CN104823055B - 支链氨基酸的nmr定量 - Google Patents

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Abstract

本发明大体上涉及使用NMR定量支链氨基酸。本发明特别适用于人体血浆或血清的NMR分析。

Description

支链氨基酸的NMR定量
相关申请
本申请要求2012年10月9日提交的美国临时申请序号No. 61/711,471和2013年6月5日提交的美国临时申请序号No. 61/831,353的权益和优先权，它们的内容就像在本文中充分叙述那样并入本文作为参考。本申请还要求2013年3月13日提交的美国专利申请序号No. 13/801,604、2013年3月14日提交的美国专利申请序号No. 13/830,199、2013年3月14日提交的美国专利申请序号No. 13/830,784、2013年5月16日提交的PCT 申请序号No.PCT/US2013/041274、2013年5月30日提交的PCT 申请序号No. PCT/US2013/043343和2013年6月7日提交的PCT 申请序号No. PCT/US2013/044679的优先权并且是它们的部分继续申请案，它们的内容就像在本文中充分叙述那样并入本文作为参考。
发明领域
本发明大体上涉及使用NMR定量支链氨基酸。本发明特别适用于人体血浆或血清的NMR分析。
背景
包括缬氨酸、异亮氨酸和亮氨酸在内的支链氨基酸（BCAAs）可能与各种疾病，如代谢病有关联。它们也可用于治疗性干预和作为膳食补充剂。
概述
本发明的实施方案提供用于至少一种支链氨基酸的NMR定量的方法、系统、电路、分析器和计算机程序产品。
本发明的实施方案涉及定量来自患者的体外未过滤生物样品中的支链氨基酸（BCAA）的方法。该方法可包括电子获取包括所述生物样品的目标拟合区域的复合NMR谱；使用具有至少一个BCAA拟合区域的指定去卷积模型将所述复合NMR谱电子去卷积；和使用计算拟合函数电子生成所述至少一种BCCA的测量值。
本发明的实施方案提供测定BCAAs浓度的方法。该方法可包括将至少一个未过滤的体外血清或血浆样品置于具有静磁场B0的NMR波谱仪中；电子获取所述样品的NMR谱，其包括与多种BCAAs相关的峰；使用指定的曲线拟合函数将所述NMR谱去卷积；由所述去卷积谱计算与各自的BCAAs相关的无单位强度信号；然后使用计算出的强度信号值与相应BCAAs的已知浓度的各自相关性电子计算所述多种BCAAs的浓度。
对于所述多种BCAAs的每一种，可以使用与在至少正常生物范围内的浓度相关的各自的指定线性方程进行浓度的所述电子计算。
该线性方程任选还包括高和/或低值的离群值。
该方法可包括对于去卷积前的各样品的各NMR谱，电子评估NMR谱中的至少一个参考峰以评定磁场不均匀性和/或选择适当的拟合函数或其线宽。所述至少一个参考峰的线宽和/或线形与磁场B0不均匀性和/或均匀性相关联。
该方法可包括对所得NMR谱中的BCAA峰施加标量耦合信息，由此促进去卷积过程中的拟合。
该标量耦合信息可识别无论磁场强度如何都分隔以赫兹为单位测得的一致距离的多个峰，去卷积可包括可约束至等于或接近该距离的分隔距离的拟合函数，由此约束该拟合。
该方法可包括对于各样品，在去卷积之前，电子测定各自样品中存在的至少一个内源性或外源性参考峰的位置、线形和/或线宽，所述参考峰具有依赖于B0的均匀性的形状特征。
该方法可包括使用至少一个参考峰计算测定去卷积步骤之前各自样品的各NMR谱的线形和/或线宽特征以计入与各自的独立NMR谱相关的磁场均匀性特征的差异，然后选择包含具有与所述至少一个参考峰对应的线宽和/或线形的拟合函数的指定去卷积模型，以便可以使用(a) 不同拟合函数和/或(b) 不同线宽不同地评估不同样品。
在一些实施方案中，浓度的电子计算可包括对各BCAA采用被定义为浓度 vs无单位强度信号相关性的线性函数的标量浓度值。
在一些实施方案中，所述多种BCAAs可包括缬氨酸、异亮氨酸和亮氨酸，并且可以使用用蛋白质和脂蛋白组分拟合的基线进行去卷积。
该方法可包括在去卷积之前，电子评估所得NMR谱中与所述样品的内源性或外源性分析物或组分相关的至少一个pH化学位移不变参考峰，然后测定所述NMR谱中的BCAA峰的位置。
在一些实施方案中，对于每个样品的单个NMR谱，可以使用大约10秒至大约5分钟的NMR采集时间（AT）进行所述电子获取。
在一些实施方案中，对于各个样品NMR谱，可以使用大约16-96次扫描进行所述电子获取，并且每个样品可以使用单个NMR谱进行BCAA浓度的电子计算。
该方法可包括传送脉冲序列，相比于来自小分子BCAAs的信号，该脉冲序列以更大的程度减弱来自样品中的脂蛋白和蛋白质的信号。
在一些实施方案中，该脉冲序列可包括减弱脂蛋白和蛋白质信号的具有指定延迟的Carr-Purcel-Meiboom-Gill（CPMG）脉冲序列。
该CPMG脉冲序列可具有大约60毫秒至大约400毫秒的延迟。在一些实施方案中，该CPMG脉冲序列可具有大约100毫秒的延迟。
根据一些实施方案, 该CPMG脉冲序列可具有大约200毫秒的延迟，且该方法可包括电子校正计算浓度的与BCAAs的信号强度衰减相关的定量误差，所述信号强度衰减与CPMG脉冲序列相关。
在一些实施方案中，该CPMG脉冲序列可具有大约300毫秒的延迟，且该方法可包括电子校正计算浓度的与BCAAs的信号强度衰减相关的定量误差，所述信号强度衰减与CPMG脉冲序列相关。
在另一些实施方案中，该CPMG脉冲序列可具有大约400毫秒的延迟，且该方法可包括电子校正计算浓度的与BCAAs的信号强度衰减相关的定量误差，所述信号强度衰减与CPMG脉冲序列相关。
在某些实施方案中，该方法可包括在样品位于NMR波谱仪中的同时传送第一脂蛋白脉冲序列和获取与样品中的脂蛋白和蛋白质相关的第一NMR谱并在用于获取BCAAs的NMR谱的第一脉冲序列之前或之后传送配置成减弱蛋白质和脂蛋白信号的第二脉冲序列以获取与BCAAs相关的NMR谱。这两种脉冲序列和随后的NMR谱都可以在每样品大约2分钟至大约6分钟的NMR信号采集时间内获取。
在一些实施方案中，该方法可包括在所述获取步骤之前使各自的样品流入NMR波谱仪。可通过以每8小时大约50至250个未过滤样品的速率连续获取各自的NMR谱来进行所述获取。
在一些实施方案中，所述多种BCAAs包括缬氨酸、异亮氨酸和亮氨酸，且缬氨酸和亮氨酸可以使用比异亮氨酸少的与所得NMR谱相关的扫描定量。
在一些实施方案中，可以使用16-96次扫描生成用于计算缬氨酸和亮氨酸的NMR谱。可以使用96次扫描生成用于计算异亮氨酸的 NMR谱。
在一些实施方案中，可以使用各BCAA的各自指定线性浓度方程进行所述电子计算以提供至少正常生物浓度范围的临床相关浓度测量。
在一些实施方案中，第一脉冲序列可包括图6中所示的脉冲序列。
在一些实施方案中，该方法可包括电子计算预测临床结果或疾病风险或确认药物或候选药物的效力的比率或加权指数。该比率或加权指数可具有下列至少一项：(a) 包含一种或多种BCAAs的至少一个无单位信号或计算浓度的分子；(b) 包含一种或多种BCAAs的至少一个无单位信号或计算浓度的分母；或(c) 包括一种或多种BCAAs的至少一个无单位信号或计算浓度的分子和分母。
在一些实施方案中，该方法可包括电子计算预测临床结果或疾病风险或确认药物或候选药物的效力的比率和/或加权指数。该比率或加权指数在分母或分子中包括或在分母和分子中都包括一种或多种BCAAs的至少一个无单位信号或计算浓度。
该方法可包括，在一些实施方案中，电子计算预测临床结果或疾病风险或确认药物或候选药物的效力的比率和/或加权指数，其中该比率和/或加权指数在分母或分子中包括或在分母和分子中都包括一种或多种BCAAs的至少一个无单位信号或计算浓度和氨基酸的无单位信号或浓度测量值。
本发明的某些实施方案涉及配置成提供BCAAs的测量的电路。该电路包括至少一个配置成执行本发明的任何方法的步骤的处理器。
本发明的另一些实施方案涉及用于评估体外患者生物样品的计算机程序产品。该计算机程序产品包括：非暂时性计算机可读存储介质，其具有收录在所述介质中的计算机可读程序代码。该计算机可读程序代码包括配置成使用指定拟合函数将具有各自的未过滤患者样品的支链氨基酸（BCAA）峰的NMR谱去卷积的计算机可读程序代码；由所述去卷积谱计算与各自的BCAAs相关的无单位强度信号的计算机可读程序代码；和配置成提供在所述无单位强度信号下的BCAAs浓度的计算机可读程序代码。
该计算机程序产品可以配置成执行本发明的一种或多种方法。
另一些实施方案涉及一种系统。该系统包括用于获取各自的体外生物样品的至少一个NMR谱的NMR波谱仪，所述NMR波谱仪具有静磁场B0；和与所述NMR波谱仪联通的至少一个处理器。所述至少一个处理器配置成，对于各自的生物样品，使用获取的至少一个NMR谱：使用指定拟合函数将所述NMR谱去卷积；由所述去卷积谱计算与各自的BCAAs相关的无单位强度信号；然后使用计算出的强度信号值与相应BCAAs的已知浓度的各自相关性计算所述多种BCAAs的浓度。
在一些实施方案中，所述至少一个处理器可以配置成使用至少一个参考峰计算测定去卷积步骤之前各自样品的各NMR谱的线形和/或线宽特征以计入与各自的独立NMR谱相关的磁场均匀性特征的差异，然后选择包含具有与所述至少一个参考峰对应的线宽和/或线形的拟合函数的指定去卷积模型，以便可以使用(a) 不同拟合函数和/或(b) 不同线宽不同地评估不同样品。
在一些实施方案中，所述至少一个处理器可以配置成在将各自的NMR谱去卷积以定量BCAA信号之前，评估各自的所得NMR谱中与所述样品的内源性或外源性分析物或组分相关的至少一个pH化学位移不变参考峰，然后测定所述NMR谱中的BCAA峰的位置。
在一些实施方案中，所述至少一个处理器可以配置成计算预测临床结果或疾病风险或确认药物或候选药物的效力的比率和/或加权指数。该比率和/或加权指数可以在分母或分子中包括或在分母和分子中都包括一种或多种BCAAs的至少一个无单位信号或计算浓度。
所述至少一个处理器在一些实施方案中可通过对各BCAA采用被定义为浓度 vs无单位强度信号相关性的线性函数的标量浓度值来计算各自的浓度。
在一些实施方案中，BCAAs可包括缬氨酸、异亮氨酸和亮氨酸，并且可以使用用蛋白质和脂蛋白组分拟合的基线进行去卷积。
在一些实施方案中，该系统可以配置成在样品位于NMR波谱仪中的同时传送第一脂蛋白脉冲序列以获取与样品中的脂蛋白和蛋白质相关的第一NMR谱并在用于获取BCAAs的NMR谱的第一脉冲序列之前或之后传送配置成减弱蛋白质和脂蛋白信号的第二脉冲序列以获取与BCAAs相关的NMR谱。这两种脉冲序列和随后各自的NMR谱都可以在每样品大约2分钟至大约6分钟的NMR信号采集时间内获取。
在一些实施方案中，所述至少一个处理器可以配置成执行本发明的任何方法。
本领域普通技术人员在阅读下列附图和优选实施方案的详述时会认识到本发明的其它特征、优点和细节，这样的描述仅举例说明本发明。就一个实施方案描述的特征可以与其它实施方案结合，即使没有与其一起具体论述。也就是说，要指出，就一个实施方案描述的本发明的方面可并入不同实施方案中，即使没有与其相关地具体描述。也就是说，所有实施方案和/或任何实施方案的特征可以以任何方式和/或组合形式组合。申请人因此保留修改任何原始提交的权利要求或相应提交任何新权利要求的权利，包括能够修正任何原始提交的权利要求以依赖于和/或包含任何其它权利要求的任何特征（尽管没有以这种方式提出原始权利要求）的权利。在下述说明书中详细解释本发明的前述和其它方面。
本领域技术人员根据本公开会认识到，本发明的实施方案可包括方法、系统、装置和/或计算机程序产品或其组合。
附图简述
图1是可根据本发明的实施方案用于计算至少一种BCAA的NMR测量值的示例性操作的流程图。
图2是显示根据本发明的实施方案的缬氨酸、异亮氨酸和亮氨酸的定量拟合的一个实例的NMR谱。
图3A-I是根据本发明的实施方案的BCAAs示例性线性浓度换算模型的曲线图。
图4是根据本发明的实施方案在目标支链氨基酸甲基区域周围的1H NMR谱的放大图。
图5以根据本发明的实施方案的相同NMR谱中的各自指定的峰区域的放大图显示对三种BCAAs的示例性拟合。
图6是根据本发明的实施方案使用具有WET溶剂抑制的标准“单脉冲”程序的示例性脉冲序列。
图7图解根据本发明的特定实施方案修改成包括CPMG序列以减弱与大分子和大聚集体，如蛋白质和脂蛋白相关的信号的图6中的第一脉冲序列。
图8是根据本发明的实施方案具有各自不同的延迟持续时间的CPMG获取的1H NMR谱阵。
图9是根据本发明的实施方案的图8的谱阵的放大图。
图10是根据本发明的实施方案具有BCAA评估模块和/或电路的系统的示意图。
图11是根据本发明的实施方案的NMR波谱装置的示意图。
图12 是根据本发明的实施方案的数据处理系统的示意图。
图13是可根据本发明的实施方案用于计算BCAA的NMR测量值的示例性操作的流程图。
图14A是根据本发明的实施方案的NMR缬氨酸试验程序的流程图。
图14B是可根据本发明的实施方案在获取生物样品的NMR信号之前使用的示例性预分析处理的流程图。
图14C是可用于根据本发明的实施方案使用NMR评估缬氨酸的操作的流程图。
在下述说明书中详细解释本发明的上述和其它目的和方面。
本发明的实施方案的详述
下面参照附图更充分描述本发明，其中显示本发明的实施方案。但是，本发明可以具体体现为许多不同的形式并且不应被视为局限于本文中阐述的实施方案；相反，提供这些实施方案以使本公开充分和完整，并向本领域技术人员充分传达本发明的范围。
在通篇中同样的数字是指同样的元件。在附图中，为清楚起见，可能放大某些线、层、部件、元件或特征的厚度。除非另有规定，虚线显示任选特征或操作。
本文所用的术语仅用于描述特定实施方案而无意限制本发明。除非上下文清楚地另行指明，本文所用的单数形式“一”和“该”旨在也包括复数形式。还要理解的是，术语“包含”在本说明书中使用时规定了所述特征、整数、步骤、操作、元件和/或部件的存在，但不排除一个或多个其它特征、整数、步骤、操作、元件、部件和/或其组合的存在或加入。本文所用的术语“和/或”包括一个或多个相关罗列项的任何和所有组合。本文所用的如“X至Y之间”和“大约X至Y之间”之类的短语应被解释为包括 X和Y。本文所用的如“大约X至Y之间”之类的短语是指“大约X至大约Y之间”。本文所用的如“大约X至Y”之类的短语是指“大约X至大约Y”。
除非另有规定，本文使用的所有术语（包括技术和科学术语）具有与本发明所属领域的普通技术人员通常理解的相同的含义。还要理解的是，如常用词典中定义的术语应被解释为具有与它们在本说明书的上下文和相关领域中的含义一致的含义，而不应以理想化或过于形式的意义解释，除非在本文中明确地如此规定。为简洁和/或清楚起见，没有详细描述公知的功能或结构。在术语冲突的情况下，以本说明书为准。
要理解的是，尽管在本文中可能使用术语第一、第二等描述各种元件、部件、区域、层和/或区段，但这些元件、部件、区域、层和/或区段不应受这些术语限制。这些术语仅用于将一个元件、部件、区域、层或区段区别于另一区域、层或区段。因此，下文论述的第一元件、部件、区域、层或区段可以被称作第二元件、部件、区域、层或区段而不背离本发明的教导。除非明确地另行指示，操作（或步骤）的次序不限于权利要求或附图中陈述的次序。
术语“以编程方式（programmatically）”是指使用计算机程序和/或软件、处理器或专用集成电路（ASIC）指导的操作执行。术语“电子”及其派生词是指使用具有电路和/或模块的装置而非通过思维步骤执行的自动化或半自动化操作，并且通常是指以编程方式执行的操作。术语“自动化”和“自动”是指可以在最低限度的人力或输入下或不用人力或输入执行的操作。术语“半自动化”是指允许操作人员做出一些输入或激活，但计算和信号采集以及离子化成分的浓度的计算是电子进行的，通常以编程方式进行，而不需要人工输入。
本文所用的术语“大约”是指规定值或数值的+/- 10%（均值或平均数）。
本文所用的“支链氨基酸”和“BCAA”是指至少一种下列氨基酸：缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸。如本领域技术人员已知，支链氨基酸是具有支链烷基侧链的氨基酸。缬氨酸具有化学式：HO2CCH(NH2)CH(CH3)2。亮氨酸具有化学式：HO2CCH(NH2)CH2CH(CH3)2。异亮氨酸具有化学式：HO2CCH(NH2)CH(CH3)CH2CH3。
当通过NMR测量BCAA时，该值可以是强度的无单位测量值。强度标是恒定的，以便可以直接比较在相同条件下获得的来自不同样品的信号强度。可以将强度与浓度相关联。可以使用校准数据将该BCAA无单位测量值乘以指定换算系数以将该无单位值换算或转化成浓度单位，如µmol/L浓度单位。
可能需要基于拟合过程之前的实验条件调节BCAA测量。也就是说，一种或多种BCAAs的实际浓度的评估可基于在可能引发NMR谱中的变化或偏离的与标准或基线实验条件不同的实验条件下评估的各自样品的强度、线宽和/或线形。可以当场和/或在时间上与各自样品的NMR数据的采集接近地自动或电子测定一个或多个实验条件，以评定能随不同样品定制所用去卷积模型的一个或多个实际实验条件。
本文所用的术语“实验条件”可包括，但不限于，样品pH、水抑制程度、与脉冲序列（如CPMG延迟）相关的BCAA峰衰减、磁场的均匀性、样品制备（例如样品的适当混合和/或将样品添加到流动池中以使其完全填满流动池）、仪器的shim状态和它们的任何组合。
术语“CAD”和“CHD”可互换使用以分别对应于患者或对象产生或患上冠状动脉疾病和/或冠心病的风险。术语心血管疾病（CVD）是指通常为CHD + 中风的综合后果。
如本文所用的化学位移位置（ppm）涉及内部参考在2.519 ppm的CaEDTA信号的NMR谱。因此，本文中论述和/或要求保护的标注峰位置可以如本领域技术人员公知的那样随如何生成或参考化学位移而变。因此，为清楚起见，某些所描述和/或所要求保护的峰位置如本领域技术人员公知的那样在其它相应化学位移中具有对等的不同峰位置。
术语“生物样品”是指人或动物的体外血液、血浆、血清、CSF、唾液、灌洗液、痰、尿或组织样品。本发明的实施方案特别适用于评定人体血浆、血清或尿液生物样品。血浆、血清或尿液样品可以是禁食的或非禁食的。在本发明的某些实施方案中，该生物样品可以是未过滤的人体血浆或人体血清。
该生物样品可以是未处理的。如本文所用的“未处理的生物样品”是指不同于用于质谱分析的样品制备，在其获得后未经受除去该生物样品中的组分的处理的生物样品。因此，一旦从人或动物中获得该生物样品，不从该生物样品中除去组分。例如，一旦获得血清生物样品，该血清不经受从血清中除去组分的处理。在一些实施方案中，未处理的生物样品未经受过滤和/或超滤处理。未处理的生物样品的一个实例是含有脂蛋白和蛋白质组分以及小分子代谢物的完整补集的未过滤生物样品。
本领域技术人员会认识到，可以将本领域技术人员已知的各种添加剂、标准品和/或稀释剂添加到生物样品中以助于识别和/或定量该生物样品中的组分，如BCAAs和/或提供实验控制。但是，将添加剂、标准品和/或稀释剂添加到生物样品中不是指或不包括在获得生物样品后除去该生物样品中的组分的处理。在某些实施方案中，该生物样品是未过滤的生物样品并用稀释剂稀释。
可以将稀释剂添加到生物样品中以形成样品混合物。合适的稀释剂包括，但不限于，缓冲液和/或参考或校准分析物，如本领域技术人员已知的那些。示例性的缓冲液包括，但不限于，酸性缓冲液，例如但不限于，柠檬酸盐、磷酸盐和/或乙酸盐缓冲液。在一些实施方案中，该稀释剂可包含pH缓冲剂。术语“pH缓冲剂”是指为了在NMR谱中产生指定的pH引发的NMR峰位移而添加到生物样品中的化学品或化学品集合。示例性的pH缓冲剂包括，但不限于，柠檬酸盐磷酸盐缓冲剂（例如柠檬酸和磷酸氢二钠，例如C6H8O7·H2O和Na2HPO4·7H2O）。例如，该生物样品可包含具有大约2.6至大约5.5的pH并含有柠檬酸、柠檬酸钠和/或磷酸钠的柠檬酸盐缓冲剂和/或柠檬酸盐磷酸盐缓冲剂。其它示例性的缓冲剂包括，但不限于，具有大约3.7至大约5.5的pH并含有乙酸、乙酸钠和/或磷酸钠的乙酸盐缓冲剂和/或乙酸盐磷酸盐缓冲剂。在一些实施方案中，该生物样品包含含有柠檬酸和磷酸氢二钠的柠檬酸盐磷酸盐缓冲剂。通常，将pH缓冲剂与去离子水混合并添加到生物样品中以将样品稀释指定量。但是，在使用pH缓冲剂时，其也可以直接添加到液体或组织生物样品中。在一些实施方案中，在可具有4-10的pH，例如但不限于大约7-8的pH或大约7.2-7.6的pH的样品混合物（例如生物样品和稀释剂或稀释的生物样品）上进行NMR分析。
生物样品、稀释剂和/或缓冲剂可含有一种或多种内源性和/或外源性参考分析物，包括但不限于，例如，白蛋白、葡萄糖、柠檬酸盐、乙酸盐或其它酸性化合物以及任何公认的化学位移或定量参考分析物，例如甲酸盐、三甲基甲硅烷基丙酸盐（和同位素标记的异构体）、4,4-二甲基-4-硅杂戊烷(silapentane)-1-磺酸（DSS）、CaEDTA和EDTA中的一种或多种。
在一些实施方案中，生物样品含有至少一种内源性或外源性参考分析物。例如，参考分析物可生成与内源性或外源性分析物相关的一个或多个参考峰。内源性参考分析物的一个实例是例如，但不限于，存在于生物样品中的葡萄糖。在一些实施方案中，该参考分析物具有pH稳定的化学位移或定量峰，意味着在4-10的pH范围内的参考峰的峰区和/或线宽基本不随pH改变（例如峰区改变小于大约± 0.1 ppm）或化学位移位置和/或尺寸响应pH变化以已知或可预测的方式改变。
在一些实施方案中，该稀释剂可包含或可以是参考或校准分析物，例如但不限于，CaEDTA和/或柠檬酸盐。
该样品混合物可包含10:90至90:10的生物样品/稀释剂比。在某些实施方案中，该生物样品/稀释剂比为50:50。可以将缓冲剂和/或其它添加剂，例如参考或校准分析物添加到样品混合物中。在某些实施方案中，缓冲剂可以使该混合物中的生物样品量最大化（例如提供55:45或更大的生物样品/稀释剂缓冲剂比）。在一些实施方案中预计可以分析低体积生物样品，如≤ 50微升或大约10微升至大约50微升。
术语“患者”以广义使用并且是指提供测试或分析用的生物样品的个体、人类或动物。
术语“临床疾病状态”是指可能表明医疗干预、疗法、治疗调整或对某一治疗（例如药物）和/或监测的排除适当的风险医疗状况（at-risk medical condition）。临床疾病状态的可能性的识别允许临床医师相应地治疗、延迟或抑制该状况的发作。临床疾病状态的实例包括，但不限于，代谢紊乱如糖尿病、CHD、CVD、中风、2型糖尿病、前驱糖尿病、肝病、癌症和癌性恶病质。
术语“CPMG”是指Carr-Purcel-Meiboom-Gill脉冲序列。这是一系列相位确定的（phase defined）射频脉冲，其提供减弱来自大的快速弛豫（relaxing）分子，如蛋白质和脂蛋白粒子的信号的手段。
响应指定的脉冲序列生成单个NMR谱。例如，使用单脉冲序列获得一个NMR谱和/或使用CPMG 脉冲序列获得一个NMR谱。通常，每个NMR谱使用多次扫描，如大约16-96次扫描来获取信号以使用信号平均法生成相关的NMR谱以使信号具有改进的信噪比（SNR）。
本发明的实施方案可提供使用NMR定量生物样品中的一种或多种支链氨基酸（BCAAs）的简单、快速和方便的检测法。在该检测中，可以使用未过滤样品的NMR谱实现所有三种BCAAs的分别定量，任选借助参考分析物生成参考峰。该样品可具有外源性和/或内源性参考分析物，它们提供至少一个可评估与NMR波谱仪的B0静磁场的不均匀性相关联的线宽和/或线形的参考峰。对于各样品，可以自动或在时间上与各自样品或样品组的NMR采集时间接近地使用参考峰评估shim状态或B0均匀性/不均匀性。
可以配置去卷积模型以基于如对用于BCAA定量的各样品NMR谱测定的参考峰线宽和/或线形选择具有适当线宽和/或线形的计算拟合函数（CFF）（例如曲线拟合函数）。
可以分别定量生物样品中的两种或三种BCAAs。
在某些实施方案中，根据本发明的实施方案的NMR分析可提供生物样品中存在的三种BCAAs的综合测量以生成缬氨酸、异亮氨酸和亮氨酸的综合无单位分数或浓度测量值而非单独的离散分数或浓度。
可以进行一种或多种BCAAs，例如至少缬氨酸和亮氨酸的定量浓度测量以提供如下表1中所示的使用加标透析标准品的测量。该校准数据预计可提供浓度测量，在健康人群中的平均浓度下的测得变异系数（CV）百分比（% CVs）小于15%。
表1: 加标透析BCAA测量
BCAAs可能是能量代谢的核心组分。在一些实施方案中，根据本发明的实施方案的NMR分析可提供至少一种BCAA与至少一种BCAA或与一组BCAAs的比率。可基于指定BCAAs的不同组合生成该比率，因此该组合可包括样品中存在的一种或多种BCAAs。或者或另外，根据本发明的实施方案的NMR分析可提供一种或多种BCAAs与另一代谢产物的比率。该比率可具有诊断价值并可用于评估患者的临床疾病状态和/或提供代谢状态或其它治疗或诊断信息。例如，根据本发明的实施方案可以获得至少一种BCAA与至少一种芳族氨基酸（例如苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸和组氨酸）的比率并可用于预测和/或诊断肝病和/或提供用于治疗被诊断出肝病的患者的信息。在一些实施方案中，可以根据本发明的实施方案计算Fischer's比率（即该生物样品中的所有三种BCAAs的总和/苯丙氨酸和酪氨酸的总和）。至少一种BCAA与其它示例性代谢产物的比率包括，但不限于，如参与糖酵解和/或b-氧化途径的那些代谢产物。在一些实施方案中，可以电子计算或获取与BCAA组分的比率。
可以根据本发明的实施方案实现生物样品中的特定BCAA的识别和定量。在一些实施方案中，在各自的生物样品中识别至少三种BCAAs（即缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸）并可以使用单一NMR谱分别定量生物样品中的三种BCAAs的每一种。
或者或另外，可以生成BCAAs的综合分数或浓度。
在一些实施方案中，可以计算具有BCAAs的至少一个无单位信号或浓度的加权指数、比率或含加权指数的比率。可以基于对各自疾病的结果的回归分析生成该比率和/或加权指数，其预测临床结果或疾病风险或确认药物或候选药物的效力。该加权指数可以加权大于另一BCAA组分的一个或多个BCAA无单位信号或测量值或可以将另一些风险分量一起相乘以形成患者的健康或风险指示分数或指数。在下列实例中，“V”是指缬氨酸，“IL”是指异亮氨酸，且“L”是指亮氨酸。比率包括，但不限于：V/(L+IL)；I/IL；V/L；IL/V；V/(IL)；(VL)/IL等。加权指数包括，但不限于：例如V*GlycA/V(IL)(L): IL/L(10)+V；V(L)(IL)/Lx10和V/(ILx10)。
根据本发明的一些实施方案，方法可包括使用脉冲序列获取未过滤样品的NMR谱（图1，方框100）。该脉冲序列可以抑制或减弱该谱中的大分子信号（例如脂蛋白和蛋白质信号），任选地，可以优化该脉冲序列。本文所用的术语“优化”是指配置该脉冲序列以减弱该NMR谱中的大分子信号以消除或充分降低对小分子BCAAs的干扰，以便定量一种或多种BCAAs。
可以以最多40%（例如通常大约2%至大约30%）抑制小分子（即分子量最多大约500道尔顿或更小的化合物或分子）信号的方式进行大分子信号的抑制。为了至少更大的衰减，可以生成该抑制以产生可任选使用一种或多种定量调节系数和/或模型进行调节的可预测衰减。
在某些实施方案中，具有脉冲序列的NMR谱可生成脂蛋白和/或蛋白质信号并且可以在计算上计入这些信号以便定量BCAAs。
任选地，可以识别和/或评估一个或多个参考峰（例如2、3、4或更多个）以识别和/或定量各自BCAA的目标BCAA峰（方框110）。这些参考峰可以与内源性和/或外源性参考分析物相关联，它们可以是pH化学位移不变参考峰。pH化学位移“不变”参考峰是在大约4至大约10的pH内pH不敏感并具有在+/- 0.1 ppm内的化学位移位置的峰。
可以电子评估所述一个或多个参考峰以测定它们的位置、线形和/或线宽。所述一个或多个参考峰可用于测定实验条件，例如但不限于，样品pH和/或磁场不均匀性。可以测定各样品的所述一个或多个参考峰并用于评估各样品NMR谱。所述一个或多个参考峰因此可用于选择指定的计算（例如曲线）拟合函数、CFE的线宽和/或用于测定一个或多个BCAA峰的位置和/或各自的BCAA的测量值/浓度。
可以使用计算（例如曲线）拟合模型将该NMR谱去卷积（方框120）。该模型可包括指定的数学去卷积函数。该模型可包括对目标BCAA峰位置的具有测定的线形和/或线宽的拟合函数。该模型可包括如图5中所示的具有基线贡献的计算拟合函数。该拟合函数可以是任何合适的函数，如Lorenztians或Gaussians。
在一些实施方案中，该拟合模型可涉及使用BCAAs的标量耦合。标量耦合是下述波谱现象：其中无论磁场强度如何，化学物类都生成分隔以赫兹为单位测得的一致距离的多个峰。该拟合函数可约束至等于或非常接近这种距离的分隔距离，以约束该拟合过程。
然后基于BCAA峰面积测定BCAA浓度（方框130）。可以由线性数学方程获得浓度换算数据或可以使用相关的校准线或图表或查找表等测定各自的BCAA浓度。在与最终分析中所用相同的波谱条件（如图3A-I中所示）下获取校准谱。如图3A-I中所示，亮氨酸、缬氨酸和异亮氨酸的典型生物范围分别为大约98.7 ± 11.5 µM、212.3 ± 62.3 µM和60.7 ±18.6 µM。在一些实施方案中，该校准数据可能包括通常小于10%的核弛豫性质的小差异。
各自的单一BCAA测量值或浓度可以独自或与另一BCAA测量值或浓度或其它代谢产物测量值或浓度结合用于评估患者的临床疾病状态和/或提供代谢状态或其它治疗或诊断信息。在一些实施方案中，对于特定的治疗或诊断结果，可以使用回归模型将BCAA组分关联到不同BCAA组分的综合BCAA数值或分数、加权指数和/或BCAA比率中。
在一些实施方案中，可以配置脉冲序列以减弱未过滤生物样品中的脂蛋白和蛋白质。一个实例是CPMG序列。也可以根据本发明的实施方案实现生物样品中的其它组分（例如代谢产物），例如但不限于，其它氨基酸（例如芳族氨基酸）、有机酸、2-羟基丁酸、GlycA、GlycB和/或脂蛋白的识别和/或定量。
在一些实施方案中，可以用样品混合物在大约7或大约7.4的pH下进行BCAA和芳族氨基酸的识别和/或定量。
BCAA峰区可落在大约0.85 ppm至大约1.10 ppm之间（在大约47℃样品温度下）。缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸在大约47℃样品温度下的峰位置可列在图2中的表中。
在NMR谱的BCAA区域的建模中，实验和/或合成模型可用于BCAA。可通过已知作用于这一区域的各蛋白质和脂蛋白组分的CPMG处理过的实验谱将基线建模。该模型也可以使用合成函数，例如但不限于，线性、二次和多项式函数以拟合基线分量。该拟合方法可采用Lawson-Hanson非负线性最小拟合法以实现实验谱和模型化谱之间的最佳吻合。
图3A-I显示BCAAs的示例性分析模型。在这一实例中，使用100 ms延迟的CPMG脉冲序列。如图3A-C中可以看出，亮氨酸和缬氨酸的分析模型基于16次扫描，异亮氨酸基于96次扫描。图3D-F显示基于96次扫描的缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸的原始面积NMR值，图3G-I显示图3D-F中的各缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸值的换算NMR浓度（µM）。可以对各BCAA的正常生物范围适当标准（appropriating norms）计算这些浓度。如Psychogios等人(2011) TheHuman Serum Metabolome. PLoS ONE 6(2): e16957, 表3. 通过NMR测定的血清代谢产物的浓度(均值 +/- 标准偏差) 中所述，亮氨酸、缬氨酸和异亮氨酸的典型生物范围分别为98.7 ± 11.5 µM、212.3 ± 62.3 µM和60.7 ± 18.6 µM。
根据本发明的一些实施方案，不需要内部或外部参考分析物就可以实现未过滤生物样品中存在的至少三种BCAAs的分别定量。
与波谱仪的匀场相关的B0均匀性/不均匀性可能影响未过滤生物样品中的BCAAs的精确定量。因此，在一些实施方案中，可以通过随样品选择具有CFF或其线宽的去卷积模型来进行定量。例如，对于各样品，可以评估该波谱中的指定参考峰的线宽和/或线形。参考峰可包括，但不限于，EDTA峰和/或柠檬酸盐峰。
可以根据本发明的实施方案获得至少一种支链氨基酸的信号（signature）。所有三种支链氨基酸的示例性信号（signature）显示在图2中，其显示该波谱的BCAA区的拟合。图2中所示的信号（signature）获自血清与柠檬酸盐缓冲剂（即稀释剂）的75:25混合物。使用16次扫描的CPMG实验以大约90秒的采集时间和100 ms CPMG脉冲串收集数据。该模型包括这三种BCAAs各自的计算导出的基函数以及实验蛋白质和脂蛋白函数。也可以由这种实验获得代谢产物（包括氨基酸和有机酸）的信号的识别和/或定量。根据本发明的一些实施方案，可以将如本文所述的BCAAs定量实验附加到用于各自生物样品的高通量分析的标准Lipoprofile®脂蛋白分析中。
图4显示在支链氨基酸甲基区域周围的1H NMR谱的放大图。上部波谱用96次扫描获取，下部波谱用16次扫描获取。在一些实施方案中，可以使用比异亮氨酸少的扫描计算亮氨酸和缬氨酸的浓度。可以使用同一NMR谱计算各BCAA。可以使用相同扫描数或不同扫描数计算各BCAA。
根据本发明的实施方案的生物样品中的BCAA的定量测量值可用于测定患者患上或产生一种或多种指定的临床疾病状态的可能性。BCAAs可能与代谢疾病，如糖尿病（例如2型糖尿病）、CHD、肝病和癌症相关联。因此，本发明的检测可用于测定患者的临床疾病状态。在一些实施方案中，根据本发明的实施方案的检测可用于测定患者产生疾病，例如但不限于代谢疾病的风险（例如患者发生糖尿病的风险）。
根据一些实施方案，根据本发明的实施方案的检测可用于疾病预测和/或干预结果。在某些实施方案中，该检测可用作患者的胰岛素敏感度改善的预测手段和/或测定患者的血糖控制是否已改善。在另一些实施方案中，该检测可用于测定患者的肝再生是否增强或患者，如癌症患者的肌肉萎缩是否减弱。在一些实施方案中，该检测可用于测定在被诊断出消耗综合征和/或严重炎性疾病（例如败血症、外伤、烧伤等）的患者中补充BCAA的潜在益处和/或需求。在另一些实施方案中，该检测可用于指导和/或监测BCAAs在营养补充和/或健康、身心健康（wellness）和/或运动表现的改善中的应用。
指定的数学去卷积模型可用于定量BCAA。可以将该“复合”或测得的信号包络Cm去卷积以定量BCAA和其它起作用的组分，如脂蛋白亚类组分的信号贡献。该去卷积计算影响测得的信号形状的组分的信号幅度并计算这些组分的总和。计算出的信号C与测得的信号Cm之间的密切匹配表明该去卷积成功地将构成NMR信号的组分建模。
根据本发明的实施方案可以使用曲线拟合函数或技术。该曲线拟合可以使用可随生物样品而变的不同基函数集，它们可以不包括或包括一个或多个与目标BCAA峰相邻的邻近BCAA峰。
可以用非负最小二乘方拟合程序实现该线形去卷积（Lawson, CL, Hanson RJ,Solving Least Squares Problems, Englewood Cliffs, NJ, Prentice-Hall, 1974）。这避免使用尤其在低信噪比波谱中会造成误差的负浓度。在数学上，在Otvos, JD,Jeyarajah, EJ和Bennett, DW的论文 Clin Chem, 37, 377, 1991中详细描述了对脂蛋白的线形分析。也可以使用合成基线校正函数以计入与残余蛋白质组分的基线偏差。这可采用二次函数或其它多项式函数的形式。测定加权因子并可通过使实验和计算谱之间的均方根偏差最小化来优化该拟合。关于去卷积复合NMR谱用于测量脂蛋白亚类的描述，参见例如美国专利Nos. 4,933,844和6,617,167，它们的内容就像在本文中充分叙述那样并入本文作为参考。关于将具有重叠信号贡献的化学成分去卷积的程序的描述，也参见美国专利No.7,243,030，其内容就像在本文中充分叙述那样并入本文作为参考。
图5显示这三种BCAAs的示例性计算拟合。左图显示来自右图的NMR谱的支链氨基酸甲基信号周围的1H NMR谱区的放大图的各BCAA区域。对于各氨基酸，已经框起用于定量的一个或多个目标峰。左图显示“实际”谱（黑色）、“拟合”谱（浅灰色）以及相关的拟合分量（下方）。拟合分量（例如高斯或洛伦兹或两者）可含有将目标分析物的贡献以及来自如蛋白质、脂蛋白和已知波谱仪诱发偏移之类来源的贡献建模的实验和/或计算导出的峰和/或函数。在一些实施方案中，拟合分量可含有将目标分析物的贡献以及来自如蛋白质和脂蛋白之类来源的贡献建模的实验和计算导出的峰和函数。这些因数和模型还可提供本领域技术人员已知的波谱仪诱发偏移，如DC偏移。
脉冲序列参数包括任何适当的参数，包括溶剂抑制方案、脉冲角和采集时间。但是，一般而言，在一些特定实施方案中，对于任一生物样品，每次扫描的NMR信号采集时间可以为大约2-7秒（平均），通常大约5-6秒（平均），如大约5.6秒（平均）。在一些实施方案中，总采集时间为大约90秒（平均）或最多大约5或10分钟（平均）。可以配置NMR分析仪以获得每个生物样品至少10次扫描，通常10-256次扫描，如16次扫描，和可能≥ 96，如96次扫描或128次扫描，每个样品在4400 Hz扫描宽度内收集至少大约16K数据点，以获得用于测量BCAA的NMR数据。可以在通常使用不同脉冲序列以便定量脂蛋白的脂蛋白扫描序列之前或之后进行BCAA扫描。
在一些实施方案中，脉冲序列中的一个要素可以是溶剂抑制方案。WET溶剂抑制方案使用在例如大约80毫秒过程中的一系列成形脉冲和脉冲场梯度。该1D NOESY-预饱和（presat）方案使用2D 核磁Overhauser效应谱（Nuclear Overhauser EffectSpectroscopy）（NOESY）实验的一阶增量（Beckonert, O.；Keun, H. C.；Ebbels, T. M. 等人 Nat. Protoc. 2007, 2, 2692-2703）。在这种方案中，在D1和“混合”时间过程中施加对水共振的连续低功率选频脉冲。PURGE溶剂抑制方案（Simpson, A. J.；Brown, S. A. J. Magn. Reson. 2005, 175, 340-346）使用对水共振的连续低功率选频脉冲、弛豫梯度和回波以减弱水信号。
所有三种序列（和本领域技术人员已知的可能其它序列）的性能足以实现该波谱中的一致溶剂抑制。换言之，可以使用CPMG获得BCAA NMR信号并可以包括WET、PRESAT和/或PURGE程序作为脉冲序列的一部分。WET序列的一个优点在于其不涉及可能通过自旋扩散干扰蛋白质基线的任何低功率饱和期。其也没有可通过弛豫造成信号衰减的任何明显延迟。
如公知的是，在脉冲序列中可以使用标准预饱和（“Presat”）脉冲序列以获得用于分析BCAA信号的NMR谱。这种脉冲序列涉及以水共振为目标并持续几秒的选择性低功率脉冲。这在NMR实践中是公知的并且是用于减弱水信号的稳健可靠的方法。
在一些实施方案中，可以使用WET水抑制方案。该WET序列涉及以水共振为目标的一系列短选择性脉冲。如Presat那样将整个方案前置到脉冲序列上，但只需要例如大约80毫秒。WET序列的另一优点是这一序列仅对蛋白质信号造成极小干扰的事实。由于典型的Presat序列的长度，一些溶剂饱和可能转移到蛋白质中，这会导致蛋白质对基线的贡献不一致。可以使用其它溶剂预饱和方案，例如PURGE序列。
本文中的某些附图的流程图和方框图图解了本发明的分析模型和评估系统和/或程序的可能的实施方案的架构、功能和操作。就此而言，流程图或方框图中的各方框代表包含一个或多个用于执行指定逻辑功能的可执行指令的模块、区段、操作或部分代码。还应指出，在一些备选实施方案中，方框中指示的功能可能不以附图中指示的次序进行。例如，根据所涉及的功能，相继显示的两个方框可能实际上基本同时执行，或方框有时可能以相反次序执行。
图6图解具有WET溶剂抑制的标准“单脉冲”序列。这产生在波谱中以来自高浓度的蛋白质和大分子聚集体（例如脂蛋白粒子）的信号为主的波谱。浓度越低，在这些波谱中越多地掩盖小分子代谢产物。如图6中所示，WET溶剂抑制方案（Smallcombe, S. H.；Patt, S.L.；Keifer, P. A. J. Magn. Reson., Ser. A 1995, 117, 295-303）包括一系列溶剂导向的选择性脉冲和脉冲场梯度，接着读数脉冲和采集时间，在此期间将该信号数字化固定的时间量。
图7中所示的第二序列包括CPMG脉冲串或序列。这种脉冲串包括一系列重聚π脉冲（180度），在此期间减弱来自大的快速弛豫（relaxing）分子的信号。可以优化这种脉冲串的持续时间以使来自大分子，例如蛋白质和脂蛋白粒子的背景信号最小化，同时保持来自小分子，如BCAA的大部分信号强度。将这一值设定为100毫秒，但可以使用其它延迟。例如，可以将CPMG脉冲序列延迟设定为60毫秒、100毫秒、200毫秒、300毫秒或400毫秒。因此，图7中所示的CPMG脉冲串被设计成减弱来自大分子的信号，这有助于许多更小分子代谢产物的检测。这一脉冲序列依赖于来自大分子的信号比小分子弛豫得快得多的事实。自旋回波序列可以在读数脉冲之后发生并被设计成在来自大分子的信号弛豫回平衡的同时保持小分子磁化。这种自旋回波序列的持续时间与大分子信号的衰减程度有关。通常将这一延迟设定在大约60毫秒至大约400毫秒之间（图8）。预计在大约60毫秒至大约150毫秒的范围内几乎没有可察觉的性能变化。在一些情况下，如果提高蛋白质和脂蛋白的衰减的益处抵消降低的信噪比，可以将这一延迟设定至高达大约400毫秒。在一些实施方案中，可以使用调整因子校正由该脉冲序列造成的BCAA NMR信号的衰减。
为了获得来自一种分子的提高的（例如最大）信号，可以使用90度脉冲并且这些脉冲之间的时间应该超过该信号的纵向弛豫时间（T1）的10倍。BCAA在400 MHz下的T1可以为大约1.5至大约3秒。这可能不是用于使信号强度最大化的时间有效的手段，因此可以在脉冲长度与脉冲间延迟之间作出折衷。信号强度、T1和脉冲长度之间的关系由恩斯特角方程给出。使用这一方程时的第一步骤是规定整个脉冲序列的长度。该长度由所需的溶剂抑制期、CPMG延迟和提供FID的所需数字化需要的数据采集期的长度确定。恩斯特角方程如下：
Cos (θ) = exp -(总延迟)/T1 方程(1)
在方程(1)中，总延迟等于d1延迟（包括溶剂抑制）、CPMG时间加上采集时间。T1代表相关分析物信号的纵向弛豫时间。要指出，在包含“总延迟”的括号前的是负号。对θ的求解给出最佳翻转角。
使用标准的实验条件集，例如1秒溶剂抑制期、100毫秒CPMG和大约3秒的采集时间，恩斯特角可以规定从90度降到60至80度之间的顶角（当以微秒描述时也被称作脉冲长度）。该方程在这一区域中相对不敏感，因此校准中的小误差或由具体样品组成造成的T1的小差异不太可能造成明显的低效率。
采集时间（AT）是将FID数字化的时间。AT的持续时间取决于要定量的信号的弛豫时间和所需的数字化。如果被检查的信号的弛豫时间比AT长，则FID会被截断，以致信号具有差的形状。如上所述，BCAA的T1弛豫时间在血清中小于大约3秒，因此用于一次扫描的采集时间应至少这么长。波谱仪的数字化速率，即每秒采集时间获取的点数，取决于该谱的扫描宽度。在一些实施方案中，所需的数字分辨率使用在4400Hz扫描宽度内收集的至少16K数据点。
提高检测灵敏度的最直接方式是增加扫描数。在一些实施方案中，可以在大约47℃下对样品进行BCAA分析，以使这种分析容易与来自LipoScience, Inc. (Raleigh, NC)的现有LipoProfile®分析交错或一起使用。但是，随着扫描数增加，样品在47℃下在探针中的停留时间增加并且样品可能变性。挑战是实现BCAA峰的所需信噪比以便在所需生物范围（至少是具有负面临床关系的那些）内准确和精确定量。
在一些实施方案中，该NMR分析可包括生物样品中存在的各BCAA的单独定量和/或至少三种BCAAs的总定量（即BCAAs的定量总和），并且可以在用于临床考虑的患者报告中提供各定量测量值。单个体外生物样品中的BCAAs的单独或总定量预计可提供重要的临床信息和/或进一步改进患者具有临床疾病状态的风险或处于提高的临床疾病状态的风险中的预测或评估。
图8显示根据本发明的实施方案的CPMG获取的1H NMR谱阵。使用抑制大分子，如蛋白质和大分子聚集体，如脂蛋白对该波谱的贡献的CPMG序列获取该波谱。如图7中所示，CMPG脉冲序列可能涉及具有可变延迟的脉冲串，在此期间来自大分子的信号衰减，由此能够检测更多的小分子代谢产物。较长的CPMG延迟时间可能导致这些信号的较大衰减。这种延迟也可能减弱小分子信号，但程度明显更低。图9显示用不同总延迟时间获取的CPMG谱阵的放大图。该放大图聚焦于如上图4中所示的BCAAs的甲基区域。注意到脂蛋白区中的信号明显衰减，而BCAA峰的总强度受到较小影响。
现在参考图10，预计可以使用具有如例如参考下图11和/或美国专利No. 8,013,602中描述的NMR临床分析器22的系统10进行BCAA的定量，它们的内容就像在本文中充分叙述那样并入本文作为参考。分析器22包括波谱仪22s和样品装卸系统。
系统10可包括装载在分析器22上或至少部分远离分析器22的BCAA分析模块和/或电路20。如果是后者，该分析模块或电路20可完全或部分位于服务器150上。可以使用云计算提供服务器150，其包括经计算机网络按需提供计算资源。该资源可具体体现为各种基础设施服务（例如计算机、存储等）以及应用、数据库、文件服务、电子邮件等。在传统计算模型中，数据和软件都通常完全包含在使用者的计算机中；在云计算中，使用者的计算机可能含有很少软件或数据（可能操作系统和/或网络浏览器）并可能仅起到在外部计算机的网络上发生的过程的显示终端的作用。云计算服务（或多个云资源的集合）通常可称为“Cloud”。云存储可包括网络化的计算机数据存储模型，其中数据存储在多个虚拟服务器中而非存放在一个或多个专用服务器中。数据转移可以加密并可以通过因特网使用任何适当防火墙进行以遵守工业或监管标准，如HIPAA。术语“HIPAA”是指Health Insurance Portability andAccountability Act规定的美国法律。患者数据可包括登记号或标识符、性别、年龄和试验数据。
分析结果可以经由计算机网络，如因特网、经由电子邮件等传送给患者、临床医师所在地50、健康保险机构52或药房51。该结果可以从分析站点直接发送或可以间接发送。可以打印出该结果并通过传统邮件发送。也可以将这一信息传送给药房和/或医疗保险公司或甚至患者，其监控可能导致提高的不良事件风险的处方或用药，或给出医疗警示以防止开出冲突的药剂。该结果可以经电子邮件发送到患者、“家庭”计算机或普适计算装置，如智能手机或平板电脑等。该结果可以例如作为整个报告的电子邮件附件或作为文本提示信息。
现在参考图11，图解用于获取和计算所选样品的线形的系统207。系统207包括用于进行样品的NMR测量的NMR波谱仪22s。在一个实施方案中，配置波谱仪22s以在400 MHz下进行质子信号的NMR测量；在另一些实施方案中，可以在200 MHz至大约900 MHz之间或其它合适的频率下进行测量。也可以使用与所需操作磁场强度对应的其它频率。通常，安装质子流探针，以及温度控制器以使样品温度保持在47 +/- 0.5℃。但是，在采集时间过程中可以使用其它样品温度。通过数字计算机214或其它信号处理单元控制波谱仪22。计算机211应该能够执行快速傅里叶变换。其还可包括与另一处理器或计算机213的数据传输器212和可连向硬盘记忆存储单元215的直接存储器存取通道214。
数字计算机211还可包括一组模拟-数字转换器、数字-模拟转换器和慢速器件I/O口，它们经脉冲控制和接口电路216连向波谱仪22s的操作元件。这些元件包括RF发射器217（其产生具有受可位于数字计算机211上或与数字计算机211联通的至少一个数字信号处理器指导的持续时间、频率和幅度的RF激发脉冲）和RF功率放大器218（其放大脉冲并将其耦合到包围样品池220和/或流探针220p的RF发射线圈219上）。线圈220接收该受激样品在由超导磁体221产生的9.4 Tesla极化磁场存在下生成的NMR信号并施加于RF接收器223。放大和过滤的NMR信号在224处解调并将所得正交信号施加于接口电路216，在此将它们数字化并经数字计算机211输入。脂蛋白测量和/或BCAA分析电路20和/或模块350（图11-12）可位于与数字计算机211相关联的一个或多个处理器中和/或可在现场或远程的、可经由全球网络，如因特网227到达的辅助计算机213或其它计算机中。
在测量元件220中从样品中获取NMR数据后，用计算机211处理产生另一文件，其可以按需要存储在存储器215中。这种第二文件是化学位移谱的数字表示，并随后读出到计算机213中以存储在其存储器225或与一个或多个服务器相关联的数据库中。在其存储器中存储的或计算机213可访问的程序的指导下，计算机213（其可以是笔记本电脑、桌面电脑、工作站电脑、电子平板电脑、电子输入板、智能电话或具有至少一个处理器的其它器件或其它计算机）根据本发明的教导处理化学位移谱以生成报告，其可以输出到打印机226或电子存储并转往所需电子邮件地址或URL。本领域技术人员会认识到，也可以使用其它输出器件，如计算机显示屏、电子平板电脑、智能电话等显示结果。
本领域技术人员显而易见的是，计算机213及其单独存储器225执行的功能也可并入波谱仪的数字计算机211执行的功能中。在这种情况中，打印机226可直接连向数字计算机211。也可以使用本领域技术人员公知的其它接口和输出器件。
本发明的某些实施方案涉及提供使用BCAA评估的方法、系统和/或计算机程序产品，其特别可用于临床疾病状态的自动化筛选试验和/或筛选体外生物样品的风险评估。
本发明的实施方案可以呈现完全软件实施方案或兼具软件和硬件方面的实施方案的形式，在本文中都统称为“电路”或“模块”。
本领域技术人员会认识到，本发明可以具体体现为装置、方法、数据或信号处理系统或计算机程序产品。相应地，本发明可以呈现完全软件实施方案或兼具软件和硬件方面的实施方案的形式。此外，本发明的某些实施方案可以为在计算机可用存储介质（其具有收录在该介质中的计算机可用程序代码工具）上的计算机程序产品的形式。可以使用任何合适的计算机可读介质，包括硬盘、CD-ROMs、光学存储器件或磁存储器件。
该计算机可用或计算机可读的介质可以是，但不限于，电子、磁、光学、电磁、红外或半导体系统、装置、器件或传播介质。计算机可读介质的更具体实例（非穷举名单）包括下列：具有一个或多个线的电连接、便携式计算机磁盘、随机存取存储器（RAM）、只读存储器（ROM）、可擦除可编程只读存储器（EPROM或闪存）、光纤和便携式光盘只读存储器（CD-ROM）。要指出，该计算机可用或计算机可读的介质甚至可以是其上打印着该程序的纸或另一合适的介质，因为该程序可通过例如该纸或其它介质的光学扫描电子捕获，然后如果必要，以合适的方式汇编、译码或以其它方式处理，然后存储在计算机存储器中。
可以在面向对象的编程语言，如Java7、Smalltalk、Python、Labview、C++或VisualBasic中写入用于执行本发明的操作的计算机程序代码。但是，也可以在传统程序化编程语言，如“C”编程语言或甚至汇编语言中写入用于执行本发明的操作的计算机程序代码。该程序代码可以全部在使用者计算机上、部分在使用者计算机上、作为独立软件包部分在使用者计算机上且部分在远程计算机上或全部在远程计算机上执行。在后一情况中，该远程计算机可以通过局域网（LAN）或广域网（WAN）连向使用者的计算机，或可以连向外部计算机（例如通过因特网服务提供商的因特网）。
图12是数据处理系统305的示例性实施方案的方框图，其图解根据本发明的实施方案的系统、方法和计算机程序产品。处理器310经由地址/数据总线348与存储器314联通。处理器310可以是任何市售或定制微处理器。存储器314是含有用于执行数据处理系统305的功能的软件和数据的存储器的整个体系的代表。存储器314可包括，但不限于，下列类型的器件：高速缓冲存储器、ROM、PROM、EPROM、EEPROM、闪存、SRAM和DRAM。
如图12中所示，存储器314可包括数据处理系统305中所用的几类软件和数据：操作系统352；应用程序354；输入/输出（I/O）设备驱动器358；BCAA评估模块350；和数据356。BCAA评估模块350可以将NMR信号去卷积以揭示各自的生物样品的质子NMR谱中的指定NMR信号峰区以确定BCAA水平。系统305还可包括一个或多个临床疾病状态评估模块或风险预测模块，其考虑测得的BCAA水平或生成比率、综合风险值或多参数风险模型。
数据356可包括可获自数据或信号采集系统320（例如NMR波谱仪22s和/或分析器22）的信号（成分谱和/或复合谱线形）数据362。本领域技术人员会认识到，操作系统352可以是适合与数据处理系统一起使用的任何操作系统，如来自International BusinessMachines Corporation, Armonk, NY的OS/2、AIX或OS/390；来自Microsoft Corporation,Redmond, WA的WindowsCE、WindowsNT、Windows95、Windows98、Windows2000或WindowsXP；来自Palm, Inc.的PalmOS；来自Apple Computer的MacOS；UNIX、FreeBSD或Linux、专有操作系统或专用操作系统，例如用于嵌入式数据处理系统。
I/O设备驱动器358通常包括应用程序354经操作系统352访问的软件例行程序以与如I/O数据口、数据存储器356和某些存储器314部件和/或图像采集系统320之类的设备联通。应用程序354是执行数据处理系统305的各种功能（features）的程序的实例并可包括至少一个支持根据本发明的实施方案的操作的应用程序。最后，数据356代表应用程序354、操作系统352、I/O设备驱动器358和可能位于存储器314中的其它软件程序使用的静态和动态数据。
尽管在图12中例如在模块350为应用程序的情况下例示本发明，但本领域技术人员会认识到，也可以采用其它配置，同时仍获益于本发明的教导。例如，也可以将BCAA模块350并入操作系统352、I/O设备驱动器358或数据处理系统305的其它此类逻辑部件（logical division）中。因此，本发明不应被解释为局限于图12的配置，其旨在涵盖能够实施本文所述的操作的任何配置。
在某些实施方案中，模块350包括用于提供BCAA水平的计算机程序代码，所述BCAA水平可用作评定临床疾病状态或风险和/或指示是否需要治疗干预和/或追踪治疗的效力或甚至治疗的非预期后果的指标。
图13是可以实施本发明的实施方案的示例性操作的流程图。可以获取生物样品（例如血浆或血清）的拟合区的NMR谱的（测得）复合包络NMR谱（方框400）。使用具有至少一个以指定化学位移位置为中心的BCAA峰区（例如在大约0.85 ppm至大约1.10 ppm之间）的指定模型将该NMR复合信号包络电子去卷积（方框402）。
对于与各BCAA相关的峰区，可以合计指定数量的（例如洛伦兹和/或高斯）曲线拟合函数（方框415）。可以对合计的函数采用换算系数以生成BCAA的计算测量值（方框420）。
可基于与用于获得复合NMR谱的波谱仪的匀场（shim）状态的测量相关的至少一个参考峰的线宽选择CFF或CFF的线宽（方框414）。
可以在患者和/或临床试验报告中提供该BCAA测量值（方框422）。该报告可以至少部分基于BCAA测量值鉴别或警示患者是否有患上或发生临床疾病状态的风险和/或额外的筛选是否适当（方框424）。
图14A-14C是可用于根据本发明的实施方案获得与缬氨酸相关的NMR信号的操作的示例性流程图。
图14A图解可在测定NMR信号的BCAA区域，例如缬氨酸区域（方框625）之前进行分析前评估（方框610），然后去卷积（方框650）。图14B图解示例性的分析前评估610，其包括将样品输入流动池的输送验证（delivery verification）——完全失败（方框612）或部分注射失败（方框613）、匀场验证（方框615）、温度验证（方框617）和柠檬酸盐管检测（失败）（方框619），都使用与添加到样品中的指定稀释剂相关的信号的指定特征。匀场验证可包括采用定量匀场调整因子。可以使用任何合适的参考分析物生成用于分析前评估的参考峰。基于所选参考峰确定该评估中所用的变量。
再参考图14A，一旦证实指定参数在界限内，可以结束分析前质量控制分析（方框620）并可以确认缬氨酸区域的测定（方框625）并将波谱去卷积和计算缬氨酸水平（方框650）。任选地，可以电子执行分析后质量控制（方框655）并输出结果（方框660）。该结果可以与评语、高或低的视觉标记等一起包括在试验报告中（方框665）。
参考图14C，显示可用于定量缬氨酸的操作的示例性方法/分析700。可以用指定的外加稀释剂电子获取体外生物样品的NMR信号（方框702）。可以进行QC评估（方框710）。测定缬氨酸区域（方框725）。将缬氨酸区域去卷积（方框750d）并计算缬氨酸的NMR导出值（750c）。
稀释剂可包含参考分析物，例如乙二胺四乙酸钙（Ca EDta）（方框703）或产生可靠峰并以可预测的方式工作的其它合适的稀释剂。公认的化学位移或定量参考分析物包括，例如，甲酸盐、三甲基甲硅烷基丙酸盐（和同位素标记的异构体）和EDTA。
分析前质量控制评估710可基于参考峰，例如CaEDTA参考峰的特征的检查，并且该系统或处理器可以配置成不执行缬氨酸测试，除非已在如图14B中所示的规定条件下获取NMR谱。在用于NMR扫描/信号采集的流动池中，样品温度可以为47 ± 0.5℃。该样品可以以1:1比率（方框705）或其它指定比率（例如更多样品、更少稀释剂或更多稀释剂；更少样品，例如2:1或更多样品、更少稀释剂，例如1:2）包含稀释剂。
如果对于任何获取的波谱，CaEDTA高度> 140，可以用指定错误代码拒绝该试验样品（方框719）。这种高值表明与CaEDTA峰一起检出柠檬酸盐峰。由于试样收集在不适当的柠檬酸盐管中而引入柠檬酸盐峰。通过干扰定位CaEDTA峰的确切位置的能力，该柠檬酸盐峰会干扰测定缬氨酸区域的过程。
缬氨酸区域相对于CaEDTA峰的位置位于高场。在缬氨酸下的宽峰是脂蛋白的各种甲基（-CH3-）质子。可以在大约22258 ± 398个数据点测定CaEDTA位置（方框721）。可以对各获取的波谱独立测定缬氨酸区域。缬氨酸信号可以用合适的数据点建模，对于四重峰的各峰，使用例如25个数据点（中心± 12个数据点），或对于双二重峰的缬氨酸区域，使用300个数据点，但可以使用其它数量的数据点。可以使用缬氨酸四重峰的一个、两个、三个或所有四个峰进行缬氨酸的测量。
可以在被非负最小二乘方算法利用之前线性插入所有基组谱。待分析的波谱和基组谱在被非负最小二乘方算法利用之前可具有零基线偏移修正。
缬氨酸区域的起点可以在CaEDTA峰位置高场大约2196-4355个数据点，在包括双二重峰时通常为后者（“缬氨酸区域偏移”）（方框722）。在一些实施方案中，缬氨酸区域的起点在CaEDTA峰位置高场4355个数据点。
在一些实施方案中，通过将在0.0-1.01 ppm之间的缬氨酸共振表征为双二重峰，进行缬氨酸定量。可以使用间隔2个数据点的三个或更多个缬氨酸实验谱作为基组以将缬氨酸信号建模。可通过使三个缬氨酸组分滑移+/- 15个数据点来定位中心缬氨酸峰并通过最小二乘方总和最小化测定。可以用总共大约300个数据点将缬氨酸信号建模。该拟合算法可以使用实验或计算导出函数的指定标量耦合模式以助于约束和优化该拟合。
各基组，包括用于基线的那些但不包括DC偏移，是从该函数中减去最低值的偏移（使最低点等于0）。这防止在它们呈现的形状中包括DC偏移。
使用已处理至与获取的波谱相同的预处理类型的一系列分析物和基线函数将来自各获取的波谱的缬氨酸区域去卷积。可以将各组分的去卷积系数乘以相关的换算因数。将所得值求和。可以平均对于各获取的波谱独立地生成的结果值以生成用于该测量的最终值。
可以由1:1稀释样品使用预饱和水抑制获取数据，并包括大约16次扫描，通常为作为8组（各2次）存储的大约16次扫描（8个FIDs，各由2次扫描构成）（方框726）。
与预饱和水抑制联合使用的脉冲序列可任选包括预饱和（水抑制）脉冲和合适的激发脉冲。例如，可以用9024个数据点以4496.4 Hz的扫描宽度获取FIDs，但如本领域技术人员已知，可以使用其它数据点和扫描宽度。可以将各FID乘以移位（shifted）高斯函数：
或以计算机术语表示，exp(–((t–gfs)/gf)^2)，其中gfs = 0.2秒且gf = 0.2秒。
这可以在傅里叶变换之前用零填充进行，其对于各FID产生由16,384个数据点构成的频域GM谱（方框727）。可以将各FID乘以数学函数以提高信噪比（例如衰减指数）和/或分辨率（例如高斯型函数和/或其任何移位形式）。该波谱可以使用校准指定的相位值定相。该波谱可以通过校准指定的放大系数放大（倍增）。可以在被非负最小二乘方算法利用之前线性插入所有基组谱。待分析的波谱和基组谱在被非负最小二乘方算法利用之前可具有零基线偏移修正（例如可以线性插入用于待分析的模型和波谱的所有分量）（方框728）。为了测定缬氨酸拟合区的中心，可以将在0.9至1.0之间的缬氨酸共振表征为双二重峰，并可以通过使三个缬氨酸组分滑移+/- 15个数据点来识别中心峰（方框729）。
上文举例说明本发明并且不应被视为对其的限制。尽管已经描述了本发明的若干示例性实施方案，但本领域技术人员容易认识到，可以在示例性实施方案中作出许多修改而不实质背离本发明的新颖教导和优点。因此，在如权利要求书中规定的本发明的范围内意在包括所有这样的修改。在权利要求中，如果使用功能性限定（means-plus-function）条款，其意在涵盖本文中描述的执行所述功能的结构并且不仅涵盖结构等同物，还涵盖等同结构。因此，要理解的是，上文举例说明本发明并且不应被视为局限于所公开的具体实施方案，在所附权利要求书的范围内意在包括对所公开的实施方案的修改以及其它实施方案。通过下列权利要求限定本发明，其中包括权利要求的等同物。

Claims (34)

1.测定支链氨基酸浓度的方法，其包括：
将至少一个未过滤的体外血清或血浆样品置于具有静磁场B0的NMR波谱仪中；
电子获取所述样品的NMR谱，其包括与多种支链氨基酸相关的峰；
使用指定的曲线拟合函数将所述NMR谱去卷积，其中使用用蛋白质和脂蛋白组分拟合的基线进行去卷积；
由去卷积的谱计算与各自的支链氨基酸相关的无单位强度信号；然后
使用计算出的强度信号值与相应支链氨基酸的已知浓度的各自相关性电子计算所述多种支链氨基酸的浓度，其中所述支链氨基酸包含缬氨酸、异亮氨酸和亮氨酸。
2.权利要求1的方法，其中对于所述多种支链氨基酸的每一种，使用与在至少正常生物范围内的浓度相关的各自的指定线性方程进行浓度的所述电子计算，任选地为了提供临床相关的浓度测量。
3.权利要求1的方法，其进一步包括，对于去卷积前的各样品的各NMR谱，电子评估NMR谱中的至少一个参考峰以评定磁场不均匀性和/或选择适当的拟合函数或其线宽，其中所述至少一个参考峰的线宽和/或线形与磁场B0不均匀性和/或均匀性相关联。
4.权利要求1的方法，其进一步包括对所得NMR谱中的支链氨基酸峰施加标量耦合信息，由此促进去卷积过程中的拟合。
5.权利要求1的方法，其进一步包括，对于各样品，在去卷积之前，电子测定各自样品中存在的至少一个内源性或外源性参考峰的位置、线形和/或线宽，所述参考峰具有依赖于B0的均匀性的形状特征。
6.权利要求1的方法，其进一步包括使用至少一个参考峰计算测定去卷积步骤之前各自样品的各NMR谱的线形和/或线宽特征以计入与各自的独立NMR谱相关的磁场均匀性特征的差异，然后选择包含具有与所述至少一个参考峰对应的线宽和/或线形的拟合函数的指定去卷积模型，以便可以使用(a) 不同拟合函数和/或(b) 不同线宽不同地评估不同样品。
7.权利要求4的方法，其中所述标量耦合信息识别无论磁场强度如何都分隔以赫兹为单位测得的一致距离的多个峰，且其中所述去卷积包含可约束至等于或接近所述距离的分隔距离的拟合函数，由此约束所述拟合。
8.权利要求1的方法，其中所述浓度的电子计算包括对各支链氨基酸采用被定义为浓度 vs无单位强度信号相关性的线性函数的标量浓度值。
9.权利要求1的方法，其进一步包括，在所述去卷积之前，电子评估所得NMR谱中与所述样品的内源性或外源性分析物或组分相关的至少一个pH化学位移不变参考峰，然后测定所述NMR谱中的支链氨基酸峰的位置。
10.权利要求1的方法，其中对于每个样品的单个NMR谱，使用大约10秒至大约5分钟的NMR采集时间（AT） 进行所述电子获取。
11.权利要求9的方法，其中对于各个样品NMR谱，使用16-96次扫描进行所述电子获取，并且其中使用每个样品的单个NMR谱进行支链氨基酸浓度的所述电子计算。
12.权利要求1的方法，其进一步包括传送脉冲序列，相比于来自小分子支链氨基酸的信号，该脉冲序列以更大的程度减弱来自样品中的脂蛋白和蛋白质的信号。
13.权利要求12的方法，其中所述脉冲序列包含减弱脂蛋白和蛋白质信号的具有指定延迟的Carr-Purcel-Meiboom-Gill（CPMG）脉冲序列。
14.权利要求13的方法，其中所述CPMG脉冲序列具有大约60毫秒至大约400毫秒的延迟。
15.权利要求14的方法，其中所述CPMG脉冲序列具有大约100毫秒的延迟。
16.权利要求14的方法，其中所述CPMG脉冲序列具有大约200毫秒的延迟，且所述方法进一步包括电子校正计算浓度的与支链氨基酸的信号强度衰减相关的定量误差，所述信号强度衰减与CPMG脉冲序列相关。
17.权利要求14的方法，其中所述CPMG脉冲序列具有大约300毫秒的延迟，且所述方法进一步包括电子校正计算浓度的与支链氨基酸的信号强度衰减相关的定量误差，所述信号强度衰减与CPMG脉冲序列相关。
18.权利要求14的方法，其中所述CPMG脉冲序列具有大约400毫秒的延迟，且所述方法进一步包括电子校正计算浓度的与支链氨基酸的信号强度衰减相关的定量误差，所述信号强度衰减与CPMG脉冲序列相关。
19.权利要求1的方法，其中所述方法包括在样品位于NMR波谱仪中的同时传送第一脉冲序列和获取与样品中的脂蛋白和蛋白质相关的第一NMR谱，并在用于获取支链氨基酸的NMR谱的第一脉冲序列之前或之后传送配置成减弱蛋白质和脂蛋白信号的第二脉冲序列以获取与支链氨基酸相关的NMR谱，其中这两种脉冲序列和随后的NMR谱都在每样品大约2分钟至大约6分钟的NMR信号采集时间内获取。
20.权利要求1的方法，其进一步包括在所述获取步骤之前使各自的样品流入NMR波谱仪，且其中通过以每8小时50至250个未过滤样品的速率连续获取各自的NMR谱来进行所述获取。
21.权利要求1的方法，其中所述多种支链氨基酸包括缬氨酸、异亮氨酸和亮氨酸，且其中缬氨酸和亮氨酸使用比异亮氨酸少的与所得NMR谱相关的扫描定量。
22.权利要求1的方法，其中使用16-96次扫描生成用于计算缬氨酸和亮氨酸的NMR谱，且其中使用96次扫描生成用于计算异亮氨酸的 NMR谱。
23.权利要求1的方法，其中使用各支链氨基酸的各自指定线性浓度方程进行所述电子计算以提供至少正常生物浓度范围的临床相关浓度测量。
24.权利要求1的方法，其进一步包括电子计算预测临床结果或疾病风险或确认药物或候选药物的效力的比率和/或加权指数，其中所述比率或加权指数在分母或分子中包含或在分母和分子中都包含一种或多种支链氨基酸的至少一个无单位信号或计算浓度。
25.配置成提供支链氨基酸的测量的电路，其包括：
至少一个配置成执行权利要求1-24中任一项的方法的处理器。
26.用于评估体外患者生物样品的装置，所述装置包括：
使用指定拟合函数将具有各自的未过滤患者样品的支链氨基酸峰的NMR谱去卷积的模块，其中使用用蛋白质和脂蛋白组分拟合的基线进行去卷积；
由去卷积的谱计算与各自的支链氨基酸相关的无单位强度信号的模块；和
提供在所述无单位强度信号下的支链氨基酸浓度的模块，其中所述支链氨基酸包含缬氨酸、异亮氨酸和亮氨酸。
27.权利要求26的装置，其配置成执行权利要求2-24中任一项的一种或多种方法。
28.一种系统，其包括：
用于获取各自的体外生物样品的至少一个NMR谱的NMR波谱仪，所述NMR波谱仪具有静磁场B0；和
与所述NMR波谱仪联通的至少一个处理器，所述至少一个处理器配置成，对于各自的生物样品，使用获取的至少一个NMR谱：
使用指定拟合函数将所述NMR谱去卷积，其中使用用蛋白质和脂蛋白组分拟合的基线进行去卷积；
由去卷积的谱计算与各自的支链氨基酸相关的无单位强度信号；然后
使用计算出的强度信号值与相应支链氨基酸的已知浓度的各自相关性计算多种支链氨基酸的浓度，其中所述支链氨基酸包含缬氨酸、异亮氨酸和亮氨酸。
29.权利要求28的系统，其中所述至少一个处理器配置成使用至少一个参考峰计算测定去卷积步骤之前各自样品的各NMR谱的线形和/或线宽特征以计入与各自的独立NMR谱相关的磁场均匀性特征的差异，然后选择包含具有与所述至少一个参考峰对应的线宽和/或线形的拟合函数的指定去卷积模型，以便可以使用(a) 不同拟合函数和/或(b) 不同线宽不同地评估不同样品。
30.权利要求28的系统，其中所述至少一个处理器配置成在将各自的NMR谱去卷积以定量支链氨基酸信号之前，评估各自的所得NMR谱中与所述样品的内源性或外源性分析物或组分相关的至少一个pH化学位移不变参考峰，然后测定所述NMR谱中的支链氨基酸峰的位置。
31.权利要求30的系统，其中所述至少一个处理器配置成计算预测临床结果或疾病风险或确认药物或候选药物的效力的比率和/或加权指数，其中所述比率和/或加权指数在分母或分子中包含或在分母和分子中都包含一种或多种支链氨基酸的至少一个无单位信号或计算浓度。
32.权利要求30的系统，其中所述至少一个处理器通过对各支链氨基酸采用被定义为浓度 vs无单位强度信号相关性的线性函数的标量浓度值来计算各自的浓度。
33.权利要求30的系统，其中所述系统配置成在样品位于NMR波谱仪中的同时传送第一脉冲序列以获取与样品中的脂蛋白和蛋白质相关的第一NMR谱并在用于获取支链氨基酸的NMR谱的第一脉冲序列之前或之后传送配置成减弱蛋白质和脂蛋白信号的第二脉冲序列以获取与支链氨基酸相关的NMR谱，其中这两种脉冲序列和随后各自的NMR谱都在每样品大约2分钟至大约6分钟的NMR信号采集时间内获取。
34.权利要求30的系统，其中所述至少一个处理器配置成执行权利要求1-24中的任一方法。
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