CN107760652A - CRISPR/CAS9介导药物转运体靶向性敲除的caco‑2细胞模型及其方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了CRISPR/CAS9介导药物转运体靶向性敲除的caco‑2细胞模型及其方法，该方法用于非诊断或治疗目的，包括如下步骤：对P‑gp、BCRP及MRP2转运体设计靶点特异性的sgRNA，设计的sgRNA序列如序列表中SEQ ID NO：1‑6所示，构建sgRNA表达载体；利用CRISPR/CAS9分别设计P‑gp、BCRP及MRP基因单敲除及两两组合双敲除，与hCas9质粒共转染caco‑2细胞，进行单克隆化扩大培养，即得转运体基因靶向性的caco‑2细胞模型。本发明获得的caco‑2细胞模型将有效排除不同转运体之间相互干扰，为药物转运研究提供更特异、更灵敏的细胞模型。

Description

CRISPR/CAS9介导药物转运体靶向性敲除的caco-2细胞模型 及其方法

技术领域

本发明涉及基因工程领域，具体涉及CRISPR/CAS9介导药物转运体靶向性敲除的caco-2细胞模型及其方法。

背景技术

药物转运研究是新药研发过程的重要内容。转运体，通过转运体进行继发性主动转运，即依靠存在于细胞外高浓度钠离子的势能(该势能由原发性主动转运提供)转运，即相当于间接消耗ATP的能量。例如小肠粘膜上皮细胞主动吸收葡萄糖的过程中，转运能量并不直接来自于ATP的分解，而是依靠上皮细胞(低)与肠腔液(高)之间的钠离子浓度梯度，在钠离子顺浓度梯度进入上皮细胞的同时，葡萄糖逆浓度梯度一同被转运进细胞。ATP结合转运体家族主要成员P-gp、BCRP及MRP2参与大量化合物转运，是目前常用候选转运体。然而三者底物及抑制剂的交叉反应严重影响结果分析。

CRISPR-Cas9具有更快速、简便、高效、多位点、特异性靶向敲除基因的优势。CRISPR-Cas9的工作原理是crRNA(CRISPR-derived RNA)通过碱基配对与tracrRNA(trans-activating RNA)结合形成tracrRNA/crRNA复合物，此复合物引导核酸酶Cas9蛋白在与crRNA配对的序列靶位点剪切双链DNA。而通过人工设计这两种RNA，可以改造形成具有引导作用的sgRNA(singleguide RNA)，足以引导Cas9对DNA的定点切割。作为一种RNA导向的dsDNA结合蛋白，Cas9效应物核酸酶是已知的第一个统一因子(unifying factor)，能够共定位RNA、DNA和蛋白，从而拥有巨大的改造潜力。将蛋白与无核酸酶的Cas9(Cas9nuclease-null)融合，并表达适当的sgRNA，可靶定任何dsDNA序列，而sgRNA的末端可连接到目标DNA，不影响Cas9的结合。因此，Cas9能在任何dsDNA序列处带来任何融合蛋白及RNA，这为生物体的研究和改造带来巨大潜力。也为解决上述问题提供了一种可能的选择。

发明内容

本发明的目的在于提供CRISPR/CAS9介导药物转运体靶向性敲除caco-2细胞模型及其方法，以解决上述背景技术中提出的问题。

为实现上述目的，本发明提供如下技术方案。

CRISPR/CAS9介导药物转运体靶向性敲除caco-2细胞模型的方法，该方法用于非诊断或治疗目的，包括如下步骤：

1)对P-gp、BCRP及MRP2转运体设计靶点特异性的sgRNA，设计的sgRNA序列如序列表中SEQ ID NO：1-SEQ ID NO：6所示，构建sgRNA表达载体；

2)利用CRISPR/CAS9分别设计P-gp、BCRP及MRP基因单敲除及两两组合双敲除，与hCas9质粒共转染caco-2细胞，进行单克隆化扩大培养，即得转运体基因靶向性的caco-2细胞模型。

优选的，步骤1)中，以U6启动子表达sgRNA，将设计的sgRNA序列合成Oligo，构建sgRNA表达载体。

本发明还提供由以上方法得到的caco-2细胞模型。

与现有技术相比，本发明的有益效果是：

本发明通过CRISPR/CAS9结合细胞单克隆技术，对ABC家族P-gp、BCRP及MRP进行了系列单敲除或双敲除，获得一系列基因敲除的caco-2细胞模型。该caco-2细胞模型将有效排除不同转运体之间相互干扰，为药物转运研究提供更特异、更灵敏的细胞模型。

附图说明

图1是靶位点PCR产物T7EI酶切后电泳结果图；

图2a是caco-2细胞单克隆(2A10)的示意图；

图2b是caco-2细胞单克隆(B14)的示意图；

图2c是caco-2细胞单克隆(2M1)的示意图；

图3是2A10单克隆敲除纯合子鉴定结果图；

图4是B14单克隆敲除纯合子鉴定结果图；

图5是2M1单克隆为2种基因型的敲除纯合子鉴定结果图；

图6是AM17单克隆的MRP2位点2种基因型的敲除纯合子鉴定结果图；

图7是AB16单克隆的BCRP位点敲除纯合子鉴定结果图；

图8是MB11单克隆的BCRP位点2种基因型敲除纯合子鉴定结果图；

图9a、图9b是单克隆细胞P-gp和MRP2转运体蛋白表达检测结果图；

图10是AB5和2A10单克隆的P-gp转运功能分析结果图。

具体实施方式

下面结合附图与实施例对本发明的具体实施作进一步的说明，但本发明的实施方式不限于此。

实施例1

本发明实施例中，CRISPR/CAS9介导药物转运体靶向性敲除caco-2细胞模型的方法，该方法用于非诊断或治疗目的，具体包括如下步骤：

1.针对ABC家族主要成员P-gp、BCRP及MRP2设计靶点特异性的sgRNA，构建其表达载体，并进行基因敲除有效性检测。

分别针对P-gp(NG_011513.1-ABCB1-Pgp)、BCRP(NG_032067.2-ABCG2-BCRP)及MRP2(NG_011798.1-ABCC2-MRP2)的基因表达功能区，设计特异性sgRNA，并进行脱靶分析。每个基因筛选两条特异性好、脱靶低的sgRNA，P-gp、BCRP及MRP2的sgRNA设计结果如表1所示。

表1

以U6启动子表达sgRNA，将设计的sgRNA序列合成Oligo，构建sgRNA表达载体U6-sgRNA。经测序分析均构建成功。

U6-sgRNA质粒构建过程：

(1)设计的sgRNA合成Oligo，正义链(即与靶位点相同的序列)：5’-CACC-GN19-3’，反义链：5’-AAAC-19NC-3’(反义链N19为正义链N19的反向互补序列)；

(2)2Oligo退火；U6进行BbsI酶切线性化，37℃反应2hr，切胶回收线性化片段；

(3)退火的Oligo与线性化U6酶切产物连接过夜；连接产物转化DH5α感受态细胞，涂布于含卡那霉素的LB平板生长，挑取单菌落于1mL LB液体培养基中(含卡那),37℃培养2～3h，采用sp6引物和正义链进行菌落PCR；菌落PCR为阳性的单克隆菌进行测序鉴定。测序引物为sp6。序列正确者进行扩大培养和质粒制备。

选择A26f，A154f，B88f，B172r，M38r，M70r sgRNA表达质粒与hCas9质粒共转染293T细胞，72h后提取基因组进行靶位点扩增，PCR产物进行T7EI酶切鉴定。酶切产物电泳显示，A26f有2条带，较浅，A154f有3条带，较浅，B88f有三条目地条带，B172r有2条目地条带，较浅，M38r有3条带，较清晰，M70r有三条带较清晰，如图1所示，其中A26f，A154f，B88f，B172r，M38r，M70r为sgRNA切割组，WT为未切割的野生型，M为DL2000marker。图1表明设计构建的sgRNA均能有效切割靶点。

转染293T细胞过程：

A26f，A154f，B88f，B172r，M38r，M70rsgRNA表达质粒与H-Cas9质粒共转染293T细胞(采用脂质体转染方法)，转染步骤具体如下：

(1)弃去旧培养基，加入2ml新鲜培养基进行孵育；

(2)取1ug sgRNA重组质粒和1ug hCas9质粒溶于100ul DMEM(H)中，取6ul脂质体转染试剂稀释至100ul，将稀释的脂质体转染试剂加入到质粒稀释液中，轻轻吹均匀，配成转染复合物，常温反应15min；

(3)将转染复合物滴入6well中，37℃反应5h，弃去反应液，加入新鲜培养基培养。

基因组提取过程：

(1)转染72h后，60mm dish 293T细胞全部0.25％胰酶消化，1000rpm离心3min，弃上清；

(2)加入1ml PBS重悬，转移到1.5ml离心管中，1000rpm离心3min弃上清，加入200ul PBS悬浮细胞；

(3)基因组提取试剂盒裂解法提取基因组DNA,最后用40ul DDH2O洗脱；

(4)DNA浓度测定；

(5)基因组DNA1％琼脂糖凝胶电泳。

靶点扩增：

以转染后提前的基因组为模板，对A26f，A154f，B88f，B172r，M38r，M70r进行PCR扩增；以野生型为模板，同样扩增A26f-wt，A154-wt，B88f-wt，B172r-wt，M38r-wt，M70r-wt，扩增引物如表2

表2

PCR扩增反应程序：95℃3min；95℃45s，61℃45s，72℃30s，30个循环；72℃5min；4℃保存。

T7EI酶切检测过程：

(1)使用PCR产物，取200ng统一稀释到20μl进行变性、退火，程序如：95℃，5min；95–85℃at-2℃/s；85–25℃at-0.1℃/s；hold at 4℃。

(2)在20μl体系中加入T7EN1 0.3μl，37℃酶切30分钟后，加入2μl 10X LoadingBuffer(上样缓冲液)，用2％的琼脂糖胶电泳检测。

2.P-gp、BCRP及MRP基因靶向性敲除caco-2单克隆细胞建立及鉴定

分别设计P-gp、BCRP及MRP基因单敲除及两两组合双敲除，分别将构建U6-sgRNA质粒与hCas9质粒共转染caco-2细胞，72h后加800ug/ml G418筛选，每2天换药一次，7天后消化消化细胞，有限稀释法稀释细胞，以100个细胞每孔的密度铺5个10cm平皿，15天待单克隆细胞长至0.5cm，可进行挑取。挑取细胞单克隆至24孔板培养，长满后取1/10细胞鉴定基因型，9/10的细胞传至12孔板，进行单克隆细胞扩大培养，长满后冻存。经测序鉴定，获得一系列单克隆敲除细胞，部分如P-gp敲除细胞2A10；BCRP敲除细胞B14，MRP2敲除细胞2M1，(见图2a、图2b、图2c、)。

(1)单克隆细胞扩大培养后，以表2的引物分别进行PCR扩增及测序鉴定。部分鉴定结果如图3-图8所示，其中图3是表1中A154f的sgRNA序列获得的2A10敲除纯合子鉴定结果图；图4是表1中B88f的sgRNA序列获得的B14敲除纯合子鉴定结果图；图5是表1中M70r的sgRNA序列获得的2M1敲除纯合子鉴定结果图；图6是表1中A154f和M70r的sgRNA序列获得AM17单克隆的MRP2位点2种基因型的敲除纯合子鉴定结果图；图7是表1中A154f和B88f的sgRNA序列获得AB16单克隆的BCRP位点敲除纯合子鉴定结果图；图8是表1中M70r和B88f的sgRNA序列获得MB11单克隆的BCRP位点2种基因型敲除纯合子鉴定结果图。

(2)敲除后转运体蛋白表达检测，部分结果如图9a、图9b所示，AB5由表1中A154f和B88f的sgRNA序列获得，AM3由表1中A154f和M70r的sgRNA序列获得，A9和2A10由表1中A154f的sgRNA序列获得，2M1、M10由表1中M70r的sgRNA序列获得，BM8和BM9由表1中B88f和M70r的sgRNA序列获得。与野生型相比较，部分基因敲除后的单克隆细胞未见转运体蛋白的表达，表明已经获得转运体基因敲除细胞模型。

(3)基因敲除后转运体功能分析

选择转运体特异性的底物，采用transwell系统对转运体进行药物转运分析，如图10所示。结果发现基因敲除后细胞系转运体的转运功能基本缺失。

此外，应当理解，虽然本说明书按照实施方式加以描述，但并非每个实施方式仅包含一个独立的技术方案，说明书的这种叙述方式仅仅是为清楚起见，本领域技术人员应当将说明书作为一个整体，各实施例中的技术方案也可以经适当组合，形成本领域技术人员可以理解的其他实施方式。

序列表

<110> 华南理工大学

<120> CRISPR/CAS9介导药物转运体靶向性敲除的caco-2细胞模型及其方法

<160> 6

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 23

<212> DNA

<213> caco-2细胞(A26f)

<400> 1

gatcttgaag gggaccgcaa tgg 23

<210> 2

<211> 23

<212> DNA

<213> caco-2细胞(A154f)

<400> 2

ttggcttgac aagttgtata tgg 23

<210> 3

<211> 23

<212> DNA

<213> caco-2细胞(B88f)

<400> 3

gacagcttcc aatgacctga agg 23

<210> 4

<211> 23

<212> DNA

<213> caco-2细胞(B172r)

<400> 4

gataatattt ctttctcaac tgg 23

<210> 5

<211> 23

<212> DNA

<213> caco-2细胞(M38r)

<400> 5

ctccggactg tccaggaatg agg 23

<210> 6

<211> 23

<212> DNA

<213> caco-2细胞(M70r)

<400> 6

acagtttgct caaaacaaag tgg 23

Claims (3)

1.CRISPR/CAS9介导药物转运体靶向性敲除caco-2细胞模型的方法，其特征在于，包括如下步骤：

1）对P-gp、BCRP及MRP2转运体设计靶点特异性的sgRNA，设计的sgRNA的序列如序列表中SEQ ID NO：1- SEQ ID NO：6所示，再构建sgRNA表达载体；

2）利用CRISPR/CAS9分别设计P-gp、BCRP及MRP基因单敲除及两两组合双敲除，与hCas9质粒共转染caco-2细胞，进行单克隆化扩大培养，即得转运体基因靶向性的caco-2细胞模型。

2.根据权利要求1所述的CRISPR/CAS9介导药物转运体靶向性敲除caco-2细胞模型的方法，其特征在于，步骤1）中，以U6启动子表达sgRNA，将设计的sgRNA序列合成Oligo，构建sgRNA表达载体。

3.由权利要求1-2任一所述方法得到的caco-2细胞模型。