CN104357422A - 转录激活子样效应因子核酸酶及其编码基因与应用 - Google Patents

转录激活子样效应因子核酸酶及其编码基因与应用 Download PDF

Info

Publication number
CN104357422A
CN104357422A CN201410521124.4A CN201410521124A CN104357422A CN 104357422 A CN104357422 A CN 104357422A CN 201410521124 A CN201410521124 A CN 201410521124A CN 104357422 A CN104357422 A CN 104357422A
Authority
CN
China
Prior art keywords
pair
mir
dna
sequence
protein
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN201410521124.4A
Other languages
English (en)
Inventor
宋春娇
茹国美
张伟光
杨万雷
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Shaoxing Peoples Hospital
Original Assignee
Shaoxing Peoples Hospital
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Shaoxing Peoples Hospital filed Critical Shaoxing Peoples Hospital
Priority to CN201410521124.4A priority Critical patent/CN104357422A/zh
Publication of CN104357422A publication Critical patent/CN104357422A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/16—Hydrolases (3) acting on ester bonds (3.1)
    • C12N9/22—Ribonucleases RNAses, DNAses
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/10—Type of nucleic acid
    • C12N2310/14—Type of nucleic acid interfering N.A.
    • C12N2310/141—MicroRNAs, miRNAs

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)

Abstract

本发明涉及转录激活子样效应因子核酸酶及其编码基因与应用，包括3对短肽，3对短肽分别为第一对短肽、第二对短肽和第三对短肽，第一对短肽识别SEQIDNO.1和SEQIDNO.2的DNA序列，第二对短肽识别SEQIDNO.3和SEQIDNO.4的DNA序列，第三对短肽识别SEQIDNO.5和SEQIDNO.6的DNA序列。本发明利用这3对短肽构建获得的转录激活子样效应因子，能够分别特异识别人miRNAs：miR-133b、miR-141和miR-488基因种子序列附近的二段相邻核苷酸；利用这3对转录激活子样效应因子构建获得的转录激活子样效应因子核酸酶，能够对人miRNAs：miR-133b,miR-141和miR-488基因进行准确、高效地打靶。

Description

转录激活子样效应因子核酸酶及其编码基因与应用
技术领域
本发明涉及基因工程领域，具体为转录激活子样效应因子核酸酶及其编码基因与应用，尤其为应用于人类miRNAs基因的敲除。
背景技术
基因组靶向修饰是近年来生命科学研究的热点之一，特别是在基因治疗人类疾病方面，基因组靶向修饰具有广阔的应用前景。通过转基因或者基因敲除等操作改变基因的遗传组成，获得满足各种需要的基因工程工具。传统较常用的转基因方法为质粒稳定转染法、反转录病毒携带法和同源重组法。但质粒转染稳定筛选的插入位点随机，且需要抗生素维持，容易导致非正常的细胞表型；而反转录病毒携带目的基因的效率虽高，但是插入位点不确定，影响其它内源基因的表达，限制了该方法的应用；另外，同源重组法虽然可以定点插入，但是成功率很低（重组概率为10-6-10-7）。
目前，基因组工程学中的三大利器为：ZFN（Zinc Finger Nucleases）、TALEN（Transcription Activator-like Effector Nuclease）和CRISPR/Cas9。
ZFN是指锌指蛋白，是转录因子，每个模块识别3-4个碱基序列，将这些模块混合搭配，可以靶定任何序列，然后，通过C末端的Fok I核酸内切酶结构域可以切断双链DNA分子。Sangamo生物科学公司和Sigma- Aldrich公司已经将ZFN技术商业化，推出CompoZr® ZFN平台。但是，由于锌指蛋白之间存在相互作用，锌指模块与DNA序列之间没有一个简单的对应关系，所以以锌指蛋白为基础设计针对序列特异性DNA结合蛋白依然是个难题，并且花费昂贵，经常要做大规模的筛选，构建过程长达几周至数月。
CRISPR/Cas9系统是由短的向导RNA介导，Cas9核酸酶在特定的双链DNA位点上产生断裂。CRISPR/Cas可通过添加多个向导RNA而实现多重编辑。然而，由于向导RNA序列比ZFN或TALEN所靶定的序列短，致使脱靶效应高。但Church最近发现，通过利用Cas9的一种突变形式（只切割单链DNA）和两个紧挨着的向导RNA，有可能大大提高系统的切割位点保真性，降低脱靶效应。
TALEN技术是一种崭新的分子生物学工具。TALEN是转录激活样效应因子，来源于黄单胞杆菌。利用TALEN蛋白的核酸结合结构域的氨基酸序列与核酸序列有恒定的对应关系，可组装成特异结合任意DNA序列的模块化蛋白，再通过添加非特异内切酶Fok I结构域，TALEN蛋白在理论上可以靶向切割任意基因组DNA双链。TALEN蛋白中DNA结合域为高度保守的重复单元，每个重复单元含有34个氨基酸，除了第12和13位氨基酸变化外，其它氨基酸都是相同的，这两个可变氨基酸被称为重复序列可变的双氨基酸残基（repeatvariable di-residues，RVD），与碱基识别相关。TALEN识别DNA的机制在于每个重复序列的RVD可以特异识别DNA的1个碱基，HD特异识别C碱基，NI识别A碱基，NN识别G碱基，NG识别T碱基。另外，通过对天然TALEN的研究发现，TALEN蛋白框架固定识别1个T碱基，所以TALEN的识别序列总是以T碱基开始。
在真核细胞内，TALEN切割的双链DNA，可以激活两条保守的DNA修复通路。非同源末端连接修复（non-homologous end joining，NHEJ），细胞基本上磨平断裂DNA的两端，再将其彼此拉近，将断裂的染色体重新连接，这个过程往往产生移码，或者在断裂位点引进小片段插入或删除，影响基因功能或产生基因敲除效应。同源指导修复（homology-directed repair，HDR）是指利用相似序列的DNA供体模板，代替断裂点周围的DNA序列，从而实现特定突变或导入外源DNA序列的目的。在本发明专利中，采用携带同源模板的pMD18载体共同转染细胞系的方法，使细胞基因组在TALEN切断双链DNA分子时，利用pMD18载体提供的同源序列，高效精确地对基因组进行编辑。
TALEN技术可以广泛的应用于基因组编辑的各个方面：细胞水平的基因敲除，定点突变，结构域缺失，定点整合等等，在疾病治疗领域具有广泛的应用前景。目前TALEN 技术主要的缺陷是效率相对较低，一般在5%-20%，无法直接获取100%编辑的细胞，只能通过挑选阳性的单克隆细胞，扩增成为稳定株。
miRNAs是一类进化上高度保守的非编码单链RNA，长度通常在22nt左右。自1993年，Lee，Feinbaum和Ambros等在线虫体内发现了第一个miRNA（lin-4）以来，miRNAs的数据与日俱增，miRNAs相关预测软件也日益成熟。miRNAs由基因组DNA编码，在RNA聚合酶Ⅱ的作用下转录成为pri-microRNAs，通过Drosha和Dicer等一系列酶切之后形成成熟的miRNAs，最终与多种蛋白共同形成miRNAs诱导的沉默复合体（miRNA-induced silencing complex，miRICS）主要结合于靶mRNA的3'-UTR区域，阻遏翻译甚至直接降解mRNA，抑制基因表达。目前，已经有超过2500余种人类miRNAs被发现。miRNAs参与多种生物学功能，如调节细胞发育、分化、增殖、凋亡等。一些miRNAs在癌症发生发展中发挥作用，其中一些miRNAs抑制肿瘤发生，称为tumor suppressor miRNAs（TSmiRs）；另一些miRNAs促进肿瘤发生，则称为oncogenic miRNAs，即oncomiRs。目前，针对miRNAs的基因操作主要分为两种：1.化学合成的反义寡核苷酸，其序列与成熟miRNAs序列互补，通过抑制miRNAs而发挥作用；2.与天然miRNAs序列相同的小分子，可增强miRNAs的作用，此方法的作用机制类似于RNA干扰，不同的是，天然miRNAs因为其序列来源于细胞基因组，体内存在miRNAs表达调控机制，故较RNAi脱靶效应小，免疫反应轻。但是，由于此两种miRNAs的基因操作均不能在基因组水平改造miRNAs，故其起效时间持续短、疗效不稳定、效果不确定。2014年，美国加利福尼亚州立大学的Claudia研究组针对人类miR-21基因在细胞系HEK-293中成功实现了双敲除。现阶段，涉及人类miRNAs基因敲除的问题主要有：1. miRNAs编码序列仅300核苷酸左右，比较难找到高效的TALEN打靶序列；2. miRNAs的拷贝数可能不止一个，同家族成员也为多个，故有效的双敲除和多敲除是关键问题；3. miRNAs多协同发挥作用，敲除单个miRNAs基因的治疗作用有待考察。本发明对人类miRNAs：miR-133b, miR-141和miR-488基因进行敲除，采用新兴的TALEN技术，针对位点为miR-133b, miR-141和miR-488的种子序列，以达到有效去除miRNAs的作用。
发明内容
针对现有技术的上述技术问题,本发明的目的是提供一种转录激活子样效应因子核酸酶及其编码基因与应用。本发明提供了3对短肽，利用这3对短肽构建获得的转录激活子样效应因子，能够分别特异识别人miRNAs：miR-133b, miR-141和miR-488基因种子序列附近的二段相邻核苷酸；利用这3对转录激活子样效应因子构建获得的转录激活子样效应因子核酸酶，能够对人miRNAs：miR-133b, miR-141和miR-488基因进行准确、高效地打靶。
为达到上述目的，本发明是通过以下技术方案实现的：
一种转录激活子样效应因子核酸酶，包括3对短肽，所述的3对短肽分别为第一对短肽、第二对短肽和第三对短肽，所述第一对短肽识别SEQ ID NO. 1和SEQ ID NO. 2的DNA序列，所述第二对短肽识别SEQ ID NO. 3和SEQ ID NO. 4的DNA序列，所述第三对短肽识别SEQ ID NO. 5和SEQ ID NO. 6的DNA序列。
所述的短肽由分别识别人类miR-133b、miR-141和miR-488基因上核苷酸序列中相应碱基的TALENs识别模块依序连接而成；识别碱基A的TALENs识别模块为NI，识别碱基T的TALENs识别模块为NG，识别碱基C的TALENs识别模块为HD，识别碱基G的TALENs识别模块为NK（见表2）。
作为优选的，所述蛋白质包括第一对蛋白质、第二对蛋白质和第三对蛋白质，所述第一对蛋白质由第一对短肽两端分别加上转录激活子样效应因子氨基酸序列框架的N端和C端组成，所述第二对蛋白质由第二对短肽两端分别加上转录激活子样效应因子氨基酸序列框架的N端和C端组成，所述第三对蛋白质由第三对短肽两端分别加上转录激活子样效应因子氨基酸序列框架的N端和C端组成；所述的转录激活子样效应因子氨基酸序列框架的N端和C端均为天然的或经过人工改造的序列。
所述第一对蛋白质、第二对蛋白质和第三对蛋白质可以分别特异性识别人类miRNAs：miR-133b, miR-141和miR-488基因上的二段核苷酸序列，所述3对核苷酸序列分别选自以下所示的核苷酸序列：
（1）SEQ ID NO. 1序列或者该序列的一个或二个核苷酸经过取代所衍生的核苷酸序列；SEQ ID NO. 2序列或者该序列的一个或二个核苷酸经过取代所衍生的核苷酸序列；
（2）SEQ ID NO. 3序列或者该序列的一个或二个核苷酸经过取代所衍生的核苷酸序列；SEQ ID NO. 4序列或者该序列的一个或二个核苷酸经过取代所衍生的核苷酸序列；
（3）SEQ ID NO. 5序列或者该序列的一个或二个核苷酸经过取代所衍生的核苷酸序列；SEQ ID NO. 6序列或者该序列的一个或二个核苷酸经过取代所衍生的核苷酸序列。
作为优选的，所述融合蛋白包括第一对融合蛋白、第二对融合蛋白和第三对融合蛋白，所述第一对融合蛋白由第一对蛋白质与DNA切割蛋白的二个亚基融合而成，所述第二对融合蛋白由第二对蛋白质与DNA切割蛋白的二个亚基融合而成，所述第三对融合蛋白由第三对蛋白质与DNA切割蛋白的二个亚基融合而成；所述的DNA切割蛋白为天然的或经过人工改造的Fok I DNA内切酶。
一种重组载体，所述重组载体的编码包含一对短肽或蛋白质中的任意一条的载体。
作为优选的，将能够特异性识别SEQ ID NO. 1—SEQ ID NO. 6碱基序列的多核苷酸连接到载体pEF1a-NLS-TALEN backbone-Fok1 (R)-pA或载体pEF1a-NLS-TALEN backbone-Fok1(L)-IRES-PURO-pA 上，构建获得包含编码转录激活子样效应因子核酸酶基因的质粒载体，能表达转录激活子样效应因子核酸酶。
一种宿主细胞，所述宿主细胞为人离体细胞，所述的人离体细胞为人RWPE-1细胞，且宿主细胞含有重组载体。
一种重组载体在对人miR-133b、 miR-141和miR-488基因靶向修饰中的应用。
一种人类miRNAs基因打靶的方法，将重组载体转入人离体细胞，于37℃扩增培养1-4天，得到miRNAs基因被靶向修饰的细胞。
作为优选的，所述人离体细胞中转入有抗puro蛋白或能表达抗puro蛋白的质粒，便于筛选。
本发明分别针对人类miRNAs：miR-133b, miR-141和miR-488基因的3个位点设计了三对转录激活子样效应因子核酸酶，这3对TALENs分别由可以识别miRNAs：miR-133b, miR-141和miR-488基因上3段核苷酸的DNA识别结构域与Fok I DNA内切酶的两个异源亚基融合得到。将这3对转录激活子样效应因子核酸酶成对转入宿主细胞时，其能对宿主细胞miRNAs：miR-133b, miR-141和miR-488基因的位点打靶，并使打靶位点发生基因突变，包括碱基缺失、碱基插入等，从而实现对人类miRNAs：miR-133b, miR-141和miR-488基因的靶向修饰，具有特异性强、打靶效率高、准确度高等优点。
附图说明
图1为序列表；
图2为人工设计的转录激活子样效应因子核酸酶识别的DNA序列及位点；
图3为载体pEF1a-NLS-TALEN backbone-Fok1(R)-pA 示意图；
图4为载体pEF1a-NLS-TALEN backbone-Fok1(L)-IRES-PURO- pA 示意图。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图对本发明作进一步的详细描述。这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件的实验方法。通常按照常规条件，例如分子克隆实验指南（第三版，J.萨姆布鲁克等著）中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。 涉及的化学试剂盒、生物制品，如未特殊说明，表明它们均为商品化产品。
TALEN试剂盒购自上海斯丹赛生物技术有限公司。用于原代细胞/普通细胞/肿瘤细胞基因打靶的专用TALEN载体包括10个，左右臂各5个，它们均含有CMV启动子，NLS，N端，C端，Fok I，嘌呤霉素抗性基因（仅在左臂）等基本结构。载体间的不同之处在于TALEN识别序列的最后一个碱基的不同，分为A/T/C/G四种，此外，包括一个带有EGFP荧光标记的TALEN右臂。左右臂骨架的Fok I序列不同，在TALEN作用时，Fok I酶会形成一个异源二聚体的结构，大大增加TALEN切割的效率。
本发明的转录激活子样效应因子核酸酶，包括3对短肽，所述的3对短肽分别为第一对短肽、第二对短肽和第三对短肽，所述第一对短肽识别SEQ ID NO. 1和SEQ ID NO. 2的DNA序列，所述第二对短肽识别SEQ ID NO. 3和SEQ ID NO. 4的DNA序列，所述第三对短肽识别SEQ ID NO. 5和SEQ ID NO. 6的DNA序列。
作为优选的，短肽由分别识别人类miR-133b、miR-141和miR-488基因上核苷酸序列中相应碱基的TALENs识别模块依序连接而成；识别碱基A的TALENs识别模块为NI，识别碱基T的TALENs识别模块为NG，识别碱基C的TALENs识别模块为HD，识别碱基G的TALENs识别模块为NK（见表2）。
作为优选的，所述蛋白质包括第一对蛋白质、第二对蛋白质和第三对蛋白质，所述第一对蛋白质由第一对短肽两端分别加上转录激活子样效应因子氨基酸序列框架的N端和C端组成，所述第二对蛋白质由第二对短肽两端分别加上转录激活子样效应因子氨基酸序列框架的N端和C端组成，所述第三对蛋白质由第三对短肽两端分别加上转录激活子样效应因子氨基酸序列框架的N端和C端组成；所述的转录激活子样效应因子氨基酸序列框架的N端和C端均为天然的或经过人工改造的序列。
作为优选的，第一对蛋白质、第二对蛋白质和第三对蛋白质可以分别特异性识别人类miRNAs：miR-133b, miR-141和miR-488基因上的二段核苷酸序列，所述3对核苷酸序列分别选自以下所示的核苷酸序列：
（1）SEQ ID NO. 1序列或者该序列的一个或二个核苷酸经过取代所衍生的核苷酸序列；SEQ ID NO. 2序列或者该序列的一个或二个核苷酸经过取代所衍生的核苷酸序列；
（2）SEQ ID NO. 3序列或者该序列的一个或二个核苷酸经过取代所衍生的核苷酸序列；SEQ ID NO. 4序列或者该序列的一个或二个核苷酸经过取代所衍生的核苷酸序列；
（3）SEQ ID NO. 5序列或者该序列的一个或二个核苷酸经过取代所衍生的核苷酸序列；SEQ ID NO. 6序列或者该序列的一个或二个核苷酸经过取代所衍生的核苷酸序列。
作为优选的，所述融合蛋白包括第一对融合蛋白、第二对融合蛋白和第三对融合蛋白，所述第一对融合蛋白由第一对蛋白质与DNA切割蛋白的二个亚基融合而成，所述第二对融合蛋白由第二对蛋白质与DNA切割蛋白的二个亚基融合而成，所述第三对融合蛋白由第三对蛋白质与DNA切割蛋白的二个亚基融合而成；所述的DNA切割蛋白为天然的或经过人工改造的Fok I DNA内切酶。
本发明的重组载体的编码包含一对短肽或蛋白质中的任意一条的载体。
作为优选的，将能够特异性识别SEQ ID NO. 1—SEQ ID NO. 6碱基序列的多核苷酸连接到载体pEF1a-NLS-TALEN backbone-Fok1 (R)-pA或载体pEF1a-NLS-TALEN backbone-Fok1(L)-IRES-PURO-pA 上，构建获得包含编码转录激活子样效应因子核酸酶基因的质粒载体，能表达转录激活子样效应因子核酸酶。
本发明的宿主细胞为人离体细胞，人离体细胞为人RWPE-1细胞，且宿主细胞含有重组载体。
本发明重组载体在对人miR-133b、 miR-141和miR-488基因靶向修饰中的应用。
本发明人类miRNAs基因打靶的方法，将重组载体转入人离体细胞，于37℃扩增培养1-4天，得到miRNAs基因被靶向修饰的细胞。
作为优选的，所述人离体细胞中转入有抗puro蛋白或能表达抗puro蛋白的质粒，便于筛选。
实施例 1
TALENs靶序列的设计
1. 从miRBase上下载人类miRNAs：miR-133b, miR-141和miR-488基因DNA序列；
2. 设计TALENs识别序列（靶序列）：
根据miRBase数据库得到的序列，并依照以下原则确定TALENs识别序列：
（1）第0位碱基为T（识别序列第一位之前的碱基为第0位）
（2）最后一位碱基可以为AGCT，优选T
（3）识别序列长度在13-19之间
（4）二个识别序列之间的间隔序列长度控制在14-21之间（12,13也可，但效率可能较低）
设计得到的靶序列位置如图1所示，具体序列见表1。
表1
实施例 2
TALENs识别模块之间的连接及重组载体的构建
1. TALENs识别模块
分别识别碱基A、T、C、G的四个识别模块NI、NG、HD、NK，序列见表2。
表2
2. 识别模块之间的连接
连接策略：以19个识别模块的连接为例，说明连接策略。因最后一个可以识别碱基T的模块已在载体上，所以只要连18个模块即可，将18个模块两两一组分为9组。
3. 重组载体的构建、筛选
（1）按照上海斯丹赛生物技术有限公司提供的试剂盒说明书构建核酸酶TALEN左右臂表达载体。将上述9组，按照说明书在反应体系中依次加入各模块对应的试剂，再加入线性载体模块，连接过夜。
（2）将上述连接产物转化大肠杆菌感受态细胞，挑取克隆、扩增后提取质粒，BamH1和Pst1双酶切鉴定，测序鉴定。选择表达正确TALEN-L和TALEN-R的大肠杆菌克隆进行大量扩增，，用于后续试验。
实施例 3
质粒转染人类RWPE-1细胞
1. 在6孔板每个孔中加入100μL基质胶，来回晃动，使之铺满整个孔的底部，铺好后置于5%CO2培养箱中30min。
2. 将培养RWPE-1细胞T25瓶中的培养基吸出，PBS吸一遍，加入1mL0.25%胰酶，来回晃动，使其均匀覆盖瓶底，置于5%CO2培养箱中5min。
3. 消化完成后加入1mL10%DMEM中和胰酶，将消化下来的细胞转移至15mL离心管中，细胞计数，离心，1200rpm，5min。
4. 用适量的10%DMEM重悬细胞，取200万RWPE-1细胞置于已铺好基质胶的6孔板中，加入2mL新鲜的10%DMEM。
5. 传代同时进行转染。
6. 将构建好的miR-133b-TALEN-L和miR-133b-TALEN-R，miR-141-TALEN-L和miR-141-TALEN-R，miR-488-TALEN-L和miR- 488-TALEN-R 两两配对组合转染细胞。
根据下列方案混合质粒、转染试剂和介质溶液：
体系中各成分的比例：
TALEN-L：TALEN-R =1:1
总DNA ：opti MEM=2μg ：100μl
总DNA ：Fμgene=2μg ：5μl
7. 转染后第二天，将6孔中的培养基吸掉，加入2.0μg/ml puro的2mL新鲜的10%DMEM。
8. 置于5%CO2培养箱中37℃培养两天，每天换2.0μg/ml puro的2mL新鲜的10%DMEM培养液。
9. 撤掉药杀，37℃的5%CO2培养箱中培养至细胞量够抽基因鉴定之用，培养液换为2mL10%DMEM。
实施例 4
细胞打靶鉴定
1. 将药杀后的6孔板中用加入300μL0.25%胰酶，来回晃匀。37℃放置5min，用枪吹打使所有细胞都被消化下来。
2. 将300μL液体吸入1.5mL EP 管中，用400μL的PBS洗6孔板两次，也加入EP管中。
3. 13200rpm/min离心5min，弃去上清液。
4. 用直接PCR Kit（thermo货号：F-140）抽提基因组，并PCR扩增打靶区域DNA片段。
5. 鉴定打靶细胞的基因型及打靶效率
将上述3种组合处理的RWPE-1细胞的基因组的PCR片段加A后连入PMD18-T载体中，单克隆化DNA片段，送测序后得到miRNAs：miR-133b, miR-141和miR-488基因的打靶位点的基因型。
本发明公开了3对转录激活子样效应因子核酸酶及其编码基因与应用。3对转录激活子样效应因子核酸酶（TALEN）由3对DNA识别蛋白分别与Fok I DNA内切酶的两个异源亚基融合得到，可以特异性地识别人类miRNAs：miR-133b, miR-141和miR-488基因种子序列附近的区域。将3对转录激活子样效应因子核酸酶成对转染宿主细胞时，其能对宿主细胞miRNAs：miR-133b, miR-141和miR-488基因的种子序列位点打靶，并使打靶位点发生基因突变，从而实现对人类miRNAs：miR-133b, miR-141和miR-488基因的靶向修饰，具有特异性强、打靶效率高、准确度高等优点。
上述实施例仅用于解释说明本发明的发明构思，而非对本发明权利保护的限定，尽管通过参照本发明的优选实施例已经对本发明进行了描述，但本领域的技术人员应当理解，可以在形式上和细节上对其作出各种各样的改变，而不偏离所附权利要求书所限定的本发明的精神和范围。凡利用此构思对本发明进行非实质性的改动，均应落入本发明的保护范围。
SEQ ID NO.1 5’-CAAACGGAACCAAGTA-3’
SEQ ID NO.2 5’-GGTTGAAGGGGACCA-3’
SEQ ID NO.3 5’-ACAGTGTTGGATGGTCT-3’
SEQ ID NO.4 5’-CTTTACCAGACAGTGT-3’
SEQ ID NO.5 5’-GGCACTCTCAAACAAGT-3’
SEQ ID NO.6 5’-GACCAAGAAATAGCCT-3’

Claims (10)

1.一种转录激活子样效应因子核酸酶，其特征在于：包括3对短肽，所述的3对短肽分别为第一对短肽、第二对短肽和第三对短肽，所述第一对短肽识别SEQ ID NO. 1和SEQ ID NO. 2的DNA序列，所述第二对短肽识别SEQ ID NO. 3和SEQ ID NO. 4的DNA序列，所述第三对短肽识别SEQ ID NO. 5和SEQ ID NO. 6的DNA序列。
2.如权利要求1所述的转录激活子样效应因子核酸酶，其特征在于：所述的短肽由分别识别人类miR-133b、miR-141和miR-488基因上核苷酸序列中相应碱基的TALENs识别模块依序连接而成；识别碱基A的TALENs识别模块为NI，识别碱基T的TALENs识别模块为NG，识别碱基C的TALENs识别模块为HD，识别碱基G的TALENs识别模块为NK。
3.如权利要求1所述的转录激活子样效应因子核酸酶，其特征在于：包括第一对蛋白质、第二对蛋白质和第三对蛋白质，所述第一对蛋白质由第一对短肽两端分别加上转录激活子样效应因子氨基酸序列框架的N端和C端组成，所述第二对蛋白质由第二对短肽两端分别加上转录激活子样效应因子氨基酸序列框架的N端和C端组成，所述第三对蛋白质由第三对短肽两端分别加上转录激活子样效应因子氨基酸序列框架的N端和C端组成；所述的转录激活子样效应因子氨基酸序列框架的N端和C端均为天然的或经过人工改造的序列。
4.如权利要求3所述的转录激活子样效应因子核酸酶，其特征在于：包括第一对融合蛋白、第二对融合蛋白和第三对融合蛋白，所述第一对融合蛋白由第一对蛋白质与DNA切割蛋白的二个亚基融合而成，所述第二对融合蛋白由第二对蛋白质与DNA切割蛋白的二个亚基融合而成，所述第三对融合蛋白由第三对蛋白质与DNA切割蛋白的二个亚基融合而成；所述的DNA切割蛋白为天然的或经过人工改造的Fok I DNA内切酶。
5.一种如权利要求4所述的重组载体，其特征在于：所述重组载体的编码包含一对短肽或蛋白质中的任意一条的载体。
6.如权利要求5所述的重组载体，其特征在于：将能够特异性识别SEQ ID NO. 1—SEQ ID NO. 6碱基序列的多核苷酸连接到载体pEF1a-NLS-TALEN backbone-Fok1 (R)-pA或载体pEF1a-NLS-TALEN backbone-Fok1(L)-IRES-PURO-pA 上，构建获得包含编码转录激活子样效应因子核酸酶基因的质粒载体，能表达转录激活子样效应因子核酸酶。
7.一种如权利要求6所述的宿主细胞，其特征在于：所述宿主细胞为人离体细胞，所述的人离体细胞为人RWPE-1细胞，且宿主细胞含有重组载体。
8.一种如权利要求7所述的重组载体在对人miR-133b、 miR-141和miR-488基因靶向修饰中的应用。
9.一种如权利要求8所述人类miRNAs基因打靶的方法，其特征在于：将重组载体转入人离体细胞，于37℃扩增培养1-4天，得到miRNAs基因被靶向修饰的细胞。
10.如权利要求9所述人类miRNAs基因打靶的方法，其特征在于：所述人离体细胞中转入有抗puro蛋白或能表达抗puro蛋白的质粒，便于筛选。
CN201410521124.4A 2014-10-08 2014-10-08 转录激活子样效应因子核酸酶及其编码基因与应用 Pending CN104357422A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201410521124.4A CN104357422A (zh) 2014-10-08 2014-10-08 转录激活子样效应因子核酸酶及其编码基因与应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201410521124.4A CN104357422A (zh) 2014-10-08 2014-10-08 转录激活子样效应因子核酸酶及其编码基因与应用

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN104357422A true CN104357422A (zh) 2015-02-18

Family

ID=52524735

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201410521124.4A Pending CN104357422A (zh) 2014-10-08 2014-10-08 转录激活子样效应因子核酸酶及其编码基因与应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN104357422A (zh)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN111885915A (zh) * 2018-03-19 2020-11-03 瑞泽恩制药公司 使用crispr/cas系统对动物进行转录调制

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2013158046A1 (en) * 2012-04-20 2013-10-24 Agency For Science, Technology And Research Rnai-based therapies for cardiomyopathies, muscular dystrophies and laminopathies

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2013158046A1 (en) * 2012-04-20 2013-10-24 Agency For Science, Technology And Research Rnai-based therapies for cardiomyopathies, muscular dystrophies and laminopathies

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
BUYUAN CHEN ET AL: "Disruption of microRNA-21 by TALEN leads to diminished cell transformation and increased expression of cell–environment interaction genes", 《CANCER LETTERS》 *
YOUNG-KOOK KIM ET AL: "TALEN-based knockout library for human microRNAs", 《NATURE STRUCTURAL & MOLECULAR BIOLOGY》 *
沈延等: "TALEN 构建与斑马鱼基因组定点突变的实验方法与流程", 《遗传》 *

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN111885915A (zh) * 2018-03-19 2020-11-03 瑞泽恩制药公司 使用crispr/cas系统对动物进行转录调制
CN111885915B (zh) * 2018-03-19 2023-04-28 瑞泽恩制药公司 使用crispr/cas系统对动物进行转录调制

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US20220033858A1 (en) Crispr oligoncleotides and gene editing
Hua et al. Simplified adenine base editors improve adenine base editing efficiency in rice
Kramerov et al. SINEs
CN106906242A (zh) 一种提高CRIPSR/Cas9靶向敲除基因产生非同源性末端接合效率的方法
CN106834347A (zh) 一种山羊cdk2基因敲除载体及其构建方法
CN107027313A (zh) 用于多元rna引导的基因组编辑和其它rna技术的方法和组合物
US20220195403A1 (en) Methods of achieving high specificity of genome editing
KR20220150329A (ko) 클래스 ii, 타입 v crispr 시스템
KR102151065B1 (ko) 동물 배아의 염기 교정용 조성물 및 염기 교정 방법
US20190390229A1 (en) Gene editing reagents with reduced toxicity
CN103842511A (zh) 产生复合转基因性状基因座的方法
CN106282231B (zh) 粘多糖贮积症ii型动物模型的构建方法及应用
CN103820452B (zh) 一种sgRNA片段及其应用
CN111902541A (zh) 增加细胞中感兴趣的核酸分子表达水平的方法
CN109706148A (zh) 一种用于敲除BCL11A基因或者BCL11A基因增强子的gRNA、gRNA组合物以及电转方法
Karagyaur et al. Practical recommendations for improving efficiency and accuracy of the CRISPR/Cas9 genome editing system
Papolu et al. Retrotransposons: How the continuous evolutionary front shapes plant genomes for response to heat stress
CN110938629B (zh) 特异性识别猪Wip1基因的成套sgRNA及其应用和产品
CN104212778A (zh) 基于TALEN和pMD18载体的定点突变系统及应用
CN104357422A (zh) 转录激活子样效应因子核酸酶及其编码基因与应用
CN118139979A (zh) 具有hepn结构域的酶
CN113493786B (zh) 阻断或者减弱水稻中OsMIR3979的表达以改良水稻籽粒性状的方法
JP2024501892A (ja) 新規の核酸誘導型ヌクレアーゼ
CN110684797B (zh) 基于tcv的同时沉默2个内源基因的vigs载体
CN112852805B (zh) 水稻miRNA纯合致死突变体的制备方法

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
RJ01 Rejection of invention patent application after publication
RJ01 Rejection of invention patent application after publication

Application publication date: 20150218