BR122023024788A2

BR122023024788A2 - Genoma de planta geneticamente modificado para aumentar o teor de proteína e resistência a um agente patogênico ou a uma praga

Info

Publication number: BR122023024788A2
Application number: BR122023024788-4A
Authority: BR
Inventors: Ling Li; Eve Syrkin Wurtele
Original assignee: Iowa State University Research Foundation, Inc.
Priority date: 2015-02-18
Filing date: 2016-02-17
Publication date: 2023-12-26
Also published as: AU2016220088A1; JP7453999B2; JP6785235B2; ZA201705045B; KR20170121218A; AU2016220088C1; BR112017017798A2; US11542520B2; IL296837A; CL2017002092A1; MX2022010832A; MX2017010480A; KR102630802B1; CN114990070A; EP3258774A1; US10640781B2; AU2016220088B2; JP2021019627A; CN107532148A; JP2022058741A

Abstract

genoma de planta geneticamente modificado para aumentar o teor de proteína e resistência a um agente patogênico ou a uma praga. a presente invenção trata de método para aumentar o teor de proteínas numa célula eucariota compreendendo um gene nf-yc4 compreendendo a modificação do local de ligação do repressor transcricional. método de produção de uma planta com aumento do teor de proteínas compreendendo cruzamento e seleção de aumento do teor de proteína. método de aumentar a resistência a um agente patogênico ou a uma praga numa planta compreendendo um gene nf-yc4 compreendendo a modificação do local de ligação do repressor transcricional, sozinho ou em combinação adicional com a expressão de qqs na planta. método para a produção de uma planta com resistência aumentada a um patógeno ou a uma praga que compreende cruzar e selecionar uma resistência aumentada ao patógeno ou à praga. célula, colecção de células, tecido, órgão ou organismo, em que o gene nf-yc4 compreende um promotor que compreende um local de ligação do repressor transcricional que tenha sido modificado de modo que o repressor da transcrição não possa impedir a transcrição do nf-yc4. plantas híbridas e sementes.

Description

Declaração sobre Pesquisa ou Desenvolvimento Patrocinado pelo Governo Federal

[001] O trabalho aqui descrito foi apoiado, pelo menos em parte, por subsídios da National Science Foundation sob o reconhecimento MCB nos 0209789 e 0951170. Portanto, o governo dos Estados Unidos possui determinados direitos na invenção.

Campo Técnico da Invenção

[002] A presente revelação se refere ao aumento do teor proteico em uma célula eucariótica, aumento de resistência da planta à tensão, como tensão abiótica (por exemplo, sal, estiagem e poluição) ou biótica (por exemplo, patógenos e parasitas), um promotor com um local de ligação de repressor de transcrição modificado, de modo que o repressor de transcrição não possa evitar a transcrição do gene, NF-YC4, QQS, TALENS, CRISPR/Cas9, cultura de tecido, plantas de cruzamento e retrocruzamento, plantas híbridas, células regeneráveis e sementes.

Histórico da Invenção

[003] A deficiência proteica é um grande problema de saúde em todo o mundo em desenvolvimento. Baixa ingestão de proteína contribui para deficiência mental, atraso de crescimento, suscetibilidade a doenças, doenças emaciantes e/ou morte em centenas de milhões de crianças por ano (Forrester et al., PloS one 7: e35907 (2012); Gomes et al., J. Neuroscience Res. 87: 3568-3575 (2009)).

[004] As plantas provêm mais de 60% da proteína alimentar humana (Young et al., Am. J. Clin. Nutr. 59: 1203S-1212S (1994)). O aumento do teor proteína de cultivos básicos poderia ajudar a aliviar a deficiência proteica, especialmente quando o uso de animais exige aproximadamente 100 vezes mais água e 11 vezes mais energia para produzir uma quantidade equivalente de proteína (Pimentel et al., Am. J. Clin. Nutr. 78: 6605-6635 (2003)) e o aumento do teor proteico de animais geralmente é acompanhado de uma redução na qualidade ou rendimento proteico (Bellaloui et al., Agricultural Sciences 1: 110-118 (2010); Wenefrida et al., J. Agricultural Food Chem. 61: 11702-11710 (2013)).

[005] O gene órfão de Arabidopsis thaliana QQS (At3g30720, Qua-Quine Starch) modula o teor proteico em Arabidopsis. Os mutantes da síntese de amido 3 de Arabidopsis thaliana (Atss3), que são morfologicamente similares às linhas de controle do tipo selvagem (WT), mas diferem em níveis de amido (Zhang et al., Plant Physiol. 138: 663-674 (2005)), possuem mais de cinco vezes a quantidade de transcrições de QQS encontradas no WT (Li et al., Plant J. 58: 485-498 (2009)). A superexpressão de QQS em Arabidopsis aumenta o teor proteico total e reduz o teor total de amido nas folhas, enquanto a desregulação de QQS possui o efeito inverso (Li et al., Plant Biotech. J. 13: 177-187 (2015); Li et al. (2009), supra). A expressão de QQS como um transgene aumenta o teor proteico em outras plantas, como soja (var. Williams 82; Li et al. (2014), supra; Li et al. (2009), supra).

[006] A expressão de QQS tem sido observada como estreitamente ligada a uma variedade de perturbações de desenvolvimento, ambientais e genéticas (vide, por exemplo, Arendsee et al., Trends in Plant Sei doi:10.1016/j.tplants.2014.07.003 (2014); Li et al. (2009), supra; and Li et al. (2015), supra). No entanto, seu papel nestas perturbações não foi esclarecido. Por exemplo, PEN3 (Resistência à Penetração (Atlg59870, PEN3, gene transportador de cassete de ligação ABC) confere resistência não hospedeira a fungos e patógenos oomicetos. QQS foi relatado como ser o único gene que é suprarregulado em mutantes de eliminação (KO) pen3; no entanto, QQS é suprarregulado em mutantes infectados e não infectados (Stein et al., Plant Cell 18(3): 731-746 (2006)). Como outro exemplo, duas sintaxinas, a saber SYP121 (At3gll820, PENl) e SYP122 (At3g52400) conferem resistência a míldios em pó. As eliminações destes genes resultam em sensibilidade elevada a estes patógenos; QQS foi relatado como sendo o único gene que é suprarregulado em ambos (Zhang et al. (2008)). Em contraste, apesar de PEN3 e EXLl serem suprarregulados após a exposição a alguns patógenos, QQS é sub-regulado em resposta à infecção por alguns patógenos, como Pseudomonas syringae (Kwon et al., Plant 236(3): 887-900 (2012); e Thilmony et al., Plant J. 46(1): 34-53 (2006)). Quando as plantas de Arabidopsis foram inoculadas com Phytopthera infestam, QQS supostamente foi primeiramente subrregulado em 6 h pós- inoculação e então suprarregulado em 12 e 24 h pós-inoculação (Scheel et al., Experiment ID "E-GEOD-5616" in ArrayExpress).

[007] Portanto, em vista do descrito acima, é um objetivo da presente revelação identificar um gene com qual QQS interage. Em Arabidopsis, QQS interage com o fator nuclear Y, subunidade C4 (NF-YC4, At5g63470). É outro objetivo prover materiais e métodos para manipulação de um gene assim identificado. Em uma realização, a manipulação de tal gene resulta em teor proteico elevado e/ou teor de carboidrato reduzido. Ainda é outro objetivo prover materiais e um método para aumentar a resistência de uma planta a um patógeno ou um parasita. Estes e demais objetivos, bem como características da invenção, ficarão evidentes a partir da descrição detalhada aqui provida.

Descrição Resumida da Invenção

[008] É provido um método de aumento de teor proteico em uma célula eucariótica que compreende um gene NF-YC4, o qual compreende um promotor compreendendo um local de ligação de repressor de transcrição. O método compreende modificação do local de ligação de repressor de transcrição, ao qual o repressor de transcrição não pode evitar a transcrição do NF-YC4. O teor proteico na célula eucariótica é elevado; assim, o método pode compreender ainda a seleção para teor proteico elevado. O método pode compreender ainda geração de uma coleção de células, tecido, órgão ou um organismo da célula eucariótica. A célula eucariótica pode ser uma parte de uma coleção de células, tecido, órgão ou organismo. O organismo pode ser uma planta, como uma planta de cultivo, como soja, arroz, milho ou similar. A planta pode ser uma monocotiledônea ou uma dicotiledônea. O local de ligação de repressor de transcrição pode ser modificado por uma exclusão. O local de ligação de repressor de transcrição pode compreender, consistir essencialmente de, ou consistir de um motivo ERF, um motivo RAVl, ou tanto um motivo ERF quanto um motivo RAVl. A célula eucariótica pode ser uma célula de arroz e (i) dois motivos ERFs são excluídos, (ii) um motivo RAFl é excluído, ou (iii) um motivo RAVl e um motivo ERF são excluídos. A célula eucariótica pode ser uma célula de soja e tanto (i) dois motivos RAVl são excluídos quanto (ii) um motivo RAVI e um motivo ERF são excluídos. Um motivo ERF, um motivo RAVI, ou tanto um motivo ERF quanto um motivo RAVl podem ser excluídos usando TALENS ou CRlSPR/Cas9.

[009] Um método de produção de uma planta com teor proteico elevado também é provido. O método compreende cruzamento de uma planta obtida em conformidade com o método acima com uma segunda planta para produzir plantas progenitoras e seleção de plantas progenitoras com teor proteico elevado. O método pode compreender ainda cruzamento de plantas progenitoras selecionadas com a segunda planta para produzir plantas progenitoras de retrocruzamento, seleção de uma primeira planta progenitora de retrocruzamento que possui teor proteico elevado para produzir planta progenitora selecionadas de retrocruzamento, e repetição de cruzamento e seleção três ou mais vezes para produzir uma planta progenitora de retrocruzamento que possui teor proteico elevado.

[0010] Uma célula, coleção de células, tecido, órgão ou organismo no qual o gene NF-YC4 compreende um promotor compreendendo um local de ligação de repressor de transcrição que foi modificado de modo que o repressor de transcrição não possa evitar a transcrição do NF-YC4 também é provido. A célula, coleção de células, tecido, órgão ou organismo possui um teor proteico elevado em comparação a uma célula, coleção de células, tecido, órgão ou organismo correspondente no qual o gene NF-YC4 compreende um promotor compreendendo uma ligação de repressor de transcrição que não foi modificado. Em uma realização, o organismo pode ser uma planta ou um híbrido desta. Uma semente da planta ou híbrido desta mencionada acima também é provida. Em outra realização, o organismo pode ser um animal não humano, como animais de pecuária, por exemplo, gado, porco, frangos, perus, ovelhas e bisão.

[0011] Também é provido um método de aumento de resistência a um patógeno ou um parasita em uma célula da planta ou planta, que compreende um gene NF-YC4, que compreende um promotor compreendendo um local de ligação de repressor de transcrição. O método compreende modificação do local de ligação de repressor de transcrição do promotor do gene NF-YC4 em uma célula da planta ou uma planta em risco de infecção com um patógeno ou um parasita, de modo que um repressor de transcrição não possa evitar a transcrição do gene NF-YC4. A resistência ao patógeno ou ao parasite é elevada na célula da planta ou planta; assim, o método pode compreender ainda seleção para aumento de resistência a um patógeno ou um parasita. O método pode compreender ainda introdução na planta ou célula da planta e expressão nesta de um polinucleotídeo que compreende sequência de nucleotídeo que codifica um polipeptídeo Qua-Quine Starch (QQS) tendo a sequência de aminoácido conforme estabelecido na SEQ ID No 16, em que a sequência de nucleotídeo é operavelmente ligada a um promotor. O método pode compreender ainda regeneração de uma planta ou parte desta a partir da célula da planta. O local de ligação de repressor de transcrição pode compreender um motivo ERF, um motivo RAVI, ou tanto um motivo ERF quanto um motivo RAVI. A célula da planta ou planta pode ser uma célula de arroz ou uma planta de arroz e (i) dois motivos ERFs são excluídos, (ii) um motivo RAFl é excluído, ou (iii) um motivo RAVl e um motivo ERF são excluídos. A célula da planta ou planta pode ser uma célula de soja ou uma planta de soja e tanto (i) dois motivos RAVls são excluídos quanto (ii) um motivo RAVl e um motivo ERF são excluídos. Um motivo ERF, um motivo RAVI, ou tanto um motivo ERF quanto um motivo RAVl podem ser excluídos ao usar TALENS ou CRISPR/Cas9. O patógeno pode ser uma bactéria ou um vírus. O parasita pode ser um afídeo. A planta pode ser uma planta de cultivo, como soja. A planta pode ser uma dicotiledônea.

[0012] Ainda é provido adicionalmente um método de produção de uma planta com resistência elevada a um patógeno ou um parasita. O método compreende cruzamento de uma planta obtida em conformidade com o descrito acima com uma segunda planta para produzir plantas progenitoras e seleção de plantas progenitoras com resistência elevada ao patógeno ou parasita da planta. O método pode compreender ainda cruzamento das plantas progenitoras selecionadas com a segunda planta para produzir plantas progenitoras de retrocruzamentos, seleção de uma primeira planta progenitora de retrocruzamento que possui resistência elevada a um patógeno ou um parasita para produzir plantas progenitoras selecionadas de retrocruzamento, e repetição de cruzamento e seleção três ou mais vezes para produzir uma planta progenitora de retrocruzamento que possui resistência elevada a um patógeno ou um parasita.

[0013] Ainda é provida adicionalmente uma planta, a qual possui resistência elevada a um patógeno ou parasita. A planta compreende um gene NF-YC4 compreendendo um promotor que compreende um local de ligação de repressor de transcrição. O local de ligação de repressor de transcrição foi modificado, de modo que o repressor de transcrição não possa evitar a transcrição do NF-YC4. Em uma realização da planta, cujo tipo selvagem não compreende e expressa QQS, um polinucleotídeo compreendendo uma sequência de nucleotídeo que codifica um polipeptídeo QQS tendo a sequência de aminoácido conforme estabelecido na SEQ ID No 16 foi introduzido e expresso. A sequência de nucleotídeo é operacionalmente ligada a um promotor.

[0014] Uma semente da planta mencionada acima também é provida, uma vez que é um híbrido da planta. Uma semente da planta híbrida também é provida.

Breve Descrição dos Desenhos

[0015] A Fig. 1A é um mapa de um vetor que expressa QQS.

[0016] A Fig. 1B é um mapa de um vetor que expressa NF-YC4 de Arabidopsis.

[0017] A Fig. 1C é um mapa de um vetor que expressa NF-YC4 de soja.

[0018] A Fig. 1D é um mapa de um vetor que expressa NF-YC4 de arroz.

[0019] A Fig. 1E é um mapa de um vetor que expressa NF-YC4 de milho.

[0020] As Figs. 2A, 2B, 2C, 2D, 2E e 2F mostram sequências que são relevantes à presente revelação da seguinte forma:

[0021] Uma região do promotor do gene NF-YC4 de Oryza sativa (Os03gl4669) é mostrada como SEQ ID No 1, na qual um motivo RAVl (reverso) é mostrado em negrito, um motivo RAVl (reverso) e motivo ERF (dianteiro) são mostrados em negrito sublinhado, e motivos ERFs (reverso) são mostradoss em negrito itálico.

[0022] Uma região do promotor do gene NF-YC4 de Oryza sativa na qual um motivo RAVl (reverso) (TGTTG; vide negrito na SEQ ID No 1) foi excluído é mostrada como SEQ ID No 2, na qual o motivo RAVl (reverso) e motivo ERF (dianteiro) é mostrado em negrito sublinhado e motivos ERFs (reversos) são mostradoss em negrito itálico.

[0023] Uma região do promotor do gene NF-YC4 de Oryza sativa na qual as sequências de sobreposição de um motivo RAVl (reverso) e um motivo ERF (dianteiro) (TGTTGACT; vide negrito sublinhado na SEQ ID No 1) foram excluídas é mostrada como SEQ ID No 3, na qual um motivo RAVl (reverso) é mostrado em negrito, e motivos ERFs (reverso) são mostradoss em negrito itálico.

[0024] Uma região do promotor do gene NF-YC4 de Oryza sativa na qual um segmento 111 contendo dois motivos ERFs (reversos) (AGTCATCACTGTTCTA TGTTCTATCTGCATTTTCCTTGATTTTGTACTTTTCCTGAACGA AAGGACAATCCTTAGCCATCATAATGCTATGATCGACTTATT CTGAAGTCA [SEQ ID No 5]; vide dois motivos ERFs em negrito itálico na SEQ ID No 1 e sequência de intervenção) foi excluído é mostrado como SEQ ID No 4, na qual um motivo RAVl (reverso) é mostrado me negrito, e um motivo RAVl (reverso) e motivo ERF (dianteiro) é mostrado em negrito sublinhado.

[0025] Uma região do promotor do gene NF-YC4 de Oryza sativa na qual um segmento 190 bp contendo dois motivos ERFs (reversos), um motivo RAVl (reverso) e motivo ERF (dianteiro), e sequências de intervenção (AACGAAAACAGCTTGTTGACTGGCTCCCTAGAGCTTTTTGT AAGTTGATCATCGAAGTAGCTAGTTCTCTTCACTTATATCAG TATCACTGTTCTATGTTCTATCTGCATTTTCCTTGATTTTGTA CTTTTCCTGAACGAAAGGACAATCCTTAGCCATCATAATGCTA TGATCGACTTATTCTGAAGTCA [SEQ ID No 7]; vide dois motivos ERFs (reversos) em itálico negrito, motivo RAVl (reverso) e motivo ERF (dianteiro) em negrito sublinhado, e sequências de intervenção na SEQ ID No 1) foram excluídos é mostrado como SEQ ID No 6, na qual um motivo RAVl (reverso) é mostrado em negrito.

[0026] Uma região do promotor do gene NF-YC4 de Glycine max (Glyma06g 17780) é mostrada como SEQ ID No 8, na qual os motivos ERFs (reversos) são mostrados em negrito itálico, motivos RAVls (reverso) são mostradoss em negrito, e um motivo RAVl (dianteiro) é mostrado em negrito sublinhado.

[0027] Uma região do promotor do gene NF-YC4 de Glycine max na qual um motivo ERF (reverso), um motivo RAVl (dianteiro) e a sequência de intervenção (AGTCACATGCCACAACA[SEQ ID No 10]; vide negrito em itálico e negrito sublinhado na SEQ ID No 8) foram excluídos é mostrada como SEQ ID No 9, na qual um motivo ERF (reverso) é mostrado em negrito itálico e os motivos RAVls (reversos) são mostrados em negrito.

[0028] Uma região do promotor do gene NF-YC4 de Glycine max na qual um motivo ERF (reverso), um motivo RAVl (reverso) e a sequência de intervenção (GGTCAGTTTTTGTTAACATTAATTTTTAGGATTATTTGTTG [SEQ ID No 12]; vide negrito itálico e negrito na SEQ ID No 8) foram excluídos é mostrado como SEQ ID No 11, na qual um motivo ERF (reverso) é mostrado em negrito itálico, motivos RAVls (reversos) são mostradoss em negrito, e um motivo RAVl (dianteiro) é mostrado em negrito sublinhado.

[0029] Uma região do promotor do gene NF-YC4 de Glycine max na qual dois motivos RAVls e a sequência de intervenção (TGTTGGTAATGTAAAAAAAATTAAAAGAAACAAGATTAAATTAC GTATTTAATAATTTAAGATTAATGTTG [SEQ ID No 14]; vide negrito na SEQ ID No 8) foram excluídos é mostrada como SEQ ID No 13, na qual os motivos ERFs (reversos) são mostrados em negrito itálico, um motivo RAVl (reverso) é mostrado em negrito, e um motivo RAVl (dianteiro) é mostrado em negrito sublinhado.

[0030] A sequência de nucleotídeo do cDNA de Qua-Quine Starch (QQS) de Arabidopsis thaliana é mostrada como SEQ ID No 15.

[0031] A sequência de aminoácidos da proteína QQS de Arabidopsis thaliana é mostrada como SEQ ID No 16.

[0032] Uma sequência de nucleotídeo do NF-YC4 de Glycine max entre o motivo RAVl-A e motivo de caixa W tendo a sequência GGTCAGTTTTTGTTAACATTAATTTTTAGGAT é mostrada como SEQ ID No 17.

[0033] O guia dianteiro GmNF-YC4Fd: 5'- CCTCCCAGGCATGGCAGTCC-3' é mostrado como SEQ ID No 18.

[0034] O guia reverso GmNF-YC4Rev: 5'- CCATCAAGGCTCCGCTGG-3' é mostrado como SEQ ID No 19.

[0035] Uma região do promotor do gene NF-YC4 de Zea mays é mostrada como SEQ ID No 20, na qual dois motivos RAVls (dianteiros) são mostrados em negrito.

[0036] A Fig. 3 é uma árvore filogenética dos genes NF-YC das espécies evolutivamente diversas de eucariotas.

[0037] A Fig. 4A é um gráfico de barras das linhagens de elite da soja que expressam QQS e seus respectivos imãos segregantes vs. proteína da semente na geração F3 (%/g de peso fresco com 13% de umidade). O aumento percentual na proteína da semente em comparação ao respective controle equivalente segregante é indicado na parte superior da barra mutante a=equivalente segregante com ausência de gene QQS dos transformantes QQS-E Williams 82; b=transformantes QQS-E Williams 82; c=controle equivalente segregante com ausência do gene QQS dos cruzamentos de linhagens de elite IA ou Williams 82 e QQS-E Williams 82; d=mutantes QQS-E dos cruzamentos de linhagens de elite IA e QQS-E Williams 82. O teste t de Student foi utilizado para comparar QQS-E e os controles. **P<0,01.

[0038] A Fig. 4B é um gráfico de barras de linhagens de elite de soja que expressam QQS e seus respectivos controles equivalente segregante vs. óleo da semente na geração F3 (%/g de peso fresco com 13% de umidade). a=equivalente segregante com ausência de gene QQS dos transformantes QQS-E Williams 82; b=transformantes QQS-E Williams 82; c=controles equivalente segregante com ausência de gene QQS dos cruzamentos de linhagens de elite IA ou Williams 82 e QQS-E Williams 82; d=mutantes QQS-E dos cruzamentos de linhagens de elite IA ou Williams 82 e QQS-E Williams 82. O teste t de Student foi utilizado para comparar QQS-E e os controles. *P<0,05. **P<0,01.

[0039] A Fig. 4C é um gráfico de barras das linhagens de elite de soja que expressam QQS e seus respectivos controles equivalente segregante vs. fibra da semente na geração F3 (%/g de peso fresco com 13% de umidade). a=equivalente segregante com ausência de gene QQS dos transformantes QQS-E Williams 82; b=transformantes QQS-E Williams 82; c=controles equivalentes segregantes com ausência de gene QQS dos cruzamentos das linhas de elite IA ou Williams 82 e QQS-E Williams 82; d=mutantes QQS-E dos cruzamentos das linhagens de elite IA ou Williams 82 e QQS-E Williams 82. O teste t de Student foi utilizado para comparar QQS-E e controles. *P<0,05. *P<0,01.

[0040] A Fig. 5A é um gráfico de barras de arroz (cultivar Kitakke) que expressa QQS (QQS-E) e seu equivalente do tipo selvagem (equivalente) vs. proteína da folha (%/peso seco). Todos os dados mostram média ± SE [desvio padrão], n=3. O teste t de Student foi utilizado para comparar QQS-E e controles. **P<0,01.

[0041] A Fig. 5B é um gráfico de barras de arroz (cultivar Kitakke) que expressa QQS (QQS-E) e seu equivalente do tipo selvagem (equivalente) vs. proteína da semente (%/peso seco). Todos os dados mostram média ± SE, n=3. O teste t de Student foi utilizado para comparar QQS-E e controles. **P<0,01.

[0042] A Fig. 6 é um gráfico de barras de vetores vazios de vítima + isca (BK+AD), QQS-vítica + vator vazio de isca (BK+QQS), AtNF- YC4-isca + vetor vazio de vítima (AtNF-YC4+AD), e AtNF-YC4-isca + QQS-vítima (AtNF-YC4+QQS) mais expressão relativa a gene relator. *P<0,05. **P<0,01.

[0043] A Fig. 7A é um gráfico de barras de Arabidopsis com superexpressão de NF-YC4 (AtNF-YC4-OE) e Arabidopsis do tipo selvagem (WT) vs. amido da folha leaf (mg/g de peso fresco). Todos os dados no gráfico de barras mostram média ± SE, n=3. O teste t de Student foi usado para comparer a composição de amido no WT e linhagens AtNF-YC4-OE. *P<0,05.

[0044] A Fig. 7B é um gráfico de barras de Arabidopsis com superexpressão de NF-YC4 (AtNF-YC4-OE) e Arabidopsis do tipo selvagem (WT) vs. proteína da folha (mg/g de peso seco). Todos os dados no gráfico de barras mostram média ± SE, n=3. O teste t de Student foi usado para comparer a composição proteica no WT e linhagens AtNF-YC4-OE. **P<0,01.

[0045] A Fig. 8 é um gráfico da atividade de LUC (luciferase) do tabaco, na qual o motive repressor de transcrição na região do promotor de NF-YC4 de soja foi excluído (pSoy-LUC DELl, pSoy- LUC DEL2, e pSoy-LUC DEL3), vs. atividade LUC relativa em comparação ao controle (pSoy-LUCFull). Os dados representam media ± SEM, n=3. O teste t de Student foi udado para comparar a atividade LUC acionada pelos promotores com exclusões e o promotor de comprimento total. *P<0,05. As barras de erro indicam os erros padrão.

[0046] A Fig. 9 é um gráfico da atividade LUC do tabaco, na qual o motivo repressor de transcrição na região do promotor do arroz NF-YC4 foi excluído (OsNF-YC4prol, Os-NF-YC4pro2 e Os-NF- YC4pro3), vs. atividade relativa de luciferase (LUC) activity em comparação ao controle (OsNF-YC4proFull). Os dados representam média ± SEM, n=3. O teste t de Student foi usado para comparar a atividade LUC acionada pelos promotores com exclusões e o promotor de comprimento total. *P<0,05. As barras de erro indicam os erros padrão.

[0047] A Fig. 10A é um gráfico de mutante vs. controles para o número de focos médios average por 10 plantas de Arabidopsis (± erro padrão em 120 horas após inoculação de vírus (hai)). O teste t de Student foi usado para comparar o número de focos no controle e mutantes de QQS ou NF-YC4. *P<0,05. **P<0,01. ***P<0,001.

[0048] A Fig. 10B é um gráfico de mutante vs. controles para tamanho de foco médio (mm2 (± erro padrão em 120 hai após inoculação de vírus (n = 40))). O teste t de Student foi usado para comparar o número de focos no controle e mutantes QQS ou NF- YC4. ***P<0,001.

[0049] A Fig. 11 é um gráfico do Dia 0 (0 dpi) e Dia 4 (4 dpi) após inoculação em plantas Arabidopsis para Pst DC3000 e ?CEL vs. número de bactérias (log10 (UFC/cm2)). As barras de erro indicam os erros padrão. O teste t de Student foi usado para comparar o número bacteriano no controle e mutantes QQS ou NF-YC4. **P<0,01. ***P<0,001.

[0050] A Fig. 12A é um gráfico da linhagem de soja por número de bactérias (UFC * 104/cm2). As barras de erro indicam os erros padrão. O test t de Student foi usado para comparar o número bacteriano no controle e mutantes QQS-E ou NF-YC4-OE. **P<0,01. (EV = vetor vazio)

[0051] A Fig. 12B é um gráfico da linhagem de soja NF-YC4-OE par nível de expressão relativa. As barras de erro indicam os erros padrão. **P<0,01. (EV = vetor vazio)

[0052] A Fig. 13 é um gráfico do genótipo de soja QQS-E 16-6 (linhagem de expressão 16-6 de QQS6), QQS-E 32-6 (linhagem de expressão 32-6 de QQS), controle, NF-YC4-OE Ll (linhagem de superexpressão 1 de NF-YC4), e NF-YC4-OE L2 (linhagem de superexpressão 2 de NF-YC4) vs. número médio de afídeos por planta. As barras de erro indicam os erros padrão. O test t de Student foi usado para comparar o número de afídeo no controle e mutantes QQS-E ou NF-YC4-OE. *P<0,05. **P<0,01. (EV = vetor vazio)

[0053] A Fig. 14A é um gráfico do evento de transformação (1, 2, 3 e 4; cada número indica um evento de transformação diferente) de NF-YC4 de superexpressão de soja transformada (NF-YC4- OE) vs. teor proteico em comparação ao equivalente controle. As barras de erro indicam os erros padrão. O test t de Student foi usado para comparar o teor proteico nos mutantes NF-YC4-OE e controles equivalentes. *P<0,05. **P<0,01.

[0054] A Fig. 14B é um gráfico de evento de transformação (1, 2, 3 e 4; cada número indica um evento de transformação diferente) de NF-YC4 que superexpressa a soja transformada (NF-YC4-OE) vs. teor de óleo em comparação ao controle equivalente. As barras de erro indicam os erros padrão. O test t de Student foi usado para comparar o teor de óleo nos mutantes NF-YC4-OE e controles equivalentes. *P<0,05.

[0055] A Fig. 14C é um gráfico de evento de transformação (1, 2, 3 e 4; cada número indica um evento de transformação diferente) de NF-YC4 de superexpressão de soja transformada (NF-YC4-OE) vs. teor proteico + de óleo em comparação ao controle equivalente. As barras de erro indicam os erros padrão. O test t de Student foi usado para comparar o teor proteico+de óleo nos mutantes NF-YC4-OE e controles equivalentes. *P<0,05. **P<0,01.

[0056] A Fig. 14D é um gráfico de evento de transformação (1, 2, 3 e 4; cada número indica um evento de transformação diferente) de NF-YC4 de superexpressão de soja transformada (NF-YC4-OE) vs. fibra de semente (% por peso fresco com 13% de umidade) em comparação ao controle equivalente. As barras de erro indicam os erros padrão. O test t de Student foi usado para comparar teor de fibra nos mutantes NF-YC4-OE e controles equivalentes. **P<0,01.

[0057] A Fig. 14E é um gráfico de evento de transformação (1, 2, 3 e 4; cada número indica um evento de transformação diferente) de NF-YC4 de superexpressão de soja transformada (NF-YC4-OE) vs. peso de semente por planta (gramas por planta) em comparação ao controle equivalente. As barras de erro indicam os erros padrão. O test t de Student foi usado para comparar o peso de semente por planta nos mutantes NF-YC4-OE e controles equivalentes.

[0058] A Fig. 15A é um gráfico de NF-YC4 de Arabidopsis de superexpressão de milho transformado (AtNF-YC4-OE) vs. proteína do grão (% por peso seco) em comparação ao controle equivalente. As barras de erro indicam os erros padrão. O test t de Student foi usado para comparar o teor proteico nos mutantes NF-YC4-OE e controles equivalentes. **P<0,01.

[0059] A Fig. 15B é um gráfico de NF-YC4 de Arabidopsis com superexpressão de milho transformado (AtNF-YC4-OE) vs. óleo de grão (% por peso seco) em comparação ao controle equivalente. As barras de erro indicam os erros padrão. O test t de Student foi usado para comparar o teor de óleo nos mutantes NF-YC4-OE e controles equivalentes.

[0060] A Fig. 15C é um gráfico de NF-YC4 de Arabidopsiscom superexpressão de milho transformado (AtNF-YC4-0E) vs. amido de grão (% por peso seco) em comparação ao controle equivalente. As barras de erro indicam os erros padrão. O test t de Student foi usado para comparar o teor de maido nos mutantes NF-YC4-0E e controles equivalentes. **P<0,01.

[0061] A Fig. 16A é um gráfico de NF-YC4 de arroz com superexpressão de arroz transformado (OsNF-YC4- l-OE) vs. amido da semente (mg por g de peso seco) em comparação ao tipo selvagem. As barras de erro indicam os erros padrão. O test t de Student foi usado para comparar o teor de maido da semente nos mutantes NF-YC4-0E e controles. **P<0,01.

[0062] A Fig. 16B é um gráfico de NF-YC4 de arroz com superexpressão de arroz transformado (OsNF-YC4-1-0E) vs. proteína da semente (mg por g de peso seco) em comparação ao tipo selvagem. As barras de erro indicam os erros padrão. O test t de Student foi usado para comparar o teor proteico da semente nos mutantes NF-YC4-0E e controles. **P<0,01.

Descrição Detalhada da Invenção

[0063] A presente revelação baseia-se, pelo menos em parte, na descoberta de um gene com o qual o QQS interage. O gene é um regulador de transcrição conhecido como NF-YC4. O gene é conservado nas species eucarióticas, estando presente em diversas espécies de planta desde Arabidopsis até espécies de cultivo básico, por exemplo, soja, arroz e milho. A superexpressão de NF-YC4 em Arabidopsis imita a superexpressão de QQS; o teor proteico é elevado o teor de carboidrato é reduzido. Assim, a presente revelação prove materiais e métodos para manipulação de um gene, como NF-YC, em particular NF-YC4 (os nomes alternativos incluem, entre outros, MLE2.10, MLE2_10 e fator nuclear Y, subunidade C), que interage com QQS (mencionado aqui como "genes de interação"). Nas realizações, a manipulação do gene resulta em teor proteico elevado e/ou teor de carboidrato reduzido e/ou aumento de resistência a um patógeno ou um parasita. A manipulalão do gene pode envolver mutação, como por meio de uma exclusão (ou uma inserção, uma substituição, uma inversão e similares) de um local de ligação de repressor de transcrição que compreende um motivo de ligação do repressor de transcrição (ou mais de um local/motivo, caso mais de um esteja presente, caso no qual eles podem ser mutados de forma igual ou diferente). O local de ligação de repressor de transcrição pode ser manipulado, como por meio de mutação, por exemplo, por meio de uma exclusão, de um ou mais motivos de ligação do repressor de transcrição nele presentes. "Modificação", "modificar", "modificando" e "modificado" podem ser aqui utilizados para descrever tais manipulações.

[0064] NF-YC é parte do complexo de fator de transcrição de NF- Y. NF-Y é compreendido de três subunidades, a saber, NF-YA, NF- YB e NF-YC. Cada uma das três subunidades compreende uma região que foi evolutivamente conservada. A região conservada encontra-se no terminal C da subunidade NF-YA, no terminal N da subunidade NF-YC e localizado centralmente na subunidade NF-YB. As subunidades NF-YA e NF-YC possuem regiões ricas em glutamina, que contêm uma função de domínio de ativação e mostram algum grau de conservação. NF-Y mostrou conter dois domínios de ativação de transcrição - um na subunidade NF-YA e outro na subunidade NF-YC. Um motivo de dobra de histona (HFM) de aproximadamente 65 aminoácidos de comprimento está presente nas subunidades NF-YB e NF-YC. As subunidades NF-YB e NF-YC formam um dímero estreito, que então se associa à subunidade NF- YA. O trímero resultante pode se ligar ao DNA.

[0065] Os fatores de transcrição de planta incluem uma superfamília mencionada como AP2/ERF. A superfamília AP2/ERF é definida pelo domínio AP2/ERF, que consiste de aproximadamente 60 a 70 aminoácidos e está envolvido na ligação ao DNA. A superfamília compreende três famílias - a família AP2, a família ERF e a família RAV. A família de proteínas AP2 contém dois domínios AP2/ERF repetidos, a família de proteínas ERF contém um único domínio AP2/ERF, e a família de proteínas RAV contém um único domínio AP2/ERF e um domínio B3, que é um domínio de ligação ao DNA que é conservado em outros fatores de transcrição específicos das plantas. As informações adicionais estão disponíveis no website de Base de Dados de Fator de Transcrição de Plantas (Plant TFDB).

[0066] Um exemplo de um motivo de ligação de repressor de transcrição encontrado na região do promotor de NF-YC4 é aquele que está ligado por RAVl. A sequência de um motivo RAVl é CAACA. RAVl liga-se como um monôero a um alvo bipartido de um motivo que possui uma CAACA e um motivo que possui uma CACCTG. Os dois motivos podem ser separados por 2 a 8 nucleotídeos e podem ser orientados diferentemente um em relação ao outro (Kagaya et al., Nucleic Acids Res. 27: 470-478 (1999)). Conforme indicado acima, RAVl é um fator de transcrição contendo domínio AP2/ERF único e B3. Os nomes alternativos incluem, entre outros, Atlgl3260, EDF4, fator de ligação ao DNA de resposta a etileno 4, RAVI de fator de transcrição de resposta a etileno, proteína relacionada a ABI3/VP1 1, relacionada a ABI3NP1 1, T6J4_2 e T6J4.2. As informações adicionais estão disponíveis no website iHOP (informação de hiperligação sobre proteínas) e no website Plant TFDB. RAVl possui as seguintes designações: UniProt Q9ZWM9, 1WID de estrutura PDB, gene NCBI de 837886, NCBI RefSeq NP_172784, NCBI RefSeq NM_101197, NCBI UniGene 837886, adesão de NCBI Nos BAA34250 e AAG09554. Os homólogos de RAVl incluem AT3G25730 (Arabidopsis thaliana), TEMl (Arabidopsis thaliana), RAV2 (Arabidopsis thaliana), Os0lg0693400 (Orzya sativa Grupo Japonica) e Os05g0549800 (Orzya sativa Grupo Japonica). Todas as informações anteriores de sequência/estrutura disponíveis do UniProt, PDB e NCBI são especificamente incorporadas pelo presente por referência.

[0067] Outro exemplo de um motivo de ligação de repressor de transcrição encontrado na região do promotor de NF-YC4 é aquele que está ligado por ERF (fator de resposta a etileno), mais especificamente um motivo de "caixa W" (por exemplo, encontrado no promotor do gene ERF3; pode ser mencionado aqui como motivo ERF). Uma sequência de um motivo de caixa W é TGACY, em que Y = C ou T). Conforme indicado acima, ERF é um fator de transcrição que contém domínio AP2/ERF único. As informações adicionais estão disponíveis no website Plant TFDB. Para uma discussão da análise ampla de genoma da família do gene ERF em Arabidopsis e arroz, vide Nakano et al., Plant Physiol. 140(2): 411-432 (2006), o qual é pelo presente incorporado por referência por seus ensinamentos em relação ao mesmo.

[0068] Portanto, em vista do exposto acima, a presente revelação prove um método de aumento do teor proteico em uma célula eucariótica que compreende um gene NF-YC4. O gene NF- YC4 compreende um promotor compreendendo um local de ligação de repressor de transcrição. Um método de produção de uma planta com teor proteico elevado também é provido. Além disso, é provido um método de aumento de resistência a tensão, como um teste abiótico (por exemplo, sal, estiagem, poluição) ou um teste biótico, como um patógeno ou um parasita, em uma célula da planta ou uma planta, em particular uma planta em risco de infecção com um patógeno ou um parasita. A planta compreende um gene NF-YC4, que compreende um promotor compreendendo um local de ligação de repressor de transcrição. Ainda é provido adicionalmente um método de produção de uma planta com aumento de resistência a um patógeno ou um parasita.

[0069] Os métodos acima compreendem manipulação ou modificação do local de ligação de repressor de transcrição, ao que o repressor de transcrição não pode evitar a transcrição do NF-YC4. O local de ligação de repressor de transcrição pode compreender, consistir essencialmente de ou consiste de um motivo ERF e/ou um motivo RAVl, tanto um quanto ambos podem ser manipulados ou modificados, como excluídos, como excluídos ao usar TALENS ou CRlSPR/Cas9. Quando dois ou mais motivos são manipulados ou modificados, eles podem ser manipulados ou modificados de forma igual ou diferente. O método não engloba a substituição de todo o promotor por outro promotor, como um promotor constitutivo.

[0070] O gene NF-YC4 pode ser qualquer gene NF-YC4 eucariótico, como um gene NF-YC4 de um animal, um gene NF-YC4 de um fungo, um gene NF-YC4 de uma alga ou um gene NF-YC4 de uma planta. Os exemplos de genes NF-YC4 incluem, entre outros, aqueles presentes em Brassica napus (CDS está disponível como Adesão ao GenBank No KC797143.I), Medicago truncatula(CDS está disponível como Adesão ao GenBank No JQ918296.I), Arabidopsis thaliana (ID do Gene 836466; TAlR AT5G63470 (AT5G63470.1 e AT5G63470.2); a sequência genômica está disponível como NC_003076.8 (25415701.25417117, complemento), CDS está disponível como Adesão ao GenBank Nos NM_l25742.5 e NM_001037053.1)), Glycine max (Glyma06gl 7780 e Glyma04g37291), Oryza sativa (Os3gl4669, Os02g07450 e Os06g45640), e Zea mays (GrmZm2g089812). Outro gene também foi identificado em Chlamydomonas reinhardtii (Crel2.g556400; Crel2.g556400.tl.3). Em uma realização do método, a região de codificação do gene NF-YC4 não é manipulada ou modificada. Em outra realização do método, a região de codificação do gene NF-YC4 é manipulada ou modificada, como manipulada ou modifica (por exemplo, inserção, exclusão, substituição, inversão ou truncamento no terminal N ou C) para aumentar mais o teor proteico.

[0071] Outros genes NF-YC4 (inclusive homólogos, ortólogos e parólogos) podem ser identificados pelos métodos conhecidos na técnica. Por exemplo, os genes podem ser identificados por meio de pesquisa às bases de dados para domínios conservados que compartilham identificação de sequência de aminoácidos com os genes NF-YC4 aqui identificados. A degeneração do código genetic permite que a sequência de nucleotídeos altamente variável seja traduzida em proteínas que possuem sequências de aminoácidos altamente similares, e até idênticas. Os programas, como MEGALIGN (DNAStar, Inc., Madison, WI), podem criar alinhamentos entre duas ou mais sequências de acordo com os diferentes métodos, por exemplo, análise de clustal (Higgin et al., Gene 73: 237-244 (1988)). Outros algoritmos e programas de alinhamento incluem PASTA, BLAST e ENTREZ (NCBI; Altschul et al., J. Mol. Evol. 36: 290-300 (1993); Altschul et al., J. Mol. Biol. 215: 403-410 (1990)). Vide também o programa GCG (Patente Norte-americana No 6.262.333) e demais técnicas para alinhamento descritas por Doolittle, Métodos em Enzimologia 266, "Computer Methods for Macromolecular Sequence Analysis," Academic Press, Inc., San Diego, CA (1996). O algoritmo de Smith-Waterman permite lacunas nos alinhamentos de sequência; o algoritmo pode ser realizado usando um computador MASPAR e um software MPSRCH. O programa GAP que usa o método de alinhamento de Needleman e Wunsch também pode ser usado para alinhas sequências. De forma adicional ou alternativa, os perfis de transcrição após superexpressão ou de eliminação de dois ou mais fatores de transcrição relacionados podem ser comparados. Os métodos manuais também podem ser usados para identificar regiões de similaridade e domínios conservados e podem envolver a comparação de estrutura terciária. Uma vez identificados, estes genes podem ser clonados em conformidade com os métodos conhecidos na técnica.

[0072] Também podem ser identificados outros genes NF-YC4 por hibridação em condições rigorosas ou altamente rigorosas. A severidade é influenciada por uma variedade de fatores, como temperatura, concentração e composição de sal, aditivos orgânicos e inorgânicos, solventes, etc., nas soluções de hibridação e de lavagem (vide, por exemplo, Sambrook et al., supra; Nucleic Acid Hybridization: A Practical Approach, Hames and Higgins, eds., IRL Press, Washington, DC (1985)). Teste de hibridação, como Southern blot, Northern blot, hibridação de solução, e similares, pode ser usado (vide, por exemplo, Sambrook et al., supra).

[0073] Em relação às sequências aqui descritas, a porcentagem de identificação de sequência pode variar de aproximadamente 55% a 100%. Dado que o gene NF-YC4 é altamente conservado em uma ampla gama de eucariotas, a porcentagem de identificação de sequência, particularmente no nível de aminoácidos, pode variar de aproximadamente 60% a 100%, como aproximadamente 65% a 100%, aproximadamente 70% a 100%, aproximadamente 75% a 100%, aproximadamente 80% a 100%, aproximadamente 85% a 100%, aproximadamente 90% a 100%, ou aproximadamente 95% a 100%, como aproximadamente 96%, aproximadamente 97%, aproximadamente 98% ou aproximadamente 99%.

[0074] A região do NF-YC4 a ser manipulada ou modificada é a região do promotor. Mais especificamente, um local de ligação de repressor de transcrição ao qual as ligações do repressor de transcrição são manipuladas ou modificada, como por meio de mutação, especificamente exclusão (ou inserção, substituição, inversão ou similares), para evitar a inibição de ligação de um repressor de transcrição ao local de ligação, modificando assim a composição bioquímica de uma eucariótica, como uma planta. Em particular, um motivo de local de ligação de repressor de transcrição é manipulado ou modificado. Por exemplo, a composição de produtos de armazenamento, como proteínas, carboidratos e lipídios, pode ser modificada. Mais especificamente, o teor proteico pode ser elevado e/ou o teor de carboidrato pode ser reduzido.

[0075] A região do promotor do gene NF-YC4 de Oryza sativa (Os03gl4669) é mostrada como SEQ ID No 1 (vide Fig. 2A). Um motivo RAVl (reverso) é mostrado em negrito, ao passo que um motivo RAVl (reverso) e ERF (dianteiro) são mostradoss em negrito sublinhado, e os motivos ERFs (reversos) são mostrados em negrito itálico.

[0076] Uma região do promotor do gene NF-YC4 de Oryza sativa na qual um motivo RAVl (reverso) (TGTTG; vide negrito na SEQ ID No: 1) foi excluído é mostrada como SEQ ID No: 2 (vide Fig. 2A). Um motivo RAVl (reverso) e ERF (dianteiro) são mostradoss em negrito sublinhado, ao passo que os motivos ERFs (reversos) são mostradoss em negrito itálico.

[0077] Uma região do promotor do gene the NF-YC4 de Oryza sativa na qual as sequências de sobreposição de um motivo RAVl (reverso) e um motivo ERF (dianteiro) (TGTTGACT; vide negrito sublinhado na SEQ ID No: 1) que foram excluídos é mostrada como SEQ ID No: 3 (vide Fig. 2B). Um motivo RAVl (reverso) é mostrado em negrito, ao passo que os motivos ERFs (reverso) são mostradoss em negrito itálico.

[0078] Uma região do promotor do gene NF-YC4 de Oryza sativa na qual um segmento 111 bp contendo dois motivos ERFs (reverso) (AGTCATCACTGTTCTATGTTCTATCTGCATTTTCCTTGATTTTG TACTTTTCCTGAACGAAAGGACAATCCTTAGCCATCATAATG CTATGATCGACTTATTCTGAAGTCA [SEQ ID No: 5; vide dois ERFs em negrito itálico na SEQ ID No: 1 e sequência de intervenção) que foram excluídos é mostrada como SEQ ID No: 4 (vide Fig. 2B). Um motivo RAVl (reverso) é mostrado em negrito, a um motivo RAVl (reverso) e ERF (dianteiro) é mostrado em negrito sublinhado.

[0079] Uma região do promotor do gene NF-YC4 de Oryza sativa na qual um segmento 190 bp contendo dois motivos ERFs (reverso), um motivo RAVl (reverso) e ERF (dianteiro), e sequências de intervenção (AACGAAAACAGCTTGTTGACTGGCTCCCTAGAGCTTTTTGTAA GTTGATCATCGAAGTAGCTAGTTCTCTTCACTTATCAGTCATCA CTGTTCTATGTTCTATCTGCATTTTCCTTGATTTTGTACTTTTCC TGAACGAAAGGACAATCCTTAGCCATCATAATGCTATGATCGA CTTATTCTGAAGTCA [SEQ ID No: 7]; vide dois motivos ERFs (reversos) em negrito itálico, motivo RAVl (reverso) e ERF (dianteiro) em negrito sublinhado, e sequências de intervenção na SEQ ID No: 1) que foram excluídos é mostrada como SEQ ID No: 6 (vide Fig. 2C). Um motivo RAVl (reverso) é mostrado em negrito.

[0080] Em realizações dos métodos que envolvem uma célula de arroz ou uma planta de arroz, (i) dois motivos ERFs podem ser excluídos, (ii) um motivo RAFl pode ser excluído ou (iii) um motivo RAVl e um motivo ERF podem ser excluídos.

[0081] A região do promotor do gene NF-YC4 de Glycine max (Glyma06g 17780) é mostrada como SEQ ID No: 8 (vide Fig. 2C). Os motivos ERFs (reversos) são mostradoss em negrito itálico, motivos RAVls (reversos) são mostrados em negrito e um motivo RAVl (dianteiro) é mostrado em negrito sublinhado.

[0082] Uma região do promotor do gene NF-YC4 de Glycine max na qual um motivo ERF (reverso), um motivo RAVl (dianteiro), e a sequência de intervenção (AGTCACATGCCACAACA[SEQ ID No: 10]; vide negrito itálico e negrito sublinhado na SEQ ID No: 8) que foram excluídos é mostrada como SEQ ID No: 9 (vide Fig. 2D). Um motivo ERF (reverso) é mostrado em negrito itálico, e os motivos RAVls (reversos) são mostradoss em negrito.

[0083] Uma região do promotor do gene NF-YC4 de Glycine max na qual um motivo ERF (reverso), um motivo RAVl (reverso), e a sequência de intervenção (GGTCAGTTTTTGTTAACATTAATTTTTAGGATTATTTGTTG [SEQ ID No: 12]; vide negrito itálico e negrito na SEQ ID No: 8) que foram excluídos é mostrada como SEQ ID No: 11 (vide Fig. 2D). Um motivo ERF (reverso) é mostrado em negrito itálico, os motivos RAVls (reversos) são mostradoss em negrito e um motivo RAVl (dianteiro) é mostrado em negrito sublinhado.

[0084] Uma região do promotor do gene NF-YC4 de Glycine max na qual dois motivos RAVls e a sequência de intervenção (TGTTGGTAATGTAAAAAAAATTAAAAGAAACAAGATTAAATTAC GTATTTAATAATTTAAGATTAATGTTG [SEQ ID No: 14]; vide negrito na SEQ ID No: 8) que foram excluídos é mostrada como SEQ ID No: 13 (vide Fig. 2E). Os motivos ERFs (reversos) são mostradoss em negrito itálico, um motivo RAVl (reverso) é mostrado em negrito e um motivo RAVl (dianteiro) é mostrado em negrito sublinhado.

[0085] Em realizações dos métodos que envolvem uma célula de soja ou uma planta de soja, (i) dois motivos RAVls podem ser excluídos ou (ii) um motivo RAVl e um motivo ERF podem ser excluídos. A região do promotor do gene NF-YC4 de Zea mays é mostrada como SEQ ID No: 20. Dois motivos RAVls (dianteiros) são mostrados em negrito. Em realizações dos métodos que envolvem uma célula de milho ou uma planta de milho, tanto um quanto ambos os motivos RAVls podem ser excluídos.

[0086] A região pode ser modificada por qualquer metodologia adequada conhecida na técnica. Por exemplo, mutagênese direcionada ou específica ao local, evolução direcionada otimizada, mutagênese de saturação do local do gene (GSSM), reconstituição da ligação sintética (SLR), PCR propensa a erros, embaralhamento, mutagênese direcionada ao oligonucleotídeo, constituição de PCR, mutagênese de PCR sexual, mutagênese in vivo, mutagênese de cassete, mutagênese de conjunto recorrente, mutagênese de conjunto exponencial, reconstituição de gene, recombinação de SLR, recombinação de sequência recorrente, mutagênese de DNA modificado de fosforotioato, mutagênese de modelo contendo uracil, mutagênese de lacuna dupla, mutagênese de reparo de incompatibilidade de ponto, mutagênese de cepa hospedeira deficiente de reparo, mutagênese química, mutagênese radiogênica, mutagênese de exclusão, mutagênese de seleção de restrição, mutagênese de purificação de restrição, síntese de gene artificial, mutagênese de conjunto, criação de multímeros de ácido nucleico quimérico, ou outras técnicas de mutagênese direcionadas, como engenharia genômica com meganucleases, transposões, recombinases, cortadores químicos de DNA, e nucleases programáveis similares a nucleases de dedo de zinco (ZFNs), nucleases efetoras similares a ativador de transcrição (TALENs), nucleases projetadas orientadas por RNA (RGENs), e sistema imunológico adaptativo de repetição palidrômica regularmente de intervalo curto agregada bacteriana tipo II (CRlSPR)-Cas (associado a CRlSPR). A engenharia genômica com ZFNs (protein de dedo de zinco (ZFP) no terminal amino e Fok I ou outro domínio de nuclease no terminal carboxil), TALENs (efetor similar ao ativador de transcrição (TALE) no terminal amino e Fok l ou outro domínio de nuclease no terminal carboxil), RGENs, e o sistema CRlSPR-Cas possibilita as modificações genéticas direcionadas em células cultivadas, plantas e animais por lavagem de DNA cromossômico de forma específica ao local, que aciona os sistemas endógenos de reparo de DNA que resultam em modificação genômica direcionada. Para uma revisão, vide Kim et al., Nature Reviews (Genetics) 15: 321-334 (May 2014), o qual é pelo presente incorporado por referência por seus ensinamentos quanto ao mesmo. Vide também referências 178 a 180 aqui mencionadas (e incorporadas por referência) para o uso de nucleases projetadas para melhorar geneticamente as plantações e referências 32 e 168 nele mencionadas (e incorporadas por referência) para o uso de nucleases projetadas para enriquecer a pecuária com determinados nutrientes ou torná-los resistente a doenças.

[0087] Os efeitos fora do alvo de RGENs e outras nucleases podem ser minimizados ou evitados. Por exemplo, a escolha de um único local alvo que não possui sequências altamente homólogas em outro lugar no genoma é importante. Estes locais podem ser identificados por meio da pesquisa usando um algoritmo de computador para TALENs. Além disso, os programas baseados na webestão disponíveis para TALENs e RGENs, conforme mencionado aqui abaixo. Também é importante otimizar níveis de expressão de nuclease para RGENs. O uso RNAs de guia modificado com duas guaninas adicionais no terminal 5' ou sgRNAs truncados reduz as mutações fora do alvo. O uso de proteínas recombinantes sobre plasmídeos para introduzir nucleases programáveis reduz mutações fora do alvo devido à rápida degradação das proteínas recombinantes nas células. Finalmente, as enzimas de corte de DNA ("nickases") que introduzem rupturas de linha única no DNA podem minimizar as mutações fora do alvo.

[0088] Em uma realização, TALENs são usados (vide, por exemplo, Pedido de norte-americana, publicação No 2011/0201118, o qual é pelo presente incorporado por referência em sua totalidade, particularmente página 50, linha 14 até página 58, llinha 4, página 64, linha 2 até página 66, linha 29, e figures 1 a 3 e 10 a 16; vide também Patente Norte-americana No 8.586.363, a qual é pelo presente incorporada por referência em sua totalidade; vide também Publicação de Pedido de Patente Norte-americana No 2014/335618, o qual é pelo presente incorporado por referência em sua totalidade; vide também Pedido de Patente norte-americano, publicação No 2014/335592, o qual é pelo presente incorporado por referência em sua totalidade; vide também Pedido de Patente Norte-americana No 2013/0122581 e Patente Norte-americana No 8.697.853, ambos os quais são pelo presente incorporados por referência em sua totalidade; vide também Pedido de Patente norte-americano, publicação No 2012/214228 e Patente Norte-americana No 8.450.471, ambos os quais são pelo presente incorporados por referência em sua totalidade; vide também Publicação de Pedido de Patente Norte-americana No 2012/178169 e Patente Norte- americana No 8.440.432, ambos os quais são pelo presente incorporados por referência em sua totalidade; vide também Publicação de Pedido de Patente Norte-americana No 2012/178131 e Patente Norte-americana No 8.440.431, ambos os quais são pelo presente incorporados por referência em sua totalidade; vide também Pedido de Patente norte-americano, publicação No 2011/0301073 e Patente Norte-americana No 8586526, ambos os quais são pelo presente incorporados por referência em sua totalidade; Publicação de Pedido de Patente Norte-americana No 2014/087426, o qual é pelo presente incorporado por referência em sua totalidade; vide também Publicação de Pedido de Patente Norte- americana No 2014/0073015 e Patente Norte-americana No 8.748.134, ambas as quais são pelo presente incorporadas por referência em sua totalidade). Uma vez que TALENs pode ser projetado para direcionar quase qualquer determinada sequência de DNA, TALENs oferecem uma vantage crucial sobre os demais tipos de nucleases, embora a escolha de uma sequência alvo com uma timina na extremiade 5' seja recomendada já que está evitando uma sequência alvo com uma citosina metilada ou substituindo a repetição de RVD de His-Asp, que reconhece citosinas, com uma repetição de RVD Asn-Gli, que reconhece timina e receonhecerá uma citosina metilada. O efetor TAL pode ser qualquer efeitor TAL adequado. Por exemplo, um efetor TAL de ocorrência natural (ou seja, um efetor TAL do tipo selvagem ou um efetor TAL mutante de ocorrência natural) ou um efetor TAL fabricado pelo homem (por exemplo, um efetor TAL mutado de ocorrência natural ou um efeito TAL sintético) pode ser usado. Um exemplo de um efetor TAL é AvrXa7 de bactérias Xanthomonas spp. ou bactérias Ralstonia spp. (vide, por exemplo, Publicação de Pedido de Patente Internacional No WO 2013/101877, o qual é pelo presente incorporado por referência em sua totalidade). A endonuclease divide ambos os filamentos de DNA e permite modificação da sequência de DNA no local da divisão. O tamanho do constructo é de ~3 kb x 2. O comprimento de determinação de especificidade do local alvo é de aproximadamente 30 bp a aproximadamente 40 bp. Desejavelmente, o local alvo inicia com uma timina e termina com uma adenina. Recursos online, como E-TALEN, recursos de engenharia de genoma, aloritmo de pontuação para previsão de atividade TALE(N), Projetor de TALEN ToolGen, e software Direcionador ZiFiT podem ser usados para projetar TALENs; vide também o recurso de biblioteca Addgene e TALEN. TALENs podem ser obtidos de fornecedores comerciais, como Cellectis Bioresearch, Life Technologies, ToolGen, e Transposagen Biopharmaceuticals.

[0089] Assim, em uma realização, a presente revelação prove um método de aumento do teor proteico em uma célula eucariótica que compreende um gene NF-YC4, que compreende um promotor compreendendo um local de ligação de repressor de transcrição. O método compreende modificação do local de ligação do repressor de transcrição no gene NF-YC4, de modo que o repressor de transcrição não possa evitar a transcrição do gene NF-YC4. O método compreende a introdução de um primeiro monômero de endonuclease de efetor similar a ativador de transcrição (TAL) e um segundo monômero de endonuclease de efetor TAL na célula. Os monômeros podem ser introduzidos na célula por qualquer método adequado, como por transfecção da célula com uma codificação de ácido nucleico do primeiro ou segundo monômero e/ou injeção mecânica do primeiro ou segundo monômero na célula como uma proteína. Quando entregue como uma protein, pode-se fazer uso do sistema de secreção bacteriana tipo III ou eletroporação. Cada monomer de endonuclease do efetor TAL compreende um domínio de endonuclease, como um domínio de endonuclease não específico, por exemplo, um domínio de endonuclease Fok I, e um domínio de efetor TAL que compreende uma pluralidade de sequências de repetição de efetor TAL. A pluralidade das sequências de repetição de efetor TAL (por exemplo, 15 ou mais repetições de ligação de DNA, como repetições de ligação de DNA, cada uma das quais compreende um resíduo di-variável (RVD) que determina o reconhecimento de um par de base na região do promotor de NF-YC4 e é responsável pelo reconhecimento de um par de base na região do promotor de NF-YC4) do primeiro monômero de endonuclease de efetor TAL, em combinação, que se liga a uma primeira sequência de nucleotídeo específica na região do promotor do gene NF-YC4. A pluralidade das sequências de repetição do efetor TAL (por exemplo, 15 ou mais repetições de ligação a mais DNA, como repetições de ligação a DNA, cada uma das quais compreende um RVD que determina o reconhecimento de um par de base na região do promotor de NF-YC4 e é responsável pelo reconhecimento um par de base na região do promotor de NF- YC4) do segundo monômero de endonuclease do efetor TAL, em combinação, que se liga a uma segunda sequência de nucleotídeo específica na região do promotor do gene NF-YC4. A primeira sequência de nucleotídeo específica e a segunda sequência de nucleotídeo específica são diferentes e são separadas por uma sequência espaçadora, como uma sequência espaçadora que é de aproximadamente 12 a 30 nucleotídeos de comprimento, por exemplo, 18 nucleotídeos. A primeira sequência de nucleotídeo específica e a segunda sequência de nucleotídeo específica são selecionadas para atingir a modificação, como por exclusão, de um local de ligação do repressor de transcrição na região do promotor do gene NF-YC4. O local de ligação do repressor de transcrição pode compreender um motivo ERF ou um motivo RAVl; quanto a isto, dois ou mais motivos ERFs, dois ou mais motivos RAVls, ou uma combinação de motivo ERF e motivos RAVls pode ser modificada, como por exclusão. O domínio de endonuclease do primeiro monômero de endonuclease do efetor TAL e o domínio de endonuclease do segundo monômero de endonuclease de efeitor TAL foram um dímero que divide a sequência de DNA alvo dentro da célula ou progenitora desta quando o domínio de efetor TAL do primeiro monômero de endonuclease do efetor TAL é ligado à primeira sequência de nucleotídeo específica e ao domínio do efetor TAL do segundo monômero de endonuclease do efetor TAL é ligado à segunda sequência de nucleotídeo específica. O método pode compreener ainda provisão à célula de um ácido nucleic que compreende uma sequência homóloga para pelo menos uma porção da sequência de DNA alvo, de modo que a recombinação homóloga ocorre entre a sequência de DNA alvo e o ácido nucleico. O teor proteico na célula eucariótica é elevado e, assim, o método pode compreender ainda a seleção de teor proteico elevado.

[0090] A célula eucariótica pode ser parte de uma coleção de células, um tecido, um órgão ou um organismo. Quando uma célula ou uma coleção de células ou progenitora desta, o método pode compreender ainda a geração de um tecido, órgão ou organismo geneticamente modificado desta. O organismo pode ser uma planta, como uma planta de cultivo, como soja, arroz ou milho, uma monocotiledônea, uma dicotiledônea, uma alga, como um flagelado unicelular, como uma espécie de Chlamydomonas. Em realizações, o organismo é soja, arroz ou milho. As plantas podem ser cruzadas e retrocruzadas e selecionadas quanto ao teor proteico elevado em conformidade com os métodos conhecidos na técnica e aqui descritos.

[0091] Em outra realização, a presente revelação prove um método de aumento de resistência a um patógeno ou parasita em uma célula da planta que compreende um gene NF-YC4, que compreende um local de ligação de repressor de transcrição. O patógeno pode ser uma bactéria, um vírus, um fungo ou uma semente de planta e em que o parasite é um inseto, um plasmodioforido, um ácaro, ou um nemátodo, cujos todos os exemplos são conhecidos na técnica e aqui descritos. Em realizações, o patógeno é uma bactéria ou um vírus, e o parasita é um afídeo. O método compreende a modificação do local de ligação de repressor de transcrição no gene NF-YC4, de modo que o repressor de transcrição não pode evitar a transcrição do gene NF-YC4. O método compreende a introdução de um primeiro monômero de endonuclease do efetor similar ao ativador de transcrição (TAL) e um monômero de endonuclease do efetor TAL na célula. Os monômeros podem ser introduzidos na célula por qualquer método adequado, como por transfecção da célula com um ácido nucleico que codifica o primeiro e o segundo monômero e/ou injeção mecânica do primeiro ou segundo monômero na célula como uma proteína. Quando fornecida como proteína, pode-se fazer uso do sistema de secreção bacteriana tipo III ou eletroporação. Cada monômero de endonuclease do efetor TAL compreende um domínio de endonuclease, como um domínio de endonuclease não específico, por exemplo, um domínio de endonuclease Fok I, e um domínio de efetor TAL compreendendo uma pluralidade de sequências de repetição de efetor TAL. A pluralidade de sequências de repetição de efetor TAL (por exemplo, 15 ou mais repetições de ligação ao DNA, como repetições de lligação ao DNA, cada uma da qual compreende uma repetição de resíduo divariável (RVD) que determina o reconhecimento de um par de base na região do promotor de NF-YC4 e é responsável por reconhecer um par de base na região do promotor de NF-YC4) do primeiro monômero de endonuclease do efetor TAL, em combinação, liga-se a uma primeira sequência de nucleotídeo específica na região do promotor do gene NF-YC4. A pluralidade de sequências de repetição do efetor TAL (por exemplo, 15 ou mais repetições de ligação ao DNA, como repetições de ligação ao DNA, cada uma da qual compreende um RVD que determina o reconhecimento de um par de base no na região do promotor de NF-YC4 e é responsável por reconhecer um par de base na região do promotor NF-YC4) do segundo monômero de endonuclease do efetor TAL, em combinação, liga-se a uma segunda sequência de nucleotídeo específica na região do promotor do gene NF-YC4. A primeira sequência de nucleotídeo específica e a segunda sequência de nucleotídeo específica são diferentes e são separadas por uma sequência espaçadora, como uma sequência espaçadora que é de aproximadamente 12 a 30 nucleotídeos de comprimento, por exemplo, 18 nucleotídeos. A primeira sequência de nucleotídeo específica e a segunda sequência de nucleotídeo específica são selecionadas para atingir a modificação, como por exclusão, de um local de ligação do repressor de transcrição na região do promotor do gene NF-YC4. O local de ligação do repressor de transcrição pode compreender um motivo ERF ou um motivo RAVl; quanto a isto, dois ou mais motivos ERFs, dois ou mais motivos RAVls, ou uma combinação de motivo ERF e motivos RAVls podem ser modificados, como por exclusão. O domínio de endonuclease do primeiro monômero de endonuclease do efetor TAL e o domínio de endonuclease do segundo monômero de endonuclease do efetor TAL formam dímero que divide a sequência de DNA alvo na célula ou progenitora desta quando o domínio do efetor TAL do primeiro monômero de endonuclease do efetor TAL é ligado à primeira sequência de nucleotídeo específica e o domínio do efetor TAL do segundo monômero de endonuclease do efetor TAL é ligado à segunda sequência de nucleotídeo específica. O método pode compreender ainda provisão à célula da planta de um ácido nucleico que compreende uma sequência homóloga para pelo menos uma porção da sequência de DNA alvo, de modo que a recombinação homóloga ocorra entre a sequência de DNA alvo e o ácido nucleico. A resistência a um patógeno ou parasite na célula da planta é elevada e, assim, o método pode compreender ainda a seleção da resistência elevada a um patógeno ou parasita.

[0092] O método pode compreender ainda a introdução na célula da planta e expressão nela de um polinucleotídeo que compreende uma sequência de nucleotídeo que codifica o polipetídeo de Qua- Quine Starch (QQS) tendo a sequência de aminoácidos conforme estabelecido na SEQ ID No: 16, em que a sequência de nucleotídeo é opeavelmente ligada a um promotor.

[0093] A célula da planta pode ser parte de uma coleção de células, um tecido, um órgão ou um organismo. Quando uma célula ou uma coleção de células ou progenitora desta, o método pode compreender ainda a geração de um tecido, órgão ou planta nela geneticamente modificados. A plants pode ser uma planta de cultivo, como soja, arroz ou milho, uma monocotiledônea ou uma dicotiledônea. Plantas podem ser cruzadas e retrocruzadas e selecionadas para aumentar a resistência a um patógeno ou parasita em conformidade com os métodos conhecidos na técnica e aqui descritos.

[0094] Em outra realização, o sistema CRISPR-Cas é utilizado. O crRNA específico ao alvo e crRNA de transativação independente do alvo (tracrRNA) são intricados com a proteína 9 associada a CRISPR (Cas9) para formar uma endonuclease de DNA ativo, ou seja, duploRNA-Cas9. A endonuclease divide uma sequência de DNA alvo de 23 bp que é composta da sequência guia de 20 bp no crRNA e o motivo adjacente proto-espaçador (PAM; 5'-NGG-3' ou 5'- NAG-3'). Qualquer Cas9 adequada pode ser usada, como a Cas9 do Streptococcus pyogenes. Como CRISPR-Cas/RGENs são simples de projetar e preparar, CRISPR/Cas oferece uma vantagem crucial sobre TALENs, embora os locais alvo RGEN sejam limitados pela exigência da sequência PAM, que é reconhecida pela Cas9 (ou seja, 5'-X20NGG-3' ou 5'-X20NAG-3', onde X20 corresponde à sequência de crRNA de 20 bp), e tanto a presença de uma 5'guanina na sequência alvo quanto a adição de uma ou duas bases guanina nas extremidades 5' do RNAs guia é recomendado. O tamanho do constructo normalmente é em torno de 4,2 kb (Cas9 do S. pyogenes) + 0,1 kb (sgRNA). O comprimento determinante de especificidade do local alvo normalmente é de 22 bp (para um comprimento total de 23 bp). Desejavelmente, o local alvo termina com um NGG ou NAG (ou seja, PAM, conforme indicado acima). Os recursos online, como ECRISP, recursos de engenharia Genome, ferramentas RGEN e software ZiFiT Targeter podem ser usados; vide também Addgene. Os componentes do sistema CRlSPR/Cas podem ser obtidos de fornecedores comerciais, como Life Technologies, Sigma-Aldrich, System Biosciences, ToolGen e Transposagen Biopharmaceuticals.

[0095] Assim, em outra realização, a presente revelação prove um método de aumento do teor proteico em uma célula eucariótica que compreende um gene NF-YC4, o qual compreende um promotor compreendendo um local de ligação de repressor de transcrição. O método compreende a modificação do local de ligação de repressor de transcrição no gene NF-YC4, de modo que o repressor de transcrição não possa evitar a transcrição do gene NF-YC4. O método compreende a introdução de um duploRNA-Cas9, ou seja, uma endonuclease de DNA ativo formada pela complexação de um crRNA específico ao alvo e um crRNA de transativação independente de alo (tracrRNA) com proteína 9 associada a CRlSPR (Cas9), na célula. A endonuclease divide uma sequência de DNA alvo de 23 bp (vide, por exemplo, SEQ ID Nos: 6 e 7 e Exemplo 18 aqui) que é composta da sequência guia de 20 bp no crRNA e o motivo adjacente proto-espaçador (PAM; 5'-NGG-3' ou 5'-NAG-3'). Qualquer Cas9 adequada pode ser usada, como a Cas9 do Streptococcus pyogenes. Os calos embriônicos de plantas podem ser transformados por meio das linhagens de gene mediadas por Agrobacterium. As linhagens transgênicas primárias podem ser triadas quando a alterações de DNA específicas ao local e identificadas, e a genotipagem por PCR pode ser usada para identificar mutantes com sequências excluídas. O teor proteico na célula eucariótica é elevado e, assim, o método pode compreender ainda a seleção de teor proteico elevado.

[0096] A célula eucariótica pode ser parte de uma coleção de células, um tecido, um órgão ou um organismo. Quando uma célula ou uma coleção de células ou progenitora desta, o método pode compreender ainda a geração de um tecido, órgão ou organismo geneticamente modificado deste. O organismo pode ser uma planta, como uma planta de cultivo, como soja, arroz, ou milho, uma monocotiledônea, uma dicotiledônea ou uma alga, como um flagelo unicelular, como uma espécie de Chlamydomonas. Em realizações, o organismo é soja arroz ou mlho. As plantas podem ser cruzadas e retrocruzadas e selecionadas quanto ao teor proteico elevado em conformidade com os métodos conhecidos na técnica e aqui descritos.

[0097] Em outra realização, a presente revelação prove um método de aumento de resistência a um patógeno ou parasita em uma célula da planta que compreende um gene NF-YC4, o qual compreende um promotor compreendendo um local de ligação de repressor de transcrição. O patógeno pode ser uma bactéria, um vírus, um fungo ou uma semente de planta e em que o parasita é um inseto, um plasmodioforido, um ácaro ou um nemátodo, cujos todos os exemplos são conhecidos na técnica e aqui descritos. Em realizações, o patógeno é uma bactéria ou um vírus, e o parasita é um afídeo. O método compreende a modificação do local de ligação de repressor de transcrição no gene NF-YC4, de modo que o repressor de transcrição não possa evitar a transcrição do gene NF-YC4. O método compreende a introdução de uma duplaRNA- Cas9, ou seja, uma endonuclease de DNA ativo formada pela complexação de um crRNA específico ao alvo e um crRNA de transativação independente de alvo (tracrRNA) com proteína 9 associada a CRISPR (Cas9), na célula. A endonuclease divide uma sequência de DNA alvo de 23bp que é composta da sequência guia de 20 bp no crRNA e no motivo adjacente protoespaçador (PAM; 5'- NGG-3' ou 5'-NAG-3'). Qualquer Cas9 adequada pode ser usada, como a Cas9 de Streptococcus pyogenes. A resistência a um patógeno ou parasite na célula da planta é elevada e, assim, o método pode compreender ainda a seleção quanto à resistência elevada a um patógeno ou parasita.

[0098] O método pode compreender ainda a introdução na célula da planta ou planta e expressão nela de um polinucleotídeo que compreende uma sequência de nucleotídeo que codifica o polipeptídeo de Qua-Quine Starch (QQS) tendo a sequência de aminoácidos conforme estabelecido na SEQ ID No: 16, em que a sequência de nucleotídeo é operavelmente ligada a um promotor.

[0099] A célula da planta pode ser parte de uma coleção de células, um tecido, um órgão ou um organismo. Quando uma célula ou uma coleção de células ou progenitora desta, o método pode compreender ainda a geração de um tecido, órgão ou planta disto geneticamente modificado. A planta pode ser uma planta de cultivo, como soja, arroz ou milho, uma monocotiledônea ou uma dicotiledônea. As plantas podem ser cruzadas e retrocruzadas e selecionadas quanto à resistência elevada a um patógeno ou parasita de acordo com os métodos conhecidos na técnica e aqui descritos.

[00100] Os modelos de nucleases e/ou homólogos programáveis, como vetores de direcionamento ou oligodeoxinucleotídeos de cadeia única (ssODNs), são fornecidos nas células alvo usando qualquer método adequado, conforme conhecido na técnica. Estes métodos incluem, por exemplo, fornecimento de DNA plasmídeo, mRNA transcrito in vitro, vetores virais ou proteínas purificadas nas células, embriões ou todos os organismos cultivaddos. As nucleases programáveis frequentemente são introduzidas nas linhagens celulares por eletroporação ou transfecção de lipossoma do DNA plasmídeo. O mRNA transcrito in vitro frequentemente é microinjetado nos embriões de uma célula. Os vetores virais não integrantes, como vetores letiviral deficient de integrase (IDLVs), adenovírus e virus associados ao adeno (AAVs) podem ser usados in vitro e in vivo, embora os IDLVs possam ser incompatíveis com TALENs devido à presença de repetições de TALENS altamente homólogas, que podem levar a eventos de recombinação indesejados. O uso de proteínas evita a incorporação indesejada de DNA estranho e evita preocupações sobre a otimização de códão e escolha de promotores e, como a purificação de novo de Cas9 não é necessária ao constructo de uma nova nuclease, pode ser conveniente para RGENs.

[00101] A translocação de proteínas de fusão de domínio de divisão TAL em uma membrana celular pode ser facilitada pelo uso de sequências de peptídeos, como a terceira hélice de Antennapedia (Prochiantz, Curr. Opi. Neurobiol. 6: 629-634 (1996); Derossi et al., J. Biol. Chem. 269: 10444 (1994)), ou o domínio hidrofóbico de peptídeos sinal, como o peptídeo sinal K-FGF (Lin et al., J. Biol. Chem. 270: 14255-14258 (1995)). Os demais peptídeos incluem um peptide de 11 aminoácidos da proteína tat do HIV, uma sequência de peptídeo de 20 resíduos que corresponde aos aminoácidos 84 a 103 da proteíona p16 (Fahracus et al., Curr. Biol. 6: 84 (1996)), o domínio de translocação VP22 de HSV (Elliot et al., Cell 88: 223-233 (1997)), e toxinas binárias (Arora et al., J. Biol. Chem. 268: 33343341 (1993); Perelle et al., Infect. Immun. 61: 5147-5156 (1993); Stennark et al., J. Célula Biol. 113: 1025-1032 (1991); Donnelly et al., PNAS USA 90: 3530-3534 (1993); Carbonetti et al., Abstr. Ann. Meet. Am. Soe. Microbial. 95: 295 (1995); Sebo et al., Infect. Immun. 63: 3851-3857 (1995); Klimpel et al., PNAS USA 89: 10277-10281 (1992); and Novak et al., J. Biol. Chem. 267: 17186- 17193 (1992)). As sequências de peptide podem ser fundidas com proteínas de fusão de divisão TAL. Opcionalmente, um ligador, como ligador de peptídeo, pode ser usado.

[00102] O método de aumento de resistência a um patógeno ou um parasita em uma célula da planta ou uma planta em risco de infecção com o patógeno ou parasita pode compreender ainda a introdução na planta e expressão nela de um polinucleotídeo que compreende uma sequência de nucleotídeo que codifica um polipeptídeo Qua-Quine Starch (QQS) (SEQ ID No: 16). A sequência de nucleotídeo é operavelmente ligada a um promotor. Assim, emu ma realização, o método compreende ainda (a) transformação das células da planta com um polinucleotídeo que compreende uma sequência de nucleotídeo que codifica o polipeptídeo QQS tendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID No: 16, em que a sequência de nucleotídeo é operavelmente ligada a um promotor, (b) regeneração de plantas transgênicas a partir das células da planta transformada, e (c) identificação e seleção de uma planta transformada a partir das plantas transgênicas que apresentam aumento de resistência a um patógeno ou parasita em comparação a uma planta não transformada da mesma espécie que não possui QQS e cresce em condições similares.

[00103] QQS pode ser expresso na planta usando qualquer método adequado conforme é conhecido na técnica (vide, por exemplo, Patente Norte-americana No 9.157.091, emitida em 13 de outubro de 2015, e que é pelo presente incorporada por referência por seus ensinamentos quanto a isso; vide, por exemplo, Exemplos 1 e 2 aqui e a descrição detalhada, cujas partes foram reproduzidas neste parágrafo e nos dois parágrafos seguintes para facilitar a referência). Por exemplo, QQS pode ser introduzido na planta como um transgene usando eletroporação, bombardeamento de microprojétil, transformação mediada por Agrobacterium (como exemplificado nos Exemplos 1 e 2 da Patente Norte-americana No 9.157.091), e contato direto de protoplastas. A transformação/transfecção (bem como outras técnicas usadas para introduzir DNA em uma planta ou fungo) e regeneração de monocotiledôneas e dicotiledôneas é assunto de rotina. O método em particular empregado dependerá, em parte, do tipo de planta ou fungo a ser transformado/transfectado. Por exemplo, diversos protocolos são descritos nos Protocolos de Agrobacterium, 2a ed., Vols. 1 e 2, Métodos em Biologia Molecular, que foi editado por Kan Wang e publicado pela Humana Press, Totowa, New Jersey, e que é especificamente incorporada pelo presente por referência em sua totalidade. Estes protocolos incluem o método de transformação de gotejamento floral e métodos de transformação de explantes de folha, explantes de cotilédone, e explantes de raiz, bem como protocolos específicos para transformação de trevo de barril, tabaco, cevada, milho, arroz (índica e japônica), centeio, sorgo, trigo, canola, algodão, mostarda da Índia, girassol, alfalfa, grão de bico, trevo, ervilha, amendoim, guandu, trevo vermelho, soja, feijão tepari, taro, repolho, pepino, beringela, alface, tomate, cenoura, mandioca, batata, batata-doce, inhame, grama-bermudas, azevém perene, Panicum virgatum, festuca dos prados, gramíneas, olmo americano, sobreiro, árvore de eucalipto, pinheiro, choupo, seringueira, banana, citrinos, café, papaya, abacaxi, cana de açúcar, castanheiro americano, maça, mirtilo, videira, morango, noz, cravo, crisântemo, orquídeas, petúnia, rosa, ginseng, cânhamo, papoila de ópio e cogumelo. Os demais métodos de transformação mediada por Agrobacterium de cereais são descritos por Shrawat et al., Plant Biotech. J. 4(6): 575-603 (Nov. 2006), que é pelo presente especificamente incorporado por referência em sua totalidade. Outros métodos de transformação de legumes são descritos por Somers et al., Plant Physiol. 131(3): 892-899 (March 2003), que é pelo presente especificamente incorporado por referência em sua totalidade.

[00104] Os métodos úteis para a transformação de arzzo são descritos por Giri et al., Biotech. Adv. 18(8): 653-683 (Dec. 2000), e Hiei et al., Plant Mol. Biol. 35(1-2): 205-218 (Sept. 1997), ambos os quais são pelo presente especificamente incorporados por referência em sua totalidade. Vasil et al., Methods Molec. Biol. 111: 349-358 (1999), e Jones et al., Plant Method 1(1): 5 (Sept. 5, 2005), ambos os quais são pelo presente especificamente incorporados por referência em sua totalidade, descrevem métodos úteis para a transformação de trigo. O uso de captação direta de DNA em cevada foi descrito por Lazzeri, Methods Molec. Biol. 49: 95-106 (1996), que é pelo presente especificamente incorporado por referência em sua totalidade. O uso de imersão temporária em um sistema de biorretator para transformar morangos é descrito por Hanhineva et al., BMC Biotech. 7: 11 (2007), que é pelo presente especificamente incorporado por referência em sua totalidade. A introdução de transgenes em plastídeos, como cloroplastos, especificamente cloroplastos em tabaco, foi descrita por Daniell et al., Trends Biotech. 23(5): 238-245 (May 2005), que é pelo presente especificamente incorporado por referência em sua totalidade. Quanto a isto, Lutz et al., Plant Physiol. 145(4): 1201-1210 (2007) (pelo presente especificamente incorporado por referência em sua totalidade), prove orientação na selação de vetores para transformação do genoma plastídeo em plantas maiores. A embriogênese somatic de vetores de cloroplasto específicos à espécie também possui aplicação em plantas, como soja, cenoura e algodão, por exemplo. Outros métodos úteis para a transformação de beterrabas foram descritos por Golovko et al., Tsitol. Genet. 39(3): 30-36 (May-June 2005), que é pelo presente especificamente incorporado por referência em sua totalidade.

[00105] Uma sequência de nucleotídeo, que codifica a sequência de domínio de codificação (CDS) de QQS, pode ser incorporada em um vetor ou um cassete (coletivamente mencionado aqui como vetores) para expressão em uma planta. Diversso vetores de expressão adequados para a transformação estável de células da planta ou para estabelecimento das plantas transgênicas foram descritos (vide, por exemplo, Weissbach et al., Methods for Plant Molecular Biology, Academic Press, New York, NY (1989); and Gelvin et al., Plant Molecular Biology Manual, Kluwer Academic Publishers, Norwell, MA (1990)). O plasmídeo Ti da Agrobacterium tumefaciens ou um vetor de Agrobacterium binárias (Bevan, Nucl. Acids Res. 12: 8711-8721 (1984)) pode ser usado para transformar monocotiledôneas e dicotiledôneas. Vetores não Ti, como vetores virais, podem ser usados para transferir DNA nas células da planta, tecidos, embriões e plantas. Vetores não Ti podem ser introduzidos através do uso de transformação mediada por lipossomo, transformação mediada por polietileno glicol (PEG), transfecção viral, microinjeção, infiltração a vácuo, eletroporação e protoplastos de plantas, bombardeamento de microprojétil, bigodes de carboneto de silício, e similares. Vide, por exemplo, Ammirato et al., Handbook of Cell Plant Culture - Crop Species, MacMillan Pub. Co. (1984); Shimamoto et al., Nature 338: 274-276 (1989); Fromm et al., Bio/Technology 8: 833-839 (1990); e Vasil et al., Biol. Technology 8: 429-434 (1990).

[00106] Além de uma sequência de codificação, um vetor de transformação/transfecção de planta compreende uma ou mais sequências reguladora de transcrição 5' e 3'. As sequências reguladoras de transcrição podem incluir um promotor, um local de início de transcrição, um local de término de transcrição, um sinal de poliadenilação, e uma região de terminação 3' (por exemplo, região de terminação PI-II da batata, região de terminação octopine synthase 3' da síntese de octopina). Se um intrão processado conventional, nuclear está presente, um ou mais sinais de processamento de RNA, como locais de união de intrão, também podem ser incluídos. Qualquer promotor adequado pode ser usado. Quanto a isto, o promotor QQS pode ser usado. Alternativmente, um promotor não QQS pode ser usado. O promotor pode ser constituinte, sintético (por exemplo, híbrido), induzível, regulado por desenvolvimento, regulado por ambiente, regulado por hormônio, quimicamente regulado, específico à célula ou específico ao tecido (por exemplo, específico à semente), por exemplo. Promotores constituintes incluem o promotor do vírus do mosaico da couve-flor (CaMV) 35S, o promotor de sintase de nopalina e o promotor de sintase de octopina. Os promotores regulados por ambiente e induzíveis incluem promotores que são induzidos por claridade, por exemplo. O promotor de napin, o promoter de faseolina e o promoter de DC3 são exemplos de promotores esspecíficos à semente, ao passo que o promotor de dru1 promotor, o promotor 2A11 e o promotor de poligalacturonase de tomate são exemplos de promotores específicos aos frutos, e PTA29, PTA26 e PTA13 são exemplos de promotores específicos ao pólen. O promotor pBAN é um promotor de casca da semente em Arabidopsis, ao passo que p26, p63 e p63tr são promotores de semente precoces da Arabidopsis (vide, por exemplo, Publicação de Pedido de Patente Norte-americana No 2009/0031450). Os exemplos de promotores específicos à raiz são descritos na Patente Norte-americana No 5.618.988; 5.837.848; e 5.905.186. Os demais promotores são induzidos por auxina, citocinina, giberelina, jasmonato de metila, ácido salicílico, calor, claridade e similares.

[00107] A prático dos métodos emprega técnicas convencionais conhecidas na técnica e descritas na literatura e aqui. Vide, por exemplo, Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd and 3rd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY (1989 e 2001); Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York, NY (1987); Methods in Enzymology, Academic Press, San Diego, CA, in particular Vol. 34 "Chromatin"; Chromatin Structure and Function, 3rd ed., Academic Press, San Diego, CA (1998); e Methods in Molecular Biology, Humana Press, Totowa, NJ, in particular Vol. 119, "Chromatin Protocols."

[00108] Para técnicas convencionais usadas para introduzir constructos de DNA no genome de uma planta hospedeira vide, por exemplo, Weissbach & Weissbach, Methods for Plant Molecular Biology, Section VIII, pp. 421-463, Academic Press, Nova York, NY (1988), e Grierson & Corey, Plant Molecular Biology, 2nd ed., Blackie, Londres, Reino Unido (1988). Por exemplo, o constructo de DNA pode ser introduzido diretamente no DNA genômico de uma célula da planta usando técnicas, como eletroporacão e microinjeção de protoplastos de célula da planta, ou os contructos de DNA podem ser introduzidos diretamente ao tecido da planta usando métodos biolísticos, como bombardeamento de partículas de DNA (vide, por exemplo, Klein et al., Nature 327: 70-73 (1987)). Alternativamente, os constructos de DNA podem ser combinados com regiões de acompanhamento de T-DNA adequadas e introduzidas em um vetor hospedeiro de Agrobacterium tumefaciens convencional. As técnicas de transformação mediadas por Agrobacterium tumefaciens, inclusive desarmamento e o uso de vetores binários, são descritas na literatura (vide, por exemplo, Horsch et al., Science 233: 4967-498 (1984), e Fraley et al., PNAS USA 80: 4803 (1983)). As funções de virulência do hospedeiro de Agrobacterium tumefaciensdirecionará a inserção do constructo e marcador adjacente no DNA da célula da planta quando a célula é infectada pela bactéria usando vetor de T-DNA binário (Bevan, Nucleic Acid Research 12: 8711-8721 (1984)) ou o procedimento de co-cultura (Horsch et al., Science 227: 1229-1231 (1985)). Geralmente, o sistema de transformação da Agrobacterium é usado para projetar dicotiledôneas (Bevan et al., Ann. Rev. Genet. 16: 357-384 (1982); Rogers et al., Methods Enzymol. 118: 627-641 (1986)). O sistema de transformação da Agrobacterium também pode ser usado para transformar monocotiledôneas (Hernalsteen et al., EMBO J. 3: 30393041 (1984); Hooykass-Van Slogteren et al., Nature 311: 763-764 (1984); Grimsley et al., Nature 325: 1677-1679 (1987); Boulton et al., Plant Mol. Biol. 12: 31-40 (1989); e Gould et al., Plant Physiol. 95: 426-434 (1991)).

[00109] Os métodos alternatives de transferência e transformação de gene incluem, entre outros, transformação de protoplasta através captação mediada por cálcio, mediada por polietileno glicol (PEG) ou mediada por eletroporação de DNA nu (Paszkowski et al., EMBO J 3: 2717-2722 (1984); Potrykus et al., Molec. gen. Genet. 199: 169177 (1985); Fromm et al., PNAS USA 82: 5824-5828 (1985); e Shimamoto, Nature 338: 274-276 (1989)) e a eletroporação de tecidos da planta (D'Halluin et al., Plant Cell 4: 1495-1505 (1992)). Os métodos adicionais para transformação da célula da planta incluem microinjeção, captação de DNA mediada por carboneto de silício (Kaeppler et al., Plant Cell Reporter 9: 415-418 (1990)), e bombardeamento de microprojétil (Klein et al,. PNAS USA 85: 43054309 (1988); e Gordon-Kamm et al., Plant Cell 2: 603-618 (1990)).

[00110] Células transformadas (ou coleção de células, calo, tecido, órgão ou organismo, por exemplo, planta) podem ser identificadas e isoladas pela seleção ou triagem de células quanto a traços particular, como expressão de um gene marcador, teor proteico elevado, ou resistência elevada a um patógeno ou parasita. Tais metodologias de triagem e seleção são bem conhecidas na técnica. Além disso, os métodos físicos e bioquímicos podem ser usados para identificar transformantes. Estes incluem Southern blots, amplificação por PCR, Northern blots, proteção de Sl RNase, extensão primária, RT-PCR, testes enzimáticos, eletroforese de gel proteico, Western blots, imunoprecipitação, imunoensaio ligados à enzima, hibridação in situ, coloração de enzima e imunocoloração.

[00111] As células transformadas, como células da planta transformadas, podem ser cultivadas para regenerar a planta como um todo, a qual possui o genótipo transformado e, portanto, o fenótipo desejado. Estas técnicas de regeneração contam com a manipulação de determinados fitohormônios em um meio de crescimento de cultura tecidual, contando normalmente com um marcador biocida e/ou herbicida, que foram introduzidos com a sequência de nucleotídeos desejada (vide, por exemplo, Evans et al., "Protoplasts Isolation and Culture," in Handbook of Plant Cell Culture, pp. 124-176, Macmillian Publishing Co., New York, NY (1983); Binding, Regeneration of Plants, Plant Protoplasts, pp. 2173, CRC Press, Boca Raton, FL (1985); e Klee et al., Ann. Rev. Plant Phys. 38: 467-486 (1987)).

[00112] Um NF-YC4 com um promotoro manipulado ou modificado, desejavelmente aquele que aumenta a produção proteica ou a resistência a um patógeno ou um parasita, pode ser isolado e transferido para outra eucariota, como outra planta, que pode ser da mesma espécie, mesmo gênero, mas um espécie diferente, ou de uma família diferente ou outro nível de filogenia. Um NF-YC4 com um local de ligação de repressor de transcrição manipulado ou modificado pode ser introduzido em outra eucariota, como outra planta, usando técnicas de reprodução padrão e retrocruzamento. Por exemplo, uma planta que possui um NF-YC4 com um promotor manipulado ou modificado pode ser cruzada com uma planta que não possui o NF-YC4 com o promotor manipulado ou modificado, as gerações resultantes podem se cruzadas, e as plantas que apresentam produção proteica elevada ou resistência elevada a um patógeno ou um parasita podem ser selecionadas. Da mesma forma, quando uma planta, que possui um NF-YC4 com um promotor manipulado ou modificado, é cruzado com uma planta, que não possui um NF-YC4 com um promotor modificado ou possui um gene diferente com um promotor manipulado ou modificado, a semente híbrida pode ser colhida e plantada para obter plantas híbridas ou partes destas. Uma planta, que possui um NF-YC4 com um promotor manipulado ou modificado e que é passível a cultura tecidual, pode ser uma fonte de células para a cultura tecidual e regeneração de plantas usando métodos de cultura tecidual conhecidos na técnica. Técnicas similares de reprodução podem ser usadas para animais não humanos.

[00113] A célula eucariótica pode ser uma parte de uma coleção de células, um tecido, um órgão ou um organismo. Em uma realização, o organismo pode ser uma planta, como uma planta de cultivo, uma colheita de raízes ou uma colheita de horticultura. Os exemplos de uma planta de cultivo incluem soja, arroz, milho, trigo, milhero, cevada, alfalfa, tomate, maça, pera, morango, laranja, melancia, pimentão, cenoura, batata, beterraba, inhame, alface, espinafre, girassol e semente colza, um planta florífera, como petúnia, rosa e crisântemo, árvores coníferas e pinheiros (por exemplo, pino, abeto e abeto vermelho), uma planta usada em fitoremediação (por exemplo, plantas com acúmulo de metal pesado), e uma planta usada para fins experimentais (por exemplo, Arabidopsis). A planta pode ser uma monocotiledônea ou uma dicotiledônea. Os exemplos de monocotiledôneas incluem, entre outros, óleo de palma, cana de açúcar, banana, erva do Sudão, milho, trigo, centeio, cevada, aveia, arroz, milheto e sorgo. Os exemplos de dicotiledôneas incluem, entre outros, cártamo, alfalfa, soja, café, amaranto, colza, amendoim e girassol. As ordens de dicotiledôneas incluem Magniolales, Illiciales, Laurales, Piperales, Aristochiales, Nymphaeales, Ranunculales, Papeverales, Sarraceniaceae, Trochodendrales, Hamamelidales, Eucomiales, Leitneriales, Myricales, Fagales, Casuarinales, Caryophyllales, Batales, Polygonales, Plumbaginales, Dilleniales, Theales, Malvales, Urticales, Lecythidales, Violales, Salcicales, Capparales, Ericales, Diapensales, Ebenales, Primulales, Rosales, Fabales, Podostemales, Haloragales, Myrtales, Cornales, Proteales, San tales, Rafflesiales, Celastrales, Euphorbiales, Rhamnales, Sapindales, Juglandales, Geraniales, Polygalales, Umbellales, Gentianales, Polemoniales, Lamiales, Plantaginales, Scrophulariales, Camapnulales, Rubiales, Dipsacalese Asterales. Os gêneros de dicotiledôneas incluem Atropa, Alseodaphne, Anacardium, Arachis, Beilschmiedia, Brassica, Carthamus, Cocculus, Croton, Cucumis, Citrus, Citrullus, Capsicum, Catharanthus, Cocos, Coffea, Cucurbita, Daucus, Duguetia, Eschscholzia, Ficus, Fragaria, Galucium, Glycine, Gossypium, Helianthus, Hevea, Hyoscyamus, Lactuca, Landolphia, Linum, Litsea, Lycopersicon, Lupinus, Manihot, Majorana, Malus, Medicago, Nicotiana, Olea, Parthenium, Papaver, Persea, Phaseolus, Pistacia, Pisum, Pyrus, Prunus, Raphanus, Ricinus, Senecio, Sinomenium, Stephania, Sinapsis, Solanum, Theobroma, Trifolium, Trigonella, Vicia, Vinca, Vilis e Vigna. As ordens de monocotiledôneas incluem Alismatales, Hydrocharitales, Najadales, Triuridales, Commelinales, Eriocaulales, Restionales, Poales, Juncales, Cyperales, Typhales, Bromeliales, Zingiberales, Arecales, Cyclanthales, Pandanales, Arales, Lilliales e Orchid ales. Os gêneros de monocotiledôneas incluem Allium, Andropogon, Aragrostis, Asparagus, Avena, Cynodon, Elaeis, Festuca, Festulolium, Heterocallis, Hordeum, Lemna, Lolium, Musa, Oryza, Panicum, Pannesetum, Phleum, Poa, Secale, Sorghum, Triticum e Zea. As demais plantas incluem Gymnospermae, como as ordens Pinales, Ginkgoales, Cycadales e Gnetales, como os gêneros Abies, Cunninghamia, Picea, Pinus e Pseudotsuga, como abeto e pinheiro. Em outra realização, o organismo pode ser uma alga, como um flagelo unicelular, como uma espécie de Chlamydomonas. Ainda em outra realização, o organismo pode ser um animal não humano, como animais de pecuária, por exemplo, gado, porcos, frangos, perus, ovelhas e bisões.

[00114] O patógeno pode ser uma bactéria, um vírus, um fungo ou uma planta com semente. O parasita pode ser um inseto (como um afídeo), um plasmodioforido, um ácaro ou um nemátodo. Em realizações, o patógeno é uma bactéria ou um vírus, e o parasita é um afídeo.

[00115] A bactéria pode ser qualquer bacteria de planta. Os exemplos incluem, entre outros, um Firmicute, um Actinobactéria ou um Proteobactéria. A Proteobactéria pode ser uma Alfaproteobactéria, uma Betaproteobactéria ou uma Gamaproteobactéria. A Alfaproteobactéria pode ser uma Agrobacterium, um Sphingomonas, ou um Candidatus Liberibacter. A Betaproteobactéria pode ser um Acidovorax, um Burkholderia, um Ralstonia, ou um Xylophilus. A Gamaproteobactéria pode ser uma Enterobacteriaceae, uma Pseudomonodaceae, ou uma Xanthomonodaceae. A Enterobacteriaceae pode ser Brenneria, Dickeya, Enterobacter, Erwinia, Ewingella, Pantoea, Pectobacterium, Candidatus Phlomobacter, Samsonia ou Serratia. A Pseudomonodaceae pode ser Pseudomonas. A Xanthomonodaceae pode ser Xanthomonas ou Xylella. A bactéria pode ser um Clavibacter, Curtobacterium, Rathayibacter, Leifsonia, Nocardia, Rhodococcus, Streptomyces, Bacillus, Clostridium, Spiroplasma, Candidatus Phytoplasma, ou Microbacteria. Os exemplos específicos de bactérias incluem, entre outros, Clavibacter michiganensis ou uma subespécie desta, Curtobacterium flaccumfaciens, Rathayibacter rathayi, Rathayibacter tritici, Rathayibacter toxicus, Leifsonia xyli ou subespécies destes, Rhodococcus fascians, Sphingomonas suberifaciens, Sphingomonas melonis, Agrobacterium vitis, Agrobacterium tumefaciens, Agrobacterium rubi, Acrobacterium larrymoorei, Acidovorax avenae, A. avenae citrulli, A. avenae avenae, Burkholderia cepacia, Burkholderia gladioli, Burkholderia andropogonis, Burkholderia caryophylli, Burkholderia glumae, Burkholderia plantarii, Dickeya dadantii, Dickeya solani, Erwinia amylovora, Ralstonia solanacearum, Ralstonia syzygii, Candidatus Phlomobacter fragariae, Candidatus Liberibacter asiaticus, Pectobacterium carotovorum, Pectobacterium atrosepticum, Pseudomonas syringae, Pseudomonas savastanoi, Pseudomonas marginalis, Pseudomonas viridiflava, Xanthomonas arboricola, Xanthomonas axonopodis, Xanthomonas campestris, Xanthomonas hortorum, Xanthomonas oryzae, Xanthomonas axonopodis, Xanthomonas translucens, Xanthomonas vasicola ou Xylellafastidiosa. De acordo com Mansfield et al. (Mol. Plant Pathol. 13: 614-629 (2012)), os principais patógenos bacterianos de planta são Pseudomonas syringae pathovars, Ralstonia solanacearum, Agrobacterium tumefaciens, Xanthomonas oryze pv. oryze, Xanthomonas campestris pathovars, Xanthomonas axonopodis pv. manihotis, Erwinia amylovora, Xylellafastidiosa, Dickeya dadantii, Dickeya solani, Pectobacterium carotovorum e Pectobacterium atrosepticum.

[00116] Os fungos podem ser quaisquer fungos de planta. Os exemplos incluem, entre outros, Ascomicetos, como Fusarium spp. (agentes causais de doença de Fusarium wilt), Fusarium graminearum, Fusarium oxysporum, Thielaviopsis spp. (agentes causais de decomposição de cancro, decomposição de raiz negra e decomposição de raiz Thielaviopsis), Verticillium spp., Magnaporthe grisea (agente causal de destruição de arroz e ponto cinza na folha em relvas), Magnaporthe oryzae, Sclerotinia sclerotiorum (mofo branco), e míldios em pó. Os demais exemplos incluem Basidiomicetos, como Ustilago spp., Ustilago maydis, Rhizoctonia spp., Rhizoctonia solani, Phakospora pachyrhizi (agente causal de oxidação da soja), Puccinia spp. (agentes causais de oxidações graves de quase todos os grãos de cereais e gramíneas cultivadas), e Armillaria spp. (species de "fungo do mel"; patógenos virulentos de árvores e cogumelhos aptos a produção). De acordo com Dean et al. (Mol. Plant Pathol. 13: 414-430 (2012)), os dez principais patógenos fúngicos de planta são Magnaporthe oryzae, Botrytis cinerea, Puccinia spp., Fusarium graminearum, Fusarium oxysporum, Blumeria graminis, Mycosphaerella graminicola, Colletotrichum spp., Ustilago maydis e Melampsora lini. De acordo com Kamoun et al. (Mol. Plant Pathol. 16: 413-434 (2015)), os dez principais oomicetos são Phytophthora infestam,(mídio), Hyaloperonospora arabidopsidis(míldio penugento), Phytophthora ramorum (morte súbita de carvalho e doença de Ramorum), Phytophthora sojae (apodrecimento do caule e raiz), Phytophthora capsici (praga, decomposição do caule e frutos, e diversos outros), Plasmopara viticola(míldio penugento), Phytophthora cinnamomi (decomposição da raiz e e perecimento), Phytophthora parsitica (decomposição da raiz e do caule e diversos outros), Pythium ultimum(podridão e decomposição da raiz) e Albugo candida (ferrugem branca).

[00117] A planta com semente pode ser cuscuta, visco ou ervas daninhas. Estas plantas são hemiparasitárias ou parasitárias em outras plantas.

[00118] O vírus pode ser qualquer vírus de planta. O vírus pode ser transmitido por seiva, por um inseto, por um nemátodo, por um plasmodiophorido, por um ácaro, por uma semente ou por pólen. Os exemplos incluem, entre outros, membros do gênero Alfamovírus (por exemplo, Bromoviridae), Alfacriptovírus (por exemplo, Partitiviridae), Badnavírus, Betacriptovírus (por exemplo, Partitiviridae), Bigeminivírus (por exemplo, Geminiviridae), Bromovírus (por exemplo, Bromoviridae), Bimovírus (por exemplo, Potyviridae), Capillovírus, Carlavírus, Carmovírus (por exemplo, Tombusviridae), Caulimovírus, Closterovírus, Comovírus (por exemplo, Comoviridae), Cucumovírus (por exemplo, Bromoviridae), Citorhabdovírus (por exemplo, Rhabdoviridae), Dianthovírus, Enamovírus, Fabavírus (por exemplo, Comoviridae), Cucumovírus (por exemplo, Bromoviridae), Citorhabdovírus (por exemplo, Rhabdoviridae), Dianthovírus, Enamovírus, Fabavírus (por exemplo, Comoviridae), Fijivírus (por exemplo, Reoviridae), Furovírus, Hordeivírus, Hibrigeminivírus (por exemplo, Geminiviridae), Idaeovírus, Ilarvírus (por exemplo, Bromoviridae), Ipomovírus (por exemplo, Potyviridae), Luteovírus, Maclomovírus, Macluravírus, Marafivírus, Monogeminivírus (por exemplo, Geminiviridae), Nanavírus, Ncrovírus, Nepovírus (por exemplo, Comoviridae), Nucleorhabdovírus (por exemplo, Rhabdoviridae), Orizavírus (por exemplo, Reoviridae), Ourmiavírus, Fitovírus (por exemplo, Reoviridae), Potexvírus, Potivírus (por exemplo, Potyviridae), Rymovíruses (por exemplo, Potyviridae), Sequivírus (por exemplo, Sequiviridae), Sobemovírus, Tenuivírus, Tobamovírus, Tobravius, Tombusvírus (por exemplo, Tombusviridae), Tospovírus (por exemplo, Bunyaviridae), Tricovírus, Timovírus, Umbravírus, potivírus não designado (por exemplo, Potyviridae), rhabdovírus não designado (por exemplo, Rhabodiviridae), Varicosavírus, Waikavírus (por exemplo, Sequiviridae), e vírus não agrupado. Os demais exemplos de vírus incluem, entre outros, vírus citrus tristeza, vírus do nanismo amarelo da cevada, vírus do enrolamento foliar da batata e vírus do impedimento de crescimento rasteiro do tomate. De acordo com Scholthof et al. (Mol. Plant Pathol. 12: 938-954 (2011)), os dez principais virus de planta são virus do mosaico do tabaco, vírus de manchas murchar de tomate, virus do ondulamento de folha amarela de tomate, vírus do mosaico do pepino, vírus Y da batata, vírus do mosaico da couve-flor, vírus do mosaico da mandioca africana, vírus plum pox, vírus do mosaico do bromo e vírus X da batata.

[00119] Os exemplos de virus transmitidos através da seiva incluem, entre outros, vírus do mosaico do tabaco, vírus X da batata, vírus Y da batata, e um vírus do mosaico do pepino.

[00120] Os exemplos de vírus transmitidos por insetos incluem, entre outros, Rhabdoviridae, Reoviridae, Potyvírus, Cucumovírus, Luteovírus, Begomovírus, Tospovírus, Comovírus, Sobemovírus, vírus da ondulação da folha amarela do tomate, vírus do topo de pseudoondulação do tomate, vírus de podrição manchada do tomate e vírus amarelo infeccioso da alface. O inseto pode ser um afídeo, uma mosca, um gafanhoto, um pulgão, ou um besouro. Afídeos podem disseminar Potyvírus, Cucumovírus e Luteovírus. As moscas podem disseminar Begomovírus, vírus da aondulação da folha amarela do tomate e vírus amarelo infeccioso da alface. Os gafanhotos podem disseminar Rhabdoviridae, Reoviridae e vírus superior de pseudoondulação do tomate. Os pulgões podem disseminar Tospovírus e vírus da podridão manchada do tomate. Os besouros podem disseminar Comovírus e Sobemovírus.

[00121] Os nematodes podem disseminar Nepovírus, Tobravírus, vírus tobacco ringspot, e vírus tobacco rattle, por exemplo. De acordo com Jones et al. (Mol. Plant Pathol. 14: 946-961 (2013)), os dez principais nematodes são nematodes do nó da raiz (ou seja, Meloidogyne spp.), nematodes de cisto (ou seja, Heterodera spp. E Globodera spp.), nematodes de lesão da raiz (ou seja, Pratylenchus spp.), o nematode escavador (ou seja, Radopholus similis), Ditylenchus dipsaci, o nematode de podridão do pinheiro (ou seja, Bursaphelenchus xylophilus), o nematode reniforme (ou seja, Rotylenchulus reniformis), Xiphinema index, Nacobbus aberram e Aphelenchoides besseyi.

[00122] Os plasmodioforidos podem disseminar Benyvírus, Bymovírus, Furovírus, Pecluvírus, Pomovírus, vírus do mosaico amarelo da cevada e vírus da veia amarela necrótica da beterraba, por exemplo.

[00123] Os ácaros podem disseminar Rymovírus, Tritimovírus, e vírus do mosaico do filão do trigo.

[00124] A semente pode disseminar Hordeivírus, vírus do mosaico comum do feijão e vírus do mosaico da faixa de cevada.

[00125] Assim que o DNA exógeno é estavelmente incorporado emu ma planta transgênica e confirmado como operável, ele pode ser introduzido em outras plantas por cruzamento sexual. Portanto, um método de produção de uma planta com teor proteico elevado ou resistência elevada a um patógeno ou um parasita também é provido. O método compreende o cruzamento de planta obtida de acordo com o exposto acima com uma segunda planta para produzir plantas progenitoras e seleção de plantas progenitoras com teor proteico elevado ou resistência elevada a um patógeno ou um parasita. O método pode compreender ainda o cruzamento de plantas progenitoras selecionadas com a dita segunda planta para produzir plantas progenitoras de retrocruzamento, seleção de uma primeira planta progenitora de retrocruzamento que possui teor proteico elevado ou resistência elevada a um patógeno ou um parasita para produzir planta progenitora selecionada de retrocruzamentos, e repetição de cruzamento e seleção três ou mais vezes para produzir uma planta progenitora de retrocruzamento que possui teor proteico elevado ou resistência elevada a um patógeno ou um parasita. Os procedimentos similares podem ser usados, ou adaptados para uso, em algas, as quais produzem animais não humanos de forma vegetativa, asexual e sexual.

[00126] Uma célula, coleção de células, tecido, órgão ou organismo no qual o gene NF-YC4 compreende um promotor compreendendo um local de ligação de repressor de transcrição que foi manipulado ou modificado, de modo que o repressor de transcrição não possa evitar a transcrição do NF-YC4 também é provido. A célula, coleção de células, tecido, órgão ou organismo possui um teor proteico elevado em comparação a uma célula, coleção de células, tecido, órgão ou organismo correspondente no qual o gene NF-YC4 compreende um promotor compreendendo um local de ligação de repressor de transcrição que não foi manipulado ou modificado. Em realizações, o organismo pode ser uma planta ou uma alga, como um flagelado unicelular. Em outra realização, o organismo pode ser um animal não humano, como animais de pecuária, por exemplo, gado, porcos, frangos, perus, ovelhas e bisões.

[00127] Uma semente da planta mencionada acima também é provida, uma vez que é um híbrido do organismo acima mencionado, como uma planta híbrida. Uma semente da planta híbrida também é provida, como são estruturas resultantes correspondentes da reprodução vegetativa, asexual e sexual de algas, e óvulos fertilizados de animalis não humanos. Outra prole, clones, linhagens celulares e células também são providos.

EXEMPLOS

[00128] Os exemplos a seguir servem para ilustrar a presente revelação. Os exemplos não pretendem limitar o escopo da invenção, conforme reivindicado.

Exemplo 1

[00129] Este exemplo descreve a fabricação de constructos de fusão e transformação 35S::QQS e 35S::AtNF-YC4.

[00130] Os constructos de fusão 35S::QQS e 35S::AtNF-YC4 foram fabricados por sequência de codificação de comprimento total amplificado no vetor binário pB2GW7, conforme anteriormente descrito (Li et al. (2015), supra). De forma breve, a sequência do domínio de codificação de QQS (CDS) ou o CDS de NF-YC4 de Arabidopsis (AtNF-YC4) foi inserida no vetor pB2GW7 (vide Figs. 1a e 1b, que são mapas dos vetores), os quais contém um gene Bar (gene de fosfinotricina acetiltransferase) no controle de Pnos (promotor de nos) e Tnos (terminal nos) da sintase de nopalina de Nicotiana tabacum. O CDS neste vetor é controlado por p35S (promotor 35S do vírus do mosaico da couve-flor (CaMV)) e terminado por T35S (CaMV 35S). Apenas a região entre LB e RB foi introduzida às plantas para gerar plantas transgênicas.

[00131] Os constructos foram introduzidos na linhagem de Agrobacterium tumefaciens GV3101 para transformação em Arabidopsis thaliana ecotipo Columbia (Col-0), e linhagem de Agrobacterium tumefaciens EHAlOl para a transformação em soja (Glycine max) cultivar William 82 (Li et al. (2015), supra), arroz (Oryza sativa) cultivar Kitakke, e milho com (Zea mays) linhagem B104.

[00132] Os transformantes que expressam QQS (QQS-E) foram identificados com base na seleção de BAR seguida por análise por reação em cadeia de polimerase (PCR) quanto a presença do gene QQS, conforme anteriormente descrito (Li et al. (2015), supra).

[00133] QQS-E Williams 82 da soja foi usado como doador de pólen para cruzar com linhagens de elite de soja de Iowa (IA1022, IA2079, IA2102, IA2053 e IA3022) no campo (Williams 82 foi usado como um controle). A geração Fl foi cultivada na estufa em vasos com três plantsa/vasos em um ambiente controlado de 16 horas de claridade e 8 horas de escuridão a 27/20 °C. A geração F2 foi plantada no campo de Ames, IA. Os mutantes QQS-E foram identificados com base na seleção de BAR seguida por análise por PCR quanto a presença do gene QQS. As segregações das plantas do tipo selvagem (WT) que não eram resistentes ao herbicida e não expressaram QQS foram usadas como controles equivalentes.

[00134] As plantas de arroz foram cultivadas emu ma câmara de crescimento em um ambiente controlado de 16 horas de claridade e 8 horas de escuridão a 28/25 °C. As plantas da geração T3 foram analisadas. Da mesma forma, as plantas foram testadas por análise de herbicida e PCR para identificar os transformantes e controles equivalentes do tipo selvagem.

[00135] As plantas de milho foram cultivadas no campo em Ames, IA. As plantas foram retrocruzadas com B104. Da mesma forma, as plantas foram testadas por análise de herbicida e PCR para identificar os transformantes e os controles equivalentes do tipo selvagem.

[00136] Arabidopsis foram transformadas, cultivadas e colhidas, conforme anteriormente descrito. Vide Li et al. (2009), supra.

Exemplo 2

[00137] Este exemplo descreve a análise de composição da planta.

[00138] A composição de folhas (coloração e quantificação de amido e proteína) foi determinada em brotos de muda de Arabidopsis 20 dias após a plantação (DAP) em uma câmara de crescimento e em segundas folhas de arroz (próximas às folhas de referência) dos cultivadores primários das plantas 30 DAP. Três (para amido) ou cinco (para proteína) plantas por réplica e três réplicas de cada linhagem T2 independente (Arabidopsis) e linhagem T3 (arroz) foram analisadas. As folhas foram colhidas no término do período de claridade. As sementes foram colhidas por planta individual para Arabidopsis, arroz e soja. Para a quantificação proteica de folha e semente, os materiais da planta foram cozidos a 71 °C. A folha seca/tecido da semente (0,07 g) foi usada para cada determinação. O teor proteico total foi medido. O nitrogênio total foi determinado pelo uso de um LECO CHN-2000 (LECO, St. Joseph, MI), e convertido em teor proteico (Li et al. (2015), supra).

[00139] Toda a porção aérea de Arabidopsis foi tingida com 12/KI, ao passo que a parte intermediária da segunda folha (próxima à folha de referência) do cultivador primário de arroz foi coletada e cortada em pequenos pedaços (aproximadamente 1 a 1,5 cm de comprimento).

[00140] Os grãos de soja e milho foram analisados (proteína, óleo e fibra para soja; proteína, óleo e amido para milho) por espectroscopia infravermelha próxima (NIRS) usando um analisador de grãos de Bruins S/N 106110 (Munique, Alemanha). Aproximadamente 60 g de sementes por planta foram testados, com três réplicas biológicas para cada linhagem.

Exemplo 3

[00141] Este exemplo descreve os ensaios de dois híbridos de levedura.

[00142] O sistema Matchmaker 3 (Clontech, Mountain View, CA) foi usado para identificar as proteínas de interação com QQS usando uma biblioteca de cDNA de Arabidopsis Columbia construída com mudas etioladas de três dias de idade (Arabidopsis.org/servlets/TairObject?type=library&id=23). Para os ensaios de dois híbridos de levedura recíproca, QQS e AtNF-YC4 foram clonados em pGBKT7 (vetor isca) e pGADT7 (vetor vítima), respectivamente (Clontech).

Exemplo 4

[00143] Este exemplo descreve ensaios de complementação de fluorescência bimolecular (BiFC).

[00144] QQS e AtNF-YC4 foram fundidos em quadros ao terminal N de nYFP (extremidade do terminal N da proteína fluorescente amarela (YFP)) e eYFP (extremidade do terminal C de YFP), respectivamente. A cepa de Agrobacterium GV3101 transformada com constructos de QQS-nYFP e AtNF-YC4-cYFP foram were co- infiltrados em Nicotiana tabaccum. O sinal de YFP reconstituído foi observado 48 horas após a infiltração em um microscópio de fluorescência Zeiss Axioplan II.

Exemplo 5

[00145] Este exemplo descreve a purificação de NF-Y recombinante direcionado a HIS-MBP.

[00146] Os transformantes de E. coli contendo o gene AtNF-YC4 (ou outros genes NF-Y ou fragmentos de gene) foram cultivados em 0,6 L do meio de Luria-Bertani (LB) a 37 °C até um ODeoo de 0,90, e então isopropil-ß-D-tiogalactopiranosideo (IPTG) foi adicionado a uma concentração final de 0,075 mM. Após a incubação a 12 °C por 20 horas, as células induzidas foram colhidas por centrifugação a 5.000 x g por 5 min. A proteína direcionada a His-MBP (ou seja, 6 x proteína direcionada à lilgação de histidina-maltose) foi purificada usando uma cromatografia de afinidade de Ni sepharose 6 de Fluxo Rápido (GE Healthcare Life Sciences, Pittsburgh, PA) em condições naturais a 4 °C. O pellte da célula foi novamente suspenso em 15 ml de tampão de ligação (50 mM de NaH2PO4, pH 8,0, 500 mM de NaCl, e 30 mM de imidazol). As células foram lisadas por sonificação intermitente. Após centrifugação a 10.000 x g durante 20 min, as resinas foram adicionadas ao lisado limpo. Após agitação a 4 °C durante 30 min, a mistura de resinas de lisado foi carregada em uma coluna. As resinas foram enxaguadas com tampão de enxague (50 mM de NaH2PO4, pH 8,0, 500 mM de NaCl, e 60 mM de imidazol). A proteína de ligação foi eluída fora da coluna com tampão de eluição (50 mM de NaH2PO4, pH 8,0, 500 mM de NaCl, e 250 mM de imidazol). As proteínas eluídas foram dialisadas duas vezes contra tampão PBS (140 mM de NaCl, 2,7 mM de KCl, 10 mM de Na2HPO4, e 1,8 mM de KH2PO4, pH 7,3). A concentração proteica foi determinada pelo kite de ensaio de proteína por BCA (Thermo Scientific, St. Louis, MO) com albumina do soro bovino (BSA) como o padrão.

Exemplo 6

[00147] Este exemplo descreve a expressão e purificação de QQS direcionado a GST.

[00148] Os transformantes de E. coli que expressam o gene QQS foram cultivados em 1,2 L do meio Luria-Bertani (LB) a 37 °C até um OD600 de 0,9, e então fooi adicionado isopropil-ß-D-1- tiogalactopiranosídeo (IPTG) a uma concentração final de 0,075 mM. Após incbuação a 12 °C durante 20 horas, as células induzidas foram colhidas por centrifugação a 5.000 x g durante 5 min. A purificação de QQ direcionado a GST (ou seja, marcado para glutationa-S- transferase) QQS foi conduzida usando cromatografia de afinidade de glutationa Sepharose 4B (GE Healthcare Life Sciences) em condições naturais a 4°C. O pellet da célula foi novamente suspenso em 15 ml de tampão PBS (140 mM de NaCl, 2,7 mM de KCI, 10 mM de Na2HPO4, e 1,8 mM de KH2PO4, pH 7,3), e as células foram lisadas por sonificação intermitente. Após centrifugação a 10.000 x g durante 20 min, as resinas foram adicionadas ao lisado limpo. Após agitação a 4°C durante 30 min, a mistura de resinas e lisado foi carregada em uma coluna. As resinas foram enxaguadas com PBS. A proteína de ligação foi eluída fora da coluna com tampão de eluição (50 mM de Tris-HCI, 10 mM de glutationa reduzida, 5 mM de DTT, pH 8,0). As proteínas eluídas foram dialisadas duas vezes contra tampão PBS. A concentração proteica foi determinada por kit de ensaio de proteína por BCA (Thermo Scientific) com BSA como o padrão.

Exemplo 7

[00149] Este exemplo descreve os ensaios de enfraquecimento.

[00150] A proteína marcada para His-MBP purificada (5 µg) foi misturada a proteína de fusão de GST-QQS imobilizada por grânulo (10 µg) em 1 ml de tampão PBS contendo NP-40 a 1%, 1 mM de DTT, e 0,5 µg/µl de BSA. A mistura foi incubada a 4°C durante 2 horas. A proteína GST imobilizada em grânulos foi usada em incubações com proteínas marcadas com His-MBP como um controle negativo. Os grânulos foram recuperados por centrifugação, enxaguados seis vezes com 1 ml de tampão PBS, e novamente suspensos em 50 µl de tampão de amostra SDS. Quinze µl da amostra resultante foram analisados por SDS-PAGE e um gel a 12%, seguido por imunotransferência e análise com antisoro contra MBP.

Exemplo 8

[00151] Este exemplo descreve o desenho estático e análises.

[00152] As plantas foram cultivadas, coletadas e analisadas em um desenho de bloco complete randomizados ou desenho completamente randomizado. As análises quantitativas e qualitativas foram conduzidas com um mínimo de três determinações biológicas de cada linhagem transgênica independentee cada controle. Para as análises de composição, as amostras de planta foram designadas com números randomizados e providas para as instalações de análise para determinação em uma ordem randomizada sem designador de genótipo.

[00153] Os dados são apresentados como media ± SE. Dois grupos de amostras independents foram comparados usando o teste t de Student (bicaudal) com conclusão de variâncias iguais (n=3). P<0,05 foi considerado significativo (*); P<0,01 foi considerado muito significativo (**).

Exemplo 9

[00154] Este exemplo descreve a inferência filogenética.

[00155] As sequências foram selecionadas como potenciais genes NF-Y com um HMMER 3.0 (Finn et al., Nucleic Acids Res. 39: W29-37 (2011)) de pesquisa (pesquisa hmm) do domínio PF00808.18 PFam (domínio de dobra similar a histona) contra as sequências de proteína de Glycine max, Oryza sativa, Arabidopsis thaliana, Chlamydomonas reinhardtii, Zea mays, Homo sapiens, Mus musculus, Danio rerio, Saccharomyces cerevisiae e Dictyostelium discoideum. Os esquemas foram construídos usando PhyML package (Guindon et al., Systematic Biology 52: 696- 704 (2003)) (com parâmetros ‘-a e -f m') e visualizados em Archaeopteryx (sites.google.com/site/cmzmasek/home/software/archaeopteryx). Vide Figs. 2a a c, que mostram sequências de NF-YC4, e Fig. 3, que é um esquema fologenético dos genes NF-YC4 a partir de espécies evolutivamente diversas.

Exemplo 10

[00156] Este exemplo demonstra que o transgene QQS afeta o teor proteico e teor de carboidrato nas linhagens de elite de soja com teores proteicos variados da semente; portanto, o efeito de QQS não está limitado à linhagem de soja Williams 82.

[00157] O transgene QQS foi introduzido nas linhagens de elite de soja com teores proteicos variados de semente pelo cruzamento com soja de QQS-que expressa (QQS-E) Williams 82 como o doador de pólen. Os descendentes autopolinizados das gerações F2 e F3 destes cruzamentos contendo o transgene QQS são similares aos respectivos irmãos de segregação em morfologia, desenvolvimento, tamanho da semente, formato da semente, peso da semente e produção de semente por planta. A composição da semente (geração F3) foi analisada por espectroscopia infravermelha próxima (NIRS).

[00158] A expressão do teor proteico elevado da semente de QQS em cada linhagem de elite, independente do nível proteico inicial na linhagem (Fig. 4A). O teor proteico da semente é mostrado na Fig. 4A, que é um gráfico em barras das linhagens de elite de soja que expressam QQS e seus respectivos controles equivalentes segregantes vs. proteína da semente na geração F3 (%/g de peso fresco com 13% de umidade). O aumento percentual na proteína da semente em comparação ao respective controle equivalente segregante é indicado na parte superior da barra mutante. a=equivalente segregante com ausência do gene QQS dos transformantes QQS-E Williams 82; b=transformantes QQS-E Williams 82; c=controles equivalentes segregantes com falta do gene QQS dos cruzamentos das linhagens de elite IA ou Williams 82 e QQS-E Williams 82; d=mutantes QQS-E dos cruzamentos das linhagens de elite IA e QQS-E Williams 82. O test t de Student foi usado para comparar QQS-E e os controles. **P<0,01. Especificamente, a expressão de QQS aumentou o tero proteico na semente em 9% na linhagem de proteína baixa IA1022, 6 a 7% nas linhagens de proteína mediana IA2079 e IA2102, e 7 a 11% nas linhagens de proteína elevada IA2053 e IA3022, quando comparado aos respectivos equivalentes segregantes.

[00159] A Fig. 4B é um gráfico em barras das linhagens de elite de soja que expressam QQS e seus respectivos controles equivalentes segregantes vs. óleo da semente na geração F3 (%/g do peso fresco com 13% de umidade). a=equivalente segregante com ausência do gene QQS de transformantes QQS-E Williams 82; b=transformantes QQS-E Williams 82; c=controles equivalentes segregantes com ausência do gene QQS de cruzamentos das linhagens de elite IA ou Williams 82 e QQS-E Williams 82; d=mutantes QQS-E dos cruzzamentos das linhagens de elite IA ou Williams 82 e QQS-E Williams 82. O test t de Student foi usado para comparar QQS-E e os controles. *P<0,05. **P<0,01.

[00160] A Fig. 4C é um gráfico em barras de linhagens de elite de soja que expressam QQS e seus respectivos controles equivalentes segregantes vs. fibra da semente na geração F3 (%/g do peso fresco com 13% de umidade). a=equivalente segregante com ausência do gene QQS dos transformantes QQS-E Williams 82; b=transformantes QQS-E Williams 82; c=controles equivalentes segregantes com ausência do gene QQS dos cruzamentos das linhagens de elite IA ou Williams 82 QQS-E Williams 82; d=mutantes QQS-E dos cruzamentos das linhagens de elite IA ou Williams 82 e QQS-E Williams 82. O test t de Student foi usado para comparar QQS-E e os controles. *P<0,05. *P<0,01.

Exemplo 11

[00161] Este exemplo demonstra que transgene QQS afeta o teor proteico no arroz e milho.

[00162] O transgene QQS foi introduzido no arroz (cultivar Kitakke; vide Fig. 1A, que é um mapa do vetor). As plantas de arroz foram cultivadas em uma câmara de crescimento em um desenho de bloco completo randomizado. As folhas das plantas T3 e as sementes T4 maduras dos três eventos de transformação independentes foram analisadas em triplicata. As linhagens transgênicas independents das plantas de arroz que expressam o gene QQS (QQS-E) e sua semente eram de forma visual e desenvolvimentais iguais aos seus respectivos controles equivalentes do tipo selvagem (WT). No entanto, a expressão do gene QQS nas três linhagens transgênicas independentes diminuiu o teor de amido nas folhas que expressam QQS (QQS-E) e seu equivalente (equivalente) do tipo selvagem e o teor proteico elevado nas folhas (vide Fig. 5A, que é um gráfico de barras do arroz (cultivar Kitakke) que expressa QQS (QQS-E) e seu equivalente (equivalente) do tipo selvagem vs. proteína da folha (%/peso seco); todos os dados montram a média ± SE, n=3; O test t de Student foi usado para comparar QQS-E e os controles; **P<0,01). O aumento proteico médio em sementes de arroz maduras nas três linhagens transgênicas foi de 20% (vide Fig. 5B, que é um gráfico de barras de arroz (cultivar Kitakke) que expressa QQS (QQS-E) e seu equivalente (equivalente) do tipo selvagem vs. proteína da semente (%/peso seco); todos os dados mostram média ± SEM, n=3; O test t de Student foi usado para comparar QQS-E e os controles; **P<0,01.).

[00163] O transgene QQS também foi introduzido no milho, o qual foi cultivado no campo. A proteína do grão (% por peso seco) aumento de aproximadamente 10% para aproximadamente 20% no milho que expressa QQS, em comparação aos controles equivalentes (vide Li et al., PNAS USA 112(47): 14734- 14739 (2015), o qual é pelo presente incorporado por referência).

Exemplo 12

[00164] Este exemplo descreve triagem de duas leveduras híbridas usando QQS como isca em oposição a uma biblioteca de cDNA de mudas de Arabidopsis para identificar um gene com o qual o QQS interage.

[00165] A triagem de duas leveduras híbridas usando QQS como isca em oposição a uma biblioteca de cDNA das mudas de Arabidopsis identificou o Fator Nuclear de Arabidopsis YC4 (AtNF- YC4) como um gene com o qual o QQS interage. Os ensaios de duas leveduras híbridas recíprocas são consistentes com uma interação de QQS e AtNF-YC4; AtNF-YC4 na isca possui um autosinal, e o sinal de vítima de QQS + de isca AtNF-YC4 é maior que a isca de AtNF-YC4. A interação entre QQS e AtNF-YC4 foi confirmada ainda pelos estudos recíprocos pareados de duas leveduras híbridas (Fig. 6). A Fig. 6 é um gráfico em barras de vetores vazios de vítima + isca (BK+AD), vítima de QQS + isca de vetor vazio (BK+QQS), isca de AtNF-YC4 + vítima de vetor vazio (AtNF-YC4+AD), e isca de AtNF- YC4 + vítima de QQS (AtNF-YC4+QQS) mais expressão relativa de gene relator. *P<0,05. **P<0,01. A análise estatística indica que a expressão isca de AtNF-YC4 + vítima de QQSé maior que a isca de AtNF-YC4 (*P<0,05). O ensaio de fluorescência bimolecular em folhas de tabaco indicou a rede interna de QQS e AtNF-YC4 com citosol e o núcleo; nenhum sinal de YFP foi detectado sem uma interação de QQS e AtNF-YC4.

Exemplo 13

[00166] Este exemplo descreve o ensaio de enfraquecimento de glutaiona-S-transferase (GST) usando as proteínas de fusão de AtNF-YC4-GST recombinante purificado para identificar a região no AtNF-YC4 necessária para ligação de QQS.

[00167] As proteínas que contém diferentes regiões de AtNF-YC4 (ou seja, comprimento total, aminoácidos 1 a 72, aminoácidos 73 a 162, aminoácidos 163 a 250, aminoácidos 1 a 162 e aminoácidos 73 a 250) fundidas com GST foram expressas. As proteínas de fusão foram usadas em ensaios de enfraquecimento. A análise indicou que QQS se liga aos aminoácidos na região do aminoácido 73 ao aminoácido 162 de AtNF-YC4. Esta região corresponde à localização do domínio similar à dobra de histona. O ensaio de complementação de fluorescência bimolecular em folhas de tabaco indicou a rede interna de QQS e NF-YC4 com citosol e o núcleo. Uma interação localizada no núcleo foi usada como um controle positivo. O ensaio de enfraquecimento de GST também mostrou uma interação entre QQS e a soja e os homólogos NF-YC4 de arroz.

Exemplo 14

[00168] Este exemplo descreve o ensaio de enfraquecimento de GST usando as proteínas de fusão de Fator Nuclear de Arabidopsis recombinante purificado YB7 (AtNF-YB7)-GST para determinar se QQS geralmente se liga às proteínas de domínio similar à dobra de histona.

[00169] AtNF-YB7 contém um domínio similar à dobra de histona e é previsto para o complexo com AtNF-YC4 (Hackenberg et al., Mol. Plant 5: 876-888 (2012)). AtNF-YB7, no entanto, não estava ligado por QQS nos ensaios de enfraquecimento de GST, indicando que QQS se liga às proteínas com domínios similares à dobra de histona tendo determinados recursos característicos.

Exemplo 15

[00170] Este exemplo descreve a co-expressão in vivo de QQS e AtNF-YC4 na folha de tabaco.

[00171] QQS e AtNF-YC4 foram expressos in vivo na folha de tabaco. Os complexos de QQS-NF-YC4 foram detectados no citosol e no núcleo. Estes dados (vide Figs. 1a e 1b para mapas de vetor) sugerem que o QQS predomintantemente citosólico (Li et al. (2009), supra) e NF-YC (Kahle et al., Molec. Cell. Biol. 25: 5339-5354 (2005)) se liga no citosol e se move no núcleo semelhante ao modelo de NF- YB que liga NF-YC no citosol e os complexos de NF-YB - NF-YC que se movem nos núcleos.

Exemplo 16

[00172] Este exemplo descreve a interação de QQS com as proteínas de arroz e soja tendo sequências de aminoácidos similares aos aminoácidos 73 a 162 de AtNF-YC4.

[00173] As proteínas de arroz e soja tendo sequências de aminoácidos similares aos aminoácidos 73 a 162 de AtNF-YC4 foram selecioandas pela análise filogenética de todos os domínios similares à dobra de histona de NF-Y nos genes de codificação de proteína dos genomas de dez espécies eucarióticas diversas (Fig. 3, que é uma árvore filogenética dos genes NF-YC de espécies evolutivamente diversas de eucariotas e que mostra a análise de arroz, soja e Arabidopsis). A interação física de QQS com os homólogos de soja (Glyma06g17780 e Glyma04g37291) e de arroz (Os3gl4669, Os2g07450 e Os6g45640) foi examinada pelo ensaio de enfraquecimento de GST. QQS interagiu com todos os homólogos. Estes achados são compatíveis com a expressão de QQS que confere um fenótipo de proteína elevada à soja e ao arroz por meio da interação com NF-YC4.

Exemplo 17

[00174] Este exemplo descreve a superexpressão de AtNF-YC4 e OsNF-YC4 em Arabidopsis.

[00175] O transgene AtNF-YC4 (At = Arabidopsis thaliana) foi superexpresso em Arabidopsis. As mudas de plantas T2 de 20 dias de idade de três eventos de transformação independentes foram analisados. A superexpressão de AtNF-YC4 reduziu o teor de amido nas folhas em aproximadamente 16% (vide Fig. 7A, que é um gráfico em barras de Arabidopsis superexpressa NF-YC4 (AtNF-YC4-OE) e Arabidopsis do tipo selvagem (WT) vs. amido da folha (mg/g de peso fresco); todos os dados no gráfico de barras mostram média ± SE, n=3; O test t de Student foi usado para comparar a composição de amido no WT e linhagens de AtNF-YC4-OE; *P<0,05) e o teor proteico aumentou nas folhas em aproximadamente 17% (vide Fig. 7B, o qual é um gráfico de barras de Arabidopsis que superexpressa NF-YC4 (AtNF-YC4-OE) e Arabidopsis do tipo selvagem (WT) vs. proteína da folha (mg/g de peso seco); todos os dados no gráfico de barras mostram média ± SE, n=3; O test t de Student foi usado para comparar a composição proteica no WT e linhagens de AtNF-YC4- OE; **P<0,01).

[00176] Estes dados sugerem que QQS atua em conjunto com o AtNF-YC4 para alterar a alocação de nitrogênio e carbono. Acredita- se que QQS se ligue a NF-YC4, e o complexo resultante se move para o núcleo e altera a trasncrição dos genes que estão represados e são ativados pelo complexo de NF-Y associado ao NF-YC4. Estas mudanças na expressão resultam em teor proteico elevado e teor de amido reduzido.

[00177] O transgene OsNF-YC4 (Os= Orzya sativa; Os3gl4669) também foi superexpresso em Arabidopsis. O CDS de NF-YC4 de Oryza sativa foi inserido no vetor pB2GW7, que contém um gene Bar (gene de fosfinotricina acetiltransferase gene) no controle de Pnos (promotor de nos) e Tnos (terminal de nos) da sintase de nopalina de Nicotiana tabacum. O OsNF-YC4 neste vetor é controlado por p35S (promotor 35S do vírus do mosaico da couve-flor (CaMV)) e encerrado por T35S (CaMV 35S). Apenas a região entre LB e RB foi introduzida nas plantas de Arabidopsis para gerar plantas transgênicas de Arabidopsis OsNF-YC4-0E (vide Fig. 1D, que é um mapa do vetor). A superexpressão de OsNF-YC4 reduziu o teor de amido nas folhas em aproximadamente 16% em comparação ao Arabidopsis WT. O teor proteico está sendo analisado.

Exemplo 18

[00178] Este exemplo descreve a remoção direcionada de um motivo de repressor identificado na região do promotor do gene NF- YC4.

[00179] Um motivo de ligação de RAVl, especificamente RAVl-A, foi identificado na região do promotor do gene NF-YC4. O motivo RAVl-A possui a sequência CAACA (vide, por exemplo, Kagaya et al., Nucleic Acids Res. 27: 470-478 (1999), para discussão de RAVl). Um motivo de "caixa W" também foi identificado na região do promotor do gene NF-YC4 (vide, por exemplo, Nishiuchi et al., J. Biol. Chem. 279: 55355-55361 (2004), para discussão de caixa W box na região do promotor do gene ERF3). Um motivo de caixa W possui a sequência TGACY, em que Y = C ou T. Estes motivos foram identificados na base de dados de elementos de DNA regulator de atuação de cis da planta (PLACE): 1999 (Nucleic Acids Res. 27(1): 297-300 (1999)); estes motivos foram identificados usando SIGNAL SCAN (Prestridge, CABIOS 7: 203-206 (1991); disponível na rede mundial em dna.affrc.go.jp/PLACE/signalscan.html). Os motivos também podem ser encontrados usando Plantcare (bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html). Os motivos do repressor na região do promotor do gene NF-YC4 em soja e arroz foram excluídos. Em relação à soja, especificamente à região entre do motivo RAVl-A e o motivo da caixa W foi excluída (ou seja, nts 360 a tendo a sequência GGTCAGTTTTTGTTAACATTAATTTTTAGGAT [SEQ ID No: 17]; vide Fig. 2E). Em relação ao arroz, especificamente o motivo RAVl- A foi excluído (ou seja, nts 250 a 254 tendo a sequência de CAACA). Um constructo com o promotor mutado e um constructo com um promotor de comprimento total foram separadamente fundidos com luciferase como um gene relator. Cada constructo em um vetor binário foi separadamente transformado em Agrobacterium GV3101 e então transformado em Nicotiana benthamiana (Leuzinger et al., Vis. Exp. 77 (2013)). O estágio de desenvolvimento recomendado do crescimento de N. benthamiana e Agrobacterium e a concentração de infiltração foram usados. A proteína de luciferase recombinante foi temporariamente expressa. A expressão de luciferase foi quantificada nas folhas de tabaco que foram infiltradas em Agrobacterium. Pelo menos três replicas nas três plantes foram incluídas por constructo. A remoção do motivo repressor do gene NF-YC4 da soja resultou em expressão elevada de luciferase em 2/3 das réplicas. Da mesma forma, a remoção do motivo repressor do gene NF-YC4 do arroz resultou em expressão elevada de luciferase em 2/3 das réplicas. No geral, a expressão total de luciferase de todas as três replicas aumentou para o gene NF-YC4 da soja e o gene NF-YC4 do arroz.

[00180] Em um experiment separado, as três mutações separadas para a região do promotor de OsNF-YC4 foram geradas para remover o motivo repressor de transcrição. Na mutação "prol" do motivo "RAVl" em 1164 bp a jusante foi excluída (vide SEQ ID No: 2 e Fig. 2A). Na mutação "pro2" do motivo "RAVl" em 982 bp a jusante a do motivo "ERF Classe II" em 979 bp a jusante foram excluídos (vide SEQ ID No: 3 e Fig. 2B). Os motivos RAVls e a sequência de intervenção foram excluídos na mutação "pro3" (vide SEQ ID No: 4 e Fig. 2B). O "proCompleto"controle contido na região do promotor de comprimento total, ou seja, 1.448 bp a jusante do códão inicial (vide SEQ ID No: 1 e Fig. 2A). As regiões do promotor foram fundidas com a região de codificação de luciferase, transformadas em Agrobacterium, e então transformadas em tabaco, conforme descrito acima. Os resultados são mostradoss na Fig. 9.

[00181] A Fig. 9 é um gráfico da atividade de LUC do tabaco, no qual o motivo repressor de repressão na região do promotor de arroz NF-YC4 foi excluído (OsNF-YC4prol, Os-NF-YC4pro2 e Os- NF-YC4pro3), vs. ativadde relativa de luciferase (LUC) em comparação ao controle (OsNF-YC4proCompleto). Os dados representam media ± SEM, n=3. O test t de Student foi usado para comparar a atividade LUC acionada por promotores com exclusões e promotor de comprimento total. *P<0,05. As barras de erro indicam os erros padrão.

[00182] Conforme mostrado, a expressão de NF-YC4 é superregulado quando o motivo repressor de transcrição na região do promotor é removido. A exclusão de dois motivos ERFs teve um efeito maior que a exclusão e um motivo RAVl ou a exclusão combinada de um motivo RAVl e um motivo ERF.

[00183] Ainda em outro experimento, três mutações separadas para a região do promotor de GmNF-YC4 foram geradas para remover o motivo repressor de transcrição. Na mutação "prol", um motivo ERF (reverso), um motivo RAVl (dianteiro) e a sequência de intervenção foram excluídos (vide SEQ ID No: 9 e Fig. 2D). Na mutação "pro2", um motivo ERF (reverso), um motivo RAVl (reverso) e a sequência de intervenção foram excluídos (vide SEQ ID No: 11 e Fig. 2D), ao passo que dois motivos RAVls e a sequência de intervenção foram excluídos na mutação "pro3"(vide SEQ ID No: 13 e Fig. 2E). O controle "proCompleto" continha a região do promotor de comprimento total, ou seja, 1.448 bp a jusante do códão inicial (vide SEQ ID No: 8 e Fig. 2C). As regiões do promotor foram fundidas com a região de codificação de luciferase, transformadas em Agrobacterium, e então transformada em tobacco, conforme descrito acima. Os resultados são mostradoss na Fig. 8.

[00184] A Fig. 8 é um gráfico de atividade de LUC (luciferase) do tabaco, na qual o motivo repressor de transcrição na região do promotor de NF-YC4 de soja foi excluído (pSoy-LUC DELl, pSoy- LUC DEL2, e pSoy-LUC DEL3), vs. a atividade relativa LUC em comparação ao controle (pSoy-LUCFull). Os dados representam média ± SEM, n=3. O test t de Student foi usado para comparar a atividade LUC acionada pelos promotores com exclusões e o promotor de comprimento total. *P<0,05. As barras de erro indicam os erros padrão. Conforme mostrado, a expressão de NF-YC4 é superregulada quando o motivo repressor de transcrição na região do promotor é removido. A exclusão de ambos os motivos RAVI tiveram um efeito maior que a exclusão combinada de um motivo RAVl e um motivo ERF.

[00185] Ainda em outro experimento, as plantas T0 de arroz (Kitaake) foram transformadas com um contructo CRlSPR/Cas9 direcionado para introduzir mutações na região do promotor de OsNF-YC4. O uso da tecnologia de gRNA/Cas9 envolveu diversas etapas para edição de gene direcionada no arroz. Uma sequência alvo em OsNF-YC4 foi selecionada (vide SEQ ID Nos: 6 e 7), um plasmídeo que expressa as nucleases (ou seja, Cas9 e gRNA) foi projetado e construído, os calos embriônicos foram transformados por meio da transferência de gene mediada por Agrobacterium, as linhagens transgênicas primárias foram triadas quanto a alterações de DNA específicas ao local e identificadas, e a genotipagem por PCR foi usada para identificar mutantes com sequências excluídas. Mais de 19 plantas mutantes (T0) com mutações heterozigóticas foram identificadas. As plantas T0 foram autocruzadas para progenia com mutações homozigóticas e segregação fora de T-DNA. As sementes T1 foram colhidas. Os mutantes com mutações homozigóticas e sem inserções de T-DNA serão selecionados.

Exemplo 19

[00186] Este exemplo descreve a triage da região do promotor do gene NF-YC4 para identificar uma região que pode conter um local de ligação de repressor de transcrição.

[00187] O DNA genômico de folhas de Kitakke é usado como um modelo para PCR para gerar constructos promotores mutados de OsNF-YC4. A região do promotor (a região de 1 kb a jusante do códão inicial) do gene NF-YC4 é mutada pela exclusão sequencial de 100 bp segmentos, iniciando da posição -1000 bp (a jusante do códão inicial). O promotor mutado de NF-YC4 com uma exclusão de 100 bp na região intermediária do promotor (ou seja, posição -900 bp a -100 bp) é construído por PCR de junção dupla (Yu et al., Fungal Genet. Biol. 41: 973-981 (2004)).

[00188] Os constructos com promotores mutados e um constructo com um promotor de comprimento total são separadamente fundidos com luciferase como um gene relator. Cada constructo em um vetor binário é separadamente transformado em Agrobacterium GV3101 e então transformado em Nicotiana benthamiana (Leuzinger et al. (2013), supra). O estágio de desenvolvimento recomendado de crescimento de N. benthamiana e Agrobacterium e a concentração de infiltração são usados. A proteína recombinante de luciferase é temporariamente expressa. A expressão de luciferase é quantificada em folhas de tabaco que foram infiltradas com Agrobacterium para identificar qual exclusão resulta em expressão elevada em comparação ao promotor de comprimento total. O promotor com expressão elevada é proposto por conter um local de ligação de repressor de transcrição. Pelo menos três replicas em três plantas são incluídas por constructo.

Exemplo 20

[00189] Este exemplo descreve os efeitos de superexpressão e subexpressão de QQS na expressão de genes envolvida na defesa da planta.

[00190] O RNA total foi extraído das amostras de folhas agrupadas usando TRizol (Life Technologies, Carlsbad, CA). O RNA foi purificado ainda usando QIAGEN RNeasy Mini Kit (QIAGEN, Valencia, CA) com tratamento de DNAse I (Life Technologies, Carlsbad, CA) para remover a contaminação do DNA.

[00191] Uma biblioteca de inserção curta de 200 bp foi construída. O sequenciamento do transcriptoma foi realizado com um sistema Illumina HiSeq2000 usando Reagente V3 (sequenciamento de extremidade de ar 91). As leituras de baixa qualidade foram filtradas pela remoção de leituras com adaptadores, leituras com mais de 5% de nucleotídeos desconhecidos, e leituras com mais de 20% de bases que possuem uma qualidade de < 10. As leituras limpas foram alinhadas para o genoma de referência reference Arabidopsis thaliana em Phytozome versão 8.0 (phytozome.net) usando TopHat. As leituras mapeadas foram contadas por contagem htseq (huber.embl.de/users/anders/HTSeq/doc/count.html).

[00192] A análise dos dados de sequenciamento de RNA de QQS RNAi (QQS que regula para baixo), QQS OE (QQS que superexpressa) e plantas de Arabidopsis do tipo selvagem Col-0 revelou que os genes marcadores relacionados à defesa da planta pertubaram os níveis de transcrição em relação a Arabidopsis do tipo selvagem, conforme mostrado na Tabela 1.

[00193] Os padrões podem ser classificados em três grupos. O primeiro grupo é compreendido de um gene com expressão reduzida em ambos os mutantes, a saber, WRKY47, que é altamente ativado pela infecção bacteriana e está envolvido na indução de defesa basal (Truman et al., Plant J. 46(1): 14-33 (2006)). O segundo grupo é compreendido de quarto genes com expressão elevada em ambos os mutantes. Os quarto genes são JMT, o qual é uma enzima metabolic chave de respostas de plantas reguladas por jasmonato (JA) (Seo et al., PNAS USA 98(8): 4788- 4793 (2001)), MYC2, que é um fator de transcrição responsive a JA que modula o antagonism entre a sinalização de jasmonato e etileno (ET) (Chico et al., Plant Cell 26(5): 1967-1980 (2014); Song et al., Plant Cell 26(1): 263-279 (2014); e Zhang et al., Plant Cell 26(3): 1105-1117 (2014)), PAP1, um fator de transcrição responsive a JA que ativa a biossíntese de antocianona dependendo da ativação de Coll por JA (Shan et al., J. Exp. Bot. 60(13): 3849-3860 (2009)), e RAB2-6, que é um fator de transcrição responsivo a ET que aciona o depósito de calose na planta (Ali et al., BMC Plant Biol. 13: 47 (2013)). O terceiro grupo é compreendido de três genes com expressão reduzida nos mutantes nos quais QQS é subregulado e expressão elevada nos mutantes nos quais QQS é superexpresso. Os três genes são WRKY38, que é um regulador negativo de defesa basal dependente de NPR que regula a imunidade acionada por SA (Caillaud et al., PLoS Biol. 11(12): e1001732 (2013); Kim et al., Plant Cell 20(9): 2357-2371 (2008); Pre et al., Plant Physiol. 147(3): 1347-1357 (2008); e Seo et al. (2001), supra),proteína reguladora de NPRl, e proteína 1 relacionada à patogênese de PRl.

Exemplo 21

[00194] Este exemplo demonstra que a infecção viral reduziu e plantas transgênicas Arabidopsis thaliana que superexpressam NF- YC4 ou QQS.

[00195] Foi realizado o ensaio de inoculação da proteína verde fluorescente que transporta o vírus de mosaico de nabo (TuMV- GFP), conforme anteriormente descrito (Yang et al., Molecular Plant-Microbe Interactions 20(4): 358-370 (2007)) com algumas modificações menores. As folhas de nabo infectado congelado de TuMV-GFP (Sete Principais) foram ciltivadas em tampão de 20 mM de fosfato de sódio (pH 7,2, 1:6 peso/vol) e filtradas através de Miracloth (Calbiochem, San Diego, CA) para obter o inóculo. O tútlo do inóculo foi ajustado para produzir local de GFP bem separado.

[00196] As plantas de Arabidopsis thaliana foram cultivadas por sete semanas em 10 horas de claridade a 22 °C para permitir grandes folhas de rosetas. As folhas de roseta foram cobertas com Carborundum e inoculadas com fricção com TuMV-GFP usando um aplicador de haste de algodão. Cento e vinte horas após a inoculação (hai), os focos de GFP nas folhas de roseta inoculada foram contados sob iluminação UV (100-W Blak-Ray longwave UV lamp; UVP, Upland, CA). Cada linhagem apresentou três replicas biológicas de 10 plantas randomicamente selecionadas. O número médio de focos de 10 plantas para cada linhagem foi calculado, e a significância das diferenças do número de focos entre as linhagens foi determinada usando o teste t de Student (P<0,01 ou 0,05).

[00197] Para cada genótipo, 40 focos de GFP únicos foram randomicamente selecionados e fotografados em um microscópio de dissecação por fluorescência Zeiss Stemi SVl 1 usando uma câmera digital Zeiss AxioCam MRc5 (Hewezi et al., Plant Cell 20(11): 30803093 (2008)). Os arquivos digitais foram então processados usando o software Zeiss AxioVision. Cada foco de GFP fotografado foi processado com uma ferramenta de medição de imagem (NIH) e calibrado contra o dimensionamento correto da imagem original da the Stemi SVl 1. A área total para o foco de GFP foi calculada como milímetros quadrados. As medições individuais para o foco de GFP de cada linhagem foram usadas para clacular um tamanho médio de foco para cada linhagem testada. A significância das diferenças de tamanho entre as linhagens foi determinada por meio do teste t de Student (P<0,01 ou 0,05).

[00198] TuMV-GFP foi inoculada em plantas de A. thaliana com diferentes fundos genéticos de QQS e NF-YC4. Os focos de GFP (número indica a capacidade de TuMV iniciar o processo de infecção) foram contados e os tamanhos dos focos de GFP (tamanho indica a capacidade de TuMV reproduzir na planta) foram medidos cinco dias após a inoculação. As linhagens Col-0 de Arabidopsis thaliana com expressão de QQS alterada e expressão alterada do interactiano QQS de NF-YC4 foram usadas em todos os ensaios de infecção. As linhagens usadas foram Col-0 (poucos tricomas, controle para transformantes) para AtQQS RNAi (subregulação de QQS), AtQQS OE (superexpressão de QQS), e AtNF-YC4 OE (superexpressão de NF-YC4) e Col-0 (tricomas, controle para mutantes de elimanação (KO) de T-DNA) para AtQQS KO e AtNF- YC4 KO.

[00199] Conforme mostrado nas Figs. 10A (um gráfico de mutante vs. controles para número médio de focos por 10 plantas de Arabidopsis (± erro padrão 120 horas após a inoculação viral (hai); teste de t Student foi usado para comparar o número de focos no controle) e mutantes de QQS ou NF-YC4; *P<0,05; **P<0,01; ***P<0,001) e 10B (um gráfico de mutante vs. controles para tamanho médio dos focos (mm2 (± erro padrão 120 horas após inoculação viral hai (n = 40); O test t de Student foi usado para comparar o número de focos no controle e mutantes de QQS ou NF- YC4; ***P<0,001), as plantas de AtNF-YC4 OE apresentaram números significativamente reduzidos de focos de GFP, aproximadamente 88% menos que os controles. Em contraste, as plantas AtNF-YC4 KO apresentaram número de focos discretamente elevado, aproximadamente 16,5% mais que os controles; embora pequena, o teste t de Student sugeriu que a diferença foi significativa. Da mesma forma, as plantas AtQQS OE apresentaram 21,7% menos focos em comparação às plantas controle, enquanto as plantas AtQQS RNAi apresentaram 12,2% mais focos que as plantas controle, e as plantas AtQQS KO apresentaram 45,9% mais focos que os controles. Estes resultados mostraram que a superexpressão tanto de AtQQS quanto AtNF-YC4 prejudicou o início da infecção viral, enquanto o silenciamento ou eliminação de AtQQS ou AtNF-YC4 facilitou o início da infecção viral. A superexpressão de YC4 quase bloqueou a infecção viral.

[00200] As alterações nos tamanhos dos focos apresentaram uma tendência similar. Os focos em plantas silenciadas AtNF-YC4 KO, AtQQS KO e AtQQS foram 27,8%, 52,5% e 51,9% maiores, respectivamente, que os controles, ao passo que os focos nas plantas AtNF-YC4 OE e AtQQS OE foram 51% e 32% menores, respectivamente, que os controles. Estes resultados mostraram que a superexpressão de AtNF-YC4 ou AtQQS prejudica a reprodução viral, enquanto o silenciamento ou eliminação de AtNF-YC4 ou AtQQS facilita a reprodução viral. Os ensaios indicam que o QQS e seu interactiano, NF-YC4, diminui a inibição de infecção e diminui a reprodução viral na planta. Portanto, eles são reguladores positivos da resposta imunológica da planta, uma vez que a superexpressão de cada um aumenta a resistência da planta a vírus.

Exemplo 22

[00201] Este exemplo demonstra que o crescimento bacteriano em plantas transgênicas Arabidopsis thaliana superexpressam NF- YC4 ou QQS.

[00202] As plantas de A. thaliana foram cultivadas em câmara de crescimento durante 10 horas de claridade e 14 horas de escuridão a 22°C durante 4 a 5 semanas. Pseudomonas syringae foram enxaguadas e novamente suspensas em tampão de inoculação (10 mM de MgCb, Silwet L-77 a 0,05%). As plantas foram pulverizadas com um inóculo bacteriano com o nível bacteriano ajustado para 108 unidades de formação de colônica (UFC)/mL (Katagiri et al., The Arabidopsis thaliana - Pseudomonas syringae Interaction. The Arabidopsis Book/ American Society of Plant Biologists, 1, e0039.http://doi.org/l0.l l99/tab.0039 (2002)). Os níveis bacterianos na planta foram determinados pelo corte de discos de folha com uma sonda (diâmetro interno de 0,5 cm) e completamente homogeneizados em 500 µl do tampão de inoculação. As suspensões resultants que continham bacteria foram diluídas e laminadas em lâminas KB com os antibióticos apropriados.

[00203] O crescimento bacteriano na planta de Pst DC3000 e a cepa CEL no mesmo conjunto de plantas A. thaliana listadas no Exemplo 21 foi exeminado. Pst DC3000 é um patógeno bacteriano que infecta de forma robusta as plantas A. thaliana, enquanto CEL, uma cepa mutada de Pst DC3000 com mutações em diversos genes efetores, é uma cepa não virulenta que cresce lentamente na planta. Pst DC3000 cresceu aproximadamente 1.000 vezes em quarto dias, enquanto CEL cresceu aproximadamente 10 vezes. O crescimento de Pst DC3000 foi muito comprometido nas plantas que superexpressam AtNF-YC4 ou AtQQS, com 88% e 63% de diminuições, respectivamente. Em contraste, no AtQQS ou AtNF- YC4 RNAi e linhagens KO, o crescimento de Pst DC3000 foi elevado em aproximadamente 30%. O crescimento elevado de Pst DC3000 foi muito significativo nas plantas de AtQQS RNAi, enquanto que nas linhagens de AtQQS ou AtNF-YC4 KO não foi significativo no nível de p = 0,05.

[00204] Por outro lado, era bastante óbvio que o crescimento de CEL nas linahgens de AtQQS ou AtNF-YC4 RNAi ou KO foi fortemente potecializado com aumento de aproximadamente 2,6 vezes. A alteração de crescimento de CEL não foi similarmente significativa nas plantas de superexpressão de AtQQS ou AtNF- YC4. No geral, os dados sobre o crescimento alterado de ambas as cepas bacterianas nas plantas A. thaliana de diferentes fundos genéticos indicam que a superexpressão de AtNF-YC4 ou AtQQS potencializa as respostas imunes da planta, tornando o patógeno bacteriano robustamente infeccioso menos virulento e de crescimento lento, enquanto o silenciamento ou eliminação de AtNF- YC4 ou AtQQS prejudica as respostas imunes das plantas, fazendo o patógeno bacteriano não virulento crescer melhor. Assim, estes dados sugerem de forma compatível que AtNF-YC4 e AtQQS são reguladores positivos das respostas imunes das plantas.

[00205] Os resultados estão resumidos na Fig. 11. A Fig. 11 é um gráfico do Dia 0 (0 dpi) e Dia 4 (4 dpi) após a inoculação em plantas Arabidopsis para Pst DC3000 e CEL vs. número de bactérias (log10 (UFC/cm2)). O inóculo inicial foi ajustado uniformemente para 108 UFC/mL. As barras de erro indicam os erros padrão. O test t de Student foi usado para comparar o número bacteriano no controle e mutantes de QQS ou NF-YC4. **P<0,01. ***P<0,001.

Exemplo 23

[00206] Este exemplo demonstra que o crescimento bacteriano diminuiu nas plantas transgênicas de soja que superexpressam NF- YC4 ou expressam QQS.

[00207] O CDS de NF-YC4 de Glycine max (GmNF-YC4) foi inserido no vetor pB2GW7, que contém um gene Bar (gene fosfinotricina acetiltransferase) no controle de Pnos (promotor nos) e Tnos (terminal nos) da sintase de nopalina de Nicotiana tabacum (vide Fig. 1C, que é um mapa do vetor). O GmNF-YC4 neste vetor é controlado por p35S (promotor 35S de vírus do mosaico da couve- flor (CaMV)) e encerrado por T35S (CaMV 35S). Apenas a região entre LB e RB foi introduzida nas plantas para gerar plantas transgênicas.

[00208] As linhagens transgênicas e estáveis de soja que expressam AtQQS (AtQQS E; vide Exemplo 1 e Fig. 1A para um mapa do vetor, QQS-OE-pB2GW7) ou que superexpressam GmNF- YC4 (Glyma06g 17780; GmNF-YC4 OE) foram gerada e cultivadas em câmara de crescimento em 14 horas de claridade e 10 horas de escuridão a 22°C. As plantas mutantes de soja de QQS E, GmNF-YC4-OE, e o controle de vetor vazio foram selecionadas pela triagem por PCR do DNA da folha. Os primeiros trifoliatos nas sojas de 23 dias de idadde foram usados para inoculação. P. savastanoi pv. glycinea Race 4 recém cultivada (PsgR4) foi suspense no tampão de inoculação (vide Exemplo 22) à concentração final de aproximadamente 107 UFC/mL. As folhas de cada folha de trifoliato foram perfuradas por agulha antes de 5 µL do inóculo serem inseridos em cada ferida (10/folha). Os níveis bacterianos na planta foram determinados 10 dias após inoculação, conforme descrito acima.

[00209] Psg causa flagelo bacteriano na soja, o que foi considerado uma grande ameaça à produção de soja. PsgR4é uma das cepas mais virulentas, uma vez que pode infectar quase todos os cultivares de soja comercial. Ao usar a linhagem de soja que carrega vetor vazio como controle, PsgR4 cresceu muito mais lento na linhagem de soja GmNF-YC4 OE e na linhagem de soja AtQQS- E, com uma redução de 62,4% e 55,3%, respectivamente. O crescimento bacteriano comprometido de PsgR4 nas linhagens de soja que superexpressam GmNF-YC4 ou expressam AtQQS indicou que GmNF-YC4 e AtQQS potencializam também a resposta imune da soja, o que é compatível com os dados acima de que NF-YC4 e QQS são reguladores positivos das respostas imunes da planta.

[00210] Os resultados são resumidos na Fig. 12A. A Fig. 12A é um gráfico da linhage de soja para um número de bactérias (UFC * 104/cm2). O inóculo inicial foi ajustado uniformemente para 107 UFC/mL. As barras de erro indicam os erros padrão. O test t de Student foi usado para comparar o número bacteriano no controle e mutantes de QQS-E ou NF-YC4-OE. **P<0,01. (EV = vetor vazio)

[00211] Para confirmer que GmNF-YC4 estava superexpressado nas linhagens transgênicas de soja, o nível de expressão de GmNF- YC4 foi determinado usando PCR quantitativo em tempo real. Aproximadamente 100 mg de folhas de soja foram usadas para isolamento de RNA usando RNeasy Plant Mini Kit (Qiagen), de acordo com as instruções do fabricante. Dois µg de RNA e SuperScript® III First Strand kit (Invitrogen) foram usados para a síntese de cDNA. Foi realizada PCR quantitativa em tempo real (qRT-PCR) usando o cDNA e primários específicos ao gene (GmNF- YC4Fd: 5'-CCTCCCAGGCATGGCAGTCC-3‘ [SEQ ID No: 18] e GmNF- YC4Rev: 5'-CCATCAAGGCTCCGCTGG-3' [SEQ ID No: 19]. Cada cDNA foi amplificado pela PCR quantitativa usando iQ™SYBR® Green Supermix (Bio-Rad) e sistema de PCR em tempo real iCycler (Bio-Rad). A expressão de GmACTIN foi usada para normalizar o valor de expressão em cada sample, e os valores de expressão relativa foram determinados contra amostras simuladas usando o método comparativo Ct (2-Mcr).

[00212] GmACTIN (Glyma 15g050200) foi usado como gene de referência (Liu et al., Mol. Plant Microbe Internet. 27(8): 824-834 (2014)). O nível de expressão de GmNF-YC4 na linhagem de GmNF- YC4 OE foi 4,47 vezes maior que na linhagem do controle de soja.

[00213] Os resultados estão resumidos na Fig. 12B. A Fig. 12B é um gráfico da linhagem de soja NF-YC4-OE para nível de expressão relativa. As barras de erro indicam os erros padrão. **P<0,01. (EV = vetor vazio)

Exemplo 24

[00214] Este exemplo demonstra que os afídeos reduziram nas plantas de soja transgênica que superexpressam NF-YC4 ou expressam QQS.

[00215] As plantas de soja transgênica foram geradas conforme descripo no Exemplo 23. Os grãos de soja foram plantados a 25 °C com um fotoperíodo de 16 horas de claridade e 8 horas de escuridão. As plantas foram infestadas 18 dias após a plantação. Sete dias após a infestação, o número médio de afídeos por planta foi determinado. Os resultados são mostradoss na Fig 13.

[00216] A Fig. 13 é um gráfico do genótipo de soja QQS-E 16-6 (linhagem 16-6 que expressa QQS), QQS-E 32-6 (linhagem 32-6 que espressa QQS), controle, NF-YC4-OE Ll (linhagem 1 que superexpressa NF-YC4), e NF-YC4-OE L2 (linhagem 2 que superexpressa NF-YC4) vs. número médio de afídeos por planta. As barras de erro indicam os erros padrão. O test t de Student foi usado para comparar o número de afídeo no controle e mutantes de QQS- E ou NF-YC4-OE. *P<0,05. **P<0,01. (EV = vetor vazio). Conforme mostrado, o número me'dio de afídeos por planta diminuiu de aproximadamente 20% para aproximadamente 30% nas plantas de soja que expressam QQS ou superexpressam NF-YC4 em comparação ao controle.

Exemplo 25

[00217] Este exemplo demonstra que a proteína ou teor proteico+ de óleo aumentou nos grãos das plantas de soja transgênica que superexpressam NF-YC4.

[00218] As plantas de soja transgênica (Williams 82) que superexpressam NF-YC4 foram geradas conforme descrito no Exemplo 23 e cresceram em um campo. Os grãos T2 foram analisados usando NIRS, conforme descrito no Exemplo 2. Os dados são mostradoss nas Figs. 14A a 14E.

[00219] A Fig. 14A é um gráfico do evento de transformação (1, 2, 3 e 4; cada número indica um evento de transformação diferente) de soja transformada que superexpressa NF-YC4 (NF-YC4-OE) vs. teor proteico em comparação ao controle equivalente. As barras de erro indicam os erros padrão. O test t de Student foi usado para comparar o teor proteico nos mutantes de NF-YC4-OE e controles equivalentes. *P<0,05. **P<0,01. Conforme mostrado, a proteína diminuiu de aproximadamente 6% para aproximadamente 12% nas plantas de soja que superexpressam NF-YC4 em comparação ao controle.

[00220] A Fig. 14B é um gráfico de evento de transformação (1, 2, 3 e 4; cada número indica um evento de transformação diferente) de soja transformada que superexpressa NF-YC4 (NF-YC4-OE) vs. teor de óleo conforme comparada com o controle equivalente. As barras de erro indicam os erros padrão. O test t de Student foi usado para comparar o teor de óleo nos mutantes de NF-YC4-OE e controles equivalentes. *P<0,05. Conforme mostrado, o oleo nas plantas de soja que superexpressam NF-YC4 conforme comparado ao control foi similar ou diminuído.

[00221] A Fig. 14C é um gráfico de evento de transformação (1, 2, 3 e 4; cada número indica um evento de transformação diferente) de soja transformada que superexpressa NF-YC4 (NF-YC4- OE) vs. teor proteico+de óleo conforme comparado ao controle equivalente. As barras de erro indicam os erros padrão. O test t de Student foi usado para comparar o teor proteico+de óleo nos mutantes de NF- YC4-OE e controles equivalentes. *P<0,05. **P<0,01. Conforme mostrado, o teor proteico+de óleo aumentou de aproximadamente 5% a aproximadamente 7% em plantas de soja que superexpressam NF-YC4 em comparação ao controle.

[00222] A Fig. 14D é um gráfico de evento de transformação (1, 2, 3 e 4; cada número indica um evento de transformação diferente) de soja transformada que superexpressa NF-YC4 (NF-YC4- OE) vs. fibra do grão (% por peso fresco com 13% de umidade) em comparação ao controle equivalente. As barras de erro indicam os erros padrão. O test t de Student foi usado para comparar o teor de fibra nos mutantes de NF-YC4-OE e controles equivalentes. **P<0,01. Conforme mostrado, a fibra do grão diminuiu de aproximadamente 3,4% a aproximadamente 5,6% nas plantas de soja que superexpressam NF-YC4 em comparação ao controle.

[00223] A Fig. 14E é um gráfico de evento de transformação (1, 2, 3 e 4; cada número indica um evento de transformação diferente) de soja transformadaque superexpressa NF-YC4 (NF-YC4- OE) vs. peso do grão por planta (gramas por planta) em comparação ao controle equivalente. As barras de erro indicam os erros padrão. O test t de Student foi usado para comparar o peso do grão por planta nos mutantes de NF-YC4-OE e controles equivalentes. Conforme mostrado, o peso do grão por planta nas plantas de soja que superexpressam NF-YC4 foi similar ao controle.

Exemplo 26

[00224] Este exemplo demonstra que o teor proteico aumentou nos grãos de plantas de milho transgênico que superexpressam NF- YC4.

[00225] As plantas transgênicas que superexpressam NF-YC4 foram geradas e cultivadas em um campo. O constructo do Exemplo 1 foi identificado no milho por meio da transformação mediada por Agrobacterium. Os grãos do retrocruzamento 2 (BC2; retrocruzamento de fundo de B104 a B104) foram analisados usando NIRS, conforme descrito no Exemplo 2. Os dados são mostradoss nas Figs. 15A a 15C.

[00226] A Fig. 15A é um gráfico de milho transformado que superexpressa Arabidopsis NF-YC4 (AtNF-YC4-0E) vs. proteína do grão (% por peso seco) em comparação ao controle equivalente. As barras de erro indicam os erros padrão. O test t de Student foi usado para comparar o teor proteico nos mutantes de NF-YC4-0E e controles equivalentes. **P<0,01. Conforme mostrado, a proteína do grão aumento aproximadamente 17% em comparação ao controle.

[00227] A Fig. 15B é um gráfico de milho transformado que superexpressa Arabidopsis NF-YC4 (AtNF-YC4-0E) vs. óleo do grão (% por peso seco) em comparação ao controle equivalente. As barras de erro indicam os erros padrão. O test t de Student foi usado para comparar o teor de óleo nos mutantes de NF-YC4-0E e controles equivalentes. Conforme mostrado, o óleo do grão foi similar ao controle.

[00228] A Fig. 15C é um gráfico de milho transformado que superexpressa Arabidopsis NF-YC4 (AtNF-YC4-0E) vs. amido do grão (% por peso seco) em comparação ao controle equivalente. As barras de erro indicam os erros padrão. O test t de Student foi usado para comparar o teor de amido nos mutantes de NF-YC4-0E e controles equivalentes. **P<0,01. Conforme mostrado, o amido do grão diminuiu aproximadamente 2,2% em comparação ao controle.

Exemplo 27

[00229] Este exemplo demonstra que o teor proteico aumento nas sementes de plantas de arroz transgênico que superexpressam NF- YC4.

[00230] As plantas de arroz transgênico que superexpressam NF- YC4 foram geradas e cultivadas em uma câmara de crescimento. O constructo do Exemplo 17 (pB2GW7-0sNF-YC4) foi introduzido no arroz por meio de transformação mediada por Agrobacterium. Os dados são mostradoss nas Figs. 16A e 16B.

[00231] A Fig. 16A é um gráfico de arroz transformado que superexpressa NF-YC4 (OsNF-YC4- l-OE) vs. amido da semente (mg por g de peso seco) em comparação ao tipo selvagem. As barras de erro indicam os erros padrão. O test t de Student foi usado para comparar o teor de amido da semente nos mutantes de NF-YC4-0E e controles. **P<0,01. Conforme mostrado, o amido da semente diminuiu em aproximadamente 6%.

[00232] A Fig. 16B é um gráfico de arroz transformado que superexpressa NF-YC4 (OsNF-YC4-l-OE) vs. proteína da semente (mg por g de peso seco) em comparação ao tipo selvagem. As barras de erro indicam os erros padrão. O test t de Student foi usado para comparar o teor proteico da semente nos mutantes de NF-YC4- 0E e controles. **P<0,01. Conforme mostrado, a proteína da semente aumentou em aproximadamente 37%.

[00233] Todas as patentes, publicações de pedido de patente, artigos de periódicos, livros didáticos e demais publicações mencionadas na especificação são indicativos do nível de perícia na técnica à qual a revelação pertence. Todas estas publicações são pelo presente incorporadas por referência na mesma medida, como se cada publicação individual fosse específica e individualmente indicada para ser incorporada por referência.

[00234] A invenção descrita aqui ilustrativamente pode ser adequadamente praticada na ausência de quaisquer elementos ou limitações, os quais não são especificamente aqui revelados. Portanto, por exemplo, cada exemplo aqui de qualquer um dos termos que "compreendendo", "consistindo essencialmente de", e "consistindo de" pode ser substituído tanto por um ou outros dois termos. Da mesma forma, as formas singulars de "um", "uma" e "o(a)" incluem referências plurais, exceto se o contexto impor claramente o contrário. Portanto, por exemplo, as referências a "o método"incluem um ou mais métodos e/ou etapas do tipo, que são aqui descritos e/ou que ficarão evidentes aos peritos na técnica mediante a leitura da revelação.

[00235] Os termos e expressões que foram empregados são usados como termos de descrição e não de limitação. Quanto a isto, onde determinados termos são definidos em "Definições"e são de outro modo definidos, descritos ou discutidos de outro modo na "Descrição Detalhada", todas estas definições, descrições e discussões são pretendidas para serem atribuídas a estes termos. Também não há a intenção no uso destes termos e expressões de excluir quaisquer equivalentes dos recursos mostrados e descritos ou partes destes. Além disso, enquanto os subtítulos, por exemplo, "Definições", são usados na "Descrição Detalhada", tal uso serve exclusivamente para facilitar a referência e não pretende limitar qualquer revelação feita em uma seção para aquela seção apenas; ao contrário, qualquer revelação feita sob qualquer subtítulo pretende constituir uma revelação em cada e todos os demais subtitítulos.

[00236] Reconhece-se que diversas modificações são possíveis dentro do escopo da invenção reivindicada. Portanto, deve ser compreendido que, embora a presente invenção tenha sido especificamente revelada no contexto das realizações preferidas e recursos opcionais, os peritos na técnica podem recorrer a modificações variações nos conceitos aqui revelados. Estas modificações e variações são consideradas dentro do escopo da invenção, conforme aqui reivindicado.

Claims

1. Genoma de planta geneticamente modificado, caracterizado pelo fato de que superexpressa um gene NF-YC4, em que pelo menos o teor de proteína é superior em uma célula de planta compreendendo o genoma de planta geneticamente modificado que o teor de proteína em uma célula de planta do tipo selvagem (WT) correspondente que não superexpressa um gene NF-YC4, em que o genoma de planta geneticamente modificado compreende (i) um sítio repressor transcricional geneticamente modificado localizado em uma região promotora do gene NF-YC4, em que a modificação compreende uma deleção, uma inserção, uma substituição ou uma inversão de um ou mais nucleotídeos no sítio repressor transcricional de modo que o repressor transcricional não possa impedir a transcrição do gene NF-YC4 devido à deleção, inserção, substituição ou inversão causando o aumento do conteúdo proteico, em que o gene NF-YC4 é o NF endógeno -Gene -YC4, ou (ii) um transgene NF-YC4.

2. Genoma de planta geneticamente modificado de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que o transgene NF- YC4 é controlado por um promotor de vírus do mosaico da couve-flor.

3. Genoma de planta geneticamente modificado de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que a região promotora de NF-YC4 geneticamente modificada compreende um local do repressor transcripcional modificado.