacgcac cgctagcagc gcccctagcg 1800 gtatcctata aaaaaacaca ccgcgccgct agcagcaccc ctaatataaa ataatgtttt 1860 ttataaaaat agtcagtacc acccctacaa aacggtgtcg gcgcgttgtt gtagccgcgc 1920 cgacaccgct tttttaaata tcataaagag agtaagagaa actaattttt cataacactc 1980 tatttataaa gaaaaatcag caaaaacttg tttttgcgtg gggtgtggtg cttttggtgg 2040 tgagaaccac caacctgttg agcctttttg tggagcgcgc ggaccgcggt ccagagagcg 2100 ttcaccgaca aacaacagat aaaacgaaag gcccagtctt tcgactgagc ctttcgtttt 2160 atttgatgcc tggagatcct tactcgagtt agtcacctcc tagctgactc aaatcaatgc 2220 gtgtttcata aagaccagtg atggattgat ggataagagt ggcatctaaa acttcttttg 2280 tagacgtata tcgtttacga tcaattgttg tatcaaaata tttaaaagca gcgggagctc 2340 caagattcgt caacgtaaat aaatgaataa tattttctgc ttgttcacgt attggtttgt 2400 ctctatgttt gttatatgca ctaagaactt tatctaaatt ggcatctgct aaaataacac 2460 gcttagaaaa ttcactgatt tgctcaataa tctcatctaa ataatgctta tgctgctcca 2520 caaacaattg tttttgttcg ttatcttctg gactaccctt caacttttca taatgactag 2580 ctaaatataa aaaattcaca tatttgcttg gcagagccag ctcatttcct ttttgtaatt 2640 ctccggcact agccagcatc cgtttacgac cgttttctaa ctcaaaaaga ctatatttag 2700 gtagtttaat gattaagtct tttttaactt ccttatatcc tttagcttct aaaaagtcaa 2760 tcggattttt ttcaaaggaa cttctttcca taattgtgat ccctagtaac tctttaacgg 2820 attttaactt cttcgatttc cctttttcca ccttagcaac cactaggact gaataagcta 2880 ccgttggact atcaaaacca ccatattttt ttggatccca gtctttttta cgagcaataa 2940 gcttgtccga atttcttttt ggtaaaattg actccttgga gaatccgcct gtctgtactt 3000 ctgttttctt gacaatattg acttggggca tggacaatac tttgcgcact gtggcaaaat 3060 ctcgcccttt atcccagaca atttctccag tttccccatt agtttcgatt agagggcgtt 3120 tgcgaatctc tccatttgca agtgtaattt ctgttttgaa gaagttcatg atattagagt 3180 aaaagaaata ttttgcggtt gctttgccta tttcttgctc agacttagca atcattttac 3240 gaacatcata aactttataa tcaccataga caaactccga ttcaagtttt ggatatttct 3300 taatcaaagc agttccaacg acggcattta gatacgcatc atgggcatga tggtaattgt 3360 taatctcacg tactttatag aattggaaat cttttcggaa gtcagaaact aatttagatt 3420 ttaaggtaat cactttaacc tctcgaataa gtttatcatt ttcatcgtat ttagtattca 3480 tgcgactatc caaaatttgt gccacatgct tagtgatttg gcgagtttca accaattggc 3540 gtttgataaa accagcttta tcaagttcac tcaaacctcc acgttcagct ttcgttaaat 3600 tatcaaactt acgttgagtg attaacttgg cgtttagaag ttgtctccaa tagtttttca 3660 tctttttgac tacttcttca cttggaacgt tatccgattt accacgattt ttatcagaac 3720 gcgttaagac cttattgtct attgaatcgt ctttaaggaa actttgtgga acaatggcat 3780 cgacatcata atcacttaaa cgattaatat ctaattcttg gtccacatac atgtctcttc 3840 cattttggag ataatagaga tagagctttt cattttgcaa ttgagtattt tcaacaggat 3900 gctctttaag aatctgactt cctaattctt tgataccttc ttcgattcgt ttcatacgct 3960 ctcgcgaatt tttctggccc ttttgagttg tctgattttc acgtgccatt tcaataacga 4020 tattttctgg cttatgccgc cccattactt tgaccaattc atcaacaact tttacagtct 4080 gtaaaatacc ttttttaata gcagggctac cagctaaatt tgcaatatgt tcatgtaaac 4140 tatcgccttg tccagacact tgtgcttttt gaatgtcttc tttaaatgtc aaactatcat 4200 catggatcag ctgcataaaa ttgcgattgg caaaaccatc tgatttcaaa aaatctaata 4260 ttgttttgcc agattgctta tccctaatac cattaatcaa ttttcgagac aaacgtcccc 4320 aaccagtata acggcgacgt ttaagctgtt tcatcacctt atcatcaaag aggtgagcat 4380 atgttttaag tctttcctca atcatctccc tatcttcaaa taaggtcaat gttaaaacaa 4440 tatcctctaa gatatcttca ttttcttcat tatccaaaaa atctttatct ttaataattt 4500 ttagcaaatc atggtaggta cctaatgaag cattaaatct atcttcaact cctgaaattt 4560 caacactatc aaaacattct atttttttga aataatcttc ttttaattgc ttaacggtta 4620 cttttcgatt tgttttgaag agtaaatcaa caatggcttt cttctgttca cctgaaagaa 4680 atgctggttt tcgcattcct tcagtaacat atttgacctt tgtcaattcg ttataaaccg 4740 taaaatactc ataaagcaaa ctatgttttg gtagtacttt ttcatttgga agatttttat 4800 caaagtttgt catgcgttca ataaatgatt gagctgaagc acctttatcg acaacttctt 4860 caaaattcca tggggtaatt gtttcttcag acttccgagt catccatgca aaacgactat 4920 tgccacgcgc caatggacca acataataag gaattcgaaa agtcaagatt ttttcaatct 4980 tctcacgatt gtcttttaaa aatggataaa agtcttcttg tcttctcaaa atagcatgca 5040 gctcacccaa gtgaatttga tggggaatag agccgttgtc aaaggtccgt tgcttgcgca 5100 gcaaatcttc acgatttagt ttcaccaata attcctcagt accatccatt ttttctaaaa 5160 ttggtttgat aaatttataa aattcttctt ggctagctcc cccatcaata taacctgcat 5220 atccgttttt tgattgatca aaaaagattt ctttatactt ttctggaagt tgttgtcgaa 5280 ctaaagcttt taaaagagtc aagtcttgat gatgttcatc gtagcgttta atcattgaag 5340 ctgatagggg agccttagtt atttcagtat ttactcttag gatatctgaa agtaaaatag 5400 catctgataa attcttagct gccaaaaaca aatcagcata ttgatctcca atttgcgcca 5460 ataaattatc taaatcatca tcgtaagtat cttttgaaag ctgtaattta gcatcttctg 5520 ccaaatcaaa atttgattta aaattagggg tcaaacccaa tgacaaagca atgagattcc 5580 caaataagcc atttttcttc tcaccgggga gctgagcaat gagattttct aatcgtcttg 5640 atttactcaa tcgtgcagaa agaatcgctt tagcatctac tccacttgcg ttaatagggt 5700 tttcttcaaa taattgattg taggtttgta ccaactggat aaatagtttg tccacatcac 5760 tattatcagg atttaaatct ccctcaatca aaaaatgacc acgaaactta atcatatgcg 5820 ctaaggccaa atagattaag cgcaaatccg ctttatcagt agaatctacc aatttttttc 5880 gcagatgata gatagttgga tatttctcat gataagcaac ttcatctact atatttccaa 5940 aaataggatg acgttcatgc ttcttgtctt cttccaccaa aaaagactct tcaagtcgat 6000 gaaagaaact atcatctact ttcgccatct catttgaaaa aatctcctgt agataacaaa 6060 tacgattctt ccgacgtgta taccttctac gagctgtccg tttgagacga gtcgcttccg 6120 ctgtctctcc actgtcaaat aaaagagccc ctataagatt ttttttgata ctgtggcggt 6180 ctgtatttcc cagaaccttg aactttttag acggaacctt atattcatca gtgatcaccg 6240 cccatccgac gctatttgtg ccgatagcta agcctattga gtatttctta tccatagatc 6300 ctttctcctc tttagatctg ctagcataat acctagggct gagctagccg taaatgaggt 6360 ttcagcaaaa aacccctcaa gacccgttta gaggccccaa ggggttatgc tagttattgc 6420 tcagcggatt aattattaga aaaattcatc cagcatcaga tgaaattgca gtttgttcat 6480 atccggatta tcaatgccat atttctgaaa cagacgtttt tgcaggctcg ggctaaattc 6540 gcccaggcag ttccacagaa tggccagatc ctgataacga tccgcaatgc ccacacggcc 6600 cacatcaatg cagccaatca gtttgccttc atcgaaaatc aggttatcca ggctaaaatc 6660 gccgtgggtc accacgctat ccgggctaaa cggcagcagt ttatgcattt ctttccacac 6720 ctgttccacc ggccagccgt tacgttcatc atcaaaatcg ctcgcatcca ccaggccgtt 6780 gttcatacgg ctctgcgcct gggccagacg aaacacacga tcgctgttaa acgggcagtt 6840 gcacaccgga atgctatgca gacgacgcag aaacacggcc agcgcatcca caatgttttc 6900 gccgctatcc ggatattctt ccagcacctg aaacgcggtt ttgcccggaa tcgcggtggt 6960 cagcagccac gcatcatccg gggtgcgaat aaaatgttta atggtcggca gcggcataaa 7020 ttcggtcagc cagttcagac gcaccatttc atcggtcaca tcgttcgcca cgctgccttt 7080 gccatgtttc agaaacagtt ccggcgcatc cggtttgcca tacagacgat aaatggtcgc 7140 gccgctctga cccacgttat cacgcgccca tttatagcca tacagatccg catccatgtt 7200 gctgttcaga cgcggacggc tacagctcgt ttcacgctga atatggctca taacacccct 7260 tgtattactg tttatgtaag cagacagttt tattgttcat gatgatatat ttttatcttg 7320 tgcaatgtaa catcagagat tttgagacac aaatttaaat cgtaattatt ggggacccct 7380 ggattctcac caataaaaaa cgcccggcgg caaccgagcg ttctgaacaa atccagatgg 7440 agttctgagg tcattactgg atctatcaac aggagtccaa gactagtcgc cagggttttc 7500 ccagtcacga cgcggccgca agcttgcatg cctgcaggtc gactctagag gatccccggg 7560 taccgagctc gaattcgcgc ggccgcggcc taggcggcct cctgtgtgaa attgttatcc 7620 gctttaatta a 7631

Claims (28)

  1. 표적-항균-플라스미드(Targeted Antibacterial Plasmid:TAP)로서,
    i) 복제 기원(origin of replication), ii) 전달 기원(origin of transfer), iii) 뉴클레아제를 암호화하는 유전학적으로-조작된 핵산 시퀀스, 및 iv) 가이드 RNA 분자를 암호화하는 하나 이상의 유전학적으로-조작된 핵산 시퀀스(들)를 포함하는, 플라스미드.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 복제 기원은 pBBR1 플라스미드의 복제 기원이고, 특히 시퀀스 동정 번호: 1의 핵산 시퀀스로 이루어지는, 플라스미드.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 전달 기원은 RP4 플라스미드의 oriT이고, 특히 시퀀스 동정 번호: 2의 핵산 시퀀스로 이루어지는, 플라스미드.
  4. 제1항에 있어서,
    상기 전달 기원은 F 플라스미드의 oriTF이고, 특히 시퀀스 동정 번호: 3의 핵산 시퀀스로 이루어지는, 플라스미드.
  5. 제1항에 있어서,
    CRISPR-연관 엔도뉴클레아제를 암호화하며, 특히 Cas9 단백질에서 파생되는(derived) CRISPR/Cas 뉴클레아제를 암호화하는, 플라스미드.
  6. 제5항에 있어서,
    Cas9 뉴클레아제는 시퀀스 동정 번호: 4에서 규정되는 바와 같은 아미노산 시퀀스를 포함하는, 플라스미드.
  7. 제5항에 있어서,
    Cas9 단백질을 암호화하는 핵산 시퀀스는 시퀀스 동정 번호: 7의 핵산 시퀀스로 이루어지는, 플라스미드.
  8. 제5항에 있어서,
    CRISPR/Cas 뉴클레아제는 결함(defective) Cas9인, 플라스미드.
  9. 제8항에 있어서,
    결함 Cas9는, 시퀀스 동정 번호: 5 또는 시퀀스 동정 번호: 6에서 규정되는 바와 같은 아미노산 시퀀스를 포함하는 Cas9 니카제인, 플라스미드.
  10. 제9항에 있어서,
    결함 Cas9 단백질을 암호화하는 핵산 시퀀스는 시퀀스 동정 번호: 8의 핵산 시퀀스로 이루어지는, 플라스미드.
  11. 제1항에 있어서,
    뉴클레아제를 암호화하는 핵산 시퀀스는 약한 구성 프로모터에 작동가능하게(operatively) 연결되며, 특히 시퀀스 동정 번호: 9의 핵산 시퀀스를 갖는 약한 구성 BBa_J23107 프로모터에 작동가능하게 연결되는, 플라스미드.
  12. 제1항에 있어서,
    가이드 RNA 분자를 암호화하는 2, 3, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개의 핵산 시퀀스를 포함하는, 플라스미드.
  13. 제1항에 있어서,
    본 발명의 플라스미드에 의해 암호화되는 가이드 RNA 분자(들)는 스페이서 시퀀스(즉, crRNA) 및 트랜스-활성화 RNA("tracrRNA") 시퀀스를 포함하는, 플라스미드.
  14. 제13항에 있어서,
    상기 스페이서 시퀀스는 항생제 내성 유전자를 표적으로 하거나, 또는 표적 시퀀스에서 DSB를 생성하도록 설계되는, 플라스미드.
  15. 제13항에 있어서,
    상기 스페이서 시퀀스는 표 1에서 선택되는 핵산 시퀀스에 의해 암호화되는, 플라스미드.
  16. 제1항에 있어서,
    가이드 RNA 분자를 암호화하는 핵산 시퀀스(들)는 강한 구성 프로모터에 작동가능하게 연결되며, 특히 시퀀스 동정 번호: 26의 핵산 시퀀스를 갖는 강한 구성 BBa_J23119 프로모터에 작동가능하게 연결되는, 플라스미드.
  17. 제1항에 있어서,
    선택적으로 하나 이상의 선택 마커(들)를 포함하는, 플라스미드.
  18. 제1항에 있어서,
    시퀀스 동정 번호: 27 또는 28에서 규정되는 바와 같은 핵산 시퀀스로 이루어지는, 플라스미드.
  19. 일정한 사본 수(a copy number of)의 제1항의 표적-항균-플라스미드를 포함하는 공여체 박테리아 세포(donor bacterial cell).
  20. 제19항에 있어서,
    일정한 사본 수의 접합 플라스미드를 더 포함하는, 공여체 박테리아 세포.
  21. 제20항에 있어서,
    일정한 사본 수의 F 인자 및 플라스미드 F의 전달 기원을 포함하는 일정한 사본 수의 표적-항균-플라스미드를 포함하는, 공여체 박테리아 세포.
  22. 제20항에 있어서,
    일정한 사본 수의 RP4 플라스미드 및 플라스미드 RP4의 전달 기원을 포함하는 일정한 사본 수의 표적-항균-플라스미드를 포함하는, 공여체 박테리아 세포.
  23. 제19항에 있어서,
    비-병원성이고, 특히 프로바이오틱 세포인, 공여체 박테리아 세포.
  24. 복수의 수신체 박테리아 세포(recipient bacterial cell)를 죽이는 방법으로서, 상기 복수의 수신체 박테리아 세포 내에서 뉴클레아제 및 하나 이상의 가이드 RNA 분자를 발현하도록 구성되는 일정한 사본 수의 제1항의 표적-항균-플라스미드를 포함하는 복수의 공여체 박테리아 세포에 상기 복수의 수신체 박테리아 세포를 노출시키는 것을 포함하며, 상기 복수의 수신체 박테리아 세포 내의 상기 뉴클레아제 및 가이드 RNA 분자의 전달 및 발현은 상기 복수의 수신체 박테리아 세포에 치명적인(lethal) 것인, 방법.
  25. 제24항에 있어서,
    상기 수신체 박테리아 세포는 병원성 박테리아인, 방법.
  26. 제24항에 있어서,
    다양한 박테리아 감염 또는 박테리아와 연관되는 바람직하지 않은 상태를 치료하기 위한, 방법.
  27. 항생제 내성 유전자를 포함하는 박테리아 세포에 의해 야기되는 대상체에서의 감염을 치료하는 방법으로서, 항생제 내성 유전자를 표적하기에 적합한 하나 이상의 가이드 RNA 분자를 암호화하는 일정한 사본 수의 표적-항균-플라스미드를 포함하는 박테리아 공여체 세포의 치료학적 유효량과 함께 항생제의 치료학적 유효량을 대상체에 투여하고, 그에 의해 항생제 내성 유전자를 비활성화하고 박테리아 세포를 상기 항생제에 대해 민감하게 하는 것을 포함하는, 방법.
  28. 일정량의 제19항의 공여체 박테리아 세포를 포함하는 조성물.
KR1020237015556A 2020-10-13 2021-10-12 표적-항균-플라스미드 조합 접합 및 crispr/cas 시스템 및 그의 용도 KR20230082676A (ko)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
EP20306200.5 2020-10-13
EP20306200 2020-10-13
PCT/EP2021/078161 WO2022079020A1 (en) 2020-10-13 2021-10-12 Targeted-antibacterial-plasmids combining conjugation and crispr /cas systems and uses thereof

Publications (1)

Publication Number Publication Date
KR20230082676A true KR20230082676A (ko) 2023-06-08

Family

ID=73598017

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020237015556A KR20230082676A (ko) 2020-10-13 2021-10-12 표적-항균-플라스미드 조합 접합 및 crispr/cas 시스템 및 그의 용도

Country Status (6)

Country Link
US (1) US20240016855A1 (ko)
EP (1) EP4229199A1 (ko)
JP (1) JP2023549042A (ko)
KR (1) KR20230082676A (ko)
CN (1) CN116391040A (ko)
WO (1) WO2022079020A1 (ko)

Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN115960895A (zh) * 2022-08-09 2023-04-14 中国科学院微生物研究所 一种偶联的crispr和毒素-抗毒素元件及其在消杀耐药细菌中的应用

Family Cites Families (11)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4968619A (en) 1976-09-27 1990-11-06 Research Corporation Modified microorganisms and method of preparing and using same
DE69941212D1 (de) 1998-03-23 2009-09-17 Gen Mills Inc Verkapselung von komponenten in essbaren produkten
DK3401400T3 (da) 2012-05-25 2019-06-03 Univ California Fremgangsmåder og sammensætninger til rna-styret mål-dna-modifikation og til rna-styret transskriptionsmodulering
US20140273230A1 (en) 2013-03-15 2014-09-18 Sigma-Aldrich Co., Llc Crispr-based genome modification and regulation
US9234213B2 (en) 2013-03-15 2016-01-12 System Biosciences, Llc Compositions and methods directed to CRISPR/Cas genomic engineering systems
CA2907198C (en) 2013-03-15 2019-12-10 The General Hospital Corporation Using rna-guided foki nucleases (rfns) to increase specificity for rna-guided genome editing
WO2015034872A2 (en) * 2013-09-05 2015-03-12 Massachusetts Institute Of Technology Tuning microbial populations with programmable nucleases
WO2017009399A1 (en) * 2015-07-13 2017-01-19 Institut Pasteur Improving sequence-specific antimicrobials by blocking dna repair
US20200115688A1 (en) * 2017-08-15 2020-04-16 The Regents Of The University Of California Compositions and methods for enhancing genome editing
WO2020146888A1 (en) * 2019-01-11 2020-07-16 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Microbiome engineering through engineered mobile genetic elements
CN111378660B (zh) * 2020-02-29 2021-08-06 浙江大学 一种靶向四环素抗性基因tetA的sgRNA及其敲除载体、载体构建方法和应用

Also Published As

Publication number Publication date
US20240016855A1 (en) 2024-01-18
EP4229199A1 (en) 2023-08-23
JP2023549042A (ja) 2023-11-22
WO2022079020A1 (en) 2022-04-21
CN116391040A (zh) 2023-07-04

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Gholizadeh et al. How CRISPR-Cas system could be used to combat antimicrobial resistance
CN107208070B (zh) 细菌基因的靶向消除
US20230310525A1 (en) Bacteriophage variants having extended host-range, methods for preparation and uses thereof in transducing nucleic acids into hosts of interest
US11542466B2 (en) Methods and compositions for delivery of CRISPR based antimicrobials
JP2021000092A (ja) 細胞工学のための方法および遺伝システム
TW202014519A (zh) 殺目標細菌之組合物及方法
EP2872162B1 (en) Colicins for treating bacterial infections
JP2019010125A (ja) 細菌中の接合性プラスミドの低減方法
Song et al. Great effect of porin (aha) in bacterial adhesion and virulence regulation in Aeromonas veronii
JP2021531039A (ja) 細菌接合システム及びその治療的使用
US20240016855A1 (en) Targeted-antibacterial-plasmids combining conjugation and crispr/cas systems and uses thereof
CN114854758B (zh) 基于CRISPR-Cas13a系统靶向杀死沙门氏菌的方法及其应用
Wang et al. CRISPR/Cas9-based genome editing platform for companilactobacillus crustorum to reveal the molecular mechanism of its probiotic properties
Erjavec et al. Strain ŽP—the first bacterial conjugation-based “kill”–“anti-kill” antimicrobial system
Ashwath et al. A quest to the therapeutic arsenal: Novel strategies to combat multidrug-resistant bacteria
US20210093679A1 (en) Engineered gut microbes and uses thereof
Sheng et al. Engineering conjugative CRISPR-Cas9 systems for the targeted control of enteric pathogens and antibiotic resistance
Hossain Molecular Interactions between phage and the catfish pathogen Edwardsiella ictaluri and Comparative Genomics of Epidemic strains of Aeromonas hydrophila
Chaudhary et al. Sulbactomax prevents antimicrobial resistance development by inhibition of conjugal transfer of F plasmids
WO2024052907A1 (en) Systems for production of transducing particles, methods, kits, compositions and uses thereof
Rodrigues CRISPR-Cas systems in Enterococcus faecalis and their application in probiotics for the removal of antibiotic resistance
Walker-Sünderhauf Removal of antimicrobial resistance genes from bacterial strains and communities using CRISPR-Cas9
Reynolds The identification and characterisation of novel antimicrobial resistance genes from human and animal metagenomes
Fang et al. Engineering probiotic Escherichia coli Nissle 1917 to block transfer of multiple antibiotic resistance genes by exploiting a type I CRISPR-Cas system
Virolle et al. Bacteria DNA conjugation: from the cellular to the community level