KR102630802B1 - 증가된 단백질 함량 및 스트레스에 대한 저항성을 위한 nf-yc4 프로모터 내 전사 리프레서 결합 부위의 변형 - Google Patents

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KR102630802B1
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Abstract

전사 리프레서 결합 부위를 변형시키는 것을 포함하는, NF-YC4 유전자를 포함하는 진핵 세포에서 단백질 함량을 증가시키는 방법; 증가된 단백질 함량을 위해 교배 및 선택하는 것을 포함하는, 증가된 단백질 함량을 갖는 식물을 생산하는 방법; 단독으로 전사 리프레서 결합 부위를 변형시키거나 또는 추가로 식물에서 QQS를 발현하는 것과 조합하여 전사 리프레서 결합 부위를 변형시키는 것을 포함하는, NF-YC4 유전자를 포함하는 식물에서 병원체 또는 해충에 대한 저항성을 증가시키는 방법; 병원체 또는 해충에 대한 증가된 저항성을 위해 교배 및 선택하는 것을 포함하는, 병원체 또는 해충에 대한 증가된 저항성을 갖는 식물을 생산하는 방법; NF-YC4 유전자가, 전사 리프레서가 NF-YC4의 전사를 방지할 수 없도록 변형된 전사 리프레서 결합 부위를 포함하는 프로모터를 포함하는 것인 세포, 세포의 집합, 조직, 기관 또는 유기체; 잡종 식물; 및 종자.

Description

증가된 단백질 함량 및 스트레스에 대한 저항성을 위한 NF-YC4 프로모터 내 전사 리프레서 결합 부위의 변형
연방 후원 연구 또는 개발에 관한 진술
본원에 기재된 연구는 MCB 어워드 번호 0209789 및 0951170 하의 국립 과학 재단으로부터의 승인에 의해 적어도 부분적으로 지원되었다. 따라서, 미국 정부는 본 발명에 특정 권리를 갖는다.
기술 분야
본 개시내용은 진핵 세포에서 단백질 함량을 증가시키는 것, 스트레스, 예컨대 비생물적 (예를 들어, 염, 가뭄 및 오염) 또는 생물적 (예를 들어, 병원체 및 해충) 스트레스에 대한 식물의 저항성을 증가시키는 것, 전사 리프레서가 유전자 NF-YC4의 전사를 방지할 수 없도록 변형된 전사 리프레서 결합 부위를 갖는 프로모터, QQS, TALENS, CRISPR/Cas9, 조직 배양, 교배 및 역교배 식물, 잡종 식물, 재생가능한 세포, 및 종자에 관한 것이다.
단백질 결핍은 개발도상국 전체에 걸쳐 주요 건강 문제이다. 낮은 단백질 흡수는 매년 수억명의 소아에서 정신 지체, 발육부진, 질환에 대한 감수성, 소모성 질환 및/또는 사망의 원인이 된다 (Forrester et al., PloS one 7: e35907 (2012); Gomes et al., J. Neuroscience Res. 87: 3568-3575 (2009)).
식물은 인간 식이 단백질의 60% 초과를 제공한다 (Young et al., Am. J. Clin. Nutr. 59: 1203S-1212S (1994)). 특히 동물을 사용하여 등가량의 단백질을 생산하는데 약 100배 더 많은 물 및 11배 더 많은 에너지가 요구되는 경우에, 주된 작물의 단백질 함량을 증가시키는 것은 단백질 결핍을 완화하는 것을 도울 수 있고 (Pimentel et al., Am. J. Clin. Nutr. 78: 6605-6635 (2003)), 동물의 단백질 함량을 증가시키는 것은 종종 단백질 품질 또는 수율의 감소를 동반한다 (Bellaloui et al., Agricultural Sciences 1: 110-118 (2010); Wenefrida et al., J. Agricultural Food Chem. 61: 11702-11710 (2013)).
아라비돕시스 탈리아나(Arabidopsis thaliana) QQS (At3g30720, 쿠아-퀸 전분) 고아 유전자는 아라비돕시스에서 단백질 함량을 조정한다. 야생형 (WT) 대조군 계통과 형태학상 유사하지만 전분 수준이 상이한 아라비돕시스 탈리아나 전분 신타제 3 (Atss3) 돌연변이체 (Zhang et al., Plant Physiol. 138: 663-674 (2005))는 WT에서 발견된 QQS 전사체 양의 5배 초과를 갖는다 (Li et al., Plant J. 58: 485-498 (2009)). 아라비돕시스에서 QQS의 과다-발현은 잎에서 총 단백질 함량을 증가시키고 총 전분 함량을 감소시키며, 반면에 QQS의 하향-조절은 반대 효과를 갖는다 (Li et al., Plant Biotech. J. 13: 177-187 (2015); Li et al. (2009), 상기 문헌). 트랜스진으로서의 QQS의 발현은 다른 식물, 예컨대 대두에서 단백질 함량을 증가시킨다 (변종 윌리암스 82; Li et al. (2014), 상기 문헌; Li et al. (2009), 상기 문헌).
QQS 발현은 다양한 발생적, 환경적 및 유전적 교란과 치밀하게 연결되어 있는 것으로 관찰되었다 (예를 들어, [Arendsee et al., Trends in Plant Sci doi:10.1016/j.tplants.2014.07.003 (2014); Li et al. (2009), 상기 문헌; 및 Li et al. (2015), 상기 문헌] 참조). 그러나, 이러한 교란에서의 그의 역할은 규명되지 않았다. 예를 들어, PEN3 (침투 저항성 3 (At1g59870, PEN3, ABC 결합 카세트 수송체 유전자))은 진균 및 난균 병원체에 대한 비-숙주 저항성을 부여한다. QQS는 pen3 녹아웃 (KO) 돌연변이체에서 상향-조절되는 유일한 유전자인 것으로 보고되었지만; 그러나, QQS는 감염 및 비-감염 돌연변이체에서 상향-조절된다 (Stein et al., Plant Cell 18(3): 731-746 (2006)). 또 다른 예로서, 2종의 신탁신, 즉 SYP121 (At3g11820, PEN1) 및 SYP122 (At3g52400)는 흰가루병에 대한 저항성을 부여한다. 이들 유전자의 녹아웃은 이들 병원체에 대한 증가된 감수성을 유발하며; QQS는 둘 다에서 상향-조절되는 유일한 유전자인 것으로 보고되었다 (Zhang et al. (2008)). 대조적으로, PEN3 및 EXL1이 일부 병원체에의 노출 후 상향-조절되지만, QQS는 일부 병원체, 예컨대 슈도모나스 시린가에(Pseudomonas syringae)에 의한 감염에 반응하여 하향-조절된다 (Kwon et al., Planta 236(3): 887-900 (2012); 및 Thilmony et al., Plant J. 46(1): 34-53 (2006)). 아라비돕시스 식물이 피토프테라 인페스탄스(Phytopthera infestans)로 접종되었을 때, QQS는 보고된 바로는 먼저 접종후 6시간에 하향-조절된 다음, 접종후 12 및 24시간에 상향-조절되었다 (Scheel et al., Experiment ID "E-GEOD-5616" in ArrayExpress).
따라서, 상기를 고려하여, QQS가 상호작용하는 유전자를 확인하는 것이 본 개시내용의 목적이다. 아라비돕시스에서 QQS는 핵 인자 Y, 서브유닛 C4 (NF-YC4, At5g63470)와 상호작용한다. 그렇게 확인된 유전자를 조작하기 위한 물질 및 방법을 제공하는 것이 또 다른 목적이다. 한 실시양태에서, 이러한 유전자의 조작은 증가된 단백질 함량 및/또는 감소된 탄수화물 함량을 유발한다. 병원체 또는 해충에 대한 식물의 저항성을 증가시키기 위한 물질 및 방법을 제공하는 것이 또 다른 목적이다. 이들 및 다른 목적, 뿐만 아니라 본 발명의 특색은 본원에 제공된 상세한 설명으로부터 분명해질 것이다.
전사 리프레서 결합 부위를 포함하는 프로모터를 포함하는 NF-YC4 유전자를 포함하는 진핵 세포에서 단백질 함량을 증가시키는 방법이 제공된다. 방법은 전사 리프레서 결합 부위를 변형시켜, 전사 리프레서가 NF-YC4의 전사를 방지할 수 없도록 하는 것을 포함한다. 진핵 세포에서의 단백질 함량은 증가되며; 따라서, 방법은 증가된 단백질 함량을 선택하는 것을 추가로 포함할 수 있다. 방법은 진핵 세포로부터 세포의 집합, 조직, 기관 또는 유기체를 생성시키는 것을 추가로 포함할 수 있다. 진핵 세포는 세포의 집합, 조직, 기관 또는 유기체의 부분일 수 있다. 유기체는 식물, 예컨대 작물 식물, 예컨대 대두, 벼, 옥수수 등일 수 있다. 식물은 단자엽 또는 쌍자엽일 수 있다. 전사 리프레서 결합 부위는 결실에 의해 변형될 수 있다. 전사 리프레서 결합 부위는 ERF 모티프, RAV1 모티프, 또는 ERF 모티프 및 RAV1 모티프 둘 다를 포함하거나, 이로 본질적으로 이루어지거나, 또는 이로 이루어질 수 있다. 진핵 세포는 벼 세포일 수 있고, (i) 2개의 ERF 모티프가 결실되거나, (ii) RAF1 모티프가 결실되거나, 또는 (iii) RAV1 모티프 및 ERF 모티프가 결실된다. 진핵 세포는 대두 세포일 수 있고, (i) 2개의 RAV1 모티프가 결실되거나, 또는 (ii) RAV1 모티프 및 ERF 모티프가 결실된다. ERF 모티프, RAV1 모티프, 또는 ERF 모티프 및 RAV1 모티프 둘 다는 TALENS 또는 CRISPR/Cas9를 사용하여 결실될 수 있다.
증가된 단백질 함량을 갖는 식물을 생산하는 방법이 또한 제공된다. 방법은 상기 방법에 따라 수득된 식물을 제2 식물과 교배하여 자손 식물을 생산하고, 증가된 단백질 함량을 갖는 자손 식물을 선택하는 것을 포함한다. 방법은 선택된 자손 식물을 제2 식물과 교배하여 역교배 자손 식물을 생산하고, 증가된 단백질 함량을 갖는 제1 역교배 자손 식물을 선택하여 선택된 역교배 자손 식물을 생산하고, 교배 및 선택을 3회 이상 반복하여 증가된 단백질 함량을 갖는 역교배 자손 식물을 생산하는 것을 추가로 포함할 수 있다.
NF-YC4 유전자가, 전사 리프레서가 NF-YC4의 전사를 방지할 수 없도록 변형된 전사 리프레서 결합 부위를 포함하는 프로모터를 포함하는 것인 세포, 세포의 집합, 조직, 기관 또는 유기체가 또한 제공된다. 세포, 세포의 집합, 조직, 기관 또는 유기체는, NF-YC4 유전자가 변형되지 않은 전사 리프레서 결합을 포함하는 프로모터를 포함하는 것인 상응하는 세포, 세포의 집합, 조직, 기관 또는 유기체와 비교하여 증가된 단백질 함량을 갖는다. 한 실시양태에서, 유기체는 식물 또는 그의 잡종일 수 있다. 상기 언급된 식물 또는 그의 잡종의 종자가 또한 제공된다. 또 다른 실시양태에서, 유기체는 비-인간 동물, 예컨대 가축 동물, 예를 들어 소, 돼지, 닭, 칠면조, 양 및 들소일 수 있다.
전사 리프레서 결합 부위를 포함하는 프로모터를 포함하는 NF-YC4 유전자를 포함하는 식물 세포 또는 식물에서 병원체 또는 해충에 대한 저항성을 증가시키는 방법이 추가로 제공된다. 방법은 병원체 또는 해충에 의한 감염의 위험이 있는 식물 세포 또는 식물에서 NF-YC4 유전자의 프로모터의 전사 리프레서 결합 부위를 변형시켜, 전사 리프레서가 NF-YC4 유전자의 전사를 방지할 수 없도록 하는 것을 포함한다. 병원체 또는 해충에 대한 저항성이 식물 세포 또는 식물에서 증가되며; 따라서, 방법은 병원체 또는 해충에 대한 증가된 저항성을 선택하는 것을 추가로 포함할 수 있다. 방법은 서열식별번호(SEQ ID NO): 16에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 갖는 쿠아-퀸 전분 (QQS) 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 식물 또는 식물 세포 내로 도입하고 그 안에서 발현하는 것을 추가로 포함할 수 있으며, 여기서 뉴클레오티드 서열은 프로모터에 작동가능하게 연결된다. 방법은 식물 세포로부터 식물 또는 그의 부분을 재생시키는 것을 추가로 포함할 수 있다. 전사 리프레서 결합 부위는 ERF 모티프, RAV1 모티프, 또는 ERF 모티프 및 RAV1 모티프 둘 다를 포함할 수 있다. 식물 세포 또는 식물은 벼 세포 또는 벼 식물일 수 있고, (i) 2개의 ERF 모티프가 결실되거나, (ii) RAF1 모티프가 결실되거나, 또는 (iii) RAV1 모티프 및 ERF 모티프가 결실된다. 식물 세포 또는 식물은 대두 세포 또는 대두 식물일 수 있고, (i) 2개의 RAV1 모티프가 결실되거나, 또는 (ii) RAV1 모티프 및 ERF 모티프가 결실된다. ERF 모티프, RAV1 모티프, 또는 ERF 모티프 및 RAV1 모티프 둘 다는 TALENS 또는 CRISPR/Cas9를 사용하여 결실될 수 있다. 병원체는 박테리아 또는 바이러스일 수 있다. 해충은 진딧물일 수 있다. 식물은 작물 식물, 예컨대 대두일 수 있다. 식물은 쌍자엽일 수 있다.
병원체 또는 해충에 대한 증가된 저항성을 갖는 식물을 생산하는 방법이 추가로 제공된다. 방법은 상기에 따라 수득된 식물을 제2 식물과 교배하여 자손 식물을 생산하고, 식물 병원체 또는 해충에 대한 증가된 저항성을 갖는 자손 식물을 선택하는 것을 포함한다. 방법은 선택된 자손 식물을 제2 식물과 교배하여 역교배 자손 식물을 생산하고, 병원체 또는 해충에 대한 증가된 저항성을 갖는 제1 역교배 자손 식물을 선택하여 선택된 역교배 자손 식물을 생산하고, 교배 및 선택을 3회 이상 반복하여 병원체 또는 해충에 대한 증가된 저항성을 갖는 역교배 자손 식물을 생산하는 것을 추가로 포함할 수 있다.
병원체 또는 해충에 대한 증가된 저항성을 갖는 식물이 추가로 제공된다. 식물은 전사 리프레서 결합 부위를 포함하는 프로모터를 포함하는 NF-YC4 유전자를 포함한다. 전사 리프레서 결합 부위는 전사 리프레서가 NF-YC4의 전사를 방지할 수 없도록 변형되었다. 상기 식물의 야생형이 QQS를 포함 및 발현하지 않는 한 실시양태에서, 서열식별번호: 16에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 갖는 QQS 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드가 도입 및 발현되었다. 뉴클레오티드 서열은 프로모터에 작동가능하게 연결된다.
상기 언급된 식물의 종자가 또한 식물의 잡종과 같이 제공된다. 잡종 식물의 종자가 또한 제공된다.
도 1a는 QQS를 발현하는 벡터의 맵이다.
도 1b는 아라비돕시스로부터의 NF-YC4를 발현하는 벡터의 맵이다.
도 1c는 대두로부터의 NF-YC4를 발현하는 벡터의 맵이다.
도 1d는 벼로부터의 NF-YC4를 발현하는 벡터의 맵이다.
도 1e는 옥수수로부터의 NF-YC4를 발현하는 벡터의 맵이다.
도 2a, 2b, 2c, 2d, 2e 및 2f는 하기와 같이 본 개시내용과 관련된 서열을 제시한다:
오리자 사티바(Oryza sativa)의 NF-YC4 유전자 (Os03g14669)의 프로모터 영역은 서열식별번호: 1로 제시되며, 여기서 RAV1 모티프 (역방향)는 볼드체로 제시되고, RAV1 (역방향) 및 ERF (정방향) 모티프는 밑줄표시된 볼드체로 제시되고, ERF 모티프 (역방향)는 이탤릭체인 볼드체로 제시된다.
RAV1 (역방향) 모티프 (TGTTG; 서열식별번호: 1에서의 볼드체 참조)가 결실된 오리자 사티바의 NF-YC4 유전자의 프로모터 영역은 서열식별번호: 2로 제시되며, 여기서 RAV1 (역방향) 및 ERF (정방향) 모티프는 밑줄표시된 볼드체로 제시되고, ERF 모티프 (역방향)는 이탤릭체인 볼드체로 제시된다.
RAV1 (역방향) 모티프 및 ERF (정방향) 모티프의 중첩 서열 (TGTTGACT; 서열식별번호: 1에서의 밑줄표시된 볼드체 참조)이 결실된 오리자 사티바의 NF-YC4 유전자의 프로모터 영역은 서열식별번호: 3으로 제시되며, 여기서 RAV1 모티프 (역방향)는 볼드체로 제시되고, ERF 모티프 (역방향)는 이탤릭체인 볼드체로 제시된다.
2개의 ERF 모티프 (역방향)를 함유하는 111 bp 절편 ( AGTCA TCACTGTTCTATGTTCTATCTGCATTTTCCTTGATTTTGTACTTTTCCTGAACGAAAGGACAATCCTTAGCCATCATAATGCTATGATCGACTTATTCTGA AGTCA [서열식별번호: 5]; 서열식별번호: 1에서의 볼드 이탤릭체의 2개의 ERF 및 개재 서열 참조)이 결실된 오리자 사티바의 NF-YC4 유전자의 프로모터 영역은 서열식별번호: 4로 제시되며, 여기서 RAV1 모티프 (역방향)는 볼드체로 제시되고, RAV1 (역방향) 및 ERF (정방향) 모티프는 밑줄표시된 볼드체로 제시된다.
2개의 ERF 모티프 (역방향), RAV1 (역방향) 및 ERF (정방향) 모티프 및 개재 서열을 함유하는 190 bp 절편 (AACGAAAACAGCT TGTTGACT GGCTCCCTAGAGCTTTTT GTAAGTTGATCATCGAAGTAGCTAGTTCTCTTCACTTATC AGTCA TCACTGTTCTATGTTCTATCTGCATTTTCCTTGATTTTGTACTTTTCCTGAACGAAAGGACAATCCTTAGCCATCATAATGCTATGATCGACTTATTCTGA AGTCA [서열식별번호: 7]; 서열식별번호: 1에서의 이탤릭체인 볼드체의 2개의 ERF 모티프 (역방향) 및 밑줄표시된 볼드체의 RAV1 (역방향) 및 ERF (정방향) 모티프, 및 개재 서열 참조)이 결실된 오리자 사티바의 NF-YC4 유전자의 프로모터 영역은 서열식별번호: 6으로 제시되며, 여기서 RAV1 모티프 (역방향)는 볼드체로 제시된다.
글리신 맥스(Glycine max)의 NF-YC4 유전자 (Glyma06g17780)의 프로모터 영역은 서열식별번호: 8로 제시되며, 여기서 ERF 모티프 (역방향)는 이탤릭체인 볼드체로 제시되고, RAV1 모티프 (역방향)는 볼드체로 제시되고, RAV1 모티프 (정방향)는 밑줄표시된 볼드체로 제시된다.
ERF 모티프 (역방향), RAV1 모티프 (정방향) 및 개재 서열 ( AGTCA CATGCCA CAACA [서열식별번호: 10]; 서열식별번호: 8에서의 이탤릭체인 볼드체 및 밑줄표시된 볼드체 참조)이 결실된 글리신 맥스의 NF-YC4 유전자의 프로모터 영역은 서열식별번호: 9로 제시되며, 여기서 ERF 모티프 (역방향)는 이탤릭체인 볼드체로 제시되고, RAV1 모티프 (역방향)는 볼드체로 제시된다.
ERF 모티프 (역방향), RAV1 모티프 (역방향) 및 개재 서열 ( GGTCA GTTTTTGTT AACATTAATTTTTAGGATTATTTGTTG [서열식별번호: 12]; 서열식별번호: 8에서의 이탤릭체인 볼드체 및 볼드체 참조)이 결실된 글리신 맥스의 NF-YC4 유전자의 프로모터 영역은 서열식별번호: 11로 제시되며, 여기서 ERF 모티프 (역방향)는 이탤릭체인 볼드체로 제시되고, RAV1 모티프 (역방향)는 볼드체로 제시되고, RAV1 모티프 (정방향)는 밑줄표시된 볼드체로 제시된다.
2개의 RAV1 모티프 및 개재 서열 (TGTTGGTAATGTAAAAAAAATTAAAAGAAA CAAGATTAAATTACGTATTTAATAATTTAAGATTAATGTTG [서열식별번호: 14]; 서열식별번호: 8에서의 볼드체 참조)이 결실된 글리신 맥스의 NF-YC4 유전자의 프로모터 영역은 서열식별번호: 13으로 제시되며, 여기서 ERF 모티프 (역방향)는 이탤릭체인 볼드체로 제시되고, RAV1 모티프 (역방향)는 볼드체로 제시되고, RAV1 모티프 (정방향)는 밑줄표시된 볼드체로 제시된다.
아라비돕시스 탈리아나 쿠아-퀸 전분 (QQS) cDNA의 뉴클레오티드 서열은 서열식별번호: 15로 제시된다.
아라비돕시스 탈리아나 QQS 단백질의 아미노산 서열은 서열식별번호: 16으로 제시된다.
서열 GGTCAGTTTTTGTTAACATTAATTTTTAGGAT를 갖는, RAV1-A 모티프와 W 박스 모티프 사이의 글리신 맥스의 NF-YC4로부터의 뉴클레오티드 서열은 서열식별번호: 17로 제시된다.
정방향 프라이머 GmNF-YC4Fd: 5'-CCTCCCAGGCATGGCAGTCC-3'는 서열식별번호: 18로 제시된다.
역방향 프라이머 GmNF-YC4Rev: 5'-CCATCAAGGCTCCGCTGG-3'는 서열식별번호: 19로 제시된다.
제아 메이스(Zea mays)의 NF-YC4 유전자의 프로모터 영역은 서열식별번호: 20으로 제시되며, 여기서 2개의 RAV1 모티프 (정방향)는 볼드체로 제시된다.
도 3은 진핵생물의 진화상 다양한 종으로부터의 NF-YC 유전자의 계통수이다.
도 4a는 F3 세대에서 QQS를 발현하는 대두 우량 계통 및 그의 각각의 분리 동기 대조군의 종자 단백질 (%/g 생중량 (13% 수분 함유))에 대한 막대 그래프이다. 각각의 분리 동기 대조군과 비교한 종자 단백질의 퍼센트 증가는 돌연변이체 막대의 상단에 나타나 있다. a=QQS-E 윌리암스 82 형질전환체로부터의 QQS 유전자가 결여되어 있는 분리 동기; b=QQS-E 윌리암스 82 형질전환체; c=IA 우량 계통 또는 윌리암스 82 및 QQS-E 윌리암스 82의 교배로부터의 QQS 유전자가 결여되어 있는 분리 동기 대조군; d=IA 우량 계통 및 QQS-E 윌리암스 82의 교배로부터의 QQS-E 돌연변이체. 스튜던트 t-검정을 사용하여 QQS-E 및 대조군을 비교하였다. **P < 0.01.
도 4b는 F3 세대에서 QQS를 발현하는 대두 우량 계통 및 그의 각각의 분리 동기 대조군의 종자 오일 (%/g 생중량 (13% 수분 함유))에 대한 막대 그래프이다. a=QQS-E 윌리암스 82 형질전환체로부터의 QQS 유전자가 결여되어 있는 분리 동기; b=QQS-E 윌리암스 82 형질전환체; c=IA 우량 계통 또는 윌리암스 82 및 QQS-E 윌리암스 82의 교배로부터의 QQS 유전자가 결여되어 있는 분리 동기 대조군; d=IA 우량 계통 또는 또는 윌리암스 82 및 QQS-E 윌리암스 82의 교배로부터의 QQS-E 돌연변이체. 스튜던트 t-검정을 사용하여 QQS-E 및 대조군을 비교하였다. *P < 0.05. **P < 0.01.
도 4c는 F3 세대에서 QQS를 발현하는 대두 우량 계통 및 그의 각각의 분리 동기 대조군의 종자 섬유 (%/g 생중량 (13% 수분 함유))에 대한 막대 그래프이다. a=QQS-E 윌리암스 82 형질전환체로부터의 QQS 유전자가 결여되어 있는 분리 동기; b=QQS-E 윌리암스 82 형질전환체; c=IA 우량 계통 또는 윌리암스 82 및 QQS-E 윌리암스 82의 교배로부터의 QQS 유전자가 결여되어 있는 분리 동기 대조군; d=IA 우량 계통 또는 또는 윌리암스 82 및 QQS-E 윌리암스 82의 교배로부터의 QQS-E 돌연변이체. 스튜던트 t-검정을 사용하여 QQS-E 및 대조군을 비교하였다. *P < 0.05. *P < 0.01.
도 5a는 QQS를 발현하는 벼 (재배품종 키타케) (QQS-E) 및 그의 야생형 동기 (동기)의 잎 단백질 (%/건조 중량)에 대한 막대 그래프이다. 모든 데이터는 평균 ± SE, n=3을 나타낸다. 스튜던트 t-검정을 사용하여 QQS-E 및 대조군을 비교하였다. **P < 0.01.
도 5b는 QQS를 발현하는 벼 (재배품종 키타케) (QQS-E) 및 그의 야생형 동기 (동기)의 종자 단백질 (%/건조 중량)에 대한 막대 그래프이다. 모든 데이터는 평균 ± SE, n=3을 나타낸다. 스튜던트 t-검정을 사용하여 QQS-E 및 대조군을 비교하였다. **P < 0.01.
도 6은 먹이 + 미끼의 공벡터 (BK+AD), QQS-먹이 + 미끼의 공벡터 (BK+QQS), AtNF-YC4-미끼 + 먹이의 공벡터 (AtNF-YC4+AD), 및 AtNF-YC4-미끼 + QQS-먹이 (AtNF-YC4+QQS)의 리포터 유전자 상대 발현에 대한 막대 그래프이다. *P < 0.05. **P < 0.01.
도 7a는 NF-YC4를 과다-발현하는 아라비돕시스 (AtNF-YC4-OE) 및 야생형 아라비돕시스 (WT)의 잎 전분 (mg/g 생중량)에 대한 막대 그래프이다. 막대 그래프에서의 모든 데이터는 평균 ± SE, n=3을 나타낸다. 스튜던트 t-검정을 사용하여 WT 및 AtNF-YC4-OE 계통에서의 전분 조성을 비교하였다. *P < 0.05.
도 7b는 NF-YC4를 과다-발현하는 아라비돕시스 (AtNF-YC4-OE) 및 야생형 아라비돕시스 (WT)의 잎 단백질 (mg/g 건조 중량)에 대한 막대 그래프이다. 막대 그래프에서의 모든 데이터는 평균 ± SE, n=3을 나타낸다. 스튜던트 t-검정을 사용하여 WT 및 AtNF-YC4-OE 계통에서의 단백질 조성을 비교하였다. **P < 0.01.
도 8은 대조군 (pSoy-LUCFull)과 비교한, 대두 NF-YC4의 프로모터 영역 내 전사 리프레서 모티프가 결실된 담배로부터의 LUC (루시페라제) 활성 (pSoy-LUC DEL1, pSoy-LUC DEL2 및 pSoy-LUC DEL3)의 상대 LUC 활성에 대한 그래프이다. 데이터는 평균 ± SEM, n=3을 나타낸다. 스튜던트 t-검정을 사용하여 결실을 갖는 프로모터 및 전장 프로모터에 의해 구동된 LUC 활성을 비교하였다. *P < 0.05. 오차 막대는 표준 오차를 나타낸다.
도 9는 대조군 (OsNF-YC4proFull)과 비교한, 벼 NF-YC4의 프로모터 영역 내 전사 리프레서 모티프가 결실된 담배로부터의 LUC 활성 (OsNF-YC4pro1, Os-NF-YC4pro2 및 Os-NF-YC4pro3)의 상대 LUC (루시페라제) 활성에 대한 그래프이다. 데이터는 평균 ± SEM, n=3을 나타낸다. 스튜던트 t-검정을 사용하여 결실을 갖는 프로모터 및 전장 프로모터에 의해 구동된 LUC 활성을 비교하였다. *P < 0.05. 오차 막대는 표준 오차를 나타낸다.
도 10a는 돌연변이체 대 대조군의 10개의 아라비돕시스 식물당 평균 초점 수 (± 바이러스 접종 후 120시간 (hai)에서의 표준 오차)에 대한 그래프이다. 스튜던트 t-검정을 사용하여 대조군 및 QQS 또는 NF-YC4 돌연변이체에서의 초점 수를 비교하였다. *P < 0.05. **P < 0.01. ***P < 0.001.
도 10b는 돌연변이체 대 대조군의 평균 초점 크기 (mm2) (± 바이러스 접종 후 120 hai에서의 표준 오차 (n = 40))에 대한 그래프이다. 스튜던트 t-검정을 사용하여 대조군 및 QQS 또는 NF-YC4 돌연변이체에서의 초점 수를 비교하였다. ***P < 0.001.
도 11은 아라비돕시스 식물에 Pst DC3000 및 Δ CEL의 접종 후 제0일 (0 dpi) 및 제4일 (4 dpi)의 박테리아 수 (log10 (CFU/cm2))에 대한 그래프이다. 오차 막대는 표준 오차를 나타낸다. 스튜던트 t-검정을 사용하여 대조군 및 QQS 또는 NF-YC4 돌연변이체에서의 박테리아 수를 비교하였다. ** P < 0.01. *** P < 0.001.
도 12a는 대두 계통의 박테리아 수 (CFU * 104/cm2)에 대한 그래프이다. 오차 막대는 표준 오차를 나타낸다. 스튜던트 t-검정을 사용하여 대조군 및 QQS-E 또는 NF-YC4-OE 돌연변이체에서의 박테리아 수를 비교하였다. ** P < 0.01. (EV = 공벡터).
도 12b는 NF-YC4-OE 대두 계통의 상대 발현 수준에 대한 그래프이다. 오차 막대는 표준 오차를 나타낸다. ** P < 0.01. (EV = 공벡터).
도 13은 대두 유전자형 QQS-E 16-6 (QQS-발현 계통 16-6), QQS-E 32-6 (QQS-발현 계통 32-6), 대조군, NF-YC4-OE L1 (NF-YC4 과다발현 계통 1) 및 NF-YC4-OE L2 (NF-YC4 과다발현 계통 2)의 식물당 진딧물의 평균 수에 대한 그래프이다. 오차 막대는 표준 오차를 나타낸다. 스튜던트 t-검정을 사용하여 대조군 및 QQS-E 또는 NF-YC4-OE 돌연변이체에서의 진딧물 수를 비교하였다. *P < 0.05. **P < 0.01. (EV = 공벡터).
도 14a는 동기 대조군과 비교한, NF-YC4를 과다발현하는 형질전환된 대두 (NF-YC4-OE)의 형질전환 이벤트 (1, 2, 3 및 4; 각각의 번호는 상이한 형질전환 이벤트를 나타냄)의 단백질 함량에 대한 그래프이다. 오차 막대는 표준 오차를 나타낸다. 스튜던트 t-검정을 사용하여 NF-YC4-OE 돌연변이체 및 동기 대조군에서의 단백질 함량을 비교하였다. * P < 0.05. ** P < 0.01.
도 14b는 동기 대조군과 비교한, NF-YC4를 과다발현하는 형질전환된 대두 (NF-YC4-OE)의 형질전환 이벤트 (1, 2, 3 및 4; 각각의 번호는 상이한 형질전환 이벤트를 나타냄)의 오일 함량에 대한 그래프이다. 오차 막대는 표준 오차를 나타낸다. 스튜던트 t-검정을 사용하여 NF-YC4-OE 돌연변이체 및 동기 대조군에서의 오일 함량을 비교하였다. * P < 0.05.
도 14c는 동기 대조군과 비교한, NF-YC4를 과다발현하는 형질전환된 대두 (NF-YC4-OE)의 형질전환 이벤트 (1, 2, 3 및 4; 각각의 번호는 상이한 형질전환 이벤트를 나타냄)의 단백질+오일 함량에 대한 그래프이다. 오차 막대는 표준 오차를 나타낸다. 스튜던트 t-검정을 사용하여 NF-YC4-OE 돌연변이체 및 동기 대조군에서의 단백질+오일 함량을 비교하였다. * P < 0.05. ** P <0.01.
도 14d는 동기 대조군과 비교한, NF-YC4를 과다발현하는 형질전환된 대두 (NF-YC4-OE)의 형질전환 이벤트 (1, 2, 3 및 4; 각각의 번호는 상이한 형질전환 이벤트를 나타냄)의 종자 섬유 (13% 수분을 함유하는 생중량당 %)에 대한 그래프이다. 오차 막대는 표준 오차를 나타낸다. 스튜던트 t-검정을 사용하여 NF-YC4-OE 돌연변이체 및 동기 대조군에서의 섬유 함량을 비교하였다. ** P < 0.01.
도 14e는 동기 대조군과 비교한, NF-YC4를 과다발현하는 형질전환된 대두 (NF-YC4-OE)의 형질전환 이벤트 (1, 2, 3 및 4; 각각의 번호는 상이한 형질전환 이벤트를 나타냄)의 식물당 종자 중량 (식물당 그램)에 대한 그래프이다. 오차 막대는 표준 오차를 나타낸다. 스튜던트 t-검정을 사용하여 NF-YC4-OE 돌연변이체 및 동기 대조군에서의 식물당 종자 중량을 비교하였다.
도 15a는 동기 대조군과 비교한, 아라비돕시스 NF-YC4를 과다발현하는 형질전환된 옥수수 (AtNF-YC4-OE)의 커넬 단백질 (건조 중량당 %)에 대한 그래프이다. 오차 막대는 표준 오차를 나타낸다. 스튜던트 t-검정을 사용하여 NF-YC4-OE 돌연변이체 및 동기 대조군에서의 단백질 함량을 비교하였다. ** P < 0.01.
도 15b는 동기 대조군과 비교한, 아라비돕시스 NF-YC4를 과다발현하는 형질전환된 옥수수 (AtNF-YC4-OE)의 커넬 오일 (건조 중량당 %)에 대한 그래프이다. 오차 막대는 표준 오차를 나타낸다. 스튜던트 t-검정을 사용하여 NF-YC4-OE 돌연변이체 및 동기 대조군에서의 오일 함량을 비교하였다.
도 15c는 동기 대조군과 비교한, 아라비돕시스 NF-YC4를 과다발현하는 형질전환된 옥수수 (AtNF-YC4-OE)의 커넬 전분 (건조 중량당 %)에 대한 그래프이다. 오차 막대는 표준 오차를 나타낸다. 스튜던트 t-검정을 사용하여 NF-YC4-OE 돌연변이체 및 동기 대조군에서의 전분 함량을 비교하였다. ** P < 0.01.
도 16a는 야생형과 비교한, 벼 NF-YC4를 과다발현하는 형질전환된 벼 (OsNF-YC4-1-OE)의 종자 전분 (g 건조 중량당 mg)에 대한 그래프이다. 오차 막대는 표준 오차를 나타낸다. 스튜던트 t-검정을 사용하여 NF-YC4-OE 돌연변이체 및 대조군에서의 종자 전분 함량을 비교하였다. ** P < 0.01.
도 16b는 야생형과 비교한, 벼 NF-YC4를 과다발현하는 형질전환된 벼 (OsNF-YC4-1-OE)의 종자 단백질 (g 건조 중량당 mg)에 대한 그래프이다. 오차 막대는 표준 오차를 나타낸다. 스튜던트 t-검정을 사용하여 NF-YC4-OE 돌연변이체 및 대조군에서의 종자 단백질 함량을 비교하였다. ** P < 0.01.
본 개시내용은, 적어도 부분적으로, QQS가 상호작용하는 유전자의 발견에 기초한다. 유전자는 NF-YC4로서 공지된 전사 조절제이다. 유전자는 진핵 종에 걸쳐 보존되며, 아라비돕시스에서 주된 작물 종, 예를 들어 대두, 벼 및 옥수수에 이르는 다양한 식물 종에 존재한다. 아라비돕시스에서의 NF-YC4의 과다-발현은 QQS 과다-발현을 모방하며; 단백질 함량은 증가되고, 탄수화물 함량은 감소된다. 따라서, 본 개시내용은 QQS와 상호작용하는 유전자 (본원에서 "상호작용자 유전자"로 지칭됨), 예컨대 NF-YC, 특히 NF-YC4 (가명은 MLE2.10, MLE2_10, 및 핵 인자 Y, 서브유닛 C를 포함하나 이에 제한되지는 않음)를 조작하기 위한 물질 및 방법을 제공한다. 실시양태에서, 유전자의 조작은 증가된 단백질 함량 및/또는 감소된 탄수화물 함량 및/또는 병원체 또는 해충에 대한 증가된 저항성을 유발한다. 유전자의 조작은 전사 리프레서 결합 모티프 (또는 1개 초과가 존재한다면 1개 초과의 부위/모티프, 이 경우에 이들은 동일한 방식으로 또는 상이한 방식으로 돌연변이될 수 있음)를 포함하는 전사 리프레서 결합 부위의, 예컨대 결실 (또는 삽입, 치환, 역위 등)에 의한 돌연변이를 수반할 수 있다. 전사 리프레서 결합 부위는 그 안에 존재하는 1개 이상의 전사 리프레서 결합 모티프의, 예컨대 돌연변이, 예를 들어 결실에 의해 조작될 수 있다. "변형", "변형시키다", "변형시키는" 및 "변형된"은 이러한 조작을 기재하기 위해 본원에 사용될 수 있다.
NF-YC는 NF-Y 전사 인자 복합체의 부분이다. NF-Y는 3종의 서브유닛, 즉 NF-YA, NF-YB 및 NF-YC로 구성된다. 각각의 3종의 서브유닛은 진화상 보존된 영역을 포함한다. 보존 영역은 NF-YA 서브유닛의 C-말단에 있고, NF-YC 서브유닛의 N-말단에 있고, NF-YB 서브유닛 내 중앙에 위치한다. NF-YA 및 NF-YC 서브유닛은 활성화 도메인 기능을 함유하며 어느 정도의 보존을 나타내는 글루타민-풍부 영역을 갖는다. NF-Y는 2종의 전사 활성화 도메인 - NF-YA 서브유닛에 하나 및 NF-YC 서브유닛에 또 다른 것을 함유하는 것으로 제시되었다. 약 65개의 아미노산 길이의 히스톤-폴드 모티프 (HFM)는 NF-YB 및 NF-YC 서브유닛에 존재한다. NF-YB 및 NF-YC 서브유닛은 치밀한 이량체를 형성한 다음, NF-YA 서브유닛과 회합된다. 생성된 삼량체는 DNA에 결합할 수 있다.
식물 전사 인자는 AP2/ERF로 지칭되는 슈퍼패밀리를 포함한다. AP2/ERF 슈퍼패밀리는 약 60-70개의 아미노산으로 이루어지며 DNA 결합에 수반되는 AP2/ERF 도메인에 의해 정의된다. 슈퍼패밀리는 3종의 패밀리 - AP2 패밀리, ERF 패밀리 및 RAV 패밀리를 포함한다. AP2 패밀리의 단백질은 2개의 반복된 AP2/ERF 도메인을 함유하고, ERF 패밀리의 단백질은 단일 AP2/ERF 도메인을 함유하고, RAV 패밀리의 단백질은 단일 AP2/ERF 도메인, 및 다른 식물-특이적 전사 인자에서 보존되는 DNA 결합 도메인인 B3 도메인을 함유한다. 추가의 정보는 식물 전사 인자 데이터베이스 (식물 TFDB) 웹사이트로부터 이용가능하다.
NF-YC4의 프로모터 영역에서 발견된 전사 리프레서 결합 모티프의 예는 RAV1에 의해 결합된 것이다. RAV1 모티프의 서열은 CAACA이다. RAV1은 CAACA를 갖는 모티프 및 CACCTG를 갖는 모티프로 이루어진 2부로 된 표적에 단량체로서 결합한다. 2개의 모티프는 2-8개의 뉴클레오티드에 의해 이격될 수 있고, 서로에 대해 상이하게 배향될 수 있다 (Kagaya et al., Nucleic Acids Res. 27: 470-478 (1999)). 상기에 나타낸 바와 같이, RAV1은 단일 AP2/ERF 및 B3 도메인-함유 전사 인자이다. 가명은 At1g13260, EDF4, 에틸렌 반응 DNA 결합 인자 4, 에틸렌-반응성 전사 인자 RAV1, ABI3/VP1 1 관련 단백질, ABI3/VP1 1 관련 단백질, T6J4_2, 및 T6J4.2를 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 추가의 정보는 iHOP (단백질에 대해 하이퍼링크된 정보) 웹사이트 및 식물 TFDB 웹사이트로부터 이용가능하다. RAV1은 하기 명칭을 갖는다: 유니프롯 Q9ZWM9, PDB 구조 1WID, NCBI 유전자 837886, NCBI RefSeq NP_172784, NCBI RefSeq NM_101197, NCBI 유니진 837886, NCBI 수탁 번호 BAA34250 및 AAG09554. RAV1의 상동체는 AT3G25730 (아라비돕시스 탈리아나), TEM1 (아라비돕시스 탈리아나), RAV2 (아라비돕시스 탈리아나), Os01g0693400 (오리자 사티바 자포니카 군) 및 Os05g0549800 (오리자 사티바 자포니카 군)을 포함한다. 유니프롯, PDB 및 NCBI로부터 이용가능한 모든 선행 서열/구조 정보는 본원에 참조로 구체적으로 포함된다.
NF-YC4의 프로모터 영역에서 발견된 전사 리프레서 결합 모티프의 또 다른 예는 ERF (에틸렌 반응 인자)에 의해 결합된 것, 보다 구체적으로 "W 박스" 모티프 (예를 들어, ERF3 유전자의 프로모터에서 발견된 것; 본원에서 ERF 모티프로 지칭될 수 있음)이다. W 박스 모티프의 서열은 TGACY (여기서 Y = C 또는 T)이다. 상기에 나타낸 바와 같이, ERF는 단일 AP2/ERF 도메인-함유 전사 인자이다. 추가의 정보는 식물 TFDB 웹사이트로부터 이용가능하다. 아라비돕시스 및 벼에서의 ERF 유전자 패밀리의 게놈-전반 분석의 논의를 위해, 이와 관련된 교시에 대해 본원에 참조로 포함된 문헌 [Nakano et al., Plant Physiol. 140(2): 411-432 (2006)]을 참조한다.
따라서, 상기를 고려하여, 본 개시내용은 NF-YC4 유전자를 포함하는 진핵 세포에서 단백질 함량을 증가시키는 방법을 제공한다. NF-YC4 유전자는 전사 리프레서 결합 부위를 포함하는 프로모터를 포함한다. 증가된 단백질 함량을 갖는 식물을 생산하는 방법이 또한 제공된다. 식물 세포 또는 식물, 특히 병원체 또는 해충에 의한 감염의 위험이 있는 식물에서 스트레스, 예컨대 비생물적 스트레스 (예를 들어, 염, 가뭄, 오염) 또는 생물적 스트레스, 예컨대 병원체 또는 해충에 대한 저항성을 증가시키는 방법이 추가로 제공된다. 식물은 전사 리프레서 결합 부위를 포함하는 프로모터를 포함하는 NF-YC4 유전자를 포함한다. 병원체 또는 해충에 대한 증가된 저항성을 갖는 식물을 생산하는 방법이 추가로 제공된다.
상기 방법은 전사 리프레서 결합 부위를 조작 또는 변형시켜, 전사 리프레서가 NF-YC4의 전사를 방지할 수 없도록 하는 것을 포함한다. 전사 리프레서 결합 부위는 ERF 모티프 및/또는 RAV1 모티프를 포함하거나, 이로 본질적으로 이루어지거나, 또는 이로 이루어질 수 있으며, 상기 모티프 중 하나 또는 둘 다는 조작 또는 변형, 예컨대 결실, 예컨대 TALENS 또는 CRISPR/Cas9를 사용하여 결실될 수 있다. 2개 이상의 모티프가 조작 또는 변형되는 경우에, 이들은 동일한 방식으로 또는 상이하게 조작 또는 변형될 수 있다. 방법은 프로모터를 또 다른 프로모터, 예컨대 구성적 프로모터로 대체하는 것을 포괄하지는 않는다.
NF-YC4 유전자는 임의의 진핵 NF-YC4 유전자, 예컨대 동물로부터의 NF-YC4 유전자, 진균으로부터의 NF-YC4 유전자, 조류로부터의 NF-YC4 유전자, 또는 식물로부터의 NF-YC4 유전자일 수 있다. NF-YC4 유전자의 예는 브라시카 나푸스(Brassica napus)에 존재하는 것 (CDS는 진뱅크 수탁 번호 KC797143.1로서 이용가능함), 메디카고 트룬카툴라(Medicago truncatula)에 존재하는 것 (CDS는 진뱅크 수탁 번호 JQ918296.1로서 이용가능함), 아라비돕시스 탈리아나에 존재하는 것 (유전자 ID 836466; TAIR AT5G63470 (AT5G63470.1 및 AT5G63470.2); 게놈 서열은 NC_003076.8 (25415701.25417117, 보체)로서 이용가능하고, CDS는 진뱅크 수탁 번호 NM_125742.5 및 NM_001037053.1로서 이용가능함), 글리신 맥스에 존재하는 것 (Glyma06g17780 및 Glyma04g37291), 오리자 사티바에 존재하는 것 (Os3g14669, Os02g07450, 및 Os06g45640), 및 제아 메이스 (GrmZm2g089812)에 존재하는 것을 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 또 다른 유전자는 또한 클라미도모나스 레인하르티이(Chlamydomonas reinhardtii)에서 확인되었다 (Cre12.g556400; Cre12.g556400.t1.3). 방법의 한 실시양태에서, NF-YC4 유전자의 코딩 영역은 조작 또는 변형되지 않는다. 방법의 또 다른 실시양태에서, NF-YC4 유전자의 코딩 영역은 조작 또는 변형, 예컨대 추가로 단백질 함량을 증가시키도록 조작 또는 변형 (예를 들어, 삽입, 결실, 치환, 역위, 또는 N- 또는 C-말단에서의 말단절단)된다.
다른 NF-YC4 유전자 (상동체, 오르토로그 및 파라로그)는 관련 기술분야에 공지된 방법에 의해 확인될 수 있다. 예를 들어, 유전자는 본원에서 확인된 NF-YC4 유전자와 아미노산 서열 동일성을 공유하는 보존된 도메인에 대한 데이터베이스를 검색함으로써 확인될 수 있다. 유전자 코드의 축중성은 고도로 가변적인 뉴클레오티드 서열이 고도로 유사하며 심지어 동일한 아미노산 서열을 갖는 단백질로 번역되도록 한다. 프로그램, 예컨대 MEGALIGN (디엔에이스타, 인크.(DNAStar, Inc.), 위스콘신주 매디슨)은 상이한 방법, 예를 들어, 클러스탈 분석에 따라 2개 이상의 서열 사이에 정렬을 생성시킬 수 있다 (Higgin et al., Gene 73: 237-244 (1988)). 다른 정렬 알고리즘 및 프로그램은 FASTA, BLAST 및 ENTREZ를 포함한다 (NCBI; Altschul et al., J. Mol. Evol. 36: 290-300 (1993); Altschul et al., J. Mol. Biol. 215: 403-410 (1990)). 또한, GCG 프로그램 (미국 특허 번호 6,262,333) 및 문헌 [Doolittle, Methods in Enzymology 266, "Computer Methods for Macromolecular Sequence Analysis," Academic Press, Inc., San Diego, CA (1996)]에 기재된 정렬을 위한 다른 기술을 참조한다. 스미스-워터맨 알고리즘은 서열 정렬에서 갭을 허용하며; 알고리즘은 MASPAR 컴퓨터 및 MPSRCH 소프트웨어를 사용하여 수행될 수 있다. 니들만 및 분쉬 정렬 방법을 사용하는 GAP 프로그램이 또한 서열을 정렬하는데 사용될 수 있다. 추가적으로 또는 대안적으로, 2종 이상의 관련 전사 인자의 과다발현 또는 녹아웃 시의 전사체 프로파일이 비교될 수 있다. 수동 방법은 또한 유사성의 영역 및 보존된 도메인을 확인하는데 사용될 수 있고, 3차 구조의 비교를 수반할 수 있다. 확인되면, 이러한 유전자는 관련 기술분야에 공지된 방법에 따라 클로닝될 수 있다.
다른 NF-YC4 유전자가 또한 엄격한 또는 고도로 엄격한 조건 하의 혼성화에 의해 확인될 수 있다. 엄격도는 다양한 인자, 예컨대 혼성화에서의 온도, 염 농도 및 조성, 유기 및 비유기 첨가제, 용매 등 및 세척 용액에 의해 영향을 받는다 (예를 들어, [Sambrook et al., 상기 문헌; Nucleic Acid Hybridization: A Practical Approach, Hames and Higgins, eds., IRL Press, Washington, DC (1985)] 참조). 혼성화 검정, 예컨대 서던 블롯, 노던 블롯, 용액 혼성화 등이 사용될 수 있다 (예를 들어, [Sambrook et al., 상기 문헌] 참조).
본원에 기재된 서열에 관하여, 서열 동일성의 백분율은 약 55% 내지 100% 범위일 수 있다. NF-YC4 유전자가 폭넓은 범위의 진핵생물에 걸쳐 고도로 보존된다는 것을 고려하면, 특히 아미노산 수준에서의 서열 동일성의 백분율은 약 60% 내지 100%, 예컨대 약 65% 내지 100%, 약 70% 내지 100%, 약 75% 내지 100%, 약 80% 내지 100%, 약 85% 내지 100%, 약 90% 내지 100%, 또는 약 95% 내지 100%, 예컨대 약 96%, 약 97%, 약 98% 또는 약 99% 범위일 수 있다.
조작 또는 변형될 NF-YC4의 영역은 프로모터 영역이다. 보다 구체적으로, 전사 리프레서가 결합하는 전사 리프레서 결합 부위는, 예컨대 돌연변이, 구체적으로 결실 (또는 삽입, 치환, 역위 등)에 의해 조작 또는 변형되어, 전사 리프레서가 결합 부위에 결합하는 것을 방지 또는 억제하여, 진핵생물, 예컨대 식물의 생화학적 조성을 변형시킨다. 특히, 전사 리프레서 결합 부위 모티프가 조작 또는 변형된다. 예를 들어, 저장 생성물, 예컨대 단백질, 탄수화물 및 지질의 조성이 변형될 수 있다. 보다 구체적으로, 단백질 함량이 증가될 수 있고/거나 탄수화물 함량이 감소될 수 있다.
오리자 사티바의 NF-YC4 유전자 (Os03g14669)의 프로모터 영역은 서열식별번호: 1로 제시된다 (도 2a 참조). RAV1 모티프 (역방향)는 볼드체로 제시되며, 반면에 RAV1 (역방향) 및 ERF (정방향) 모티프는 밑줄표시된 볼드체로 제시되고, ERF 모티프 (역방향)는 이탤릭체인 볼드체로 제시된다.
RAV1 (역방향) 모티프 (TGTTG; 서열식별번호: 1에서의 볼드체 참조)가 결실된 오리자 사티바의 NF-YC4 유전자의 프로모터 영역은 서열식별번호: 2로 제시된다 (도 2a 참조). RAV1 (역방향) 및 ERF (정방향) 모티프는 밑줄표시된 볼드체로 제시되며, 반면에 ERF 모티프 (역방향)는 이탤릭체인 볼드체로 제시된다.
RAV1 (역방향) 모티프 및 ERF (정방향) 모티프의 중첩 서열 (TGTTGACT; 서열식별번호: 1에서의 밑줄표시된 볼드체 참조)이 결실된 오리자 사티바의 NF-YC4 유전자의 프로모터 영역은 서열식별번호: 3으로 제시된다 (도 2b 참조). RAV1 모티프 (역방향)는 볼드체로 제시되며, 반면에 ERF 모티프 (역방향)는 이탤릭체인 볼드체로 제시된다.
2개의 ERF 모티프 (역방향)를 함유하는 111 bp 절편 ( AGTCA TCACTGTTCTATGTTCTATCTGCATTTTCCTTGATTTTGTACTTTTCCTGAACGAAAGGACAATCCTTAGCCATCATAATGCTATGATCGACTTATTCTGA AGTCA [서열식별번호: 5]; 서열식별번호: 1에서의 볼드 이탤릭체의 2개의 ERF 및 개재 서열 참조)이 결실된 오리자 사티바의 NF-YC4 유전자의 프로모터 영역은 서열식별번호: 4로 제시된다 (도 2b 참조). RAV1 모티프 (역방향)는 볼드체로 제시되고, RAV1 (역방향) 및 ERF (정방향) 모티프는 밑줄표시된 볼드체로 제시된다.
2개의 ERF 모티프 (역방향), RAV1 (역방향) 및 ERF (정방향) 모티프, 및 개재 서열을 함유하는 190 bp 절편 (AACGAAAACAGCT TGTTGACT GGCTCCCTAGAGCTTTTT GTAAGTTGATCATCGAAGTAGCTAGTTCTCTTCACTTATC AGTCA TCACTGTTCTATGTTCTATCTGCATTTTCCTTGATTTTGTACTTTTCCTGAACGAAAGGACAATCCTTAGCCATCATAATGCTATGATCGACTTATTCTGA AGTCA [서열식별번호: 7]; 서열식별번호: 1에서의 이탤릭체인 볼드체의 2개의 ERF 모티프 (역방향), 밑줄표시된 볼드체의 RAV1 (역방향) 및 ERF (정방향) 모티프, 및 개재 서열 참조)이 결실된 오리자 사티바의 NF-YC4 유전자의 프로모터 영역은 서열식별번호: 6으로 제시된다 (도 2c 참조). RAV1 모티프 (역방향)는 볼드체로 제시된다.
벼 세포 또는 벼 식물을 수반하는 방법의 실시양태에서, (i) 2개의 ERF 모티프가 결실될 수 있거나, (ii) RAF1 모티프가 결실될 수 있거나, 또는 (iii) RAV1 모티프 및 ERF 모티프가 결실될 수 있다.
글리신 맥스의 NF-YC4 유전자 (Glyma06g17780)의 프로모터 영역은 서열식별번호: 8로 제시된다 (도 2c 참조). ERF 모티프 (역방향)는 이탤릭체인 볼드체로 제시되고, RAV1 모티프 (역방향)는 볼드체로 제시되고, RAV1 모티프 (정방향)는 밑줄표시된 볼드체로 제시된다.
ERF 모티프 (역방향), RAV1 모티프 (정방향) 및 개재 서열 ( AGTCA CATGCCA CAACA [서열식별번호: 10]; 서열식별번호: 8에서의 이탤릭체인 볼드체 및 밑줄표시된 볼드체 참조)이 결실된 글리신 맥스의 NF-YC4 유전자의 프로모터 영역은 서열식별번호: 9로 제시된다 (도 2d 참조). ERF 모티프 (역방향)는 이탤릭체인 볼드체로 제시되고, RAV1 모티프 (역방향)는 볼드체로 제시된다.
ERF 모티프 (역방향), RAV1 모티프 (역방향) 및 개재 서열 ( GGTCA GTTTTTGTT AACATTAATTTTTAGGATTATTTGTTG [서열식별번호: 12]; 서열식별번호: 8에서의 이탤릭체인 볼드체 및 볼드체 참조)이 결실된 글리신 맥스의 NF-YC4 유전자의 프로모터 영역은 서열식별번호: 11로 제시된다 (도 2d 참조). ERF 모티프 (역방향)는 이탤릭체인 볼드체로 제시되고, RAV1 모티프 (역방향)는 볼드체로 제시되고, RAV1 모티프 (정방향)는 밑줄표시된 볼드체로 제시된다.
2개의 RAV1 모티프 및 개재 서열 (TGTTGGTAATGTAAAAAAAATTAAAAGAAA CAAGATTAAATTACGTATTTAATAATTTAAGATTAATGTTG [서열식별번호: 14]; 서열식별번호: 8에서의 볼드체 참조)이 결실된 글리신 맥스의 NF-YC4 유전자의 프로모터 영역은 서열식별번호: 13으로 제시된다 (도 2e 참조). ERF 모티프 (역방향)는 이탤릭체인 볼드체로 제시되고, RAV1 모티프 (역방향)는 볼드체로 제시되고, RAV1 모티프 (정방향)는 밑줄표시된 볼드체로 제시된다.
대두 세포 또는 대두 식물을 수반하는 방법의 실시양태에서, (i) 2개의 RAV1 모티프가 결실될 수 있거나, 또는 (ii) RAV1 모티프 및 ERF 모티프가 결실될 수 있다.
제아 메이스의 NF-YC4 유전자의 프로모터 영역은 서열식별번호: 20으로 제시된다. 2개의 RAV1 모티프 (정방향)는 볼드체로 제시된다. 옥수수 세포 또는 옥수수 식물을 수반하는 방법의 실시양태에서, 하나 또는 둘 다의 RAV1 모티프가 결실될 수 있다.
영역은 관련 기술분야에 공지된 임의의 적합한 방법론에 의해 변형될 수 있다. 예를 들어, 부위-지정 또는 부위-특이적 돌연변이유발, 최적화된 방향적 진화, 유전자 부위-포화 돌연변이유발 (GSSM), 합성 라이게이션 재조립 (SLR), 오류-유발 PCR, 셔플링, 올리고뉴클레오티드-지정 돌연변이유발, 조립 PCR, 성 PCR 돌연변이유발, 생체내 돌연변이유발, 카세트 돌연변이유발, 재귀적 앙상블 돌연변이유발, 지수적 앙상블 돌연변이유발, 유전자 재조립, SLR 재조합, 재귀적 서열 재조합, 포스포로티오에이트-변형된 DNA 돌연변이유발, 우라실-함유 주형 돌연변이유발, 갭이 있는 듀플렉스 돌연변이유발, 포인트 미스매치 복구 돌연변이유발, 복구-결핍 숙주 균주 돌연변이유발, 화학적 돌연변이유발, 방사성 돌연변이유발, 결실 돌연변이유발, 제한-선택 돌연변이유발, 제한-정제 돌연변이유발, 인공 유전자 합성, 앙상블 돌연변이유발, 키메라 핵산 다량체 생성, 또는 다른 표적화된 돌연변이유발 기술, 예컨대 메가뉴클레아제, 트랜스포손, 레콤비나제, 화학적 DNA 커터, 및 프로그램가능한 뉴클레아제 예컨대 아연-핑거 뉴클레아제 (ZFN), 전사 활성화제-유사 이펙터 뉴클레아제 (TALEN), RNA-가이드된 조작된 뉴클레아제 (RGEN) 및 박테리아의 유형 II 클러스터링된 규칙적 간격의 짧은 회문식 반복부 (CRISPR)-Cas (CRISPR-연관) 적응 면역계를 사용한 게놈 조작이 있다. ZFN (아미노 말단에서의 아연-핑거 단백질 (ZFP) 및 카르복실 말단에서의 Fok I 또는 다른 뉴클레아제 도메인), TALEN (아미노 말단에서의 전사 활성화제-유사 이펙터 (TALE) 및 카르복실 말단에서의 Fok I 또는 다른 뉴클레아제 도메인), RGEN 및 CRISPR-Cas 시스템을 사용한 게놈 조작은 배양된 세포, 식물 및 동물에서 염색체 DNA를 부위-특이적 방식으로 절단하여 표적화된 게놈 변형을 유발하는 내인성 DNA 복구 시스템을 촉발함으로써 표적화된 유전자 변형을 가능하게 한다. 검토를 위해, 이와 관련된 교시에 대해 본원에 참조로 포함된 문헌 [Kim et al., Nature Reviews (Genetics) 15: 321-334 (May 2014)]을 참조한다. 또한, 작물을 유전학적으로 개선시키기 위한 조작된 뉴클레아제의 용도에 대해서는 상기 문헌에서 인용된 (그리고 참조로 포함된) 참고문헌 178-180을 참조하고, 가축에 특정 영양소를 풍부하게 하거나 또는 이들이 질병-저항성이도록 만들기 위한 조작된 뉴클레아제의 용도에 대해서는 상기 문헌에서 인용된 (그리고 참조로 포함된) 참고문헌 32 및 168을 참조한다.
RGEN 및 다른 뉴클레아제의 오프-타겟 효과는 최소화 또는 회피될 수 있다. 예를 들어, 게놈 내 다른 곳에 고도로 상동인 서열이 결여되어 있는 고유한 표적 부위를 선택하는 것이 중요하다. 이러한 부위는 TALEN에 대한 컴퓨터 알고리즘을 사용하여 검색함으로써 확인될 수 있다. 추가로, 웹-기반 프로그램이 본원 하기에 언급된 바와 같이 TALEN 및 RGEN에 대해 이용가능하다. 또한 RGEN에 대한 뉴클레아제 발현 수준을 최적화하는 것이 중요하다. 5' 말단에 2개의 추가의 구아닌을 갖는 변형된 가이드 RNA 또는 말단절단된 sgRNA의 사용은 오프-타겟 돌연변이를 감소시킨다. 프로그램가능한 뉴클레아제를 도입하기 위한 플라스미드 상의 재조합 단백질의 사용은 세포에서 재조합 단백질의 신속한 분해로 인해 오프-타겟 돌연변이를 감소시킨다. 최종적으로, DNA 내로 단일-가닥 파괴를 도입하는 DNA-니킹 효소 ("니카제")는 오프-타겟 돌연변이를 최소화할 수 있다.
한 실시양태에서, TALEN이 사용된다 (예를 들어, 미국 특허 출원 공개 번호 2011/0201118 (이는 그 전문이 본원에 참조로 포함됨), 특히 50면 14줄 내지 58면 4줄, 64면 2줄 내지 66면 29줄, 및 도 1-3 및 10-16 참조; 또한, 미국 특허 번호 8,586,363 (이는 그 전문이 본원에 참조로 포함됨) 참조; 또한, 미국 특허 출원 공개 번호 2014/335618 (이는 그 전문이 본원에 참조로 포함됨) 참조; 또한, 미국 특허 출원 공개 번호 2014/335592 (이는 그 전문이 본원에 참조로 포함됨) 참조; 또한, 미국 특허 출원 번호 2013/0122581 및 미국 특허 번호 8,697,853 (이들 둘 다는 그 전문이 본원에 참조로 포함됨) 참조; 또한, 미국 특허 출원 공개 번호 2012/214228 및 미국 특허 번호 8,450,471 (이들 둘 다는 그 전문이 본원에 참조로 포함됨) 참조; 또한, 미국 특허 출원 공개 번호 2012/178169 및 미국 특허 번호 8,440432 (이들 둘 다는 그 전문이 본원에 참조로 포함됨) 참조; 또한, 미국 특허 출원 공개 번호 2012/178131 및 미국 특허 번호 8,440,431 (이들 둘 다는 그 전문이 본원에 참조로 포함됨) 참조; 또한, 미국 특허 출원 공개 번호 2011/0301073 및 미국 특허 번호 8586526 (이들 둘 다는 그 전문이 본원에 참조로 포함됨) 참조; 미국 특허 출원 공개 번호 2014/087426 (이는 그 전문이 본원에 참조로 포함됨) 참조; 또한, 미국 특허 출원 공개 번호 2014/0073015 및 미국 특허 번호 8,748,134 (이들 둘 다는 그 전문이 본원에 참조로 포함됨) 참조). TALEN은 임의의 주어진 DNA 서열을 거의 표적화하도록 설계될 수 있기 때문에, 메틸화 시토신을 갖는 표적 서열을 회피하거나 또는 시토신을 인식하는 His-Asp RVD 반복부를 티민을 인식하여 메틸화 시토신을 인식할 Asn-Gly RVD 반복부로 대체하는 것과 같이 5' 말단에 티민을 갖는 표적 서열을 선택하는 것이 권장되기는 하지만, TALEN은 다른 유형의 뉴클레아제보다 중요한 이점을 제공한다. TAL 이펙터는 임의의 적합한 TAL 이펙터일 수 있다. 예를 들어, 자연 발생 TAL 이펙터 (즉, 야생형 TAL 이펙터 또는 자연 발생 돌연변이체 TAL 이펙터) 또는 인간-제조 TAL 이펙터 (예를 들어, 돌연변이된 자연 발생 TAL 이펙터 또는 합성 TAL 이펙터)가 사용될 수 있다. TAL 이펙터의 예는 크산토모나스(Xanthomonas) 종 박테리아 또는 랄스토니아(Ralstonia) 종 박테리아로부터의 AvrXa7이다 (예를 들어, 국제 특허 출원 공개 번호 WO 2013/101877 (이는 그 전문이 본원에 참조로 포함됨) 참조). 엔도뉴클레아제는 DNA의 두 가닥을 절단하고, 절단의 부위에서 DNA 서열의 변형을 가능하게 한다. 구축물의 크기는 ~3 kb x 2이다. 표적 부위의 특이성-결정 길이는 약 30 bp 내지 약 40 bp이다. 바람직하게는, 표적 부위는 티민으로 시작하고 아데닌으로 종료된다. 온라인 자료, 예컨대 E-TALEN, 게놈 조작 자료, TALE(N) 활성을 예측하기 위한 점수화 알고리즘, 툴젠(ToolGen) TALEN 디자이너 및 ZiFiT 타겟터 소프트웨어가 TALEN을 설계하는데 사용될 수 있으며; 또한, 애드진 및 TALEN 라이브러리 자료를 참조한다. TALEN은 상업적 공급업체, 예컨대 셀렉티스 바이오리서치(Cellectis Bioresearch), 라이프 테크놀로지스(Life Technologies), 툴젠 및 트랜스포사젠 바이오파마슈티칼스(Transposagen Biopharmaceuticals)로부터 입수될 수 있다.
따라서, 한 실시양태에서, 본 개시내용은 전사 리프레서 결합 부위를 포함하는 프로모터를 포함하는 NF-YC4 유전자를 포함하는 진핵 세포에서 단백질 함량을 증가시키는 방법을 제공한다. 방법은 NF-YC4 유전자 내 전사 리프레서 결합 부위를 변형시켜, 전사 리프레서가 NF-YC4 유전자의 전사를 방지할 수 없도록 하는 것을 포함한다. 방법은 제1 전사 활성화제-유사 (TAL) 이펙터 엔도뉴클레아제 단량체 및 제2 TAL 이펙터 엔도뉴클레아제 단량체를 세포 내로 도입하는 것을 포함한다. 단량체는, 임의의 적합한 방법에 의해, 예컨대 제1 또는 제2 단량체를 코딩하는 핵산으로 세포를 형질감염시키고/거나 제1 또는 제2 단량체를 단백질로서 세포 내로 기계적으로 주사함으로써 세포 내로 도입될 수 있다. 단백질로서 전달되는 경우에, 박테리아 유형 III 분비 시스템 또는 전기천공이 사용될 수 있다. 각각의 TAL 이펙터 엔도뉴클레아제 단량체는 엔도뉴클레아제 도메인, 예컨대 비-특이적 엔도뉴클레아제 도메인, 예를 들어 Fok I 엔도뉴클레아제 도메인, 및 복수의 TAL 이펙터 반복 서열을 포함하는 TAL 이펙터 도메인을 포함한다. 제1 TAL 이펙터 엔도뉴클레아제 단량체의 복수의 TAL 이펙터 반복 서열 (예를 들어, 15개 이상의 DNA 결합 반복부, 예컨대 NF-YC4 프로모터 영역 내 염기 쌍의 인식을 결정하며 NF-YC4 프로모터 영역 내 1개의 염기 쌍의 인식을 담당하는 반복 가변-이-잔기 (RVD)를 각각 포함하는 DNA 결합 반복부)은 조합되어 NF-YC4 유전자의 프로모터 영역 내 제1 특이적 뉴클레오티드 서열에 결합한다. 제2 TAL 이펙터 엔도뉴클레아제 단량체의 복수의 TAL 이펙터 반복 서열 (예를 들어, 15개 이상의 DNA 결합 반복부, 예컨대 NF-YC4 프로모터 영역 내 염기 쌍의 인식을 결정하며 NF-YC4 프로모터 영역 내 1개의 염기 쌍의 인식을 담당하는 RVD를 각각 포함하는 DNA 결합 반복부)은 조합되어 NF-YC4 유전자의 프로모터 영역 내 제2 특이적 뉴클레오티드 서열에 결합한다. 제1 특이적 뉴클레오티드 서열 및 제2 특이적 뉴클레오티드 서열은 상이하고, 스페이서 서열, 예컨대 약 12 내지 30개의 뉴클레오티드 길이, 예를 들어 18개의 뉴클레오티드인 스페이서 서열에 의해 이격된다. 제1 특이적 뉴클레오티드 서열 및 제2 특이적 뉴클레오티드 서열은 NF-YC4 유전자의 프로모터 영역 내 전사 리프레서 결합 부위의, 예컨대 결실에 의한 변형을 달성하기 위해 선택된다. 전사 리프레서 결합 부위는 ERF 모티프 또는 RAV1 모티프를 포함할 수 있으며; 이와 관련하여, 2개 이상의 ERF 모티프, 2개 이상의 RAV1 모티프, 또는 ERF 및 RAV1 모티프의 조합이, 예컨대 결실에 의해 변형될 수 있다. 제1 TAL 이펙터 엔도뉴클레아제 단량체의 엔도뉴클레아제 도메인 및 제2 TAL 이펙터 엔도뉴클레아제 단량체의 엔도뉴클레아제 도메인은, 제1 TAL 이펙터 엔도뉴클레아제 단량체의 TAL 이펙터 도메인이 제1 특이적 뉴클레오티드 서열에 결합되고 제2 TAL 이펙터 엔도뉴클레아제 단량체의 TAL 이펙터 도메인이 제2 특이적 뉴클레오티드 서열에 결합되는 경우에, 세포 또는 그의 자손 내에서 표적 DNA 서열을 절단하는 이량체를 형성한다. 방법은, 표적 DNA 서열과 핵산 사이에 상동 재조합이 발생하도록, 표적 DNA 서열의 적어도 일부분에 상동인 서열을 포함하는 핵산을 세포에 제공하는 것을 추가로 포함할 수 있다. 진핵 세포에서의 단백질 함량은 증가되고, 따라서 방법은 증가된 단백질 함량을 선택하는 것을 추가로 포함할 수 있다.
진핵 세포는 세포의 집합, 조직, 기관 또는 유기체의 부분일 수 있다. 세포 또는 세포의 집합 또는 그의 자손인 경우에, 방법은 그로부터 유전자 변형된 조직, 기관 또는 유기체를 생성시키는 것을 추가로 포함할 수 있다. 유기체는 식물, 예컨대 작물 식물, 예컨대 대두, 벼 또는 옥수수, 단자엽, 쌍자엽, 조류, 예컨대 단세포 편모충, 예컨대 클라미도모나스 종일 수 있다. 실시양태에서, 유기체는 대두, 벼 또는 옥수수이다. 식물은 관련 기술분야에 공지되어 있으며 본원에 기재된 방법에 따라 교배 및 역교배되고 증가된 단백질 함량에 대해 선택될 수 있다.
또 다른 실시양태에서, 본 개시내용은 전사 리프레서 결합 부위를 포함하는 프로모터를 포함하는 NF-YC4 유전자를 포함하는 식물 세포에서 병원체 또는 해충에 대한 저항성을 증가시키는 방법을 제공한다. 병원체는 박테리아, 바이러스, 진균 또는 종자 식물일 수 있고, 해충은 곤충, 플라스모디오포리드, 응애 또는 선충류이며, 이들 모두의 예는 관련 기술분야에 공지되어 있고 본원에 기재되어 있다. 실시양태에서, 병원체는 박테리아 또는 바이러스이고, 해충은 진딧물이다. 방법은 NF-YC4 유전자 내 전사 리프레서 결합 부위를 변형시켜, 전사 리프레서가 NF-YC4 유전자의 전사를 방지할 수 없도록 하는 것을 포함한다. 방법은 제1 전사 활성화제-유사 (TAL) 이펙터 엔도뉴클레아제 단량체 및 제2 TAL 이펙터 엔도뉴클레아제 단량체를 세포 내로 도입하는 것을 포함한다. 단량체는, 임의의 적합한 방법에 의해, 예컨대 제1 또는 제2 단량체를 코딩하는 핵산으로 세포를 형질감염시키고/거나 제1 또는 제2 단량체를 단백질로서 세포 내로 기계적으로 주사함으로써 세포 내로 도입될 수 있다. 단백질로서 전달되는 경우에, 박테리아 유형 III 분비 시스템 또는 전기천공이 사용될 수 있다. 각각의 TAL 이펙터 엔도뉴클레아제 단량체는 엔도뉴클레아제 도메인, 예컨대 비-특이적 엔도뉴클레아제 도메인, 예를 들어 Fok I 엔도뉴클레아제 도메인, 및 복수의 TAL 이펙터 반복 서열을 포함하는 TAL 이펙터 도메인을 포함한다. 제1 TAL 이펙터 엔도뉴클레아제 단량체의 복수의 TAL 이펙터 반복 서열 (예를 들어, 15개 이상의 DNA 결합 반복부, 예컨대 NF-YC4 프로모터 영역 내 염기 쌍의 인식을 결정하며 NF-YC4 프로모터 영역 내 1개의 염기 쌍의 인식을 담당하는 반복 가변-이-잔기 (RVD)를 각각 포함하는 DNA 결합 반복부)은 조합되어 NF-YC4 유전자의 프로모터 영역 내 제1 특이적 뉴클레오티드 서열에 결합한다. 제2 TAL 이펙터 엔도뉴클레아제 단량체의 복수의 TAL 이펙터 반복 서열 (예를 들어, 15개 이상의 DNA 결합 반복부, 예컨대 NF-YC4 프로모터 영역 내 염기 쌍의 인식을 결정하며 NF-YC4 프로모터 영역 내 1개의 염기 쌍의 인식을 담당하는 RVD를 각각 포함하는 DNA 결합 반복부)은 조합되어 NF-YC4 유전자의 프로모터 영역 내 제2 특이적 뉴클레오티드 서열에 결합한다. 제1 특이적 뉴클레오티드 서열 및 제2 특이적 뉴클레오티드 서열은 상이하고, 스페이서 서열, 예컨대 약 12 내지 30개의 뉴클레오티드 길이, 예를 들어 18개의 뉴클레오티드인 스페이서 서열에 의해 이격된다. 제1 특이적 뉴클레오티드 서열 및 제2 특이적 뉴클레오티드 서열은 NF-YC4 유전자의 프로모터 영역 내 전사 리프레서 결합 부위의, 예컨대 결실에 의한 변형을 달성하기 위해 선택된다. 전사 리프레서 결합 부위는 ERF 모티프 또는 RAV1 모티프를 포함할 수 있으며; 이와 관련하여, 2개 이상의 ERF 모티프, 2개 이상의 RAV1 모티프, 또는 ERF 및 RAV1 모티프의 조합이, 예컨대 결실에 의해 변형될 수 있다. 제1 TAL 이펙터 엔도뉴클레아제 단량체의 엔도뉴클레아제 도메인 및 제2 TAL 이펙터 엔도뉴클레아제 단량체의 엔도뉴클레아제 도메인은, 제1 TAL 이펙터 엔도뉴클레아제 단량체의 TAL 이펙터 도메인이 제1 특이적 뉴클레오티드 서열에 결합되고 제2 TAL 이펙터 엔도뉴클레아제 단량체의 TAL 이펙터 도메인이 제2 특이적 뉴클레오티드 서열에 결합되는 경우에, 세포 또는 그의 자손 내에서 표적 DNA 서열을 절단하는 이량체를 형성한다. 방법은, 표적 DNA 서열과 핵산 사이에 상동 재조합이 발생하도록, 표적 DNA 서열의 적어도 일부분에 상동인 서열을 포함하는 핵산을 식물 세포에 제공하는 것을 추가로 포함할 수 있다. 식물 세포에서의 병원체 또는 해충에 대한 저항성은 증가되고, 따라서 방법은 병원체 또는 해충에 대한 증가된 저항성을 선택하는 것을 추가로 포함할 수 있다.
방법은 서열식별번호: 16에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 갖는 쿠아-퀸 전분 (QQS) 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 식물 세포 내로 도입하고 그 안에서 발현하는 것을 추가로 포함할 수 있으며, 여기서 뉴클레오티드 서열은 프로모터에 작동가능하게 연결된다.
식물 세포는 세포의 집합, 조직, 기관 또는 유기체의 부분일 수 있다. 세포 또는 세포의 집합 또는 그의 자손인 경우에, 방법은 그로부터 유전자 변형된 조직, 기관 또는 식물을 생성시키는 것을 추가로 포함할 수 있다. 식물은 작물 식물, 예컨대 대두, 벼 또는 옥수수, 단자엽 또는 쌍자엽일 수 있다. 식물은 관련 기술분야에 공지되어 있으며 본원에 기재된 방법에 따라 교배 및 역교배되고 병원체 또는 해충에 대한 증가된 저항성에 대해 선택될 수 있다.
또 다른 실시양태에서, CRISPR-Cas 시스템이 사용된다. 표적-특이적 crRNA 및 표적-독립적 트랜스-활성화 crRNA (tracrRNA)는 CRISPR-연관 단백질 9 (Cas9)와 복합체화되어 활성 DNA 엔도뉴클레아제, 즉 dualRNA-Cas9를 형성한다. 엔도뉴클레아제는 crRNA 내 20-bp 가이드 서열 및 프로토-스페이서 인접 모티프 (PAM; 5'-NGG-3' 또는 5'-NAG-3')로 구성된 23-bp 표적 DNA 서열을 절단한다. 임의의 적합한 Cas9, 예컨대 스트렙토코쿠스 피오게네스(Streptococcus pyogenes)로부터의 Cas9가 사용될 수 있다. CRISPR-Cas/RGEN은 설계 및 제조하기가 간단하기 때문에, RGEN 표적 부위가 Cas9에 의해 인식되는 PAM 서열 (즉, 5'-X20NGG-3' 또는 5'-X20NAG-3', 여기서 X20은 20-bp crRNA 서열에 상응함)에 대한 요건에 의해 제한되고 표적 서열 내 5' 구아닌의 존재 또는 가이드 RNA의 5' 말단에 1 또는 2개의 구아닌 염기의 부가가 권장되기는 하지만, CRISPR/Cas는 TALEN보다 중요한 이점을 제공한다. 구축물의 크기는 전형적으로 약 4.2 kb (에스. 피오게네스로부터의 Cas9) + 0.1 kb (sgRNA)이다. 표적 부위의 특이성-결정 길이는 전형적으로 22 bp (23 bp의 총 길이에 대해)이다. 바람직하게는, 표적 부위는 NGG 또는 NAG (즉, 상기에 나타낸 바와 같은 PAM)로 종료된다. 온라인 자료, 예컨대 E-CRISP, 게놈 조작 자료, RGEN 툴 및 ZiFiT 타겟터 소프트웨어가 사용될 수 있으며; 또한, 애드진을 참조한다. CRISPR/Cas 시스템의 성분은 상업적 공급업체, 예컨대 라이프 테크놀로지스, 시그마-알드리치(Sigma-Aldrich), 시스템 바이오사이언시스(System Biosciences), 툴젠 및 트랜스포사젠 바이오파마슈티칼스로부터 입수될 수 있다.
따라서, 또 다른 실시양태에서, 본 개시내용은 전사 리프레서 결합 부위를 포함하는 프로모터를 포함하는 NF-YC4 유전자를 포함하는 진핵 세포에서 단백질 함량을 증가시키는 방법을 제공한다. 방법은 NF-YC4 유전자 내 전사 리프레서 결합 부위를 변형시켜, 전사 리프레서가 NF-YC4 유전자의 전사를 방지할 수 없도록 하는 것을 포함한다. 방법은 dualRNA-Cas9, 즉 표적-특이적 crRNA 및 표적-독립적 트랜스-활성화 crRNA (tracrRNA)와 CRISPR-연관 단백질 9 (Cas9)와의 복합체화에 의해 형성된 활성 DNA 엔도뉴클레아제를 세포 내로 도입하는 것을 포함한다. 엔도뉴클레아제는 crRNA 내 20-bp 가이드 서열 및 프로토-스페이서 인접 모티프 (PAM; 5'-NGG-3' 또는 5'-NAG-3')로 구성된 23-bp 표적 DNA 서열 (예를 들어, 본원 서열식별번호: 6 및 7 및 실시예 18 참조)을 절단한다. 임의의 적합한 Cas9, 예컨대 스트렙토코쿠스 피오게네스로부터의 Cas9가 사용될 수 있다. 식물의 배아 캘러스는 아그로박테리움-매개된 유전자 전달을 통해 형질전환될 수 있다. 1차 트랜스제닉 계통은 부위-특이적 DNA 변화에 대해 스크리닝될 수 있고, 확인될 수 있으며, PCR 유전자형결정이 결실된 서열을 갖는 돌연변이체를 확인하는데 사용될 수 있다. 진핵 세포에서의 단백질 함량은 증가되고, 따라서 방법은 증가된 단백질 함량을 선택하는 것을 추가로 포함할 수 있다.
진핵 세포는 세포의 집합, 조직, 기관 또는 유기체의 부분일 수 있다. 세포 또는 세포의 집합 또는 그의 자손인 경우에, 방법은 그로부터 유전자 변형된 조직, 기관 또는 유기체를 생성시키는 것을 추가로 포함할 수 있다. 유기체는 식물, 예컨대 작물 식물, 예컨대 대두, 벼 또는 옥수수, 단자엽, 쌍자엽, 또는 조류, 예컨대 단세포 편모충, 예컨대 클라미도모나스 종일 수 있다. 실시양태에서, 유기체는 대두, 벼 또는 옥수수이다. 식물은 관련 기술분야에 공지되어 있으며 본원에 기재된 방법에 따라 교배 및 역교배되고 증가된 단백질 함량에 대해 선택될 수 있다.
또 다른 실시양태에서, 본 개시내용은 전사 리프레서 결합 부위를 포함하는 프로모터를 포함하는 NF-YC4 유전자를 포함하는 식물 세포에서 병원체 또는 해충에 대한 저항성을 증가시키는 방법을 제공한다. 병원체는 박테리아, 바이러스, 진균 또는 종자 식물일 수 있고, 해충은 곤충, 플라스모디오포리드, 응애 또는 선충류이며, 이들 모두의 예는 관련 기술분야에 공지되어 있고 본원에 기재되어 있다. 실시양태에서, 병원체는 박테리아 또는 바이러스이고, 해충은 진딧물이다. 방법은 NF-YC4 유전자 내 전사 리프레서 결합 부위를 변형시켜, 전사 리프레서가 NF-YC4 유전자의 전사를 방지할 수 없도록 하는 것을 포함한다. 방법은 dualRNA-Cas9, 즉 표적-특이적 crRNA 및 표적-독립적 트랜스-활성화 crRNA (tracrRNA)와 CRISPR-연관 단백질 9 (Cas9)와의 복합체화에 의해 형성된 활성 DNA 엔도뉴클레아제를 세포 내로 도입하는 것을 포함한다. 엔도뉴클레아제는 crRNA 내 20-bp 가이드 서열 및 프로토-스페이서 인접 모티프 (PAM; 5'-NGG-3' 또는 5'-NAG-3')로 구성된 23-bp 표적 DNA 서열을 절단한다. 임의의 적합한 Cas9, 예컨대 스트렙토코쿠스 피오게네스로부터의 Cas9가 사용될 수 있다. 식물 세포에서의 병원체 또는 해충에 대한 저항성은 증가되고, 따라서 방법은 병원체 또는 해충에 대한 증가된 저항성을 선택하는 것을 추가로 포함할 수 있다.
방법은 서열식별번호: 16에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 갖는 쿠아-퀸 전분 (QQS) 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 식물 세포 또는 식물 내로 도입하고 그 안에서 발현하는 것을 추가로 포함할 수 있으며, 여기서 뉴클레오티드 서열은 프로모터에 작동가능하게 연결된다.
식물 세포는 세포의 집합, 조직, 기관 또는 유기체의 부분일 수 있다. 세포 또는 세포의 집합 또는 그의 자손인 경우에, 방법은 그로부터 유전자 변형된 조직, 기관 또는 식물을 생성시키는 것을 추가로 포함할 수 있다. 식물은 작물 식물, 예컨대 대두, 벼 또는 옥수수, 단자엽 또는 쌍자엽일 수 있다. 식물은 관련 기술분야에 공지되어 있으며 본원에 기재된 방법에 따라 교배 및 역교배되고 병원체 또는 해충에 대한 증가된 저항성에 대해 선택될 수 있다.
프로그램가능한 뉴클레아제 및/또는 상동 주형, 예컨대 표적화 벡터 또는 단일-가닥 올리고데옥시뉴클레오티드 (ssODN)는 관련 기술분야에 공지된 바와 같은 임의의 적합한 방법을 사용하여 표적 세포 내로 전달된다. 이러한 방법은, 예를 들어 배양된 세포, 배아 또는 전체 유기체 내로의 플라스미드 DNA, 시험관내-전사된 mRNA, 바이러스 벡터 또는 정제된 단백질의 전달을 포함한다. 프로그램가능한 뉴클레아제는 빈번하게 플라스미드 DNA의 전기천공 또는 리포솜 형질감염에 의해 세포주 내로 도입된다. 시험관내-전사된 mRNA는 빈번하게 1-세포 배아 내로 미세-주사된다. 비-통합 바이러스 벡터, 예컨대 인테그라제-결핍 렌티바이러스 벡터 (IDLV), 아데노바이러스 및 아데노-연관 바이러스 (AAV)는, IDLV가 고도로 상동인 TALE 반복부의 존재로 인해 TALEN과 비상용성이어서 원치않는 재조합 이벤트를 유도할 수 있기는 하지만, 시험관내 및 생체내에서 사용될 수 있다. 단백질의 사용은 외래 DNA의 원치않는 혼입을 회피하고, 코돈 최적화 및 프로모터의 선택에 대한 우려를 제거하며, Cas9의 신생 정제가 새로운 뉴클레아제를 구축하는데 요구되지 않기 때문에, RGEN에 편리할 수 있다.
세포 막을 가로지르는 TAL-절단 도메인 융합 단백질의 전위는 펩티드 서열, 예컨대 안텐나페디아의 제3 헬릭스 (Prochiantz, Curr. Opi. Neurobiol. 6: 629-634 (1996); Derossi et al., J. Biol. Chem. 269: 10444 (1994)), 또는 신호 펩티드, 예컨대 신호 펩티드 K-FGF의 소수성 도메인 (Lin et al., J. Biol. Chem. 270: 14255-14258 (1995))의 사용에 의해 용이해질 수 있다. 다른 펩티드는 HIV의 tat 단백질의 11-아미노산 펩티드, p16 단백질의 아미노산 84-103에 상응하는 20-잔기 펩티드 서열 (Fahracus et al., Curr. Biol. 6: 84 (1996)), HSV로부터의 VP22 전위 도메인 (Elliot et al., Cell 88: 223-233 (1997)), 및 이원 독소 (Arora et al., J. Biol. Chem. 268: 3334-3341 (1993); Perelle et al., Infect. Immun. 61: 5147-5156 (1993); Stennark et al., J. Cell Biol. 113: 1025-1032 (1991); Donnelly et al., PNAS USA 90: 3530-3534 (1993); Carbonetti et al., Abstr. Ann. Meet. Am. Soc. Microbiol. 95: 295 (1995); Sebo et al., Infect. Immun. 63: 3851-3857 (1995); Klimpel et al., PNAS USA 89: 10277-10281 (1992); 및 Novak et al., J. Biol. Chem. 267: 17186-17193 (1992))를 포함한다. 펩티드 서열은 TAL-절단 융합 단백질과 융합될 수 있다. 임의로, 링커, 예컨대 펩티드 링커가 사용될 수 있다.
병원체 또는 해충에 의한 감염의 위험이 있는 식물 세포 또는 식물에서 병원체 또는 해충에 대한 저항성을 증가시키는 방법은 쿠아-퀸 전분 (QQS) 폴리펩티드 (서열식별번호: 16)를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 식물 내로 도입하고 그 안에서 발현하는 것을 추가로 포함할 수 있다. 뉴클레오티드 서열은 프로모터에 작동가능하게 연결된다. 따라서, 한 실시양태에서, 방법은 (a) 서열식별번호: 16의 아미노산 서열을 갖는 QQS 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드로 식물 세포를 형질전환시키고 (여기서 뉴클레오티드 서열은 프로모터에 작동가능하게 연결됨), (b) 형질전환된 식물 세포로부터 트랜스제닉 식물을 재생시키고, (c) 트랜스제닉 식물로부터, QQS가 결여되어 있으며 유사한 조건 하에 성장한 동일한 종의 형질전환되지 않은 식물과 비교하여 병원체 또는 해충에 대한 증가된 저항성을 나타내는 형질전환된 식물을 확인 및 선택하는 것을 추가로 포함한다.
QQS는 관련 기술분야에 공지된 바와 같은 임의의 적합한 방법을 사용하여 식물에서 발현될 수 있다 (예를 들어, 2015년 10월 13일에 허여되고 이와 관련된 교시에 대해 본원에 참조로 포함된 미국 특허 번호 9,157,091을 참조하며; 예를 들어, 그 안의 실시예 1 및 2 및 상세한 설명을 참조하며, 이들의 부분들은 참조의 용이성을 위해 이 단락 및 다음 2개의 단락에서 재현됨). 예를 들어, QQS는 전기천공, 미세발사체 충격, 아그로박테리움-매개된 형질전환 (미국 특허 번호 9,157,091의 실시예 1 및 2에 예시된 바와 같음), 및 원형질체의 직접 접촉을 사용하여 트랜스진으로서 식물 내로 도입될 수 있다. 형질전환/형질감염 (뿐만 아니라 DNA를 식물 또는 진균 내로 도입하는데 사용되는 다른 기술) 및 단자엽 및 쌍자엽의 재생은 상용 문제이다. 사용된 특정한 방법은 형질전환/형질감염될 식물 또는 진균의 유형에 부분적으로 좌우될 것이다. 예를 들어, 수많은 프로토콜이, 칸 왕(Kan Wang)에 의해 편집되고 뉴저지주 토토와 소재 휴먼 프레스(Humana Press)에 의해 공개되었으며 그 전문이 본원에 참조로 구체적으로 포함된 문헌 [Agrobacterium Protocols, 2nd ed., Vols. 1 and 2, Methods in Molecular Biology]에 기재되어 있다. 이러한 프로토콜은 꽃 침지 형질전환 방법, 및 잎 외식편, 자엽 외식편 및 뿌리 외식편의 형질전환 방법, 뿐만 아니라 배럴 클로버, 담배, 보리, 옥수수, 벼 (인디카 및 자포니카), 호밀, 수수, 밀, 카놀라, 목화, 인도 겨자, 해바라기, 알팔파, 병아리콩, 클로버, 완두, 땅콩, 비둘기콩, 적색토끼풀, 대두, 테파리 콩, 토란, 양배추, 오이, 가지, 상추, 토마토, 당근, 카사바, 감자, 고구마, 참마, 버뮤다 그래스, 다년생 라이그래스, 스위치그래스, 톨 페스큐, 터프 그래스, 미국 느릅나무, 굴참나무, 유칼립투스 나무, 소나무, 포플러, 고무 나무, 바나나, 시트러스, 커피, 파파야, 파인애플, 사탕수수, 미국 밤, 사과, 블루베리, 포도덩굴, 딸기, 호두, 카네이션, 국화, 난초, 페튜니아, 장미, 인삼, 대마, 아편 양귀비 및 버섯의 형질전환에 대한 특정 프로토콜을 포함한다. 곡류의 아그로박테리움-매개된 형질전환의 다른 방법은 전문이 본원에 참조로 구체적으로 포함된 문헌 [Shrawat et al., Plant Biotech. J. 4(6): 575-603 (Nov. 2006)]에 기재되어 있다. 콩과식물의 형질전환의 다른 방법은 전문이 본원에 참조로 구체적으로 포함된 문헌 [Somers et al., Plant Physiol. 131(3): 892-899 (March 2003)]에 기재되어 있다. 벼의 형질전환에 유용한 방법은 둘 다 전문이 본원에 참조로 구체적으로 포함된 문헌 [Giri et al., Biotech. Adv. 18(8): 653-683 (Dec. 2000), 및 Hiei et al., Plant Mol. Biol. 35(1-2): 205-218 (Sept. 1997)]에 기재되어 있다. 둘 다 전문이 본원에 참조로 구체적으로 포함된 문헌 [Vasil et al., Methods Molec. Biol. 111: 349-358 (1999), 및 Jones et al., Plant Methods 1(1): 5 (Sept. 5, 2005)]은 밀의 형질전환에 유용한 방법을 기재한다. 보리에서의 직접적 DNA 흡수의 사용은 전문이 본원에 참조로 구체적으로 포함된 문헌 [Lazzeri, Methods Molec. Biol. 49: 95-106 (1996)]에 기재되었다. 딸기를 형질전환시키기 위한 생물반응기 시스템에서의 일시적 침지의 사용은 전문이 본원에 참조로 구체적으로 포함된 문헌 [Hanhineva et al., BMC Biotech. 7: 11 (2007)]에 기재되어 있다. 색소체, 예컨대 엽록체, 구체적으로 담배에서의 엽록체 내로의 트랜스진의 도입은 전문이 본원에 참조로 구체적으로 포함된 문헌 [Daniell et al., Trends Biotech. 23(5): 238-245 (May 2005)]에 기재되었다. 이와 관련하여, 문헌 [Lutz et al., Plant Physiol. 145(4): 1201-1210 (2007)] (그 전문이 본원에 참조로 구체적으로 포함됨)은 고등 식물에서 색소체 게놈의 형질전환을 위한 벡터의 선택에 있어서 안내를 제공한다. 종-특이적 엽록체 벡터의 체세포 배아발생은 또한, 예를 들어 식물, 예컨대 대두, 당근 및 목화에서 적용된다. 비트의 형질전환에 유용한 다른 방법은 전문이 본원에 참조로 구체적으로 포함된 문헌 [Golovko et al., Tsitol. Genet. 39(3): 30-36 (May-June 2005)]에 기재되었다.
QQS의 코딩 도메인 서열 (CDS)을 코딩하는 뉴클레오티드 서열은 식물에서의 발현을 위해 벡터 또는 카세트 (본원에서 벡터로 총칭됨) 내로 혼입될 수 있다. 식물 세포의 안정한 형질전환 또는 트랜스제닉 식물의 확립에 적합한 수많은 발현 벡터가 기재되었다 (예를 들어, 문헌 [Weissbach et al., Methods for Plant Molecular Biology, Academic Press, New York, NY (1989); 및 Gelvin et al., Plant Molecular Biology Manual, Kluwer Academic Publishers, Norwell, MA (1990)] 참조). 아그로박테리움 투메파시엔스(Agrobacterium tumefaciens)로부터의 Ti 플라스미드 또는 이원 아그로박테리움 벡터 (Bevan, Nucl. Acids Res. 12: 8711-8721 (1984))는 단자엽 및 쌍자엽을 형질전환시키는데 사용될 수 있다. 비-Ti 벡터, 예컨대 바이러스 벡터는 DNA를 식물 세포, 조직, 배아 및 식물 내로 전달하는데 사용될 수 있다. 비-Ti 벡터는 리포솜-매개된 형질전환, 폴리에틸렌 글리콜 (PEG)-매개된 형질전환, 바이러스 형질감염, 미세-주사, 진공 침윤, 식물 원형질체의 전기천공, 미세발사체 충격, 탄화규소 휘스커 등의 사용을 통해 도입될 수 있다. 예를 들어, 문헌 [Ammirato et al., Handbook of Plant Cell Culture - Crop Species, MacMillan Pub. Co. (1984); Shimamoto et al., Nature 338: 274-276 (1989); Fromm et al., Bio/Technology 8: 833-839 (1990); 및 Vasil et al., Biol. Technology 8: 429-434 (1990)]을 참조한다.
코딩 서열 이외에도, 식물 형질전환/형질감염 벡터는 1개 이상의 5' 및 3' 전사 조절 서열을 포함한다. 전사 조절 서열은 프로모터, 전사 개시 부위, 전사 종결 부위, 폴리아데닐화 신호 및 3' 종결인자 영역 (예를 들어, 감자의 PI-II 종결인자 영역, 옥토핀 신타제 3' 종결인자 영역, 또는 노팔린 신타제 3' 종결인자 영역)을 포함할 수 있다. 통상적인 핵 프로세싱된 인트론이 존재하는 경우에, 1개 이상의 RNA 프로세싱 신호, 예컨대 인트론 스플라이스 부위가 또한 포함될 수 있다. 임의의 적합한 프로모터가 사용될 수 있다. 이와 관련하여, QQS 프로모터가 사용될 수 있다. 대안적으로, 비-QQS 프로모터가 사용될 수 있다. 프로모터는, 예를 들어 구성적, 합성 (예를 들어, 하이브리드), 유도성, 발생적으로 조절되는, 환경적으로 조절되는, 호르몬으로 조절되는, 화학적으로 조절되는, 세포-특이적, 또는 조직-특이적 (예를 들어, 종자-특이적) 프로모터일 수 있다. 구성적 프로모터는 콜리플라워 모자이크 바이러스 (CaMV) 35S 프로모터, 노팔린 신타제 프로모터 및 옥토핀 신타제 프로모터를 포함한다. 환경적으로 조절되는 유도성 프로모터는, 예를 들어 광에 의해 유도되는 프로모터를 포함한다. 나핀 프로모터, 파세올린 프로모터 및 DC3 프로모터는 종자-특이적 프로모터의 예이며, 반면에 dru1 프로모터, 2A11 프로모터 및 토마토 폴리갈락투로나제 프로모터는 과실-특이적 프로모터의 예이고, PTA29, PTA26 및 PTA13은 화분-특이적 프로모터의 예이다. pBAN 프로모터는 아라비돕시스에서의 종피 프로모터이며, 반면에 p26, p63 및 p63tr은 아라비돕시스로부터의 초기 종자 프로모터이다 (예를 들어, 미국 특허 출원 공개 번호 2009/0031450 참조). 뿌리-특이적 프로모터의 예는 미국 특허 번호 5,618,988; 5,837,848; 및 5,905,186에 기재되어 있다. 다른 프로모터는 옥신, 시토키닌, 지베렐린, 메틸 자스모네이트, 살리실산, 열, 광 등에 의해 유도된다.
방법의 실시는 관련 기술분야에 공지되어 있으며 문헌 및 본원에 기재된 통상적인 기술을 사용한다. 예를 들어, 문헌 [Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd and 3rd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY (1989 and 2001); Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York, NY (1987); Methods in Enzymology, Academic Press, San Diego, CA, in particular Vol. 34 "Chromatin"; Chromatin Structure and Function, 3rd ed., Academic Press, San Diego, CA (1998); 및 Methods in Molecular Biology, Humana Press, Totowa, NJ, in particular Vol. 119, "Chromatin Protocols"]을 참조한다.
DNA 구축물을 숙주 식물의 게놈 내로 도입하는데 사용되는 통상적인 기술에 대해서는, 예를 들어 문헌 [Weissbach & Weissbach, Methods for Plant Molecular Biology, Section VIII, pp. 421-463, Academic Press, New York, NY (1988), 및 Grierson & Corey, Plant Molecular Biology, 2nd ed., Blackie, London, UK (1988)]을 참조한다. 예를 들어, DNA 구축물은 식물 세포 원형질체의 전기천공 및 미세주사와 같은 기술을 사용하여 식물 세포의 게놈 DNA 내로 직접적으로 도입될 수 있거나, 또는 DNA 구축물은 DNA 입자 충격과 같은 바이오리스틱 방법을 사용하여 식물 조직에 직접적으로 도입될 수 있다 (예를 들어, 문헌 [Klein et al., Nature 327: 70-73 (1987)] 참조). 대안적으로, DNA 구축물은 적합한 T-DNA 플랭킹 영역과 조합될 수 있고, 통상적인 아그로박테리움 투메파시엔스 숙주 벡터 내로 도입될 수 있다. 이원 벡터의 무력화 및 사용을 포함한, 아그로박테리움 투메파시엔스-매개된 형질전환 기술은 문헌에 기재되어 있다 (예를 들어, 문헌 [Horsch et al., Science 233: 4967-498 (1984), 및 Fraley et al., PNAS USA 80: 4803 (1983)] 참조). 아그로박테리움 투메파시엔스 숙주의 병독성 기능은, 세포가 이원 T DNA 벡터 (Bevan, Nucleic Acid Research 12: 8711-8721 (1984)) 또는 공동-배양 절차 (Horsch et al., Science 227: 1229-1231 (1985))를 사용하여 박테리아에 의해 감염되는 경우에, 식물 세포 DNA 내로 구축물 및 인접 마커의 삽입을 지시할 것이다. 일반적으로, 아그로박테리움 형질전환 시스템은 쌍자엽을 조작하는데 사용된다 (Bevan et al., Ann. Rev. Genet. 16: 357-384 (1982); Rogers et al., Methods Enzymol. 118: 627-641 (1986)). 아그로박테리움 형질전환 시스템은 또한 단자엽을 형질전환시키는데 사용될 수 있다 (Hernalsteen et al., EMBO J. 3: 3039-3041 (1984); Hooykass-Van Slogteren et al., Nature 311: 763-764 (1984); Grimsley et al., Nature 325: 1677-1679 (1987); Boulton et al., Plant Mol. Biol. 12: 31-40 (1989); 및 Gould et al., Plant Physiol. 95: 426-434 (1991)).
대안적 유전자 전달 및 형질전환 방법은 네이키드 DNA의 칼슘-매개된, 폴리에틸렌 글리콜 (PEG)-매개된 또는 전기천공-매개된 흡수를 통한 원형질체 형질전환 (Paszkowski et al., EMBO J 3: 2717-2722 (1984); Potrykus et al., Molec. gen. Genet. 199: 169-177 (1985); Fromm et al., PNAS USA 82: 5824-5828 (1985); 및 Shimamoto, Nature 338: 274-276 (1989)) 및 식물 조직의 전기천공 (D'Halluin et al., Plant Cell 4: 1495-1505 (1992))을 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 식물 세포 형질전환을 위한 추가의 방법은 미세주사, 탄화규소-매개된 DNA 흡수 (Kaeppler et al., Plant Cell Reporter 9: 415-418 (1990)), 및 미세발사체 충격 (Klein et al.,. PNAS USA 85: 4305-4309 (1988); 및 Gordon-Kamm et al., Plant Cell 2: 603-618 (1990))을 포함한다.
형질전환된 세포 (또는 세포의 집합, 캘러스, 조직, 기관 또는 유기체, 예를 들어 식물)는 특정한 형질, 예컨대 마커 유전자의 발현, 증가된 단백질 함량, 또는 병원체 또는 해충에 대한 증가된 저항성에 대해 세포를 선택 또는 스크리닝함으로써 확인 및 단리될 수 있다. 이러한 스크리닝 및 선택 방법론은 관련 기술분야에 널리 공지되어 있다. 추가로, 물리적 및 생화학적 방법이 형질전환체를 확인하는데 사용될 수 있다. 이들은 서던 블롯, PCR 증폭, 노던 블롯, S1 RNase 보호, 프라이머-연장, RT-PCR, 효소적 검정, 단백질 겔 전기영동, 웨스턴 블롯, 면역-침전, 효소-연결된 면역검정, 계내 혼성화, 효소 염색 및 면역 염색을 포함한다.
형질전환된 세포, 예컨대 형질전환된 식물 세포는 배양되어 형질전환된 유전자형 및 따라서 목적하는 표현형을 지니는 전체 식물을 재생시킬 수 있다. 이러한 재생 기술은 조직 배양 성장 배지에서의 특정 피토호르몬의 조작에 좌우되며, 전형적으로는 목적하는 뉴클레오티드 서열과 함께 도입된 살생물제 및/또는 제초제 마커에 좌우된다 (예를 들어, 문헌 [Evans et al., "Protoplasts Isolation and Culture," in Handbook of Plant Cell Culture, pp. 124-176, Macmillian Publishing Co., New York, NY (1983); Binding, Regeneration of Plants, Plant Protoplasts, pp. 21-73, CRC Press, Boca Raton, FL (1985); 및 Klee et al., Ann. Rev. Plant Phys. 38: 467-486 (1987)] 참조).
조작 또는 변형된 프로모터, 바람직하게는 단백질 생산 또는 병원체 또는 해충에 대한 저항성을 증가시키는 프로모터를 갖는 NF-YC4는 단리되어, 동일한 종, 동일한 속이지만 상이한 종, 또는 상이한 패밀리 또는 다른 수준의 계통발생으로부터의 것일 수 있는 또 다른 진핵생물, 예컨대 또 다른 식물에 전달될 수 있다. 조작 또는 변형된 전사 리프레서 결합 부위를 갖는 NF-YC4는 표준 번식 기술 및 역교배를 사용하여 또 다른 진핵생물, 예컨대 또 다른 식물 내로 도입될 수 있다. 예를 들어, 조작 또는 변형된 프로모터를 갖는 NF-YC4를 갖는 식물이 조작 또는 변형된 프로모터를 갖는 NF-YC4가 결여되어 있는 식물과 교배될 수 있고, 생성된 세대들이 교배될 수 있고, 증가된 단백질 생산 또는 병원체 또는 해충에 대한 증가된 저항성을 나타내는 식물이 선택될 수 있다. 따라서, 조작 또는 변형된 프로모터를 갖는 NF-YC4를 갖는 식물이 변형된 프로모터를 갖는 NF-YC4를 갖지 않거나 또는 조작 또는 변형된 프로모터를 갖는 상이한 유전자를 갖는 식물과 교배되는 경우에, 잡종 종자가 수확되고, 이를 심어 잡종 식물 또는 그의 부분을 수득할 수 있다. 조작 또는 변형된 프로모터를 갖는 NF-YC4를 가지며 조직 배양을 잘 받아들이는 식물은 관련 기술분야에 공지된 조직 배양 방법을 사용하는 조직 배양 및 식물의 재생을 위한 세포의 공급원일 수 있다. 유사한 번식 기술이 비-인간 동물에 사용될 수 있다.
진핵 세포는 세포의 집합, 조직, 기관 또는 유기체의 부분일 수 있다. 한 실시양태에서, 유기체는 식물, 예컨대 작물 식물, 뿌리 작물 또는 원예 작물일 수 있다. 작물 식물의 예는 대두, 벼, 옥수수, 밀, 기장, 보리, 알팔파, 토마토, 사과, 배, 딸기, 오렌지, 수박, 페퍼, 당근, 감자, 사탕무, 참마, 상추, 시금치, 해바라기, 및 평지 종자, 현화 식물, 예컨대 페튜니아, 장미 및 국화, 침엽수 및 소나무 (예를 들어, 소나무, 전나무 및 가문비나무), 식물환경복원에 사용되는 식물 (예를 들어, 중금속-축적 식물), 및 실험 목적으로 사용되는 식물 (예를 들어, 아라비돕시스)을 포함한다. 식물은 단자엽 또는 쌍자엽일 수 있다. 단자엽의 예는 기름 야자, 사탕수수, 바나나, 수단 그래스, 옥수수, 밀, 호밀, 보리, 귀리, 벼, 기장 및 수수를 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 쌍자엽의 예는 홍화, 알팔파, 대두, 커피, 아마란스, 평지씨, 땅콩 및 해바라기를 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 쌍자엽 목은 목련목, 붓순나무목, 녹나무목, 후추목, 쥐방울덩굴목, 수련목, 미나리아재비목, 양귀비목, 사라세니아과, 수레나무목, 조록나무목, 두충목, 레이트네리아목, 소귀나무목, 참나무목, 목마황목, 석죽목, 바티스목, 마디풀목, 갯질경이목, 오이과목, 차나무목, 아욱목, 쐐기풀목, 오예목, 제비꽃목, 버드나무목, 카파리스목, 진달래목, 돌매화나무목, 감나무목, 앵초목, 장미목, 콩목, 포도스테뭄목, 개미탑목, 도금양목, 층층나무목, 프로테아목, 단향목, 라플레시아목, 노박덩굴목, 대극목, 갈매나무목, 무환자나무목, 가래나무목, 쥐손이풀목, 원지목, 산형화목, 용담목, 꽃고비목, 꿀풀목, 질경이목, 현삼목, 초롱꽃목, 꼭두서니목, 산토끼꽃목 및 국화목을 포함한다. 쌍자엽 속은 아트로파, 알세오다프네, 아나카르디움, 아라키스, 베일쉬미에디아, 브라시카, 카르타무스, 코쿨루스, 크로톤, 쿠쿠미스, 시트러스, 시트룰루스, 캅시쿰, 카타란투스, 코코스, 코페아, 쿠쿠르비타, 다우쿠스, 두구에티아, 에스크스콜지아, 피쿠스, 프라가리아, 갈루시움, 글리신, 고시피움, 헬리안투스, 헤베아, 히오시아무스, 락투카, 란돌피아, 리눔, 리트세아, 리코페르시콘, 루피누스, 만니호트, 마조라나, 말루스, 메디카고, 니코티아나, 올레아, 파르테니움, 파파베르, 페르세아, 파세올루스, 피스타시아, 피숨, 피루스, 프루누스, 라파누스, 리시누스, 세네시오, 시노메니움, 스테파니아, 시나피스, 솔라눔, 테오브로마, 트리폴리움, 트리고넬라, 비시아, 빈카, 빌리스 및 비그나를 포함한다. 단자엽의 목은 택사목, 자라풀목, 나자스말목, 트리우리스목, 닭의장풀목, 곡정초목, 레스티오목, 벼목, 골풀목, 사초목, 부들목, 파인애플목, 생강목, 종려목, 시클란투스목, 판다누스목, 천남성목, 백합목 및 난초목을 포함한다. 단자엽 속은 알리움, 안드로포곤, 에라그로스티스, 아스파라거스, 아베나, 시노돈, 엘라에이스, 페스투카, 페스툴롤리움, 헤메로칼리스, 호르데움, 렘나, 롤리움, 무사, 오리자, 파니쿰, 펜니세툼, 플레움, 포아, 세칼레, 소르굼, 트리티쿰 및 제아를 포함한다. 다른 식물은 겉씨식물문, 예컨대 구과목, 은행나무목, 소철목 및 네타목, 예컨대 아비에스, 쿤닝하미아, 피세아, 피누스 및 슈도츠가 속, 예컨대 전나무 및 소나무를 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 유기체는 조류, 예컨대 단세포 편모충, 예컨대 클라미도모나스 종일 수 있다. 또 다른 실시양태에서, 유기체는 비-인간 동물, 예컨대 가축 동물, 예를 들어, 소, 돼지, 닭, 칠면조, 양 및 들소일 수 있다.
병원체는 박테리아, 바이러스, 진균 또는 종자 식물일 수 있다. 해충은 곤충 (예컨대 진딧물), 플라스모디오포리드, 응애 또는 선충류일 수 있다. 실시양태에서, 병원체는 박테리아 또는 바이러스이고, 해충은 진딧물이다.
박테리아는 임의의 식물 박테리아일 수 있다. 예는 후벽균, 악티노박테리움 또는 프로테오박테리움을 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 프로테오박테리움은 알파프로테오박테리움, 베타프로테오박테리움 또는 감마프로테오박테리움일 수 있다. 알파프로테오박테리움은 아그로박테리움, 스핑고모나스 또는 칸디다투스 리베리박터일 수 있다. 베타프로테오박테리움은 아시도보락스, 부르크홀데리아, 랄스토니아 또는 크실로필루스일 수 있다. 감마프로테오박테리움은 엔테로박테리아세아에, 슈도모나다세아에 또는 크산토모나다세아에일 수 있다. 엔테로박테리아세아에는 브렌네리아, 딕케야, 엔테로박터, 에르위니아, 에윙겔라, 판토에아, 펙토박테리움, 칸디다투스 플로모박터, 삼소니아 또는 세라티아일 수 있다. 슈도모나다세아에는 슈도모나스일 수 있다. 크산토모나다세아에는 크산토모나스 또는 크실렐라일 수 있다. 박테리아는 클라비박터, 쿠르토박테리움, 라타이이박터, 레이프소니아, 노카르디아, 로도코쿠스, 스트렙토미세스, 바실루스, 클로스트리디움, 스피로플라스마, 칸디다투스 피토플라스마 또는 마이크로박테리아일 수 있다. 박테리아의 구체적 예는 클라비박터 미키가넨시스(Clavibacter michiganensis) 또는 그의 아종, 쿠르토박테리움 플라쿰파시엔스(Curtobacterium flaccumfaciens), 라타이이박터 라타이이(Rathayibacter rathayi), 라타이이박터 트리티시(Rathayibacter tritici), 라타이이박터 톡시쿠스(Rathayibacter toxicus), 레이프소니아 크실리(Leifsonia xyli) 또는 그의 아종, 로도코쿠스 파시안스(Rhodococcus fascians), 스핑고모나스 수베리파시엔스(Sphingomonas suberifaciens), 스핑고모나스 멜로니스(Sphingomonas melonis), 아그로박테리움 비티스(Agrobacterium vitis), 아그로박테리움 투메파시엔스(Agrobacterium tumefaciens), 아그로박테리움 루비(Agrobacterium rubi), 아그로박테리움 라리무레이(Agrobacterium larrymoorei), 아시도보락스 아베나에(Acidovorax avenae), 에이. 아베나에 시트룰리(A. avenae citrulli), 에이. 아베나에 아베나에(A. avenae avenae), 부르크홀데리아 세파시아(Burkholderia cepacia), 부르크홀데리아 글라디올리(Burkholderia gladioli), 부르크홀데리아 안드로포고니스(Burkholderia andropogonis), 부르크홀데리아 카리오필리(Burkholderia caryophylli), 부르크홀데리아 글루마에(Burkholderia glumae), 부르크홀데리아 플란타리이(Burkholderia plantarii), 딕케야 다단티이(Dickeya dadantii), 딕케야 솔라니(Dickeya solani), 에르위니아 아밀로보라(Erwinia amylovora), 랄스토니아 솔라나세아룸(Ralstonia solanacearum), 랄스토니아 시지기이(Ralstonia syzygii), 칸디다투스 플로모박터 프라가리아에(Candidatus Phlomobacter fragariae), 칸디다투스 리베리박터 아시아티쿠스(Candidatus Liberibacter asiaticus), 펙토박테리움 카로토보룸(Pectobacterium carotovorum), 펙토박테리움 아트로셉티쿰(Pectobacterium atrosepticum), 슈도모나스 시린가에(Pseudomonas syringae), 슈도모나스 사바스타노이(Pseudomonas savastanoi), 슈도모나스 마르기날리스(Pseudomonas marginalis), 슈도모나스 비리디플라바(Pseudomonas viridiflava), 크산토모나스 아르보리콜라(Xanthomonas arboricola), 크산토모나스 악소노포디스(Xanthomonas axonopodis), 크산토모나스 캄페스트리스(Xanthomonas campestris), 크산토모나스 호르토룸(Xanthomonas hortorum), 크산토모나스 오리자에(Xanthomonas oryzae), 크산토모나스 악소노포디스(Xanthomonas axonopodis), 크산토모나스 트란스루센스(Xanthomonas translucens), 크산토모나스 바시콜라(Xanthomonas vasicola) 또는 크실렐라 파스티디오사(Xylella fastidiosa)를 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 문헌 [Mansfield et al. (Mol. Plant Pathol. 13: 614-629 (2012))]에 따르면, 상위 박테리아 식물 병원체는 슈도모나스 시린가에 병원체변종, 랄스토니아 솔라나세아룸, 아그로박테리움 투메파시엔스, 크산토모나스 오리자에 병원체변종 오리자에, 크산토모나스 캄페스트리스 병원체변종, 크산토모나스 악소노포디스 병원체변종 마니호티스, 에르위니아 아밀로보라, 크실렐라 파스티디오사, 딕케야 다단티이, 딕케야 솔라니, 펙토박테리움 카로토보룸 및 펙토박테리움 아트로셉티쿰이다.
진균은 임의의 식물 진균일 수 있다. 예는 자낭균류, 예컨대 푸사리움(Fusarium) 종 (푸사리움 시들음병의 병원체), 푸사리움 그라미네아룸(Fusarium graminearum), 푸사리움 옥시스포룸(Fusarium oxysporum), 티엘라비옵시스(Thielaviopsis) 종 (동고썩음병, 검은뿌리썩음병 및 티엘라비옵시스 뿌리썩음병의 병원체), 베르티실리움(Verticillium) 종, 마그나포르테 그리세아(Magnaporthe grisea) (도열병 및 잔디 회색 점무늬병의 병원체), 마그나포르테 오리자에(Magnaporthe oryzae), 스클레로티니아 스클레로티오룸(Sclerotinia sclerotiorum) (흰곰팡이병) 및 흰가루병을 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 다른 예는 담자균류, 예컨대 우스틸라고(Ustilago) 종, 우스틸라고 마이디스(Ustilago maydis), 리족토니아(Rhizoctonia) 종, 리족토니아 솔라니(Rhizoctonia solani), 파코프소라 파키리지(Phakopsora pachyrhizi) (대두 녹병의 병원체), 푹시니아(Puccinia) 종 (실질적으로 모든 곡물 및 재배 초본의 중증 녹병의 병원체), 및 아르밀라리아(Armillaria) 종 ("꿀 진균" 종; 나무 및 생산-가능 버섯의 병독성 병원체)을 포함한다. 문헌 [Dean et al. (Mol. Plant Pathol. 13: 414-430 (2012))]에 따르면, 상위 10종의 식물 진균 병원체는 마그나포르테 오리자에, 보트리티스 시네레아(Botrytis cinerea), 푹시니아 종, 푸사리움 그라미네아룸, 푸사리움 옥시스포룸, 블루메리아 그라미니스(Blumeria graminis), 미코스파에렐라 그라미니콜라(Mycosphaerella graminicola), 콜레토트리쿰(Colletotrichum) 종, 우스틸라고 마이디스 및 멜람프소라 리니(Melampsora lini)이다. 문헌 [Kamoun et al. (Mol. Plant Pathol. 16: 413-434 (2015))]에 따르면, 상위 10종의 난균류는 피토프토라 인페스탄스(Phytophthora infestans) (역병), 히알로페로노스포라 아라비돕시디스(Hyaloperonospora arabidopsidis) (노균병), 피토프토라 라모룸(Phytophthora ramorum) (오크 급사병 및 라모룸병), 피토프토라 소자에(Phytophthora sojae) (줄기 및 뿌리썩음병), 피토프토라 카프시시(Phytophthora capsici) (마름병, 줄기 및 과실썩음병, 및 다양한 다른 것), 플라스모파라 비티콜라(Plasmopara viticola) (노균병), 피토프토라 신나모미(Phytophthora cinnamomi) (뿌리썩음병 및 가지마름병), 피토프토라 파라시티카(Phytophthora parasitica) (뿌리 및 줄기썩음병, 및 다양한 다른 것), 피티움 울티뭄(Pythium ultimum) (모잘록병 및 뿌리썩음병) 및 알부고 칸디다(Albugo candida) (흰녹병)이다.
종자 식물은 새삼, 겨우살이 또는 현삼과일 수 있다. 이러한 식물은 다른 식물에 반-기생 또는 기생한다.
바이러스는 임의의 식물 바이러스일 수 있다. 바이러스는 수액을 통해, 곤충에 의해, 선충류에 의해, 플라스모디오포리드에 의해, 응애에 의해, 종자에 의해 또는 화분에 의해 전파될 수 있다. 예는 알파모바이러스 (예를 들어, 브로모비리다에), 알파크립토바이러스 (예를 들어, 파르티티비리다에), 바드나바이러스, 베타크립토바이러스 (예를 들어, 파르티티비리다에), 비제미니바이러스 (예를 들어, 제미니비리다에), 브로모바이러스 (예를 들어, 브로모비리다에), 비모바이러스 (예를 들어, 포티비리다에), 카필로바이러스, 카를라바이러스, 카르모바이러스 (예를 들어, 톰부스비리다에), 콜리모바이러스, 클로스테로바이러스, 코모바이러스 (예를 들어, 코모비리다에), 쿠쿠모바이러스 (예를 들어, 브로모비리다에), 시토랍도바이러스 (예를 들어, 랍도비리다에), 디안토바이러스, 에나모바이러스, 파바바이러스 (예를 들어, 코모비리다에), 쿠쿠모바이러스 (예를 들어, 브로모비리다에), 시토랍도바이러스 (예를 들어, 랍도비리다에), 디안토바이러스, 에나모바이러스, 파바바이러스 (예를 들어, 코모비리다에), 피지바이러스 (예를 들어, 레오비리다에), 푸로바이러스, 호르데이바이러스, 히브리제미니바이러스 (예를 들어, 제미니비리다에), 이다에오바이러스, 일라르바이러스 (예를 들어, 브로모비리다에), 이포모바이러스 (예를 들어, 포티비리다에), 루테오바이러스, 마클로모바이러스, 마클루라바이러스, 마라피바이러스, 모노제미니바이러스 (예를 들어, 제미니비리다에), 나나바이러스, 네크로바이러스, 네포바이러스 (예를 들어, 코모비리다에), 뉴클레오랍도바이러스 (예를 들어, 랍도비리다에), 오리자바이러스 (예를 들어, 레오비리다에), 우르미아바이러스, 피토레오바이러스 (예를 들어, 레오비리다에), 포텍스바이러스, 포티바이러스 (예를 들어, 포티비리다에), 리모바이러스 (예를 들어, 포티비리다에), 세퀴바이러스 (예를 들어, 세퀴비리다에), 소베모바이러스, 테누이바이러스, 토바모바이러스, 토브라바이러스, 톰부스바이러스 (예를 들어, 톰부스비리다에), 토스포바이러스 (예를 들어, 분야비리다에), 트리코바이러스, 티모바이러스, 움브라바이러스, 비할당 포티바이러스 (예를 들어, 포티비리다에), 비할당 랍도바이러스 (예를 들어, 랍도비리다에), 바리코사바이러스, 와이카바이러스 (예를 들어, 세퀴비리다에), 및 비분류 바이러스 속의 구성원을 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 바이러스의 다른 예는 감귤 트리스테자 바이러스, 보리 황색 위축 바이러스, 감자 잎말림병 바이러스 및 토마토 덤불 성장위축 바이러스를 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 문헌 [Scholthof et al. (Mol. Plant Pathol. 12: 938-954 (2011))]에 따르면, 상위 10종의 식물 바이러스는 담배 모자이크 바이러스, 토마토 점무늬 시들음병 바이러스, 토마토 황색 잎말림병 바이러스, 오이 모자이크 바이러스, 감자 바이러스 Y, 콜리플라워 모자이크 바이러스, 아프리카 카사바 모자이크 바이러스, 자두 폭스 바이러스, 브롬 모자이크 바이러스 및 감자 바이러스 X이다.
수액을 통해 전파되는 바이러스의 예는 담배 모자이크 바이러스, 감자 바이러스 X, 감자 바이러스 Y 및 오이 모자이크 바이러스를 포함하나 이에 제한되지는 않는다.
곤충에 의해 전파되는 바이러스의 예는 랍도비리다에, 레오비리다에, 포티바이러스, 쿠쿠모바이러스, 루테오바이러스, 베고모바이러스, 토스포바이러스, 코모바이러스, 소베모바이러스, 토마토 황색 잎말림병 바이러스, 토마토 슈도-컬리 탑 바이러스, 토마토 점무늬 시들음병 바이러스 및 상추 감염성 황색 바이러스를 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 곤충은 진딧물, 가루이, 호퍼, 총채벌레 또는 딱정벌레일 수 있다. 진딧물은 포티바이러스, 쿠쿠모바이러스 및 루테오바이러스를 퍼트릴 수 있다. 가루이는 베고모바이러스, 토마토 황색 잎말림병 바이러스 및 상추 감염성 황색 바이러스를 퍼트릴 수 있다. 호퍼는 랍도비리다에, 레오비리다에 및 토마토 슈도-컬리 탑 바이러스를 퍼트릴 수 있다. 총채벌레는 토스포바이러스 및 토마토 점무늬 시들음병 바이러스를 퍼트릴 수 있다. 딱정벌레류는 코모바이러스 및 소베모바이러스를 퍼트릴 수 있다.
선충류는, 예를 들어 네포바이러스, 토브라바이러스, 담배 원형반점 바이러스 및 담배 얼룩무늬 바이러스를 퍼트릴 수 있다. 문헌 [Jones et al. (Mol. Plant Pathol. 14: 946-961 (2013))]에 따르면, 상위 10종의 선충류는 뿌리혹 선충류 (즉, 멜로이도기네(Meloidogyne) 종), 낭포 선충류 (즉, 헤테로데라(Heterodera) 종 및 글로보데라(Globodera) 종), 뿌리썩이 선충류 (즉, 프라틸렌쿠스(Pratylenchus) 종), 천공 선충류 (즉, 라도폴루스 시밀리스(Radopholus similis)), 디틸렌쿠스 딥사시(Ditylenchus dipsaci), 소나무 시들음병 선충류 (즉, 부르사펠렌쿠스 크실로필루스(Bursaphelenchus xylophilus)), 잠두형 선충류 (즉, 로틸렌쿨루스 레니포르미스(Rotylenchulus reniformis)), 크시피네마 인덱스(Xiphinema index), 나코부스 아베란스(Nacobbus aberrans) 및 아펠렌코이데스 베세이이(Aphelenchoides besseyi)이다.
플라스모디오포리드는, 예를 들어 베니바이러스, 비모바이러스, 푸로바이러스, 페클루바이러스, 포모바이러스, 보리 황색 모자이크 바이러스 및 비트 괴사성 황색 엽맥 바이러스를 퍼트릴 수 있다.
응애는 리모바이러스, 트리티모바이러스 및 밀 줄무늬 모자이크 바이러스를 퍼트릴 수 있다.
종자는, 예를 들어 호르데이바이러스, 콩 일반 모자이크 바이러스 및 보리 줄무늬 모자이크 바이러스를 퍼트릴 수 있다.
외인성 DNA가 트랜스제닉 식물에 안정하게 혼입되고 작동가능한 것으로 확인되면, 유성 교배에 의해 다른 식물 내로 도입될 수 있다. 따라서, 증가된 단백질 함량 또는 병원체 또는 해충에 대한 증가된 저항성을 갖는 식물을 생산하는 방법이 또한 제공된다. 방법은 상기에 따라 수득된 식물을 제2 식물과 교배하여 자손 식물을 생산하고, 증가된 단백질 함량 또는 병원체 또는 해충에 대한 증가된 저항성을 갖는 자손 식물을 선택하는 것을 포함한다. 방법은 선택된 자손 식물을 상기 제2 식물과 교배하여 역교배 자손 식물을 생산하고, 증가된 단백질 함량 또는 병원체 또는 해충에 대한 증가된 저항성을 갖는 제1 역교배 자손 식물을 선택하여 선택된 역교배 자손 식물을 생산하고, 교배 및 선택을 3회 이상 반복하여 증가된 단백질 함량 또는 병원체 또는 해충에 대한 증가된 저항성을 갖는 역교배 자손 식물을 생산하는 것을 추가로 포함할 수 있다. 유사한 절차가 영양, 무성 및 유성 생식하는 조류, 및 비-인간 동물에서 사용될 수 있거나 또는 사용하기 위해 적합화될 수 있다.
NF-YC4 유전자가, 전사 리프레서가 NF-YC4의 전사를 방지할 수 없도록 조작 또는 변형된 전사 리프레서 결합 부위를 포함하는 프로모터를 포함하는 것인 세포, 세포의 집합, 조직, 기관 또는 유기체가 또한 제공된다. 세포, 세포의 집합, 조직, 기관 또는 유기체는, NF-YC4 유전자가 조작 또는 변형되지 않은 전사 리프레서 결합 부위를 포함하는 프로모터를 포함하는 것인 상응하는 세포, 세포의 집합, 조직, 기관 또는 유기체와 비교하여 증가된 단백질 함량을 갖는다. 실시양태에서, 유기체는 식물 또는 조류, 예컨대 단세포 편모충일 수 있다. 또 다른 실시양태에서, 유기체는 비-인간 동물, 예컨대 가축 동물, 예를 들어, 소, 돼지, 닭, 칠면조, 양 및 들소일 수 있다.
상기 언급된 식물의 종자가 또한 상기 언급된 유기체의 잡종, 예컨대 잡종 식물과 같이 제공된다. 잡종 식물의 종자가 또한 조류의 영양, 무성 및 유성 생식, 및 비-인간 동물의 수정란으로부터 생성되는 상응하는 구조물과 같이 제공된다. 다른 자손, 클론, 세포주 및 세포가 또한 제공된다.
실시예
하기 실시예는 본 개시내용을 예시하는 역할을 한다. 실시예는 청구된 바와 같은 본 발명의 범주를 제한하는 것으로 의도되지는 않는다.
실시예 1
본 실시예는 35S::QQS 및 35S::AtNF-YC4 융합 구축물의 제조 및 형질전환을 기재한다.
35S::QQS 및 35S::AtNF-YC4 융합 구축물은 이전에 기재된 바와 같이 증폭된 전장 코딩 서열을 이원 벡터 pB2GW7 내로 클로닝함으로써 제조하였다 (Li et al. (2015), 상기 문헌). 간략하게, QQS 코딩 도메인 서열 (CDS) 또는 아라비돕시스로부터의 NF-YC4 CDS (AtNF-YC4)를, 니코티아나 타바쿰(Nicotiana tabacum)으로부터의 노팔린 신타제로부터의 Pnos (nos 프로모터) 및 Tnos (nos 종결인자)의 제어 하에 Bar 유전자 (포스피노트리신 아세틸트랜스퍼라제 유전자)를 함유하는 벡터 pB2GW7에 삽입하였다 (벡터의 맵인 도 1a 및 1b 참조). 이 벡터 상의 CDS는 p35S (콜리플라워 모자이크 바이러스 (CaMV) 35S 프로모터)에 의해 제어되고 T35S (CaMV 35S)에 의해 종결된다. 단지 LB와 RB 사이의 영역만을 식물에 도입하여 트랜스제닉 식물을 생성시켰다.
구축물을 아라비돕시스 탈리아나 생태형 콜럼비아 (Col-0)에서의 형질전환을 위해 아그로박테리움 투메파시엔스 균주 GV3101 내로 도입하고, 대두 (글리신 맥스) 재배품종 윌리암 82 (Li et al. (2015), 상기 문헌), 벼 (오리자 사티바) 재배품종 키타케 및 옥수수 (제아 메이스) 계통 B104 내로의 형질전환을 위해 아그로박테리움 투메파시엔스 균주 EHA101 내로 도입하였다.
QQS를 발현하는 형질전환체 (QQS-E)는 이전에 기재된 바와 같이 BAR 선택에 이어서 QQS 유전자의 존재에 대한 폴리머라제 연쇄 반응 (PCR) 분석에 기초하여 확인하였다 (Li et al. (2015), 상기 문헌).
대두 QQS-E 윌리암스 82를 재배지에서 화분 공여자로서 사용하여 아이오와 대두 우량 계통 (IA1022, IA2079, IA2102, IA2053 및 IA3022)과 교배하였다 (윌리암스 82를 대조군으로서 사용하였다). F1 세대를 27/20℃에서 16시간 명기 및 8시간 암기의 제어 환경 하에 온실 내 화분에서 3개의 식물/화분으로 성장시켰다. F2 세대를 아이오와주 에임스에 있는 재배지에 식재하였다. QQS-E 돌연변이체는 BAR 선택에 이어서 QQS 유전자의 존재에 대한 PCR 분석에 기초하여 확인하였다. 제초제에 대한 저항성을 갖지 않고 QQS를 발현하지 않은 분리 야생형 (WT) 식물을 동기 대조군으로서 사용하였다.
벼 식물을 28/25℃에서 16시간 명기 및 8시간 암기의 제어 환경 하에 성장 챔버에서 성장시켰다. T3 세대 식물을 분석하였다. 유사하게, 식물을 제초제 및 PCR 분석에 의해 시험하여 형질전환체 및 WT 동기 대조군을 확인하였다.
옥수수 식물을 아이오와주 에임스에 있는 재배지에서 성장시켰다. 식물을 B104와 역교배하였다. 유사하게, 식물을 제초제 및 PCR 분석에 의해 시험하여 형질전환체 및 WT 동기 대조군을 확인하였다.
아라비돕시스를 이전에 기재된 바와 같이 형질전환시키고, 성장시키고, 수거하였다. 문헌 [Li et al. (2009), 상기 문헌]을 참조한다.
실시예 2
본 실시예는 식물 조성의 분석을 기재한다.
잎의 조성 (전분 염색 및 단백질의 정량화)을 성장 챔버에의 식재 후 20일 (DAP)에 아라비돕시스 묘목 싹에서 결정하고, 30 DAP에 식물로부터의 1차 분얼경의 제2 벼 잎 (지엽 옆)에서 결정하였다. 반복실험당 3개의 식물 (전분에 대한 것) 또는 5개의 식물 (단백질에 대한 것)을 분석하고, 각각의 독립적 T2 계통 (아라비돕시스) 및 T3 계통 (벼)으로부터의 3회의 반복실험을 분석하였다. 잎을 명기의 종료시에 수거하였다. 종자를 아라비돕시스, 벼 및 대두에 대한 개별 식물마다 수거하였다. 잎 및 종자 단백질 정량화를 위해, 식물 물질을 71℃에서 베이킹하였다. 건조 잎/종자 조직 (0.07 g)을 각각의 결정을 위해 사용하였다. 총 단백질 함량을 측정하였다. 총 질소를 LECO CHN-2000 (LECO, 미시간주 세인트 요셉)을 사용하여 결정하고, 단백질 함량으로 전환시켰다 (Li et al. (2015), 상기 문헌).
아라비돕시스의 전체 공중 부분을 I2/KI로 염색하였으며, 반면에 벼의 1차 분얼경의 제2 잎 (지엽 옆)의 중간부를 수집하고 작은 조각으로 절단하였다 (약 1-1.5 cm 길이).
대두 및 옥수수 종자를 브루인스(Bruins) 곡물 분석기 S/N 106110 (독일 뮌헨)을 사용하여 근적외선 분광분석법 (NIRS)에 의해 분석하였다 (대두에 대해서는 단백질, 오일 및 섬유; 옥수수에 대해서는 단백질, 오일 및 전분). 식물당 약 60 g의 종자를 시험하였으며, 각각의 계통에 대해 3회의 생물학적 반복실험이 있었다.
실시예 3
본 실시예는 효모 2종-하이브리드 검정을 기재한다.
매치메이커 시스템 3 (클론테크(Clontech), 캘리포니아주 마운틴 뷰)을 사용하여 3일령 황백화 묘목에 의해 구축된 아라비돕시스 콜럼비아 cDNA 라이브러리를 사용하여 QQS-상호작용 단백질을 확인하였다 (Arabidopsis.org/servlets/TairObject?type=library&id=23). 상호 효모 2종-하이브리드 검정을 위해, QQS 및 AtNF-YC4를 각각 pGBKT7 (미끼 벡터) 및 pGADT7 (먹이 벡터) 내로 클로닝하였다 (클론테크).
실시예 4
본 실시예는 이분자 형광 상보성 (BiFC) 검정을 기재한다.
QQS 및 AtNF-YC4를 각각 nYFP의 N-말단 (황색 형광 단백질 (YFP)의 N-말단 단부) 및 cYFP (YFP의 C-말단 단부)에 인-프레임으로 융합시켰다. QQS-nYFP 및 AtNF-YC4-cYFP 구축물로 형질전환된 아그로박테리움 균주 GV3101을 니코티아나 타바쿰 내로 공동-침윤시켰다. 재구성된 YFP 신호를 자이스(Zeiss) 악시오플란 II 형광 현미경 하에 침윤 48시간 후에 관찰하였다.
실시예 5
본 실시예는 HIS-MBP-태그부착된 재조합 NF-Y의 정제를 기재한다.
AtNF-YC4 유전자 (또는 다른 NF-Y 유전자 또는 유전자 단편)를 함유하는 이. 콜라이(E. coli) 형질전환체를 37℃에서 0.6 L의 루리아-베르타니 (LB) 배지에서 OD600 0.90까지 성장시킨 다음, 이소프로필-β-D-티오갈락토피라노시드 (IPTG)를 최종 농도 0.075 mM로 첨가하였다. 12℃에서 20시간 동안 인큐베이션한 후에, 유도된 세포를 5,000 x g로 5분 동안 원심분리하여 수거하였다. His-MBP-태그부착된 (즉, 6x히스티딘-말토스 결합 단백질-태그부착된) 단백질을 4℃에서 천연 조건 하에 Ni 세파로스 6 패스트 플로우 (지이 헬스케어 라이프 사이언시스(GE Healthcare Life Sciences), 펜실베니아주 피츠버그) 친화성 크로마토그래피를 사용하여 정제하였다. 세포 펠릿을 15 ml의 결합 완충제 (50 mM NaH2PO4, pH 8.0, 500 mM NaCl 및 30 mM 이미다졸) 중에 재현탁시켰다. 세포를 간헐적 초음파처리에 의해 용해시켰다. 10,000 x g로 20분 동안 원심분리한 후에, 수지를 청정화된 용해물에 첨가하였다. 4℃에서 30분 동안 진탕한 후에, 용해물-수지 혼합물을 칼럼에 로딩하였다. 수지를 세척 완충제 (50 mM NaH2PO4, pH 8.0, 500 mM NaCl 및 60 mM 이미다졸)로 세척하였다. 결합 단백질을 용리 완충제 (50 mM NaH2PO4, pH 8.0, 500 mM NaCl 및 250 mM 이미다졸)를 사용하여 칼럼으로부터 용리시켰다. 용리된 단백질을 PBS 완충제 (140 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 10 mM Na2HPO4 및 1.8 mM KH2PO4, pH 7.3)에 대해 2회 투석하였다. 단백질 농도를 표준물로서의 소 혈청 알부민 (BSA)을 사용하는 BCA 단백질 검정 키트 (써모 사이언티픽(Thermo Scientific), 미주리주 세인트 루이스)에 의해 결정하였다.
실시예 6
본 실시예는 GST-태그부착된 QQS의 발현 및 정제를 기재한다.
QQS 유전자를 발현하는 이. 콜라이 형질전환체를 37℃에서 1.2 L의 루리아-베르타니 (LB) 배지에서 OD600 0.9까지 성장시킨 다음, 이소프로필-β-D-1-티오갈락토피라노시드 (IPTG)를 최종 농도 0.075 mM로 첨가하였다. 12℃에서 20시간 동안 인큐베이션한 후에, 유도된 세포를 5,000 x g로 5분 동안 원심분리하여 수거하였다. GST-태그부착된 (즉, 글루타티온-S-트랜스퍼라제-태그부착된) QQS의 정제를 4℃에서 천연 조건 하에 글루타티온 세파로스 4B (지이 헬스케어 라이프 사이언시스) 친화성 크로마토그래피를 사용하여 수행하였다. 세포 펠릿을 15 ml의 PBS 완충제 (140 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 10 mM Na2HPO4 및 1.8 mM KH2PO4, pH 7.3) 중에 재현탁시키고, 세포를 간헐적 초음파처리에 의해 용해시켰다. 10,000 x g로 20분 동안 원심분리한 후에, 수지를 청정화된 용해물에 첨가하였다. 4℃에서 30분 동안 진탕한 후에, 용해물-수지 혼합물을 칼럼 상에 로딩하였다. 수지를 PBS로 세척하였다. 결합 단백질을 용리 완충제 (50 mM 트리스-HCl, 10 mM 환원 글루타티온, 5 mM DTT, pH 8.0)를 사용하여 칼럼으로부터 용리시켰다. 용리된 단백질을 PBS 완충제에 대해 2회 투석하였다. 단백질 농도를 표준물로서의 BSA를 사용하는 BCA 단백질 검정 키트 (써모 사이언티픽)에 의해 결정하였다.
실시예 7
본 실시예는 풀-다운 검정을 기재한다.
정제된 His-MBP-태그부착된 단백질 (5 μg)을 1% NP-40, 1 mM DTT 및 0.5 μg/μl BSA를 함유하는 PBS 완충제 1 ml 중에서 비드-고정화된 GST-QQS 융합 단백질 (10 μg)과 혼합하였다. 혼합물을 4℃에서 2시간 동안 인큐베이션하였다. 비드 상에 고정화된 GST 단백질을 음성 대조군으로서의 His-MBP-태그부착된 단백질과 함께 인큐베이션에 사용하였다. 비드를 원심분리에 의해 회수하고, 1 ml의 PBS 완충제로 6회 세척하고, 50 μl SDS-샘플 완충제 중에 재현탁시켰다. 15 μl의 생성된 샘플을 12% 겔 상의 SDS-PAGE, 이어서 이뮤노블롯팅 및 MBP에 대한 항혈청을 사용한 분석에 의해 분석하였다.
실시예 8
본 실시예는 통계적 설계 및 분석을 기재한다.
식물을 무작위화 완전 블록 설계 또는 완전 무작위화 설계로 성장, 수집 및 분석하였다. 정성 및 정량 분석을 각각의 독립적 트랜스제닉 계통 및 각각의 대조군으로부터 최소 3회의 생물학적 결정으로 수행하였다. 조성 분석을 위해, 식물 샘플을 무작위화 번호에 할당하고, 어떠한 유전자형의 지정자도 없이 무작위화 순서로의 결정을 위한 분석 시설에 제공하였다.
데이터는 평균 ± SE로 제시된다. 독립적 샘플의 2개 세트를 등분산의 가정 하에 스튜던트 t-검정 (양측)을 사용하여 비교하였다 (n=3). P < 0.05는 유의한 것으로 간주하였고 (*); P < 0.01은 매우 유의한 것으로 간주하였다 (**).
실시예 9
본 실시예는 계통발생학적 추론을 기재한다.
글리신 맥스(Glycine max), 오리자 사티바(Oryza sativa), 아라비돕시스 탈리아나(Arabidopsis thaliana), 클라미도모나스 레인하르티이(Chlamydomonas reinhardtii), 제아 메이스(Zea mays), 호모 사피엔스(Homo sapiens), 무스 무스쿨루스(Mus musculus), 다니오 레리오(Danio rerio), 사카로미세스 세레비지아에(Saccharomyces cerevisiae) 및 딕티오스텔리움 디스코이데움(Dictyostelium discoideum)의 단백질 서열에 대해 PF00808.18 PFam 도메인 (히스톤 폴드-유사 도메인)의 HMMER 3.0 (Finn et al., Nucleic Acids Res. 39: W29-37 (2011)) 검색 (hmmsearch)을 사용하여 잠재적 NF-Y 유전자로서의 서열을 선택하였다. 계통수는 PhyML 패키지 (Guindon et al., Systematic Biology 52: 696-704 (2003)) (파라미터 '-a e -f m'을 사용함)를 사용하여 구축하고, 아르케오프테릭스에서 시각화하였다 (sites.google.com/site/cmzmasek/home/software/archaeopteryx). NF-YC4 서열을 제시하는 도 2a-c, 및 진화상 다양한 종으로부터의 NF-YC4 유전자의 계통수인 도 3을 참조한다.
실시예 10
본 실시예는 QQS 트랜스진이 다양한 종자 단백질 함량을 갖는 우량 대두 계통에서 단백질 함량 및 탄수화물 함량에 영향을 미친다는 것을 입증하며; 따라서, QQS의 효과는 대두 계통 윌리암스 82에 제한되지 않는다.
QQS 트랜스진을 다양한 종자 단백질 함량을 갖는 우량 대두 계통 내로, 화분 공여자로서의 QQS-발현 (QQS-E) 윌리암스 82 대두와의 교배에 의해 도입하였다. QQS 트랜스진을 함유하는 이들 교배의 F2 및 F3 세대의 자가-수분 자손은 형태, 발생, 종자 크기, 종자 형상, 종자 중량 및 식물당 종자 수확량에 있어서 각각의 분리 동기와 유사하였다. 종자 조성 (F3 세대)을 근적외선 분광분석법 (NIRS)에 의해 분석하였다.
QQS의 발현은 계통에서의 초기 단백질 수준에 상관없이 각각의 우량 계통에서 종자 단백질 함량을 증가시켰다 (도 4a). 종자 단백질 함량은 도 4a에 나타나 있으며, 이는 F3 세대에서 QQS를 발현하는 대두 우량 계통 및 그의 각각의 분리 동기 대조군의 종자 단백질 (%/g 생중량 (13% 수분 함유))에 대한 막대 그래프이다. 각각의 분리 동기 대조군과 비교한 종자 단백질의 퍼센트 증가는 돌연변이체 막대의 상단에 나타나 있다. a=QQS-E 윌리암스 82 형질전환체로부터의 QQS 유전자가 결여되어 있는 분리 동기; b=QQS-E 윌리암스 82 형질전환체; c=IA 우량 계통 또는 윌리암스 82 및 QQS-E 윌리암스 82의 교배로부터의 QQS 유전자가 결여되어 있는 분리 동기 대조군; d=IA 우량 계통 및 QQS-E 윌리암스 82의 교배로부터의 QQS-E 돌연변이체. 스튜던트 t-검정을 사용하여 QQS-E 및 대조군을 비교하였다. **P < 0.01. 구체적으로, QQS의 발현은 종자 단백질 함량을, 각각의 분리 동기와 비교하였을 때 저-단백질 계통 IA1022에서 9%, 중-단백질 계통 IA2079 및 IA2102에서 6-7%, 및 고-단백질 계통 IA2053 및 IA3022에서 7-11% 증가시켰다.
도 4b는 F3 세대에서 QQS를 발현하는 대두 우량 계통 및 그의 각각의 분리 동기 대조군의 종자 오일 (%/g 생중량 (13% 수분 함유))에 대한 막대 그래프이다. a=QQS-E 윌리암스 82 형질전환체로부터의 QQS 유전자가 결여되어 있는 분리 동기; b=QQS-E 윌리암스 82 형질전환체; c=IA 우량 계통 또는 윌리암스 82 및 QQS-E 윌리암스 82의 교배로부터의 QQS 유전자가 결여되어 있는 분리 동기 대조군; d=IA 우량 계통 또는 또는 윌리암스 82 및 QQS-E 윌리암스 82의 교배로부터의 QQS-E 돌연변이체. 스튜던트 t-검정을 사용하여 QQS-E 및 대조군을 비교하였다. *P < 0.05. **P < 0.01.
도 4c는 F3 세대에서 QQS를 발현하는 대두 우량 계통 및 그의 각각의 분리 동기 대조군의 종자 섬유 (%/g 생중량 (13% 수분 함유))에 대한 막대 그래프이다. a=QQS-E 윌리암스 82 형질전환체로부터의 QQS 유전자가 결여되어 있는 분리 동기; b=QQS-E 윌리암스 82 형질전환체; c=IA 우량 계통 또는 윌리암스 82 및 QQS-E 윌리암스 82의 교배로부터의 QQS 유전자가 결여되어 있는 분리 동기 대조군; d=IA 우량 계통 또는 또는 윌리암스 82 및 QQS-E 윌리암스 82의 교배로부터의 QQS-E 돌연변이체. 스튜던트 t-검정을 사용하여 QQS-E 및 대조군을 비교하였다. *P < 0.05. *P < 0.01.
실시예 11
본 실시예는 QQS 트랜스진이 벼 및 옥수수에서 단백질 함량에 영향을 미친다는 것을 입증한다.
QQS 트랜스진을 벼 (재배품종 키타케; 벡터의 맵인 도 1a 참조) 내로 도입하였다. 벼 식물을 무작위화 완전 블록 설계로 성장 챔버에서 성장시켰다. 3개의 독립적 형질전환 이벤트로부터의 T3 식물의 잎 및 성숙 T4 종자를 삼중으로 분석하였다. QQS 유전자를 발현하는 벼 식물의 독립적 트랜스제닉 계통 (QQS-E) 및 그의 종자는 그의 각각의 야생형 (WT) 동기 대조군과 시각적으로 및 발생적으로 유사하였다. 그러나, 3개의 독립적 트랜스제닉 계통에서의 QQS 유전자의 발현은 QQS를 발현하는 잎 (QQS-E) 및 그의 야생형 동기 (동기)에서 전분 함량을 감소시키고, 잎에서 단백질 함량을 증가시켰다 (도 5a를 참조하며, 이는 QQS를 발현하는 벼 (재배품종 키타케) (QQS-E) 및 그의 야생형 동기 (동기)의 잎 단백질 (%/건조 중량)에 대한 막대 그래프이고; 모든 데이터는 평균 ± SE, n=3을 나타내고; 스튜던트 t-검정을 사용하여 QQS-E 및 대조군을 비교하였음; **P < 0.01). 3개의 트랜스제닉 계통에 걸쳐 성숙 벼 종자에서의 평균 단백질 증가는 20%였다 (도 5b를 참조하며, 이는 QQS를 발현하는 벼 (재배품종 키타케) (QQS-E) 및 그의 야생형 동기 (동기)의 종자 단백질 (%/건조 중량)에 대한 막대 그래프이고; 모든 데이터는 평균 ± SEM, n=3을 나타내고; 스튜던트 t-검정을 사용하여 QQS-E 및 대조군을 비교하였음; **P < 0.01.).
QQS 트랜스진을 또한 옥수수 내로 도입하고, 이를 재배지에서 성장시켰다. 커넬 단백질 (건조 중량당 %)은 동기 대조군과 비교하여 QQS-발현 옥수수에서 약 10% 내지 약 20% 증가하였다 (본원에 참조로 포함된 문헌 [Li et al., PNAS USA 112(47): 14734-14739 (2015)] 참조).
실시예 12
본 실시예는 QQS가 상호작용하는 유전자를 확인하기 위해 아라비돕시스 묘목으로부터의 cDNA 라이브러리에 대해 QQS를 미끼로서 사용하는 효모 2종-하이브리드 스크리닝을 기재한다.
아라비돕시스 묘목으로부터의 cDNA 라이브러리에 대해 QQS를 미끼로서 사용하는 효모 2종-하이브리드 스크리닝은 QQS가 상호작용하는 유전자로서 아라비돕시스 핵 인자 YC4 (AtNF-YC4)를 확인시켜 주었다. 상호 효모 2종-하이브리드 검정은 QQS 및 AtNF-YC4 상호작용과 일치하며; 미끼 상의 AtNF-YC4는 자동-신호를 갖고 QQS-먹이 + AtNF-YC4-미끼 신호는 AtNF-YC4-미끼보다 높다. QQS와 AtNF-YC4 사이의 상호작용을 효모 2종-하이브리드 쌍별 상호 연구에 의해 추가로 확인하였다 (도 6). 도 6은 먹이 + 미끼의 공벡터 (BK+AD), QQS-먹이 + 미끼의 공벡터 (BK+QQS), AtNF-YC4-미끼 + 먹이의 공벡터 (AtNF-YC4+AD), 및 AtNF-YC4-미끼 + QQS-먹이 (AtNF-YC4+QQS)의 리포터 유전자 상대 발현에 대한 막대 그래프이다. *P < 0.05. **P < 0.01. 통계적 분석은 AtNF-YC4-미끼 + QQS-먹이 발현이 AtNF-YC4-미끼보다 높다는 것을 나타낸다 (*P < 0.05). 담배 잎에서의 이분자 형광 상보성 검정은 QQS 및 AtNF-YC4가 시토졸 및 핵과 상호작용한다는 것을 나타냈으며; 어떠한 YFP 신호도 QQS 및 AtNF-YC4 상호작용 없이는 검출되지 않았다.
실시예 13
본 실시예는 QQS 결합에 요구되는 AtNF-YC4에서의 영역을 확인하기 위해 정제된 재조합 AtNF-YC4-GST 융합 단백질을 사용하는 글루타티온-S-트랜스퍼라제 (GST) 풀-다운 검정을 기재한다.
GST와 융합된 AtNF-YC4의 상이한 영역 (즉, 전장, 아미노산 1-72, 아미노산 73-162, 아미노산 163-250, 아미노산 1-162 및 아미노산 73-250)을 함유하는 단백질을 발현하였다. 융합 단백질을 풀-다운 검정에 사용하였다. 분석은 QQS가 AtNF-YC4의 아미노산 73에서 아미노산 162의 영역에 있는 아미노산에 결합한다는 것을 나타냈다. 이 영역은 히스톤-폴드-유사 도메인의 위치에 상응한다. 담배 잎에서의 이분자 형광 상보성 검정은 QQS 및 NF-YC4가 시토졸 및 핵과 상호작용한다는 것을 나타냈다. 핵에 국재화된 상호작용을 양성 대조군으로서 사용하였다. GST 풀-다운 검정은 또한 QQS와 대두 및 벼 NF-YC4 상동체 사이의 상호작용을 나타냈다.
실시예 14
본 실시예는 QQS가 일반적으로 히스톤-폴드-유사 도메인 단백질에 결합하는지 여부를 결정하기 위해 정제된 재조합 아라비돕시스 핵 인자 YB7 (AtNF-YB7)-GST 융합 단백질을 사용하는 GST 풀-다운 검정을 기재한다.
AtNF-YB7은 히스톤-폴드-유사 도메인을 함유하고, AtNF-YC4와 복합체화되는 것으로 예측된다 (Hackenberg et al., Mol. Plant 5: 876-888 (2012)). 그러나, AtNF-YB7은 GST 풀-다운 검정에서 QQS에 의해 결합되지 않았으며, 이는 QQS가 특정 특징적 특색을 갖는 히스톤-폴드-유사 도메인을 갖는 단백질에 결합한다는 것을 나타낸다.
실시예 15
본 실시예는 담배 잎에서 QQS 및 AtNF-YC4의 생체내 공동-발현을 기재한다.
QQS 및 AtNF-YC4를 담배 잎에서 생체내 공동-발현하였다. QQS-NF-YC4 복합체를 시토졸 및 핵에서 검출하였다. 이들 데이터 (벡터 맵에 대한 도 1a 및 1b 참조)는, NF-YB가 시토졸에서 NF-YC에 결합하고 NF-YB - NF-YC 복합체가 핵 내로 이동하는 모델과 유사하게, 우세하게는 시토졸 QQS (Li et al. (2009), 상기 문헌) 및 NF-YC (Kahle et al., Molec. Cell. Biol. 25: 5339-5354 (2005))가 시토졸에서 결합하여 핵 내로 이동한다는 것을 시사한다.
실시예 16
본 실시예는 AtNF-YC4의 아미노산 73-162와 유사한 아미노산 서열을 갖는 벼 및 대두 단백질과 QQS의 상호작용을 기재한다.
AtNF-YC4의 아미노산 73-162와 유사한 아미노산 서열을 갖는 벼 및 대두 단백질을 10종의 다양한 진핵 종의 게놈으로부터의 단백질-코딩 유전자에서의 모든 NF-Y 히스톤-폴드-유사 도메인의 계통발생학적 분석에 의해 선택하였다 (진핵생물의 진화상 다양한 종으로부터의 NF-YC 유전자의 계통수이며 벼, 대두 및 아라비돕시스에 대한 분석을 나타내는 도 3). 대두 (Glyma06g17780 및 Glyma04g37291) 및 벼 (Os3g14669, Os2g07450 및 Os6g45640) 상동체와 QQS의 물리적 상호작용을 GST 풀-다운 검정에 의해 검사하였다. QQS는 모든 상동체와 상호작용하였다. 이들 발견은 QQS의 발현이 NF-YC4와의 상호작용을 통해 대두 및 벼에 고-단백질 표현형을 부여한다는 것과 일치한다.
실시예 17
본 실시예는 아라비돕시스에서 AtNF-YC4 및 OsNF-YC4의 과다-발현을 기재한다.
AtNF-YC4 (At = 아라비돕시스 탈리아나) 트랜스진을 아라비돕시스에서 과다-발현하였다. 3개의 독립적 형질전환 이벤트로부터의 20일령 T2 식물의 묘목을 분석하였다. AtNF-YC4의 과다-발현은 잎에서 전분 함량을 대략 16% 감소시켰고 (도 7a를 참조하며, 이는 NF-YC4를 과다-발현하는 아라비돕시스 (AtNF-YC4-OE) 및 야생형 아라비돕시스 (WT)의 잎 전분 (mg/g 생중량)에 대한 막대 그래프이고; 막대 그래프에서의 모든 데이터는 평균 ± SE, n=3을 나타내고; 스튜던트 t-검정을 사용하여 WT 및 AtNF-YC4-OE 계통에서의 전분 조성을 비교하였음; *P < 0.05), 잎에서 단백질 함량을 대략 17% 증가시켰다 (도 7b를 참조하며, 이는 NF-YC4를 과다-발현하는 아라비돕시스 (AtNF-YC4-OE) 및 야생형 아라비돕시스 (WT)의 잎 단백질 (mg/g 건조 중량)에 대한 막대 그래프이고; 막대 그래프에서의 모든 데이터는 평균 ± SE, n=3을 나타내고; 스튜던트 t-검정을 사용하여 WT 및 AtNF-YC4-OE 계통에서의 단백질 조성을 비교하였음; **P < 0.01).
이들 데이터는 QQS가 AtNF-YC4와 함께 작용하여 질소 및 탄소의 할당을 변경한다는 것을 시사한다. QQS는 NF-YC4에 결합하는 것으로 여겨지고, 생성된 복합체는 핵으로 이동하여, NF-YC4-회합된 NF-Y 복합체에 의해 억제 및 활성화되는 유전자의 전사를 변경한다. 발현에서의 이들 이동은 증가된 단백질 함량 및 감소된 전분 함량을 유발한다.
OsNF-YC4 (Os = 오리자 사티바; Os3g14669) 트랜스진을 또한 아라비돕시스에서 과다-발현하였다. 오리자 사티바로부터의 NF-YC4 CDS를, 니코티아나 타바쿰으로부터의 노팔린 신타제로부터의 Pnos (nos 프로모터) 및 Tnos (nos 종결인자)의 제어 하에 Bar 유전자 (포스피노트리신 아세틸트랜스퍼라제 유전자)를 함유하는 벡터 pB2GW7에 삽입하였다. 이 벡터 상의 OsNF-YC4는 p35S (콜리플라워 모자이크 바이러스 (CaMV) 35S 프로모터)에 의해 제어되고 T35S (CaMV 35S)에 의해 종결된다. 단지 LB와 RB 사이의 영역만을 아라비돕시스 식물에 도입하여 트랜스제닉 아라비돕시스 OsNF-YC4-OE 식물을 생성시켰다 (벡터의 맵인 도 1d 참조). OsNF-YC4의 과다-발현은 아라비돕시스 WT와 비교하여 잎에서 전분 함량을 ~ 16% 감소시켰다. 단백질 함량을 분석하였다.
실시예 18
본 실시예는 NF-YC4 유전자의 프로모터 영역 내 확인된 리프레서 모티프의 표적화된 제거를 기재한다.
RAV1의 결합 모티프, 구체적으로 RAV1-A를 NF-YC4 유전자의 프로모터 영역에서 확인하였다. RAV1-A 모티프는 서열 CAACA를 갖는다 (예를 들어, RAV1의 논의에 대해, 문헌 [Kagaya et al., Nucleic Acids Res. 27: 470-478 (1999)] 참조). "W 박스" 모티프를 또한 NF-YC4 유전자의 프로모터 영역에서 확인하였다 (예를 들어, ERF3 유전자의 프로모터 영역 내 W 박스의 논의에 대해, 문헌 [Nishiuchi et al., J. Biol. Chem. 279: 55355-55361 (2004)] 참조). W 박스 모티프는 서열 TGACY를 가지며, 여기서 Y = C 또는 T이다. 이러한 모티프를 식물 시스-작용 조절 DNA 요소 (PLACE) 데이터베이스: 1999에서 확인하였고 (Nucleic Acids Res. 27(1): 297-300 (1999)); 이러한 모티프를 SIGNAL SCAN을 사용하여 확인하였다 (Prestridge, CABIOS 7: 203-206 (1991); 월드와이드 웹 상의 dna.affrc.go.jp/PLACE/signalscan.html에서 이용가능함). 모티프는 또한 플랜트케어를 사용하여 발견될 수 있다 (bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html). 대두 및 벼에서의 NF-YC4 유전자의 프로모터 영역 내 리프레서 모티프를 결실시켰다. 대두와 관련하여, 구체적으로 RAV1-A 모티프와 W 박스 모티프 사이의 영역을 결실시켰다 (즉, 서열 GGTCAGTTTTTGTTAACATTAATTTTTAGGAT [서열식별번호: 17]를 갖는 뉴클레오티드 360-391; 도 2e 참조). 벼와 관련하여, 구체적으로 RAV1-A 모티프를 결실시켰다 (즉, CAACA의 서열을 갖는 뉴클레오티드 250-254). 돌연변이된 프로모터를 갖는 구축물 및 전장 프로모터를 갖는 구축물을 개별적으로 리포팅 유전자로서의 루시페라제와 융합시켰다. 이원 벡터 상의 각각의 구축물을 개별적으로 아그로박테리움 GV3101 내로 형질전환시킨 다음, 니코티아나 벤타미아나(Nicotiana benthamiana) 내로 형질전환시켰다 (Leuzinger et al., Vis. Exp. 77 (2013)). 권장되는 엔. 벤타미아나의 발생 단계 및 아그로박테리움 성장 및 침윤 농도를 사용하였다. 재조합 루시페라제 단백질을 일시적으로 발현하였다. 루시페라제 발현을 아그로박테리움-침윤된 담배 잎에서 정량화하였다. 구축물당 3개의 식물에서의 적어도 3회의 반복실험을 포함시켰다. 대두로부터의 NF-YC4 유전자로부터 리프레서 모티프의 제거는 2회/3회의 반복실험에서 루시페라제의 증가된 발현을 유발하였다. 유사하게, 벼로부터의 NF-YC4 유전자로부터 리프레서 모티프의 제거는 2회/3회의 반복실험에서 루시페라제의 증가된 발현을 유발하였다. 종합하면, 모든 3회의 반복실험의 총 루시페라제 발현은 대두로부터의 NF-YC4 유전자 및 벼로부터의 NF-YC4 유전자에 대해 증가하였다.
개별 실험에서, OsNF-YC4의 프로모터 영역에 대한 3개의 개별 돌연변이를 생성시켜 전사 리프레서 모티프를 제거하였다. "pro1" 돌연변이에서는 1164 bp 상류에서의 "RAV1" 모티프를 결실시켰다 (서열식별번호: 2 및 도 2a 참조). "pro2" 돌연변이에서는 982 bp 상류에서의 "RAV1" 모티프 및 979 bp 상류에서의 "부류 II ERF" 모티프를 결실시켰다 (서열식별번호: 3 및 도 2b 참조). "pro3" 돌연변이에서는 RAV1 모티프 및 개재 서열을 결실시켰다 (서열식별번호: 4 및 도 2b 참조). 대조군 "proFull"은 전장 프로모터 영역, 즉 개시 코돈의 1,448 bp 상류를 함유하였다 (서열식별번호: 1 및 도 2a 참조). 프로모터 영역을 상기 기재된 바와 같이 루시페라제 코딩 영역과 융합시키고, 아그로박테리움 내로 형질전환시킨 다음, 담배 내로 형질전환시켰다. 결과는 도 9에 나타나 있다.
도 9는 대조군 (OsNF-YC4proFull)과 비교한, 벼 NF-YC4의 프로모터 영역 내 전사 리프레서 모티프가 결실된 담배로부터의 LUC 활성 (OsNF-YC4pro1, Os-NF-YC4pro2 및 Os-NF-YC4pro3)의 상대 LUC (루시페라제) 활성에 대한 그래프이다. 데이터는 평균 ± SEM, n=3을 나타낸다. 스튜던트 t-검정을 사용하여 결실을 갖는 프로모터 및 전장 프로모터에 의해 구동된 LUC 활성을 비교하였다. *P < 0.05. 오차 막대는 표준 오차를 나타낸다.
나타나 있는 바와 같이, NF-YC4 발현은 프로모터 영역 내 전사 리프레서 모티프가 제거될 때 상향-조절된다. 2개의 ERF 모티프의 결실은 1개의 RAV1 모티프의 결실 또는 1개의 RAV1 모티프 및 1개의 ERF 모티프의 조합된 결실보다 더 큰 효과를 나타냈다.
또 다른 실험에서, GmNF-YC4의 프로모터 영역에 대한 3개의 개별 돌연변이를 생성시켜 전사 리프레서 모티프를 제거하였다. "pro1" 돌연변이에서는 ERF 모티프 (역방향), RAV1 모티프 (정방향) 및 및 개재 서열을 결실시켰다 (서열식별번호: 9 및 도 2d 참조). "pro2" 돌연변이에서는 ERF 모티프 (역방향), RAV1 모티프 (역방향) 및 개재 서열을 결실시켰으며 (서열식별번호: 11 및 도 2d 참조), 반면에 "pro3" 돌연변이에서는 2개의 RAV1 모티프 및 개재 서열을 결실시켰다 (서열식별번호: 13 및 도 2e 참조). 대조군 "proFull"은 전장 프로모터 영역, 즉 개시 코돈의 1,448 bp 상류를 함유하였다 (서열식별번호: 8 및 도 2c 참조). 프로모터 영역을 상기 기재된 바와 같이 루시페라제 코딩 영역과 융합시키고, 아그로박테리움 내로 형질전환시킨 다음, 담배 내로 형질전환시켰다. 결과는 도 8에 나타나 있다.
도 8은 대조군 (pSoy-LUCFull)과 비교한, 대두 NF-YC4의 프로모터 영역 내 전사 리프레서 모티프가 결실된 담배로부터의 LUC (루시페라제) 활성 (pSoy-LUC DEL1, pSoy-LUC DEL2 및 pSoy-LUC DEL3)의 상대 LUC 활성에 대한 그래프이다. 데이터는 평균 ± SEM, n=3을 나타낸다. 스튜던트 t-검정을 사용하여 결실을 갖는 프로모터 및 전장 프로모터에 의해 구동된 LUC 활성을 비교하였다. *P < 0.05. 오차 막대는 표준 오차를 나타낸다. 나타나 있는 바와 같이, NF-YC4 발현은 프로모터 영역 내 전사 리프레서 모티프가 제거될 때 상향-조절된다. RAV1 모티프 둘 다의 결실은 1개의 RAV1 모티프 및 1개의 ERF 모티프의 조합된 결실보다 더 큰 효과를 나타냈다.
또 다른 실험에서, 벼 T0 식물 (키타케)을 OsNF-YC4의 프로모터 영역 내 돌연변이를 도입하기 위해 표적화된 CRISPR/Cas9 구축물에 의해 형질전환시켰다. gRNA/Cas9 기술의 사용은 벼에서의 표적화된 유전자 편집을 위한 다중 단계를 수반하였다. OsNF-YC4 내 표적 서열을 선택하고 (서열식별번호: 6 및 7 참조), 뉴클레아제 (즉, Cas9 및 gRNA)를 발현하는 플라스미드를 설계 및 구축하고, 배아 캘러스를 아그로박테리움-매개된 유전자 전달을 통해 형질전환시키고, 1차 트랜스제닉 계통을 부위-특이적 DNA 변화에 대해 스크리닝하고, 확인하고, PCR 유전자형결정을 사용하여 결실된 서열을 갖는 돌연변이체를 확인하였다. 이형접합 돌연변이를 갖는 19개 초과의 돌연변이체 식물 (T0)을 확인하였다. T0 식물을 동형접합 돌연변이 및 T-DNA로부터의 분리를 갖는 자손을 위해 자가-교배하였다. T1 종자를 수거하였다. 동형접합 돌연변이를 가지며 T-DNA 삽입이 없는 돌연변이체를 선택할 것이다.
실시예 19
본 실시예는 전사 리프레서 결합 부위를 함유할 수 있는 영역을 확인하기 위한 NF-YC4 유전자의 프로모터 영역의 스크리닝을 기재한다.
키타케 잎의 게놈 DNA는 돌연변이된 OsNF-YC4 프로모터 구축물을 생성시키기 위해 PCR을 위한 주형으로서 사용한다. NF-YC4 유전자의 프로모터 영역 (개시 코돈으로부터 상류 1 kb 영역)을 위치 -1000 bp (개시 코돈으로부터 상류)에서 시작하여 100 bp 절편의 순차적 결실에 의해 돌연변이시킨다. 프로모터의 중간 (즉, 위치 -900 bp에서 -100 bp)에 100-bp 결실을 갖는 돌연변이된 NF-YC4 프로모터를 이중-연결 PCR에 의해 구축한다 (Yu et al., Fungal Genet. Biol. 41: 973-981 (2004)).
돌연변이된 프로모터를 갖는 구축물 및 전장 프로모터를 갖는 1개의 구축물을 개별적으로 리포팅 유전자로서의 루시페라제와 융합시킨다. 이원 벡터 상의 각각의 구축물을 개별적으로 아그로박테리움 GV3101 내로 형질전환시킨 다음, 니코티아나 벤타미아나 내로 형질전환시킨다 (Leuzinger et al. (2013), 상기 문헌). 권장되는 엔. 벤타미아나의 발생 단계 및 아그로박테리움 성장 및 침윤 농도를 사용한다. 재조합 루시페라제 단백질을 일시적으로 발현한다. 루시페라제 발현을 아그로박테리움-침윤된 담배 잎에서 정량화하여 어느 결실이 전장 프로모터와 비교하여 증가된 발현을 유발하는지를 확인한다. 증가된 발현을 갖는 프로모터가 전사 리프레서 결합 부위를 함유하는 것으로 제안된다. 구축물당 3개의 식물에서의 적어도 3회의 반복실험을 포함시킨다.
실시예 20
본 실시예는 식물 방어에 수반되는 유전자의 발현에 대한 QQS의 과다-발현 및 과소-발현의 효과를 기재한다.
총 RNA를 트리졸 (라이프 테크놀로지스, 캘리포니아주 칼스배드)을 사용하여 풀링된 잎 샘플로부터 추출하였다. 추가로 퀴아젠(QIAGEN) RN이지 미니 키트 (퀴아젠, 캘리포니아주 발렌시아)와 DNA 오염을 제거하기 위한 DNAse I (라이프 테크놀로지스, 캘리포니아주 칼스배드) 처리를 사용하여 RNA를 정제하였다.
200-bp 짧은-삽입물 라이브러리를 구축하였다. 트랜스크립톰 서열분석을 V3 시약을 사용하는 일루미나 HiSeq2000 시스템으로 수행하였다 (91쌍 말단 서열분석). 저-품질 판독물은 어댑터를 갖는 판독물, 5% 초과의 미지의 뉴클레오티드를 갖는 판독물, 20% 초과의 품질 ≤ 10의 염기를 갖는 판독물을 제거함으로써 여과하였다. 세정된 판독물을 탑해트를 사용하는 피토좀 버전 8.0 (phytozome.net)에서 참조 아라비돕시스 탈리아나 게놈에 대해 정렬시켰다. 맵핑된 판독물을 htseq-count (huber.embl.de/users/anders/HTSeq/doc/count.html)에 의해 계수하였다.
QQS RNAi (하향-조절 QQS), QQS OE (과다-발현 QQS) 및 야생형 Col-0 아라비돕시스 식물로부터의 RNA-Seq 데이터의 분석은 표 1에 제시된 바와 같이 식물 방어-관련 마커 유전자가 야생형 아라비돕시스에 비해 교란된 전사체 수준을 갖는다는 것을 밝혀냈다.
표 1
Figure 112017090236350-pct00001
패턴은 3개의 군으로 분류될 수 있다. 제1 군은 돌연변이체 둘 다에서 감소된 발현을 갖는 1종의 유전자, 즉 박테리아 감염에 의해 고도로 활성화되고 기초 방어의 유도에 수반되는 WRKY47로 구성된다 (Truman et al., Plant J. 46(1): 14-33 (2006)). 제2 군은 돌연변이체 둘 다에서 증가된 발현을 갖는 4종의 유전자로 구성된다. 4종의 유전자는 자스모네이트 (JA)-조절된 식물 반응의 주요 대사 효소인 JMT (Seo et al., PNAS USA 98(8): 4788-4793 (2001)), 자스모네이트와 에틸렌 (ET) 신호전달 사이의 길항작용을 조정하는 JA-반응성 전사 인자인 MYC2 (Chico et al., Plant Cell 26(5): 1967-1980 (2014); Song et al., Plant Cell 26(1): 263-279 (2014); 및 Zhang et al., Plant Cell 26(3): 1105-1117 (2014)), JA에 의한 Col1의 활성화에 따라 안토시아닌 생합성을 활성화시키는 JA-반응성 전사 인자인 PAP1 (Shan et al., J. Exp. Bot. 60(13): 3849-3860 (2009)), 및 식물내에서 캘러스 침착을 촉발하는 ET-반응성 전사 인자인 RAB2-6 (Ali et al., BMC Plant Biol. 13: 47 (2013)))이다. 제3 군은 QQS가 하향-조절되는 돌연변이체에서의 감소된 발현 및 QQS가 과다-발현되는 돌연변이체에서의 증가된 발현을 갖는 3종의 유전자로 구성된다. 3종의 유전자는 SA-촉발된 면역을 조절하는 NPR-의존성 기초 방어 음성 조절제인 WRKY38 (Caillaud et al., PLoS Biol. 11(12): e1001732 (2013); Kim et al., Plant Cell 20(9): 2357-2371 (2008); Pre et al., Plant Physiol. 147(3): 1347-1357 (2008); 및 Seo et al. (2001), 상기 문헌), NPR1 조절 단백질, 및 PR1 발병기전-관련 단백질 1이다.
실시예 21
본 실시예는 NF-YC4 또는 QQS를 과다발현하는 트랜스제닉 아라비돕시스 탈리아나 식물에서 바이러스 감염이 감소했다는 것을 입증한다.
녹색 형광 단백질을 보유하는 순무 모자이크 바이러스 (TuMV-GFP) 접종 검정을 이전에 기재된 바와 같이 (Yang et al., Molecular Plant-Microbe Interactions 20(4): 358-370 (2007)) 일부 소수 변형을 가하여 수행하였다. 동결된 TuMV-GFP-감염된 순무 (세븐 탑) 잎을 20 mM 인산나트륨 완충제 (pH 7.2, 1:6 wt/vol) 중에서 분쇄하고, 미라클로스 (칼바이오켐(Calbiochem), 캘리포니아주 샌디에고)를 통해 여과하여 접종물을 수득하였다. 접종물의 역가를 조정하여 잘-분리된 GFP 유전자좌를 생성시켰다.
아라비돕시스 탈리아나 식물을 22℃에서 10시간 명기 하에 7주 동안 성장시켜 큰 로제트 잎이 발생하도록 하였다. 로제트 잎에 카르보런덤을 살분하고, 면봉 어플리케이터를 사용하여 TuMV-GFP를 문질러 접종하였다. 접종 후 120시간 (hai)에, 접종된 로제트 잎 상의 GFP 초점을 UV 조명 (100-W 블랙-레이 장파 UV 램프; UVP, 캘리포니아주 업랜드) 하에 계수하였다. 각각의 계통에 대해 10개의 무작위로 선택된 식물의 3회의 생물학적 반복실험을 하였다. 각각의 계통에 대해 10개의 식물의 평균 초점 수를 계산하고, 계통 사이의 초점 수 차이의 유의성을 스튜던트 t-검정을 사용하여 결정하였다 (P < 0.01 또는 0.05).
각각의 유전자형에 대해, 40개의 단일 GFP 초점을 무작위로 선택하고, 자이스 악시오캠 MRc5 디지털 카메라를 사용하는 자이스 스테미 SV11 형광 해부 현미경 상에서 사진촬영하였다 (Hewezi et al., Plant Cell 20(11): 3080-3093 (2008)). 이어서, 디지털 파일을 자이스 악시오비전 소프트웨어를 사용하여 처리하였다. 각각의 사진촬영된 GFP 초점을 이미지제이 측정 도구 (NIH)로 처리하고, 스테미 SV11로부터의 원래 이미지의 정확한 척도화에 대해 보정하였다. GFP 초점에 대한 총 면적은 평방 밀리미터로서 계산하였다. 각각의 계통의 GFP 초점에 대한 개별 측정을 사용하여 시험된 각각의 계통에 대한 평균 초점 크기를 계산하였다. 계통 사이의 크기 차이의 유의성을 스튜던트 t-검정을 통해 결정하였다 (P < 0.01 또는 0.05).
TuMV-GFP를 QQS 및 NF-YC4의 상이한 유전적 배경을 갖는 에이. 탈리아나 식물 상에 접종하였다. GFP 초점 (수는 감염 과정을 개시하는 TuMV의 능력을 나타냄)을 계수하고, GFP 초점의 크기 (크기는 식물내에서 증식하는 TuMV의 능력을 나타냄)를 접종 후 5일에 측정하였다. 변경된 QQS 발현 및 QQS 상호작용자 NF-YC4의 변경된 발현을 갖는 아라비돕시스 탈리아나 Col-0 계통을 모든 감염 검정에 사용하였다. 사용된 계통은 AtQQS RNAi (QQS-하향조절), AtQQS OE (QQS-과다발현) 및 AtNF-YC4 OE (NF-YC4-과다발현)에 대한 Col-0 (소수 모상체, 형질전환체에 대한 대조군), 및 AtQQS KO 및 AtNF-YC4 KO에 대한 Col-0 (모상체, T-DNA 녹아웃 (KO) 돌연변이체에 대한 대조군)이었다.
도 10a (돌연변이체 대 대조군의 10개의 아라비돕시스 식물당 평균 초점 수 (± 바이러스 접종 후 120시간 (hai)에서의 표준 오차)에 대한 그래프; 스튜던트 t-검정을 사용하여 대조군 및 QQS 또는 NF-YC4 돌연변이체에서의 초점 수를 비교하였음; *P < 0.05; **P < 0.01; ***P < 0.001) 및 10b (돌연변이체 대 대조군의 평균 초점 크기 (mm2) (± 바이러스 접종 후 120 hai에서의 표준 오차 (n = 40))에 대한 그래프; 스튜던트 t-검정을 사용하여 대조군 및 QQS 또는 NF-YC4 돌연변이체에서의 초점 수를 비교하였음; ***P < 0.001)에 나타나 있는 바와 같이, AtNF-YC4 OE 식물은 대조군보다 대략 88% 더 적은 유의하게 감소된 GFP 초점 수를 가졌다. 대조적으로, AtNF-YC4 KO 식물은 대조군보다 대략 16.5% 더 많은 약간 증가된 초점 수를 가졌으며; 적더라도, 스튜던트 t-검정은 그 차이가 유의하다는 것을 시사하였다. 유사하게, AtQQS OE 식물은 대조군 식물과 비교하여 21.7% 더 적은 초점을 가졌으며, 반면에 AtQQS RNAi 식물은 대조군 식물보다 12.2% 더 많은 초점을 가졌고, AtQQS KO 식물은 대조군보다 45.9% 더 많은 초점을 가졌다. 이들 결과는 AtQQS 또는 AtNF-YC4를 과다-발현하는 것이 바이러스 감염 개시를 손상시켰으며, 반면에 AtQQS 또는 AtNF-YC4를 침묵 또는 녹아웃시키는 것은 바이러스 감염 개시를 용이하게 하였다는 것을 제시하였다. YC4 과다-발현은 바이러스 감염을 거의 차단하였다.
초점 크기에서의 변화는 유사한 경향을 가졌다. AtNF-YC4 KO, AtQQS KO 및 AtQQS-침묵된 식물에서의 초점은 대조군보다 각각 27.8%, 52.5% 및 51.9% 더 컸으며, 반면에 AtNF-YC4 OE 및 AtQQS OE 식물에서의 초점은 대조군보다 각각 51% 및 32% 더 작았다.
이들 결과는 AtNF-YC4 또는 AtQQS를 과다발현하는 것이 바이러스 증식을 손상시키며, 반면에 AtNF-YC4 또는 AtQQS를 침묵 또는 녹아웃시키는 것은 바이러스 증식을 용이하게 한다는 것을 제시하였다. 검정은 QQS 및 그의 상호작용자인 NF-YC4가 감염의 개시를 감소시키고 식물내에서 바이러스 증식을 감소시킨다는 것을 나타낸다. 따라서, 이들은 각각의 과다-발현이 바이러스에 대한 식물 저항성을 증가시키기 때문에 식물 면역 반응의 양성 조절제이다.
실시예 22
본 실시예는 NF-YC4 또는 QQS를 과다발현하는 트랜스제닉 아라비돕시스 탈리아나 식물에서 박테리아 성장이 감소했다는 것을 입증한다.
에이. 탈리아나 식물을 22℃에서 10시간 명기 및 14시간 암기 하에 4-5주 동안 성장 챔버에서 성장시켰다. 슈도모나스 시린가에(Pseudomonas syringae)를 접종 완충제 (10 mM MgCl2, 0.05% 실웨트 L-77) 중에서 세척 및 재현탁시켰다. 식물에 108 콜로니-형성 단위 (CFU)/mL로 조정된 박테리아 수준을 갖는 박테리아 접종물을 분무하였다 (Katagiri et al., The Arabidopsis thaliana - Pseudomonas syringae Interaction. The Arabidopsis Book / American Society of Plant Biologists, 1, e0039.http://doi.org/10.1199/tab.0039 (2002)). 식물내 박테리아 수준은 코르크 천공기 (내부 직경 0.5 cm)로 잎 절편을 절단하고 이들을 500 μl의 접종 완충제 중에 완전히 균질화함으로써 결정하였다. 박테리아를 함유하는 생성된 현탁액을 희석하고, 적절한 항생제가 있는 KB 플레이트 상에 플레이팅하였다.
실시예 21에 열거된 에이. 탈리아나 식물의 동일한 세트에서 Pst DC3000 및 ΔCEL 균주의 식물내 박테리아 성장을 검사하였다. Pst DC3000은 에이. 탈리아나 식물을 강하게 감염시키는 박테리아 병원체이며, 반면에 다중 이펙터 유전자에 돌연변이를 갖는 돌연변이된 Pst DC3000 균주인 ΔCEL은 식물내에서 천천히 성장하는 비-병독성 균주이다. Pst DC3000은 4일간 대략 1,000배 성장하였으며, 반면에 ΔCEL은 대략 10배 성장하였다. Pst DC3000의 성장은 AtNF-YC4 또는 AtQQS를 과다발현하는 식물에서 각각 88% 및 63% 감소로 매우 손상되었다. 대조적으로, AtQQS 또는 AtNF-YC4 RNAi 및 KO 계통에서, Pst DC3000의 성장은 대략 30% 증가하였다. Pst DC3000의 증가된 성장은 AtQQS RNAi 식물에서 꽤 유의하였으며, 반면에 AtQQS 또는 AtNF-YC4 KO 계통에서는 p = 0.05의 수준으로 유의하지 않았다.
다른 한편으로는, AtQQS 또는 AtNF-YC4 RNAi 또는 KO 계통에서 ΔCEL의 성장이 대략 2.6배 증가로 강하게 증진되었다는 것이 꽤 명백하였다. ΔCEL의 성장 변화는 유사하게 AtQQS 또는 AtNF-YC4 과다-발현 식물에서 유의하지 않았다. 종합하면, 상이한 유전적 배경의 에이. 탈리아나 식물에서 두 박테리아 균주의 변경된 성장에 관한 데이터는, AtNF-YC4 또는 AtQQS를 과다-발현하는 것이 식물 면역 반응을 증진시켜, 강하게 감염성인 박테리아 병원체를 덜 병독성이면서 천천히 성장하도록 만들며, 반면에 AtNF-YC4 또는 AtQQS를 침묵 또는 녹아웃시키는 것은 식물 면역 반응을 손상시켜, 비-병독성 박테리아 병원체를 더 잘 성장하도록 만든다는 것을 나타낸다. 따라서, 이들 데이터는 AtNF-YC4 및 AtQQS가 식물 면역 반응의 양성 조절제라는 것을 일관되게 시사한다.
결과는 도 11에 요약되어 있다. 도 11은 아라비돕시스 식물에 Pst DC3000 및 Δ CEL의 접종 후 제0일 (0 dpi) 및 제4일 (4 dpi)의 박테리아 수 (log10 (CFU/cm2))에 대한 그래프이다. 초기 접종물은 균일하게 108 CFU/mL로 조정하였다. 오차 막대는 표준 오차를 나타낸다. 스튜던트 t-검정을 사용하여 대조군 및 QQS 또는 NF-YC4 돌연변이체에서의 박테리아 수를 비교하였다. ** P < 0.01. *** P < 0.001.
실시예 23
본 실시예는 NF-YC4를 과다발현하거나 또는 QQS를 발현하는 트랜스제닉 대두 식물에서 박테리아 성장이 감소했다는 것을 입증한다.
글리신 맥스로부터의 NF-YC4 CDS (GmNF-YC4)를, 니코티아나 타바쿰으로부터의 노팔린 신타제로부터의 Pnos (nos 프로모터) 및 Tnos (nos 종결인자)의 제어 하에 Bar 유전자 (포스피노트리신 아세틸트랜스퍼라제 유전자)를 함유하는 벡터 pB2GW7 내로 삽입하였다 (벡터의 맵인 도 1c 참조). 이 벡터 상의 GmNF-YC4는 p35S (콜리플라워 모자이크 바이러스 (CaMV) 35S 프로모터)에 의해 제어되고 T35S (CaMV 35S)에 의해 종결된다. 단지 LB와 RB 사이의 영역만을 식물 내로 도입하여 트랜스제닉 식물을 생성시켰다.
AtQQS를 발현하는 안정한 트랜스제닉 대두 계통 (AtQQS E; 실시예 1 및 벡터 QQS-OE-pB2GW7의 맵에 대한 도 1a 참조) 또는 GmNF-YC4를 과다-발현하는 안정한 트랜스제닉 대두 계통 (Glyma06g17780; GmNF-YC4 OE)을 생성시키고, 22℃에서 14시간 명기 및 10시간 암기 하에 성장 챔버에서 성장시켰다. QQS E, GmNF-YC4-OE 및 공벡터 대조군의 대두 돌연변이체 식물을 잎 DNA의 PCR-스크리닝에 의해 선택하였다. 23일령 대두 상의 제1 삼출엽을 접종에 사용하였다. 새로 배양된 피. 사바스타노이 병원체변종 글리시네아 레이스 4 (PsgR4)를 접종 완충제 (실시예 22 참조) 중에 최종 농도 약 107 CFU/mL로 현탁시켰다. 각각의 삼출엽의 소엽을 바늘에 의해 찌른 후에 5 μL의 접종물을 각각의 상처 상에 배치하였다 (10개/소엽). 식물내 박테리아 수준은 상기 기재된 바와 같이 접종 후 10일에 결정하였다.
Psg는 대두 상의 박테리아성 마름병을 유발하며, 이는 대두 생산에 대한 큰 위협으로서 간주되었다. PsgR4는 거의 모든 상업용 대두 재배품종을 감염시킬 수 있기 때문에 가장 병독성인 균주 중 하나이다. 대조군으로서 공벡터를 보유하는 대두 계통을 사용하여, PsgR4는 대두 GmNF-YC4 OE 계통 및 대두 AtQQS-E 계통에서 각각 62.4% 및 55.3% 감소로 훨씬 더 천천히 성장하였다. GmNF-YC4를 과다-발현하거나 또는 AtQQS를 발현하는 대두 계통에서 PsgR4의 손상된 박테리아 성장은 GmNF-YC4 및 AtQQS가 대두 면역 반응을 역시 증진시킨다는 것을 나타냈으며, 이는 NF-YC4 및 QQS가 식물 면역 반응의 양성 조절제라는 상기 데이터와 일치한다.
결과는 도 12a에 요약되어 있다. 도 12a는 대두 계통의 박테리아 수 (CFU * 104/cm2)에 대한 그래프이다. 초기 접종물은 균일하게 107 CFU/mL로 조정하였다. 오차 막대는 표준 오차를 나타낸다. 스튜던트 t-검정을 사용하여 대조군 및 QQS-E 또는 NF-YC4-OE 돌연변이체에서의 박테리아 수를 비교하였다. ** P < 0.01. (EV = 공벡터).
GmNF-YC4가 트랜스제닉 대두 계통에서 과다-발현되었다는 것을 확인하기 위해, GmNF-YC4의 발현 수준을 정량적 실시간 PCR을 사용하여 결정하였다. 대략 100 mg 대두 잎을 RN이지 식물 미니 키트 (퀴아젠)를 사용하여 제조업체의 지침에 따라 RNA 단리에 사용하였다. 2 μg의 RNA 및 슈퍼스크립트(SuperScript)® III 제1 가닥 키트 (인비트로젠(Invitrogen))를 cDNA 합성에 사용하였다. cDNA 및 유전자-특이적 프라이머 (GmNF-YC4Fd: 5'-CCTCCCAGGCATGGCAGTCC-3' [서열식별번호: 18] 및 GmNF-YC4Rev: 5'-CCATCAAGGCTCCGCTGG-3' [서열식별번호: 19])를 사용하여 정량적 실시간 PCR (qRT-PCR)을 수행하였다. 각각의 cDNA를 iQ™SYBR® 그린 슈퍼믹스 (바이오-라드(Bio-Rad)) 및 아이사이클러 실시간 PCR 시스템 (바이오-라드)을 사용하는 정량적 PCR에 의해 증폭시켰다. GmACTIN 발현을 사용하여 각각의 샘플에서의 발현 값을 정규화하고, 비교 Ct 방법 (2-ΔΔCt)을 사용하여 모의 샘플에 대해 상대 발현 값을 결정하였다.
GmACTIN (Glyma 15g050200)을 참조 유전자로서 사용하였다 (Liu et al., Mol. Plant Microbe Interact. 27(8): 824-834 (2014)). GmNF-YC4 OE 계통에서의 GmNF-YC4의 발현 수준은 대두 대조군 계통에서의 발현보다 4.47배 더 높았다.
결과는 도 12b에 요약되어 있다. 도 12b는 NF-YC4-OE 대두 계통의 상대 발현 수준에 대한 그래프이다. 오차 막대는 표준 오차를 나타낸다. ** P < 0.01. (EV = 공벡터).
실시예 24
본 실시예는 NF-YC4를 과다발현하거나 또는 QQS를 발현하는 트랜스제닉 대두 식물에서 진딧물이 감소했다는 것을 입증한다.
트랜스제닉 대두 식물을 실시예 23에 기재된 바와 같이 생성시켰다. 대두 종자를 25℃에서 16시간 명기 및 8시간 암기의 광주기 하에 심었다. 심은지 18일 후에 식물에 침입시켰다. 침입 7일 후에, 식물당 진딧물의 평균 수를 결정하였다. 결과는 도 13에 나타나 있다.
도 13은 대두 유전자형 QQS-E 16-6 (QQS-발현 계통 16-6), QQS-E 32-6 (QQS-발현 계통 32-6), 대조군, NF-YC4-OE L1 (NF-YC4 과다발현 계통 1) 및 NF-YC4-OE L2 (NF-YC4 과다발현 계통 2)의 식물당 진딧물의 평균 수에 대한 그래프이다. 오차 막대는 표준 오차를 나타낸다. 스튜던트 t-검정을 사용하여 대조군 및 QQS-E 또는 NF-YC4-OE 돌연변이체에서의 진딧물 수를 비교하였다. *P < 0.05. **P < 0.01. (EV = 공벡터). 나타나 있는 바와 같이, 식물당 진딧물의 평균 수는 대조군과 비교하여 QQS를 발현하거나 또는 NF-YC4를 과다발현하는 대두 식물에서 약 20% 내지 약 30% 감소하였다.
실시예 25
본 실시예는 NF-YC4를 과다발현하는 트랜스제닉 대두 식물의 종자에서 단백질 또는 단백질+오일 함량이 증가하였다는 것을 입증한다.
NF-YC4를 과다발현하는 트랜스제닉 대두 식물 (윌리암스 82)을 실시예 23에 기재된 바와 같이 생성시키고, 재배지에서 성장시켰다. T2 종자를 실시예 2에 기재된 바와 같이 NIRS를 사용하여 분석하였다. 데이터는 도 14a-14e에 나타나 있다.
도 14a는 동기 대조군과 비교한, NF-YC4를 과다발현하는 형질전환된 대두 (NF-YC4-OE)의 형질전환 이벤트 (1, 2, 3 및 4; 각각의 번호는 상이한 형질전환 이벤트를 나타냄)의 단백질 함량에 대한 그래프이다. 오차 막대는 표준 오차를 나타낸다. 스튜던트 t-검정을 사용하여 NF-YC4-OE 돌연변이체 및 동기 대조군에서의 단백질 함량을 비교하였다. * P < 0.05. ** P < 0.01. 나타나 있는 바와 같이, 단백질은 대조군과 비교하여 NF-YC4를 과다발현하는 대두 식물에서 약 6% 내지 약 12% 증가하였다.
도 14b는 동기 대조군과 비교한, NF-YC4를 과다발현하는 형질전환된 대두 (NF-YC4-OE)의 형질전환 이벤트 (1, 2, 3 및 4; 각각의 번호는 상이한 형질전환 이벤트를 나타냄)의 오일 함량에 대한 그래프이다. 오차 막대는 표준 오차를 나타낸다. 스튜던트 t-검정을 사용하여 NF-YC4-OE 돌연변이체 및 동기 대조군에서의 오일 함량을 비교하였다. * P < 0.05. 나타나 있는 바와 같이, 오일은 대조군과 비교하여 NF-YC4를 과다발현하는 대두 식물에서 유사하거나 또는 감소하였다.
도 14c는 동기 대조군과 비교한, NF-YC4를 과다발현하는 형질전환된 대두 (NF-YC4-OE)의 형질전환 이벤트 (1, 2, 3 및 4; 각각의 번호는 상이한 형질전환 이벤트를 나타냄)의 단백질+오일 함량에 대한 그래프이다. 오차 막대는 표준 오차를 나타낸다. 스튜던트 t-검정을 사용하여 NF-YC4-OE 돌연변이체 및 동기 대조군에서의 단백질+오일 함량을 비교하였다. * P < 0.05. ** P <0.01. 나타나 있는 바와 같이, 단백질+오일 함량은 대조군과 비교하여 NF-YC4를 과다발현하는 대두 식물에서 약 5% 내지 약 7% 증가하였다.
도 14d는 동기 대조군과 비교한, NF-YC4를 과다발현하는 형질전환된 대두 (NF-YC4-OE)의 형질전환 이벤트 (1, 2, 3 및 4; 각각의 번호는 상이한 형질전환 이벤트를 나타냄)의 종자 섬유 (13% 수분을 함유하는 생중량당 %)에 대한 그래프이다. 오차 막대는 표준 오차를 나타낸다. 스튜던트 t-검정을 사용하여 NF-YC4-OE 돌연변이체 및 동기 대조군에서의 섬유 함량을 비교하였다. ** P < 0.01. 나타나 있는 바와 같이, 종자 섬유는 대조군과 비교하여 NF-YC4를 과다발현하는 대두 식물에서 약 3.4% 내지 약 5.6% 감소하였다.
도 14e는 동기 대조군과 비교한, NF-YC4를 과다발현하는 형질전환된 대두 (NF-YC4-OE)의 형질전환 이벤트 (1, 2, 3 및 4; 각각의 번호는 상이한 형질전환 이벤트를 나타냄)의 식물당 종자 중량 (식물당 그램)에 대한 그래프이다. 오차 막대는 표준 오차를 나타낸다. 스튜던트 t-검정을 사용하여 NF-YC4-OE 돌연변이체 및 동기 대조군에서의 식물당 종자 중량을 비교하였다. 나타나 있는 바와 같이, NF-YC4를 과다발현하는 대두 식물에서의 식물당 종자 중량은 대조군과 유사하였다.
실시예 26
본 실시예는 NF-YC4를 과다발현하는 트랜스제닉 옥수수 식물의 종자에서 단백질 함량이 증가하였다는 것을 입증한다.
NF-YC4를 과다발현하는 트랜스제닉 옥수수 식물을 생성시키고, 재배지에서 성장시켰다. 실시예 1로부터의 구축물을 아그로박테리움-매개된 형질전환을 통해 옥수수 내로 도입하였다. 역교배 2 (BC2; B104에 대한 B104 배경 역교배) 종자를 실시예 2에 기재된 바와 같이 NIRS를 사용하여 분석하였다. 데이터는 도 15a-15c에 나타나 있다.
도 15a는 동기 대조군과 비교한, 아라비돕시스 NF-YC4를 과다발현하는 형질전환된 옥수수 (AtNF-YC4-OE)의 커넬 단백질 (건조 중량당 %)에 대한 그래프이다. 오차 막대는 표준 오차를 나타낸다. 스튜던트 t-검정을 사용하여 NF-YC4-OE 돌연변이체 및 동기 대조군에서의 단백질 함량을 비교하였다. ** P < 0.01. 나타나 있는 바와 같이, 커넬 단백질은 대조군과 비교하여 약 17% 증가하였다.
도 15b는 동기 대조군과 비교한, 아라비돕시스 NF-YC4를 과다발현하는 형질전환된 옥수수 (AtNF-YC4-OE)의 커넬 오일 (건조 중량당 %)에 대한 그래프이다. 오차 막대는 표준 오차를 나타낸다. 스튜던트 t-검정을 사용하여 NF-YC4-OE 돌연변이체 및 동기 대조군에서의 오일 함량을 비교하였다. 나타나 있는 바와 같이, 커넬 오일은 대조군과 유사하였다.
도 15c는 동기 대조군과 비교한, 아라비돕시스 NF-YC4를 과다발현하는 형질전환된 옥수수 (AtNF-YC4-OE)의 커넬 전분 (건조 중량당 %)에 대한 그래프이다. 오차 막대는 표준 오차를 나타낸다. 스튜던트 t-검정을 사용하여 NF-YC4-OE 돌연변이체 및 동기 대조군에서의 전분 함량을 비교하였다. ** P < 0.01. 나타나 있는 바와 같이, 커넬 전분은 대조군과 비교하여 약 2.2% 감소하였다.
실시예 27
본 실시예는 NF-YC4를 과다발현하는 트랜스제닉 벼 식물의 종자에서 단백질 함량이 증가하였다는 것을 입증한다.
NF-YC4를 과다발현하는 트랜스제닉 벼 식물을 생성시키고, 성장 챔버에서 성장시켰다. 실시예 17로부터의 구축물 (pB2GW7-OsNF-YC4)을 아그로박테리움-매개된 형질전환을 통해 벼 내로 도입하였다. 데이터는 도 16a 및 16b에 나타나 있다.
도 16a는 야생형과 비교한, 벼 NF-YC4를 과다발현하는 형질전환된 벼 (OsNF-YC4-1-OE)의 종자 전분 (g 건조 중량당 mg)에 대한 그래프이다. 오차 막대는 표준 오차를 나타낸다. 스튜던트 t-검정을 사용하여 NF-YC4-OE 돌연변이체 및 대조군에서의 종자 전분 함량을 비교하였다. ** P < 0.01. 나타나 있는 바와 같이, 종자 전분은 약 6% 감소하였다.
도 16b는 야생형과 비교한, 벼 NF-YC4를 과다발현하는 형질전환된 벼 (OsNF-YC4-1-OE)의 종자 단백질 (g 건조 중량당 mg)에 대한 그래프이다. 오차 막대는 표준 오차를 나타낸다. 스튜던트 t-검정을 사용하여 NF-YC4-OE 돌연변이체 및 대조군에서의 종자 단백질 함량을 비교하였다. ** P < 0.01. 나타나 있는 바와 같이, 종자 단백질은 약 37% 증가하였다.
명세서에 언급된 모든 특허, 특허 출원 공개, 학술지 논문, 텍스트북 및 다른 공개는 본 개시내용이 속하는 기술분야의 통상의 기술자의 수준을 나타낸다. 모든 이러한 공개는 각각의 개별 공개가 구체적으로 및 개별적으로 참조로 포함된 것으로 나타나 있는 것과 동일한 정도로 본원에 참조로 포함된다.
본원에 예시적으로 기재된 본 발명은 적합하게는 본원에 구체적으로 개시되지 않은 임의의 요소(들) 또는 제한(들)의 부재 하에 실시될 수 있다. 따라서, 예를 들어, 본원의 각각의 경우에서 용어 "포함하는", "본질적으로 이루어진" 및 "이루어진" 중 어느 것은 다른 두 용어 중 어느 하나로 대체될 수 있다. 마찬가지로, 단수 형태는 문맥에 달리 명백하게 기재되지 않는 한 복수 지시대상을 포함한다. 따라서, 예를 들어, "방법"에 대한 언급은 본원에 기재되고/거나 본 개시내용을 읽을 때 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 분명해지는 유형의 하나 이상의 방법 및/또는 단계를 포함한다.
사용된 용어 및 표현은 제한이 아니라 설명의 관점에서 사용된다. 이와 관련하여, 특정 용어가 "정의" 하에 정의되고 있고 "상세한 설명"의 다른 곳에 달리 정의, 기재 또는 논의되어 있는 경우, 모든 이러한 정의, 기재 및 논의는 이러한 용어에 기인하는 것으로 의도된다. 또한, 이러한 용어 및 표현의 사용에 있어서 제시 및 기재된 특색 또는 그의 부분의 임의의 등가물을 배제하려는 의도는 없다. 게다가, 부표제, 예를 들어 "정의"가 "상세한 설명"에 사용되지만, 이러한 사용은 오로지 참조의 용이성을 위한 것이고, 한 섹션에 이루어진 임의의 개시내용을 단지 그 섹션으로만 제한하는 것으로 의도되지는 않으며; 오히려, 한 부표제 하에 이루어진 임의의 개시내용은 각각의 및 모든 다른 부표제 하의 개시내용을 구성하는 것으로 의도된다.
청구된 본 발명의 범주 내에서 다양한 변형이 가능하다고 인식된다. 따라서, 본 발명이 바람직한 실시양태 및 임의적인 특색과 관련하여 구체적으로 개시되었더라도, 관련 기술분야의 통상의 기술자는 본원에 개시된 개념의 변형 및 변경에 의존할 수 있는 것으로 이해되어야 한다. 이러한 변형 및 변경은 본원에 청구된 바와 같은 본 발명의 범주 내에 있는 것으로 간주된다.
SEQUENCE LISTING <110> IOWA STATE UNIVERSITY RESEARCH FOUNDATION, INC. <120> MODIFICATION OF TRANSCRIPTIONAL REPRESSOR BINDING SITE IN NF-YC4 PROMOTER FOR INCREASED PROTEIN CONTENT AND RESISTANCE TO STRESS <130> ISURF 1401-2 PCT <150> 62/117,924 <151> 2015-02-18 <150> 62/244,131 <151> 2015-10-20 <160> 20 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 1447 <212> DNA <213> Oryza sativa <400> 1 gcaagaaccc cagttgagag tggagatggc cattttgttc aggcactagg cagtgggtag 60 gacggtgagg agtgtgtcct gcactcctgc ttcccctgac gatcgatccc catgcgtgcc 120 gaagcatctg atacttttgc tgtgctgttc tttaatttac cctgatactt ttggatatct 180 gaagcagtag agctcgttca ctcaaacagg ctagcctgtt ttgctttctg gtaagaactt 240 aattaactag ttgagatcga catgcatgga tgcgtgaatc tattgttgca ttttttctaa 300 tggatagtta gatttgttcc agcttttttt ttgtcaattc tgttacattt gcagtgtctt 360 caacttctgc atcattcttc tctattcttc cttcactttc tttcttgaac tagaaaagca 420 aaccagagtt ctttttcccc ctcttctaca taaacgaaaa cagcttgttg actggctccc 480 tagagctttt tgtaagttga tcatcgaagt agctagttct 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gcttatcaat 1140 ccttcgatct ctcacagaca atacctacaa gcgtcgttta cactttgcat gtatagctag 1200 ccattgttac atacgtggag catgtagcga tcattcgttc ctagcacgta aattaatcgc 1260 cgtaattttg cccatgcaga cacagcacac acagctacaa atcgactgta attaaggtac 1320 gtatatatag gtgaca 1336 <210> 5 <211> 111 <212> DNA <213> Oryza sativa <400> 5 agtcatcact gttctatgtt ctatctgcat tttccttgat tttgtacttt tcctgaacga 60 aaggacaatc cttagccatc ataatgctat gatcgactta ttctgaagtc a 111 <210> 6 <211> 1257 <212> DNA <213> Oryza sativa <400> 6 gcaagaaccc cagttgagag tggagatggc cattttgttc aggcactagg cagtgggtag 60 gacggtgagg agtgtgtcct gcactcctgc ttcccctgac gatcgatccc catgcgtgcc 120 gaagcatctg atacttttgc tgtgctgttc tttaatttac cctgatactt ttggatatct 180 gaagcagtag agctcgttca ctcaaacagg ctagcctgtt ttgctttctg gtaagaactt 240 aattaactag ttgagatcga catgcatgga tgcgtgaatc tattgttgca ttttttctaa 300 tggatagtta gatttgttcc agcttttttt ttgtcaattc tgttacattt gcagtgtctt 360 caacttctgc atcattcttc tctattcttc cttcactttc tttcttgaac tagaaaagca 420 aaccagagtt ctttttcccc ctcttctaca tatccggcct cgatcctctt ttgtttcggt 480 gagatctgta atggtttagg aaaattatgg atctctgaaa aataagaaac atctagtagt 540 atatgaaatt aagaaatgtc ggaccacgtc aaatcctact ggtatcatat accagataac 600 taactttttg aatggaacca aacacgagat tgtgaatata tagcagtaag aaatacaacc 660 ccgaagggta aaggagaaaa aggaaaagca gtttagtgta cgagctgtag gagtagcttt 720 gctcctgcca aggcccagat ccttgcctct tccttcattt ctgcgaggag accaggcact 780 gaggtctcat tgtgatcgaa gattctcctg tttctctcct tccagatctc ctttgggaac 840 accctgtgtg tttgcaagcg cttagcttca ttttcatgca tgatatgatc tctggataga 900 agataagtag cccccacaca tgcacttcgc cacctatagc cagcctcgag ttctcatctg 960 tttgatccgt cgcacatgtg gagcaacgaa gctctagagt acgtctccta atctctactt 1020 acttttgcag tttgcacaca tattgagaaa tgcttatcaa tccttcgatc tctcacagac 1080 aatacctaca agcgtcgttt acactttgca tgtatagcta gccattgtta catacgtgga 1140 gcatgtagcg atcattcgtt cctagcacgt aaattaatcg ccgtaatttt gcccatgcag 1200 acacagcaca cacagctaca aatcgactgt aattaaggta cgtatatata ggtgaca 1257 <210> 7 <211> 190 <212> DNA <213> Oryza sativa <400> 7 aacgaaaaca gcttgttgac tggctcccta gagctttttg taagttgatc atcgaagtag 60 ctagttctct tcacttatca gtcatcactg ttctatgttc tatctgcatt ttccttgatt 120 ttgtactttt cctgaacgaa aggacaatcc ttagccatca taatgctatg atcgacttat 180 tctgaagtca 190 <210> 8 <211> 1176 <212> DNA <213> Glycine max <400> 8 taatataata taagaatttg taaattataa acctaaaaaa ggtgcatacc aaatgaatag 60 tttatttcaa aagcaaagat aaattttata cacaaaagtg acaaaatgtg gacttgaaaa 120 tcacatgcta gagcaaagca aggttcagat gaagccaaat ggctagaacg taaatgctgc 180 aaaaatcaat tatatttgaa tctcacgggc attgaacaaa agagaatgga cccatcaatg 240 gggcattgac atggatggat ggaacaccct catagtcaca tgccacaaca gagtaacgct 300 aaacaaaatg tattaacaaa aactatagga tcatgctttc ttaatttaaa aacataggtg 360 gtcagttttt gttaacatta atttttagga ttatttgttg aagacaaata tggaaggttt 420 ataataattt atgtgcatta ctcaatgtaa tccttaaaat gaaaataact aaactttttt 480 tttttggata gttaaacaac tacgaagcta aatgaataat taaatcaata ttaattttga 540 ttaaaaataa gattaataat atccctaata ttgtgaacaa actttgttgg taatgtaaaa 600 aaaattaaaa gaaacaagat taaattacgt atttaataat ttaagattaa tgttgtttaa 660 tttgattttt taaatattta tctttctttt gaatttgatt ctttagttca cttaagatta 720 tgatcgttaa taattctaaa agataaatgt catcaatctt gaattgattg aaagattaaa 780 ttaaataaaa agaattaaga taaatgatga aaatacattt aaaaaataag atgaaacaaa 840 atgtgtcatt taaccaaaaa aaaaaggaaa aataaattaa aaaaaggaac ttacccttcc 900 cctcaaaaaa gaaaagaaaa aaaaaaagga acttaccctt ggttgttccg ttgaaattga 960 aaaaacaaac cctaaactta ccttaaccta ggtcctaggg cactggtcgg atatgttatt 1020 gtttagttta ccttatccca ccacatacat agtttttttt ttcttaaatt tcccaatcaa 1080 ttccatccat cgggtcttta ctctcttacc caacccacac acactctttc tctctctctc 1140 tttccctgat catcaaaatc agaaaaaatt ggggga 1176 <210> 9 <211> 1159 <212> DNA <213> Glycine max <400> 9 taatataata taagaatttg taaattataa acctaaaaaa ggtgcatacc aaatgaatag 60 tttatttcaa aagcaaagat aaattttata cacaaaagtg acaaaatgtg gacttgaaaa 120 tcacatgcta gagcaaagca aggttcagat gaagccaaat ggctagaacg taaatgctgc 180 aaaaatcaat tatatttgaa tctcacgggc attgaacaaa agagaatgga 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ttactctctt acccaaccca cacacactct ttctctctct ctctttccct gatcatcaaa 1140 atcagaaaaa attggggga 1159 <210> 10 <211> 17 <212> DNA <213> Glycine max <400> 10 agtcacatgc cacaaca 17 <210> 11 <211> 1135 <212> DNA <213> Glycine max <400> 11 taatataata taagaatttg taaattataa acctaaaaaa ggtgcatacc aaatgaatag 60 tttatttcaa aagcaaagat aaattttata cacaaaagtg acaaaatgtg gacttgaaaa 120 tcacatgcta gagcaaagca aggttcagat gaagccaaat ggctagaacg taaatgctgc 180 aaaaatcaat tatatttgaa tctcacgggc attgaacaaa agagaatgga cccatcaatg 240 gggcattgac atggatggat ggaacaccct catagtcaca tgccacaaca gagtaacgct 300 aaacaaaatg tattaacaaa aactatagga tcatgctttc ttaatttaaa aacataggta 360 agacaaatat ggaaggttta taataattta tgtgcattac tcaatgtaat ccttaaaatg 420 aaaataacta aacttttttt ttttggatag ttaaacaact acgaagctaa atgaataatt 480 aaatcaatat taattttgat taaaaataag attaataata tccctaatat tgtgaacaaa 540 ctttgttggt aatgtaaaaa aaattaaaag aaacaagatt aaattacgta tttaataatt 600 taagattaat gttgtttaat ttgatttttt aaatatttat ctttcttttg aatttgattc 660 tttagttcac ttaagattat gatcgttaat aattctaaaa gataaatgtc atcaatcttg 720 aattgattga aagattaaat taaataaaaa gaattaagat aaatgatgaa aatacattta 780 aaaaataaga tgaaacaaaa tgtgtcattt aaccaaaaaa aaaaggaaaa ataaattaaa 840 aaaaggaact tacccttccc ctcaaaaaag aaaagaaaaa aaaaaaggaa cttacccttg 900 gttgttccgt tgaaattgaa aaaacaaacc ctaaacttac cttaacctag gtcctagggc 960 actggtcgga tatgttattg tttagtttac cttatcccac cacatacata gttttttttt 1020 tcttaaattt cccaatcaat tccatccatc gggtctttac tctcttaccc aacccacaca 1080 cactctttct ctctctctct ttccctgatc atcaaaatca gaaaaaattg gggga 1135 <210> 12 <211> 41 <212> DNA <213> Glycine max <400> 12 ggtcagtttt tgttaacatt aatttttagg attatttgtt g 41 <210> 13 <211> 1105 <212> DNA <213> Glycine Max <400> 13 taatataata taagaatttg taaattataa acctaaaaaa ggtgcatacc aaatgaatag 60 tttatttcaa aagcaaagat aaattttata cacaaaagtg acaaaatgtg gacttgaaaa 120 tcacatgcta gagcaaagca aggttcagat gaagccaaat ggctagaacg taaatgctgc 180 aaaaatcaat tatatttgaa tctcacgggc attgaacaaa agagaatgga cccatcaatg 240 gggcattgac atggatggat ggaacaccct catagtcaca tgccacaaca gagtaacgct 300 aaacaaaatg tattaacaaa aactatagga tcatgctttc ttaatttaaa aacataggtg 360 gtcagttttt gttaacatta atttttagga ttatttgttg aagacaaata tggaaggttt 420 ataataattt atgtgcatta ctcaatgtaa tccttaaaat gaaaataact aaactttttt 480 tttttggata gttaaacaac tacgaagcta aatgaataat taaatcaata ttaattttga 540 ttaaaaataa gattaataat atccctaata ttgtgaacaa actttttaat ttgatttttt 600 aaatatttat ctttcttttg aatttgattc tttagttcac ttaagattat gatcgttaat 660 aattctaaaa gataaatgtc atcaatcttg aattgattga aagattaaat taaataaaaa 720 gaattaagat aaatgatgaa aatacattta aaaaataaga tgaaacaaaa tgtgtcattt 780 aaccaaaaaa aaaaggaaaa ataaattaaa aaaaggaact tacccttccc ctcaaaaaag 840 aaaagaaaaa aaaaaaggaa cttacccttg gttgttccgt tgaaattgaa aaaacaaacc 900 ctaaacttac cttaacctag gtcctagggc actggtcgga tatgttattg tttagtttac 960 cttatcccac cacatacata gttttttttt tcttaaattt cccaatcaat tccatccatc 1020 gggtctttac tctcttaccc aacccacaca cactctttct ctctctctct ttccctgatc 1080 atcaaaatca gaaaaaattg gggga 1105 <210> 14 <211> 71 <212> DNA <213> Glycine max <400> 14 tgttggtaat gtaaaaaaaa ttaaaagaaa caagattaaa ttacgtattt aataatttaa 60 gattaatgtt g 71 <210> 15 <211> 586 <212> DNA <213> Arabidopsis thaliana <400> 15 ctcagaagaa gcctcctttc gatctgtcag ccattgaaga aacctccttt cgatctgtca 60 gccattgaag atcagaagaa acaagactca cacggtcagc cattgaagaa gcctcctctc 120 attacctctc atcaaacatc tagatctgta cccaaacctt atcccttttt ccttatttct 180 cgctttgtct attcttaatc tgattaatac ttgttgttgt tccaggttat agaagatctg 240 ggttgtgtta tatgcttcat tttctccaca gcgaccagtt ggtgtttggt tcttagattc 300 atgaagacca atagagagca ggaaatttac gttgaaagaa gcttcaaacc aaacaattca 360 acaattcaga atttgatgga cattgaaagg ttcattttgc ctcacacttc tacatcaggt 420 gtcgcaaggc tcaaaatgag ggtcatatca tgggtcgggc ttcagttcta caactactga 480 tattgggcct tatcacaaat tagttatagg gccattgtat ccaatattta atatctctgt 540 aaacttgttt aatggttatt ttgttctaat gcccattaca actaga 586 <210> 16 <211> 59 <212> PRT <213> Arabidopsis thaliana <400> 16 Met Lys Thr Asn Arg Glu Gln Glu Ile Tyr Val Glu Arg Ser Phe Lys 1 5 10 15 Pro Asn Asn Ser Thr Ile Gln Asn Leu Met Asp Ile Glu Arg Phe Ile 20 25 30 Leu Pro His Thr Ser Thr Ser Gly Val Ala Arg Leu Lys Met Arg Val 35 40 45 Ile Ser Trp Val Gly Leu Gln Phe Tyr Asn Tyr 50 55 <210> 17 <211> 32 <212> DNA <213> Glycine max <400> 17 ggtcagtttt tgttaacatt aatttttagg at 32 <210> 18 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Synthetic <400> 18 cctcccaggc atggcagtcc 20 <210> 19 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Synthetic <400> 19 ccatcaaggc tccgctgg 18 <210> 20 <211> 1034 <212> DNA <213> Zea mays <400> 20 agggccctgc agcggcggca gctggcggga gagaggcttg ggactgggcc gcccggccgc 60 gaggaataaa ctcactcctg tcttcatacg tatccatagc cggcaggcgg cagtacctgt 120 atgtggtttt agctatacgc gacctcagtt cgggcgcaag gttagtcttc gatttaagca 180 tagattttat tttatcttct tggctccacc aaataacact aacaaaatcg ctttggcttc 240 tatgggttca aattaagcac tggatcgtac cattttcttg ttcatttata ctttgtcatc 300 caatccacac cgattaattt ctcacggtca acaacgcatg aagttttcat 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Claims (49)

  1. 식물에서 핵 인자 Y, 서브유닛 C4 (NF-YC4) 단백질의 발현을 증가시키는 것을 포함하는, 식물에서 단백질 함량을 증가시키는 방법이며, 여기서 방법은:
    (a) (i) 하나 이상의 식물을 식물로부터의 NF-YC4 단백질을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 재조합 핵산으로 형질전환시키며, 여기서 NF-YC4 단백질을 코딩하는 뉴클레오티드 서열은 프로모터의 제어 하에 있는 것인 단계, 및 (ii) 상기 재조합 핵산이 결여된 상응하는 야생형 (WT) 식물에서의 총 단백질 함량과 비교하여 총 단백질 함량이 증가된, 단계 (i)로부터의 하나 이상의 형질전환된 식물을 선택하는 단계, 또는
    (b) NF-YC4 단백질을 코딩하는 NF-YC4 유전자의 프로모터 영역을 변형시켜, NF-YC4 단백질의 발현이 증가되고, 이에 따라 식물에서 적어도 단백질 함량이 NF-YC4 유전자의 변형된 프로모터 영역을 갖지 않는 상응하는 WT 식물에서의 단백질 함량보다 높은 것인 단계
    를 포함하는 방법.
  2. 제1항에 있어서, 단계 (b)를 포함하는 방법.
  3. 제2항에 있어서, NF-YC4 유전자의 프로모터 영역에 위치된 전사 리프레서 부위를 변형시키는 것을 포함하며, 여기서 상기 변형은 NF-YC4 유전자의 전사를 증가시키는 것인 방법.
  4. 제1항에 있어서, NF-YC4 단백질을 코딩하는 뉴클레오티드 서열이 아라비돕시스 탈리아나(Arabidopsis thaliana), 오리자 사티바(Oryza sativa) 및 글리신 맥스(Glycine max)로 이루어진 군으로부터 선택되는 식물로부터의 것인 방법.
  5. 제1항에 있어서, NF-YC4 단백질을 코딩하는 뉴클레오티드 서열이 콜리플라워 모자이크 바이러스 프로모터에 의해 제어되는 것인 방법.
  6. 제5항에 있어서, 콜리플라워 모자이크 바이러스 프로모터가 p35s 프로모터인 방법.
  7. 제1항에 있어서, NF-YC4 단백질을 코딩하는 뉴클레오티드 서열이 트랜스진인 방법.
  8. 제1항에 있어서, NF-YC4 단백질을 코딩하는 뉴클레오티드 서열이 벡터 내에 있는 것인 방법.
  9. 제1항에 있어서, 단계 (a)를 포함하는 방법.
  10. 제1항에 있어서, NF-YC4 단백질을 코딩하는 뉴클레오티드 서열이 아그로박테리움(Agrobacterium)-매개된 형질전환을 통해 식물 내로 도입되는 것인 방법.
  11. 제1항에 있어서, 단백질 함량이 식물의 잎 또는 종자에서 증가되는 것인 방법.
  12. 제1항에 있어서, 식물이 작물 식물인 방법.
  13. 제12항에 있어서, 작물 식물이 옥수수, 대두, 알팔파, 카놀라, 밀, 벼, 감자 및 상추로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법.
  14. 제1항의 방법에 따라 수득된 식물인 유기체를 제2 식물과 교배하여 자손 식물을 생산하고, 증가된 단백질 함량을 갖는 자손 식물을 선택하여, 증가된 단백질 함량을 갖는 식물이 생산되도록 하는 것을 포함하는, 증가된 단백질 함량을 갖는 식물을 생산하는 방법.
  15. 제14항의 방법에 의해 생산된 식물.
  16. 핵 인자 Y, 서브유닛 C4 (NF-YC4) 단백질의 증가된 발현을 갖는 식물 세포이며, 여기서 식물 세포에서 적어도 단백질 함량이 NF-YC4 단백질의 증가된 발현을 갖지 않는 상응하는 야생형 (WT) 세포에서의 단백질 함량보다 높고, 여기서 식물 세포는,
    (a) (i) 하나 이상의 식물 세포를 식물로부터의 NF-YC4 단백질을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 재조합 핵산으로 형질전환시키며, 여기서 NF-YC4 단백질을 코딩하는 뉴클레오티드 서열은 프로모터의 제어 하에 있는 것인 단계, 및 (ii) 상기 재조합 핵산이 결여된 상응하는 WT 세포에서의 총 단백질 함량과 비교하여 증가된 단백질 함량에 대해 세포 또는 그의 자손을 선택하는 단계, 또는
    (b) NF-YC4 단백질을 코딩하는 NF-YC4 유전자의 NF-YC4 프로모터 영역을 변형시켜, 식물 세포에서의 NF-YC4 단백질의 발현이 변형된 NF-YC4 프로모터 영역이 결여된 WT 세포와 비교하여 증가되는 것인 단계
    에 의해 수득되는, 식물 세포.
  17. 제16항에 있어서, 변형된 NF-YC4 프로모터 영역을 포함하는 식물 세포.
  18. 제17항에 있어서, 변형된 NF-YC4 프로모터 영역에 위치된 변형된 전사 리프레서 부위를 포함하는 식물 세포.
  19. 제16항의 식물 세포를 포함하는 식물 부분.
  20. 제19항에 있어서, 종자인 식물 부분.
  21. 병원체 또는 해충에 의한 감염의 위험이 있는 식물에서 핵 인자 Y, 서브유닛 C4 (NF-YC4) 단백질의 발현을 증가시키는 것을 포함하는, 식물에서 병원체 또는 해충에 대한 저항성을 증가시키는 방법이며, 여기서 방법은:
    (a) (i) 하나 이상의 식물을 식물로부터의 NF-YC4 단백질을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 재조합 핵산으로 형질전환시키며, 여기서 NF-YC4 단백질을 코딩하는 뉴클레오티드 서열은 프로모터의 제어 하에 있는 것인 단계, 및 (ii) 상기 재조합 핵산이 결여된 상응하는 야생형 (WT) 식물과 비교하여 병원체 또는 해충에 대한 저항성이 증가된, 단계 (i)로부터의 하나 이상의 형질전환된 식물을 선택하는 단계, 또는
    (b) NF-YC4 단백질을 코딩하는 NF-YC4 유전자의 프로모터 영역을 변형시켜, NF-YC4 단백질의 발현이 증가되고, 이에 따라 식물에서 병원체 또는 해충에 대한 저항성이 증가되는 것인 단계
    를 포함하는 방법.
  22. 제21항에 있어서, 단계 (b)를 포함하는 방법.
  23. 제22항에 있어서, NF-YC4 유전자의 프로모터 영역에 위치된 전사 리프레서 부위가 변형되며, 여기서 상기 변형은 NF-YC4 유전자의 전사를 증가시키는 것인 방법.
  24. 제21항의 방법에 따라 수득된 식물을 제2 식물과 교배하여 자손 식물을 생산하고, 병원체 또는 해충에 대한 증가된 저항성을 갖는 자손 식물을 선택하여, 병원체 또는 해충에 대한 증가된 저항성을 갖는 식물이 생산되도록 하는 것을 포함하는, 병원체 또는 해충에 대한 증가된 저항성을 갖는 식물을 생산하는 방법.
  25. 제24항의 방법에 따라 생산된 식물.
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