CN112795572B

CN112795572B - 月季核因子RhNF-YC9及其在调控花瓣扩展中的应用

Info

Publication number: CN112795572B
Application number: CN202011268764.0A
Authority: CN
Inventors: 高俊平; 孙小明; 陈昶曦
Original assignee: China Agricultural University
Current assignee: China Agricultural University
Priority date: 2020-11-13
Filing date: 2020-11-13
Publication date: 2022-12-27
Anticipated expiration: 2040-11-13
Also published as: CN112795572A

Abstract

本发明涉及月季核因子RhNF‑YC9及其在调控花瓣扩展中的应用。具体地说，本发明涉及具有如SEQ ID NO.2所示的开放阅读架序列的RhNF‑YC9基因或蛋白以及通过它们来调控花瓣扩展的方法以及它们在调控花朵开放中的应用。本发明揭示了RhNF‑YC9转录因子在乙烯调控花瓣扩展中的作用，为调控植物花朵开放尤其是月季鲜切花的花朵开放提供了新的思路和技术手段，开辟了新的花朵调控研究领域，具有重大的学术价值和重要的生产应用前景。

Description

月季核因子RhNF-YC9及其在调控花瓣扩展中的应用

技术领域

本发明涉及分子生物技术领域，尤其涉及月季核因子RhNF-YC9 及其在调控花瓣扩展中的应用。

背景技术

花朵是开花植物的一个必不可少的器官，花朵开放调控是植物生理研究尤其是以花朵作为观赏部位的观赏植物生理研究中的一个重要方面，而花朵能否成功开放以及能够充分开放主要依赖于花瓣扩展情况。

月季(Rosa hybrida)是世界上最重要的切花之一，具有很高的观赏价值和经济价值。在中国，约75％的切花月季产自云南省(数据来自农业农村部)。目前，长距离运输是全国供应切花月季的主要方式，然而在运输过程中，乙烯(Ethylene)的产生严重影响了花朵的开放，而花朵开放的进程决定了切花月季的观赏时间。另外，由于我国幅员辽阔，而且切花月季进口和出口量大，使得从生产地将切花月季往消费地运输需要冷链远距离运输，影响了切花月季尤其是离开母体的月季切花的正常开放，经常发生“僵花”现象。因此，研究乙烯调节的花朵开放机理尤其是花瓣扩展机理，进而用于保持切花月季的观赏价值具有重要意义。

乙烯在植物生长发育过程中的多个方面发挥重要作用，主要包括种子萌发、器官伸长、开花、果实成熟、器官衰老和脱落。然而，乙烯调节的花朵开放尤其是花瓣扩展的分子机制仍有待进一步研究。

转录因子广泛参与植物激素信号通路调控植物生长发育。核因子 Y(NF-Y)转录因子参与调控植物发育和逆境响应。NF-Y蛋白通常由NF-YA、NF-YB和NF-YC三个亚基组成，它们以三聚体的形式结合在一起，并形成稳定的复合物。在拟南芥中，NF-YC亚家族有13 个成员，它们能够与其他转录因子互作形成各种特异复合体发挥作用。例如，NF-YC4能够与Qua-Quine Starch(QQS)互作调控植物的代谢， nf-yc3/4/9三重突变体具有更短的下胚轴。然而，NF-YC转录因子如何被乙烯调控及是否介导了花瓣扩展等生理活动仍不清楚。

发明内容

本发明人在月季花瓣中分离到一个NF-YC转录因子RhNF-YC9，研究发现RhNF-YC9基因的表达在花朵开放初期被诱导，但其表达受乙烯抑制，进而发现RhNF-YC9是在乙烯调节的花朵开放尤其是花瓣扩展中重要的调节因子。于是，本发明人研究了RhNF-YC9调控花朵开放的作用机制，尤其是乙烯与其他植物激素之间的交互作用，鉴定了RhNF-YC9调控的下游基因，从而完成了本发明。

于是，本发明在第一方面提供了RhNF-YC9基因，所述基因具有如SEQ ID NO.2所示的开放阅读架序列。优选的是，所述基因具有如SEQ ID NO.1所示的全长序列。优选的是，所述基因可以采用如 SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.5所示的引物进行克隆。

本发明在第二方面提供了RhNF-YC9蛋白，所述蛋白由本发明第一方面所述的基因编码。优选的是，所述蛋白具有如SEQ ID NO.3 所示的序列。

本发明在第三方面提供了一种调控花瓣扩展的方法，其特征在于，所述方法通过调节植物的如权利要求1或2所述的基因或权利要求3 所述的蛋白的表达来实现。

本发明在第四方面提供了本发明第一方面所述的基因或本发明第二方面所述的蛋白在如下方面的应用：

(1)调控植物花朵开放尤其是花朵开放初期的花瓣扩展；

(2)调控植物体内乙烯对花瓣扩展的影响；

(3)调控植物体内赤霉素含量对花瓣扩展和花瓣大小的影响；

(4)调控植物细胞壁降解和合成对花瓣扩展的影响；

(5)调控植物细胞膨胀度改变对花瓣扩展的影响；

(6)调控植物细胞骨架重建对花瓣扩展的影响；和/或

(7)调控植物的选自由水通道蛋白基因RhPIP1；1/2；1、纤维素合成酶基因RhCesA2/3、木葡聚糖内糖基转移酶基因RhXTH2/6/23/30、扩展蛋白基因RhEXPA1/8和微管相关基因RhTOR3/4组成的组中的任一个或多个基因对花瓣扩展的影响。

优选的是，所述应用为调控植物体内乙烯与赤霉素之间的交互作用对花瓣扩展的影响；进一步优选为调控植物体内赤霉素20氧化酶 (GA20ox)和/或赤霉素2-β-双加氧酶(GA2ox)对花瓣扩展的影响。

另外优选的是，所述调控通过抑制RhNF-YC9基因或蛋白的表达来延缓花瓣扩展；或所述调控通过促进RhNF-YC9基因或蛋白的表达来促进花瓣扩展。

另外优选的是，通过至少部分地沉默RhNF-YC9基因来实现所述延缓，优选的是，选择RhNF-YC9基因的3’端来沉默RhNF-YC9基因；或通过过表达RhNF-YC9基因来实现所述促进。

另外优选的是，所述应用为使花瓣的下表皮细胞的尺寸下降和/ 或使单位面积内花瓣的下表皮细胞数量增加。

另外优选的是，所述植物为蔷薇科植物或植物材料，更优选为月季或月季鲜切花例如‘萨曼莎’(R.hybrida‘Samantha’)。

花朵开放快慢直接影响到观赏期。乙烯作为花瓣扩展的负调节因子，通过转录调节影响到花朵的开放进程。本发明人从月季花瓣中克隆了NF-YC转录因子基因RhNF-YC9，经研究发现RhNF-YC9的表达在花朵开放初期被诱导，但其表达受到乙烯的抑制，RhNF-YC9基因的沉默使花瓣从2级到5级的扩展速度减慢。在RhNF-YC9沉默的花瓣中，与细胞壁松弛、细胞膨压和细胞骨架重塑相关的11个细胞扩展相关基因的表达显著下调。此外，本发明人经过研究发现，在 RhNF-YC9沉默的花瓣中，赤霉素生物合成基因RhGA20ox的表达显著降低，而赤霉素分解代谢基因RhGA2ox的转录显著增加。进一步对活性GA含量的测定发现，RhNF-YC9沉默的花瓣中的GA₄和GA₇的含量显著降低。另外，RhGA20ox和RhGA2ox的表达趋势与乙烯处理结果一致。这些结果表明，RhNF-YC9在花瓣开放过程中介导了乙烯和GA生物合成之间的交互作用。本发明人的研究结果揭示了NF-YC转录因子在乙烯调控的花瓣扩展中的作用，为调控植物花朵开放尤其是月季鲜切花的花朵开放提供了新的思路和技术手段，开辟了新的花朵调控研究领域，具有重大的学术价值和重要的生产应用前景。

附图说明

图1显示了RhNF-YC9在花朵开放阶段和不同激素处理下的表达。 RhNF-YC9在月季花瓣不同开放时期(A)及乙烯、GA、6-BA和NAA 处理下的表达模式(B)。以RhUBI2为内对照。所有数值均为5个生物重复的平均值±SD。图中展示经Student’s t-test检验的结果，其中星号表示差异有统计学意义(**P<0.01)。

图2显示了RhNF-YC9沉默影响花瓣的扩展。(A)采用qRT-PCR 方法检测了RhNF-YC9沉默植株(TRV-RhNF-YC9)和TRV对照植株中RhNF-YC9的表达。(B)记录对照(TRV)和沉默植物 (TRV-NF-YC9)的开花表型，并在不同时间点拍照。(C)花朵从2 级到5级的开放天数。(D)记录花朵直径变化。以RhUBI2为内参。结果是至少5个生物重复的平均数±SD。图中展示经Student’s t-test 检验的结果，其中星号表示差异有统计学意义(*P<0.05，**P<0.01)。

图3显示了RhNF-YC9沉默植株的花瓣大小和花瓣下表皮细胞观察结果。(A)RhNF-YC9沉默和TRV对照植株的花瓣大小。标尺： 1厘米。图像下方的数字表示花瓣面积(平均值±SD，n＝5)。(B) RhNF-YC9沉默和TRV对照样本花瓣下表皮细胞密度。标尺：50μm。细胞计数单位为1024μm²。图像下面的数字表示单位面积内的细胞数量(平均值±SD，n＝5)。

图4显示了RhNF-YC9沉默对月季花瓣细胞扩展基因的影响。利用qRT-PCR技术对RhNF-YC9沉默的月季花瓣中的12个细胞扩展相关基因进行了分析。基因包括水通道蛋白基因(RhPIP1；1，RhPIP2；1)，纤维素合成酶基因(RhCesA2，RhCesA3)，木葡聚糖内糖基转移酶基因(RhXTH2，RhXTH6，RhXTH23，RhXTH30)，扩展蛋白基因(RhEXPA1， RhEXPA8)和微管相关基因(RhTOR3，RhTOR4)。以RhUBI2为内对照。结果显示为三个生物学重复的平均值±SD。图中展示经 Student’s t-test检验的结果，其中星号表示差异有统计学意义(*P<0.05， **P<0.01)。

图5显示了RhNF-YC9沉默对月季花瓣活性赤霉素的影响。 (A)采用qRT-PCR方法检测了RhNF-YC9沉默的月季花瓣中的RhGA20ox(GA生物合成基因)和RhGA2ox(GA分解代谢基因)的表达。(B)RhNF-YC9沉默和TRV对照植株的花瓣中活性赤霉素含量。(C)采用qRT-PCR方法检测了乙烯和对照处理的月季花瓣中RhGA20ox和RhGA2ox的表达。结果显示为三个生物重复的平均值±SD。图中展示经Student’s t-test 检验的结果，其中星号表示差异有统计学意义(**P<0.01)。

图6显示了RhNF-YC9参与月季花瓣扩展的示意图。根据本发明的研究结果，RhNF-YC9的表达在花朵开放早期上调，但受到乙烯的抑制。RhNF-YC9通过增加GA20ox和降低GA2ox 表达来促进赤霉素的积累。GA可能通过诱导参与细胞壁松弛、细胞膨压调节和细胞骨架重塑的基因表达来增大细胞大小，并最终促进花瓣扩展。

具体实施方式

实施例

1.材料及方法

1.1植物材料和处理

月季‘萨曼莎’组培苗培养在含1.0mg/L 6-苄基氨基嘌呤 (6-BA)、0.05mg/Lα-萘乙酸(NAA)和3mg/L赤霉素(GA3)的 MS培养基上，在22±1℃，长日照(光照16h/黑暗8h)。将四周龄的小苗移至含有0.1mg/L NAA的1/2MS培养基上生根。接下来，将生根幼苗移栽到蛭石与泥炭苔藓的1:1比例的培养土中，在22±1℃，相对湿度～60％，长日照(光照16h/黑暗8h)的条件下。

根据之前发表文章定义花开放阶段(Ma等，2005)。不同阶段的花瓣样本是采集的花朵中层花瓣(Wu等，2017)。用2级切花月季进行激素处理。对于乙烯处理，花瓶中的月季切花在密封的玻璃箱中处理10μL/L乙烯24小时。对于其他激素处理，月季切花分别放置在包含80μM GA3、100μM 6-BA和100μM NAA的花瓶中24小时(Wu, L.,Ma,N.,Jia,Y.C.,Zhang,Y.,Feng,M.,Jiang,C.Z.,Ma,C.,and Gao, J.P.,2017.An ethylene-induced regulatorymodule delays flower senescence by regulating cytokinin content.PlantPhysiol,173:853-862)。每个处理设置五个生物重复。

1.2基因克隆和序列分析

利用引物RhNF-YC9-ORF-F(参见SEQ ID NO.4)和 RhNF-YC9-ORF-R(参见SEQ IDNO.5)，从‘萨曼莎’花瓣cDNA 中扩增出RhNF-YC9 ORF(参见SEQ ID NO.2)。

1.3RNA提取和荧光定量RT-PCR分析

使用热硼酸盐法从月季花瓣中提取总RNA(Ma,N.,Tan,H.,Xue, J.H.,Li,Y.Q.,and Gao,J.P.,2006.Transcriptional regulation of ethylene receptor and CTRgenes involved in ethylene-induced flower opening in cut rose(Rosa hybrida)cv.Samantha.J Exp Bot,57:2763-2773.)。用 M-MLV逆转录酶(Promega)从1μg总RNA中得到cDNA。荧光定量RT-PCR(qRT-PCR)使用KAPA SYBR FAST Universal qRT-PCR 试剂盒(Kapa Biossystems)在Applied Biosystems StepOnePlusTM实时定量PCR系统中进行反应。以RhUBI2基因作为内对照，至少3 个生物学重复。用2^-ΔΔCT法计算相关基因表达。

1.4病毒诱导的基因沉默(VIGS)

实验方法参考本发明人之前的研究(Tian,J.,Pei,H.X.,Zhang,S., Chen,J.W.,Chen,W.,Yang,R.Y.,Meng,Y.L.,You,J.,Gao,J.P.,and Ma, N.,2014.TRVGFP:a modifiedTobacco rattle virus vector for efficient and visualizable analysis of genefunction.J Exp Bot,65:311-322.)。具体地说，利用含有EcoR I和BamH I酶切位点插入445bp的RhNF-YC9 特异性片段(ORF区277bp和3’非翻译区168bp)构建 pTRV2-RhNF-YC9载体。携带pTRV2-RhNF-YC9载体的根癌农杆菌菌株GV3101在添加50μg/mL卡那霉素和50μg/mL利福平的Luria-Bertani(LB)培养基中生长，接着在28℃，200rpm的液体培养基中振荡14h，4000rpm离心收集农杆菌细胞，重悬在渗透缓冲液 (10mM 2-(N-吗啉基)乙磺酸(2-(N-Morpholino)ethanesulfonic acid, MES，)，200mM乙酰丁香酮(acetosyringone)和10mM氯化镁 (MgCl₂)，pH 5.6)，菌的终浓度为OD₆₀₀＝0.8-1.0。将pTRV-1和 pTRV-2-RhNF-YC9以1:1(v/v)的比例混合(对照为pTRV-1和 pTRV-2)，室温黑暗培养3～4h，将月季幼苗浸泡在渗透缓冲液中，置于-25KPa真空中转化。去离子水冲洗试管苗，然后在8℃黑暗中培养3天。移栽至培养土中，在22±1℃、相对湿度60％、长日照(光照16h/黑暗8h)下生长。培养40天时，对1级到5级花朵的花朵表型进行了监测。

1.5显微镜观察和细胞计数

取直径5mm的花瓣圆盘，距花瓣顶部长度的50％，用甲醛-乙酸(FAA)溶液(3.7％甲醛、5％冰醋酸、50％乙醇，v/v)固定。采用ImageJ软件对每个视野内的AbsE细胞进行计数。

1.6登录号

本研究所用R.chinensis‘Old Blush’基因在数据库 (https://lipm-browsers.toulouse.inra.fr/pub/RchiOBHm-V2/)中登录号如下：RhCesA2(RchiOBHm_Chr7g0217741),RhCesA3 (RchiOBHm_Chr1g0316091),RhXTH2(RchiOBHm_Chr4g0412651),RhXTH6(RchiOBHm_Chr2g0109241),RhXTH23 (RchiOBHm_Chr4g0398631),RhXTH30(RchiOBHm_Chr7g0212101), RhEXPA1(RchiOBHm_Chr3g0470941),RhEXPA8 (RchiOBHm_Chr1g0372131),RhPIP1；1(RchiOBHm_Chr1g0355771), RhPIP2；1(RchiOBHm_Chr6g00278401),RhTOR3 (RchiOBHm_Chr7g0179911),RhTOR4(RchiOBHm_Chr4g0444931),RhGA20ox(RchiOBHm_Chr1g0353791),RhGA2ox (RchiOBHm_Chr5g0027981)。

2.结果

2.1.RhNF-YC9的表达在花朵开放过程中增加并受乙烯抑制

开花速度与开花质量和观赏期密切相关。为了揭示开花的分子机制，探索关键的调控基因，以期对花朵开放进行调节和控制，本发明人从转录组数据库中筛选出候选基因，并主要集中于转录因子。本发明人经过深入研究发现，在月季中，转录本RU01784伴随着花朵的开放而增加。转录本RU01784在R.chinensis‘Old Blush’数据库中对应的基因编号是RchiOBHm_Chr3g0454311(Raymond等，2018)。接着，本发明人从‘萨曼莎’的花瓣中分离到RchiOBHm_Chr3g0454311(全长参见SEQ ID NO.1)。 RchiOBHm_Chr3g0454311的ORF长度为801bp(参见SEQ ID NO.2)，可编码一个含266个氨基酸的蛋白(参见SEQ ID NO.3)。

此外，本发明人还检测了RhNF-YC9在月季花瓣不同开放阶段的表达模式。RhNF-YC9的转录水平在花朵开放的2级(萼片完全张开的花蕾)达到峰值，随后从3级开始下降(图1A)，这表明RhNF-YC9 可能在花开放的早期发挥作用。然后，本发明人分别检测了乙烯、GA、6-BA和NAA处理后RhNF-YC9的表达。在这些处理中，只有乙烯处理显著降低了RhNF-YC9的转录水平(图1B)因此推测 RhNF-YC9可能参与了乙烯相关的花瓣扩展。

2.2.RhNF-YC9的沉默延缓了花瓣扩展进程

为了研究RhNF-YC9在花瓣展开过程中的潜在功能，本发明人利用VIGS在月季组培苗中沉默RhNF-YC9。选择RhNF-YC9的3’端特异性的区域沉默RhNF-YC9。与TRV对照相比，RhNF-YC9沉默的花瓣中RhNF-YC9的表达降低了61.6％，表明RhNF-YC9沉默的植株可以用于后续的研究(图2A)。RhNF-YC9沉默植株与TRV对照植株开花过程的差异表现在2级(第5天，完全开放蕾期)到5级(完全开放的花朵)(图2B)，这正好是花朵最具有观赏价值的时期！从2级到5级，对照植株从1.8±0.3天延长到RhNF-YC9沉默植株的2.9±0.4 天，延长了约61.1％(图2C)！RhNF-YC9沉默的花朵直径从第5天开始与TRV对照出现差异，但当花朵完全开放时没有显著差异(图 2D)。这些结果表明，RhNF-YC9在花瓣扩展中起着显著的正调控作用。

本发明人还观察了RhNF-YC9沉默植株的花瓣大小。根据花径的变化，用第6天2-4级的花瓣进行观察(图2D)。结果表明，与TRV 对照植物相比，沉默RhNF-YC9花瓣显著减小(图3A)。RhNF-YC9 沉默花瓣的大小(8.25±1.39cm²)与TRV对照花瓣(10.36±1.25cm²) 相比减小了20.4％(图3A)！本发明人还测试了花瓣中下表皮细胞的大小。从外层花瓣顶部50％区域取直径为5mm的圆片。显微镜观察显示，RhNF-YC9沉默植株花瓣的下表皮细胞明显比TRV对照小(图 3B)！单位面积内，RhNF-YC9沉默花瓣的下表皮细胞数量增加了约20.0％，从TRV对照组的195.5±12.8个增加到RhNF-YC9沉默花瓣的234.6±17.4个(图3B)！综上所述，本发明人的结果表明，RhNF-YC9 主要通过调节单位面积内花瓣细胞大小和细胞的数量来影响花瓣扩展过程。花瓣的扩展主要依赖于细胞分裂和细胞扩展，但是现有技术中认为，花瓣的细胞分裂几乎停止在1级，而2级到5级主要是细胞扩展(Yamada,K.,Norikoshi,R.,Suzuki,K.,Nishijima,T.,Imanishi,H., and Ichimura,K.,2009.Celldivision and expansion growth during rose petal development.J Jpn Soc HorticSci,78:356-362.)。因此，对于在调节植物花朵开发尤其是对鲜切花这一类相对成熟、一般都是在2级花朵开放度时采切、且已经离开母体植株的产品来说，此前主要研究如何调节和控制细胞的扩展。本发明人的研究结果为调节或控制花朵的开放提供了新的途径，为调节或控制花朵开放研究开辟了一个新的领域，具有重要的意义。

2.3.RhNF-YC9通过影响细胞扩展基因的表达来调控花瓣扩展

本发明人接着分析了RhNF-YC9在花瓣细胞扩展过程中的下游基因网络。基于本发明人在之前研究，本发明人选择了12个细胞扩展相关基因(Pei等，2013)，包括水通道蛋白基因(RhPIP1；1/2；1)，纤维素合成酶基因(RhCesA2/3)，木葡聚糖内糖基转移酶基因(RhXTH2/6/23/30)，扩展蛋白基因(RhEXPA1/8)和微管相关基因 (RhTOR3/4)，并检测了它们在RhNF-YC9沉默花瓣中的表达。结果表明，与TRV对照相比，沉默RhNF-YC9显著下调了其中的11个基因，说明RhNF-YC9与细胞壁的降解和合成、细胞膨胀度的改变和细胞骨架的重建有关(图4)。

2.4.RhNF-YC9沉默降低了花瓣中活性赤霉素的含量

考虑到RhNF-YC9参与了细胞扩展，而GA是一种生长促进激素，因此本发明人检测了GA生物合成相关的两个关键基因赤霉素20氧化酶(GA20ox)和赤霉素2-β-双加氧酶(GA2ox)的表达。与TRV 对照相比，RhNF-YC9沉默的花瓣中RhGA20ox转录本的表达水平显著降低(图5A)。然而，在RhNF-YC9沉默的花瓣中，RhGA2ox的表达显著增加(图5A)。进一步，本发明人测定了RhNF-YC9沉默的花瓣中活性赤霉素(GA₁、GA₃、GA₄、GA₇)的含量，发现RhNF-YC9的沉默显著降低了花瓣中GA₄和GA₇的含量(图5B)！然后，本发明人探讨了RhNF-YC9是否介导了乙烯和GA之间的交互作用。另外，本发明人发现乙烯处理下调了RhGA20ox的表达，而上调了RhGA2ox 的表达(图5C)。

3.讨论

切花开放是切花实现观赏价值和经济价值的关键。在花朵开放时，花瓣的扩展是由细胞分裂和细胞扩张驱动的。花朵开放过程中，乙烯抑制了花瓣细胞的扩展。NF-Y转录因子在植物生长发育中发挥重要作用。本发明人发现一种NF-YC转录因子RhNF-YC9在月季花瓣的乙烯调节中发挥作用。乙烯抑制花瓣扩展可能是通过抑制RhNF-YC9 的表达实现的。这项工作发现了NF-YC转录因子在花瓣扩张中的新功能。

赤霉素是众所周知的生长促进激素在植物的细胞伸长。在拟南芥中，乙烯可以抑制赤霉素诱导的根系伸长。气体通过诱导GA信号抑制因子DELLA蛋白的快速降解来激活其信号通路。DELLA蛋白介导乙烯和GA之间的生长相互作用。RhHB1可以通过直接抑制RhGA20ox1的表达来促进花瓣衰老，从而介导了花瓣衰老过程中乙烯和GA的拮抗作用。本发明人发现RhNF-YC9通过两条途径调控了赤霉素的积累。RhNF-YC9通过增加RhGA20ox的表达促进赤霉素的合成，而通过降低RhGA2ox转录水平来抑制赤霉素的失活。此外， RhNF-YC9沉默花瓣中RhGA20ox和RhGA2ox的表达与乙烯处理花瓣中表现出相同的趋势，说明RhNF-YC9介导在花瓣扩展过程中介导了赤霉素和乙烯之间的交互作用。

4.结论

在本研究中，本发明人从月季中鉴定了一个NF-YC转录因子 RhNF-YC9。RhNF-YC9的表达在花朵开放初期被诱导，但被乙烯抑制。RhNF-YC9通过增加GA20ox和降低GA2ox的表达来促进GA的积累。在月季花瓣开放过程中，RhNF-YC9可能介导了乙烯和GA生物合成的拮抗作用。赤霉素参与细胞扩展过程，诱导与细胞壁松动、细胞膨大调控和细胞骨架重塑相关的基因表达，最终促进花瓣扩展 (图6)。本发明人的结果提供了一种RhNF-YC9介导的花瓣扩展调控机制，该机制涉及乙烯和GA之间的交互作用。

本发明所涉及到的序列列表：

最后应说明的是：以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的精神和范围。

SEQUENCE LISTING

<110> 中国农业大学

<120> 月季核因子RhNF-YC9及其在调控花瓣扩展中的应用

<130> GY20100749

<160> 5

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 1324

<212> DNA

<213> R. hybrida 'Samantha'

<400> 1

tttgccttac aaaaaaattt cccagaacag aaaaacaatg aaagtttcag tctttttgaa 60

acccaatact tgttaatgcc caggtgaata tttcttccag ttttttattt tttctgaaag 120

aattttctct ctttttttca ggttcgaaat cgattttgcg tagcagagca tcccctgttt 180

gtgaaaaagg aactggatgg atcagcaagg acatgggcaa ccccaatcta tggggatggt 240

aggtagtgga gctcaattgg catatgggac tgctccgtat cagcatactc aaatggtagg 300

gagtccgaat cctgctacag ttggtgcgcc agttggaggc attcaatcta gtagtcaatc 360

tgccggagct cagcttcaac agcatcaact tgcttatcgg cacattcacc agcagcagca 420

gcaacaactt caacaacaac tgcaaagttt ctgggcaaat cagtttcaag agattgagaa 480

ggtaactgat ttcaaggacc atagccttcc tctagcaagg atcaagaaga ttatgaaagc 540

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agtacacatg acttatccca gcctcatgtt catgttgaat tcaaatagga gctcagaata 1080

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<211> 801

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<400> 2

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caacagcatc aacttgctta tcggcacatt caccagcagc agcagcaaca acttcaacaa 240

caactgcaaa gtttctgggc aaatcagttt caagagattg agaaggtaac tgatttcaag 300

gaccatagcc ttcctctagc aaggatcaag aagattatga aagctgatga ggatgtgaga 360

atgatatcag ctgaggcacc tgtgatcttt gcaagggcat gtgaaatgtt catcttggag 420

ttgaccttgc ggtcttggaa tcacacagaa gagaataaaa ggaggacact tcaaaagaat 480

gacattgcag ctgcaatcac aaggactgat atctttgatt tcttggtaga catcgtgccg 540

agagaggatc tgaaagatga agtccttgca tccattccaa ggggaacggt ttctgttggg 600

gctgctgatg cacttcctcc atactgctat atgccacctc agcatggacc tcaggtgggg 660

gctcctggga tgatcatggg caagcctatg atggacccat ctatgtacgg gcaacagtct 720

cacccctaca tggctccgca aatgtggccg caggcaccgg agcagcagca gcaacagcag 780

cagtcaccat ctgatcatta g 801

<210> 3

<211> 266

<212> PRT

<213> R. hybrida 'Samantha'

<400> 3

Met Asp Gln Gln Gly His Gly Gln Pro Gln Ser Met Gly Met Val Gly

1 5 10 15

Ser Gly Ala Gln Leu Ala Tyr Gly Thr Ala Pro Tyr Gln His Thr Gln

20 25 30

Met Val Gly Ser Pro Asn Pro Ala Thr Val Gly Ala Pro Val Gly Gly

35 40 45

Ile Gln Ser Ser Ser Gln Ser Ala Gly Ala Gln Leu Gln Gln His Gln

50 55 60

Leu Ala Tyr Arg His Ile His Gln Gln Gln Gln Gln Gln Leu Gln Gln

65 70 75 80

Gln Leu Gln Ser Phe Trp Ala Asn Gln Phe Gln Glu Ile Glu Lys Val

85 90 95

Thr Asp Phe Lys Asp His Ser Leu Pro Leu Ala Arg Ile Lys Lys Ile

100 105 110

Met Lys Ala Asp Glu Asp Val Arg Met Ile Ser Ala Glu Ala Pro Val

115 120 125

Ile Phe Ala Arg Ala Cys Glu Met Phe Ile Leu Glu Leu Thr Leu Arg

130 135 140

Ser Trp Asn His Thr Glu Glu Asn Lys Arg Arg Thr Leu Gln Lys Asn

145 150 155 160

Asp Ile Ala Ala Ala Ile Thr Arg Thr Asp Ile Phe Asp Phe Leu Val

165 170 175

Asp Ile Val Pro Arg Glu Asp Leu Lys Asp Glu Val Leu Ala Ser Ile

180 185 190

Pro Arg Gly Thr Val Ser Val Gly Ala Ala Asp Ala Leu Pro Pro Tyr

195 200 205

Cys Tyr Met Pro Pro Gln His Gly Pro Gln Val Gly Ala Pro Gly Met

210 215 220

Ile Met Gly Lys Pro Met Met Asp Pro Ser Met Tyr Gly Gln Gln Ser

225 230 235 240

His Pro Tyr Met Ala Pro Gln Met Trp Pro Gln Ala Pro Glu Gln Gln

245 250 255

Gln Gln Gln Gln Gln Ser Pro Ser Asp His

260 265

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

atggatcagc aaggacatgg 20

<210> 5

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

ctaatgatca gatggtgact gctg 24

Claims

1.一种延缓花瓣扩展的方法，其特征在于，所述方法通过抑制植物的RhNF-YC9基因或RhNF-YC9蛋白的表达来实现；其中，所述RhNF-YC9基因具有如SEQ ID NO. 2所示的开放阅读架序列，所述RhNF-YC9蛋白由所述RhNF-YC9基因编码；所述植物为月季。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述基因的全长序列如SEQ ID NO. 1所示。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述RhNF-YC9蛋白的氨基酸序列如SEQ IDNO. 3所示。

4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述RhNF-YC9蛋白的氨基酸序列如SEQ IDNO. 3所示。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述植物为月季鲜切花。

6.抑制RhNF-YC9基因或RhNF-YC9蛋白表达的试剂在如下方面的应用：

（1）延缓植物花朵开放的花瓣扩展；和/或

（2）减小花瓣尺寸；

其中，所述RhNF-YC9基因具有如SEQ ID NO. 2所示的开放阅读架序列，所述RhNF-YC9蛋白由所述RhNF-YC9基因编码；

其中，所述植物为月季。

7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述基因的全长序列如SEQ ID NO. 1所示。

8.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述RhNF-YC9蛋白的氨基酸序列如SEQ IDNO. 3所示。

9.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述延缓植物花朵开放的花瓣扩展为延缓植物花朵开放初期的花瓣扩展。

10.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述应用通过调控植物体内乙烯与赤霉素的之间的交互作用来实现。

11.根据权利要求10所述的应用，其特征在于，所述应用通过下调植物体内赤霉素20氧化酶和/或上调植物体内赤霉素2-β-双加氧酶的作用来实现。

12.根据权利要求6至11中任一项所述的应用，其特征在于，通过抑制RhNF-YC9基因或RhNF-YC9蛋白的表达来延缓花瓣扩展。

13.根据权利要求12所述的应用，其特征在于，通过至少部分地沉默RhNF-YC9基因来实现所述延缓。

14.根据权利要求13所述的应用，其特征在于，选择RhNF-YC9基因的3’端来沉默RhNF- YC9基因。

15.根据权利要求6至11中任一项所述的应用，其特征在于，所述应用为使花瓣的下表皮细胞的尺寸下降和/或使单位面积内花瓣的下表皮细胞数量增加。

16.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述植物为月季鲜切花。