CN116391040A - 结合接合和Crispr/Cas系统的靶向抗菌质粒及其用途 - Google Patents

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Abstract

全球耐药细菌的出现导致我们的抗生素库失去疗效，严重限制了目前可用的治疗方法的成功。本发明中，发明人开发了一种基于靶向抗菌质粒(TAPs)的创新策略，该策略利用细菌接合递送发挥菌株特异性抗菌活性的CRISPR/Cas系统。TAPs用途广泛，因为它们可以针对任何特定的基因组或质粒DNA使用识别合适的靶向间隔序列的自定义算法(CSTB)。本发明人通过在靶向基因组中引入致死性DSBs证明了TAPs诱导菌株选择性杀伤的能力。针对质粒产生的碳青霉烯类耐药基因的TAPs能有效地使菌株对该药物产生重新敏感。这项工作代表了开发抗生素治疗替代品的重要一步，其可以在不影响其他非靶向细菌群落的情况下消除靶向耐药细菌和/或病原体细菌。

Description

结合接合和Crispr/Cas系统的靶向抗菌质粒及其用途
技术领域
本发明涉及细菌学和医学领域。
背景技术
据预测，在未来几十年内，抗药细菌在世界范围内的扩散将导致人类由于治疗失败而死亡的数量急剧增加。细菌耐药性的不断出现和目前抗生素发现率低强调了开发创新的抗菌策略的必要性，这些策略以真正替代抗生素的使用。此外，抗生素由于针对细菌增殖所必需的基本过程，通常缺乏特异性。因此，抗生素影响整个治疗细菌群落，而不区分不需要的菌株和共生菌株，并且还会选择耐药菌株增殖。最近的报告表明，通过使用成簇的规则间隔短回文重复序列(CRISPR)和相关的Cas蛋白来实现特异性抗菌活性的可能性。CRISPR/Cas系统可以通过Cas9核酸酶诱导染色体的双链断裂(DSB)来实现杀菌(Jinek et al2012,PMID22745249；Gasiunas et al 2012,PMID22949671)。当使用死亡的催化Cas9酶(dCas9)时，也可以通过CRISPR干扰(CRISPRi)来抑制特定基因的表达(Qi et al 2013；Bikard et al 2013；PMID23452860 PMID23761437)。CRISPR靶向依赖于约16～20个核苷酸的靶特异性向导RNA(gRNA)序列，该序列允许将Cas核酸酶募集到互补的DNA序列中(Jineket al 2012；Anders et al 2014；PMID22745249 PMID 25079318)。CRISPR靶向具有高度特异性，尤其是在脱靶活性有限的细菌中。然而，为了用作实用的抗菌工具，CRISPR/Cas基因需要被递送到靶细菌。细菌DNA接合精确地提供了将长DNA片段转移到一系列细菌物种的可能性(转移特异性取决于所考虑的接合系统的宿主范围)。
发明内容
本发明由权利要求限定。特别地，本发明涉及靶向抗菌质粒及其用途，特别是用于治疗目的的用途。
附图说明
图1为通过F质粒机制转移TAP介导靶向大肠杆菌菌株的杀灭。(a)TAPs模块由CRISPR系统组成，该系统由由弱组成型BBa_J23107启动子表达的野生型(cas9)或催化死亡的cas9(dcas9)基因以及由强组成型BBa_J23119启动子表达的gRNA模块组成；F质粒转移起点(oriTF)；pBBR1复制起点(oriV)和一组抗性盒(Ap，氨苄青霉素；Kn，卡那霉素；Cm，氯霉素；St，链霉素；Gm，庆大霉素)，一个可选的盒，用于从宽宿主范围合成BioFab启动子中高表达的SFGFP或Mcherry基因。(b)TAP抗菌策略示意图。供体菌株产生F质粒接合机制，将TAP转移到受体菌株中。靶向受体携带由CRISPR(i)系统识别的序列，诱导杀伤或基因表达抑制。缺乏间隔识别序列的非靶向受体对CRISPR(i)的活性不敏感。(c)通过流式细胞仪估计的TAPs转移直方图显示，交配3小时后，TAPkn-Cas9-nsp-GFP和TAPkn-Cas9-lacZ2-GFP在受体细胞中以相似的效率转移。供体为TAP-Cas9-nsp(LY1371)或TAP-Cas9-lacZ2(LY1380)，受体为HU-mCherry lac+(LY248)。(d)通过电镀测定估计的活的转化接合子浓度的直方图显示，与TAP-Cas9-lacZ2的获取相关的活力损失。每个柱上方显示了相应的可存活的转化接合子的百分比(比率T/R+T)。(e)在交配3小时内，受体种群计数的倍数增加。供体为TAP-Cas9-nsp(LY1369)或TAP-Cas9-lacZ2(LY1370)，受体为lac+(LY827)。(c-e)平均值和标准偏差(SD)由3次独立试验计算得出。
图2为获取TAP后大肠杆菌杀灭的实时可视化。(a-b)转化接合子(a)细菌和(b)类核长度的单细胞延时定量。显示平均值和标准偏差(SD)(分析了n个细胞)。TAP采集时间(红色虚线为0分钟)对应于转化接合子细胞中绿色荧光增加15％。(c-d)转化接合子的单细胞延时定量(c)细胞长度和(d)RecA-GFP荧光信号的偏度。显示平均值和标准偏差(SD)(分析了n个细胞)。TAP采集时间(红色虚线为0分钟)对应于转化接合子细胞中绿色荧光增加30％。
图3为TAP系统特异性杀死靶向和非靶向大肠杆菌受体细胞混合物中的靶向受体。(a)通过TAPkn-Cas9-nsp或TAPkn-Cas9-lacZ2从供体转移到混合lac+和lac-受体种群的或转化接合子细胞和转化接合子细胞的百分比(比率T/R+T)。(b)在交配的6小时内，对lac+和lac-受体种群计数的倍数增加进行量化。平均值和标准偏差由4次独立试验计算得出。供体：TAP-Cas9-nsp(LY1369)或TAP-Cas9-lacZ2(LY1370)；受体为lac+(LY827)和lac-(LY848)。(c)单细胞定量显示靶向lac+转化接合子细胞中的细胞长度增加，但非靶向的lac-转化接合子细胞中的细胞长度没有增加。TAP采集时间(红色虚线为0分钟)对应于转化接合子细胞中绿色荧光增加15％。细胞平均长度用标准偏差(SD)表示(分析了n个细胞)。供体为TAP-Cas9-lacZ2(LY1380)；受体为HU-mCherry lac+(LY248)和DnaN-mCherry lac-(LY1423)。
图4为TAP使携带pOXA48的受体细胞重新敏感并阻止抗性的传播。(a)TAP介导的反抗性策略示意图。将靶向blaOXA48启动子的TAP-Cas9-OXA48从供体转移至携带pOXA-48a质粒的氨苄青霉素抗性受体细胞。获得TAP-Cas9-OXA48会诱导双链断裂(DSB)进入质粒，而TAP-dCas9-OXA48抑制blaOXA48基因表达。两种TAP均使转化接合子细胞对氨苄青霉素敏感。(b)直方图显示在获得TAPkn-Cas9-OXA48、TAPkn-dCas9-OXA48和TAPkn-Cas9-OXA48-PemI后，转化接合子细胞中氨苄青霉素抗性的降低。显示了转化接合子的百分比(比率T/R+T)。(c)直方图显示了供体细胞通过从受体转移pOXA-48a获得氨苄青霉素抗性的频率(如上图所示)。(d)直方图显示了通过pOXA-48a转移到已接受TAPs(TAP-transc.#2)的R#2无质粒wt受体中获得氨苄青霉素抗性的频率(如上图所示)。根据至少3次独立试验计算平均值和标准偏差。供体为TAP-dCas9-nsp(LY1524)、TAP-Cas9-nsp(LY1369)、TAP-dCas9-OXA48(LY1523)、TAP-Cas9-OXA48(LY1522)或TAP-PemI-Cas9-OXA48(LY1549)；受体为R#1wt/pOXA-48a(LY1507)和R#2wt(LY945)。
图5为多物种受体群体中TAPs的高效和菌株特异性杀灭。(a)TAP-Cas9-NSP从大肠杆菌(LY1369)供体转移到鼠类柠檬酸杆菌(C.rodentium)、阴沟肠杆菌(E.cloacae)、肠致病性大肠杆菌(E.coli EPEC)或HS受体的效率。直方图显示了鼠类柠檬酸杆菌(C.rodentium)、阴沟肠杆菌(E.cloacae)、致病性大肠杆菌(E.coli EPEC)受体在接合24小时后和大肠杆菌HS受体在接合3小时后的转化接合子的百分比(T/R+T)；根据至少3次独立试验计算平均值和标准偏差。(b)针对每个受体细胞测试携带用CSTB算法识别的特定间隔区的TAPs。为了说明不同受体菌株中TAP转移的变异性，直方图显示了由TAPKn-Cas9-nsp获得的活转化接合子标准化的活转化接合子的相对丰度。星号上方括号中的数字表示检测限低于10-8的转化接合子的重复次数。平均值和标准偏差SD由3次独立试验计算得出。(c)在与供体交配前通过涂布试验(plating assay)估计的受体比例。显示了每个受体菌株从3个独立试验计算的平均值和标准偏差SD。(d)每个携带特定间隔区的TAP通过大肠杆菌供体和包含所有受体物种的受体种群之间的接合来测试。直方图显示了交配3小时后混合种群中活转化接合子的比例。星号上方括号中的数字表示检测限低于10-8的转化接合子的重复次数。平均值和标准偏差SD由3次独立试验计算得出。供体为TAP-Cas9-nsp(LY1369)、TAP-Cas9-Cr1(LY1597)、TAP-Cas9-Ecl(LY1566)、TAP-Cas9-EPEC(LY1618)、TAP-Cas9-EEC(LY1665)；受体为鼠类柠檬酸杆菌(C.rodentium)(LY720)、阴沟肠杆菌(E.cloacae)(LY1410)、肠致病性大肠杆菌(E.coli EPEC)(LY1615)或HS(LY1601)。
具体实施方式
全球耐药细菌的出现导致我们的抗生素库失去疗效，严重限制了目前可用的治疗方法的成功。本发明中，发明人开发了一种基于靶向抗菌质粒(TAPs)的创新策略，利用细菌接合来递送发挥菌株特异性抗菌活性的CRISPR/Cas系统。TAPs用途广泛，因为它们可以针对任何特定的基因组或质粒DNA使用识别合适的靶向间隔序列的自定义算法(CSTB)。本发明人通过在靶向基因组中引入致死性DSBs证明了TAPs诱导菌株选择性杀伤的能力。针对质粒产生的碳青霉烯类耐药基因的TAPs能有效地使菌株对该药物产生重新敏感。这项工作代表了开发抗生素治疗替代品的重要一步，其可以在不影响其他非靶向细菌群落的情况下消除靶向耐药细菌和/或病原体细菌。
主要定义：
如本文所用，术语“多肽”、“肽”和“蛋白质”可互换使用用于指代任何长度的氨基酸聚合物。该术语还包括已被修饰的氨基酸聚合物；例如二硫键形成、糖基化、脂质化、磷酸化或与标记组分结合。当在基因治疗的上下文中讨论时，多肽是指各自完整的多肽，或其任何片段或基因工程衍生物，其保留了完整蛋白质所需的生化功能。
如本文所用，表述“衍生自”是指其中第一组分(例如，第一多肽)或来自该第一组分的信息用于分离、衍生或制造不同的第二组分(例如，与第一组分不同的第二多肽)的过程。
如本文所用，术语“核酸序列”是指任何长度的核苷酸的聚合形式，包括脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸，或其类似物。核酸序列可包含修饰的核苷酸，例如甲基化的核苷酸和核苷酸类似物，并且可以被非核苷酸组分中断。如果存在，可以在聚合物组装之前或之后进行核苷酸结构的修饰。
如本文所用，术语“质粒”是指通常来自细菌的自包含双链DNA分子，可以容易地接受额外的(外源)DNA，并且可以容易地被引入合适的宿主细胞。质粒载体通常含有编码DNA和启动子DNA，并具有一个或多个适于插入外源DNA的限制性位点。启动子DNA和编码DNA可以来自同一基因或来自不同基因，也可以来自相同或不同的生物体。通常，质粒具有所需长度的大小，合适地为至少约5kb，优选为至少约10kb，更优选为至少约20或30kb，甚至更优选为至少约40或50kb。质粒大小的上限可以根据需要选择，合适地为约300kb，优选为约350或400kb。在一些实施方式中，大小上限甚至更高，例如450或500kb。
如本文所用，术语“接合”是指核酸通过细胞间的直接接触从一个原核细胞直接转移到另一个原核细胞。接合后携带转移DNA的细胞被称为“接合后体(exoconjugant)”、“接合后体(exconjugant)”或“转化接合子”。
如本文所用，术语“原核生物F因子分区系统”是指确保F因子在细胞分裂时的适当分离和忠实分布的一种主动定位过程。这种分区系统包含三个功能不同的区域：其中两个(sopA和sopB)编码反式作用的基因产物，而第三个区域(sopC)在顺式中起作用。如本文所用，“F因子”或“原核F因子”是指在原核生物中发现的生育因子。它是一段约100Kb的游离DNA，使细菌能够介导与其他细菌的接合。F因子“分区系统”是指确保两个子细胞都继承亲代质粒拷贝的系统。
如本文所用，术语“供体细菌细胞”是指包含用于转移到受体细菌细胞中的接合质粒的细菌细胞。
如本文所用，术语“受体细菌细胞”表示最终接受供体细菌细胞的接合质粒的细菌细胞。
如本文所用，术语“益生菌”是指活的微生物，它们以足够的量整合在一起，对健康、舒适和身心健康产生超出传统营养效果的积极影响。益生菌微生物被定义为“当给予足够的剂量时对宿主健康有益的活微生物”(FAO/WHO 2001)。
如本文所用，术语“活益生菌细胞”是指具有代谢活性并且能够在受试者的胃肠道中定植的微生物。
如本文所用，术语“重组质粒”或“合成质粒”是指人工构建的质粒，使用分子生物学方案将从自然界不同生物体获得的核酸序列组合起来。
如本文所用，术语“接合质粒”指通过细胞间的直接接触，从一个供体细菌细胞直接转移到一个受体细菌细胞的质粒。已知许多天然存在的接合质粒，它们可以在有限的物种内(窄宿主范围)或在许多物种之间(宽宿主范围)转移相关基因。
如本文所用，术语“靶向抗菌质粒”或“TAP”是指合成的接合质粒，其在细胞内作为DNA复制的自主单位，即能够在其自身控制下复制，其包含i)复制起点，ii)转移起点，iii)编码核酸酶的核酸序列，和iv)一个或多个编码向导RNA分子的核酸序列。根据本发明，本发明的靶向抗菌质粒靶向受体细菌细胞，从而改变其表型和/或杀死受体细菌细胞。
如本文所用，术语“拷贝数”是指细菌细胞中质粒的数量。这将被理解为描述存在于供体菌细胞中的重组表达构建体的特征，其中每个细胞多于一个拷贝。大多数质粒通过术语“多拷贝数”、“低拷贝数”或“高拷贝数”来分类，这些术语描述了质粒/染色体分子的比例。
如本文所用，术语“复制起点”或“oriV”旨在涵盖质粒复制所必需的核苷酸区域。
如本文所用，术语“范围”或“宿主范围”通常是指特定质粒(天然或重组)可以复制的不同细菌种类的数量和多样性的参数。在这两个参数中，本领域技术人员认为生物的多样性通常更能定义宿主范围。例如，如果质粒在一个组的许多物种中复制，例如肠杆菌科，则可能被认为其宿主范围较窄。相比之下，如果据报道质粒仅在少数物种中复制，但这些物种来自系统发育多样化的类群，则该质粒可被认为具有广泛的宿主范围。如本文所述，两种类型的质粒都将在本发明中找到用途。
如本文所用，术语“转移起点”或“oriT”旨在涵盖允许质粒从一个供体细胞转移至宿主所必需的核苷酸区域。转移起点代表载体上转移过程开始的位点。它在遗传学上也被定义为要转移的DNA顺式所需区域。接合特异性DNA复制起始于oriT区域，该区域也编码质粒转移因子。通常，oriT的长度约为40-500bp，并且包含固有弯曲以及结合参与DNA转移相关的蛋白质的正向(direct)和反向重复序列。oriT由三个功能定义的结构域组成：切割结构域、转移结构域和终止结构域。nic位点本身是链特异性和序列特异性切割位点，被松弛酶切割和再连接。在大多数情况下，松弛酶需要将松弛酶导向到nic位点并确保反应的特异性的辅助蛋白。迄今为止鉴定的nic位点的序列揭示了由IncF、-P和-Q以及某些革兰氏阳性质粒(如pMV158)代表的四种可能的序列。此外，通常有一种蛋白质与oriT内的多个位点结合，在DNA中形成更高级的结构，这对于该过程至关重要。这种蛋白质似乎也具有将松弛体锚定在运输载体(transport machinery)上的功能。
如本文所用，术语“核酸酶”包括诱导核酸序列断裂的蛋白质(即酶)，例如双链DNA序列中的单链或双链断裂。
如本文所用，术语“CRISPR/Cas核酸酶”具有其在本领域中的一般含义，是指含有成簇的规则间隔短回文重复序列(CRISPR)和由Cas基因编码的相关核酸酶的原核DNA片段。在细菌中，CRISPR/Cas基因座编码针对移动遗传元件(病毒、转座因子和接合质粒)的RNA指导的适应性免疫系统。已经确定了三种类型的CRISPR系统。CRISPR簇包含间隔子，该序列与先前的移动元件互补。CRISPR簇被转录并加工成成熟的CRISPR(成簇规则间隔短回文重复序列)RNA(crRNA)。CRISPR/Cas核酸酶Cas9和Cpf1属于II型和V型CRISPR/Cas系统，具有强的内切核酸酶活性来切割靶DNA。Cas9由成熟的crRNA引导，该crRNA包含约20个核苷酸的独特靶序列(称为间隔序列)和反式激活的小RNA(tracrRNA)，该小RNA也可作为前crRNA的核糖核酸酶III辅助的加工的引导。crRNA：tracrRNA双链体通过crRNA上的间隔序列和靶DNA上的互补序列(称为原间隔序列)之间的互补碱基配对，引导Cas9靶向靶DNA。Cas9识别三核苷酸(S.Pyogenes Cas9的NGG)原型间隔序列相邻基序(PAM)以指定切割位点(PAM上游的第3个或第4个核苷酸)。
如本文所用，术语“Cas9”或“Cas9核酸酶”是指包含Cas9蛋白或其片段的RNA引导的核酸酶(例如，包含Cas9的活性或无活性DNA切割结构域和/或Cas9的gRNA结合结构域的蛋白质)。Cas9核酸酶有时也被称为casn1核酸酶或CRISPR(成簇规则间隔短回文重复序列)相关的核酸酶。CRISPR是一种适应性免疫系统，可提供针对移动遗传元件(病毒、转座因子和接合质粒)的保护。CRISPR簇包含间隔序列、与先前的移动元件互补的序列以及靶向入侵核酸。CRISPR簇被转录并加工成CRISPR RNA(crRNA)。在II型CRISPR系统中，正确加工前体crRNA需要反式编码的小RNA(tracrRNA)、内源性核糖核酸酶3(rnc)和Cas9蛋白。tracrRNA可作为核糖核酸酶3辅助加工前体crRNA的指导。随后，Cas9/crRNA/tracrRNA核酸内切切割与间隔序列互补的线性或环状dsDNA靶标。与crRNA不互补的靶链首先被核酸内切，然后被3′-5′核酸外切法切割。在自然界中，DNA结合和切割通常需要蛋白质和两种RNA。然而，可以对单向导RNA(“sgRNA”，或简称为“gRNA”)进行工程化，以便将crRNA和tracrRNA的各个方面结合到单个RNA种类中。参见例如Jinek M.,Chylinski K.,Fonfara I.,Hauer M.,DoudnaJ.A.,Charpentier E.Science 337:816-821(2012)，其全部内容通过引用并入本文。Cas9识别CRISPR重复序列(PAM或原型间隔子相邻基序)中的短基序，以帮助区分自身与非自身。Cas9核酸酶序列和结构是本领域技术人员熟知的(参见，例如，“化脓性链球菌M1菌株的完整基因组序列。”Ferretti et al.,J.J.,McShan W.M.,Ajdic D.J.,Savic D.J.,SavicG.,Lyon K.,Primeaux C.,Sezate S.,Suvorov A.N.,Kenton S.,Lai H.S.,Lin S.P.,Qian Y.,Jia H.G.,Najar F.Z.,Ren Q.,Zhu H.,Song L.,White J.,Yuan X.,CliftonS.W.,Roe B.A.,McLaughlin R.E.,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.98:4658-4663(2001)；“通过反式编码的小RNA和宿主因子RNase III使CRISPR RNA成熟。”Deltcheva E.,ChylinskiK.,Sharma C.M.,Gonzales K.,Chao Y.,Pirzada Z.A.,Eckert M.R.,Vogel J.,Charpentier E.,Nature471:602-607(2011)；和“适应性细菌免疫中的可编程双RNA向导的DNA核酸内切酶。”Jinek M.,Chylinski K.,Fonfara I.,Hauer M.,Doudna J.A.,Charpentier E.Science 337:816-821(2012)，这些文献的全部内容通过引用并入本文)。Cas9直向同源物已经在各种物种中得到描述，包括但不限于化脓链球菌(S.pyogenes)和嗜热链球菌(S.thermophiluss)。基于本公开内容，其他合适的Cas9核酸酶和序列对于本领域技术人员来说是显而易见的，并且此类Cas9核酸酶和序列包括来自Chylinski,Rhun和Charpentier，“II型CRISPR-Cas免疫系统的tracrRNA和Cas9家族”(2013)RNA Biology 10:5,726-737；该申请的全部内容以引用方式并入本文。在一些实施方式中，术语“Cas9”是指来自下列的Cas9：溃疡棒状杆菌(Corynebacterium ulcerans)(NCBI Refs:NC_015683.1,NC_017317.1)；白喉棒状杆菌(Corynebacterium diphtheria)(NCBI Refs:NC_016782.1,NC_016786.1)；食蚜螺原体(Spiroplasma syrphidicola)(NCBI Ref:NC_021284.1)；中间普氏菌(Prevotella intermedia)(NCBI Ref:NC_017861.1)；台湾螺原体(Spiroplasmataiwanense)(NCBI Ref:NC_021846.1)；海豚链球菌(Streptococcus iniae)(NCBI Ref:NC_021314.1)；波罗的海贝尔氏菌(Belliella baltica)(NCBI Ref:NC_018010.1)；扭曲冷弯曲菌(Psychroflexus torquisI)(NCBI Ref:NC_018721.1)；嗜热链球菌(Streptococcusthermophilus)(NCBI Ref:YP_820832.1)；英诺克李斯特氏菌(Listeria innocua)(NCBIRef:NP_472073.1)；空肠弯曲杆菌(Campylobacter jejuni)(NCBI Ref:YP_002344900.1)；或者脑膜炎双球菌(Neisseria.meningitidis)(NCBI Ref:YP_002342100.1)。
如本文所用，术语“有缺陷的CRISPR/Cas核酸酶”或“CRISPR/dCas9”是指已经失去至少一个核酸酶结构域的CRISPR/Cas核酸酶。
如本文所用，术语“向导RNA分子”通常是指能够结合CRISPR蛋白并将CRISPR蛋白靶向至靶DNA内特定位置的RNA分子(或一组RNA分子的统称)。向导RNA可以包含两个片段：DNA靶向指导片段和蛋白质结合片段。DNA靶向片段包含与靶序列互补(或至少可以在严格条件下杂交)的核苷酸序列。蛋白质结合片段与CRISPR蛋白质相互作用，例如Cas9或Cas9相关的多肽。这两个片段可以位于同一RNA分子中，也可以位于两个或多个独立的RNA分子中。当两个片段位于不同的RNA分子中时，包含DNA靶向指导片段的分子被称为CRISPR RNA(“crRNA”)，而包含蛋白质结合片段的分子被称为反式激活RNA(“tracrRNA”)。通常，crRNA包含至少一个间隔序列和至少一个重复序列，或其一部分，与间隔序列的5′末端相连接。本发明的crRNA的设计将基于使用crRNA的CRISPR-Cas系统而变化。本发明的crRNAs是人工合成的，在自然界中没有发现。通常，crRNA可以包括5′至3′的重复序列(全长或其部分(“手柄”))、间隔序列和重复序列(全长或其部分)。在一些实施方式中，crRNA可以包括5′至3′的重复序列(全长或其部分(“手柄”))和间隔序列。tracr核酸包括5′至3′的凸起、连结发夹和末端发夹，可选地，在5′末端的上茎(参见，Briner et al.(2014)Molecular Cell.56(2):333-339)。tracrRNA在与成熟或未成熟crRNA的重复部分杂交中起作用，将Cas9蛋白募集到靶位点，并可能通过诱导结构重排来促进Cas9的催化活性。tracrRNAs的序列对于CRISPR-Cas II型系统是特异性的，并且可以是可变的。当质粒被工程化成除了II型crRNA之外还包含异源II型CRISPR-Cas系统时，可以使用任何已知的或以后鉴定的tracr核酸。在一些实施方式中，tracr核酸与本发明的crRNA融合以形成单一的向导核酸。
如本文所用，术语“靶核酸序列”、“靶序列”或“靶区域”是指希望使用本文所公开的CRISPR系统结合的特定序列或其互补序列。更具体地，“靶核酸链”是指与本文公开的向导RNA进行碱基配对的靶核酸链。也就是说，与crRNA和向导序列杂交的靶核酸链被称为“靶核酸链”。与向导序列不互补的靶核酸的另一条链被称为“非互补链”。在双链靶核酸(例如DNA)的情况下，只要有合适的PAM位点，每条链都可以是“靶核酸链”，用于设计crRNA并指导RNA，并用于实施本发明的方法。
如本文所用，术语“双链断裂”或“DSB”是指核酸分子(例如DNA分子)中的两次断裂：核酸分子第一链中的第一次断裂，以及核酸分子第二链中的第二次断裂。
如本文所用，术语“启动子”旨在包括介导细胞中核酸转录的DNA序列。
如本文所用，术语“组成型启动子”用于描述在不存在任何活化生物或非生物调节因子的情况下，处于允许基因表达的永久活性状态的启动子。本领域技术人员熟知诸如“强组成型启动子”和“弱组成型启动子”等术语的含义。然而，本文定义的术语“弱组成型启动子”是指表达水平比强组成型启动子低10倍或更低的启动子。例如，泛素启动子(具有其第一内含子)通常被认为是强组成型启动子，并且已知第一个内含子的缺失会使启动子的表达降低10倍，使其成为弱组成型启动子。
如本文所用，术语“可操作性连接”旨在描述核酸之间的连接，其中，连接的位置和接近确保了偶联复制，并且足以被反式作用转录因子和其他细胞因子识别，从而在适当条件下有效表达编码多肽的核酸。
如本文所用，术语“互补性”是指核酸借助传统的沃森-克里克碱基配对或其他非传统类型与另一核酸序列形成氢键的能力。互补性百分比表示核酸分子中可与第二核酸序列(例如，10个之中有5、6、7、8、9、10个即为50％、60％、70％、80％、90％和100％互补)形成氢键(例如，沃森-克里克碱基配对)的残基的百分比。“完全互补”是指一个核酸序列的所有连续残基将与第二个核酸序列中相同数量的连续残基形成氢键。如本文所用的“基本上互补”是指在8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、30、35、40、45、50或更多核苷酸的区域内至少60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％或100％的互补程度，或指在严格条件下杂交的两个核酸。
如本文所用，术语“限制性内切酶”将被理解为是指由细菌产生的一组酶中的任何一种，其在特定碱基序列上从内部切割DNA分子。限制性内切酶的例子包括：BspEI、SpaI、BglII、NsiI、NotI、SacI、SpeI和AlwNI。
如本文所用，术语“限制性位点”将被理解为是指DNA分子中被限制性内切酶识别的碱基序列。
如本文所用，术语“克隆”是指将DNA分子连接到质粒中的过程。
如本文所用，术语“选择”是指鉴定和分离含有目标质粒(如本发明的质粒)的细胞，例如供体细胞或受体细菌细胞。
如本文所用，术语“选择标记基因”是指编码多肽的基因，该多肽为含有该基因的细胞提供表型，使得该表型允许对含有选择标记基因的细胞进行阳性或阴性选择。选择标记基因可用于区分转化细胞和非转化细胞。
如本文所用，术语“约”定义了给定值的偏差为20％，优选为10％，更优选为7％，甚至更优选为3％。
如本文所用，术语“抗生素”是指由一种由微生物产生的传统抗生素，该抗生素对其他微生物的生长具有拮抗作用，并且更一般地还包括能够杀死或抑制微生物生长的抗微生物剂，包括天然存在的抗生素的化学合成版本和变体。
如本文所用，术语“碳青霉烯类”表示一类β-内酰胺类抗生素，其中β-内酰胺结构1位的硫原子已被碳原子取代，并且引入了不饱和度，因此具有使其对大多数具有广谱抗菌活性的β-内酰胺酶具有抗性的分子结构。鉴于碳青霉烯类药物对大多数细菌β-内酰胺酶具有耐药性，碳青霉烯类是许多细菌感染(如大肠杆菌(E.coli)和肺炎克雷伯菌)的最后抗生素之一。
如本文所用，术语“抗生素抗性基因”包括编码产物或转录赋予抗生素耐药性的功能性RNA的基因。例如，抗生素抗性基因可以是有助于上述四种耐药性机制中任何一种的基因或其编码部分。例如抗生素抗性基因可以编码(1)降解抗生素的酶，(2)修饰抗生素的酶，(3)泵，例如外排泵，或(4)抑制抗生素作用的突变靶标。
如本文所用，术语“食物”指液体(即饮料)、固体或半固体饮食组合物，特别是总食物组合物(食物替代品)，其不需要额外的营养摄入或食物补充剂组合物。
如本文所用，术语“患者”或“受试者”是指人或动物(动物作为临床疗效的模型尤其有效)。在一些实施方式中，受试者可以是人或任何其他易受细菌感染的动物(例如，鸟类和哺乳动物)(例如，家畜如猫和狗；牲畜和农场动物，如马、牛、猪、鸡等)。通常，所述受试者是哺乳动物，包括非灵长类动物(例如，骆驼、驴、斑马、牛、猪、马、山羊、绵羊、猫、狗、大鼠和小鼠)和灵长类动物(例如，猴子、黑猩猩和人)。在一些实施方式中，受试者是非人类动物。在一些实施方式中，受试者是农场动物或宠物。在一些实施方式中，受试者是人类。在一些实施方式中，受试者是人类婴儿。在一些实施方式中，受试者是人类儿童。在一些实施方式中，受试者是成年人类。在一些实施方式中，受试者是老年人。在一些实施方式中，受试者是早产儿。
如本文所用，术语“治疗”和“诊治”是指预防性或预防性治疗，也指治愈性或疾病缓解性治疗，包括治疗有感染疾病风险或疑似感染该疾病的患者以及生病或被诊断患有疾病或医疗状况的患者，并包括抑制临床复发。治疗可以施用于患有医学疾病或最终可能患有该疾病的患者，以预防、治愈、延缓疾病或复发性疾病的发作、降低疾病或复发性疾病的严重程度，或改善疾病和复发性疾病的一种或多种症状，或为了延长患者的存活时间，使其超过在没有此类治疗的情况下的预期存活时间。“治疗方案”是指疾病的治疗模式，例如，治疗期间使用的给药模式。治疗方案可以包括诱导方案和维持方案。短语“诱导方案”或“诱导期”是指用于疾病初始治疗的治疗方案(或治疗方案的一部分)。诱导方案的总体目标是在治疗方案的初始阶段向患者提供高水平的药物。诱导方案可以采用(部分或全部)“负荷方案”，其中可以包括给予比医生在维持方案期间使用的药物剂量更大的给药剂量，比医生在维持方案期间给药频率更频繁地给物，或两者兼有。短语“维持方案”或“维持期”是指用于在疾病治疗期间维持患者的治疗方案(或治疗方案的一部分)，例如，使患者长时间(数月或数年)处于缓解状态。维持治疗方案可以采用连续治疗(例如，定期给药，例如每周、每月、每年等)或间歇治疗(例如，中断治疗、间歇治疗、复发治疗或达到特定预定标准后的治疗[例如，疼痛、疾病表现等])。
如本文所用，术语“治疗有效量”是指足以产生期望效果的供体细菌细胞的量，所述效果可以是治疗和/或有益效果。有效量将随年龄、受试者的一般状况、所治疗病症的严重程度、所施用的特定药剂、治疗的持续时间、任何并发治疗的性质、所使用的药学上可接受的载体以及本领域技术人员的知识和专业技能内的类似因素而变化。在适当的情况下，任何个体情况下的“有效量”可以由本领域技术人员通过参考相关文本和文献和/或通过使用常规试验来确定。在一些实施方式中，宿主细菌和/或其组合物的有效量可以是约105至约1010个菌落形成单位(CFU)。在一些实施方式中，有效量可以是将细菌受体细胞负荷减少约10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的量，以及其中的任何值或范围。
如本文所用，术语“药物组合物”是指本文所述的组合物或其药学上可接受的盐，以及其它试剂如载体和/或赋形剂。本文提供的药物组合物通常包括药学上可接受的载体。
如本文所用，术语“药学上可接受的载体”包括任何和所有溶剂、稀释剂或其它液体载体、分散剂或悬浮助剂、表面活性剂、等渗剂、增稠剂或乳化剂、防腐剂、固体粘合剂、润滑剂等，以适合所需的特定剂型。Remington'sPharmaceutical-Sciences,SixteenthEdition,E.W.Martin(Mack Publishing Co.,Easton,Pa.,1980)公开了用于配制药物组合物的各种载体及其已知的制备技术。
靶向抗菌质粒
本发明的第一个目的涉及靶向抗菌质粒(TAP)，包含i)复制起点，ii)转移起点，iii)编码核酸酶的基因工程核酸序列，和iv)一个或多个编码向导RNA分子的基因工程核酸序列。
i)复制起点
在一些实施方式中，复制起点通常是宿主特异性的，并控制质粒的宿主范围。可从中获得复制起源的广谱(“混杂”)质粒的例子包括但不限于：R6K、RK2、p15A和RSF1010。例如，预计本发明的质粒将在所有革兰氏阴性细菌中发挥作用，并且将特别适用于醋酸杆菌属(Acetobacter)、不动杆菌属(Acinetobacter)、气单胞菌属(Aeromonas)、土壤杆菌属(Agrobacterium)、产碱杆菌属(Alcaligenes)、鱼腥藻属(Anabaena)、固氮根瘤菌属(Azorizobium)、巴尔通体属(Bartonella)、博德特氏菌属(Bordetella)、布鲁氏菌属(Brucella)、伯克氏菌属(Burkholderia)、弯曲菌属(Campylobacter)、柄杆菌属(Caulobacter)、着色菌属(Chromatium)、丛毛单胞菌属(Comamonas)、噬细胞菌属(Cytophaga)、异常球菌属(Deinococcus)、欧文氏菌属(Erwinia)、赤杆菌属(Erythrobacter)、埃希氏菌属(Escherichia)、黄杆菌属(Flavobacterium)、生丝微菌属(Hyphomicrobium)、克雷伯氏菌属(Klebsiella)、甲烷杆菌属(Methanobacterium)、甲基杆菌属(Methylbacterium)、甲基菌属(Methylobacillus)、甲基细菌属(Methylobacter)、甲基杆菌属(Methylobacterium)、甲基球菌属(Methylococcus)、甲基孢囊菌属(Methylocystis)、甲基微菌属(Methylomicrobium)、甲基单胞菌属(Methylomonas)、嗜甲基菌属(Methylophilus)、甲基弯曲菌属(Methylosinus)、粘球菌属(Myxococcus)、泛菌属(Pantoea)、副球菌属(Paracoccus)、假单胞菌属(Pseudomonas)、根瘤菌属(Rhizobium)、红细菌属(Rhodobacter)、沙门氏菌属(Salmonella)、志贺氏菌属(Shigella)、鞘脂单胞菌属(Sphingomonas)和弧菌属(Vibrio)。
在一些实施方式中，复制起点是选自下列一种质粒的复制起点：pEBFP-N1、pECFP-N1、pEGFP-N1、pEGFP-N2、pEGFP-N3、pEYFP-N1、pEBEP-C1、pECFP-C1、pEGFP-C1、pEGFP-C2、pEGFP-C3、pEYFP-C1、pEGFP-F、pCMS-EGFP、pIIRES2-EGFP、pd2ECFP-N1、pd2EGFP-N1、pd2EYFP-N1、pd1EGFP-N1和由Clontech Laboratories Inc(Palo Alto,Calif.)销售；由Stratagene(La Jolla,Calif.)销售的pCMV-Script、pCMV-Tag、pDual、pBK-CMV和pBK-RSV；以及由Promega公司(Madison,Wis.)销售的
Figure BDA0004175047600000181
pCI和pCI-Neo。
在一些实施方式中，复制起点是pBBR1质粒的复制起点。在一些实施方式中，复制起点由SEQ ID NO:1的核酸序列组成。
SEQ ID NO:1>oriV-pBBR1
gcttatctccatgcggtaggggtgccgcacggttgcggcaccatgcgcaatcagctgcaacttttcggcagcgcgacaacaattatgcgttgcgtaaaagtggcagtcaattacagattttctttaacctacgcaatgagctattgcggggggtgccgcaatgagctgttgcgtaccccccttttttaagttgttgatttttaagtctttcgcatttcgccctatatctagttctttggtgcccaaagaagggcacccctgcggggttcccccacgccttcggcgcggctccccctccggcaaaaagtggcccctccggggcttgttgatcgactgcgcggccttcggccttgcccaaggtggcgctgcccccttggaacccccgcactcgccgccgtgaggctcggggggcaggcgggcgggcttcgcccttcgactgcccccactcgcataggcttgggtcgttccaggcgcgtcaaggccaagccgctgcgcggtcgctgcgcgagccttgacccgccttccacttggtgtccaaccggcaagcgaagcgcgcaggccgcaggccggaggcttttccccagagaaaattaaaaaaattgatggggcaaggccgcaggccgcgcagttggagccggtgggtatgtggtcgaaggctgggtagccggtgggcaatccctgtggtcaagctcgtgggcaggcgcagcctgtccatcagcttgtccagcagggttgtccacgggccgagcgaagcgagccagccggtggccgc
ii)转移起点
在一些实施方式中，转移起点来源于混杂的IncP质粒RP4和R751。在一些实施方式中，转移起点是RP4质粒的oriT。在一些实施方式中，本发明的转移起点由SEQ ID NO:2的核酸序列组成。
SEQ ID NO:2>oriT-RK2
gggcaggataggtgaagtaggcccacccgcgagcgggtgttccttcttcactgtcccttattcgcacctg
gcggtgctcaacgggaatcctgctctgcgaggctggccg
在一些实施方式中，转移起点是F质粒的oriTF，以使质粒可通过来自供体细菌细胞中所含的接合F质粒的转移蛋白Tra移动。在一些实施方式中，本发明的转移起点由SEQID NO:3的核酸序列组成。
SEQ ID NO:3oriT-F
aggctcaacaggttggtggttctcaccaccaaaagcaccacaccccacgcaaaaacaagtttttgctgatttttctttataaatagagtgttatgaaaaattagtttctcttactctctttatgatatttaaaaaagcggtgtcggcgcggctacaacaacgcgccgacaccgttttgtaggggtggtactgactatttttataaaaaacattattttatattaggggtgctgctagcggcgcggtgtgtttttttataggataccgctaggggcgctgctagcggtgcg
iii)核酸酶
在一些实施方式中，本发明的质粒编码CRISPR相关的核酸内切酶。各种CRISPR/Cas核酸酶可用于本发明。合适的CRISPR/CRISPR/Cas核酸酶的非限制性实例包括Cas3、Cas4、Cas5、Cas5e(或CasD)、Cas6、Cas6e、Cas6f、Cas7、Cas8a1、Cas8a2、Cas8b、Cas8c、Cas9、Cas10、Cas10d、CasF、CasG、CasH、Csy1、Csy2、Csy3、Cse1(或CasA)、Cse2(或CasB)、Cse3(或CasE)、Cse4(或CasC)、Csc1、Csc2、Csa5、Csn2、Csm2、Csm3、Csm4、Csm5、Csm6、Cmr1、Cmr3、Cmr4，Cmr5、Cmr6、Csb1、Csb2、Csb3、Csx17、Csx14、Csx10、Csx16、CsaX、Csx3、Csz1、Csx15、Csf1、Csf2、Csf3、Csf4和Cu1966。参见例如，WO2014144761、WO2014144592、WO2013176772、US20140273226和US20140273233，其内容通过引用并入本文。
在一些实施方式中，CRISPR/Cas核酸酶来源于Cas9蛋白。Cas9蛋白可以源自化脓性链球菌(Streptococcus pyogenes)、嗜热链球菌(Streptococcus thermophilus)、特异性链球菌(Streptococcus sp.)、达松维尔拟诺卡氏菌(Nocardiopsis dassonvillei)、始旋链霉菌(Streptomyces pristinaespiralis)、绿色产色链霉菌(Streptomycesviridochromogenes)、绿色产色链霉菌(Streptomyces viridochromogenes)、链孢囊菌(Streptosporangium roseum)、链孢囊菌(Streptosporangium roseum)、酸热脂环酸杆菌(Alicyclobacillus acidocaldarius)、假蕈状芽孢杆菌(Bacillus pseudomycoides)、硒芽孢杆菌(Bacillus selenitireducens)、西伯利亚微小杆菌(Exiguobacteriumsibiricum、)德氏乳杆菌(Lactobacillus delbrueckii)、唾液乳杆菌(Lactobacillussalivarius)、海洋微颤菌(Microscilla marina)、伯克霍尔德氏菌(Burkholderialesbacterium)、食萘极谱单胞菌(Polaromonas naphthalenivorans)、极单胞菌属(Polaromonas sp.)、单细胞集胞藻(Crocosphaera watsonii)、蓝杆藻菌(Cyanothecesp.)、铜绿微囊藻(Microcystis aeruginosa)、聚球藻(Synechococcus sp.)、阿拉伯糖醋盐杆菌(Acetohalobium arabaticum)、德根斯产氨菌(Ammonifex degensii)、嗜热厌氧细菌(Caldicelulosiruptor becscii)、金矿菌(Candidatus Desulforudis)、肉毒杆菌(Clostridium botulinum)、艰难梭菌(Clostridium difficile)、大芬戈尔德菌(Finegoldia magna)、嗜热盐碱厌氧菌(Natranaerobius thermophilus)、嗜热丙酸厌氧肠状菌(Pelotomaculum thermopropionicum)、喜温嗜酸硫杆状菌(Acidithiobacilluscaldus)、嗜酸氧化亚铁硫杆菌(Acidithiobacillus ferrooxidans)、Allochromatiumvinosum、海杆菌属(Marinobacter sp.)、嗜盐亚硝化球菌(Nitrosococcus halophilus)、Nitrosococcus watsoni、假交替单胞菌(Pseudoalteromonas haloplanktis)、Ktedonobacter racemifer、Methanohalobium evestigatum、多变鱼腥藻(Anabaenavariabilis)、泡沫节球藻(Nodularia spumigena)、念珠藻属(Nostoc sp.)、极大节螺藻(Arthrospira maxima)、钝顶节螺藻(Arthrospira platensis)、Arthrospira sp.、Lyngbya sp.、原型微鞘藻(Microcoleus chthonoplastes)、颤藻(Oscillatoria sp.)、运动石袍菌(Petrotoga mobilis)、非洲栖热腔菌(Thermosipho africanus)或Acaryochloris marina，除其它外。
在一些实施方式中，Cas9核酸酶可以具有与野生型化脓性链球菌序列相同的核苷酸序列。在一些实施方式中，Cas9核酸酶包含SEQ ID NO:4中所示的氨基酸序列。
SEQ ID NO:4>Cas9序列
MDKKYSIGLAIGTNSVGWAVITDEYKVPSKKFKVLGNTDRHSIKKNLIGA LLFDSGETAEATRLKRTARRRYTRRKNRICYLQEIFSNEMAKVDDSFFHR LEESFLVEEDKKHERHPIFGNIVDEVAYHEKYPTIYHLRKKLVDSTDKAD LRLIYLALAHMIKFRGHFLIEGDLNPDNSDVDKLFIQLVQTYNQLFEENP INASGVDAKAILSARLSKSRRLENLIAQLPGEKKNGLFGNLIALSLGLTP NFKSNFDLAEDAKLQLSKDTYDDDLDNLLAQIGDQYADLFLAAKNLSDAI LLSDILRVNTEITKAPLSASMIKRYDEHHQDLTLLKALVRQQLPEKYKEI FFDQSKNGYAGYIDGGASQEEFYKFIKPILEKMDGTEELLVKLNREDLLR KQRTFDNGSIPHQIHLGELHAILRRQEDFYPFLKDNREKIEKILTFRIPY YVGPLARGNSRFAWMTRKSEETITPWNFEEVVDKGASAQSFIERMTNFDK NLPNEKVLPKHSLLYEYFTVYNELTKVKYVTEGMRKPAFLSGEQKKAIVD LLFKTNRKVTVKQLKEDYFKKIECFDSVEISGVEDRFNASLGTYHDLLKI IKDKDFLDNEENEDILEDIVLTLTLFEDREMIEERLKTYAHLFDDKVMKQ LKRRRYTGWGRLSRKLINGIRDKQSGKTILDFLKSDGFANRNFMQLIHDD SLTFKEDIQKAQVSGQGDSLHEHIANLAGSPAIKKGILQTVKVVDELVKV MGRHKPENIVIEMARENQTTQKGQKNSRERMKRIEEGIKELGSQILKEHP VENTQLQNEKLYLYYLQNGRDMYVDQELDINRLSDYDVDHIVPQSFLKDD SIDNKVLTRSDKNRGKSDNVPSEEVVKKMKNYWRQLLNAKLITQRKFDNL TKAERGGLSELDKAGFIKRQLVETRQITKHVAQILDSRMNTKYDENDKLI REVKVITLKSKLVSDFRKDFQFYKVREINNYHHAHDAYLNAVVGTALIKK YPKLESEFVYGDYKVYDVRKMIAKSEQEIGKATAKYFFYSNIMNFFKTEI TLANGEIRKRPLIETNGETGEIVWDKGRDFATVRKVLSMPQVNIVKKTEV QTGGFSKESILPKRNSDKLIARKKDWDPKKYGGFDSPTVAYSVLVVAKVE KGKSKKLKSVKELLGITIMERSSFEKNPIDFLEAKGYKEVKKDLIIKLPK YSLFELENGRKRMLASAGELQKGNELALPSKYVNFLYLASHYEKLKGSPE DNEQKQLFVEQHKHYLDEIIEQISEFSKRVILADANLDKVLSAYNKHRDK PIREQAENIIHLFTLTNLGAPAAFKYFDTTIDRKRYTSTKEVLDATLIHQ SITGLYETRIDLSQLGGD
在一些实施方式中，CRISPR相关的核酸内切酶可以是来自其他物种的序列，例如其他链球菌物种，如嗜热链球菌；铜绿假单胞菌、大肠杆菌或其他已测序的细菌基因组和古细菌，或其他原核微生物。或者，可以修饰野生型化脓性链球菌Cas9序列。或者，Cas9核酸酶序列可以是，例如包含在市售载体中的序列，例如来自Addgene(Cambridge，MA)的pX330、pX260或pMJ920。在一些实施方式中，Cas9核酸内切酶可以具有氨基酸序列，该氨基酸序列是Genbank编录号为KM099231.1GL669193757；KM099232.1；GL669193761；或KM099233.1GL669193765中的任何Cas9核酸内切酶序列的变体或片段，或pX330、pX260或pMJ920的Cas9氨基酸序列(Addgene,Cambridge,MA)。
在一些实施方式中，CRISPR/Cas核酸酶由突变的CRISPR/Cas核酸酶组成，即具有一个或多个点突变、插入、缺失、截短、融合蛋白或其组合的蛋白质。在一些实施方式中，突变体具有RNA指导的DNA结合活性，但缺乏其核酸酶活性位点中的一个或两个。在一些实施方式中，突变体包含与CRISPR/Cas核酸酶的野生型氨基酸序列具有至少50％同一性的氨基酸序列。
在一些实施方式中，CRISPR/Cas核酸酶是野生型CRISPR/Cas核酸酶(例如Cas9)的突变体或其片段。在一些实施方式中，CRISPR/Cas核酸酶是来自化脓性链球菌的突变Cas9蛋白。在一些实施方式中，本发明的CRISPR/Cas核酸酶是有缺陷的Cas9，即来自S.pyrogenes的Cas9具有至少一个选自由D10A和H840A组成的组的突变。在一些实施方式中，本发明的碱基编辑酶包含有缺陷的CRISPR/Cas核酸酶。序列识别机制与无缺陷的CRISPR/Cas核酸酶相同。通常，本发明的有缺陷的CRISPR/Cas核酸酶包含至少一个RNA结合结构域。RNA结合结构域与下文定义的向导RNA分子相互作用。然而，本发明的有缺陷的CRISPR/Cas核酸酶是没有核酸酶活性的修饰型。因此，有缺陷的CRISPR/Cas核酸酶特异性识别向导RNA分子，从而将碱基编辑酶引导至其靶DNA序列。
在一些实施方式中，本发明的CRISPR/Cas核酸酶是切口酶，更具体地是Cas9切口酶，即来自化脓性链球菌的具有选自由D10A和H840A组成的组的一个突变的Cas9。在一些实施方式中，本发明的切口酶包含SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:6中所示的氨基酸序列。
SEQ ID NO:5>具有D10A突变的化脓性链球菌nCas9蛋白序列
MDKKYSIGLAIGTNSVGWAVITDEYKVPSKKFKVLGNTDRHSIKKNLIGALLFDSGETAEATRLKRTARRRYTRRKNRICYLQEIFSNEMAKVDDSFFHRLEESFLVEEDKKHERHPIFGNIVDEVAYHEKYPTIYHLRKKLVDSTDKADLRLIYLALAHMIKFRGHFLIEGDLNPDNSDVDKLFIQLVQTYNQLFEENPINASGVDAKAILSARLSKSRRLENLIAQLPGEKKNGLFGNLIALSLGLTPNFKSNFDLAEDAKLQLSKDTYDDDLDNLLAQIGDQYADLFLAAKNLSDAILLSDILRVNTEITKAPLSASMIKRYDEHHQDLTLLKALVRQQLPEKYKEIFFDQSKNGYAGYIDGGASQEEFYKFIKPILEKMDGTEELLVKLNREDLLRKQRTFDNGSIPHQIHLGELHAILRRQEDFYPFLKDNREKIEKILTFRIPYYVGPLARGNSRFAWMTRKSEETITPWNFEEVVDKGASAQSFIERMTNFDKNLPNEKVLPKHSLLYEYFTVYNELTKVKYVTEGMRKPAFLSGEQKKAIVDLLFKTNRKVTVKQLKEDYFKKIECFDSVEISGVEDRFNASLGTYHDLLKIIKDKDFLDNEENEDILEDIVLTLTLFEDREMIEERLKTYAHLFDDKVMKQLKRRRYTGWGRLSRKLINGIRDKQSGKTILDFLKSDGFANRNFMQLIHDDSLTFKEDIQKAQVSGQGDSLHEHIANLAGSPAIKKGILQTVKVVDELVKVMGRHKPENIVIEMARENQTTQKGQKNSRERMKRIEEGIKELGSQILKEHPVENTQLQNEKLYLYYLQNGRDMYVDQELDINRLSDYDVDHIVPQSFLKDDSIDNKVLTRSDKNRGKSDNVPSEEVVKKMKNYWRQLLNAKLITQRKFDNLTKAERGGLSELDKAGFIKRQLVETRQITKHVAQILDSRMNTKYDENDKLIREVKVITLKSKLVSDFRKDFQFYKVREINNYHHAHDAYLNAVVGTALIKKYPKLESEFVYGDYKVYDVRKMIAKSEQEIGKATAKYFFYSNIMNFFKTEITLANGEIRKRPLIETNGETGEIVWDKGRDFATVRKVLSMPQVNIVKKTEVQTGGFSKESILPKRNSDKLIARKKDWDPKKYGGFDSPTVAYSVLVVAKVEKGKSKKLKSVKELLGITIMERSSFEKNPIDFLEAKGYKEVKKDLIIKLPKYSLFELENGRKRMLASAGELQKGNELALPSKYVNFLYLASHYEKLKGSPEDNEQKQLFVEQHKHYLDEIIEQISEFSKRVILADANLDKVLSAYNKHRDKPIREQAENIIHLFTLTNLGAPAAFKYFDTTIDRKRYTSTKEVLDATLIHQSITGLYETRIDLSQLGGD
SEQ ID NO:6>具有H840A突变的化脓性链球菌nCas9蛋白序列
MDKKYSIGLDIGTNSVGWAVITDEYKVPSKKFKVLGNTDRHSIKKNLIGALLFDSGETAEATRLKRTARRRYTRRKNRICYLQEIFSNEMAKVDDSFFHRLEESFLVEEDKKHERHPIFGNIVDEVAYHEKYPTIYHLRKKLVDSTDKADLRLIYLALAHMIKFRGHFLIEGDLNPDNSDVDKLFIQLVQTYNQLFEENPINASGVDAKAILSARLSKSRRLENLIAQLPGEKKNGLFGNLIALSLGLTPNFKSNFDLAEDAKLQLSKDTYDDDLDNLLAQIGDQYADLFLAAKNLSDAILLSDILRVNTEITKAPLSASMIKRYDEHHQDLTLLKALVRQQLPEKYKEIFFDQSKNGYAGYIDGGASQEEFYKFIKPILEKMDGTEELLVKLNREDLLRKQRTFDNGSIPHQIHLGELHAILRRQEDFYPFLKDNREKIEKILTFRIPYYVGPLARGNSRFAWMTRKSEETITPWNFEEVVDKGASAQSFIERMTNFDKNLPNEKVLPKHSLLYEYFTVYNELTKVKYVTEGMRKPAFLSGEQKKAIVDLLFKTNRKVTVKQLKEDYFKKIECFDSVEISGVEDRFNASLGTYHDLLKIIKDKDFLDNEENEDILEDIVLTLTLFEDREMIEERLKTYAHLFDDKVMKQLKRRRYTGWGRLSRKLINGIRDKQSGKTILDFLKSDGFANRNFMQLIHDDSLTFKEDIQKAQVSGQGDSLHEHIANLAGSPAIKKGILQTVKVVDELVKVMGRHKPENIVIEMARENQTTQKGQKNSRERMKRIEEGIKELGSQILKEHPVENTQLQNEKLYLYYLQNGRDMYVDQELDINRLSDYDVDAIVPQSFLKDDSIDNKVLTRSDKNRGKSDNVPSEEVVKKMKNYWRQLLNAKLITQRKFDNLTKAERGGLSELDKAGFIKRQLVETRQITKHVAQILDSRMNTKYDENDKLIREVKVITLKSKLVSDFRKDFQFYKVREINNYHHAHDAYLNAVVGTALIKKYPKLESEFVYGDYKVYDVRKMIAKSEQEIGKATAKYFFYSNIMNFFKTEITLANGEIRKRPLIETNGETGEIVWDKGRDFATVRKVLSMPQVNIVKKTEVQTGGFSKESILPKRNSDKLIARKKDWDPKKYGGFDSPTVAYSVLVVAKVEKGKSKKLKSVKELLGITIMERSSFEKNPIDFLEAKGYKEVKKDLIIKLPKYSLFELENGRKRMLASAGELQKGNELALPSKYVNFLYLASHYEKLKGSPEDNEQKQLFVEQHKHYLDEIIEQISEFSKRVILADANLDKVLSAYNKHRDKPIREQAENIIHLFTLTNLGAPAAFKYFDTTIDRKRYTSTKEVLDATLIHQSITGLYETRIDLSQLGGD
在一些实施方式中，编码Cas9蛋白的核酸序列由SEQ ID NO:7的核酸序列组成。
SEQ ID NO:7>Cas9(addgene#44250)
atggataagaaatactcaataggcttagatatcggcacaaatagcgtcggatgggcggtgatcactgatgaatataaggttccgtctaaaaagttcaaggttctgggaaatacagaccgccacagtatcaaaaaaaatcttataggggctcttttatttgacagtggagagacagcggaagcgactcgtctcaaacggacagctcgtagaaggtatacacgtcggaagaatcgtatttgttatctacaggagattttttcaaatgagatggcgaaagtagatgatagtttctttcatcgacttgaagagtcttttttggtggaagaagacaagaagcatgaacgtcatcctatttttggaaatatagtagatgaagttgcttatcatgagaaatatccaactatctatcatctgcga
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在一些实施方式中，编码有缺陷的Cas9蛋白的核酸序列由SEQ ID NO:8的核酸序列组成。
SEQ ID NO:8>dCas9(addgene#44249)
atggataagaaatactcaataggcttagctatcggcacaaatagcgtcggatgggcggtgatcactgatgaatataaggttccgtctaaaaagttcaaggttctgggaaatacagaccgccacagtatcaaaaaaaatcttataggggctcttttatttgacagtggagagacagcggaagcgactcgtctcaaacggacagctcgtagaaggtatacacgtcggaagaatcgtatttgttatctacaggagattttttcaaatgagatggcgaaagtagatgatagtttctttcatcgacttgaagagtcttttttggtggaagaagacaagaagcatgaacgtcatcctatttttggaaatatagtagatgaagttgcttatcatgagaaatatccaactatctatcatctgcgaaaaaaattggtagattctactgataaagcggatttgcgcttaatctatttggccttagcgcatatgattaagtttcgtggtcattttttgattgagggagatttaaatcctgataatagtgatgtggacaaactatttatccagttggtacaaacctacaatcaattatttgaagaaaaccctattaacgcaagtggagtagatgctaaagcgattctttctgcacgattgagtaaatcaagacgattagaaaatctcattgctcagctccccggtgagaagaaaaatggcttatttgggaatctcattgctttgtcattgggtttgacccctaattttaaatcaaattttgatttggcagaagatgctaaattacagctttcaaaagatacttacgatgatgatttagataatttattggcgcaaattggagatcaatatgctgatttgtttttggcagctaagaatttatcagatgctattttactttcagatatcctaagagtaaatactgaaataactaaggctcccctatcagcttcaatgattaaacgctacgatgaacatcatcaagacttgactcttttaaaagctttagttcgacaacaacttccagaaaagtataaagaaatcttttttgatcaatcaaaaaacggatatgcaggttatattgatgggggagctagccaagaagaattttataaatttatcaaaccaattttagaaaaaatggatggtactgaggaattattggtgaaactaaatcgtgaagatttgctgcgcaagcaacggacctttgacaacggctctattccccatcaaattcacttgggtgagctgcatgctattttgagaagacaagaagacttttatccatttttaaaagacaatcgtgagaagattgaaaaaatcttgacttttcgaattccttattatgttggtccattggcgcgtggcaatagtcgttttgcatggatgactcggaagtctgaagaaacaattaccccatggaattttgaagaagttgtcgataaaggtgcttcagctcaatcatttattgaacgcatgacaaactttgataaaaatcttccaaatgaaaaagtactaccaaaacatagtttgctttatgagtattttacggtttataacgaattgacaaaggtcaaatatgttactgaaggaatgcgaaa
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在一些实施方式中，编码核酸酶的核酸序列与弱组成型启动子可操作地连接。在一些实施方式中，编码核酸酶的核酸序列与具有SEQ ID NO:9核酸序列的弱组成型BBa_J23107启动子可操作地连接。
SEQ ID NO:9>BBa_J23107启动子
tttacggctagctcagccctaggtattatgctagcAGATCTaaagaggagaaa
iv)向导RNA分子
在一些实施方式中，本发明的质粒包含编码向导RNA分子的2个、3个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个或10个核酸序列。
在一些实施方式中，由本发明的质粒编码的向导RNA分子包含间隔序列(即crRNA)和反式激活RNA(“tracrRNA”)序列。
在一些实施方式中，间隔序列与受体菌细胞中存在的任何特定靶序列互补。通常，间隔序列由本领域公知的任何自定义算法设计，并通常由实施例中的自定义算法CSTB ad描述。
在一些实施方式中，间隔序列靶向参与致病性或微生物代谢的其他方面的基因。在一些实施方式中，间隔序列与参与细菌代谢的基因的靶区域互补，更具体地，与参与生物膜生成的相关基因互补。
在一些实施方式中，间隔序列靶向抗生素抗性基因。例如，有许多编码β-内酰胺酶的抗性基因(bla基因)对多种不同的β-内酰胺类抗生素产生抗性。在一些实施方式中，本发明的质粒转录一种或多种RNA向导分子，每种RNA向导分子包含与一种或多种β-内酰胺酶基因的靶序列充分互补的间隔序列。例如，一种或多种RNA向导分子可以靶向选自以下的一种或多种或所有基因：NDM、VIM、IMP、KPC、OXA、TEM、SHV、CTX、OKP、LEN、GES、MIR、ACT、ACC、CMY、LAT和FOX。特别地，一种或多种RNA向导分子可包含与抗生素抗性基因的β-内酰胺家族的靶序列充分互补的间隔序列，包括以下一种或多种或全部：与NDM-1、-2、-10的靶序列充分互补的第一间隔序列；与VIM-1、-2、-4、-12、-19、-26、-27-33、-34的靶序列充分互补的第二间隔区；与IMP-32、-38、-48的靶序列充分互补的第三间隔区；与KPC-1、-2、-3、-4、-6、-7、-8、-11、-12、-14、-15、-16、-17的靶序列充分互补的第四间隔区；与OXA-48的靶序列充分互补的第五间隔区；与TEM-1、-1B、-3、-139、-162、-183、-192、-197、-198、-209的靶序列充分互补的第六间隔区，与SHV及其变体的靶序列充分互补的第七间隔区；和与CTX及其变体的靶序列充分互补的第八间隔区。
在一些实施方式中，间隔序列被设计成在靶序列中产生DSB。例如，当靶序列位于染色体或复制子(例如质粒)上，例如细菌染色体或质粒上，DSB会导致降解，从而导致染色体或复制子的丢失。如果靶序列位于细菌染色体上，那么受体可能会因DSB而直接死亡。此外，一些天然质粒携带只有当细胞失去质粒时才会产生毒性的杀伤功能，这是确保分裂细胞中质粒忠实性遗传的天然机制。如果携带抗生素抗性基因靶序列的质粒也携带这种杀伤功能，且质粒由于产生的DSB而丢失，则细胞可能死亡。
在一些实施方式中，间隔序列由选自表A的核酸序列编码。
Figure BDA0004175047600000281
在一些实施方式中，编码间隔序列的核酸序列在每一端侧接限制性位点，以便允许在本发明的质粒中快速克隆所述间隔序列。
在一些实施方式中，向导RNA分子的tracrRNA序列由SEQ ID NO:25的核酸序列编码。
SEQ ID NO:25>tracrRNA序列
gttttagagctagaaatagcaagttaaaataaggctagtccgttatcaacttgaaaaagtggcaccgagtcggtgc
在一些实施方式中，编码向导RNA分子的核酸序列与强组成型启动子可操作地连接。在一些实施方式中，编码向导RNA分子的核酸序列与具有SEQ ID NO:26的核酸序列的强组成型BBa_J23119启动子可操作地连接。
SEQ ID NO:26>BBa_J23119启动子
ttgacagctagctcagtcctaggtataatactagt
V)可选的选择标记基因
在一些实施方式中，本发明的质粒可选地包含一个或多个选择标记。确实可以用多种阳性和/或阴性选择标记来选择含有本发明质粒的转化细胞。
例如，阳性选择标记可以是允许在缺少必需营养素(如氨基酸)的情况下生长的基因。例如，本领域已知的各种氨基酸类似物可用作阴性选择，而在基本培养基上的生长(相对于氨基酸类似物)可用作阳性选择。
视觉上可检测的标记也适用于本发明，并且可以使用诸如荧光激活细胞分选(FACS)或微流体技术进行阳性和阴性选择和/或筛选。可检测标记的实例包括各种酶、辅基、荧光标记、发光标记、生物发光标记等。合适的荧光蛋白的实例包括但不限于黄色荧光蛋白(YFP)、绿色荧光蛋白(GFP)、青色荧光蛋白(CFP)、伞形酮、荧光素、异硫氰酸荧光素、罗丹明(rhodamine)、二氯三嗪氨荧光素(dichiorotriazinylamine fluorescein)、丹磺酰氯、藻红蛋白等。合适的生物发光标记的实例包括但不限于荧光素酶(例如细菌、萤火虫、叩头虫等)、荧光素、水母发光蛋白等。具有视觉可检测信号的合适酶系统的实例包括但不限于半乳糖苷酶类、葡萄糖苷酶(glucorinidases)、磷酸酶、过氧化物酶、胆碱酯酶类等。
在一些实施方式中，阳性选择标记是赋予化合物抗性的基因，在缺乏该基因的情况下，该化合物对细胞是致命的。例如，表达抗生素抗性基因的细胞可以在抗生素存在的情况下存活，而缺乏该基因的细胞则不能。合适的抗生素抗性基因包括但不限于诸如氨苄青霉素抗性基因(ampicillin-resistance gene)、新霉素抗性基因(neomycin-resistancegene)、杀稻瘟菌素抗性基因(blasticidin-resistance gene)、潮霉素抗性基因(hygromycin-resistance gene)、嘌呤霉素抗性基因(puromycin-resistance gene)、氯霉素抗性基因(chloramphenicol-resistance gene)、阿泊拉霉素抗性基因(apramycin-resistance gene)等基因。
vi)特异性质粒：
在一些实施方式中，本发明的质粒由SEQ ID NO：27或28中所示的核酸序列组成。
SEQ ID NO:27>TAPKn-Cas9-nsp
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vii)质粒的制备方法
本发明的质粒可以使用本领域技术人员熟知的常规分子生物学和重组DNA技术来制备。这些技术在文献中有充分的解释。参见，例如，Sambrook,Fritsch&Maniatis,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,Second Edition(1989)Cold Spring HarborLaboratory Press,Cold Spring Harbor,New York(herein"Sambrook et al.,1989")；DNA Cloning:A Practical Approach,Volumes Iand II(D.N.Glover ed.1985)；F.M.Ausubel et al.(eds.),Current Protocols in Molecular Biology,John Wiley&Sons,Inc.(1994)。
供体菌细胞：
本发明的另一个目的是包含本发明的靶向抗菌质粒的拷贝数的供体细菌细胞。
本发明的供体细菌细胞还包含接合转移基因，因此通常包含接合质粒的拷贝数。接合转移(tra)基因已经在许多接合细菌质粒中得到表征。基因模块之间的可互换性赋予了对接合转移敏感的宿主范围，宿主范围包括革兰氏阳性物种和革兰氏阴性物种。适用于本发明的特征tra基因的实例是来自以下的tra基因：(1)F(Firth,N.,Ippen-Ihler,K.和Skurray,R.A.1996,F因子的结构和功能以及接合机制。在：大肠杆菌和沙门氏菌，Neidhard等人编辑，ASM Press,Washington D.C.)；(2)RP4(Nunez,B.,Avila,P.和de la Cruz,1997,参与接合DNA处理的基因。Mol.Microbial.24:1157-1168)；和(3)Ti(Ferrand,S.K.,Hwang,I.和Cook,D.M.1996,Nopaline型Ti质粒的tra区是具有与RSF1010、RP4和F的转移系统相关的元件的嵌合体。J.Bacteriol.178:4233-4247)。
在一些实施方式中，本发明的供体细菌细胞包含F因子的拷贝数和靶向抗菌质粒的拷贝数，所述靶向抗菌质粒包含质粒F的转移起点(origin transfer)。
在一些实施方式中，本发明的供体细菌细胞包含RP4质粒的拷贝数和靶向抗菌质粒的拷贝数，所述靶向抗菌质粒包含质粒RP4的转移起点。
在一些实施方式中，供体细菌细胞选自由以下家族组成的组：酸杆菌科(Acidobacteriaceae)、放线菌科(Actinomycetaceae)、放线多孢菌科(Actinopolysporaceae)、棒状杆菌科(Corynebacteriaceae)、戈登氏菌科(Gordoniaceae)、分枝杆菌科(Mycobacteriaceae)、诺卡菌科(Nocardiaceae)、短杆菌科(Brevibacteriaceae)、纤维素单胞菌科(Cellulomonadaceae)、去甲基醌菌科(Demequinaceae)、微杆菌科(Microbacteriaceae)、微球菌科(Micrococcaceae)、小单孢菌科(Promicromonosporaceae)、嗜酸性细菌科(Aarobacteraceae)、微单孢菌科(Micromonosporaceae)、类诺卡氏菌科(Nocardioidaceae)、丙酸杆菌科(Propionibacteriaceae)、束丝放线菌科(Actinosynnemataceae)、伪诺卡氏科(Pseudonocardiaceae)、链霉菌科(Streptomycetaceae)、拟诺卡氏菌科(Nocardiopsaceae)、链孢囊菌科(Streptosporangiaceae)、高温单孢菌科(Thermomonosporaceae)、双歧杆菌科(Bifidobacteriaceae)、拟杆菌科(Bacteroidaceae)、海洋滑动菌(Marinilabiliaceae)、多形单胞菌(Morphyromonadaceae)、环杆菌科(Cyclobacteriaceae)、噬纤维细菌科(Cytophagaceae)、火色杆菌科(Flammeovirgaceae)、快生嗜冷菌(Rhodothermaceae)、蟑螂杆状体科(Blattabacteriaceae)、Cryomorphaceae、黄杆菌科(Flavobacteriaceae)、Schleiferiaceae、噬几丁质菌科(Chitinophagaceae)、腐螺旋菌科(Saprospiraceae)、鞘脂杆菌科(Sphingobacteriaceae)、衣原体科(Chlamydiaceae)、副衣原体科(Parachlamydiaceae)、芯卡体科(Simkaniaceae)、石德菌科(Waddliaceae)、芽孢杆菌科(Bacillaceae)、李斯特氏菌科(Listeriaceae)、类芽孢杆菌科(Paenibacillaceae)、球菌科(Planococcaceae)、葡萄球菌科(Staphylococcaceae)、气球菌科(Aerococcaceae)、肉杆菌科(Carnobacteriaceae)、肠球菌科(Enterococcaceae)、乳酸杆菌科(Lactobacillaceae)、明串珠菌科(Leuconostocaceae)、链球菌科(Streptococcaceae)、梭菌科(Clostridiaceae)、优杆菌科(Eubacteriaceae)、太阳杆菌科(Heliobacteriaceae)、消化球菌科(Peptococcaceae)、瘤胃球菌科(Ruminococcaceae)、柄杆菌科(Caulobacteraceae)、生丝单胞菌科(Hyphomonadaceae)、慢生根瘤菌科(Bradyrhizobiaceae)、布鲁氏菌科(Brucellaceae)、生丝微菌科(Hyphomicrobiaceae)、甲基杆菌科(Methylobacteriaceae)、根瘤菌科(Rhizobiaceae)、黄色杆菌科(Xanthobacteraceae)、红细菌科(Rhodobacteraceae)、醋杆菌科(Acetobacteraceae)、红螺菌科(Rhodospirillaceae)、产碱菌科(Alcaligenaceae)、伯克氏菌科(Burkholderiaceae)、丛毛单胞菌科(Comamonadaceae)、草酸杆菌科(Oxalobacteraceae)、奈瑟氏菌科(Neisseriaceae)、螺菌科(Spirillaceae)、红环菌科(Rhodocyclaceae)、脱硫杆菌科(Desulfobacteraceae)、孢囊杆菌科(Cystobacteraceae)、粘液球菌科(Myxococcaceae)、侏囊菌科(Nannocystaceae)、相粘菌科(Phaselicystidaceae)、多囊粘菌科(Polyangiaceae)、Sandaracinaceae、互营菌科(Syntrophaceae)、互营杆菌科(Syntrophobacteraceae)、互营主杆菌科(Syntrophorhabdaceae)、弯曲菌科(Campylobacteraceae)、螺杆菌科(Helicobacteraceae)、酸硫杆状菌科(Acidithiobacillaceae)、气单胞菌科(Aeromonadaceae)、琥珀酸弧菌科(Succinivibrionaceae)、交替单胞菌科(Alteromonadaceae)、Celerinatantimonadaceae、寇蔚尔菌科(Colwelliaceae)、铁单胞菌科(Ferrimonadaceae)、源洋菌科(Idiomarinaceae)、Moritellaceae、假交替单胞菌科(Pseudoalteromonadaceae)、冷单胞菌科(Psychromonadaceae)、希万氏菌科(Shewanellaceae)、着色菌科(Chromatiaceae)、外硫红螺旋菌科(Ectothiorhodospiraceae)、颗粒状球菌科(Granulosicoccaceae)、肠杆菌科(Enterobacteriaceae)、柯克斯体科(Coxiellaceae)、军团菌科(Legionellaceae)、烷烃降解菌科(Alcanivoracaceae)、河氏菌科(Hahellaceae)、盐单胞菌科(Halomonadaceae)、岸生菌科(Litoricolaceae)、巴斯德氏菌科(Pasteurellaceae)、极毛杆菌科(Pseudomonadaceae)、弧菌科(Vibrionaceae)、涅瓦河菌科(Nevskiaceae)、华杆菌科(Sinobacteraceae)、莫拉菌科(Moraxellaceae)、黄单胞菌科(thomonadaceae)、短螺旋体科(Brachyspiraceae)、Brevinemataceae、钩端螺旋体科(Leptospiraceae)、螺旋体科(Spirochaetaceae)、盐扁菌科(Haloplasmataceae)和支原体科(Mycoplasmataceae)。
在一些实施方式中，供体细菌细胞选自以下的组：生二素链霉菌(Streptomycesambofaciens)、阿维链霉菌(Streptomyces avermitilis)、链霉菌(Streptomycescapreolus)、制癌链霉菌(Streptomyces carcinostaticus)、鹿色链霉菌(Streptomycescervinus)、带小棒链霉菌(Streptomyces clavuligerus)、达窝链霉菌(Streptomycesdavawensis)、弗氏链霉菌(Streptomyces fradiae)、灰色链霉菌(Streptomycesgriseus)、吸水链霉菌(Streptomyces hygroscopicus)、淡紫灰链霉菌(Streptomyceslavendulae)、变铅青链霉菌(Streptomyces lividans)、纳塔尔链霉菌(Streptomycesnatalensis)、诺尔斯氏链霉菌(Streptomyces noursei)、卡那链霉菌(Streptomyceskanamyceticus)、从链霉菌(Streptomyces nodosum)、链霉菌属(Streptomycestsukubaensis)、和链霉菌(Streptomyces sp.)、天蓝色链霉菌(Streptomycescoelicolor)、肉桂地链霉菌(Streptomyces cinnamonensis)、放线菌(Streptomycesplatensis)、龟裂链丝菌(Streptomyces rimosus)、壮观链霉菌(Streptomycesspectabilis)、轮枝链霉菌(Streptomyces verticillus)、委内瑞拉链霉菌(Streptomycesvenezuelae)、紫黑链霉菌(Streptomyces violaceoniger)、紫红链霉菌(Streptomycesviolaceoruber)、茂原链霉菌(Streptomyces mobaraensis)、链霉菌属(Streptomycespeuceticus)、天蓝淡红链霉菌(Streptomyces coeruleorubidus)、牛放线菌(Actinomycesbovis)、鲍德尼放线菌(Actinomyces bowdenii)、犬放线菌(Actinomyces canis)、Actinomyces catuli、Actinomyces coleocanis、欧洲放线菌(Actinomyces europaeus)、福氏放线菌(Actinomyces funkei)、乔格放线菌(Actinomyces georgiae)、香港放线菌(Actinomyces hongkongensis)、衣氏放菌(Actinomyces israelii)、Actinomycesmarimammalium、麦氏放线菌(Actinomyces meyeri)、金黄色放线菌(Actinomycesoricola)、斯氏放线菌(Actinomyces slackii)、链霉素放线菌(Actinomycesstreptomycini)、猪放线菌(Actinomyces suis)、替考游动放线菌(Actinoplanesteichomyceticus)、珍贵橙色束丝放线菌(Actinosynnema pretiosum)、自养假诺卡氏菌(Pseudonocardia autotrophica)、地中海拟无枝菌酸菌(Amycolatopsis mediteranei)、东方拟无枝酸菌(Amycolatopsis orientalis)、糖多孢红霉菌(Saccharopolysporaeritharaea)、Saccharopoylspora hirsuta、绿脓杆菌(Pseudomonas aeruginosa)、恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)、丁香假单胞菌(Pseudomonas syringae)、Xantomonasorysae、洋葱伯克霍尔德菌(Burkholderia cenocepacia)、枯草杆菌(Bacillussubtilis)、地衣芽孢杆菌(Bacilllus licheniformis)、巨大芽孢杆菌(Bacillusmegaterium)、Mixococcus xantus、嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus)、干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)、短乳杆菌(Lactobacillus brevis)、乳酸乳球菌(Lactococcuslactis)、乳酪短杆菌(Brevibacterium casei)、氧化短杆菌(Brevibacterium oxydans)、双裂双岐杆菌(Bifidobacterium bifidum)、其中含双叉杆菌(Bifidobacterum longum)、从毛单胞菌(Commamonas sp.)、谷氨酸棒状杆菌(Corynebacterium glutamicum)、红球菌(Rhodococcus sp.)、粘质沙雷氏菌(Serratia marescens)、三叶草根瘤菌(Rhizobiumtrifolii)、放射型根瘤菌(Rhizobium radiobacter)、粘液杆菌纤维素(Sporangiumcellulosum)、藏红花软骨霉状菌(Chondromyces crocatus)、氧化葡萄糖酸杆菌(Gluconobacter oxydans)、灰色小单孢菌(Micromonospora grisea)、微球菌属(Micrococcus sp.)、红橙小单孢菌(Micromonospora rhodorangea)、Micromonosporazionensis、小单孢菌(Micromonospora purpurea)、伊纽小单孢菌(Micromonosporainyoensis)、相模原小单孢菌(Micromonospora sagamiensis)、巴龙特孢浮游单孢菌(Palnomonospora parontospora)、松崎町指孢囊菌(Dactylosporangiummatsuzakiense)、诺卡氏菌(Nocardia lactamdurans)、多粘芽孢杆菌(Bacilluscolistinus)、玫瑰游动双孢菌(Planobispora rosea)、沙场链霉菌(Streptomycesarenae)、抗生链霉菌(Streptomyces antibioticus)、春日链霉菌(Streptomyceskasugaensis)、三鹰链霉菌(Streptomyces mitakaensis)、比基尼链霉菌(Streptomycesbikiniensis)、白黑链霉菌(Streptomyces alboniger)、黑暗链霉菌(Streptomycestenebrarius)、环形杆菌(Bacillus circulans)、核糖苷链霉菌(Streptomycesribosidificus)、多粘芽孢杆菌(Bacillus colistinus)、海洋链霉菌(Streptomycestenjimariensis)和密旋链霉菌(Streptomyces pactum)。
在一些实施方式中，本发明的供体细菌细胞是非病原性的。供体细菌细胞实际上可以是与温血动物(包括人类在内)的身体相关的数千种非致病细菌中的任何一种。优选地，利用在身体的非无菌部位(例如，皮肤、消化道、泌尿生殖区域、口腔、鼻腔、咽喉和上呼吸道、耳朵和眼睛)定植的非致病细菌作为供体菌细胞，并且使用本发明的方法来治疗身体这些部分的细菌感染。特别优选地供体细菌物种的实例包括但不限于：(1)非致病性大肠杆菌菌株(大肠杆菌F18和大肠杆菌菌株Nissle 1917)，(2)各种乳杆菌属(例如干酪乳杆菌、胚芽乳杆菌、副干酪乳杆菌、嗜酸乳杆菌、发酵乳杆菌、玉米须乳杆菌(L.zeae)和格氏乳杆菌)，(3)其它非致病性或益生菌皮肤或胃肠道定植细菌，例如乳球菌属、双歧杆菌属(Bi.fidobacteria)、真细菌类，和(4)细菌微细胞，是注定死亡但仍能转移质粒的环状细胞(参见，例如，Adler et al(1970)Proc.Nat.Acad,Sci USA 57；321-326；Frazer et al.(1975)Current Topics in Microbiology and Immunology 69:1-84；U.S.Pat.No.4,968,619to Curtiss III)。
在一些实施方式中，供体细菌细胞是益生菌细胞。在一些实施方式中，本发明的益生菌细胞是活益生菌细胞。在一些实施方式中，本发明的益生菌菌株选自食品级细菌，即在食品中使用并通常被认为安全的细菌。在一些实施方式中，益生菌菌株是革兰氏阴性菌株。在一些实施方式中，益生菌菌株是肠杆菌科的成员。在一些实施方式中，益生菌菌株是大肠杆菌菌株。在一些实施方式中，根据本发明的教导使用的益生菌大肠杆菌菌株包括发挥益生菌活性的非致病性大肠杆菌菌株。益生菌大肠杆菌菌株的实例是益生菌大肠杆菌菌株BU-230-98，ATCC保藏号202226(DSM 12799)，它是已知的市售益生菌大肠杆菌菌株M-17的分离物。非致病性的实例是大肠杆菌Nissle1917。不被称为益生菌的大肠杆菌菌株的一个实例是实验室大肠杆菌菌株K12。
可通过本领域技术人员已知的任何方法将本发明的质粒引入供体细菌细胞。转化的示例性方法包括通过感受态细胞的电穿孔转化、感受态细胞的被动摄取、感受态细胞的化学转化，以及导致将核酸引入细胞的任何其他电、化学、物理(机械)和/或生物机制，包括其任何组合。用于转化原核生物体的程序是本领域众所周知的常规程序，并在整个文献中有所描述(参见，例如，Jiang et al.2013.Nat.Biotechnol.31:233-239；Ran etal.Nature Protocols8:2281-2308(2013))。
方法：
本发明还涉及一种用于杀死多个受体菌细胞的方法，包括将所述多个受体细菌细胞暴露给多个供体细菌细胞，所述供体细菌细胞包含本发明的靶向抗菌质粒的拷贝数，所述靶向抗菌质粒被配置为在所述多个受体细菌细胞中表达核酸酶和一个或多个向导RNA分子，其中所述核酸酶和向导RNA分子在所述多个受体细菌细胞中的转移和表达，对所述多个受体细菌细胞是致命的。
通常，受体菌细胞是分散在受试者全身的病原菌，但特别是在皮肤上或消化道、泌尿生殖区域、口腔、鼻腔、咽喉和上呼吸道、眼睛和耳朵上。对于靶向和根除特别感兴趣的是铜绿假单胞菌、大肠杆菌、肺炎葡萄球菌和其他物种、肠杆菌属、肠球菌属和结核分枝杆菌的致病菌株。本文还讨论了其他一些菌种，并且这些菌种对于本领域技术人员来说将是显而易见的，但通常包括艰难梭菌(Clostridium difficile)、大肠杆菌(Escherichiacoli)、破伤风梭状杆菌(Clostridium tetani)、幽门螺杆菌(Helicobacter pylori)、具核棱杆菌(Fusobacterium nucleatum)、加德纳菌性阴道炎(Gardnerella vaginitis)、牙龈卟啉单胞菌(Porphyromonas gingivalis)、伴放线放线杆菌(Aggregatibacteractinomycetemcomitans)、李斯特菌(Listeria monocytogenes)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、空肠弯曲杆菌(Campylobacter jejuni)、创伤弧菌(Vibriovulnificus)、伤寒沙门氏菌(Salmonella typhi)、肉毒杆菌(Clostridium botulinum)、结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)、麻风分枝杆菌(Mycobacterium leprae)、弥漫型麻风分枝杆菌(Mycobacterium lepromatosis)、白喉棒状杆菌(Corynebacteriumdiptheriae)、肺炎克雷伯杆菌(Klebsiella pneumoniae)、鲍氏不动杆菌(Acinetobacterbaumannii)、变异链球菌(Streptococcus mutans)、B链球菌(group B streptococci)，包括但不限于金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、无乳链球菌(Streptococcusagalactiae)、肺炎链球菌(Streptococcus pneumonia)、肠球菌属(Enterococcus spp.)，包括但不限于粪肠球菌(Enterococcus faecalis)。
本发明的方法特别适用于治疗多种细菌感染或与细菌相关的不良病症。在一些实施方式中，细菌感染是胃肠道感染、泌尿生殖道感染、呼吸道感染(例如鼻炎、扁桃体炎、咽炎、支气管炎、肺炎)、内脏器官感染(例如肾炎、肝炎、腹膜炎、心内膜炎、脑膜炎、骨髓炎)、眼、耳感染以及皮肤和皮下感染、腹泻、皮肤病、中毒性休克综合征、菌血症、败血症和结核病。在一些实施方式中，感染由革兰氏阳性菌或革兰氏阴性菌引起。在一些实施方式中，细菌感染由选自以下的组的细菌引起：葡萄球菌(Staphylococcus)、链球菌(Streptococcus)、假单胞菌属(Pseudomonas)、埃希氏菌属(Escherichia)、沙门氏菌属(Salmonella)、螺杆菌属(Helicobacter)、奈瑟菌属(Neisseria)、弯曲菌属(Campylobacter)、衣原体属(Chlamydia)、梭菌属(Clostridium)、弧菌属(Vibrio)、密螺旋体属(Treponema)、分枝杆菌属(Mycobacterium)、克雷伯氏菌性(Klebsiella)、放线菌属(Actinomyces)、厌氧杆菌属(Bacterioides)、博德特氏菌(Bordetella)、包柔氏螺旋体属(Borrelia)、布鲁氏菌属(Brucella)、棒状杆菌属(Corynebacterium)、双球菌属(Diplococcus)、肠杆菌属(Enterobacter)、梭杆菌属(Fusobacterium)、钩端螺旋体属(Leptospira)、利斯特菌属(Listeria)、巴氏杆菌属(Pasteurella)、变形杆菌属(Proteus)、立克次氏体属(Rickettsia)、志贺氏菌属(Shigella)、产球菌属(Sphaerophorus)、耶尔森氏菌属(Yersinia)或其组合。引起细菌性呼吸道感染的细菌的实例包括，但不限于，衣原体菌(Chlamydia species)(例如肺炎衣原体)、克雷伯氏菌(Klebsiella species)、流感嗜血杆菌(Haemophilus influenzae)、军团菌科(Legionallaceae family)、分枝杆菌属(mycobacteria)(例如结核分支杆菌)、巴斯德菌科(Pasteurellaceae family)、假单胞菌属(Pseudomonas species)、葡萄球菌属(Staphylococcus)(例如抗甲氧西林金黄色葡萄球菌和酿脓葡萄球菌)、链球菌(例如肠炎链球菌、粪链球菌(Streptococcus Fasciae)和肺炎链球菌)。引起肠道感染的细菌的实例包括但不限于拟杆菌科家族(Bacteroidaceae family)、曲状杆菌属(Campylobacterspecies)、衣原体菌(Chlamydia species)、梭菌属(Clostridium)、肠杆菌科家族(Enterobacteriaceae family)(例如柠檬酸杆菌(Citrobacter species)、爱德华菌属(Edwardsiella)、产气肠杆菌属(Enterobacter aerogenes)、大肠杆菌(Escherichiacoli)、克雷伯氏菌属(Klebsiella species)、沙门氏菌(Salmonella species)和福氏志贺氏菌(Shigella flexneri))、加丁氏菌科(Gardinella family)、李斯特菌属(Listeriaspecies)、巴斯德氏菌科家族(Pasteurellaceae family)、假单胞菌属(Pseudomonasspecies)、链球菌(Streptococcus)(例如肠炎链球菌(Streptococcus enteritidis)、粪链球菌(Streptococcus Fasciae)和肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae))、螺杆菌家族(Helicobacter Family)。这些用途的其他代表性实例包括治疗(1)由嗜血杆菌引起的结膜炎和由铜绿假单胞菌引起的角膜溃疡；(2)由铜绿假单胞菌引起的外耳炎；(3)由多种革兰氏阳性球菌和革兰氏阴性杆菌引起的慢性鼻窦炎；(4)与铜绿假单胞菌有关的囊性纤维化；(5)由幽门螺杆菌(溃疡)、大肠杆菌、鼠伤寒沙门氏菌、弯曲杆菌和志贺氏菌属引起的肠炎；(6)开放性伤口，包括手术和非手术伤口，作为许多菌种的预防措施；(7)烧伤以消除铜绿假单胞菌或其他革兰氏阴性病原体；(8)由痤疮丙杆菌引起的痤疮；(9)抗甲氧西林金黄色葡萄球菌(MSRA)引起的鼻子和皮肤感染；(10)主要由革兰氏阳性厌氧菌引起的体臭(即用于除臭剂)；(11)与阴道加德纳氏菌和其他厌氧菌相关的细菌性阴道病；和(12)由各种微生物引起的牙龈炎和/或龋齿。
本发明还涉及一种使用本发明的供体细菌细胞用于增强抗生素在有需要的受试者中清除感染的临床疗效的方法，即意味着与单独的抗生素治疗相比，本发明的供体细菌细胞改善了细菌的清除和感染的恢复。
本发明的另一个目的涉及治疗由包含抗生素抗性基因的细菌细胞引起的受试者感染的方法，其中该方法包括向受试者施用治疗有效量的抗生素和治疗有效量的细菌供体细胞的组合，所述细菌供体细胞包含靶向抗菌质粒的拷贝数，所述靶向抗菌质粒编码一种或多种适于靶向抗生素抗性基因的向导RNA分子，从而使抗生素抗性基因失活并使细菌细胞对所述抗生素敏感。
特别地，抗生素与靶向一个或多个抗生素抗性基因的供体菌细胞的组合，可以增强宿主在开始治疗前修复由感染诱导的损伤的能力。因此，本发明的组合可以降低发病率。根据本发明，供体菌细胞靶向一个或多个抗生素抗性基因，增强抗生素清除细菌感染的活性。本文所用的术语“增强”是指增强或增加抗生素的至少一种生物效应或活性，使得(i)当抗生素增强时，与相同浓度或量的抗生素未被增强时相比，当给定浓度或量的抗生素增强时，会产生更大的生物效应或活性；或(ii)当抗生素增强时，需要的抗生素浓度或量低于抗生素未增强时所需的抗生素浓度或数量才能达到特定的生物效应或活性；或(iii)(i)和(ii)两者都。特别地，与抗生素结合的供体细菌细胞：-1-可以影响抗生素无法到达的特定生态位(即某些细胞的细胞内区室)，从而使抗生素在与供体细菌细胞结合时起作用；-2-可以影响抗生素治疗感染的恢复期(组织修复、受感染组织生理功能的恢复)；-3-可以限制副作用(例如改变肠道、皮肤、呼吸道...中微生物群组成)和-4-可以抑制抗生素抗性的发展(通常是由于微生物群细菌获得了抗性)。
在一些实施方式中，所述抗生素选自氨基糖苷类(aminoglycosides)、β-内酰胺类(beta-lactams)、喹诺酮类(quinolones)或氟喹诺酮类(fluoroquinolones)、大环内酯类(macrolides)、磺胺类(sulfonamides)、磺胺甲基异恶唑(sulfamethaxozoles)、四环素类(tetracyclines)、链阳性菌素类(streptogramins)、唑烷酮类(oxazolidinones)(如利奈唑胺(linezolid))、利福霉素类(rifamycins)、糖肽类(glycopeptides)、多粘菌素类(polymixins)、脂肽类抗生素(lipo-peptide antibiotics)。特别地，抗生素选自β-内酰胺类。β-内酰胺类的所有成员都具有β-内酰胺环和羧基，导致其药代动力学和作用机制有55个相似之处。大多数临床上有用的β-内酰胺类属于青霉素类或头孢菌素类，包括头孢霉素和氧头孢烯类。β-内酰胺类还包括碳青霉烯类和单酰胺环类。一般地，β-内酰胺类抑制细菌细胞壁的合成。更具体地，这些抗生素在细胞壁的肽聚糖网中造成“缺口”，使细菌原生质从其保护网流入周围的低渗培养基。然后，液体积聚在裸露的65原生质体(没有细胞壁的细胞)中，最终破裂，导致有机体死亡。从机理上讲，β-内酰胺类通过与连接到酶靶位点羟基的开放内酰胺环的羧基形成稳定的酯来抑制D-丙氨酰-D-丙氨酸转肽酶的活性而起作用。β-内酰胺类抗生素非常有效，通常毒性较低。作为一组药物，这些药物对许多革兰氏阳性、革兰氏阴性和厌氧微生物有效。属于此类的药物包括2-(3-丙氨酰基)庚酮(2-(3-alanyl)clavam)、2-羟甲基克拉维烷(2-hydroxymethylclavam)、7-甲氧头孢菌素(7-methoxycephalosporin)、差向硫霉素(epi-thienamycin)、乙酰噻吩霉素(acetyl-thienamycin)、阿莫西林(amoxicillin)、萘啶毒霉素(apalcillin)、阿扑西林(aspoxicillin)、叠氮青霉素(azidocillin)、阿洛西林(azlocillin)、氨曲南(aztreonam)、氨下青霉素甲戊酯(bacampicillin)、比阿培南(blapenem)、羧苄青霉素(carbenicillin)、羧下青霉素苯酯(carfecillin)、羧下青霉素茚满酯(carindacillin)、毯霉素A和B(carpetimycin A and B)、头孢乙氰(cefacetril)、氯氨下头孢菌素(cefaclor)、头孢羟氨苄(cefadroxil)、头孢氨苄(cefalexin)、头孢菌素(cefaloglycin)、头孢噻啶(cefaloridine)、头孢噻吩(cefalotin)、羟下四唑头孢菌素(cefamandole)、头孢吡硫(cefapirin)、氨羟下三嗪硫甲头孢菌素(cefatrizine)、头孢西酮(cefazedone)、头孢唑啉(cefazolin)、头孢拉宗(cefbuperazone)、头孢卡品(cefcapene)、头孢地尼(cefdinir)、头孢托仑(cefditoren)、头孢吡肟(cefepime)、头孢他美(cefetamet)、头孢克肟(cefixime)、头孢甲肟(cefinenoxime)、头孢美唑(cefinetazole)、头孢米诺(cefminox)、cefmolexin、头孢地嗪(cefodizime)、头孢尼西(cefonicid)、氧哌羟苯唑头(cefoperazone)、头孢雷特(ceforamide)、头孢噻利(cefoselis)、氨中噻肟头孢菌素(cefotaxime)、头孢替坦(cefotetan)、噻乙胺唑头孢菌素(cefotiam)、甲氧噻吩头孢菌素(cefoxitin)、头孢唑兰(cefozopran)、头孢匹胺(cefpiramide)、头孢匹罗(cefpirome)、头孢泊肟(cefpodoxime)、头孢丙烯(cefprozil)、头孢喹肟(cefquinome)、头孢拉定(cefradine)、氧甲环烯氨头孢菌素(cefroxadine)、磺吡下头孢霉素(cefsulodin)、头孢他啶(ceftazidime)、头孢特仑(cefteram)、头孢替唑(ceftezole)、头孢布烯(ceftibuten)、去甲噻肟头孢菌素(ceftizoxime)、头孢曲松(ceftriaxone)、呋肟头孢菌素(cefuroxime)、头孢菌素C(cephalosporin C)、头霉素A(cephamycin A)、头孢霉素C(cephamycin C)、头孢噻吩(cephalothin)、chitinovorin A、chitinovorin B、chitinovorin C、环青霉素(ciclacillin)、氯甲西林(clometocillin)、氯唑西林(cloxacillin)、环丝氨酸(cycloserine)、脱氧多酸霉素B和C(deoxy pluracidomycin B and C)、双氯青霉素(dicloxacillin)、二氢多酸霉素C(dihydro pluracidomycin C)、依匹西林(epicillin)、差向硫霉素D、E和F(epithienamycin D,E,and F)、厄他培南(ertapenem)、法罗培南(faropenem)、氟氧头孢(flomoxef)、氟氯西林(flucloxacillin)、缩酮氨下青霉素(hetacillin)、亚胺培南(imipenem)、棱氨西林(lenampicillin)、氯碳头孢(loracarbef)、美西林(mecillinam)、美罗培南(meropenem)、甲烯氨下青霉素(metampicillin)、甲氧西林(meticillin)(也称为甲氧苯青霉素)、美洛西林(mezlocillin)、氧酰胺菌素(moxalactam)、乙氧萘青霉素(nafcillin)、去甲基硫霉素(northienamycin)、青霉素P-12(oxacillin)、帕尼培南(panipenem)、青霉素G双酯(penamecillin)、青霉素G、N和V(penicillin G,N,and V)、苯氧乙基青霉素(phenethicillin)、哌拉西林(piperacillin)、povampicillin、pivcefalexin、氮卓脒青霉素双酯(povmecillinam)、氮卓脒青霉素双酯(pivmecillinam)、多酸霉素B、C和D(pluracidomycin B,C,and D)、丙匹西林(propicillin)、沙莫西林(sarmoxicillin)、舒巴坦(sulbactam)、舒他西林(sultamicillin)、氨下青霉素酞酯(talampicillin)、替莫西林(temocillin)、特康唑(terconazole)、噻嗯霉素(thienamycin)、andticarcillin。更具体地，碳青霉烯类包括例如获批准的亚胺培南抗生素(antibiotics Imipenem)、美罗培南(Meropenem)、厄他培南(Ertapenem)、多利培南(Doripenem)、帕尼培南/倍他米隆(Panipenem/betamipron)、比阿培南(Biapenem)以及实验性抗生素阿祖培南(Razupenem)、泰比培南(Tebipenem)、来那培南(Lenapenem)和托莫培南(Tomopenem)。
一旦产生了供体细菌细胞，它们就被用于在需要这种治疗的个体中抵抗一种或多种选定的病原体。根据要保护的细胞群或组织，考虑本发明供体细菌细胞的以下给药模式：局部、口服、鼻、肺/支气管(例如，通过吸入器)、眼、直肠、泌尿生殖器、皮下、腹膜内和静脉注射。供体菌细胞优选地为以药物制剂的形式提供，在适合于为被治疗患者选择的给药方式的递送载体中。
例如，为了将供体菌细胞递送至胃肠道或鼻腔通道，优选地给药方式是通过口服摄入或鼻用气化喷雾剂，或通过喂食(单独或掺入受试者的饲料或食物中)。在一些实施方式中，本发明的供体细菌细胞可以作为凝胶胶囊中的粉末冻干制剂提供，或者以散装形式提供用于喷洒到食物或饮料中。对于局部应用，可以将供体细菌细胞配制成软膏或乳膏，涂在受影响的皮肤表面。软膏或乳膏制剂也适用于直肠或阴道给药，以及其他标准制剂，如栓剂。用于局部、阴道或直肠给药的合适制剂是药物化学家熟知的。
还考虑了本发明的供体细菌细胞的其他用途。包括农业和园艺应用，例如：(1)用于肉类或其他食品上，以消除致病菌；(2)用于动物饲料(鸡、牛)，以减轻生物负荷或减少或消除特定的病原微生物(例如沙门氏菌)；(3)用于鱼类，以防止变形杆菌和其他生物引起的“鱼腥味”；和(4)用于切花以防止枯萎。
组合物：
本发明的另一个目的涉及一种包含一定量本发明的供体菌细胞的组合物。
在一些实施方式中，本发明的组合物是药物组合物。包含供体细菌细胞的药物制剂被配制成剂量单位形式，以便于给药和剂量的均匀性。本文所用的剂量单位形式是指适用于接受治疗的患者的药物制剂的物理离散单位。每个剂量应含有一定量的供体细菌，其量经计算可产生与所选药物载体相关的所需抗菌效果。用于确定适当剂量单位的程序是本领域技术人员熟知的。剂量单位可以根据患者的体重按比例增加或减少。如本领域已知的，可通过剂量浓度曲线计算来确定用于实现消灭靶细胞群或组织的病原菌的合适浓度。用于局部给药的本发明的药物组合物可以是适于局部使用的形式，例如，气雾剂、乳膏、软膏、洗剂或扑粉。本文提供的药物组合物可以配制成通过吸入给药。例如，组合物可以是气溶胶、雾或粉末的形式。因此，本文所述的组合物可以使用合适的推进剂，例如二氯二氟甲烷、三氯氟甲烷、二氯四氟乙烷、二氧化碳或其他合适的气体，以气溶胶喷雾的形式从加压包装或雾化器中递送。在使用加压气雾剂的情况下，可以通过使用阀门来输送计量的量以确定剂量单位。
在一些实施方式中，本发明的供体细菌细胞被包封，以便当将供体细菌细胞通过摄入(即口服途径)施用给受试者时保护其免受胃部的损害。因此，在一些实施方式中，本发明的供体细菌细胞以胶囊形式配制成组合物，以便显著提高它们的存活时间。在这种情况下，胶囊的存在尤其可以延迟或阻止微生物在胃肠道中的降解。应当理解，本发明实施方式的组合物可以被包封到肠溶包衣的、定时释放的胶囊或片剂中。肠溶包衣允许胶囊/片剂在通过胃肠道时保持完整(即未溶解)，直到到达小肠。包封活细菌细胞的方法在本领域是公知的(参见，例如，U.S.patents to General Mills Inc.such as U.S.Pat.No.6,723,358)。例如，用海藻酸盐和Hi-MaizeTM进行微胶囊化，然后进行冷冻干燥，已被证明能够成功延长乳制品中细菌细胞的保质期[参见，例如，Kailasapathy et al.Curr Issues IntestMicrobiol.2002September；3(2):39-48]。或者，可以用葡甘露聚糖纤维(glucomannanefibers)，例如从魔芋中提取的葡甘露聚糖纤维来进行包封。或者，也可以使用在芝麻油乳液中包埋的活益生菌[参见，例如，Hou et al.J.Dairy Sci.86:424-428]。在一些实施方式中，用于肠溶包衣的试剂优选是甲基丙烯酸-丙烯酸烷基酯共聚物，例如
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聚合物。聚(甲基)丙烯酸酯已经证明特别适合作为涂层材料。/>
Figure BDA0004175047600000512
是由丙烯酸酯和甲基丙烯酸酯衍生的共聚物的商标名，其性质由官能团决定。各个/>
Figure BDA0004175047600000513
等级的中性、碱性或酸性基团的比例有所不同，因此在物理化学性质也有所不同。不同
Figure BDA0004175047600000514
聚合物的巧妙使用和组合为各种制药和技术应用中的药物控释提供了理想的解决方案。/>
Figure BDA0004175047600000515
为缓释片剂和颗粒涂层提供功能性薄膜。这些聚合物在国际药典如欧洲药典、USP/NF、DMF和JPE中有所描述。/>
Figure BDA0004175047600000521
聚合物可为药物控释提供以下可能性：胃肠道靶向(胃阻力、结肠释放)、防护涂料(味道和气味掩蔽、防潮)和延迟药物释放(缓释制剂)。/>
Figure BDA0004175047600000522
聚合物有多种不同的浓度和物理形态可供选择，包括水溶液、水分散体、有机溶液和固体物质。/>
Figure BDA0004175047600000523
聚合物的药物特性由其官能团的化学性质决定。
在一些实施方式中，本发明的供体细菌细胞以食品组合物的形式施用于受试者。因此，本发明的另一方面涉及一种包含一定量的本发明的供体细菌细胞的食品组合物。在一些实施方式中，包含本发明的供体菌细胞的食品组合物选自完整的食品组合物、食品补充剂、营养保健品组合物等。本发明的组合物可以用作食品成分和/或饲料成分。在一些实施方式中，包含本发明的供体细菌细胞的食物组合物包含至少一种益生元。“益生元”是指旨在促进本发明的供体细菌细胞在肠道中生长的食品物质。所述益生元可以选自由低聚糖组成的组，可选地含有果糖、半乳糖、甘露糖、大豆和/或菊粉、和/或膳食纤维。
包含本发明的供体细菌细胞的组合物通常包含载体或赋形剂。“载体”或“赋形剂”是指适于给药的材料，包括本领域已知的任何此类材料，例如任何液体、凝胶、溶剂、液体稀释剂、增溶剂或类似物，其是无毒的，并且不会以有害方式与组合物的任何组分相互作用。可接受的载体的实例包括，例如，水、盐溶液、醇、硅酮、蜡、凡士林、植物油、聚乙二醇、丙二醇、脂质体、糖、明胶、乳糖、直链淀粉、硬脂酸镁、滑石、表面活性剂、硅酸、粘性石蜡、香油、脂肪酸单酸甘油酯和双甘油酯、石油醚脂肪酸酯(petroethral fatty acid esters)、羟甲基纤维素、聚乙烯吡咯烷酮等。在一些实施方式中，包含本发明的供体细菌细胞的组合物包含保护性亲水胶体(如树胶、蛋白质、改性淀粉)、粘合剂、成膜剂、包封剂/材料、壁/壳材料、基质化合物、涂料、乳化剂、表面活性剂、增溶剂(油、脂肪、蜡、卵磷脂等)、吸附剂、载体、填料、共化合物、分散剂、湿润剂、加工助剂(溶剂)、流动剂、掩味剂、增重剂、胶凝剂(jellifying agents)、凝胶形成剂(gel forming agents)、抗氧化剂和抗菌剂。该组合物还可以包含常规的药物添加剂和佐剂、赋形剂和稀释剂，包括但不限于水、任何来源的明胶、植物胶、木质素磺酸盐、滑石、糖、淀粉、阿拉伯胶、植物油、聚亚烷基二醇、调味剂、防腐剂、稳定剂、乳化剂、缓冲剂、润滑剂、着色剂、湿润剂、填料等。在所有情况下，将根据它们对预期接受者的适用性来选择这些进一步的组分。
本发明将通过以下附图和实施例进一步说明。然而，这些实施例和附图不应以任何方式解释为限制本发明的范围。
实施例
方法：
细菌菌株、质粒、引物和生长培养条件。
细菌菌株的构建和生长程序。质粒克隆由Gibson Assembly(Gibson等，2009)完成，并由Sanger测序(Eurofins Genomics)验证。染色体突变通过噬菌体P1转导转移以产生最终菌株。菌株在37℃下的Luria-Bertani(LB)培养基、添加有葡萄糖(0.2％)和酪蛋白氨基酸(0.4％)的M9培养基(M9-CASA)或添加有葡萄糖(0.2％)和酪蛋白氨基酸(0.4％)的M63培养基(M63)中生长。适当时，在培养基中添加以下抗生素：50μg/ml卡那霉素(Kan)，20μg/ml氯霉素(Cm)，10μg/ml四环素(Tc)，20μg/ml萘啶酸(Nal)，20μg/ml链霉素(St)，100μg/ml氨苄青霉素(Ap)，10μg/ml庆大霉素(Gm)，50μg/ml利福平(Rif)。适当时，加入40μg/ml 5-溴-4-氯-3-吲哚基-β-D-吡喃半乳糖苷(X-Gal)和40μM异丙基β-D-1-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)用于筛选LAC表型。
TAPs的构建和TAPs上间隔序列的一步克隆变化。
通过IVA克隆(García-Nafría等人,2016)进行质粒构建，希望改变TAPs中的间隔序列，这通过用SapI-间隔-SapI DNA序列取代pEGL129中的间隔来完成的。nsp(非特异性)间隔序列的两侧是两个SapI限制性位点，允许在SapI消化时释放非粘性DNA末端。为了取代nsp间隔区，通过退火2个寡核苷酸来构建新的间隔区，所述寡核苷酸与TAP-Cas9-nsp或TAP-dCas9-nsp质粒的SapI限制性内切酶产生的非粘性末端具有互补序列。新的间隔片段和TAP主链之间的连接产物被转化到DH5α或TB28菌株中。通过PCR反应和测序验证构建。
刚果红试验(Congo red assay)
Curli生产菌落试验。将含有或不含有质粒的大肠杆菌菌株OmpR234涂布在刚果红培养基上(10g细菌用胰蛋白胨、5g酵母膏、18g细菌用琼脂、40μg/ml刚果红和20μg/ml考马斯亮蓝G)，并在30℃下孵育4天。用M80立体显微镜(徕卡)在x10的放大倍率下观察菌落。使用与立体显微镜耦合的IC80-HD集成摄像头捕捉数字图像，通过LASv4.8软件(徕卡)操作。
液体聚集试验。将过夜培养的含有或不含质粒的大肠杆菌菌株OmpR234在补充有25μg/ml刚果红的1ml M9-CASA培养基中稀释至A600为0.05。培养物在30℃无搅拌下生长24小时，并捕捉图像。
接合试验
将在供体和受体菌株的LB中生长的过夜培养物稀释至A600为0.05，并生长至A600达到0.7至0.9之间。将50μl供体和150μl受体培养物混合到Eppendorf管中，以获得1：3的供体与受体比例。在0分钟时，将100μl混合物稀释到1ml LB中，连续稀释并涂布补充有抗生素的LB琼脂上，以筛选供体、受体和转化接合细胞(transconjugant cells)。将剩余的100μl在37℃下孵育1小时30分钟。缓慢加入1ml LB，并将试管在37℃下再孵育1小时30分钟、4小时30分钟或22小时30分钟。然后将接合混合物涡旋，连续稀释并按时间为0分钟接种。
长期接合试验。制备接合混合物，并在37℃下无搅拌孵育。每隔24小时，将100μl混合物稀释到1ml LB中，并在37℃下重新孵育。将剩余的混合物涡旋，连续稀释，并涂布补充有抗生素的LB琼脂上，以筛选供体、受体和转化接合细胞。在第1天和第7天，将产生的氨苄青霉素抗性受体的100个克隆体与携带RAP-dCas9-0XA48的供体混合，在补充有Tc或Kn的LB琼脂上划线，以分别评估F-Tn10或TAP-dCas9-OXA48质粒的存在。
多物种接合。将在供体和受体菌株的LB中生长的过夜培养物稀释至A600为0.05，并生长至A600达到0.7至0.9之间。通过以等比例混合鼠类柠檬酸杆菌(C.rodentium)、阴沟肠杆菌(E.cloacae)、致病性大肠杆菌(E.coli EPEC)或大肠杆菌HS受体(E.coli HSrecipients)菌株来制备受体混合物。将该混合物连续稀释，并涂布在补充有抗生素的LB琼脂上，以针对每个受体进行选择。将100μl供体和100μl受体混合物加入Eppendorf管中进行交配。在0分钟时，将100μl混合物稀释到1ml LB中，连续稀释并涂布在补充有抗生素的LB琼脂上，以选择供体、受体和转移接合物。将剩余的100μl在37℃下孵育1小时30分钟。缓慢加入1ml LB，并将试管在37℃下再孵育1小时30分钟。然后将接合混合物涡旋，连续稀释并涂布在补充有抗生素的LB琼脂上，以筛选供体，受体和转化接合细胞。在图中，接合效率表示为转化接合细胞的最终浓度(CFU/ml)或根据比率(T/R+T)计算的转化接合细胞的百分比。
转化测定
将在LB中生长的过夜培养物稀释1/100，并生长至A600介于0.4和0.6之间。用氯化铷(Rubidium Chloride)处理细胞，用100ng质粒和热激转化90μl的所得感受态细胞。在37℃孵育1小时后进行表型表达，将细胞以5000rpm离心5分钟，重悬于100μl LB中，并将10μl连续稀释液点在补充有适当抗生素的LB平板上。
活细胞显微成像和分析
延时试验。将供体和受体细胞在M9-CASA(大肠杆菌之间)或M63(大肠杆菌和鼠类柠檬酸杆菌之间)中的过夜培养物稀释至A600为0.05，并生长至A600介于0.7和0.9之间。将25μl供体和75μl受体混合到Eppendorf管中，并将50μl混合物装载到B04A微流体室(ONIX,
Figure BDA0004175047600000561
)中。在整个成像过程中，营养供应保持在1psi，温度保持在37℃。每10分钟对细胞进行一次成像，持续3小时。
图像采集。常规宽场荧光显微镜成像是在Eclipse Ti-E显微镜(尼康)上进行的，配备x100/1.45oil Plan Apo Lambda相位物镜，FLash4 V2 CMOS相机(滨松)，使用NIS软件进行图像采集。使用50％功率的Fluo LED Spectra X光源在488nm和560nm激发波长下进行采集。由TAPs产生的sfGFP的曝光设置为50毫秒，mCherry的曝光设置为50毫秒；RecA-GFP为100毫秒；HU-mCherry为100毫秒；DnaN-mCherry为100毫秒。
图像分析。使用带有MicrobeJ插件的Fiji软件进行定量图像分析(Ducret等人，2016年)。使用MicrobeJ的手动编辑界面来优化细胞检测，并自动提取和绘制平均荧光强度、偏度和细胞长度参数。我们通过分析TAP(sfGFP或mCh)赋予的荧光信号的增加来定义TAP采集的时间(时间t＝0)。当在转化接合细胞中观察到15％的sfGFP或30％的mCherry荧光增加时，质粒采集得到验证。然后根据定义的t＝0对齐每个细胞的荧光图谱，以生成图2a、2b、2c、2d、3c所示的图。
流式细胞术
如接合测定部分所述，在0.1μm过滤LB中进行接合。在90分钟和180分钟时，将接合混合物在0.1μm过滤LB中稀释至A600为0.03，并在Attune NxT声聚焦流式细胞仪上以25μl/min的流速进行分析。在适当的PMT设置下采集正向散射(FSC)、侧向散射(SSC)以及荧光信号BL1(sfGFP)和YL2(mCherry)，用AttuneTM NxT分析软件表示。为了证实TAPs中Cas9或dCas9组成型表达无毒性，我们比较了含有Cas9基因或dcas9基因的大肠杆菌MS388/TAP，或者不含任何cas9基因的大肠杆菌MS388/TAP的生长情况。这些菌株在0.1μm过滤的LB中过夜生长，并稀释到A600为0.05。它们在8小时内生长，并通过0、2、4、6和8小时的电镀测定估计A600和CFU/ml。同时，在1小时、2小时和5小时30分，以25μl/min的流速，在Attune NxT声聚焦流式细胞仪上分析菌株。使用AttuneTM NxT软件采集并表示正向散射(FSC)。
TAP-逃逸突变体的分析
在大肠杆菌中。将31个TAP逃逸突变体在补充有X-Gal和IPTG的培养基上划线，以确定它们的LAC表型。表现出lac+表型的TAP-逃逸突变体被归类为“蓝色”，其他被归类为“白色”。为了确定获得了修饰靶向lacZ2基因座的点突变或缺失，用OL240和OL654进行PCR，该PCR在wt菌株中扩增出包含lacZ2基因座的748pb片段。对于未表现出lacZ2基因座缺失但仍具有活性TAP CRISPR系统的逃逸突变体，对PCR产物进行测序并鉴定突变。还用OL655和OL656进行了PCR，以扩增lacZ2周围的较大片段，并观察到如前所述的巨大缺失(Cui和Bikard，2016)。为了确定从逃逸突变体中提取的TAP的活性，如接合试验部分所述，在TAP-逃逸突变体和大肠杆菌MS388 lac+菌株之间进行接合。同时，如转化试验部分所述，通过转化为lac+和lac-菌株，来验证使用Machery
Figure BDA0004175047600000571
质粒试剂盒从逃逸突变体中提取的TAPs的活性。对7个失活TAPs进行测序，以鉴定使CRISPR系统失活的突变。
鼠类柠檬酸杆菌(C.rodentium.)。对于20个TAP-Cas9-Cr1-逃逸突变体，使用OL686和OL687进行PCR，以确定染色体基因座的缺失。为了验证来自鼠类柠檬酸杆菌TAP-逃逸突变体的TAPs的CRISPR活性，在鼠类柠檬酸杆菌突变体和大肠杆菌MS388菌株之间进行了5小时接合，以产生新的大肠杆菌TAPs供体。然后在24小时内，在这些新的供体和新鲜的鼠类柠檬酸杆菌受体之间进行接合，并涂布以筛选受体和转化接合子。为了证实从鼠类柠檬酸杆菌逃逸突变体中分离的TAPs的活性，使用Machery Nagel
Figure BDA0004175047600000581
质粒试剂盒提取TAPs，并通过电穿孔(2.5kV)转化到用10％蔗糖处理的wt鼠类柠檬酸杆菌细胞中。在37℃孵育1小时后，将细胞涂布在补充或不补充Kan的LB-琼脂上，以评估转化效率。对从逃逸克隆中分离出的两个非活性TAP-Cas9-Cr1和两个非活性TAP-Cas9-Cr22进行测序。
CSTB算法
CSTB网络服务能够在跨越广泛的细菌基因组和质粒中进行CRISPR基序的比较分析。目前认为的基序是18到23个碱基对长的NGG锚定序列。CSTB后端数据库索引了2914个完整基因组中存在的所有CRISPR基序，其在RefSeq(03/12/20)的第99版中被标记为代表性或参考。此外，添加了7个细菌基因组和5个感兴趣的质粒。细菌基因组中不同基序的平均数为55923(最小值为5719，最大值为2729570)。基因组根据NCBI分类法(07/22/20)进行分类。通过使用以下程序处理相应的完整fasta，将每个基因组插入基序数据库中。首先，检测所有满足CRISPR基序正则表达式的词，并将其染色体坐标存储在基序数据库中。其次，使用我们开发的每基2位编码软件[https://github.com/glaunay/crispr-set]，将所有唯一的词转换为整数表示。然后，将这些整数在每个基因组唯一的平面文件中排序。将CRISPR基序作为整数进行索引，可以在计算上有效地比较几种生物体的基序集。最后，将原始fasta文件添加到blast数据库中。所有相关软件都可以在https://github.com/MMSB-MOBI/CSTB_ database_manager中免费获得。CSTB输入界面显示2914个基因组，可作为两个分类树进行搜索。左侧树允许选择基因组必须具有相同/相似的CRISPR基序的物种。这组基因组定义了靶向的CRISPR基序。同时，右侧树允许选择“被排除的”生物体，这些生物体必须与目标生物体没有共同的基序。满足用户选择的基序组实际上等于从“被排除的”生物体中发现的基序交集中减去所选生物体中发现的基序的并集。根据选择的大小，计算时间从几秒钟到几分钟不等，完成后会发送电子邮件。
所有解决方案的CRISPR基序都呈现在sgRNA序列及其在每个选定的生物体中出现的交互表中。该表具有对基序计数和序列组成进行排序和过滤的功能。这允许容易地选择感兴趣的基序。可以下载整套解决方案的详细信息，或仅下载选定基序的详细信息。这些详细信息以表格文件的形式提供，其中行标有目标生物体中每个sgRNA基序的坐标。或者，用户可以使用基于基因组的方法来探索结果。因此，每个目标基因组都有其图形视图。该图是所选基因组中溶液sgRNA基序的整个分布的圆形直方图。该图形是交互式的，以显示sgRNA分布的局部分解。可以在https://cstb.ibcp.fr免费访问CSTB网站。
结论：
靶向抗菌质粒(TAPs)模块化设计
TAPs衍生自合成的pSEVA质粒集合7，并携带pBBR1复制起点、抗性基因盒的选择和F质粒转移的oriTF起点(图1a)。因此，TAPs可以通过供体细胞中含有的接合型F-Tn10辅助质粒反式产生的接合机制进行移动(图1b)8、9。我们插入了化脓性链球菌野生型cas9(用于CRISPR活性)或催化死亡的dcas9基因(用于CRISPRi活性)以及由恒定tracrRNA支架和靶特异性crRNA间隔序列组成的向导gRNA序列(图1a)。在一步克隆中改变crRNA间隔序列允许针对任何特定染色体或质粒DNA对TAPs的靶向进行重新编程。可选地，TAPs还携带精良折叠版本的绿色荧光(sfgfp)或从宽宿主范围合成BioFab启动子10中高度表达的mcherry基因，以在显微镜和流式细胞术分析中用作质粒转移荧光报告基因(图1a)。
TAPs CRISPR和CRISPRi活性的验证
我们研究了TAPs诱导有效和特异性Cas9介导的杀伤(CRISPR)或dCas9介导的基因表达抑制(CRISPRi)的能力。首先，使用先前描述的靶向大肠杆菌lacZ基因的lacZ2间隔区证实了TAPs诱导Cas9介导的杀伤的能力。将TAP-Cas9-lacZ2质粒转化lac+MG1655 wt菌株的效率比携带靶lacZ基因座缺失的同源lac菌株低约1000倍。相比之下，含有不靶向大肠杆菌基因组的非特异性(nsp)crRNA间隔区的TAP-Cas9-nsp质粒在lac+和lac-菌株中的转化效率相同。其次，TAPs诱导dCas9介导的CRISPRi活性的能力通过使用csgB间隔区来验证，该间隔区靶向驱动MG1655大肠杆菌突变株OmpR23413中细胞表面卷曲菌毛12产生的csgB启动子。在琼脂板上的刚果红(CR)染色和液体培养基中聚集团块的形成被用作生成卷曲菌毛13、14的直接读数。TAP-dCas9-csgB有效地抑制了OmpR234菌株产生卷曲菌毛，这通过在CR存在下白色菌落的形成和无法形成聚集块来反映。相比之下，非特异性TAP-dCas9-nsp对OmpR234菌株中的卷曲菌毛的形成或聚集没有影响。此外，我们证实，来自TAPs的Cas9或dCas9的组成型产物不会引起生长缺陷或拉长的细胞形态，这与某些系统15-18中报道的毒性效应相反。这些结果表明，TAPs诱导Cas9介导的杀伤或dCas9介导的基因表达抑制的能力是有效的，并且取决于间隔序列的准确靶向。
TAPs介导的靶向受体细胞的杀伤
接下来，我们研究了TAPs通过接合转移并在大肠杆菌受体细胞中诱导抗菌活性的能力。使用含有F-Tn10辅助质粒和TAP-Cas9-nsp或TAP-Cas9-lacZ2可移动质粒的大肠杆菌MG1655供体菌株进行接合。使用流式细胞仪分析，我们量化了这些TAPs(携带sfGFP绿色荧光报告基因)在lac+受体菌株中的转移效率，该菌株产生编码在染色体上的红色荧光组蛋白样蛋白HU-mCherry。表现出红色和绿色组合荧光的转化接合子的定量表明，TAP-Cas9-nsp和TAP-Cas9-lacZ2在交配3小时后均转移到约65％的受体细胞群中(图1c)。正如所预期的，TAPs转移需要在供体菌株中存在F-Tn10质粒。最重要的是，与TAP-Cas9-nsp转化接合子相比，接合混合物的平行铺板显示，TAP-Cas9-lacZ2转化接合子的存活率降低了约3.5个对数级(图1d)。这种杀伤活性还体现在与TAP-Cas9-lacZ2供体菌株交配的三个小时内，受体细胞总数没有增加，而与TAP-Cas9-nsp供体菌株相比增加了约20倍(图1e)。重要的是，当使用缺乏靶向lacZ基因座的同基因lac受体菌株时，没有观察到任何TAPs的杀伤作用。这些结果表明，TAP-Cas9-nsp和TAP-Cas9-lacZ2通过F-Tn10接合机制以相同的效率转移。然而，获得TAP-Cas9-lacZ2而非TAP-Cas9-nsp，与转化接合细胞的活力丧失有关。
使用活细胞影像显微镜，我们表征了受体细胞对TAPs采集的细胞反应(图2)。在这些试验中，TAPs携带sfGFP报告系统，该系统赋予供体和转化接合细胞绿色荧光。lac+受体细胞产生类核结合蛋白HU-mCherry，其定位揭示了染色体的整体结构。正如所预期的，通过在红色受体细胞中产生sfGFP绿色荧光来报告的TAP-Cas9-nsp的获得对生长、细胞形态或类核组织没有影响(未显示)。相比之下，TAP-Cas9-lacZ2的获得触发了类核的快速分解，生长成非结构化的DNA块，随后细胞丝化和偶尔的细胞裂解(图2a-b)。此外，我们分析了RecA-GFP融合蛋白在受体细胞中的定位模式，据报道，该融合蛋白在DNA损伤诱导下聚合成胞内大结构19。在该试验中，TAPs携带mCherry报告系统，该系统赋予供体和转化接合细胞红色荧光。图像分析显示，获得了TAP-Cas9-lacZ2(未显示)，而非TAP-Cas9-nsp(未显示)，随后是细胞丝化(图2c)以及RecA-GFP聚合，其使用荧光偏度分析进行定量(图2d，参见方法)。类核体分裂、细胞丝化和RecA-GFP束形成证实了TAP-Cas9-lacZ2获得后是CRISPR介导的DSB诱导，导致转化接合子死亡。
TAPs介导的大肠杆菌混合受体种群中的选择性杀伤
我们在由靶向lac+和非靶向lac-大肠杆菌菌株组成的混合受体群体中验证了TAPs介导的杀伤的特异性。我们观察到，当使用TAP-Cas9-lacZ2时，与lac-转化接合子相比，活的lac+转化接合子减少了约4对数倍，而使用TAP-Cas9-nsp时没有观察到差异(图3a)。TAP-Cas9-lacZ2特异性杀伤活性还表现为靶向lac+受体总种群的停滞，而非靶向lac-群体则能够在交配的六个小时期间增长(图3b)。我们进行了活细胞显微成像，其中lac+和lac-受体分别通过类核相关HU-mCherry和复制体相关DNA夹DnaN-mCherry的典型定位模式来区分。延时分析表明，两种菌株都接受到绿色荧光增加报告的质粒，然而只有靶向lac+转化接合子表现出细胞丝化，这是Cas9介导的DNA损伤诱导的症状(图3c)。这些结果概括了当使用单个受体菌株时获得的效果，并证明TAPs在混合群体中实现了靶向菌株的选择性杀死。
TAP-逃逸突变体分析
TAP-Cas9-lacZ2的转移与lac+转化接合细胞约3.5个对数位的存活力损失相关，然而我们注意到尽管获得了TAP，仍有一部分转化接合子能够存活(图1d)。对31个逃逸TAP-Cas9-lacZ2活性克隆的基因分型和序列分析，揭示了两种类型的逃逸突变体。三分之一的(31个中有12个)在质粒产生的cas9基因中获得转座酶或IS插入，从而使CRISPR系统失活。如前所述11，三分之二的获得了修饰靶lacZ染色体基因座的突变，或者是通过小或大的缺失(31个中的12个)，或者是通过PAM(31个中的7个)种子区的单点突变，这被证明是Cas9-gRNA复合体20识别的关键。
针对碳青霉烯类耐药人群的TAPs
接合型质粒是细菌多重耐药性传播的主要贡献者21，对碳青霉烯类耐药的菌株是临床密切关注的问题22。IncL/M pOXA-48a质粒携带编码OXA-48碳青霉烯酶的blaOXA-48基因，该基因赋予对碳青霉烯类和其他β-内酰胺类(如亚胺培南和青霉素)的抗性23。我们设计了靶向pOXA-48a的TAPs，并评估了其对质粒携带群体对氨苄青霉素敏感的能力。使用靶向blaOXA-48基因5'-末端的OXA48间隔区，我们构建了TAP-Cas9-OXA48在pOXA-48a上诱导Cas9介导的DSB，以及构建了TAP-dCas9-OXA48以通过CRISPRi抑制blaOXA-48基因转录(图4a)。将TAP-Cas9-OXA48和TAP-dCas9-OXA48质粒转移到携带pOXA-48a的大肠杆菌受体中，导致氨苄青霉素抗性水平降低约4.5个对数级，而TAP-Cas9-nsp或TAP-dCas9-nsp则没有效果(图4b)。出乎意料的是，我们观察到，与TAP-dCas9-OXA48相比，当使用TAP-Cas9-OXA48时，在没有氨苄青霉素选择的情况下，获得的活性转化接合子明显较少(图4b)。我们排除了TAP-Cas9-OXA48转移能力下降的可能性，因为所有4个测试的质粒都是由pOXA-48a无质粒的大肠杆菌受体以相似的频率获得的。然而，pOXA-48a质粒序列的分析揭示了存在pemIK毒素-抗毒素(TA)系统，该系统通过抑制不遗传质粒的子代细胞的生长而参与质粒的稳定性24-26。事实上，由于质粒丢失而导致的pemIK表达停滞导致不稳定的PemI抗毒素的快速耗尽，从而其不再能抑制更稳定的PemK毒素的毒性活性。据报道，这种调节使用CRISPR相关的噬菌体疗法来治疗pSHV-18质粒携带的抗生素抗性26。然后，我们假设观察到的TAP-Cas9-OXA48转化接合子活性的降低可能是由于缺失Cas9切割靶向的pOXA-48a的细胞中的PemK毒性作用。通过在TAP-Cas9-OXA48中插入组成型表达的抗毒素pemI基因，证实了这一可能性，该基因导致转化接合子存活率增加了约1.5个对数级，同时保留了对氨苄青霉素抗性的抑制作用(图4b)。
我们进一步研究了携带pOXA-48a与TAP供体接合的菌株的长期抗性演变。我们观察到，虽然TAP-dCas9-nsp没有作用，但TAP-dCas9-OXA48的转移以及由此导致的受体群体对氨苄青霉素的再敏化在24小时后达到平衡。至此，稳定的90％的受体接受了TAP-dCas9-OXA48，并对氨苄青霉素变得敏感。我们假设剩余的10％的氨苄青霉素抗性受体细胞可能仅来自于F-Tn10质粒的获得，从而导致受体细胞中F-编码的排斥系统的建立，并且永久无法通过随后的接合事件中获得TAP。这一假设得到了证实，表明在共培养1天和7天后，存在于群体中的所有氨苄青霉素抗性受体确实含有F-Tn10，但不含有TAP-dCas9OXA47。调节可移动TAPs的转移效率的一种方法是通过删除F质粒的转移起源来防止其转移。首先，这将阻止仅获得F质粒以及随后在受体细胞中建立排斥机制。其次，仅接受TAP的受体细胞由于缺乏F编码的接合机制而无法将TAP传递给其他受体细胞。在这种情况下，预计TAPs的传播会更慢，但可能会传播到群体中的所有受体细胞。
pOXA-48a是一种在肠杆菌科中传播的自主接合质粒，增加了含有pOXA-48a的受体在交配期间将氨苄青霉素抗性转移给TAPs供体的可能性。我们观察到氨苄青霉素抗性确实传递给约0.2％和0.12％的携带TAP-dCas9-nsp或TAP-Cas9-nsp的供体(图4c)。然而，携带TAP-dCas9-OXA48或TAP-Cas9-OXA48的供体无法获得氨苄青霉素抗性(图4c)。假设pOXA48转移的效率对细胞中TAPs的存在不敏感，该结果表明，即使获得了pOXA48质粒，针对OXA48的TAPs阻碍抗性的发展。我们通过在接合混合物中使用额外的无质粒的受体wt菌株(R#2)进行相同的接合试验来测试这种可能性(见图4d中的图表)。在接受TAP-Cas9-nsp或TAP-dCas9-nsp的R#2细胞中，分别有约0.24％和0.15％产生氨苄青霉素抗性。然而，在接受TAP-Cas9-OXA48或TAP-dCas9-OXA48(图4d)的R#2细胞中没有观察到氨苄青霉素抗性。总之，这些结果表明，针对blaOXA-48基因的TAPs是使携带pOXA-48a的菌株对氨苄青霉素敏感的有效策略。此外，TAPs似乎还通过保护供体和其他无质粒的受体免于产生抗性来阻止抗性的传播。
CSTB软件：靶向多物种细菌种群中的特定菌株
在不影响其他细菌菌株的情况下，设计对特定细菌物种具有抗菌活性的TAPs，需要对存在于靶生物基因组中，但不存在于其他非靶菌株基因组中的间隔序列进行可靠的识别。由于没有此类工具来完成这项任务，我们开发了一种“Crispr细菌搜索工具”CSTB算法，该算法能够在宽范围的细菌基因组和质粒中对约18-23nt长的间隔序列进行比较分析。CSTB后端数据库对这些基序索引，这些基序存在于根据NCBI分类法分类的2919个完整基因组中。CSTB允许识别适当的间隔序列，以针对靶染色体或质粒DNA中的独特或多个位点对TAP进行重新编程。我们要求CSTB算法生成针对附着/去除(A/E)病原体鼠类柠檬酸杆菌菌株ICC168(Cr间隔区)的间隔序列，或肠致病性大肠杆菌EPEC菌株E2348/69(EPEC间隔区)，或医院病原体阴沟肠杆菌(Ecl间隔区)，或其中三种(EEC间隔区)，而不靶向数据库中存在的任何其他细菌基因组。针对鼠类柠檬酸杆菌的TAPs携带靶向独特基因座的Cr1间隔区，或靶向分布于整个基因组的22个基因座的Cr22间隔区。从大肠杆菌供体转移TAP-Cas9-Cr1可将鼠类柠檬酸杆菌转化接合细胞的存活率降低了4个对数级。活细胞显微镜检查显示，TAP-Cas9-Cr1的获得诱导了鼠类柠檬酸杆菌丝化和裂解，而TAP-Cas9-nsp没有诱导鼠类柠檬酸杆菌的生长缺陷。这表明，正如在大肠杆菌中观察到的，Cas9对单个DSB的诱导对鼠类柠檬酸杆菌是致命的。一致地，通过TAP-Cas9-Cr22靶向22个染色体基因座可产生相当的转化接合子杀伤效率。然而，多重靶向使转化接合子逃逸到TAPs活性的机制的贡献失衡。对逃脱Cr1单一靶向的20个克隆的分析显示，靶向染色体基因座的缺失或TAP上的CRISPR系统失活的比例相同。相比之下，绝大多数(20个中的19个)逃脱Cr22多重靶向的克隆携带使TAPCRISPR系统失活的突变。这与预测一致，即同一呼叫(the same call)内的22个靶向染色体位点的突变即使可能也极少发生。
通过F接合机制的TAP转移对MG1655大肠杆菌实验室菌株非常有效，在交配3小时内效率高达90％(图1)。我们量化了非实验室菌株中TAP-Cas9-nsp转移的效率，并观察到受体之间的差异，与MG1655大肠杆菌相比，TAP的获取频率总体下降了约700至900倍(图5a)。为了解释这种可变性，我们将对TAP-Cas9-Cr1、-Ecl、-EPEC和-EEC中获得的活性转化接合子(viable transconjugants)的频率标准化为相应细菌菌株中TAP-Cas9-nsp转化接合子的频率(图5b)。我们量化了TAP-Cas9-Cr1仅在鼠类柠檬酸杆菌中引起接合活性丧失，TAP-Cas9-Ecl在阴沟肠杆菌中引起接合活性丧失，TAP-Cas9-EPEC在大肠杆菌EPEC中引起接合活性丧失，而TAP-Cas9-EEC则针对这三种致病菌。作为对照，我们发现共生大肠杆菌HS受体，其基因组不受任何间隔序列的靶向，不受这些抗菌TAPs的影响(图5b)。这些结果表明，通过CSTB算法生成的间隔序列允许对TAPs进行有力的重新编程，从而对单物种受体群体具有高效和菌株特异性的抗菌活性。这也表明一个特定的TAP可以同时针对几个物种。
接下来，我们研究了TAPs在由等比例的三种致病菌株和共生大肠杆菌HS组成的多菌种受体群体中诱导菌株特异性抗菌活性的能力(图5c)。与TAP-Cas9-nsp交配3小时后获得的转化接合子的比例不同(图5d)，反映了TAP在不同受体菌株间的转移效率(图5a)。我们观察到在多物种受体混合物中，TAP-Cas9-Cr1显著降低了鼠类柠檬酸杆菌转化接合子的存活率，TAP-Cas9-Ecl显著降低了阴沟肠杆菌转化接合子的活力，TAP-Cas9-EPEC显著降低了大肠杆菌EPEC的活力，而这3个菌种均受到三重靶向TAP-Cas9-EEC的影响。对照共生大肠杆菌HS的转化接合子的活力不受任何抗菌TAP的影响(图5d)。这些结果验证了TAPs在多物种混合受体群体中实现选择性杀伤，而不影响非目标物种。尽管抗菌TAP选择性地影响转化接合子群体的生存能力，但由于TAP转移到致病受体菌株的效率有限，以及这些菌株在接合混合物中的竞争中的差异适应性，因此它们的活性并未显著反映在每个物种的总受体计数中。
讨论：
用于原位微生物群操作的工具目前还处于起步阶段。在这里，我们证明了TAP抗菌策略在体外多物种群体中发挥高效和菌株特异性抗菌活性的能力。TAPs的选择性杀伤活性诱导受试物种的活力损失约4个对数级。靶向pOXA48a碳青霉烯抗性质粒的TAPs导致菌株对药物的敏感性增加4至5个对数级。目前正在开发的大多数CRISPR递送方法集中在噬菌体的使用上，噬菌体本质上的宿主范围很窄27。此外，最近的几项研究成功地使用了宽宿主范围的RK2接合系统在体外传递靶向大肠杆菌26、28-30或肠道沙门菌的CRISPR系统。与这些方法相比，我们的策略的一个关键优势是CSTB算法赋予的多功能性，该算法能够可靠地鉴定gRNA，该gRNA应当用于针对一种或多种感兴趣的细菌菌株特异性地重新靶向TAPs，而不靶向其他物种。尽管有许多程序致力于CRISPR基序的鉴定，但目前为止，CSTB还没有类似的程序32。通过在一步克隆中改变间隔序列，可以快速简便地对TAPs重新编程(参见方法)。TAPs的另一个优点是组成型表达来自启动子的CRISPR系统(和荧光报告基因)，该系统在肠杆菌科细菌中广泛存在。由于不需要外部诱导物，因此TAP方法更适合于体内天然细菌群落的修饰。
我们的工作还表明，TAPs效率主要由两个主要限制因素决定。第一个限制因素是约10-4-10-5频率的逃逸克隆获得使质粒携带的cas9基因失活的突变，或修饰靶序列的突变。如鼠类柠檬酸杆菌所示，后一种逃逸机制可以通过靶向靶细菌基因组上的多个位点来避免。另一种策略是靶向必需基因，因为它们的突变对宿主细菌来说往往是致命的33。第二个限制参数是TAPs向目标菌株转移的效率。迄今为止，所有使用接合的抗菌28、34或抗药物29、30、35方法都基于incP RK2接合系统，该系统提供了宽的宿主范围，但转移效率低(10-4-10-5)。Hamilton等人已经展示了一种在体外使用玻璃珠提高转移效率的人工方法31。本发明中，我们使用F质粒作为辅助质粒，介导相对有效的TAPs转移(10-1-102)到密切相关的肠杆菌科。因此，TAPs似乎适合于靶向一系列临床相关的致病或耐药细菌(大肠杆菌(E.coli)、柠檬酸杆菌属(Citrobacter)、肠杆菌属(Enterobacter)、克雷伯氏菌属(Klebsiella)、沙门菌(Salmonella)、耶尔森氏菌属(Yersinia)、志贺氏菌属(Shigella)、肠杆菌科沙雷菌属(Serratia)……)。使用TAPs靶向系统发育距离远的物种，将需要开发具有增强转移能力的宽宿主范围接合系统。通过Tn-seq方法36、37已经成功地分离了这种超扩散质粒突变体，为扩大TAPs可以定向的细菌范围提供了一个有价值的选择。
将目前的体外概念证明转化为原位环境将代表以定向方式发展用于原位操作微生物群组成的非抗生素策略的重要一步。TAPs可用于抑制来自受感染宿主或环境的有害致病性和抗性菌株，或通过抑制毒力效应基因或参与生物膜形成的基因作为抗毒力策略。TAPs方法在临床或环境设置中的未来适用性将需要考虑对GMO、CRISPR和生物防逃逸的快速发展的监管38-40。
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在本申请中，各种参考文献描述了本发明所属的现有技术的现状。这些参考文献的公开内容通过引用并入本公开中。
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Claims (28)

1.一种靶向抗菌质粒(TAP)，包括
i)复制起点，ii)转移起点，iii)编码核酸酶的基因工程核酸序列，和iv)一个或多个编码向导RNA分子的基因工程核酸序列。
2.根据权利要求1所述的质粒，其中，所述复制起点为pBBR1质粒的复制起点，更具体地，所述复制起点由SEQ ID NO:1的核酸序列组成。
3.根据权利要求1所述的质粒，其中，所述转移起点为RP4质粒的oriT位点，更具体地，所述转移起点由SEQ ID NO:2的核酸序列组成。
4.根据权利要求1所述的方法，其中，所述转移起点为F质粒的oriTF，更具体地，所述转移起点由SEQ ID NO:3的核酸序列组成。
5.根据权利要求1所述的质粒，其中，所述质粒编码CRISPR相关的核酸内切酶，更具体地，所述质粒编码源自Cas9蛋白的CRISPR/Cas核酸酶。
6.根据权利要求5所述的质粒，其中，Cas9核酸酶包含如SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列。
7.根据权利要求5所述的质粒，其中，编码所述Cas9蛋白的核酸序列由SEQ ID NO:7的核酸序列组成。
8.根据权利要求5所述的质粒，其中，所述CRISPR/Cas核酸酶是有缺陷的Cas9。
9.根据权利要求8所述的质粒，其中，所述有缺陷的Cas9为Cas9切口酶，所述Cas9切口酶包含如SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:6所示的氨基酸序列。
10.根据权利要求9所述的质粒，其中，编码有缺陷的Cas9蛋白的核酸序列由SEQ IDNO:8的核酸序列组成。
11.根据权利要求1所述的质粒，其中，编码所述核酸酶的核酸序列与弱组成型启动子可操作地连接，更具体地，所述编码核酸酶的核酸序列与具有SEQ ID NO:9的核酸序列的弱组成型BBa_J23107启动子可操作地连接。
12.根据权利要求1所述的质粒，其中，所述质粒包含2个、3个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个或10个编码所述向导RNA分子的核酸序列。
13.根据权利要求1所述的质粒，其中，由本发明所述的质粒编码的所述向导RNA分子包括间隔序列(即crRNA)和反式激活RNA(“tracrRNA”)序列。
14.根据权利要求13所述的质粒，其中，所述间隔序列靶向抗生素抗性基因，或者，所述间隔序列被设计为在靶序列中产生DSB。
15.根据权利要求13所述的质粒，其中，所述间隔序列由选自表A的核酸序列编码。
16.根据权利要求1所述的质粒，其中，编码所述向导RNA分子的核酸序列与强组成型启动子可操作地连接，更具体地，编码所述向导RNA分子的核酸序列与具有SEQ ID NO:26的核酸序列的强组成型BBa_J23119启动子可操作地连接。
17.根据权利要求1所述的质粒，所述质粒任选地包含一个或多个选择标记。
18.根据权利要求1所述的质粒，所述质粒由SEQ ID NO:27或28中所示的核酸序列组成。
19.一种供体细菌细胞，包括权利要求1所述的靶向抗菌质粒的拷贝数。
20.根据权利要求19所述的供体细菌细胞，所述供体细菌细胞还包括共轭质粒的拷贝数。
21.根据权利要求20所述的供体细菌细胞，所述供体细菌细胞包含F因子的拷贝数和包含F质粒的起始转移的靶向抗菌质粒的拷贝数。
22.根据权利要求20所述的供体细菌细胞，所述供体细菌细胞包含RP4质粒的拷贝数和包含RP4质粒的起始转移的靶向抗菌质粒的拷贝数。
23.根据权利要求19所述的供体细菌细胞，所述供体细菌细胞是非致病性的，更具体地，所述供体细菌细胞是益生菌细胞。
24.一种用于杀死多个受体细菌细胞的方法，包括将所述多个受体细菌细胞暴露于多个供体细菌细胞中，所述供体细菌细胞包含权利要求1所述的靶向抗菌质粒的拷贝数，所述靶向抗菌质粒被配置为在所述多个受体细菌细胞中表达核酸酶以及表达一个或多个向导RNA分子，其中，所述核酸酶和所述向导RNA分子在所述多个受体细菌细胞中的转移和表达对于所述多个受体细菌细胞是致命的。
25.根据权利要求24所述的方法，其中，所述受体细菌细胞是病原菌。
26.权利要求24所述的方法，所述方法用于治疗多种细菌感染或与细菌相关的不良病症。
27.一种治疗由包含抗生素抗性基因的细菌细胞引起的受试者感染的方法，其中，所述方法包括向受试者施用治疗有效量的抗生素以及治疗有效量的细菌供体细胞，所述细菌供体细胞包含靶向抗菌质粒的拷贝数，所述靶向抗菌质粒编码一个或多个适于靶向抗生素抗性基因的向导RNA分子，从而使所述抗生素抗性基因失活并使所述细菌细胞对所述抗生素敏感。
28.一种组合物，所述组合物包含一定量的权利要求19所述的供体细菌细胞。
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