JP4358814B2

JP4358814B2 - 試料の解析方法

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Publication number: JP4358814B2
Application number: JP2005325070A
Authority: JP
Inventors: 中村　　文彦
Original assignee: Kao Corp
Current assignee: Kao Corp
Priority date: 2005-11-09
Filing date: 2005-11-09
Publication date: 2009-11-04
Anticipated expiration: 2025-11-09
Also published as: JP2007132752A

Description

本発明は、試料の解析方法に関する。さらに詳しくは、パルスフーリエＮＭＲ（核磁気共鳴）スペクトルからのシグナルの分離による試料の解析方法及びパルスフーリエＮＭＲスペクトルのデータ処理方法に関する。より詳しくは、パルスフーリエＮＭＲスペクトルのシグナルごとに緩和時間が異なることを利用してスペクトルからシグナルを分離し、各緩和時間におけるシグナルの解析を行うことを利用した試料の解析方法及びデータ処理方法に関する。

パルスフーリエＮＭＲによる試料の解析方法では、装置の性能、試料の状態などによってシグナルの分解能が低い場合や、シグナルの分解能に別段の問題がなくても複数のシグナルのケミカルシフトの差が著しく小さい場合、波形分離を要することが多い。

波形分離については、これまでにも数多くの研究がなされており、単一のスペクトルからでも、標準波形のフィッティングによる分離や、数学的処理によるデコンボリューションなどの方法が採られている。

しかし、標準波形のフィッティングには、もともとの波形分離状態が悪い場合、シグナルの位置などの前提条件を与えないと一義的な解が得られないことがあるなどの課題がある。また、数学的処理によるデコンボリューションでは、データのノイズレベルが低くなければ、信頼しうる結果が得られないことがある。

また、二次元的なＮＭＲスペクトルの測定を行い、複数のスペクトルから解析を行う方法として、分子の並進拡散挙動の違いを利用し、磁場勾配ＮＭＲにより行うＤＯＳＹ〔(Diffusion Ordered SpectroscopY)、以下、ＤＯＳＹという〕(例えば、非特許文献１参照)が知られている。これは、同じ分子に属する核からのシグナルは、同じ並進拡散挙動を示すことを利用して混合物のＮＭＲスペクトルを測定し、混合物に含まれている単品のスペクトルを抽出する方法である。

しかし、この方法は、シグナルの分離法ではあるが、シグナルの分解能の向上を意図したものではない。すなわち、同じ分子内に存在する核からのシグナルは分離されることがなく、信頼しうる結果を得るためには、それぞれの自己拡散係数が大きく異なっていることを必要とする。また、この方法には、磁場勾配ＮＭＲスペクトルの測定を行うことができる特殊なプローブも必要である。
C.S.Johnson, Progress in Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy 34(1999), p.203-256

本発明の課題は、ＮＭＲスペクトルの周波数分解能が不十分な場合の波形分離、及び個々のシグナルを有する試料の状態解析を可能とする方法を提供することにある。

波形分離や数学的処理によるデコンボリューションでは、あらかじめピークの位置が決まっていたり、データのノイズレベルが著しく低かったりするために必要となる前提条件が多い。これは、一次元のスペクトルでは、基本的には同定する情報が少ないからであると考えられる。そこで、何らかの他の物理量の情報を付加することが考えられ、前記ＤＯＳＹでは、自己拡散係数を利用している。シグナルごとに異なることが予想される物理量は、すべてのシグナルの分離に対して有効であり、特殊な装置を使用しなくても測定可能な物理量であることが望ましい。

本発明者は、そのような物理量として、パルスフーリエＮＭＲの緩和時間に着目し、パルスフーリエＮＭＲの測定方法に本質的に存在する、個々の成分の違いによる緩和時間の違いを波形分離に利用することができることを見出した。

すなわち、本発明は、
（１）試料のパルスフーリエＮＭＲスペクトルの測定の際に、ＮＭＲスペクトルの遅延時間依存性を利用してシグナルの分離と緩和時間の算出を並行して行い、前記シグナルの形状及び緩和時間を決定する試料の解析方法、および
（２）試料のパルスフーリエＮＭＲスペクトルの測定の際に、ＮＭＲスペクトルの遅延時間依存性を利用してシグナルの分離と緩和時間の算出を並行して行うＮＭＲスペクトルのデータ処理方法
に関する。

本発明は、ＮＭＲスペクトルの周波数分解能が不十分な場合の波形分離、及び個々のシグナルを有する試料の状態解析を可能とする。

ＮＭＲスペクトルの周波数分解能が不十分となる原因としては、試料が空間的に不均一であること、試料中での化合物の分子運動性が低いなどの試料の性状に由来してピーク幅に広がりがあること、非常に近接した位置に複数のシグナルが現れるという化合物の構造又はその組成上の問題、主として永久磁石が使用された小型の装置や元々性能に劣る装置を使用するなどの装置性能に基づく問題などが考えられている。試料の性状に由来するピーク幅の広がりは、例えば、エマルジョン、サスペンジョン、液体試料が固相に含浸された状態で存在するなどの複数の相が共存していること、化合物の一部が析出していること、化合物が何らかの構造体を形成していること、気泡が混入していることなどによって生じるが、従来、こうした試料は、ＮＭＲの不得意とするところである。
本発明は、それらの欠点を大きく改善するという効果も奏する。

本発明では、試料のパルスフーリエＮＭＲスペクトルの測定の際に、ＮＭＲスペクトルの遅延時間依存性を利用してシグナルの分離と緩和時間の算出を並行して行い、前記シグナルの形状及び緩和時間を決定する。

本発明の方法におけるパルスフーリエＮＭＲスペクトルの測定方法は、その測定原理が通常のパルスフーリエＮＭＲと大きく異なるところがない。したがって、測定の対象となる試料は、従来の^１Ｈ-ＮＭＲや^１３Ｃ-ＮＭＲの測定の際に試料として使用されている有機化合物と同様であればよく、特に限定されない。

測定の対象となる有機化合物としては、例えば、ベンゼン環、糖骨格、ヘテロ環などの環構造を有する化合物、アルキル基やオキシアルキレン基などの鎖状の有機基を有する化合物、アミノ基やカルボキシル基などの官能基を有する化合物などが挙げられる。有機化合物は、単一化合物であってもよく、複数の化合物からなる混合物や組成物であってもよい。

試料は、有機化合物の有機溶媒や無機溶媒などの溶液であってもよい。さらに、試料として、従来、分解能の低さから解析が困難であるとして測定の対象から除外されていた化合物、該化合物の混合物や組成物、該化合物が無機物質中や他の構造体中に存在しているものを用いることもできる。したがって、本発明は、従来、分解能の低さから解析不能として測定の対象から除外されていた化合物についても解析が可能となるので、測定の対象となる試料の範囲を拡張するという利点を有する。

パルスフーリエＮＭＲとしては、一般に採用されている方法であればよく、特に限定がない。

本発明では、ＮＭＲスペクトルの遅延時間依存性を利用してシグナルの分離と緩和時間の算出を行う。シグナルを分離するための手段については、特に限定がなく、種々の手段を利用することができる。例えば、シグナルの分離は、以下のようにして行うことができる。

すなわち、ＣＰＭＧなどの横緩和時間測定用の各種シーケンスを用いて遅延時間τで測定したスペクトルｆ_τ(x)は、Ｉ番目の成分のτ＝０でのスペクトルをｆ_ｉ(x)、その緩和時間Ｔ_２をＴ_２ｉとすると、式(１)：
ｆ_τ(x)＝Σ｛ｆ_ｉ(x)・exp(-τ・１／Ｔ_２ｉ)｝ (１)
で表される。

式(１)は、物理的な意味合いが異なるものの、数学的には、式(２)：
ｆ_{δ，Δ，ｇ}(x)＝Σ｛ｆ_i(x)・exp(-γ^２δ^２ｇ^２（Δ-δ／３）Ｄ_i)｝ (２)
(式中、γは磁気回転比、δは磁場勾配パルス幅、ｇは磁場勾配強度、Ｄ_iはi番目の成分の拡散係数、Δは磁場勾配パルス間隔を示す)
で表される、自己拡散係数の違いを利用してスペクトルの分離を行うＤＯＳＹと同様であることがわかる。なお、式(２)中のＤ_iは式(１)中の１／Ｔ_２ｉに対応し、式(２)中のγ^２δ^２ｇ^２（Δ-δ／３）は式(１)中のτに対応する。

式(２)で表されるＤＯＳＹにおいては、磁場勾配強度（ｇ）、すなわちγ^２δ^２ｇ^２(Δ-δ／３)の値を変えて測定した複数のスペクトルから、各成分化合物のスペクトル及びその自己拡散係数を求めることができるとされている。したがって、緩和測定においても、原理的には、遅延時間τを変化させて測定した複数のスペクトルから、各シグナルのピークとそれらの緩和時間Ｔ_２を求めることができると考えられる。

ＤＯＳＹでは、式(２)で表される関数形に対し、フィッティングを行う方法(参考文献：S.W.Provencher et al. in "Numerical Treatment of Inverse Problems in Differential and Integral Equations”(P.Deuflhard et al. Eds.), Birkhaeuser, Boston, 1983, p.304)や、多変量解析を用いる方法(参考文献：L.C.M. Van Gorkom et al., J. Magn. Reson. 130(1998), p.125)により、スペクトルの解析が行われており、これらの手法は、いずれも本発明に利用することができる。また、より直接的には、逆ラプラス変換を用いることも原理的には可能である。

このようにして、従来、ＤＯＳＹのために考案し、確立された方法を利用することにより、より一般的な緩和時間を利用した波形分離が可能であり、並行して状態解析的に重要な意味を持つ緩和時間も個々のシグナルに対して算出することができる。

ただし、上記の方法は、非常に高精度に測定されたデータを必要とする。そこで、本発明者は、さらに、ノイズレベルの高いスペクトルでも解析可能な方法として、単一シグナルの波形を標準波形と仮定して行う２つの方法を見出し、より汎用性を持たせることにも成功した。

以下に、その２つの方法、すなわち逐次法及び一括フィッティング法によるシグナルの分離について述べる。

〔逐次法によるスペクトルの分離〕
以下に述べる逐次的な操作により、スペクトルを分割する（図１参照。ただし、図１では、便宜上、標準波形としてガウス関数とローレンツ関数の重ね合わせを使用した場合を示しているが、本発明では後述するように他の関数も使用可能である）。

１．シグナルの分離を全成分がすべて消失した状態から遅延時間の長いスペクトルが認識できる状態までの間のいずれかの段階から始め、緩和時間がもっとも長い単一シグナルを決定する。もっとも長い緩和時間Ｔ_２を有する単一シグナルだけが残るような長い遅延時間τでのスペクトルに対して、標準波形となる関数を用いてカーブフィッティングを行い、そのシグナルの位置、幅などの形状を決定するパラメータ(形状因子)を決定する。標準波形となる関数としては、ガウス関数、ローレンツ関数、それらの和やコンボリューションなどの種々のものを利用することができる。

２．徐々に遅延時間を短縮し、緩和時間がより短い成分のシグナルを逐次決定する。
具体的には、前記1に記載のスペクトルよりも少し短い遅延時間τでのスペクトルに対して、ピークの高さだけを変化させてフィッティングを行う。フィッティングが良好であれば、この操作を繰り返す。フィッティングしきれないシグナルが現れたら、次の３に記載の操作を行う。

３．これまでのシグナルでフィッティングしきれない部分が発生しているので、もう１つの標準波形を追加し、その波形因子を決定し、前記２に記載の操作に戻る。

４．前記１〜３に記載の操作を繰り返し、もっとも遅延時間τの短いスペクトルまでフィッティングし終えると、各シグナルの形状因子とシグナル強度の遅延時間τに対する依存性とが決定される。しかし、この段階では、まだ分割処理は終了していない。

５．次に、各成分のシグナル強度を遅延時間τに対して対数プロットし、これが直線上に存在することにより初めて分割が終了する。その傾きが−１／Ｔ_２となることから、該当シグナルの緩和時間Ｔ_２も並行して求められる。

対数プロットが下に凸の曲線になるのであれば、ケミカルシフトは一致するものの、緩和時間Ｔ_２が異なる複数のシグナルからなることがわかる。この場合、複数の緩和時間Ｔ_２を仮定し、カーブフィッティングを行うことにより、緩和時間Ｔ_２の異なる複数のシグナルに分割することができる。

上記の操作を要約すると以下のようになる。遅延時間が異なる一連のスペクトルを測定し、まず、もっとも遅延時間が長いシグナルのみが残ったとみなせる、遅延時間が長いスペクトルから該シグナルの形状因子を決定したうえで、より遅延時間が短いスペクトルに対して強度のみを変化させてフィッティングを行い、強度のみの変化ではスペクトルを再現させることができなくなるたびに新しいシグナルを追加し、その形状因子を決定することにより、各シグナルの形状因子と遅延時間に対する強度変化プロファイルを取得し、個々の強度変化プロファイルに対して単一又は複数の指数関数によるフィッティングを行い、個々の成分の緩和時間を得るとともに成分数を確定させる。

以上の操作により、「ケミカルシフト」及び「緩和時間」のうち、少なくともいずれかが異なるシグナルを分割することが可能であり、各シグナルの形状因子と、緩和時間を一度に求めることができる。

〔一括フィッティング法によるスペクトルの分離〕
シグナルの関数形を仮定し、シグナルの形状因子及び緩和時間をパラメータとして、遅延時間を変化させて測定した一連のスペクトルに対する一括フィッティングによりシグナルの分離を行う。より具体的には、式(１)で表される遅延時間τで測定したスペクトルｆ_τ(x)を用いて、直接、遅延時間τを変化させた一連のスペクトルに対し、一括でカーブフィッティングを行う。

ただし、このとき、データの質が比較的低い場合であっても安定した解析を行うことができるようにするために、少数のパラメータで形状を定義することができる標準波形を仮定する。標準波形としては、ガウス関数、ローレンツ関数、それらの和やコンポリューションなどの種々のものを利用することができる。

なお、フィッティングの操作は、実測されたスペクトルと計算によって再現されたスペクトルとの差(以下、残差という)の二乗和が最小になるように行うのが普通である。しかし、遅延時間τの長い領域のスペクトルの強度が小さいことに起因して絶対的な差が小さくなるため、計算上の重みが小さくなってしまい、遅延時間τの長いシグナルについては、視覚的に大きな不一致を残した状態で計算が収束しやすい。そうした場合、残差を各スペクトルの最大値で規格化して用いることが有効である。

以上のようにして、逐次法又は一括フィッティング法により、スペクトルに含まれている各シグナルを分離し、緩和時間を決定することができる。

したがって、この方法を利用すれば、試料のパルスフーリエＮＭＲスペクトルの測定の際に、ＮＭＲスペクトルの遅延時間依存性を利用してシグナルの分離と緩和時間の算出を並行して行うことにより、試料のＮＭＲスペクトルのデータ処理を行うことができる。

実施例１
特許第３１２３７５７号明細書に記載の「実施例３」に準じて製造した洗剤粒子を用いた。洗剤粒子の主成分は、無機物質と界面活性剤であるが、主な界面活性剤として、直鎖アルキルベンゼンスルホン酸ナトリウムとポリオキシエチレンアルキルエーテルを含んでおり、^１Ｈ-ＮＭＲで検出可能な部位のうち含有量が多いものとしては、両性界面活性剤に共通のアルキル基とポリオキシエチレン鎖（ＥＯ鎖）、及び水分(水酸基)が挙げられる。

以下の^１Ｈ-ＮＭＲの測定方法及び測定条件の下で、前記逐次法により、洗剤粒子の^１Ｈ-ＮＭＲスペクトルの解析を行った。

〔^１Ｈ-ＮＭＲの測定方法〕
直径５ｍｍのＮＭＲ測定用チューブ内に約５ｃｍの高さまで洗剤粒子を入れ、そのままスピニングなしで^１Ｈ-ＮＭＲを測定した。洗剤粒子をＮＭＲ測定用チューブ内に押し込むなどの特別な充填処理を施すことにより緊密充填した場合、その利点よりもむしろ洗剤粒子を破壊するリスクのほうが大きいので、あえて行わなかった。

〔^１Ｈ-ＮＭＲの測定条件〕
・装置： Varian社製、商品名： Inova^UNITY300
・プローブ：Doty 社製、磁場勾配プローブ(最大磁場勾配 300Gauss/cm)
・測定温度：25.0℃
・緩和待ち時間(d1):５ｓ
・走査幅(sw)^*：10000（＊：ピークが非常にブロードなため、広げる必要があった。）

(一次元測定)
・励起パルス幅(pw)：6.5μｓ
・積算回数：100回

(遅延時間τのスペクトルの測定)
・パルスシーケンス：図２に示すＣＰＭＧ法によるパルスシーケンスを採用。図２に示すパルスシーケンスにおける各記号は、以下のことを意味する。
・90度パルス幅(p1)：11.6μｓ
・180度パルス幅(pw)：23.2μｓ
・積算回数：32回
・単位遅延時間(d2)：0.00002ｓ
・遅延時間τ(bt)：0.00008, 0.00016, 0.00032, 0.00064, 0.00128, 0.00256, 0.00512, 0.01024, 0.02048, 0.04096, 0.08, 0.16, 0.32, 0.64, 1.28ｓ
・ｎ：btに達するまで繰り返すことを意味する。

一次元測定(普通の測定条件)の結果は、図３の¹Ｈ-ＮＭＲスペクトルの測定結果に示されるように、極めてブロードなスペクトルとなる。

なお、このような試料の測定には、通常、ＭＡＳ法(マジック角回転法)を用いて分解能の向上を図ることが多いが、用いられた洗剤粒子を高速回転させると遠心力により、界面活性剤と無機物質とが分離し、本来の洗剤粒子の状態とは異なる状態となってしまうため、好ましくない。

ＣＰＭＧ法を用いた測定により得られた遅延時間τの寄与を受けたスペクトルを図４に示す。図４において、その上から順に、遅延時間τが 0.00008、0.00016、0.00032、0.00064、0.00128、0.00256、0.00512、0.01024、0.02048、0.04096、0.08又は0.16のときのシグナル強度を示す。図４に示された結果から、遅延時間τが0.32ｓ以上のところでは、シグナルがもはや観測されなかったが、その直前では、単一ピークと思われる左右対称形になっており、逐次法が適用可能であることがわかる。

図４に示されたデータに対して、逐次法を適用することで決定された３つのピークの強度変化を図５に示す。関数形は、ガウシアンとローレンチアンの和を用いた。

図５に示された結果より、3.3ppm及び4.6ppmにおいては、対数プロットが直線となることから、それぞれ、緩和時間的にも洗剤粒子が単成分で構成されていることがわかるが、1.2ppmにおいては、明らかに下に凸の曲線が描かれているため、洗剤粒子が複数成分で構成されていることがわかる。

そこで、1.2ppmにおけるデータに対しては、さらに図６に示されるように、カーブフィッティングを行い、ピークを２成分に分割した。

以上の操作により、図２に示される遅延時間τが0.00008ｓであるスペクトルは、ケミカルシフト的には、図７示されるように３成分からなり、また、緩和時間も考慮すると、表１に示される４成分からなることがわかる。

実施例２（参考例）
特許第３１２３７５７号明細書に記載の実施例３に準じて製造した洗剤粒子のスペクトルの解析に、前記一括フィッティング法を採用した。

一括フィッティング法のソフトウエアとしては、Microsoft Excel（マイクロソフト社、登録商標）及びそのアドインソフト「ソルバー」（商品名）を使用し、関数形は、ガウシアンとローレンチアンの和とした。

その結果、成分数を増やすに従い、残差二乗和が減少したが、図８のピーク本数とフィッティング残差との関係に示されるように、５成分目の導入はほとんど効果が認められなかった。なお、図８(a)は、ピーク本数に対してフィッティング残差二乗和を対数プロットした結果を示し、図８(b)は、ピーク本数に対してフィッティング残差二乗和をリニアプロットした結果を示す。この結果より、４成分としてフィッティングすることがもっとも適していると判断された。ここで、４成分として同定した場合の結果を図９及び表２に示す。図９は、より詳しくは、遅延時間τ＝0.00008ｓにおける一括フィッティングによるスペクトルの分割結果を示す。表２におけるシグナル強度は、全体を100としたときの相対強度を示す。

比較例１
特許第３１２３７５７号明細書に記載の実施例３に準じて製造した洗剤粒子を用いて、実施例１と同じ条件で測定した一次元スペクトル(遅延時間なし)に対して、ガウシアンとローレンチアンの和を標準波形として用い、フィッティングを行った。その結果を図１０に示す。

図１０に示されるように、一次元スペクトルについては、２つの標準波形を用いるだけで、スペクトル形状を再現することができた。

しかし、遅延時間τが正、すなわち、緩和がある程度進んだスペクトルを再現するには、実施例１及び２で示した３〜４成分が必要であり、これら２つの標準波形を重ね合わせただけでは、適切かつ一義的に再現することができない。
したがって、比較例１における方法では、波形の分離が不十分であることがわかる。

この結果から、通常の一次元測定データからだけでは、波形分離が十分には行えないことが示され、緩和軸を考慮した波形分離の有用性がわかる。

本発明の方法は、各種試料の解析やＮＭＲスペクトルのデータ処理に好適に使用することができる。

逐次法によるスペクトルのピークの分割に関するフローチャートである。実施例１におけるＣＰＭＧパルスシーケンスの説明図である。実施例１における洗剤粒子の¹Ｈ-ＮＭＲスペクトルの測定結果を示す図である。実施例１において、ＣＰＭＧ法を用いた測定により得られた遅延時間τによるスペクトルの変化を示す図である。実施例１において、逐次法を適用することで決定された３つのピークの強度変化を示す図である。実施例１において、カーブフィッティングを行い、ピークを２成分に分割したときの図である。実施例１において、図２に示されたスペクトルが３成分のケミカルシフトからなることを示す逐次法による分割結果を示す図である。実施例１において、ピーク本数とフィッティング残差との関係を示す図である。実施例１において、一括フィッティングによるスペクトルの分割結果を示す図である。実施例１において、通常の方法での波形分離結果を示す図である。

Claims

試料のパルスフーリエＮＭＲスペクトルの測定の際に、ＮＭＲスペクトルの遅延時間依存性を利用してシグナルの分離と緩和時間の算出を並行して行い、前記シグナルの形状及び緩和時間を決定する試料の解析方法であって、前記シグナルの分離を全成分がすべて消失した状態から前記ＮＭＲスペクトルの遅延時間の長いスペクトルが認識できる状態までの間のいずれかの段階から始め、緩和時間がもっとも長い単一シグナルを決定した後、徐々に遅延時間を短縮し、緩和時間がより短い成分のシグナルを逐次決定する試料の解析方法。