CN104531685B - 特异识别猪H11位点的sgRNA及其编码DNA和应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了特异识别猪H11位点的sgRNA及其编码DNA和应用，该sgRNA序列包括识别染色体上特定的DNA序列片段和骨架RNA片段，识别染色体上特定的DNA序列片段的核苷酸序列如下1)或2)：1)序列表中的序列1或序列2所示的核苷酸序列；2)将所述1)的核苷酸序列经过一个或几个碱基的取代和/或缺失和/或添加且具有与1)中的核苷酸序列具有同样功能的核苷酸序列。本发明所提供的sgRNA能高效的识别猪的H11位点，并借助Cas9酶对该位点进行高效的定点切割，其为后面的针对猪H11位点高效定点整合实验打下了坚实的基础。

Description

特异识别猪H11位点的sgRNA及其编码DNA和应用

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，具体涉及能够特异识别猪H11位点的sgRNA及其编码DNA和应用。

背景技术

2010年，斯坦福大学的Simon Hippenmeyer及其研究团队在小鼠的第11号染色体上分离并鉴定出了一个良好的基因插入位点，命名为hipp11位点，简称H11位点。H11位点位于Eif4enif1与Drg1两个基因的间隙，与Eif4enif1基因的19号外显子和Drg1基因的9号外显子相邻，大小约5kb。H11位点由于位于两个基因之间，因此安全性较高，无基因沉默效应，具有广谱的细胞表达活性。实验证实Hipp11位点定点基因修饰的小鼠与野生型小鼠生长发育无区别。目前类似的还有Ros26位点，但是该位点为一个基因，其启动子为全身性广谱表达，难以做到组织特异性表达，然而H11位点则不存在类似的困难，由于其位于两基因之间，并且不存在启动子，所以可以选择实验所需的启动子完成目的基因的时空特异性表达，更好的达到任务目标。如果在猪的基因组中定位hipp11这样安全有效的基因修饰位点，将有利于稳定转基因猪培育的技术体系。

ZFN和TALEN打靶技术是目前研究较为成熟的两种定点突变技术，但是这两种技术构建程序较为繁琐，每一个位点需要构建一对相应的核酸酶，而CRISPR/Cas9系统对特异位点的识别靠小的crRNA的引导，CRISPR区可以有一系列的crRNA组成，每个针对特异位点的crRNA只有几十个碱基，整个载体较小，相对于ZFN和TALEN载体，更加容易构建。

(CRISPR)/CRISPR-associated(Cas)是细菌和古细菌一种不断进化适应的免疫防御机制。CRISPR/Cas9利用一段小RNA来识别并剪切DNA以降解外来核酸分子。Cong等及Mali等证明Cas9系统能在293T、K562、iPS等多种细胞中，进行有效的靶向酶切，非同源重组(NHEJ)、同源重组(HR)效率在3-25％之间，与TALEN酶切效果相当。他们还证明，多个靶点可以同时进行靶向酶切。 借助于这一技术，动植物基因功能研究及育种等等都将得到迅猛的发展。

因此，寻求能高效的特异性识别猪的H11位点的序列，并借助Cas9酶对该位点进行高效的定点切割，将会为后面的针对猪H11位点高效定点整合实验打下了坚实的基础。

发明内容

本发明的一个目的是提供了能高效特异识别猪H11位点sgRNA。本发明是利用编码sgRNA部分序列的短片段DNA构建表达载体，该表达载体能够表达出该sgRNA的识别染色体上特定的DNA序列的片段序列,该sgRNA的部分序列能够特异性地识别猪H11位点。本发明还利用该sgRNA引导Cas9核酸酶(即Cas9切刻酶)对猪H11位点进行准确、高效地靶向修饰。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

特异识别猪H11位点基因的sgRNA，由101个核苷酸组成，其中5’末端20nt的RNA片段可以识别染色体上特定的DNA序列，其余81nt称为骨架RNA片段。骨架RNA片段可形成发夹结构，与Cas9核酸酶结合，从而引导Cas9核酸酶切割靶标DNA双链，DNA双链断裂后，细胞利用自身修复功能，使得靶标位点附近的序列发生变化；

其中识别染色体上特定的DNA序列片段的核苷酸序列如下1)或2)：

1)序列表中的序列1或序列2所示的核苷酸序列；

2)将所述1)的核苷酸序列经过一个或几个碱基的取代和/或缺失和/或添加且具有与1)中的核苷酸序列具有同样功能的核苷酸序列。

本发明还提供了上述的编码特异识别猪H11位点的sgRNA的DNA分子。

上述的编码特异识别猪H11位点的sgRNA的DNA分子包括但不限于编码序列1)的分子或序列2)分子。

进一步的，上述的编码特异识别猪H11位点的sgRNA的DNA分子由编码序列1的分子甲或序列2分子乙组成。

其中，上述DNA分子甲的核苷酸序列如序列表中的序列3所示。

其中，上述DNA分子乙的核苷酸序列如序列表中的序列4所示。

本发明的另一个目的是提供所述sgRNA在特异识别和靶向修饰猪H11基因中的应用。

本发明的再一个目的是特异sgRNA在构建猪H11基因突变库中的应用。所述的猪H11基因，其基因组序列是如序列表中的序列5所示。

本发明提供的特异识别猪H11基因的sgRNA，特异性强，能有效减少CRISPR/Cas9系统存在的脱靶现象，进而减少非特异性切割所引起的基因组非靶向位点的突变带来的影响。此外，本发明提供的编码该sgRNA的DNA片段，能通过构建Cas9-sgRNA表达系统实现在细胞或个体水平上对猪H11基因进行敲除或修饰，以解析猪H111基因的功能、构建猪H11基因突变库,为培育优良品系的猪提供前期技术支持。

附图说明

图1为测序检测分析酶切载体结果图。

具体实施方式

以下实施例用于进一步说明本发明，但不应理解为对本发明的限制。在不背离本发明精神和实质的前提下，对本发明所作的修饰或者替换，均属于本发明的范畴。

实施例1 sgRNA表达质粒的构建

1、在基因库中调出猪的H11位点序列，其核苷酸序列如序列表中的序列5所示，根据PAM序列选择用于基因敲除的sgRNA靶点，PAM序列为NGG：

sgRNA靶位点位置1(命名为H11-sg1):GTTCCTGGAAGTTTAGATCAGGG，相对应的sgRNA序列中识别该靶点的核苷酸序列如序列表中序列1所示；编码该上述序列的DNA序列如序列表中的序列3所示。

sgRNA靶位点位置2(命名为H11-sg2):AGATCAGGGTGGGCAGCTCTGGG，相对应的sgRNA序列中识别该靶点核苷酸序列如序列表中序列2所示；编码该上述序列的DNA序列如序列表中的序列4所示。

2、sgRNA表达质粒构建

使用唯尚力德公司的cas9/gRNA构建试剂盒(Catalog.No.VK001-01)完成构建，构建过程如下：

(1)根据前面所述的两个靶点序列，设计相应的引物序列，由北京天一辉远公司合成，具体序列见表1：

表1 两个sgRNA靶点引物序列

核苷酸名称	序列(5’-3’)
		H11-sg1-F	AAACACCGGTTCCTGGAAGTTTAGATCA
H11-sg1-R	CTCTAAAACTGATCTAAACTTCCAGGAAC
		H11-sg2-F	AAACACCGAGATCAGGGTGGGCAGCTCT
H11-sg2-R	CTCTAAAACAGAGCTGCCCACCCTGATCT

(2)寡核苷酸二聚体(oligoduplex)的形成

将合成的oligo分别稀释成10μM，分别按如下比例混合

分别混匀后，按照如下程序处理：95℃3min；将样品管放在95℃水中使上述混合物由95℃到25℃缓慢冷却；再在16℃下处理5min，最终获得寡核苷酸二聚体-1。

分别混匀后，按照如下程序处理：95℃3min；将样品管放在95℃水中使上述混合物由95℃到25℃缓慢冷却；再在16℃下处理5min，最终获得寡核苷酸二 聚体-2。

(3)寡核苷酸二聚体分别插入到载体中

在以下反应体系中进行反应：

充分混合后，室温(25℃)静置5min，获得载体Cas9/gRNA-H11-sg1。

充分混合后，室温(25℃)静置5min，获得载体Cas9/gRNA-H11-sg2。

(4)转化

分别取步骤(3)的最终产物(载体Cas9/gRNA-H11-sg1、Cas9/gRNA-H11-sg2)5μL加入到刚解冻的50μL DH5a感受态细胞中，轻弹混匀，冰浴30分钟后，42℃热激90秒，冰上静置2分钟，直接涂于氨苄抗性的平板。

(5)验证

挑5个白色菌落摇菌，提取质粒DNA进行测序。测序引物为：TGAGCGTCGATTTTTGTGATGCTCGTCAG，得到Cas9/gRNA-H11-sg1与Cas9/gRNA-H11-sg2的测序结果，上述测序结果见序列表中的序列6和序列7。该结果表明，通过上述操作能顺利将编码sgRNA的DNA序列(即靶位点1和靶位点2的序列)插入到Cas9/gRNA载体骨架中。

实施例2 sgRNA表达质粒的效率验证

1、分离猪胎儿成纤维细胞

从流产的猪胎儿中分离得到PEF细胞，具体分离方法参见文献：李红，魏红江，许成盛，汪霞，卿玉波，曾养志；版纳微型猪近交系胎儿成纤维细胞系的建 立及其生物学特征。

2、核转染

将通过实施例1取得的重组质粒Cas9/gRNA-H11-sg1与Cas9/gRNA-H11-sg2各4μg通过电转化的方式分别转染PEF细胞，得到重组细胞。转染的具体步骤是：使用核转仪(Amaxa，型号：AAD-1001S)及配套的哺乳动物成纤维细胞转染试剂盒(Amaxa，货号：VPI-1002)进行转染。首先使用0.1％胰蛋白酶(Gibco，货号：610-5300AG)消化贴壁细胞，用胎牛血清(Gibco，货号：16000-044)终止消化，磷酸盐缓冲液(Gibco，货号：10010-023)洗涤细胞两次，添加转染试剂，使用程序T-016转染细胞。

3、DNA的提取

将步骤2得到的两种重组细胞37℃培养48小时，然后收集细胞。具体步骤是：首先使用0.1％胰蛋白酶(Gibco，货号：610-5300AG)消化贴壁细胞，用胎牛血清(Gibco，货号：16000-044)终止消化，磷酸盐缓冲液(Gibco，货号：10010-023)洗涤细胞两次，添加200微升细胞裂解液GA(TIANGEN公司DNA提取试剂盒DP304中的组分)。参考试剂盒说明书步骤分别提取两种细胞总DNA。

4、PCR扩增

提取上步骤收集的细胞的基因组DNA并作为模板，用H11-F与H11-R组成的引物对进行PCR扩增，回收约370bp的PCR扩增产物。

H11-F：5’-GCGAGAATTCTAAACTGGAG-3’

H11-R：5’-GATCTGAGGTGACAGTCTCAA-3’

5、连T载体

回收步骤4得到的PCR扩增产物并与PMD-18T载体(宝生物，货号：D101A)连接，得到连接产物，具体操作步骤参见试剂盒说明书。

6、转化测序

将步骤5得到的连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，然后涂布于含500mg/ml氨苄青霉素的LB固体培养基平板上进行培养，两组分别随机挑取40 个克隆并进行测序，计算突变的克隆占总体克隆数的比例，从而算出重组质粒Cas9/gRNA-H11-sg1与Cas9/gRNA-H11-sg2质粒的效率。

实验结果见图1，结果显示：Cas9/gRNA-H11-sg1的效率为:63％(11个克隆里有7个发生突变)Cas9/gRNA-H11-sg2质粒的效率为58％(40个克隆里有23个发生突变)。上述结果表明：该sgRNA能高效的识别猪H11位点，并借助Cas9酶对该位点进行高效的定点切割。从总DNA的H11位点的突变率我们可以看出，针对Cas9/gRNA-H11-sg1，其效率为63％,说明在基因组中100条染色体的H11位点中有63条的H11位点被该sgRNA识别，并切割。同理，Cas9/gRNA-H11-sg2的效率也非常高。其为后面的针对猪H11位点高效定点整合实验打下了坚实的基础。

Claims (5)

1.特异识别猪H11位点的sgRNA，其序列由识别染色体上特定的DNA序列片段和骨架RNA片段组成，其特征在于，识别染色体上特定的DNA序列片段的核苷酸序列为序列表中的序列1或序列2所示的核苷酸序列。

2.编码权利要求1所述的特异识别猪H11位点的sgRNA的DNA分子。

3.根据权利要求2所述的DNA分子，其特征在于，由编码所述序列1的DNA分子和编码所述骨架RNA片段的DNA分子组成，或者由编码所述序列2的DNA分子和编码所述骨架RNA片段的DNA分子组成。

4.权利要求1所述的sgRNA在特异识别和靶向修饰猪H11基因中的应用。

5.权利要求1所述的sgRNA在构建猪H11基因突变库中的应用。