CN106701765A - 用于hiv感染治疗的多核苷酸及其制备药物应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种分离的多核苷酸，所述述多核苷酸可用于制备治疗艾滋病药物；本发明还涉及一种序列优化的嵌合多核苷酸，包含上述多核苷酸和加长型的gRNA scaffold，所述嵌合多核苷酸可用于制备治疗艾滋病药物；采用本发明的多核苷酸和序列优化的嵌合多核苷酸进行基因敲除，能显著提升对靶基因CCR5的在靶率，并具有较低的脱靶率，具有优良的艾滋病治疗药物前景。

Description

用于HIV感染治疗的多核苷酸及其制备药物应用
技术领域
本发明属于生物技术和基因工程领域，具体涉及用于HIV感染治疗的多核苷酸及其制备药物应用。
背景技术
获得性免疫缺陷综合征(acquired immunodeficiency syndrome，AIDS)是由人类免疫缺陷病毒(Human Immunodeficiency Virus，HIV)感染所引起的免疫系统疾病，是一种危害性极大的全球化传染病。HIV以人体免疫系统中最重要的T淋巴细胞作为主要攻击对象，造成免疫功能丧失，从而易患各种疾病，死亡率高达99％-100％。HIV在人体内的潜伏期能长达8-10年，很多HIV感染者在发展成艾滋病患者之前可以无病症的生活，但病毒在人体内始终存在并不可治愈。虽然全世界众多医学研究人员专注于艾滋病的预防和治疗，但至今尚未研制出特效药物，由于HIV的变异极其迅速，因此也还没有可用于预防的有效疫苗。
对于HIV感染的治疗，目前的主要策略是最大限度和持久的降低病毒载量、获得免疫功能重建和维持免疫功能、提高生活质量，以及降低HIV相关的发病率和死亡率。抗逆转录病毒治疗(anti-retroviral therapy，ART)是近年来广泛使用的治疗手段，它有效抑制HIV在体内的复制，减少体内病毒载量，从而延长感染者的寿命，但其花费高昂，患者依从性差，长期治疗容易产生副作用和抗药性，并且一旦中止治疗病情可能快速反弹，最重要的是，ART并不能够根除体内的HIV病毒，达不到根治的效果。而以基因为基础的治疗方法可以持续的抑制病毒从而减少治疗干预措施，是一种非常有前景的治疗方式。
对HIV感染基因治疗手段的发展经历了两个阶段。一，基于RNA的治疗方法，即一种下调相关基因表达量的方法，如shRNA、siRNA、反义RNA等。复旦大学(201110182785.5)公开了一种携带特定RNAi核苷酸片段的重组慢病毒表达载体以及在此基础上构建的重组慢病毒及其制备方法，可以应用于艾滋病的基因治疗，为患者提供新的安全有效的治疗途径。武汉大学(200910062851.8)公开了一种多靶点siRNA重组慢病毒载体，其中针对CCR5和HIV保守基因rev和tat的三靶点siRNA重组慢病毒载体具有最佳的抑制HIV病毒复制的能力，并能克服或延缓病毒逃逸。但上述技术只能达到基因沉默的效果，不能彻底的将基因敲除。二，基于蛋白质的治疗方法，即对相关基因的敲除，如ZFN(Zinc Finger Nuclease)、CRIAPR/Cas9，TALEN(TranscriptionActivator-like Effector Nuclease)等。清华大学和北京唯尚立德生物科技有限公司共同申请的专利(201210385677.2)公开了一类调控CCR5和CXCR4的融合蛋白及方法，该方法利用TALEN技术靶向剪切CCR5或CXCR4基因的活性区域，使经过基因编辑后的细胞具备抵御HIV的能力。中国科学院广州生物医药与健康研究院和呼吸疾病国家重点实验室对CCR5缺失型的造血干细胞及其制备方法与应用提出专利申请(201110115680.8)，该技术通过ZFN来失活人诱导多潜能干细胞的CCR5基因，再经过体外定向诱导分化得到CCR5缺失型的造血干细胞。然而TALEN和ZFN基因编辑系统较为复杂，突变效率较低[1]，已经逐步被CRISPR/Cas9技术所代替。
CRISPR(clustered regularly interspaced short palindromic repeats)-Cas(CRISPR-associated endonuclease)系统是基因治疗领域的新成员，是一款强大的基因编辑工具。有别于ZFN和TALEN需要研究者根据目的基因设计和生产一对特异性的核酸酶，CRISPR更简单，具有更广泛的适应性。CRISPR系统由一段crRNA和tracrRNA的嵌合体(crRNA-tracrRNA chimera)和一个Ⅱ类CRISPR系统的非特异性的内切核酸酶9(Cas9)组成，其中的RNA嵌合体由一段Cas9绑定序列gRNA scaffold和一段20nt左右的靶向结合目的基因/位点的RNA向导序列(guide RNA，gRNA，或称引导RNA)构成。只要根据目的基因设计特异性的gRNA序列，即可引导Cas9在靶位点附近进行切割，产生双链断裂(double strandbreak,DSB)，然后细胞通过容易产生插入/缺失突变的非同源末端连接(non-homologousend-joining，NHEJ)将其修复，从而破坏目的基因的开放阅读框，达到敲除基因的目的。
CRISPR/Cas9技术的多样性可允许靶定病毒生命周期的各个阶段[2]，并且介导持续、有效的对抗HIV的基因治疗。比如说，Cas9核酸酶联合一个或多个靶向前病毒的gRNA，可以介导整合病毒基因组的切除；一种经过修饰的核酸酶缺陷型Cas9与转录激活域融合，可定向激活前病毒的基因表达，从而清除体内潜在的病毒。这种技术也可用于定向靶定宿主依赖的因素，如趋化因子辅助受体(chemokin co-receptors)CCR5[1,3-5]和CXCR4(201410770508.X)，从而阻止病毒进入细胞。
HIV主要有R5-嗜性和X4-嗜性两种，对应的辅助受体分别为CCR5和CXCR4，R5-嗜性病毒是目前最普遍感染且在感染的前期起主导作用的病毒类型。全球首例HIV感染的治愈发生在“柏林病人”身上，他接受了一名CCR5-Δ32基因突变纯合体捐献者的骨髓移植，此后的五年都没有在其身上检测到HIV病毒的踪迹。2014年，利用ZFN技术对患者CD4+原代T细胞的CCR5基因进行编辑的第一期临床试验获得成功[6]，为HIV的基因治疗带来新的突破。从此，对于HIV进入人体细胞的主要趋化因子辅助受体——CCR5的基因编辑策略受到更广泛的关注。HyunJan Kang[4]等利用CRISPR/Cas9技术编辑诱导型多能干细胞的CCR5基因，筛选出CCR5突变纯合子并诱导分化成造血细胞(包括巨噬细胞)，证明了诱导的造血细胞具有特异性抵抗R5嗜性病毒的能力。来自南京大学模式动物研究所的黄行许(201410149287.4)公开了CRISPR-Cas9特异性敲除人CCR5基因的方法以及能够精确靶向人CCR5基因并且实现基因敲除的sgRNA。自CRISPR/Cas9技术面世以来，该技术已经成为国内外基因治疗研究的热点。到目前为止，国内外已有很多科学家投身于CCR5基因敲除的研究，但是离临床应用还有很长的距离。CRISPR/Cas9技术对基因敲除的有效性已经得到广泛的验证，目前急需要解决的是如何降低CRISPR/Cas9的脱靶效率，以确保临床使用的安全性。
在对CRISPR/Cas9技术应用的研究中，gRNA的设计一度成为研究的重点和难点，国内外许多实验室和科学家投身于这一课题的研究[7-9]，开发出多种在线或离线设计gRNA的软件。对于gRNA的设计，即靶序列的选择，必须满足两个条件：(1)靶序列的上游或下游具有PAM(protospacer-adjacent motif)，因为Ca9对靶序列的识别有一个要求，就是结合位点附近必须有PAM区域，而来源不同的Cas9对PAM的序列又有不同的要求，例如最常用的来源于酿脓链球菌(Streptococcus pyogenes)的Cas9，倾向于识别“5’-NGG”；(2)对于基因组的其他位点，靶序列是唯一的，即gRNA具有特异性。因为gRNA只由20nt左右的核苷酸组成，其中起主要作用的是靠近PAM的约12nt的核苷酸序列，在全基因组范围内，与此gRNA对应的DNA序列相似，即与靶序列具有一定同源性的序列可能有很多，所以gRNA很容易脱靶结合于非目的序列上，从而引起非预期的基因或功能性非编码序列的突变，导致受基因编辑的细胞、组织或动物出现非预期的毒副作用。这也是目前CRISPR/Cas9技术在临床治疗应用上的弊端。
因此，通过软件把gRNA设计出来后，对gRNA的筛选才是CRISPR/Cas9技术应用型研究和相关产品开发的重中之重。这里所说的筛选，一般的做法就是对软件设计出来的gRNA进行实验验证，通过体外甚至体内实验进一步确定在特定物种中的敲除效率和脱靶率，以评估该gRNA用于临床治疗利与弊。
现在普遍采用的筛选思路是根据目的基因的结构和功能，选取靶定序列位于关键的功能性结构域附近的gRNA(这种gRNA所引起的突变使得目的基因被敲除的可能性大大提高)，设计实验评估体内外的在靶效率/敲除效率和脱靶效率，择优选取敲除效率高而脱靶效率在可接受范围内的gRNA。Chang Li[3]等根据软件评分和在靶率检测，筛选出在靶效率较高的gRNA并对其潜在的脱靶位点进行脱靶效率检测，发现它们在潜在的脱靶位点均未造成明显的突变效应。然而，CRISPR/Cas9作为一种在临床治疗方面潜力无限的新兴治疗技术，其脱靶突变所引起的毒副作用正是限制其临床应用的瓶颈。在临床应用上，虽然常常同时强调“安全和有效”，但是“安全”往往被放在更加重要的位置，医疗“安全”也是全世界人民最为关注的问题。现在普遍采用的筛选思路没有把脱靶效率作为最重要的选择依据，而是更为重视敲除效率的提高。
当然，除了关注gRNA的脱靶效率，更应该关注潜在脱靶基因的功能。当脱靶突变不可避免时，应尽量选择潜在脱靶基因被敲除后毒副作用较小的gRNA。由于目的基因CCR5与CCR2、CCR3高度同源，大部分靶定CCR5的gRNA对CCR2和CCR3也有靶定作用，也就是说CCR2和CCR3对于大部分设计出来的gRNA来说，是可能性最大的潜在脱靶基因。然而，这两个基因却与人体非常重要的生理机能相关，他们的敲除甚至是致病性的。CCR2特异性的介导单核细胞的趋化性，与炎性疾病相关，如类风湿性关节炎，并且参与肿瘤的炎症应答，而CCR2缺陷型的小鼠表现为加速化的老人痴呆症样病理症状。CCR3在寄生虫感染引起的呼吸道过敏症中参与嗜酸性粒细胞和其他炎性细胞的聚集和活化。因此，脱靶于CCR2和CCR3可能会造成比较严重的毒副作用，应尽量避免选择与CCR2和CCR3有同源性的gRNA。然而，即使在临床前的序列分析、体外实验和动物体内实验中表现的再安全、脱靶效率再低，真正应用于临床的时候也可能出现非预期的脱靶，这就要求选择的gRNA其潜在的脱靶基因不会对人体造成严重的毒副作用。
总的来说，对脱靶效率的研究是CRISPR/Cas9的重要环节，影响着gRNA应用的安全性，因此必须谨慎设计和严格筛选gRNA[10]，并把脱靶效率研究提高到最重要的地位。
在此基础上，为了进一步提高gRNA的在靶效率或敲除效率，尽可能的减少脱靶突变，科学家们还提出了很多优化方法，例如：利用两个或多个gRNA同时靶定目的序列，同时切割多个位点，造成目的序列大片段缺失，或多位点缺失，提高移码突变的可能性，即提高敲除效率；缩短gRNA的长度，提高gRNA的在靶率；延长gRNA的长度，增加gRNA的特异性；适当延长Cas9绑定序列gRNA scaffold的长度，提高Cas9和gRNA scaffold的结合效率，从而提高在靶率和敲除效率；改变gRNA scaffold的碱基序列，提高gRNA转录活性，从而提高在靶率和敲除效率等。
发明内容
本发明的一个目的在于提供一种分离的多核苷酸，其编码用于HIV感染基因治疗的引导RNA(gRNA)。本发明也包括含有所述多核苷酸的表达载体和宿主细胞。
本发明的另一个目的在于提供所述多核苷酸在制备治疗艾滋病病毒感染的药物中的应用。可以将本发明的多核苷酸单独或与编码另一个或多个gRNA的多核苷酸结合使用。
本发明的再一个目的在于提供包含所述多核苷酸和加长型的gRNA scaffold的优化的多核苷酸和其用途。
本发明有别于普遍采用的筛选思路，以选取脱靶效率最低的gRNA为出发点，从软件设计出来的gRNA中，挑选潜在脱靶效率较低的gRNA(全基因组序列比对后，潜在脱靶位点位于基因的内含子或非编码区的、PAM为非“NGG”组成的、或者种子区域内与潜在脱靶位点不完全配对的)，再设计实验评估其在靶/敲除效率，以及验证脱靶效率。在一开始的筛选中，已经把那些敲除效率很高但是潜在的脱靶突变也很强的gRNA筛除了，在接下来的实验中除了测试在靶/敲除效率，更重要的是选取脱靶可能性最大的基因(或者多个脱靶可能性相对较大的基因)，通过实验评估其真实的脱靶突变的可能性，而不仅仅停留在软件分析预测脱靶突变的层面。然后，进一步的，在脱靶突变程度可以接受的范围内，再选取可以有效敲除目的基因的gRNA。从而在安全的基础上进一步强调治疗的有效性。
根据本发明的一方面，编码用于HIV感染基因治疗的引导RNA(gRNA)的多核苷酸，其DNA序列为SEQ ID NO.3所示的序列；编码的相应RNA序列为SEQ ID NO.8所示的序列。
本发明采用软件设计靶向敲除CCR5基因的gRNA，根据潜在脱靶位点从中挑取5条脱靶可能性较低的gRNA，在293T细胞中进行在靶效率以及脱靶效率分析，由sanger测序结果从中筛选出3条gRNA，并进一步用NGS测序分析其在靶和脱靶效率，从中选取1条在靶效率高且脱靶效率低的gRNA。。本发明的gRNA，与其他gRNA相比在靶效率高，而脱靶效率低，有望作为HIV感染基因治疗的新工具。
本领域技术人员可以理解，可通过基因工程手段，利用本发明的多核苷酸构建各种表达载体并转化宿主，因此含有本发明的多核苷酸的各种表达载体、转化宿主以及各中间载体和宿主也属于本申请的范围内。
本发明也提供上述编码gRNA的多核苷酸与编码另一种或几种gRNA的多核苷酸组合使用的方式，可以将本发明的SEQ ID NO.1至SEQ ID NO.5的编码5个gRNA的多核苷酸相互组合，例如将SEQ ID NO.3所示的多核苷酸与选自SEQ ID NO.1,SEQ ID NO.2,SEQ IDNO.4和SEQ ID NO.5的一个或几个多核苷酸进行组合作为引导序列，组合使用的gRNA在靶效率有明显提高的同时，脱靶率没有变化。上述组合使用可以是分别构建包含各多核苷酸的表达载体，将各表达载体组合后转化细胞，也可以是将各多核苷酸共同构建入同一表达载体中转化细胞。
根据本发明的另一方面，提供上述编码引导RNA的多核苷酸在制备治疗艾滋病病毒感染的药物中的应用。在艾滋病的基因治疗中，可将本发明的gRNA作为向导序列，靶向人CCR5基因并且实现基因敲除。
CRISPR/Cas9系统已经被用于一些特殊的基因疾病的研究，而对HIV特异性辅助受体CCR5的敲除，还处于起始阶段。有别于现在已经临床试用的ZFN技术对CCR5基因的敲除，CRISPR/Cas9的实验设计更加简单，gRNA的合成也更加方便，且价格低廉，适于大量应用。
然而CRISPR/Cas9可能会存在脱靶剪切，导致非目的基因的破坏，引起预期外的毒副作用。因此，谨慎设计gRNA序列，并且对gRNA序列的脱靶效率进行深入研究显得尤为重要。
本发明针对CCR5蛋白设计gRNA序列，并将设计出来的gRNA序列在全基因组范围内进行序列比对，寻找可能的脱靶位点，尤其是PAM附近的12个碱基对在靶和脱靶的影响尤为重要。在可能的脱靶位点中，分析哪些是外显子，哪些是内含子或非编码序列，因为外显子的破坏直接关系到功能基因的剪切，危害性更大。对分析后确定的危害最大的、脱靶可能性最大的脱靶位点采取实验的手段进行进一步的分析，确定gRNA对脱靶位点的基因敲除效率。最后根据对CCR5的在靶效率以及对非预期基因的脱靶效率，综合评估gRNA的应用价值。
本发明进一步提供一种经序列优化的多核苷酸，将编码上述gRNA的多核苷酸与gRNA scaffold序列结合，并对gRNA scaffold序列进行优化，获得序列优化的多核苷酸，其对应的DNA序列如SEQ ID NO.14所述，编码转录后的RNA序列如SEQ ID NO.13所示，经序列优化后，本发明的gRNA可在脱靶效率保持低水平的情况下，在靶效率能有效提高。本领域技术人员可以理解的是，含有所述gRNA的载体、宿主，以及所述序列优化的多核苷酸在制备治疗艾滋病药物的用途也相应地属于本发明的内容。
有益效果：相较于其它多核苷酸，本发明的多核苷酸G3单独使用的在靶突变效率最高，且脱靶突变效率最低。
将本发明的多核苷酸G3和其它多核苷酸组合使用，可以大大提高对CCR5基因的在靶突变效率，且不会提高脱靶突变效率。
本发明提供的序列优化的多核苷酸，是在原有的gRNA scaffold基础上改进序列，然后将改进的gRNA scaffold和G3结合为一种嵌合多核苷酸，上述多核苷酸对CCR5基因的在靶突变效率有所提高。
附图说明
图1为多核苷酸对应的带粘性末端的双链DNA序列；
图2为多核苷酸对HEK 293T细胞CCR5基因的突变效率比较(sanger测序图)；
图3为PX458质粒图谱；
图4为G3和G1组合、G3和G2组合以及G3对CCR5的在靶效率分析；
其中：泳道1：PX458-G3和PX458-G1共转化在293T细胞中的在靶突变效率；2：PX458-G3和PX458-G2共转化在293T细胞中的在靶突变效率；3：PX458-G3在293T细胞中的在靶突变效率；4：mock；5：marker DL1000(TaKaRa)；
图5为G3和G1组合、G3和G2组合共转化与G1、G2、G3单独转化的脱靶效率比较；
其中：泳道1：G3和G1组合对INTS7基因的脱靶突变效率；2：G3和G1组合对CCR3基因的脱靶突变效率；3：G1对CCR3基因的脱靶突变效率；4：G3对INTS7基因的脱靶突变效率；5：mock；6：G3对INTS7基因的脱靶突变效率；7：G2对CCR3基因的脱靶突变效率；8：G3和G2组合对CCR3基因的脱靶突变效率；9：G3和G2组合对INTS7基因的脱靶突变效率。
图6为PX458eL-gRNA质粒图谱；
图7为PX458-G3和PX458eL-G3的在靶突变效率比较；
其中：泳道1：PX458-G3在293T细胞中的突变效率；2：PX458eL-G3在293T细胞中的突变效率；3：mock；4：marker DL1000(TaKaRa)。
图8为原gRNAscaffold和加长型的gRNA scaffold对应关系。
具体实施方式
一、多核苷酸的设计和筛选
以下通过对本发明较佳实施方式的详细描述，说明但不限制本发明。
试剂盒和遗传材料：转染试剂盒lipofectamine3000(赛默飞世尔科技)、重组酶试剂盒“ClonExpress II One Step Cloning Kit”(南京诺唯赞生物科技有限公司)、PX458(来源于Addgene，武汉淼灵生物科技有限公司代理)、pGSI(广州艾基生物技术有限公司)、Top 10大肠杆菌感受态(北京康为世纪生物科技有限公司)、HEK 293T(ATCC保藏，购于中山大学实验动物中心)。
其他的试剂材料等均为市售材料。
本发明方案的建立：
(1)软件设计用于敲除CCR5基因的编码gRNA的多核苷酸，根据潜在脱靶位点的功能和脱靶的可能性(即gRNA与脱靶位点的匹配程度),初步筛选出5条多核苷酸序列,它们对应的序列分别为：
G1：TCATCCTCCTGACAATCGAT(SEQ ID NO.1)
G2：CCTGACAATCGATAGGTACC(SEQ ID NO.2)
G3：ACAATGTGTCAACTCTTGAC(SEQ ID NO.3)
G4：CATACAGTCAGTATCAATTC(SEQ ID NO.4)
G5：GGTCCTGCCGCTGCTTGTCA(SEQ ID NO.5)
它们编码的gRNA序列分别为：
UCAUCCUCCUGACAAUCGAU(SEQ ID NO.6)
CCUGACAAUCGAUAGGUACC(SEQ ID NO.7)
ACAAUGUGUCAACUCUUGAC(SEQ ID NO.8)
CAUACAGUCAGUAUCAAUUC(SEQ ID NO.9)
GGUCCUGCCGCUGCUUGUCA(SEQ ID NO.10)
(2)合成上述5条多核苷酸序列；
(3)分别将上述编码gRNA的多核苷酸克隆至pSpCas9(BB)-2A-GFP(PX458)载体的g(N)20gRNA位置，形成5个质粒：PX458-G1、PX458-G2、PX458-G3、PX458-G4、PX458-G5；
(4)将PX458-G1、PX458-G2、PX458-G3、PX458-G4、PX458-G5分别转化HEK293T细胞，并对转化后的细胞进行sanger测序初步分析各个gRNA的在靶效率；
(5)根据sanger测序结果，初步选出3条在靶效率较高的质粒，分别为PX458-G1、PX458-G2和PX458-G3。
(6)对G1、G2、G3这三条筛选出来的多核苷酸进行全基因组序列比对，根据PAM序列、同源性(尤其是近PAM的12个碱基)，以及是否脱靶于外显子位置等，选择脱靶可能性最高的潜在脱靶序列；
(7)用PX458-G1、PX458-G2和PX458-G3分别转HEK293T细胞，对CCR5基因和上述筛选出来的脱靶可能性最高的潜在脱靶序列进行NGS测序，精确分析各自编码出的gRNA在293T细胞中的脱靶效率和在靶效率；
(8)选取脱靶效率最低、在靶效率最好的多核苷酸序列，即G3，用于后续的优化和验证。
本发明涉及的G3，对其脱靶位点的预测和分析如表1所示(主要列出脱靶于基因外显子的情况)。由表中的配对情况可见，其所编码的gRNA的种子区内与脱靶位点匹配程度低，所以脱靶的可能性较小。另外，临床治疗针对的是体内局部组织和细胞，被敲除的基因是否在接受治疗的细胞或组织中特异性表达或致病，都是临床治疗安全性必须考虑的因素。
表1 G3潜在脱靶位点功能分析
注：“|”表示该多核苷酸编码的gRNA的位点与脱靶基因可配对；“—”表示不匹配；“[]”表示种子区域。
二、多核苷酸的组合使用
(1)分别合成G3或者其他多核苷酸双链序列；
(2)分别插入PX458载体的g(N)20gRNA位置，形成PX458-G3和其他PX458与多核苷酸的嵌合载体；
(3)用PX458-G3和其他PX458与多核苷酸的嵌合载体共同转化293T细胞，可以是用两个或者两个以上的质粒共同转化HEK293T细胞，其中必须包含PX458-G3；
(4)转化后的细胞提取基因组，对CCR5基因进行PCR后，收集PCR产物用T7核酸内切酶酶切，分析G3和其他多核苷酸共同作用于CCR5基因的在靶效率；
(5)转化后的细胞提取基因组，对G3和其他共同转化的多核苷酸所潜在的脱靶基因进行PCR后，收集PCR产物用T7核酸内切酶酶切，分析G3和其他共同转化的多核苷酸的综合脱靶效率。
三、多核苷酸的优化
(1)合成G3双链序列，插入PX458载体的g(N)20gRNA位置，形成PX458-G3；
(2)在PX458-G3的gRNA scaffold序列的第13bp的位置插入“5’-TGCTG”5个核苷酸，在第17bp的位置插入“5’-CAGCA”5个核苷酸，形成加长型的gRNA scaffold，然后把gRNAscaffold的第5bp的核苷酸T，替换成任意核苷酸N(A、T、G或C)，对应的质粒命名为PX458eL-G3；
原gRNA scaffold SEQ ID NO.11和加长型的gRNA scaffold SEQ ID NO.12对应关系如图8所示；
原gRNA scaffold序列：
GTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTTAAAATAAGGCTAGTCCGTTATCAACTTGAAAAAGTGGCACCGAGTCGGTGC(SEQ ID NO.11)
加长型的gRNA scaffold序列：
GTTTNAGAGCTATGCTGGAAACAGCATAGCAAGTTAAAATAAGGCTAGTCCGTTATCAACTTGAAAAAGTGGCACCGAGTCGGTGC(SEQ ID NO.12)
(3)用PX458eL-G3转化293T细胞；
(4)转化后的细胞提取基因组，对CCR5基因和潜在的脱靶基因进行PCR后，收集PCR产物用T7核酸内切酶酶切，分析PX458eL-G3的在靶效率和脱靶效率。
因此，本发明也涉及将G3与上述优化的gRNA scaffold结合为嵌合多核苷酸，其序列如下：
ACAATGTGTCAACTCTTGACGTTTNAGAGCTATGCTGGAAACAGCATAGCAAGTTAAAATAAGGCTAGTCCGTTATCAACTTGAAAAAGTGGCACCGAGTCGGTGC(SEQ ID NO.14)
其编码的RNA序列为：
ACAAUGUGUCAACUCUUGACGUUUNAGAGCUAUGCUGGAAACAGCAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGC(SEQ ID NO.13)
实施例1多核苷酸的设计和筛选
1.1通过软件设计用于敲除人类CCR5基因的编码gRNA的多核苷酸，根据软件预测的脱靶位点，从中筛选出5条脱靶作用较小的多核苷酸，如表2所示；
表2多核苷酸序列及潜在脱靶基因
1.2分别合成G1～G5对应正义链，以及相对应的反义链，同时在正义链的5'端添加CACCG，反义链的5'端添加AAAC，反义链的3'端添加C。将上述正义链和对应的反义链经加热后退火，形成双链DNA序列，如图1所示；
1.3用Bbs I酶对pSpCas9(BB)-2A-GFP(PX458)(图3)载体酶切线性化；
1.4将合成的带粘性末端的双链DNA序列与线性化的PX458载体用T4连接酶连接，用连接产物转化大肠杆菌Top10感受态细胞；
1.5转化后的Top10感受态细胞经恢复培养1h后，涂布氨苄青霉素LB平板，培养24小时以上；
1.6挑取单菌落，接种至氨苄青霉素LB培养基，37℃摇床培养过夜，收集菌体提取质粒进行sanger测序，测序引物为表3中SeqForward和SeqReverse；
1.7根据测序结果选取阳性克隆菌，用氨苄青霉素LB培养基扩大培养，37℃摇床过夜培养；
1.8收集扩大培养的菌体，提取质粒PX458-Gx(x代表多核苷酸编号，即PX458-G1、PX458-G2、PX458-G3、PX458-G4、PX458-G5)；
1.9使用试剂盒lipofectamine3000，分别用质粒PX458-Gx转化HEK 293T细胞；
1.10对转化后的HEK 293T细胞，培养48小时后收集细胞，提取基因组；
1.11对上述各组细胞的基因组进行sanger测序(测序引物见表3),对PX458-G1、PX458-G2和PX458-G3转化后的细胞用引物G1G2G3Forward和G1G2G3Reward进行测序，对PX458-G4转化的细胞用引物G4Forward单向测序，对PX458-G5转化的细胞用引物G5Reverse单向测序，以测序结果图初步判断各个gRNA对HEK 293T细胞CCR5基因的突变效率，结果见图2；
表3引物序列表
名称 序列
SeqForward 5'-ATTTTTGTGATGCTCGTCAG-3'(SEQ ID NO.22)
SeqReverse 5'-GGTAATAGCGATGACTAATA-3'(SEQ ID NO.23)
G1G2G3Forward 5'-CTGACATCTACCTGCTCAAC-3'(SEQ ID NO.24)
G1G2G3Reward 5'-GCTGCAGGTGTAATGAAGAC-3'(SEQ ID NO.25)
G4Forward 5'-ACTTGGGTGGTGGCTGTGTT-3'(SEQ ID NO.26)
G5Reverse 5'-CTTGGTCCAACCTGTTAGAG-3'(SEQ ID NO.27)
1.12根据sanger测序结果，发现G1、G2、G3的突变效率较高，选择PX458-G1、PX458-G2、PX458-G3再次转化HEK 293T细胞，用流式细胞仪测定转化效率(转化率约为80％)，并对转化的细胞进行NGS测序，精确测定G1、G2、G3对CCR5基因的在靶效率，结果如表4所示。
表4 G1、G2、G3对CCR5基因的在靶效率
1.13对G1、G2、G3在全基因组范围内比对潜在脱靶位点，优先考虑PAM序列为NGG，且种子区域内(离PAM最近的12nt)同源性最高的外显子序列，筛选的潜在脱靶基因见表5；
表5脱靶可能性最大的潜在脱靶位点
多核苷酸序号 脱靶基因 PAM 同源性分析
G1 CCR3 AGG |-|||||-[|||||||||||-]PAM
G2 CCR3 TGG -|||||||[||||-|||||||]PAM
G3 INTS7 TGG ||||-||-[||||||--||||]PAM
注：“|”表示该多核苷酸编码的gRNA位点与脱靶基因可配对；“—”表示不匹配；“[]”表示种子区域。
1.14对转化后的HEK 293T细胞的潜在脱靶基因进行NGS测序，精确测定G1、G2、G3对潜在脱靶基因的脱靶效率，结果见表6。
表6 G1、G2、G3对潜在脱靶基因的脱靶效率
实施例2多核苷酸的组合使用
2.1提取从上述实施例1中筛选获得的质粒，PX458-G1、PX458-G2、PX458-G3；
2.2将PX458-G1和PX458-G3，PX458-G2和PX458-G3分别共转化HEK293T细胞；
2.3转化后培养48小时，收集细胞，提取基因组DNA；
2.4用PCR法扩增(引物见表3的G1G2G3Forward和G1G2G3Reward)各组细胞的CCR5基因中含靶序列的片段；
2.5收集上述PCR产物后，用T7内切核酸酶法进行突变效率分析，结果如图4所示。
2.6用灰度分析软件(image J)对图4每个泳道的酶切效率进行分析比较，即可分析出多核苷酸在靶效率，结果如表7；
表7G3和G1组合、G3和G2组合以及G3对CCR5的在靶效率
序号 多核苷酸 敲除效率
1 G3+G1 22.99％
2 G3+G2 31.70％
3 G3 16.46％
从表7的结果可知，将G3和G1组合，或者G3和G2组合使用，可以大大提高对CCR5基因的在靶突变效率。
2.7以PX458-G1和PX458-G3组合，PX458-G2和PX458-G3组合分别共转化的HEK293T细胞的基因组DNA为模板，用PCR法(引物见表8)扩增各靶点潜在的脱靶基因中含脱靶位点的片段；
表8脱靶基因CCR3和INTS7的PCR引物
CCR31-f atccctaggctgctatcaca(SEQ ID NO.28)
CCR31-r ttgctccgctcacagtcatt(SEQ ID NO.29)
INTS7 1-f TGCTTGCAGCGTCATCTTTG(SEQ ID NO.30)
INTS7 1-r TGTTCTGAGGCAACCTGAGTC(SEQ ID NO.31)
2.8回收上述含脱靶位点的PCR产物后，用T7内切核酸酶法进行脱靶位点的突变效率分析，结果如图5所示：
从图5可知，G3和G1组合、G3和G2组合，两条多核苷酸同时使用与单独使用G1、G2、G3相比，脱靶效率并没有明显提高。
实施例3多核苷酸的优化
3.1合成编码gRNA-EX的双链DNA片段，上述DNA片段是以如SEQ ID NO.12所示加长型的gRNA scaffold为基础，在其两侧分别附加一段与pX458质粒两个酶切位点对应的同源序列而成，其正义链如下：
AACACCGGGTCTTCGAGAAGACCTGTTTTAGAGCTATGCTGGAAACAGCATAGCAAGTTAAAATAAGGCTAGTCCGTTATCAACTTGAAAAAGTGGCACCGAGTCGGTGCTTTTTTGTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTTAAAATAAGGCTAGTCCGTTTTTAGCGCGTGCGCCAATTCTGCAGACAAATGGCTCTAGAGG(SEQ ID NO.32)
3.2取pGSI质粒进行Sma I单酶切，与上述双链DNA片段连接，转化Top10大肠杆菌感受态细胞，涂布Amp平板，培养24小时后挑取菌落进行Sanger测序，选取测序正确的单克隆(命名为pGSI-gRNA-EX)扩大培养；
3.3提取pGSI-gRNA-EX质粒；
3.4设计并合成表9所示的引物，以pGSI-gRNA-EX为模板进行PCR扩增，获取用于替换pX458中原始gRNA scaffold的同源DNA片段；(注：将被替换优化gRNA scaffold后的pX458命名为pX458eL)
表9pX458eL替换片段扩增引物
pX458eL-F 5'-TGTGGAAAGGACGAAAcaccGGgtcttcGAGAAG-3'(SEQ ID NO.33)
pX458eL-R 5'-TATGTAACGGGTACCtctagaGCCATTTGTCTGCAG-3'(SEQ ID NO.34)
3.5回收上述PCR产物(用于替换pX458中原始gRNA scaffold的同源DNA片段)；
3.6提取pX458质粒，以Bbs I和Xba I对pX458进行双酶切，并经琼脂糖凝胶电泳后切胶回收酶切后的线性化pX458质粒(pX458质粒的gRNA scaffold如SEQ ID NO.11所示)；
3.7将上述酶切后的线性化pX458质粒与上述同源DNA片段进行同源重组(使用重组酶试剂盒“ClonExpress II One Step Cloning Kit”)；
3.8将上述重组产物转化Top10感受态细胞，经恢复培养1h后涂布氨苄青霉素LB平板，培养24小时以上挑选单菌落进行sanger测序(以SeqForward为引物)；
3.9选取上述测序正确的质粒扩大培养并提取质粒，即为pX458eL(图6)；
3.10参考实施例1.2-1.7的步骤，将G3连接于pX458eL，形成pX458eL-G3，pX458eL-G3中的嵌合多核苷酸序列如SEQ ID NO.14所示。
3.11用pX458-G3和pX458eL-G3分别转化HEK 293T细胞，以未转化的HEK 293T细胞为对照；
3.12收集上述细胞，提取基因组，对CCR5基因中含靶序列的片段进行PCR扩增；
3.13收集上述PCR产物后，用T7内切核酸酶法进行突变效率分析，结果如图7所示；
3.14用灰度分析软件(image J)对图7每道的酶切效率进行分析比较，结果如表10。
表10PX458-G3和PX458eL-G3的在靶突变效率
序列 质粒 敲除效率
1 PX458-G3 13.48％
2 PX458eL-G3 19.33％
从表10结果可知，延长了gRNA scaffold之后的PX458eL-G3，比起PX458-G3，对CCR5基因的敲除效率有所提高。
以上对本发明的详细描述并不限制本发明，本领域技术人员可以在此基础上做出各种改变和变形，只要不脱离本发明的精神，均应属于本发明权利要求所限定的范围。
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<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
tcatcctcct gacaatcgat 20
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<212> DNA
<213> 人工序列
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cctgacaatc gataggtacc 20
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<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
acaatgtgtc aactcttgac 20
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<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
catacagtca gtatcaattc 20
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<212> DNA
<213> 人工序列
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ggtcctgccg ctgcttgtca 20
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<212> RNA
<213> 人工序列
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ucauccuccu gacaaucgau 20
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ccugacaauc gauagguacc 20
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<212> RNA
<213> 人工序列
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acaauguguc aacucuugac 20
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<211> 20
<212> RNA
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cauacaguca guaucaauuc 20
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<212> RNA
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ggcaccgagt cggtgc 76
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<222> (25)..(25)
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acaatgtgtc aactcttgac gtttnagagc tatgctggaa acagcatagc aagttaaaat 60
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<212> DNA
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aaataaggct agtccgttat caacttgaaa aagtggcacc gagtcggtgc ttttttgttt 120
tagagctaga aatagcaagt taaaataagg ctagtccgtt tttagcgcgt gcgccaattc 180
tgcagacaaa tggctctaga gg 202
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<212> DNA
<213> 人工序列
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tgtggaaagg acgaaacacc gggtcttcga gaag 34
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<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 34
tatgtaacgg gtacctctag agccatttgt ctgcag 36

Claims (10)

1.一种分离的多核苷酸，编码用于HIV感染基因治疗的引导RNA，其特征在于所述多核苷酸的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。
2.根据权利要求1所述的多核苷酸，其特征在于所述多核苷酸编码的RNA序列如SEQ IDNO.8所示。
3.一种表达载体，含有权利要求1所述的多核苷酸。
4.权利要求1所述的多核苷酸在制备治疗艾滋病药物中的用途。
5.根据权利要求4所述的用途，其中包括将编码所述引导RNA的多核苷酸与编码另一个或几个引导RNA的多核苷酸结合使用，所述编码另一个或几个引导RNA的多核苷酸具有选自如SEQ ID NO.1,SEQ ID NO.2,SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.5所示的DNA序列。
6.根据权利要求5所述的用途，其中如SEQ ID NO.3所示的多核苷酸编码的引导RNA，其序列如SEQ ID NO.8所示；SEQ ID NO.1所示的多核苷酸编码的引导RNA，其序列如SEQ IDNO.6所示；SEQ ID NO.2所示的多核苷酸编码的引导RNA，其序列如SEQ ID NO.7所示；SEQID NO.4所示的多核苷酸编码的引导RNA，其序列如SEQ ID NO.9所示；和SEQ ID NO.5所示的多核苷酸编码的引导RNA，其序列如SEQ ID NO.10所示。
7.一种序列优化的嵌合多核苷酸，包含权利要求1所述的分离的多核苷酸和加长型的gRNA scaffold，其核苷酸序列如SEQ ID NO.14所示。
8.根据权利要求7所述的序列优化的嵌合多核苷酸，其编码如SEQ ID NO.13所示的gRNA。
9.一种含有权利要求7所述的序列优化的嵌合多核苷酸的表达载体。
10.权利要求7所述的序列优化的嵌合多核苷酸在制备治疗艾滋病药物中的用途。
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