CN103820441B - CRISPR‑Cas9特异性敲除人CTLA4基因的方法以及用于特异性靶向CTLA4基因的sgRNA - Google Patents
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Abstract
本发明属于基因工程领域，更具体地说，涉及CRISPR‑Cas9特异性敲除人CTLA4基因的方法以及用于特异性靶向CTLA4基因的sgRNA。本发明提供了CRISPR‑Cas9特异性敲除人CTLA4基因的方法以及用于特异性靶向CTLA4基因的sgRNA。利用本发明制备的特异性靶向人CTLA4基因的sgRNA能够精确靶向人CTLA4基因并且实现基因敲除。该制备方法步骤简单、sgRNA靶向性好，CRISPR‑Cas9系统的敲除效率高。
Description
技术领域
本发明属于基因工程领域，更具体地说涉及CRISPR-Cas9特异性敲除人CTLA4基因的方法以及用于特异性靶向CTLA4基因的sgRNA。
背景技术
规律成簇间隔短回文重复系统（clustered regularly interspaced shortpalindromic repeat;CRISPR-associated，CRISPR-Cas9）是一种具有核酸内切酶活性的复合体，识别特定的DNA序列，进行特定位点切割造成双链DNA断裂（Double-strand breaks,DSB），在没有模板的条件下，发生非同源重组末端连接（Non-homologous end joining,NHEJ）,造成移码突变（frameshift mutation），导致基因敲除（图1）。
这一技术由于能快速、简便、高效地靶向基因组任何基因，从而引起了广泛的关注，在2012年开始像爆炸一般流行开来。由于其容易操作、可以同时靶向多个基因，可以高通量制备、造价低等优势，Cas9已经成为一种发展最快的技术（Pennisi,2013）。正是由于其优越性，这一技术在Nature推荐的2013十大进展中位列第一（http://www.nature.com/ news/365-days-nature-s-10-1.14367），在Science推荐的2013十大进展中位列第二位（http://news.sciencemag.org/breakthrough-of-the-year-2013）。
Cas9靶向切割DNA是通过两种小RNA——crRNA（CRISPR RNA）和tracrRNA(trans-activating crRNA)和靶序列互补识别的原理实现的。现在已经把两种小RNA融合成一条RNA链，简称sgRNA（single guide RNA）。因此，sgRNA能否做到特异性、精确靶向目标基因是CRISPR-Cas9能否特异性敲除目标基因的先决条件，无论是脱靶还是错误靶向，都会影响CRISPR-Cas9对目标基因的特异性敲除。因此，能够设计、制备出精确性和特异性靶向目标基因的sgRNA成为CRISPR-Cas9基因敲除的关键技术（图1）。
肿瘤免疫治疗，尤其是对免疫检查点的阻断，是当前靶向基因治疗最成功的领域。免疫检查点是指维持免疫自我耐受，以及调节生理条件下的免疫反应强度和持续时间的一系列免疫抑制性反应。研究表明，肿瘤细胞和免疫检查点途径协同作用，产生了抑制肿瘤免疫的效果，特别是抑制肿瘤抗原特异的效应T细胞的作用。对免疫检查点的阻断，是指利用T细胞免疫检查抑制性受体的单克隆抗体，特异性阻断抑制性受体与其配体的结合，从而阻断免疫检查机制抑制T细胞活化的作用，增强效应T细胞的抗肿瘤效果。
已经成功用于临床的肿瘤免疫治疗的免疫检查靶点之一是免疫抑制性受体，CTLA4基因。CTLA4是首个临床肿瘤免疫治疗的靶基因，只表现在T细胞上，负责调节T细胞激活早期的反应强度。CTLA4和共刺激受体，CD28，共同受同一配体，CD86。CTLA4主要通过和CD28竞争配体影响CD28共激活T细胞，从而实现其控制T细胞活性的作用。利用CTLA4单克隆（lpilimumab、Tremelimumab）和CTLA4结合，促进CD86和CD28结合，显著增强免疫反应，从而达到减缓肿瘤生长，或清除肿瘤的作用，从而达到治疗肿瘤的效果。
不过，利用CTLA4抗体的治疗现在只在黑色素癌应用，对其它肿瘤的疗效还在测试中。因为利用抗体进行靶基因的治疗还受到一些因素的限制：（1）抗体的作用只是暂时阻断的作用；（2）抑制性受体有多种，如何利用多种抗体同时阻断多种抑制性受体还没有对策；（3）不容易研发出有效的抗体；（4）只针对细胞外靶点；（5）抗体药物昂贵，等。
CRISPR-Cas9快速、简便、高效、特异性靶向敲除基因，通过靶向敲除CTLA4基因，为实现肿瘤免疫治疗提供了一种可行的策略。但是，能否设计、制备出精确性和特异性靶向CTLA4基因的sgRNA以及通过分子生物学方法制备出靶向CTLA4基因的CRISPR-Cas9成为CRISPR-Cas9特异性敲除CTLA4基因的关键技术。本发明的目的就是要解决这些关键技术问题，提供相应的技术方案，达到特异性敲除CTLA4基因的目的。
参考文献：
Mali P,Esvelt KM,Church GM.Cas9as a versatile tool for engineeringbiology.Nat.Methods.2013;10(10):957-963.
Pennisi E.The CRISPR craze.Science,2013;341(6148):833-6.doi:10.1126/science.341.6148.833.
Pardoll DM.The blockade of immune checkpoints in cancerimmunotherapy.Nature Rev.Cancer,2012;12:252-264.
Mellman I,Coukos G,Dranoff G.Cancer immunotherapy comes ofage.Nature,2011;480:480-489.
发明内容
针对现有利用CTLA4抗体进行免疫检测阻断治疗肿瘤存在的问题：（1）抗体的作用只是暂时阻断的作用；（2）抑制性受体有多种，如何利用多种抗体阻断多种抑制性受体还没有对策；（3）不容易研发出有效的抗体；（4）只针对细胞外靶点；（5）开发抗体药物费时、费力、费钱，使得抗体药物昂贵等。本发明设计、合成了一组在CRISPR-Cas9特异性敲除人CTLA4基因中特异性靶向CTLA4基因的sgRNA，并分别将该sgRNA与线性的pGL3-U6-sgRNA质粒连接成载体，将一对正向和方向sgRNA寡核苷酸载体与pST1374-NLS-flag-Cas9-ZF质粒一起成功转染细胞即可实现CTLA4基因的敲除。本申请提供了一种利用Cas9/sgRNA快速、简便、高效、特异性敲除CTLA4的策略。有效地解决了利用抗体治疗存在的问题：（1）直接敲除CTLA4基因，可以实现永久的效果；（2）既可以针对CTLA4的多个编码序列进行同时敲除，也可以针对多个靶基因进行同时敲除；（3）提供了高效的sgRNA；（4）既可以针对胞外，也能针对胞内靶点；（5）sgRNA只需要小量合成多核苷酸片断，就能大批量生产。
为了解决上述技术问题，本申请的技术方案如下：
一、sgRNA寡核苷酸的设计和选择
因为没有使用体外转录，只是构建普通载体的方式制作。所以如无特殊说明，文中的sgRNA序列指的是sgRNA对应DNA序列。
1.靶向CTLA4基因的sgRNA的设计：
（1）在CTLA4基因上选择5’-GGN(19)GG的序列，如果没有5’-GGN(19)GG的序列，5’-GN(20)GG或者5’-N(21)GG也可以。
（2）sgRNA在CTLA4基因上的靶向位点位于基因的外显子。
（3）sgRNA在CTLA4基因上的靶向位点位于不同的各种剪切形式的共有外显子上。
（4）在UCSC数据库中用BLAT或NCBI数据库中用BLAST，确定sgRNA的靶序列是否唯一。
2.靶向CTLA4基因的sgRNA的选择：
（1）不能离ATG起始子太近，防止转录会后下游另一个ATG开始而出现一个被截短的基因形式，不能保证基因完全失活；
（2）sgRNA在CTLA4基因上的靶向位点位于整个基因的前半段，尤其宜在基因的功能结构域中;
（3）选择相隔一定距离（10～30bp）成对的位点。这样有利于形成特异性的片段缺失，也有利于降低脱靶效应。
二、构建sgRNA的寡聚核苷酸
根据选择的sgRNA，在其5’加上CCGG得到正向寡核苷酸（Forward oligo）（如果序列本身在5’端已经有1或者2个G，那么就对应的省略1或者2个G）；根据选择的sgRNA，获得其对应DNA的互补链，并且在其5’加上AAAC得到反向寡核苷酸（Reverse oligo）。分别合成上述正向寡核苷酸和反向寡核苷酸，将合成的sgRNA寡聚核苷酸的forward oligo和reverseoligo成对变性、退火，退火之后形成可以连入U6真核表达载体的双链，如下：
三、sgRNA寡聚核苷酸质粒的构建
1.线性化pGL3-U6-sgRNA质粒（结构如图4所示）。
2.将退火的sgRNA寡聚核苷酸双链与线性化pGL3-U6-sgRNA质粒连接获得pGL3-U6-hCTLA4sg质粒。
3.转化并涂Amp+平板（50μg/ml）。
4.用ID NO.9的通用引物U6测序的方法鉴定阳性克隆。
5.37℃摇床摇菌过夜并用AxyPrep Plasmid Miniprep Kit （AP-MN-P-250）抽提pGL3-U6-hCTLA4sg质粒。
四、转染细胞获得CTLA4基因敲除细胞
1、按照LipofectamineTM2000Transfection Reagent（Invitrogen，11668-019）的操作手册，将分别带有对应sgRNA寡聚核苷酸的pGL3-U6-hCTLA4sg质粒（可以为1种或者多种）与序列为SEQ ID NO.11的pST1374-NLS-flag-Cas9-ZF质粒（结构如图5所示）混匀，共转染细胞。
2、用T7EN1酶切检测和TA克隆测序确认CTLA4基因已经被敲除。
更进一步的，同时利用一对相邻（在CTLA4基因上的靶向起始位点相距5bp-30bp）的sgRNA可以显著提高敲除效率。在靶向CTLA4的sgRNA寡核苷酸设计、选择和合成之后，将靶向CTLA4的sgRNA寡聚核苷酸与线性化pGL3-U6-sgRNA质粒连接获得含靶向CTLA4的sgRNA寡聚核苷酸的pGL3-U6-hCTLA4sg质粒，在转染细胞获得CTLA4基因敲除细胞过程中，如下操作：
1、按照LipofectamineTM2000Transfection Reagent（Invitrogen，11668-019）的操作手册，将两个分别含1个靶向CTLA4的sgRNA寡聚核苷酸的pGL3-U6-hCTLA4sg质粒（这两个载体分别带有的靶向CTLA4的sgRNA寡聚核苷酸在CTLA4基因上的靶向起始位点相距8bp-24bp）与序列为SEQ ID NO.11的pST1374-NLS-flag-Cas9-ZF质粒混匀，共转染细胞。
2、用T7EN1酶切检测和TA克隆测序确认CTLA4基因已经被敲除。
本发明还提供了特异性靶向CTLA4基因的sgRNA，其序列如SEQ ID NO.24-90所示。
相比于现有利用CTLA4抗体进行免疫检测阻断治疗肿瘤技术，本发明的优点在于：
（1）抗体的作用只是暂时封闭的作用，本发明直接敲除CTLA4基因，可以实现永久的效果；
（2）抑制性受体有多种，如何利用多种抗体封闭多种抑制性受体还没有对策，本发明既可以针对CTLA4的多个编码序列进行敲除，也可以针对多个靶基因进行敲除；
（3）有效的CTLA4抗体研发很困难，本发明提供了针对人CTLA4基因的一组高效的sgRNA；
（4）抗体作用只能针对细胞外靶点，本发明既可以针对胞外，也能针对胞内靶点；
（5）开发抗体药物是一项费时、费力、费钱的过程，使得抗体药物昂贵等，利用sgRNA只需要小量合成多核苷酸片断，就能大批量生产。
附图说明
图1 Cas9实现定点切割导致DNA双链断裂过程示意图
CRISPR/Cas9系统定向识别和剪切从而导致基因敲除是通过sgRNA和Cas9实现的。sgRNA决定了Cas9的靶向性。
图2 T7EN1酶切鉴定sgRNA/Cas9介导的基因人CTLA4特异性切割
以提取的HEK293T细胞基因组为模板，使用序列如SEQ ID NO.12和SEQ ID NO.13的hCTLA4test For和hCTLA4test Rev为引物进行PCR扩增，PCR产物为390bp，纯化PCR产物。将上述PCR产物取200ng退火，使用T7EN1酶切鉴定，电泳。如图所示，加入针对人CTLA4的sgRNA的样品都出现了切割条带，而且具有很高的效率。
图3 sgRNA/Cas9介导的基因位点特异性人CTLA4切割结果测序
以提取的细胞基因组为模板，使用序列如SEQ ID NO.13和SEQ ID NO.14的hCTLA4test For和hCTLA4test Rev为引物进行PCR扩增。纯化PCR产物，连入TA克隆并送测序。下划线序列为PAM序列；(-)表示敲除。
图4载体pGL3-U6-sgRNA的结构
图5载体pST1374-NLS-flag-cas9-ZF的结构
具体实施方式
下面结合附图和具体的实施例对本发明的技术方案做进一步介绍。
实施例1CRISPR-Cas9特异性敲除人CTLA4基因中用于特异性靶向CTLA4基因的sgRNA的设计和合成
1.靶向人CTLA4基因的sgRNA的设计：
（1）在CTLA4基因上选择5’-GGN(19)GG的序列，如果没有5’-GGN(19)GG的序列，5’-GN(20)GG或者5’-N(21)GG也可以。
（2）sgRNA在CTLA4基因上的靶向位点位于基因的外显子，这样更容易引起片段的缺失或移框突变，从而达到基因完全失活的目的。
（3）sgRNA在CTLA4基因上的靶向位点位于不同的各种剪切形式的共有外显子上。
（4）在UCSC数据库中用BLAT或NCBI数据库中用BLAST，确定sgRNA的靶序列是否唯一，减少潜在的脱靶位点。
根据以上方法，我们一共设计了67个靶向人CTLA4基因的sgRNA，序列分别如序列表SEQ ID NO.24-90所示。
2.靶向人CTLA4基因的sgRNA的选择：
（1）靶向CTLA4基因的sgRNA的靶序列在CTLA4基因上不能离ATG起始子太近，防止转录会后下游另一个ATG开始而出现一个被截短的基因形式，不能保证基因完全失活。
（2）sgRNA在CTLA4基因上的靶向位点位于整个基因的前半段，尤其宜在基因的功能结构域中。
（3）在CTLA4基因上选择相隔一定距离（10～30bp）成对的位点。这样有利于形成特异性的片段缺失，也有利于降低脱靶效应。
根据以上方法，在67个靶向人CTLA4基因的sgRNA(序列分别如序列表SEQ IDNO.24-90所示)中符合的序列有10个（分别如序列表SEQ ID NO.36、42、55、56、57、58、67、69、84和85所示），由于序列较多，没有必要一一做实验验证，我们从中选择了4个（分别如序列表SEQ ID NO.36、84、56、69所示）进行后续实验。
3.靶向人CTLA4基因的sgRNA寡聚核苷酸的合成和构建
根据选择的4个（分别如序列表SEQ ID NO.36、84、56、69所示），在其5’加上CCGG得到正向寡核苷酸（Forward oligo）（如果序列本身在5’端已经有1或者2个G，那么就对应的省略1或者2个G）；根据选择的sgRNA，获得其对应DNA的互补链，并且在其5’加上AAAC得到反向寡核苷酸（Reverse oligo）。分别合成（合成方法参见文献：Significant improvementof quality for long oligonucleotides by using controlled pore glass withlarge pores.Nucleosides Nucleotides Nucleic Acids.2005;24(5-7):1037-41.）上述正向寡核苷酸和反向寡核苷酸，将合成的sgRNA寡聚核苷酸的forward oligo和reverseoligo成对变性、退火，退火之后形成可以连入U6真核表达载体的双链sgRNA寡聚核苷酸，模式如下：
Reverse oligo:
变性、退火体系为：
2.5μl forward Oligo(100μM)
2.5μl reverse Oligo(100μM)
1μl NEB buffer2
4μl灭菌水
在PCR仪中按照以下touch down程序运行：95℃，5min；95–85℃ at-2℃/s；85–25℃ at-0.1℃/s；hold at4℃。
选择的第1个sgRNA（如序列表SEQ ID NO.36所示），其forward oligo和reverseoligo（Forward oligo和Reverse oligo序列分别如序列表SEQ ID NO.1和2所示）成对变性、退火之后获得可以连入U6真核表达载体的双链sgRNA寡聚核苷酸。
选择的第2个sgRNA（如序列表SEQ ID NO.84所示），其forward oligo和reverseoligo（Forward oligo和Reverse oligo序列分别如序列表SEQ ID NO.3和4所示）成对变性、退火之后获得可以连入U6真核表达载体的双链sgRNA寡聚核苷酸。
选择的第3个sgRNA（如序列表SEQ ID NO.56所示），其forward oligo和reverseoligo（Forward oligo和Reverse oligo序列分别如序列表SEQ ID NO.5和6所示）成对变性、退火之后获得可以连入U6真核表达载体的双链sgRNA寡聚核苷酸。
选择的第4个sgRNA（如序列表SEQ ID NO.69所示），其forward oligo和reverseoligo（Forward oligo和Reverse oligo序列分别如序列表SEQ ID NO.7和8所示）成对变性、退火之后获得可以连入U6真核表达载体的双链sgRNA寡聚核苷酸。
实施例2利用CRISPR-Cas9特异性敲除人CTLA4基因（用于靶向CTLA4基因的sgRNA如序列表SEQ ID NO.36所示）
1、线性化序列如序列表SEQ ID NO.10所示的pGL3-U6-sgRNA质粒。
酶切体系和条件如下：
2μg pGL3-U6-sgRNA（400ng/μl）；
1μl CutSmart Buffer；
1μl BsaI(NEB，R0535L)；
补水至50μl，37℃孵育3～4小时，每隔一段时间振荡一下并离心以防液滴蒸发至管盖上。
酶切完成后用AxyPrep PCR Clean up Kit（AP-PCR-250）纯化回收至20～40μl灭菌水中。
2、将变性、退火之后获得的可以连入U6真核表达载体的双链sgRNA寡聚核苷酸（其Forward oligo和Reverse oligo序列分别如序列表SEQ ID NO.1和2所示）与线性化的pGL3-U6-sgRNA质粒相连获得pGL3-U6-hCTLA4sg1载体。
连接体系如下：
3μl，50μM退火产物（双链sgRNA寡聚核苷酸，其forward oligo如序列表SEQ IDNO.1所示，其reverse oligo如序列表SEQ ID NO.2所示）
1μl线性化的pGL3-U6-sgRNA质粒（25ng/μl）
1μl T4ligation Buffer
0.5μl T4ligase(NEB，M0202S)
4.5μl灭菌水
16℃孵育1小时。
4、将上述步骤获得的连接产物转化DH5α感受态细胞（TransGen,CD201）并涂Amp+平板（50μg/ml），并挑取克隆。
5、用如序列表SEQ ID NO.9所示的通用引物U6，用常规测序的方法鉴定获得阳性克隆。
6、37℃摇床摇菌过夜培养阳性克隆，并用AxyPrep Plasmid Miniprep Kit（AP-MN-P-250）抽提质粒，获得pGL3-U6-hCTLA4sg1质粒（如序列表SEQ ID NO.14所示）。
7、细胞培养与转染
（1）HEK293T细胞接种培养于DMEM高糖培养液中（HyClone,SH30022.01B），其中含10%FBS，penicillin（100U/ml）和streptomycin（100μg/ml）。
（2）在转染前分至12孔板中，待70%～80%密度时进行转染。
（3）按照LipofectamineTM2000Transfection Reagent（Invitrogen，11668-019）的操作手册，将0.5μg pGL3-U6-hCTLA4sg1质粒（如序列表SEQ ID NO.14所示）与1.5μg的pST1374-NLS-flag-Cas9-ZF质粒（如序列表SEQ ID NO.11所示）混匀，共转染至每孔细胞中，6～8小时后换液，并加入Blasticidin（Sigma,15205）和Puromycin（Merck,540411）药筛，48小时后收取细胞。
质粒pST1374-NLS-flag-Cas9-ZF的制备方法参见文献：Shen et al.2013,Generation of gene-modified mice via Cas9/RNA-mediated gene targeting.CellResearch23,720-723.（doi:10.1038/cr.2013.46）
8、T7EN1酶切检测
（1）将收集的细胞在裂解液（10μM Tris-HCl,0.4M NaCl,2μM EDTA,1%SDS）中用100μg/ml蛋白酶K裂解消化后，酚-氯仿抽提后溶解到50μl去离子水中。
（2）使用序列如SEQ ID NO.12和SEQ ID NO.13的引物hCTLA4testFor和hCTLA4test Rev进行PCR扩增，用AxyPrep PCR cleanup纯化获得PCR回收产物，取200ng统一稀释到20μl进行变性、退火，程序如：95℃，5min；95–85℃ at-2℃/s；85–25℃ at-0.1℃/s；hold at4℃。
（3）在20μl体系中加入T7EN10.3μl，37℃酶切30分钟后，加入2μl10X LoadingBuffer,用2.5%的琼脂糖胶电泳检测。
9、TA克隆测序
（1）将T7EN1酶切检测步骤（2）获得的PCR回收产物用rTaq进行加A反应。加A反应体系为：
700～800ng PCR回收产物
5μl10X Buffer(Mg2+free)
3μl Mg2+
4μl dNTP
0.5μl rTaq(TAKARA,R001AM)
补水至50μl体系。
37℃温育30分钟后，取1μl产物与pMD19-T vector(TAKARA,3271)连接并转化DH5α感受态细胞（TransGen,CD201）。
（2）挑取单克隆以序列如序列表SEQ ID NO.9的通用引物U6测序，根据测序结果（如序列表SEQ ID NO.18所示）发现：靶基因CTLA4缺失了靶序列，基因敲除成功。
实施例3利用CRISPR-Cas9特异性敲除人CTLA4基因（用于靶向CTLA4基因的sgRNA如序列表SEQ ID NO.84所示）
1、线性化序列如序列表SEQ ID NO.10所示的pGL3-U6-sgRNA质粒。酶切体系和条件如下：
2μg pGL3-U6-sgRNA（400ng/μl）；
1μl CutSmart Buffer；
1μl BsaI(NEB，R0535L)；
补水至50μl，37℃孵育3～4小时，每隔一段时间振荡一下并离心以防液滴蒸发至管盖上。
酶切完成后用AxyPrep PCR Clean up Kit（AP-PCR-250）纯化回收至20～40μl灭菌水中。
2、将变性、退火之后获得的可以连入U6真核表达载体的双链sgRNA寡聚核苷酸（其Forward oligo和Reverse oligo序列分别如序列表SEQ ID NO.3和4所示）与线性化的pGL3-U6-sgRNA质粒相连获得pGL3-U6-hCTLA4sg2质粒。
连接体系如下：
3μl50μM退火产物双链sgRNA寡聚核苷酸，其forward oligo如序列表SEQ ID NO.3所示，其reverse oligo如序列表SEQ ID NO.4所示）
1μl线性化的pGL3-U6-sgRNA质粒（25ng/μl）
1μl T4ligation Buffer
0.5μl T4ligase(NEB，M0202S)
4.5μl灭菌水
16℃孵育1小时。
4、将上述步骤获得的连接产物转化DH5α感受态细胞（TransGen,CD201）并涂Amp+平板（50μg/ml），并挑取克隆。
5、用如序列表SEQ ID NO.9所示的通用引物U6，用常规测序的方法鉴定获得阳性克隆。
6、37℃摇床摇菌过夜培养阳性克隆，并用AxyPrep Plasmid Miniprep Kit（AP-MN-P-250）抽提质粒，获得pGL3-U6-hCTLA4sg2质粒（如序列表SEQ ID NO.15所示）。
7、细胞培养与转染
（1）HEK293T细胞接种培养于DMEM高糖培养液中（HyClone,SH30022.01B），其中含10%FBS，penicillin（100U/ml）和streptomycin（100μg/ml）。
（2）在转染前分至12孔板中，待70%～80%密度时进行转染。
（3）按照LipofectamineTM2000Transfection Reagent（Invitrogen，11668-019）的操作手册，将0.5μg pGL3-U6-hCTLA4sg2质粒（如序列表SEQ IDNO.15所示）与1.5μg的pST1374-NLS-flag-Cas9-ZF质粒（如序列表SEQ ID NO.11所示）混匀，共转染至每孔细胞中，6～8小时后换液，并加入Blasticidin（Sigma,15205）和Puromycin（Merck,540411）药筛，48小时后收取细胞。
质粒pST1374-NLS-flag-Cas9-ZF的制备方法参见文献：Shen et al.2013,Generation of gene-modified mice via Cas9/RNA-mediated genetargeting.CellResearch23,720-723.（doi:10.1038/cr.2013.46）
8、T7EN1酶切检测
（1）将收集的细胞在裂解液（10μM Tris-HCl,0.4M NaCl,2μM EDTA,1%SDS）中用100μg/ml蛋白酶K裂解消化后，酚-氯仿抽提后溶解到50μl去离子水中。
（2）使用序列如SEQ ID NO.12和SEQ ID NO.13的引物hCTLA4testFor和hCTLA4test Rev进行PCR扩增，用AxyPrep PCR cleanup纯化获得PCR回收产物，取200ng统一稀释到20μl进行变性、退火，程序如：95℃，5min；95–85℃ at-2℃/s；85–25℃ at-0.1℃/s；hold at4℃。
（3）在20μl体系中加入T7EN10.3μl，37℃酶切30分钟后，加入2μl10X LoadingBuffer,用2.5%的琼脂糖胶电泳检测。
9、TA克隆测序
（1）将T7EN1酶切检测步骤（2）获得的PCR回收产物用rTaq进行加A反应。加A反应体系为：
700～800ng PCR回收产物
5μl10X Buffer(Mg2+free)
3μl Mg2+
4μl dNTP
0.5μl rTaq(TAKARA,R001AM)
补水至50μl体系。
37℃温育30分钟后，取1μl产物与pMD19-T vector(TAKARA,3271)连接并转化DH5α感受态细胞（TransGen,CD201）。
（2）挑取单克隆以序列如序列表SEQ ID NO.9的通用引物U6测序，根据测序结果（如序列表SEQ ID NO.19所示）发现：靶基因CTLA4缺失了靶序列的一段，基因敲除成功。
实施例4利用CRISPR-Cas9特异性敲除人CTLA4基因（用于靶向CTLA4基因的sgRNA如序列表SEQ ID NO.56所示）
1、线性化序列如序列表SEQ ID NO.10所示的pGL3-U6-sgRNA质粒。
酶切体系和条件如下：
2μg pGL3-U6-sgRNA（400ng/μl）；
1μl CutSmart Buffer；
1μl BsaI(NEB，R0535L)；
补水至50μl，37℃孵育3～4小时，每隔一段时间振荡一下并离心以防液滴蒸发至管盖上。
酶切完成后用AxyPrep PCR Clean up Kit（AP-PCR-250）纯化回收至20～40μl灭菌水中。
2、将变性、退火之后获得的可以连入U6真核表达载体的双链sgRNA寡聚核苷酸（其Forward oligo和Reverse oligo序列分别如序列表SEQ ID NO.5和6所示）与线性化的pGL3-U6-sgRNA质粒相连获得pGL3-U6-hCTLA4sg3质粒。
连接体系如下：
3μl50μM退火产物（双链sgRNA寡聚核苷酸，其forward oligo如序列表SEQ IDNO.5所示，其reverse oligo如序列表SEQ ID NO.6所示）
1μl线性化的pGL3-U6-sgRNA质粒（25ng/μl）
1μl T4ligation Buffer
0.5μl T4ligase(NEB，M0202S)
4.5μl灭菌水
16℃孵育1小时。
4、将上述步骤获得的连接产物转化DH5α感受态细胞（TransGen,CD201）并涂Amp+平板（50μg/ml），并挑取克隆。
5、用如序列表SEQ ID NO.9所示的通用引物U6，用常规测序的方法鉴定获得阳性克隆。
6、37℃摇床摇菌过夜培养阳性克隆，并用AxyPrep Plasmid Miniprep Kit（AP-MN-P-250）抽提质粒，获得pGL3-U6-hCTLA4sg3质粒（如序列表SEQ ID NO.16所示）。
7、细胞培养与转染
（1）HEK293T细胞接种培养于DMEM高糖培养液中（HyClone,SH30022.01B），其中含10%FBS，penicillin（100U/ml）和streptomycin（100μg/ml）。
（2）在转染前分至12孔板中，待70%～80%密度时进行转染。
（3）按照LipofectamineTM2000Transfection Reagent（Invitrogen，11668-019）的操作手册，将0.5μg pGL3-U6-hCTLA4sg3质粒（如序列表SEQ IDNO.16所示）与1.5μg的pST1374-NLS-flag-Cas9-ZF质粒（如序列表SEQ ID NO.11所示）混匀，共转染至每孔细胞中，6～8小时后换液，并加入Blasticidin（Sigma,15205）和Puromycin（Merck,540411）药筛，48小时后收取细胞。
质粒pST1374-NLS-flag-Cas9-ZF的制备方法参见文献：Shen et al.2013,Generation of gene-modified mice via Cas9/RNA-mediated gene targeting.CellResearch23,720-723.（doi:10.1038/cr.2013.46）
8、T7EN1酶切检测
（1）将收集的细胞在裂解液（10μM Tris-HCl,0.4M NaCl,2μM EDTA,1%SDS）中用100μg/ml蛋白酶K裂解消化后，酚-氯仿抽提后溶解到50μl去离子水中。
（2）使用序列如SEQ ID NO.12和SEQ ID NO.13的引物hCTLA4testFor和hCTLA4test Rev进行PCR扩增，用AxyPrep PCR cleanup纯化获得PCR回收产物，取200ng统一稀释到20μl进行变性、退火，程序如：95℃，5min；95–85℃ at-2℃/s；85–25℃ at-0.1℃/s；hold at4℃。
（3）在20μl体系中加入T7EN10.3μl，37℃酶切30分钟后，加入2μl10X LoadingBuffer,用2.5%的琼脂糖胶电泳检测。
9、TA克隆测序
（1）将T7EN1酶切检测步骤（2）获得的PCR回收产物用rTaq进行加A反应。加A反应体系为：
700～800ng PCR回收产物
5μl10X Buffer(Mg2+free)
3μl Mg2+
4μl dNTP
0.5μl rTaq(TAKARA,R001AM)
补水至50μl体系。
37℃温育30分钟后，取1μl产物与pMD19-T vector(TAKARA,3271)连接并转化DH5α感受态细胞（TransGen,CD201）。
（2）挑取单克隆以序列如序列表SEQ ID NO.9的通用引物U6测序，根据测序结果（如序列表SEQ ID NO.20所示）发现：靶基因CTLA4缺失了靶序列的一段，基因敲除成功。
实施例5利用CRISPR-Cas9特异性敲除人CTLA4基因（用于靶向CTLA4基因的sgRNA如序列表SEQ ID NO.69所示）
1、线性化序列如序列表SEQ ID NO.10所示的pGL3-U6-sgRNA质粒。
酶切体系和条件如下：
2μg pGL3-U6-sgRNA（400ng/μl）；
1μl CutSmart Buffer；
1μl BsaI(NEB，R0535L)；
补水至50μl，37℃孵育3～4小时，每隔一段时间振荡一下并离心以防液滴蒸发至管盖上。
酶切完成后用AxyPrep PCR Clean up Kit（AP-PCR-250）纯化回收至20～40μl灭菌水中。
2、将变性、退火之后获得的可以连入U6真核表达载体的双链sgRNA寡聚核苷酸（其Forward oligo和Reverse oligo序列分别如序列表SEQ ID NO.7和8所示）与线性化的pGL3-U6-sgRNA质粒相连获得pGL3-U6-hCTLA4sg4质粒
连接体系如下：
3μl50μM退火产物（双链sgRNA寡聚核苷酸，其forward oligo如序列表SEQ IDNO.7所示，其reverse oligo如序列表SEQ ID NO.8所示）
1μl线性化的pGL3-U6-sgRNA质粒（25ng/μl）
1μl T4ligation Buffer
0.5μl T4ligase(NEB，M0202S)
4.5μl灭菌水
16℃孵育1小时。
3、将上述步骤获得的连接产物转化DH5α感受态细胞（TransGen,CD201）并涂Amp+平板（50μg/ml），并挑取克隆。
4、用如序列表SEQ ID NO.9所示的通用引物U6，用常规测序的方法鉴定获得阳性克隆。
5、37℃摇床摇菌过夜培养阳性克隆，并用AxyPrep Plasmid Miniprep Kit（AP-MN-P-250）抽提质粒，获得pGL3-U6-hCTLA4sg4质粒（如序列表SEQ ID NO.17所示）。
6、细胞培养与转染
（1）HEK293T细胞接种培养于DMEM高糖培养液中（HyClone,SH30022.01B），其中含10%FBS，penicillin（100U/ml）和streptomycin（100μg/ml）。
（2）在转染前分至12孔板中，待70%～80%密度时进行转染。
（3）按照LipofectamineTM2000Transfection Reagent（Invitrogen，11668-019）的操作手册，将0.5μg pGL3-U6-hCTLA4sg4质粒（如序列表SEQ IDNO.17所示）与1.5μg的pST1374-NLS-flag-Cas9-ZF质粒（如序列表SEQ ID NO.11所示）混匀，共转染至每孔细胞中，6～8小时后换液，并加入Blasticidin（Sigma,15205）和Puromycin（Merck,540411）药筛，48小时后收取细胞。
质粒pST1374-NLS-flag-Cas9-ZF的制备方法参见文献：Shen et al.2013,Generation of gene-modified mice via Cas9/RNA-mediated gene targeting.CellResearch23,720-723.（doi:10.1038/cr.2013.46）
8、T7EN1酶切检测
（1）将收集的细胞在裂解液（10μM Tris-HCl,0.4M NaCl,2μM EDTA,1%SDS）中用100μg/ml蛋白酶K裂解消化后，酚-氯仿抽提后溶解到50μl去离子水中。
（2）使用序列如SEQ ID NO.12和SEQ ID NO.13的引物hCTLA4test For和hCTLA4test Rev进行PCR扩增，用AxyPrep PCR cleanup纯化获得PCR回收产物，取200ng统一稀释到20μl进行变性、退火，程序如：95℃，5min；95–85℃ at-2℃/s；85–25℃ at-0.1℃/s；hold at4℃。
（3）在20μl体系中加入T7EN10.3μl，37℃酶切30分钟后，加入2μl10X LoadingBuffer,用2.5%的琼脂糖胶电泳检测。
9、TA克隆测序
（1）将T7EN1酶切检测步骤（2）获得的PCR回收产物用rTaq进行加A反应。加A反应体系为：
700～800ng PCR回收产物
5μl10X Buffer(Mg2+free)
3μl Mg2+
4μl dNTP
0.5μl rTaq(TAKARA,R001AM)
补水至50μl体系。
37℃温育30分钟后，取1μl产物与pMD19-T vector(TAKARA,3271)连接并转化DH5α感受态细胞（TransGen,CD201）。
（2）挑取单克隆以序列如序列表SEQ ID NO.9的通用引物U6测序，根据测序结果（如序列表SEQ ID NO.21所示）发现：靶基因CTLA4缺失了靶序列的一段，基因敲除成功。
实施例6利用CRISPR-Cas9特异性敲除人CTLA4基因
用于靶向CTLA4基因的sgRNA为两个sgRNA共靶向，其序列如序列表SEQ ID NO.36和84所示，这两个sgRNA在CTLA4基因上的靶向起始位点相距24bp，可以显著提高敲除效率。
1、线性化序列如序列表SEQ ID NO.10所示的pGL3-U6-sgRNA质粒。
酶切体系和条件如下：
2μg pGL3-U6-sgRNA（400ng/μl）；
1μl CutSmart Buffer；
1μl BsaI(NEB，R0535L)；
补水至50μl，37℃孵育3～4小时，每隔一段时间振荡一下并离心以防液滴蒸发至管盖上。
酶切完成后用AxyPrep PCR Clean up Kit（AP-PCR-250）纯化回收至20～40μl灭菌水中。
2、将变性、退火之后获得的可以连入U6真核表达载体的双链sgRNA寡聚核苷酸（其Forward oligo和Reverse oligo序列分别如序列表SEQ ID NO.1和2所示）与线性化的pGL3-U6-sgRNA质粒相连获得pGL3-U6-hCTLA4sg1质粒。
将变性、退火之后获得的可以连入U6真核表达载体的双链sgRNA寡聚核苷酸（其Forward oligo和Reverse oligo序列分别如序列表SEQ ID NO.3和4所示）与线性化的pGL3-U6-sgRNA质粒相连获得pGL3-U6-hCTLA4sg2质粒。
连接体系如下：
3μl50μM退火产物（双链sgRNA寡聚核苷酸，其forward oligo如序列表SEQ IDNO.1所示，其reverse oligo如序列表SEQ ID NO.2所示）或者（双链sgRNA寡聚核苷酸，其forward oligo如序列表SEQ ID NO.3所示，其reverse oligo如序列表SEQ ID NO.4所示）
1μl线性化的pGL3-U6-sgRNA质粒（25ng/μl）
1μl T4ligation Buffer
0.5μl T4ligase(NEB，M0202S)
4.5μl灭菌水
16℃孵育1小时。
3、将上述步骤获得的连接产物分别转化DH5α感受态细胞（TransGen,CD201）并涂Amp+平板（50μg/ml），并挑取克隆。
5、用如序列表SEQ ID NO.9所示的通用引物U6，用常规测序的方法鉴定获得阳性克隆。
6、37℃摇床摇菌过夜培养阳性克隆，并用AxyPrep Plasmid Miniprep Kit（AP-MN-P-250）抽提质粒，获得pGL3-U6-hCTLA4sg1质粒（如序列表SEQ ID NO.14所示）和pGL3-U6-hCTLA4sg2质粒（如序列表SEQ ID NO.15所示）。
7、细胞培养与转染
（1）HEK293T细胞接种培养于DMEM高糖培养液中（HyClone,SH30022.01B），其中含10%FBS，penicillin（100U/ml）和streptomycin（100μg/ml）。
（2）在转染前分至12孔板中，待70%～80%密度时进行转染。
（3）按照LipofectamineTM2000Transfection Reagent（Invitrogen，11668-019）的操作手册，将0.5μg pGL3-U6-hCTLA4sg1质粒（如序列表SEQ ID NO.14所示）和0.5μg pGL3-U6-hCTLA4sg2质粒（如序列表SEQ ID NO.15所示）与1.5μg的pST1374-NLS-flag-Cas9-ZF质粒（如序列表SEQ ID NO.11所示）混匀，共转染至每孔细胞中，6～8小时后换液，并加入Blasticidin（Sigma,15205）和Puromycin（Merck,540411）药筛，48小时后收取细胞。
质粒pST1374-NLS-flag-Cas9-ZF的制备方法参见文献：Shen et al.2013,Generation of gene-modified mice via Cas9/RNA-mediated genetargeting.CellResearch23,720-723.（doi:10.1038/cr.2013.46）
8、T7EN1酶切检测
（1）将收集的细胞在裂解液（10μM Tris-HCl,0.4M NaCl,2μM EDTA,1%SDS）中用100μg/ml蛋白酶K裂解消化后，酚-氯仿抽提后溶解到50μl去离子水中。
（2）使用序列如SEQ ID NO.12和SEQ ID NO.13的引物hCTLA4testFor和hCTLA4test Rev进行PCR扩增，用AxyPrep PCR cleanup纯化获得PCR回收产物，取200ng统一稀释到20μl进行变性、退火，程序如：95℃，5min；95–85℃ at-2℃/s；85–25℃ at-0.1℃/s；hold at4℃。
（3）在20μl体系中加入T7EN10.3μl，37℃酶切30分钟后，加入2μl10X LoadingBuffer,用2.5%的琼脂糖胶电泳检测。
如图2所示，通过琼脂糖胶电泳可以发现：发生断裂末端连接修复的基因组会因为与原基因组不完全匹配，而被T7EN1切割。显示出较小的条带。
9、TA克隆测序
（1）将T7EN1酶切检测步骤（2）获得的PCR回收产物用rTaq进行加A反应。加A反应体系为：
700～800ng PCR回收产物
5μl10X Buffer(Mg2+free)
3μl Mg2+
4μl dNTP
0.5μl rTaq(TAKARA,R001AM)
补水至50μl体系。
37℃温育30分钟后，取1μl产物与pMD19-T vector(TAKARA,3271)连接并转化DH5α感受态细胞（TransGen,CD201）。
（2）挑取单克隆以序列如序列表SEQ ID NO.9的通用引物U6测序，根据测序结果（如序列表SEQ ID NO.22所示）发现：靶基因CTLA4缺失了两个靶序列之间的一段，基因敲除成功（如图3所示）。
实施例7利用CRISPR-Cas9特异性敲除人CTLA4基因
用于靶向CTLA4基因的sgRNA为两个sgRNA共靶向，其序列如序列表SEQID NO.56和69所示，这两个sgRNA在CTLA4基因上的靶向起始位点相距8bp，可以显著提高敲除效率。
1、线性化序列如序列表SEQ ID NO.10所示的pGL3-U6-sgRNA质粒。
酶切体系和条件如下：
2μg pGL3-U6-sgRNA（400ng/μl）；
1μl CutSmart Buffer；
1μl BsaI(NEB，R0535L)；
补水至50μl，37℃孵育3～4小时，每隔一段时间振荡一下并离心以防液滴蒸发至管盖上。
酶切完成后用AxyPrep PCR Clean up Kit（AP-PCR-250）纯化回收至20～40μl灭菌水中。
2、将变性、退火之后获得的可以连入U6真核表达载体的双链sgRNA寡聚核苷酸（其Forward oligo和Reverse oligo序列分别如序列表SEQ ID NO.5和6所示）与线性化的pGL3-U6-sgRNA质粒相连获得pGL3-U6-hCTLA4sg3质粒。
将变性、退火之后获得的可以连入U6真核表达载体的双链sgRNA寡聚核苷酸（其Forward oligo和Reverse oligo序列分别如序列表SEQ ID NO.7和8所示）与线性化的pGL3-U6-sgRNA质粒相连获得pGL3-U6-hCTLA4sg4载体。
连接体系如下：
3μl50μM退火产物（sgRNA寡聚核苷酸，其forward oligo如序列表SEQ ID NO.5所示，其reverse oligo如序列表SEQ ID NO.6所示）或者（sgRNA寡聚核苷酸，其forwardoligo如序列表SEQ ID NO.7所示，其reverse oligo如序列表SEQ ID NO.8所示）
1μl线性化的pGL3-U6-sgRNA质粒（25ng/μl）
1μl T4ligation Buffer
0.5μl T4ligase(NEB，M0202S)
4.5μl灭菌水
16℃孵育1小时。
4、将上述步骤获得的连接产物分别转化DH5α感受态细胞（TransGen,CD201）并涂Amp+平板（50μg/ml），并挑取克隆。
5、用如序列表SEQ ID NO.9所示的通用引物U6，用常规测序的方法鉴定获得阳性克隆。
6、37℃摇床摇菌过夜培养阳性克隆，并用AxyPrep Plasmid Miniprep Kit（AP-MN-P-250）抽提质粒，获得pGL3-U6-hCTLA4sg3质粒（如序列表SEQ ID NO.16所示）和pGL3-U6-hCTLA4sg4质粒（如序列表SEQ ID NO.17所示）。
7、细胞培养与转染
（1）HEK293T细胞接种培养于DMEM高糖培养液中（HyClone,SH30022.01B），其中含10%FBS，penicillin（100U/ml）和streptomycin（100μg/ml）。
（2）在转染前分至12孔板中，待70%～80%密度时进行转染。
（3）按照LipofectamineTM2000Transfection Reagent（Invitrogen，11668-019）的操作手册，将0.5μg pGL3-U6-hCTLA4sg3质粒（如序列表SEQ ID NO.16所示）和0.5μg pGL3-U6-hCTLA4sg4质粒（如序列表SEQ ID NO.17所示）与1.5μg的pST1374-NLS-flag-Cas9-ZF质粒（如序列表SEQ ID NO.11所示）混匀，共转染至每孔细胞中，6～8小时后换液，并加入Blasticidin（Sigma,15205）和Puromycin（Merck,540411）药筛，48小时后收取细胞。
质粒pST1374-NLS-flag-Cas9-ZF的制备方法参见文献：Shen et al.2013,Generation of gene-modified mice via Cas9/RNA-mediated gene targeting.CellResearch23,720-723.（doi:10.1038/cr.2013.46）
8、T7EN1酶切检测
（1）将收集的细胞在裂解液（10μM Tris-HCl,0.4M NaCl,2μM EDTA,1%SDS）中用100μg/ml蛋白酶K裂解消化后，酚-氯仿抽提后溶解到50μl去离子水中。
（2）使用序列如SEQ ID NO.12和SEQ ID NO.13的引物hCTLA4testFor和hCTLA4test Rev进行PCR扩增，用AxyPrep PCR cleanup纯化获得PCR回收产物，取200ng统一稀释到20μl进行变性、退火，程序如：95℃，5min；95–85℃ at-2℃/s；85–25℃ at-0.1℃/s；hold at4℃。
（3）在20μl体系中加入T7EN10.3μl，37℃酶切30分钟后，加入2μl10X LoadingBuffer,用2.5%的琼脂糖胶电泳检测。
如图2所示，通过琼脂糖胶电泳可以发现：发生断裂末端连接修复的基因组会因为与原基因组不完全匹配，而被T7EN1切割。显示出较小的条带。
9、TA克隆测序
（1）将T7EN1酶切检测步骤（2）获得的PCR回收产物用rTaq进行加A反应。加A反应体系为：
700～800ng PCR回收产物
5μl10X Buffer(Mg2+free)
3μl Mg2+
4μl dNTP
0.5μl rTaq(TAKARA,R001AM)
补水至50μl体系。
37℃温育30分钟后，取1μl产物与pMD19-T vector(TAKARA,3271)连接并转化DH5α感受态细胞（TransGen,CD201）。
（2）挑取单克隆以序列如序列表SEQ ID NO.9的通用引物U6测序，根据测序结果（如序列表SEQ ID NO.23所示）发现：靶基因CTLA4缺失了两个靶序列之间的一段，基因敲除成功（如图3所示）。
Claims (1)
1.CRISPR-Cas9特异性敲除人CTLA4基因的方法，该方法用于非诊断或治疗目的，其特征为包括如下步骤：
(1)提供sgRNA，所述sgRNA在CTLA4基因上的靶序列符合5’-N(21)GG的序列排列规则，所述sgRNA在CTLA4基因上的靶序列位于基因的外显子，所述sgRNA在CTLA4基因上的靶序列位于不同的各种剪切形式的共有外显子上，所述sgRNA在CTLA4基因上的靶序列是唯一的，所述sgRNA对应的DNA序列如序列表SEQ ID NO.36、84、56或者69任意一条序列所示，在所述sgRNA对应的DNA序列5’加上CCGG，如果序列本身在5’端已经有1或者2个G，那么就对应的省略1或者2个G，合成得到正向寡核苷酸即Forward oligo；获得所述sgRNA对应DNA的互补链，并且在互补链的5’加上AAAC合成得到反向寡核苷酸即Reverse oligo；将合成的1对互补的sgRNA寡聚核苷酸的forward oligo和reverse oligo成对变性、退火，退火之后形成可以连入U6真核表达载体的双链sgRNA寡聚核苷酸；
(2)线性化序列如序列表SEQ ID NO.10所示的pGL3-U6-sgRNA质粒；将退火的双链sgRNA寡聚核苷酸与线性化pGL3-U6-sgRNA质粒连接获得pGL3-U6-hCTLA4sg质粒；pGL3-U6-hCTLA4sg质粒转化感受态细菌并涂Amp+平板，挑选单克隆并用序列如序列表SEQ ID NO.9所示的通用引物U6通过测序鉴定出阳性克隆；37℃摇床摇阳性克隆菌过夜并用货号为AP-MN-P-250的AxyPrep Plasmid Miniprep Kit抽提pGL3-U6-hCTLA4sg质粒；
(3)用LipofectamineTM 2000 Transfection Reagent装载两种不同的pGL3-U6-hCTLA4sg质粒和序列为SEQ ID NO.11的pST1374-NLS-flag-Cas9-ZF质粒，共转染细胞；所述的两种不同的pGL3-U6-hCTLA4sg质粒的序列为SEQ ID NO.14和15，这两个pGL3-U6-hCTLA4sg质粒对应所含的两个sgRNA片段在CTLA4基因上的靶向起始位点相距24bp；或者所述的两种不同的pGL3-U6-hCTLA4sg质粒的序列为SEQ ID NO.16和17，这两个pGL3-U6-hCTLA4sg质粒对应所含的两个sgRNA片段在CTLA4基因上的靶向起始位点相距8bp；
(4)用T7EN1酶切检测和TA克隆测序确认CTLA4基因已经被敲除并获得基因敲除的细胞。
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