CN108753772B

CN108753772B - 基于CRISPR/Cas技术敲除CAPNS1基因的人神经母细胞瘤细胞系的构建方法

Info

Publication number: CN108753772B
Application number: CN201810298998.6A
Authority: CN
Inventors: 龙鼎新; 朱家佳; 李小玲; 杨越; 唐乖
Original assignee: Nanhua University
Current assignee: Nanhua University
Priority date: 2018-04-04
Filing date: 2018-04-04
Publication date: 2020-10-30
Anticipated expiration: 2038-04-04
Also published as: CN108753772A

Abstract

本发明涉及基因工程技术领域，尤其涉及基于CRISPR/Cas技术敲除CAPNS1基因的人神经母细胞瘤细胞系的构建方法。本发明提供了敲除人神经母细胞瘤细胞CAPNS1基因的方法，质粒转染SK‑N‑SH细胞后，制备单克隆，Cruiser^TM Enzyme酶切后疑似为阳性克隆，单克隆测序结果显示SK‑N‑SH细胞CAPNS1基因敲除细胞系构建成功；并且，在CAPNS1^‑/‑组，CAPNS1蛋白及Calpain1和Calpain2蛋白水平明显降低。结果表明SK‑N‑SH细胞CAPNS1基因敲除细胞系构建成功。

Description

基于CRISPR/Cas技术敲除CAPNS1基因的人神经母细胞瘤细胞系的构建方法

技术领域

本发明涉及基因工程技术领域，尤其涉及敲除人神经母细胞瘤细胞 CAPNS1基因的方法。

背景技术

钙蛋白酶(calpain)是一组高度保守的特异性Ca²⁺依赖性细胞内中性蛋白酶，其活性主要与细胞内Ca²⁺浓度有关。calpain在机体的生理过程中发挥着重要作用，其不仅与细胞内蛋白质的水解关，还参与细胞自噬、细胞周期调控与凋亡、细胞骨架重构、葡萄糖转运、细胞信号转导等正常的生理过程[3,4]。自在大鼠的脑组织中首次发现一种可溶的Ca²⁺依赖的中性蛋白酶以来，研究者们越来越关注这种蛋白酶在体内的作用。目前，研究发现在哺乳动物中calpain 存在15种亚型，其中，calpain1(μ-calpain)和calpain2(m-calpain)在体内广泛表达，且研究也较为广泛。Calpain1和calpain2主要由80kD的大亚基和30kD的小亚基(calpain-s1，CAPNS1)组成，CAPNS1是calpain1和calpain2活性所必需的，而且也是细胞迁移，凋亡和存活所必需的。

人神经母细胞瘤细胞(human neuroblastoma cell,HNC)是研究神经系统基因功能和神经毒性机制的良好的体外模型，建立敲除CAPNS1基因的人神经母细胞瘤细胞模型有利于对CAPNS1蛋白的作用的进一步研究，更有利于对神经系统多种疾病机理的研究。

基因敲除是通过DNA序列改变，出现基因功能的“全或无”表象。基因沉默技术是以不改变DNA序列为前提，使基因沉默，即基因不表达或低表达。基因编辑技术是指在基因组水平精确地进行基因编辑，其是通过精确识别靶细胞DNA片段中靶点的核苷酸序列，利用核酸内切酶对DNA靶点序列进行切割，从而完成对靶细胞DNA目的基因片段的敲除、加入等过程。基因敲除构建出的突变型细胞系比基因沉默构建的细胞系稳定。细胞基因沉默的效率并不总是非常高，也不十分稳定，影响实验结果敏感性和可靠性。

继锌指核酸酶(ZFN)和转录激活因子样效应物核酸酶(TALENs)基因编辑技术之后，第三代基因编辑技术CRISPR/Cas技术是目前运用最为广泛的基因技术。CRISPR/Cas是一种来源于原核生物适应性免疫系统，通过人工改良而得。相比ZFN和TALENs，CRISPR/Cas技术具有成本低、可同时进行多位点编辑、效率高等优势。CRISPR/Cas系统分为3种，其中II型最为简单，研究得也较多。该系统主要包含非特异性Cas9核酸酶和sgRNA两部分，其中sgRNA具引导和检测作用；Cas9是一种RNA依赖的DNA内切核酸酶，其利用单一向导 RNA(sgRNA)使双链DNA断裂，起到剪刀作用。

脱靶效应是存在于所有基因组靶向修饰技术中的一道难题，它会对基因组非特性序列进行切割，造成未知突变，增加后期的鉴定工作量。CRISPR/Cas9 系统中，对靶序列的识别主要是依靠一段20bp的短RNA，但是研究表明当存在单个甚至多达5个碱基错配时，切割仍能正常发生。进一步研究发现，在这20bp中只有位于PAM位点前12bp的种子序列对靶位点识别影响较大，即总共只有14bp(PAM中的GG和种子序列)是靶位点识别的关键序列。这在生物体庞大的基因组中很容易出现脱靶位点，从而引入意外突变。除此之外，Cas9蛋白或sgRNA的浓度也对脱靶活性产生影响。

而神经细胞本身较其他细胞的培养较为苛刻，是一种转染质粒较难的细胞系，且转染效率低，而电转对神经细胞的伤害也较大，因此，对于转染条件的摸索较不易。在筛选单克隆时，神经细胞生长培养较难。综上，构建敲除人神经母细胞瘤细胞CAPNS1基因并不容易。

发明内容

有鉴于此，本发明要解决的技术问题在于以CRISPR/Cas技术敲除人神经母细胞瘤细胞CAPNS1基因的方法及细胞系，其能够成功、稳定的敲除掉人神经母细胞瘤细胞中的CAPNS1基因。

本发明提供了人CAPNS1基因第4外显子和/或第5外显子在构建 CAPNS1基因敲除人神经母细胞瘤细胞中的应用。

本发明还提供了靶向CAPNS1基因第4外显子的sgRNA，其核苷酸序列如SEQ IDNO.1和SEQ ID NO.2所示。

靶向CAPNS1基因第5外显子的sgRNA，其核苷酸序列如SEQ ID NO.3 所示。

本发明试验表明，采用CAPNS1基因的第1～3外显子区域的靶位点构建出来的载体在转染细胞后，没有筛选到纯合子。而采用CAPNS1基因的第4～5 外显子的CDS区作为靶点，成功地构建了CAPNS1基因敲除SK-N-SH细胞株。

本发明还提供了如SEQ ID NO.4～9所示的核苷酸序列的6条敲除 CAPNS1基因的靶标寡核苷酸序列。

所述SEQ ID NO.4～9的核苷酸序列中，SEQ ID NO.4～5以SEQ ID NO.1 为靶序列。SEQ ID NO.6～7以SEQ ID NO.2为靶序列。SEQ ID NO.8～9以SEQ ID NO.3为靶序列。

本发明还提供了敲除CAPNS1基因的载体，包括骨架载体和dsDNA片段；所述dsDNA片段由SEQ ID NO.4～5退火形成；或由SEQ ID NO.6～7退火形成；或由SEQ ID NO.8～9退火形成。

本发明中，所述骨架载体为pGK1.1。

所述敲除CAPNS1基因的载体的制备方法为，将dsDNA与线性化的骨架载体T4DNALigase酶连接。

本发明还提供了敲除CAPNS1基因的试剂，包括本发明提供的靶标寡核苷酸序列或本发明提供的敲除载体。本发明还提供了一种敲除人神经母细胞瘤细胞CAPNS1基因的方法，将本发明提供的敲除载体转染入人神经母细胞瘤细胞中，获得敲除CAPNS1基因的人神经母细胞瘤细胞株。

本发明中，所述人神经母细胞瘤细胞为SK-N-SH细胞。

所述SK-N-SH细胞为对数期的SK-N-SH细胞。

本发明中，所述转染采用电转染，转染的电压为1400V。

转染中，所述载体的浓度不低于1μg/μL。

以本发明提供方法构建的敲除CAPNS1基因的人神经母细胞瘤细胞。

本发明提供了敲除人神经母细胞瘤细胞CAPNS1基因的方法，质粒转染 SK-N-SH细胞后，制备单克隆，Cruiser^TMEnzyme酶切后疑似为阳性克隆，单克隆测序结果显示SK-N-SH细胞CAPNS1基因敲除细胞系构建成功；并且，在CAPNS1^-/-组，CAPNS1蛋白及Calpain1和Calpain2蛋白水平明显降低。结果表明SK-N-SH细胞CAPNS1基因敲除细胞系构建成功。

附图说明

图1 Pgk1.1质粒图谱；

图2载体酶切后的电泳检测图；其中泳道1是原质粒对照，M为marker， 2-4为切开的载体

图3菌落PCR检测电泳图；M为Marke菌落PCR检测电泳图k；1、2 为CAPNS1-gRNA1菌落PCR检测电泳图；3、4为CAPNS1-gRNA2菌落PCR 检测电泳图；5、6为CAPNS1-gRNA3菌落PCR检测电泳图

图4 sgRNA测序验证；A、B、C分别代表插入PGK1.1载体的sgRNA1、 sgRNA2、sgRNA3序列测序图；

图5 sgRNA测序比对结果；A、B、C分别表示sgRNA1位点、sgRNA2 位点、sgRNA3位点比对结果；

图6 CAPNS1基因Cruiser验证；

图7 SK-N-SH细胞CAPNS1基因敲除细胞系单克隆测序；

图8 CAPNS1基因敲除SK-N-SH细胞TA克隆测序及比对；

图9 CAPNS1敲除后CAPNS1、calpain1和calpain2蛋白表达情况；

图10不同电压转染SK-N-SH细胞结果；

图11 CAPNS1基因敲除载体转染后的混克隆测序验证。

具体实施方式

本发明提供了以CRISPR/Cas技术敲除人神经母细胞瘤细胞CAPNS1基因的方法及细胞系，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。

本发明采用的试材皆为普通市售品，皆可于市场购得。

下面结合实施例，进一步阐述本发明：

实施例

1)设计Crispr/cas9敲除靶位点

首先，需要在靶标DNA区域中设计一对20bp左右的oligo DNA，通过以下在线工具设计：

麻省理工学院的CRISPR Design：http://crispr.mit.edu/

选取CAPNS1基因所有转录本公共的CDS区，找出公共CDS区所处的外显子进行靶位点设计，选择第四个和第五个外显子进行靶位点设计。

3个靶位点序列信息：

CAPNS1-gRNA1：AGTTCGACACTGACCGATCAGGG(SEQ ID NO.1)

CAPNS1-gRNA2：TGAACTCCCAGGTGCCTTTGAGG(SEQ ID NO.2)

CAPNS1-gRNA3：CACTTTCATCTGAGTAGCGTCGG(SEQ ID NO.3)

2)引物添加接头

引物合成需在靶序列头部添加额外的碱基，正向引物添加CACC，反向引物添加AAAC，需要特别注意的是靶序列的第一个碱基必须是G，如果你选取的靶序列第一个碱基不是G，可自行在靶序列前加一个G，靶序列引物设计如下：

CAPNS1-1F：CACCGAGTTCGACACTGACCGATCA(SEQ ID NO.4)

CAPNS1-1R：AAACTGATCGGTCAGTGTCGAACTC(SEQ ID NO.5)

CAPNS1-2F：CACCGTGAACTCCCAGGTGCCTTTG(SEQ ID NO.6)

CAPNS1-2R：AAACCAAAGGCACCTGGGAGTTCAC(SEQ ID NO.7)

CAPNS1-3F：CACCGCACTTTCATCTGAGTAGCGT(SEQ ID NO.8)

CAPNS1-3R：AAACACGCTACTCAGATGAAAGTGC(SEQ ID NO.9)

3)Oligo杂交，敲除载体连接反应

将合成后的2条单链oligo DNA稀释成10μM，退火形成dsDNA，再与线性化后的pGK1.1linear vector(cat.no.GP0134，图谱如图1)载体连接，可直接用T4DNA Ligase连接，退火反应体系如下：

将以上体系瞬时离心后，置于PCR仪中95℃孵育3min，孵育后自然冷却20min。取1μl的杂交后的dsDNA进行T4DNA Ligase连接反应，反应体系如下：

将以上体系瞬时离心后，置于PCR仪中16℃孵育30min。

pGK1.1质粒包含了含Cas9核酸酶表达框和gRNA克隆框2个重要原件，其图谱如下，大小为10656bp。VSP primer：CATATGCTTACCGTAACTT

GAAAG序列位于载体的U6启动子区域。下游负链Oligo序列即靶位点的反向互补序列，位于载体的双BbsI酶切位点。(靶位点替换双BbsI酶切位点)。载体经酶切后，获得10kb左右片段，见图2。

4)转化Top10感受态

①从-80℃冰箱中取1管Top10感受态，置冰上融解。

②融解后加入10μl连接产物，轻弹混匀，冰上孵育30min。

③42℃水浴热击60sec，迅速拿出置冰上冷却2～3min。

④向管中加入800μl无抗SOC液体培养基，至摇床(37℃/160rpm) 恢复培养培养45min。

⑤4500rpm离心5min，弃去800μl上清，将沉淀悬在剩余的100μl上清中，均匀涂布于含Kan抗性的的筛选平板上，倒置培养过夜。

5)筛选阳性重组子

第二天使用上游引物VSP primer与下游负链Oligo引物进行菌落PCR筛选，阳性克隆PCR正确大小应为100bp，筛选到的阳性克隆抽质粒进一步测序验证。测序正确的质粒浓缩到1μg/μl浓度以上。

使用上游引物VSP primer与下游负链Oligo引物进行菌落PCR筛选，均能扩增出100bp大小的片段，说明所检测单克隆全为阳性，见图3。测序发现插入序列正确，见图4。SeqMan软件测序比对结果正确，载体构建成功，见图5。

6)电转染靶细胞(cat.no.GP7901)

①取状态良好的对数生长期SK-N-SH细胞悬液台盼蓝计数，确定细胞数及细胞活力(细胞活力>95％)。

②取5×10⁶个细胞于15ml离心管中，离心弃上清(1000rpm/4min)。

③将细胞沉淀悬浮于210μl DPBS中，转移至1.5ml EP管中，加入所需量构建好的敲除质粒5～8μg(质粒浓度要求1μg/μl以上)，轻轻混匀。

④将上述细胞质粒混合液用专用电转枪头转移至电击杯中，确定电击杯中溶液无气泡，且液面凸起后，盖上电击杯盖并至于电转仪，设定好电转条件后进行电转。待显示峰图正常后取出细胞液转移至六孔板培养基中(培养基需事先37℃预热且无抗生素)。

结论：1200V、1300V和1400V三个条件，1400V电转效率较高且死细胞较少，建议使用1400V。

药杀浓度结果：Puro 1ug/ml；

单克隆验证结果：能长成单克隆细胞，3cell/孔；图10。

7)pool细胞测序检测敲除效率

①电转72hr后，pool细胞台盼蓝计数。

②在筛选阳性克隆之前，需对pool细胞(混合克隆)的敲除效率进行体内验证。

③一般靶位点附近的序列测序中(图11)，阳性样品应在靶点位置及之后的序列中出现套峰，如敲除效率较低时，信号强度往往较低，影响判断；

根据图11的测序结果，可以看出在靶点位置及之后的序列中明显出现套峰，初步认为阳性克隆的存在。

8)单克隆的制备和生长

有限稀释法稀释细胞至10块96孔板中，37℃，CO₂培养箱中静置培养；一周后观察单克隆生长情况，约两周后将长起来的单克隆转移至48孔中扩大培养；当细胞长满48孔1/2时，即可取出一部分(10²～10⁴)，使用Genloci TNA 抽提试剂盒(cat.no.GP0155,GP0156)提取细胞基因组。

9)单克隆基因组DNA的提取

取10²～10⁴个细胞于1.5ml EP管中，室温1500rpm离心5min，小心吸掉培养液。

加入150μl PBS重悬细胞，室温1500rpm离心5min，小心弃去上清。

重复步骤2一次。

向离心管中加入适量体积(推荐体积为50～200μl)预先配制的溶液A 与溶液B的混合液，枪头吹打5次，冰上放置10min，使细胞充分裂解。

加入两倍体积的无水乙醇，颠倒混匀，-20℃条件下沉淀20min以上。

4℃，12000rpm，离心20min，弃上清。

加入400～500μl预冷的75％乙醇洗涤沉淀，4℃，12000rpm，离心10 min，小心弃去上清，自然晾干(不超过5min为宜)。

加入适量体积(推荐体积为10-30μl)灭菌的双蒸水溶解沉淀，溶液可直接用于PCR反应，或于-20℃保存。

10)PCR扩增目的片段

引物设计

在敲除靶位点附近设计高特异性的Primers，扩增产物长度为分别为455 bp。Primers引物序列如下：

CAPNS1-seqF3：AAGCCATGGAGACACTATGC

CAPNS1-seqR3：TGGTCCATAGAGGTCATAGG

PCR扩增获得杂交DNA

在灭菌PCR管中配制如下反应体系，使用高特异性的Primers，扩增获得野生型和突变型充分杂交的DNA产物。

PCR反应程序如下：

自然冷却至40℃以下(野生型片段与突变型片段杂交)。

PCR结束后，取2～3μl进行电泳检测，要求目的片段明亮并且单一。

11)Cruiser^R Enzyme酶切筛选阳性克隆

在灭菌PCR管中配制如下反应体系：

45℃反应20min后立即向上述10μl反应体系内加入2μl 6×Stop Buffer，随后进行琼脂糖电泳检测或置于-20℃保存。

根据扩增引物及理论敲除位点位置，扩增产物约455bp，扩增目的大小明显变小或者可以切出条带的克隆为疑似阳性克隆。从图6可以看出，呈现的条带在400bp和500bp之间，疑似为阳性克隆。

12)测序筛选阳性克隆

对Crusier酶切初步筛选出来的阳性克隆进行测序验证，进一步确认阳性克隆(图7)。TA克隆测序结果比对发现两个亲本都缺失35bp： TCAGGGACCATTTGCAGTAGTGAACTCCCAGGTGC，见图8。CAPNS1基因敲除SK-N-SH细胞株构建成功。

13)TA克隆

对于阳性克隆中，两个等位基因突变情况不一样的阳性克隆，重新做TA 克隆后送测序，跟野生型比对，确定每个等位基因的突变情况。

14)Western blot检测CAPNS1、calpain1和calpain2蛋白表达情况

对稳定CAPNS1基因敲除后的SK-N-SH细胞中的CAPNS1蛋白及活性受 CAPNS1调节的calpain1和calpain2蛋白表达进行western blot分析，结果显示，与对照SK-N-SH细胞(CAPNS1^+/+)相比，稳定CAPNS1基因敲除后的 SK-N-SH细胞(CAPNS1^-/-)中CAPNS1、calpain1和calpain2的蛋白表达明显降低。见图9。

以上仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

序列表

<110> 南华大学

<120> 基于CRISPR/Cas技术敲除CAPNS1基因的人神经母细胞瘤细胞系的构建方法

<130> MP1803791

<160> 9

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

agttcgacac tgaccgatca ggg 23

<210> 2

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

tgaactccca ggtgcctttg agg 23

<210> 3

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

cactttcatc tgagtagcgt cgg 23

<210> 4

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

caccgagttc gacactgacc gatca 25

<210> 5

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

aaactgatcg gtcagtgtcg aactc 25

<210> 6

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

caccgtgaac tcccaggtgc ctttg 25

<210> 7

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

aaaccaaagg cacctgggag ttcac 25

<210> 8

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

caccgcactt tcatctgagt agcgt 25

<210> 9

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

aaacacgcta ctcagatgaa agtgc 25

Claims

1.靶向人CAPNS1基因CDS区第4外显子和/或第5外显子的sgRNA在构建CAPNS1基因敲除的人神经母细胞瘤细胞系的应用，

所述应用为非疾病治疗的应用，其中：

靶向CAPNS1基因第4外显子的sgRNA，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.2所示；

靶向CAPNS1基因第5外显子的sgRNA，其核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。

2.扩增SEQ ID NO.1~3所示的sgRNA的引物，所述引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.4~9所示。

3.敲除CAPNS1基因的载体，其特征在于，包括骨架载体和dsDNA片段；所述dsDNA片段由SEQ ID NO.4~5退火形成；或由SEQ ID NO.6~7退火形成；或由SEQ ID NO.8~9退火形成。

4.敲除CAPNS1基因的试剂，其特征在于，包括权利要求2所述的引物或权利要求3所述的载体。

5.一种敲除人神经母细胞瘤细胞CAPNS1基因的非疾病治疗的方法，其特征在于，将权利要求3所述的载体转染入人神经母细胞瘤细胞中，获得敲除CAPNS1基因的人神经母细胞瘤细胞系。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述人神经母细胞瘤细胞为SK-N-SH细胞。

7.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述转染采用电转染，转染的电压为1400V。

8.权利要求5~7任一项所述方法构建的敲除CAPNS1基因的人神经母细胞瘤细胞。