CN105002198B - 用于培育表达人血清白蛋白的转基因猪的成套产品及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了用于培育表达人血清白蛋白的转基因猪的成套产品及其应用。采用本发明的方法能够成功将人血清白蛋白的编码基因导入猪的受精卵中，获得的转基因小猪能够表达出人血清白蛋白。本发明的方法操作方便，耗费时间短，花费低而且成功率高，为人血清白蛋白的生产提供了新的途径。

Description

用于培育表达人血清白蛋白的转基因猪的成套产品及其应用
技术领域
本发明涉及动物基因工程领域中用于培育表达人血清白蛋白的转基因猪的成套产品及其应用。
背景技术
近十年来出现了3种新的研究手段，可以帮助科研人员对各种细胞和各种生物体内的几乎任意基因进行人工操作。这种新技术就是我们常说的“基因组编辑技术(genomeediting)”，包括锌指核酸酶(Zinc-finger nucleases,ZFN)、转录激活样效应因子核酸酶(transcription activator-like effector nucleases,TALEN)和规律成簇间隔短回文重复(Clustered regularly interspaced short palindromic repeats),CRISPR)。
锌指核酸酶和转录激活样效应因子核酸酶都是嵌合体，都是由经过设计的、序列特异性的DNA结合元件(programmable,sequence-specific DNA-binding modules)和非特异性的DNA切割结构域结合而成的。ZFN和TALEN都可以对DNA进行各种遗传修饰，这两种核酸酶的作用机制都是先对DNA双链分子进行切割，形成DNA双链断裂切口(DNA double-strand break，DSB)，然后激活细胞内的非同源末端连接(nonhomologous end joining，NHEJ)修复机制，这是一种非保真的、容易出现遗传突变的修复机制，或者同源重组(homology-directed repair，HDR)修复机制，这是一种高保真的修复机制，不容易出现突变，利用细胞自身的修复机制对DNA进行遗传学修饰。这种由序列特异性的DNA结合结构域与非特异性的DNA切割结构域组合而成的人工核酸酶就是这种基因组编辑技术的重要组成部分。这些嵌合式的核酸酶能够以极高的效率、极高的精确度对基因组进行人工修饰，切割DNA产生DSB，然后利用NHEJ或HDR等DSB修复机制完成我们所需要的各种人工修饰。由于科研人员们对锌指蛋白和TALE蛋白等蛋白的DNA结合结构域的设计能力越来越强，所以这种基因组编辑技术的应用范围也一再地被拓展。这些既简单又灵活的核酸酶在遗传工程学领域里发挥了极大的作用，其重要性也在与日俱增，已经站到了遗传工程工作的最前线。
CRISPRs是一类广泛分布于细菌和古菌基因组中的重复结构，这一模式出现在超过40％的细菌和90％的古生菌中。研究表明，CRISPR与一系列相关蛋白、前导序列一起，能为原核生物提供对抗噬菌体等外源基因的获得性免疫能力。
起初，很多研究人员假定这些奇怪的重复序列是毫无意义的，但是2005年，三个生物信息学团队报告，间隔区DNA通常和噬菌体的基因序列相匹配，表明CRISPR在微生物免疫中可能发挥了作用。马里兰州美国国家生物技术信息中心的Eugene Koonin和他的同事提出，细菌和古生菌获得了噬菌体DNA，之后将其作为RNA分子(能阻止外来DNA的匹配)的一个模板保存起来，就像真核细胞利用一个被称作核糖核酸干扰(RNAi)的系统摧毁RNA一样。2007年，Rodolphe Barrangou、Philippe Horvath和其他人证明，他们能通过添加或删除和噬菌体DNA相匹配的间隔区DNA，改变嗜热链球菌对噬菌体攻击的抵抗力，这一发现使得杜邦公司能够为食品生产培育更强壮的菌株；他们同时也发现了其中隐藏的基本原理：遭遇噬菌体入侵时，CRISPR会作出反应，此时细菌把间隔区DNA和DNA回文序列转录成一串长的RNA分子，tracrRNA(一个额外的RNA片段)和Cas9蛋白一起作用产生crRNA(源自间隔区的RNAs)。2011年，Charpentier在《自然》杂志上提出，Cas9蛋白、tracrRNA和crRNA一起以某种方法攻击和crRNA配对的外来DNA。不仅是食品科学家和微生物学家，很多领域的研究人员都意识到细菌免疫系统的重要性，因为它具备一个非常有价值的特性：以某个特定的基因序列为目标。许多科研团队利用它来删除、添加、激活或抑制人体、老鼠、斑马鱼、细菌、果蝇、酵母、线虫和农作物细胞中的目标基因，从而证明了这个技术的广泛适用性。
在以上提到的三种精确操纵基因的技术中，CRISPR的功效和易用性在各方面都更胜一筹。在切割目标DNA方面，CRISPR系统要比TALENs更高效，且能比TALENs处理更多的基因。Zhang Feng和他的同事的实验显示，CRISPR能立刻锁定和切割人体细胞中的两个基因。在与马萨诸塞州怀海德生物医学研究所发育生物学家Rudolf Jaenisch的合作中，Zhang分裂了小鼠胚胎干细胞中的5个基因，这些工作为培育转基因小鼠打下了基础，这是生物医学研究的一个关键工具。他的团队发现，这能简单地将Cas9蛋白信使RNA和两个向导RNAs注入老鼠的卵子或受精卵中。此外，通过对Cas9蛋白基因进行改构和利用一对gRNA引入不同的切割位点，CRISPR的脱靶效应问题也被克服。至此，CRISPR技术本身走向完善，并开始进入了应用阶段。
人血清白蛋白是人血浆中的主要成份，血清白蛋白在肝脏中合成后分泌进入血液，临床上主要用于：1、失血创伤、烧伤引起的休克；2、脑水肿及损伤引起的颅压升高；3、肝硬化及肾病引起的水肿或腹水；4、低蛋白血症的防治；5、新生儿高胆红素血症；6、用于心肺分流术、烧伤的辅助治疗、血液透析的辅助治疗和成人呼吸窘迫综合征。由于医用蛋白如今主要由人血提取，而有限的血液资源极大地限制了白蛋白的生产和使用，供给仍然远远不能满足市场需求。如果能制备出表达人血清白蛋白的转基因动物，将有望获得新的更充足的人血清白蛋白来源。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是如何制备人血清白蛋白。
为解决上述技术问题，本发明首先提供了用于培育表达人血清白蛋白的转基因猪的成套产品。
本发明所提供的用于培育表达人血清白蛋白的转基因猪的成套产品，含有人血清白蛋白基因的重组载体、能产生Cas9蛋白的mRNA的生物材料和能产生sgRNA的生物材料；
所述人血清白蛋白基因编码a1或a2的蛋白质：
a1、氨基酸序列是SEQ ID No.1的蛋白质；
a2、在SEQ ID No.1所示的氨基酸序列中经过取代和/或缺失和/或添加一个或几个氨基酸残基得到的具有人血清白蛋白活性的由a1衍生的蛋白质；
所述sgRNA在猪基因组中识别的靶标DNA序列为SEQ ID No.3所示的核苷酸序列。
其中，SEQ ID No.1由609个氨基酸组成。
上述成套产品中，所述人血清白蛋白基因为如下所述的核酸分子：
1)其编码序列是SEQ ID No.2的第1020-2849位的DNA分子或cDNA分子；
2)与1)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且编码所述人血清白蛋白的DNA分子或cDNA分子；
3)在严格条件下与1)或2)限定的核苷酸序列杂交，且编码所述人血清白蛋白的DNA分子或cDNA分子。
上述用于编码所述人血清白蛋白的核酸分子，本领域普通技术人员可以很容易地采用已知的方法，例如定向进化和点突变的方法，对本发明的编码所述人血清白蛋白的核酸分子的核苷酸序列进行突变。那些经过人工修饰的，与本发明分离得到的编码所述人血清白蛋白的核酸分子的核苷酸序列具有75％或者更高同一性且编码所述人血清白蛋白，均是衍生于本发明的核苷酸序列并且等同于本发明的序列。
这里使用的术语“同一性”指与天然核酸序列的序列相似性。“同一性”包括与本发明的SEQ ID No.2的第1020-2849位核苷酸所示的DNA分子或cDNA分子具有75％或更高，或85％或更高，或90％或更高，或95％或更高同一性的核苷酸序列。同一性可以用肉眼或计算机软件进行评价。使用计算机软件，两个或多个序列之间的同一性可以用百分比(％)表示，其可以用来评价相关序列之间的同一性。
所述严格条件是在2×SSC，0.1％SDS的溶液中，在68℃下杂交并洗膜2次，每次5min，又于0.5×SSC，0.1％SDS的溶液中，在68℃下杂交并洗膜2次，每次15min。
上述75％或75％以上同一性，可为80％、85％、90％或95％以上的同一性。
其中，SEQ ID No.2的第1020-2849位编码SEQ ID No.1所示的蛋白质。
上述成套产品中，所述人血清白蛋白基因的重组载体为1)或2)的载体：
1)所述人血清白蛋白基因的重组载体含有SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列；
2)将载体pDNR-LIB的SalI和SpeI识别位点间的序列替换为SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列，保持pDNR-LIB的其它序列不变，得到的重组载体pDNR-LIB-Albumin。
上述成套产品中，SEQ ID NO.2的第1-1013位所示的核苷酸序列为猪白蛋白编码基因左同源臂(albumin L1)；SEQ ID NO.2的第1020-2849位所示的核苷酸序列为人血清白蛋白基因序列(Human Albumin CDS)，SEQ ID NO.2的第2850-3165位为3’UTR序列，SEQ IDNO.2的第3172-3393位为SV40PolyA；SEQ ID NO.2的第3394-4393位所示的核苷酸序列为猪白蛋白编码基因右同源臂(albumin R1)。
上述成套产品中，所述能产生Cas9蛋白的mRNA的生物材料为pST1374-NLS-flag-linker-Cas9载体，所述pST1374-NLS-flag-linker-Cas9载体为表达所述Cas9蛋白mRNA的载体。
上述成套产品中，所述Cas9蛋白为b1或b2的蛋白质：
b1、氨基酸序列是SEQ ID No.4的蛋白质；
b2、在SEQ ID No.4所示的氨基酸序列中经过取代和/或缺失和/或添加一个或几个氨基酸残基得到的具有Cas9蛋白活性的由b1衍生的蛋白质。
其中，SEQ ID No.4由1403个氨基酸组成。
上述成套产品中，所述Cas9蛋白基因为如下所述的核酸分子：
1)其编码序列是SEQ ID No.5的DNA分子或cDNA分；
2)与1)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且编码所述Cas9蛋白的DNA分子或cDNA分；
3)在严格条件下与1)或2)限定的核苷酸序列杂交，且编码所述Cas9蛋白的DNA分子或cDNA分。
上述用于编码所述Cas9蛋白的核酸分子，本领域普通技术人员可以很容易地采用已知的方法，例如定向进化和点突变的方法，对本发明的编码所述Cas9蛋白的核酸分子的核苷酸序列进行突变。那些经过人工修饰的，与本发明分离得到的编码所述Cas9蛋白的核酸分子的核苷酸序列具有75％或者更高同一性且编码所述Cas9蛋白，均是衍生于本发明的核苷酸序列并且等同于本发明的序列。
这里使用的术语“同一性”指与天然核酸序列的序列相似性。“同一性”包括与本发明的SEQ ID No.5的核苷酸所示的DNA分子或cDNA分子具有75％或更高，或85％或更高，或90％或更高，或95％或更高同一性的核苷酸序列。同一性可以用肉眼或计算机软件进行评价。使用计算机软件，两个或多个序列之间的同一性可以用百分比(％)表示，其可以用来评价相关序列之间的同一性。
所述严格条件是在2×SSC，0.1％SDS的溶液中，在68℃下杂交并洗膜2次，每次5min，又于0.5×SSC，0.1％SDS的溶液中，在68℃下杂交并洗膜2次，每次15min。
上述75％或75％以上同一性，可为80％、85％、90％或95％以上的同一性。
其中，SEQ ID No.5由4212个核苷酸组成，其中的第1-4212位编码SEQ ID No.4所示的蛋白质。
上述成套产品中，所述sgRNA的核苷酸序列为SEQ ID No.6所示的RNA分子。
为解决上述技术问题，本发明还提供了用于培育表达人血清白蛋白的转基因猪的转基因受精卵的制备方法。
本发明所提供的用于培育表达人血清白蛋白的转基因猪的转基因受精卵的制备方法，包括如下步骤：将所述人血清白蛋白基因的重组载体、能产生Cas9蛋白的mRNA和所述sgRNA注射入离体的猪受精卵中，获得转基因受精卵。
上述方法中，所述离体的猪受精卵是以巴马香猪的卵细胞和巴马香猪的精子体内受精得到的。
上述方法中，所述人血清白蛋白基因的重组载体、所述能产生Cas9蛋白的mRNA和所述sgRNA的注射质量比具体可为35:20:10。
为解决上述技术问题，本发明还提供了培育表达人血清白蛋白的转基因猪的方法。
本发明所提供的培育表达人血清白蛋白的转基因猪的方法，包括如下步骤：
1)按照所述用于培育表达人血清白蛋白的转基因猪的转基因受精卵的制备方法制备用于培育表达人血清白蛋白的转基因猪的转基因受精卵；
2)用所述转基因受精卵培育表达人血清白蛋白的转基因猪。
上述方法中，用所述转基因受精卵培育表达人血清白蛋白的转基因猪具体可为将所述转基因受精卵置于代孕母猪的输卵管中，或者将所述转基因受精卵在体外或体内进行培养，形成转基因胚，然后再将所述转基因胚移植到代孕母猪的子宫内；饲养所述代孕母猪，产生表达人血清白蛋白的转基因猪。
本发明还提供了下述1)-8)中任一所述的应用：
1)所述成套产品在制备转基因猪的转基因受精卵中的应用；
2)所述成套产品在培育表达人血清白蛋白的转基因猪中的应用；
3)所述成套产品在制备人血清白蛋白中的应用；
4)所述用于培育表达人血清白蛋白的转基因猪的转基因受精卵的制备方法在培育表达人血清白蛋白的转基因猪中的应用；
5)所述用于培育表达人血清白蛋白的转基因猪的转基因受精卵的制备方法在制备人血清白蛋白中的应用；
6)所述转基因受精卵在在培育表达人血清白蛋白的转基因猪中的应用；
7)所述转基因受精卵在制备人血清白蛋白中的应用；
8)所述培育表达人血清白蛋白的转基因猪的方法在制备人血清白蛋白中的应用。
实验证明，采用本发明的方法能够成功将人血清白蛋白的编码基因导入猪的受精卵中，获得的转基因小猪能够表达出人血清白蛋白。本发明的方法操作方便，耗费时间短，花费低而且成功率高，为人血清白蛋白的生产提供了新的途径。
附图说明
图1为pUC57-sgRNA表达载体的结构示意图。
图2为重组载体pDNR-LIB-Albumin的结构示意图。
图3为转基因小猪的PCR扩增产物的琼脂糖凝胶电泳图。其中，1-16分别为编号为1-16号的转基因小猪；C为对照的非转基因小猪。
图4为转基因小猪的人血清白蛋白的表达水平的Western blot结果分析图。其中，1-16分别为编号为1-16号的转基因小猪；Human Plasma为人血浆；C为对照的非转基因小猪，M为蛋白质Marker。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
下述实施例中的巴马香猪为中国人民解放军第三军医大学实验动物中心的实验猪场的产品。
下述实施例中的载体pST1374-NLS-flag-linker-Cas9(Bin Shen,Jun Zhang,Hongya Wu,Jianying Wang,Ke Ma,Zheng Li,Xueguang Zhang,Pumin Zhang,and XingxuHuang.Generation of gene-modified mice via Cas9/RNA-mediated genetargeting.Cell Res.2013,23(5):720–723.)，载体具体信息见：http://www.addgene.org，公众可从北京蛋白质组研究中心获得，该生物材料只为重复本发明的相关实验所用，不可作为其它用途使用。
下述实施例中的pUC57-sgRNA表达载体(Efficient genome modification byCRISPR-Cas9nickase with minimal off-target effects.Shen B,Zhang W,Zhang J,Zhou J,Wang J,Chen L,Wang L,Hodgkins A,Iyer V,Huang X,Skarnes WC.NatMethods.2014,11(4):399-402.)，公众可从北京蛋白质组研究中心获得该生物材料，该生物材料只为重复本发明的相关实验所用，不可作为其它用途使用。
下述实施例中的载体pDNR-LIB为invitrogen公司的产品。
下述实施例中的mMESSAGET7ULTRA Transcription Kit是Ambion公司的产品，产品目录号为AM1345。
下述实施例中的miRNeasy Mini Kit是Qiagen公司的产品，产品目录号为#217004。
下述实施例中的MEGAshortscriptTM T7 Transcription Kit是Ambion公司的产品，产品目录号为AM1354。
下述实施例中的MEGAclearTM Transcription Clean-Up Kit是Ambion公司的产品，产品目录号为AM1908。
实施例1、表达人血清白蛋白转基因猪的制备
一、载体的制备
合成两条模板：TAATACGACTCACTATAGAAGCCTTTGGCACAATGAAGGttttagagctagaaATAG和CTATTTCTAGCTCTAAAACCTTCATTGTGCCAAAGGCTTCTATAGTGAGTCGTATTA，退火形成双链，采用NEB GibsonMaster Mix试剂盒将上述双链同源重组入pUC57-sgRNA表达载体(图1)中，获得重组载体pUC57-pig albumin sgRNA，重组载体pUC57-pig albumin sgRNA能产生在猪基因组中识别的靶标DNA序列为SEQ ID No.3所示的sgRNA，该sgRNA的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示。
将载体pDNR-LIB的SalI和SpeI识别位点间的序列替换为SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列，保持载体pDNR-LIB的其它序列不变，得到重组载体pDNR-LIB-Albumin，为表达人血清白蛋白基因的重组载体。其中，SEQ ID NO.2的第1-1013位所示的核苷酸序列为猪白蛋白编码基因左同源臂(albumin L1)；SEQ ID NO.2的第1020-2849位所示的核苷酸序列为人血清白蛋白的编码基因(Human Albumin CDS)，SEQ ID NO.2的第2850-3165位为3’UTR序列，SEQ ID NO.2的第3172-3393位为SV40PolyA；SEQ ID NO.2的第3394-4393位所示的核苷酸序列为猪白蛋白编码基因右同源臂(albumin R1)(图2)。
二、体外转录
pST1374-NLS-flag-linker-Cas9载体为能够表达Cas9蛋白mRNA的载体，采用AgeI酶将pST1374-NLS-flag-linker-Cas9载体进行酶切，采用乙醇沉淀回收酶切后的载体，获得线性化的pST1374-NLS-flag-linker-Cas9载体。使用mMESSAGET7ULTRATranscription Kit对线性化的pST1374-NLS-flag-linker-Cas9载体进行体外转录，具体操作参见说明书，获得体外转录产物。采用miRNeasy Mini Kit纯化体外转录产物，获得Cas9蛋白mRNA，具体操作参见说明书。
采用DraI酶将重组载体pUC57-pig albumin sgRNA进行酶切，采用乙醇沉淀回收酶切后的载体，获得线性化的重组载体pUC57-pig albumin sgRNA。使用MEGAshortscriptTMT7 Transcription Kit对线性化的重组载体pUC57-pig albumin sgRNA进行体外转录，具体操作参见说明书，获得体外转录产物。采用MEGAclearTM Transcription Clean-Up Kit纯化体外转录产物，获得靶标基因sgRNA，具体操作参见说明书。靶标基因sgRNA的识别序列为SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列，对应8q12位置的猪白蛋白基因(NCBI ReferenceSequence:NC_010450.3)的第73630094-73630072位。
三、受精卵注射
a.置凹玻片于显微镜下，低倍聚焦。
b.调节持卵管，注射针与受精卵在同一视野下后，转换到高倍镜(32X)下时位置稍微低于受精卵，以便自如地操作受精卵。该受精卵是以巴马香猪的卵细胞和巴马香猪的精子体内受精得到的。
c.挨近注射针到工作液或油界边缘，稍微进入油界。
d.移动持卵管回到受精卵下部，通过微分驱动水压控制系统使持卵管内产生温和的负压，并使持卵管末端吸住受精卵。
e.对持卵管内真空进行缓慢调节，使持卵管内受精卵轻柔地旋转，使卵内原核位于持卵管口的远侧端。
g.维持持卵管稳定，使注射针的针头紧靠受精卵的透明带，用注射针依次刺破透明带，细胞外膜，进入胞浆中。
h.采用无RNase水溶液将重组载体pDNR-LIB-Albumin、Cas9蛋白mRNA和靶标基因sgRNA按照35:20:10的质量比(ng/uL)进行混合，得到混合注射液。保持注射针位置固定，轻轻增加压力使混合注射液流入胞浆中，得到含有混合注射液的受精卵。
四、表达人血清白蛋白转基因猪的制备及鉴定
1、表达人血清白蛋白转基因猪的制备
将含有混合注射液的受精卵移入巴马香猪母猪子宫内，通过观察巴马香猪母猪发情行为来判断是否怀孕成功。将注射了含有混合注射液的受精卵的巴马香猪母猪产下的小猪称为转基因小猪。
2、表达人血清白蛋白转基因猪的鉴定
1)PCR鉴定
相关溶液的配制方法：
TSB溶液：由溶剂和溶质组成，溶剂为水，溶质由Tris-Cl(pH8.0)、SDS、EDTA和NaCl组成，Tris-Cl(pH8.0)在TSB溶液中的浓度为10mM，SDS在TSB溶液中的浓度为10mg/mL,EDTA在TSB溶液中的浓度为5mM，NaCl在TSB溶液中的浓度为100mM。
Tail salts溶液：由溶剂和溶质组成，溶剂为水，溶质由Tris-Cl(pH8.0)、NaCl和KCl组成，Tris-Cl(pH8.0)在Tail salts溶液中的浓度为10mM，NaCl在Tail salts溶液中的浓度为4.21M,KCl在Tail salts溶液中的浓度为0.63M。
剪取小米粒大小的步骤1的转基因小猪的耳朵，加入500μL的TSB溶液和10μL的蛋白酶K溶液(浓度为20mg/mL)，55℃孵育3h，然后加入200μL的Tail salts溶液，置于冰上孵育10min，然后4℃，12000rpm离心10min，收集上清液。向上清液中加入是上清液体积1/10的浓度为3M的NaoAc溶液(pH值5.2)和是上清液体积2倍的无水乙醇(预冷)，得到混合液，将混合液置于-20℃保持30min，将混合液中的丝状沉淀挑出，加入1mL的75％乙醇洗涤丝状沉淀，再将丝状沉淀挑出，将丝状沉淀干燥后加入100μL无菌水中，获得转基因小猪的基因组DNA。
以转基因小猪的基因组DNA为模板，采用下述a-f的引物对进行PCR反应验证转基因小猪中是否成功插入了人血清白蛋白的编码基因，对于获得的PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，以非转基因的小猪的基因组DNA作为对照。
PCR反应体系
反应条件
a-f的引物对序列如下：
a GCTGTGGAAACGCCTTAACC；
b AGCAGTCAGCCATTTCACCA；
c TCTCTTATTCCACTTCGGTA；
d ATTTAAAGTACTCCGTAGCC；
e ACAGATCCAGACGGCAAACA；
f AGCTACTGAGAGGATGGTCTG。
结果如图3所示，使用a和b引物对在获得的16头转基因小猪中均可以扩增出1498bp大小的片段，而对照的非转基因小猪则扩增不出该大小的片段；使用c和d引物对在获得的16头转基因小猪中均可以扩增出1314bp大小的片段，而对照的非转基因小猪则扩增不出该大小的片段；使用e和f引物对在获得的16头转基因小猪中均可以扩增出3085bp大小的片段，而对照的非转基因小猪则扩增不出该大小的片段；上述结果表明，获得的16头转基因小猪均成功转入了SEQ ID NO.2所示的含有人血清白蛋白编码基因的核苷酸序列。
2)Western blot鉴定
制胶
分离胶：制备聚丙烯酰胺分离胶5mL，凝胶浓度为10％；
浓缩胶：制备聚丙烯酰胺积层胶2mL，凝胶浓度为5％。
电泳
上下槽加入1×电泳缓冲液(1.5g Tris,7.7g甘氨酸，0.5gSDS，加水定容至500mL),按次序上样(血清0.5μL，稀释十倍，并加入1/4体积的5×电泳加样缓冲液)
电压(浓缩胶80V，分离胶120V)
电转膜仪转膜(NC膜，90mA,120min；转膜缓冲液：甘氨酸2.9g，Tris 5.8g，SDS0.37g，甲醇200mL，加ddH2O定容至1000mL)。
免疫反应
室温封闭1h(封闭液：5％(质量浓度)的脱脂牛奶)；
一抗(Albumin，CST 4929s)4℃孵育过夜，孵育结束后1xTBST洗三次，每次10min；
羊抗兔二抗(santa cruz，SC-2004)室温孵育1h，孵育结束后1xTBST洗三次，每次10min。
显色曝光
用显色试剂盒(Thermo，prod#34080)进行显色，采用GE的ImageQuant LAS500仪器进行显影。
以获得的16头转基因小猪作为实验组，以人血浆作为阳性对照，以非转基因的小猪作为对照。图4中的实验结果表明，实验组16头小猪中有14头小猪的人血清白蛋白的编码基因都得到了正确的表达，其中以2号、3号和4号转基因小猪的人血清白蛋白的表达水平较高。

Claims (9)

1.用于培育表达人血清白蛋白的转基因猪的成套产品，含有人血清白蛋白基因的重组载体、能产生Cas9蛋白的mRNA的生物材料和能产生sgRNA的生物材料；
所述人血清白蛋白基因编码的氨基酸序列是SEQ ID No.1；
含有人血清白蛋白基因的重组载体为将载体pDNR-LIB的SalI和SpeI识别位点间的序列替换为SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列得到的重组载体；
所述sgRNA在猪基因组中识别的靶标DNA序列为SEQ ID No.3所示的核苷酸序列。
2.根据权利要求1所述的成套产品，其特征在于：所述人血清白蛋白基因为编码序列是SEQ ID No.2的第1020-2849位的DNA分子或cDNA分子。
3.根据权利要求1或2所述的成套产品，其特征在于：所述能产生Cas9蛋白的mRNA的生物材料为pST1374-NLS-flag-linker-Cas9载体。
4.根据权利要求1或2所述的成套产品，其特征在于：所述Cas9蛋白为氨基酸序列是SEQID No.4的蛋白质；
所述Cas9蛋白基因为编码序列是SEQ ID No.5的DNA分子或cDNA分子。
5.根据权利要求1或2所述的成套产品，其特征在于：所述sgRNA的核苷酸序列如SEQ IDNo.6所示。
6.用于培育表达人血清白蛋白的转基因猪的转基因受精卵的制备方法，包括如下步骤：将权利要求1所述成套产品中所述的含有人血清白蛋白基因的重组载体、Cas9蛋白的mRNA和sgRNA注射入离体的猪受精卵中，获得转基因受精卵；
所述Cas9蛋白的mRNA是通过权利要求3所述的成套产品中所述的能产生Cas9蛋白的mRNA的生物材料制备获得的；
所述sgRNA为SEQ ID No.6所示的RNA分子。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于：所述离体的猪受精卵是以巴马香猪的卵细胞和巴马香猪的精子受精得到的。
8.培育表达人血清白蛋白的转基因猪的方法，包括如下步骤：
1)按照权利要求6或7所述的方法制备用于培育表达人血清白蛋白的转基因猪的转基因受精卵；
2)用所述转基因受精卵培育表达人血清白蛋白的转基因猪。
9.下述1)-8)中任一所述的应用：
1)权利要求1-5任一所述的成套产品在制备转基因猪的转基因受精卵中的应用；
2)权利要求1-5任一所述的成套产品在培育表达人血清白蛋白的转基因猪中的应用；
3)权利要求1-5任一所述的成套产品在制备人血清白蛋白中的应用；
4)权利要求6或7所述的方法在培育表达人血清白蛋白的转基因猪中的应用；
5)权利要求6或7所述的方法在制备人血清白蛋白中的应用；
6)利用权利要求6所述的方法制备获得的转基因受精卵在培育表达人血清白蛋白的转基因猪中的应用；
7)利用权利要求6所述的方法制备获得的转基因受精卵在制备人血清白蛋白中的应用；
8)权利要求8所述的方法在制备人血清白蛋白中的应用。
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