CN103842511A - 产生复合转基因性状基因座的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了用于在植物中产生在目的基因组区域中包含至少两个变更的靶序列的复合转基因性状基因座的方法。所述方法涉及使用两种或者多种双链断裂诱导剂，每种双链断裂诱导剂都可在目的基因组区域中的靶序列中造成双链断裂，从而导致靶序列的变更。本发明还公开了植物中的复合转基因性状基因座。复合转基因性状基因座包含与目的多核苷酸在遗传上连接的至少两个变更的靶序列。还公开了包含一个或者多个复合转基因性状基因座的植物、植物细胞、植物部分和种子。

Description

产生复合转基因性状基因座的方法
技术领域
本发明涉及植物分子生物学领域，具体涉及改变植物细胞的基因组的方法。
背景技术
重组DNA技术已使得可以将外来DNA序列插入到生物体的基因组中，从而改变该生物体的表型。最常用的植物转化方法是农杆菌感染和生物射弹粒子轰击，其中转基因以随机方式和以不可预测的拷贝数整合到植物基因组中。因此，人们作出努力来控制植物中的转基因整合。
一种插入或者修饰DNA序列的方法涉及通过引入侧接有与基因组目标同源的序列的转基因DNA序列来进行的同源DNA重组。第5,527,695号美国专利描述了用靶向真核生物DNA的预定序列的DNA序列转化真核生物细胞。具体地讲，讨论了使用位点特异性重组。转化的细胞通过使用选择性标记来鉴定，该选择性标记作为所引入的DNA序列的一部分而被包括。
已证实，在植物细胞中人工诱导的位点特异性基因组双链断裂通过使用两个不同的途径用外源供应的DNA进行同源重组而得到修复。(Puchta等人，(1996)，《美国国家科学院院刊》(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)，93：5055-5060；2005年8月4日公布的公布号为2005／0172365A1的美国专利申请；2006年12月14日公布的公布号为2006／0282914的美国专利申请；2005年6月2日公开的WO2005／028942)。
由于DNA区段(包括编码序列和非编码序列在内)的分离、克隆、转移和重组用限制性内切核酸酶进行最便利，许多研究集中在探索和设计内切核酸酶，如2004年8月12日公开的WO2004／067736；1998年8月11日的授予Dujon等人的第5,792,632号美国专利；2003年8月26目的Dujon等人的第6,610,545B2号美国专利；Chevalier等人，(2002)，《分子细胞》(MolCell)，10：895-905；Chevalier等人，(2001)，Nucleic Acids Res(《核酸研究》)，29：3757-3774；Seligman等人，(2002)，Nucleic Acids Res(《核酸研究》)，30：3870-3879。
虽然已开发出了许多方法来靶向植物基因组中的特定位点以进行修饰，但对用于产生具有变更的基因组的能育植物的方法仍存在需求，所述变更的基因组包含两个或者多个位于该植物基因组的确定区域中的位点特异性修饰。
发明内容
本发明提供用于在植物中产生在目的基因组区域中包含至少两个变更的靶序列的复合转基因性状基因座的方法。所述方法涉及选择植物中的包含第一靶序列和第二靶序列的基因组区域，然后提供第一双链断裂诱导剂和第二双链断裂诱导剂。第一双链断裂诱导剂能够在包含第一靶序列的DNA中诱导第一双链断裂，第二双链断裂诱导剂能够在包含第二靶序列的DNA中诱导第二双链断裂。所述方法还涉及使至少一个植物细胞与第一双链断裂诱导剂接触，鉴定出在第一靶序列处包含第一变更的细胞，然后从包含第一变更的细胞再生出第一能育植物。第一能育植物也包含第一变更。另外，所述方法还涉及使至少一个植物细胞与第二双链断裂诱导剂接触，鉴定出在第二靶序列中包含第二变更的细胞，然后从包含第二变更的细胞再生出第二能育植物。所述方法还包括从第二能育植物获得能育子代植物，其中所述能育子代植物包含物理连接在一起的第一和第二变更。
在用于在植物中产生复合转基因性状基因座的方法的第一个实施例中，能育子代植物是通过将第一能育植物与第二能育植物杂交并选择出包含物理连接在一起的第一和第二变更的能育子代植物来获得。
在第二个实施例中，使包含第一变更的第一能育植物或其子代的细胞与第二双链断裂诱导剂接触。
在第三个实施例中，复合转基因性状基因座还包含位于目的基因组区域中的至少一个目的多核苷酸。这种目的多核苷酸可以例如为转基因、天然基因以及在其中作出靶向突变之前属天然基因的基因。
在第四个实施例中，第一变更包括目的第一DNA序列或其部分插入到第一靶序列中，和／或第二变更包括目的第二DNA序列或其部分插入到第二靶序列中。这种目的第一和／或第二DNA序列可以为例如用于基因沉默的DNA、编码表型标记的DNA和编码提供农艺优势的蛋白质的DNA。
在第五个实施例中，第一和第二双链断裂诱导剂选自内切核酸酶、锌指核酸酶或者TAL效应物核酸酶。
在第六个实施例中，内切核酸酶被修饰成在第一靶序列或者在第二靶序列特异性切割，而不再在其野生型内切核酸酶靶序列切割。
在第七个实施例中，第一靶序列和第二靶序列在植物的基因组中彼此相隔约0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8.、0.9、1、2、3、4或5厘摩(cM)。
在第八个实施例中，所述方法可涉及使能育子代植物与在目的基因组区域中包含至少第三变更的靶序列的另一能育植物杂交，然后从该杂交选择出包含物理连接在一起的第一变更、第二变更和第三变更的能育子代植物。与第一和第二变更的靶序列一样，第三变更的靶序列来源于被第三双链断裂诱导剂识别和切割的第三靶序列。
本发明另外提供植物中的通过本发明方法产生的复杂性状基因座，以及包含至少一个本发明的复合转基因性状基因座的植物、植物细胞、植物部分及其种子。
本发明还提供包含至少两个变更的靶序列的复合转基因性状基因座，所述变更的靶序列在植物基因组中与目的多核苷酸遗传地连接(geneticallylinked)。这种变更的靶序列来源于被双链断裂诱导剂识别和切割的相应靶序列。变更的靶序列包含变更，例如在靶序列中置换至少一个核苷酸、在靶序列中缺失至少一个核苷酸、在靶序列中插入至少一个核苷酸，或者它们的任何组合。目的多核苷酸可以例如是转基因、天然基因和突变基因。本发明还提供包含至少一个本发明的复合转基因性状基因座的植物、植物部分、植物细胞和种子。
在本发明的复合转基因性状基因座的一个实施例中，至少一个变更的靶序列包含重组DNA分子。重组DNA分子包括但不限于用于基因沉默的DNA、编码表型标记的DNA和编码提供农艺优势的蛋白质的DNA。
在另一个实施例中，复合转基因性状基因座的两个变更的靶序列位于目的多核苷酸0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或最多21厘摩(cM)以内。
本发明提供包含至少一个本发明的复合转基因性状基因座的植物、植物部分、植物细胞和种子。
本发明另外提供另一种用于在植物中产生复合转基因性状基因座的方法，所述复合转基因性状基因座在目的基因组区域中包含至少两个变更的靶序列。这个方法涉及获得在目的基因组区域包含第一变更的靶序列的第一能育植物和在目的基因组区域包含第二变更的靶序列的第二能育植物。在这个方法中，第一变更的靶序列来源于被第一双链断裂诱导剂识别和切割的第一靶序列，第二变更的靶序列来源于被第二双链断裂诱导剂识别和切割的第二靶序列。这另一种方法还涉及使第一能育植物和第二能育植物杂交，然后从该杂交选择出包含物理连接在一起的第一变更和第二变更的能育子代植物。
本发明还提供包含至少一个复合转基因性状基因座的、通过本发明第二个方法产生的植物以及其植物细胞、植物部分和种子。
在另一个实施例中，本发明提供包含表达构建体的植物，该表达构建体包含与编码内切核酸酶的核苷酸序列可操作连接的启动子。该内切核酸酶能够特异性结合选自SEQ ID NO：1、2、3、4、5、6、7、8、68、69、70、71、72、73、74、75、76和77的靶序列并在该靶序列中产生双链断裂，其中该启动子能够驱动有效连接的核苷酸序列在植物细胞中的表达。编码该内切核酸酶的核苷酸序列可包含内切核酸酶的DNA结合结构域的编码序列，其中该编码序列包含SEQ ID NO：9、10、11、12、13、14、15、16、78、79、80、81、82或者83的核苷酸100-261和核苷酸850-1011；或其简并编码序列。优选地，编码该内切核酸酶的核苷酸序列是选自SEQ ID NO：9、10、11、12、13、14、15、16、78、79、80、81、82和83的核苷酸序列。
在本发明的又另一个实施例中，本发明的植物包含至少一个变更的靶序列，其中该至少一个变更的靶序列来源于被双链断裂诱导剂识别和切割的相应靶序列。在这个实施例中，变更的靶序列在这样的目的基因组区域中，该目的基因组区域：从SEQ ID NO：4所示的靶序列延伸到SEQ ID NO：2所示的靶序列；从SEQ ID NO：5所示的靶序列延伸到SEQ ID NO：8所示的靶序列；或者从SEQ ID NO：68所示的靶序列延伸到SEQ ID NO：77所示的靶序列。本发明的这种植物可通过这样的方法产生，该方法包括提供至少一种能够在包含靶序列的DNA中引起双链断裂的双链断裂诱导剂，其中该靶序列在这样的目的基因组区域中，该目的基因组区域：从SEQ ID NO：4所示的靶序列延伸到SEQ ID NO：2所示的靶序列；从SEQ ID NO：5所示的靶序列延伸到SEQ ID NO：8所示的靶序列；或者从SEQ ID NO：68所示的靶序列延伸到SEQ ID NO：77所示的靶序列。该方法还包括使至少一个细胞与该双链断裂诱导剂接触，鉴定出在该靶序列包含变更的细胞，和再生出包含该变更的能育植物。在这个方法的一个实施例中，该双链断裂诱导剂由包含内切核酸酶的DNA结合结构域的编码序列的核苷酸序列编码，且其中该编码序列选自SEQ ID NO：9、10、11、12、13、14、15、16和80的核苷酸100-261和核苷酸850-1011，及其简并编码序列。在这个方法的另一个实施例中，该双链断裂诱导剂由包含内切核酸酶的DNA结合结构域的编码序列的核苷酸序列编码，且其中该编码序列选自SEQ ID NO：78、79、81、82和83的核苷酸100-261和核苷酸661-822，及其简并编码序列。在这个方法的另一个实施例中，该双链断裂诱导剂由选自SEQ ID NO：9、10、11、12、13、14、15、16、78、79、80、81、82和83的核苷酸序列编码。
本发明的方法和组合物的另外实施例在下文公开。
附图和序列表简述
由以下的“具体实施方式”及构成本申请的一部分的附图和序列表可以更完全地理解本发明。本申请随附的序列说明和序列表符合美国联邦法规37C.F.R.§§1.821-1.825中关于专利申请中的核苷酸和氨基酸序列公开的指导规则。序列说明包含37C.F.R.§§1.821-1.825中定义的氨基酸三字母代码，将其以引用方式并入本文。
附图
图1.DNA双链断裂诱导了内源靶位点的DNA变更。(A)一般化的内源靶位点，其侧翼是标为DNA1和DNA2的基因组DNA序列，所述基因组序列可用作同源重组的DNA交换区。(B)一般化的DNA构建体，其可用于表达DNA内切核酸酶以识别和切割内源靶位点。该DNA内切核酸酶基因可被物理连接到(C)或者(D)中描述的供体DNA，或者被其他双链断裂诱导剂置换。(C)一般化的供体DNA构建体，其具有两个区域DNA1和DNA2，所述两个区域与目的多核苷酸和／或标记基因侧翼的基因组靶标同源。(D)一般化的供体DNA构建体，其不具有与目的多核苷酸和／或标记基因侧翼的基因组靶标同源的区域。DNA片段的插入将在识别位点之处或者附近产生目的多核苷酸的插入。(E)当(C)或者(D)中描述的供体构建体的目的多核苷酸和／或标记基因分别通过同源重组或者非同源重组插入在内源靶位点时的一个预期结果。(F)在修复被DNA内切核酸酶切割的DNA双链断裂的过程中通过缺失来变更内源靶位点时的另一个结果。(C)或者(D)中描述的供体构建体的目的多核苷酸和／或标记基因可通过随机DNA整合插入在不相关的位点。(G)在修复被DNA内切核酸酶切割的DNA双链断裂的过程中通过插入不相关DNA来变更内源靶位点时的另一个结果。(C)或者(D)中描述的供体构建体的目的多核苷酸和／或标记基因可通过随机DNA整合插入在不相关的位点。
图2.靶位点和目的转基因之间的遗传距离。
图3.A：用于检测TS21靶位点修饰和转基因整合的PCR测定法的示意图。B：所选择的TS21转基因事件的变更的靶序列的比对。
图4.A：所选择的TS5转基因事件的变更的靶序列的比对。B：所选择的TS14转基因事件的变更的靶序列的比对。
图5.用定制的大范围核酸酶作出双链断裂而实现通过同源重组进行基因整合。
图6.大豆中接近除草剂抗性转基因事件的靶位点的位置。
图7.使用大范围核酸酶靶位点簇通过依序转化或者遗传杂交进行多个性状的堆积。
图8.玉蜀黍(maize)植物中目的转基因DNA整合位点周围的各个MHP靶位点的位置。实心黑色三角形表示BAC克隆。每个框中的名称和数字为靶位点。从框指向BAC的箭头表示属于BAC克隆的靶位点。图底部的数字和箭头表示靶位点相对于目的转基因DNA的插入位置的遗传距离。如在图顶部所示，在玉蜀黍染色体的这个区域中物理距离为约1.8Mb核苷酸。
图9.A：针对供体在MHP14靶位点处的整合进行的PCR筛选的示意图(供体为PHP44779)。B：MHP14事件的PCR：用引物146773／146775进行的B1-B12junction PCR；用引物146772／146778进行的b1-b12junctionPCR。有两个事件(B2和B5)对于两种junction PCR均为阳性。箭头表示与所用的各个引物对应的位置。
图10.A：用于证实ubi：mopat：pinII盒整合在内源MHP14靶标的PCR的示意图。B：对来自三个事件的T0植物的长PCR显示了在靶位点整合。植物A5来自事件#1、A6-A8事件#2和C4-C6事件#3。CKP：来自愈伤组织DNA的阳性对照。B：左边小图显示使用基因组引物(146775)和moPAT引物(mopatR2)在HR1侧进行的junction PCR的结果。右边小图显示使用moPAT引物(mopatF2)和基因组引物(146772)在HR2侧进行的junction PCR的结果。箭头表示与所用的各个引物对应的位置。
图11.来自大范围核酸酶的植物优化核苷酸序列的片段的比对，所述大范围核酸酶包含SEQ ID NO：9、10、11、12、13、14、15、16和80的核苷酸100-261和核苷酸850-1011以及SEQ ID NO：78、79、81、82和83的核苷酸100-261和核苷酸661-822。
序列
SEQ ID NO：1是大豆基因组中TS21靶位点的核苷酸序列。
SEQ ID NO：2是大豆基因组中TS14靶位点的核苷酸序列。
SEQ ID NO：3是大豆基因组中TS30靶位点的核苷酸序列。
SEQ ID NO：4是大豆基因组中TS5靶位点的核苷酸序列。
SEQ ID NO：5是大豆基因组中TS7靶位点的核苷酸序列。
SEQ ID NO：6是大豆基因组中TS4靶位点的核苷酸序列。
SEQ ID NO：7是大豆基因组中TS22靶位点的核苷酸序列。
SEQ ID NO：8是大豆基因组中TS24靶位点的核苷酸序列。
SEQ ID NO：9是含有核靶位点和ST-LS1内含子的TS21大范围核酸酶的植物优化核苷酸序列。
SEQ ID NO：10是含有核靶位点和ST-LS1内含子的TS14大范围核酸酶的植物优化核苷酸序列。
SEQ ID NO：11是含有核靶位点和ST-LS1内含子的TS30大范围核酸酶的植物优化核苷酸序列。
SEQ ID NO：12是含有核靶位点和ST-LS1内含子的TS5大范围核酸酶的植物优化核苷酸序列。
SEQ ID NO：13是含有核靶位点和ST-LS1内含子的TS7大范围核酸酶的植物优化核苷酸序列。
SEQ ID NO：14是含有核靶位点和ST-LS1内含子的TS4大范围核酸酶的植物优化核苷酸序列。
SEQ ID NO：15是含有核靶位点和ST-LS1内含子的TS22大范围核酸酶的植物优化核苷酸序列。
SEQ ID NO：16是含有核靶位点和ST-LS1内含子的TS24大范围核酸酶的植物优化核苷酸序列。
SEQ ID NO：17是TS21靶位点的同源区1(HR1)。
SEQ ID NO：18是TS21靶位点的同源区2(HR2)。
SEQ ID NO：19是TS14靶位点的HR1。
SEQ ID NO：20是TS14靶位点的同源区2。
SEQ ID NO：21是TS30靶位点的HR1。
SEQ ID NO：22是TS30靶位点的同源区2。
SEQ ID NO：23是TS5靶位点的HR1。
SEQ ID NO：24是TS5靶位点的同源区2。
SEQ ID NO：25是TS7靶位点的HR1。
SEQ ID NO：26是TS7靶位点的同源区2。
SEQ ID NO：27是TS4靶位点的HR1。
SEQ ID NO：28是TS4靶位点的同源区2。
SEQ ID NO：29是TS22靶位点的HR1。
SEQ ID NO：30是TS22靶位点的同源区2。
SEQ ID NO：31是TS24靶位点的HR1。
SEQ ID NO：32是TS24靶位点的同源区2。
SEQ ID NO：33是不含ST-LS1内含子的TS21大范围核酸酶的植物优化核苷酸序列。
SEQ ID NO：34是SV40核定位信号的氨基酸序列。
SEQ ID NO：35：是表达盒RTW317的核苷酸序列，其包含TS21大范围核酸酶植物优化序列，无内含子，与大豆EF1A启动子有效连接。
SEQ ID NO：36是表达盒RTW322的核苷酸序列，其包含TS21大范围核酸酶植物优化序列，有内含子，与大豆EF1A启动子有效连接。
SEQ ID NO：37是RTW328A的核苷酸序列，其是TS21大范围核酸酶的修复性DNA片段。
SEQ ID NO：38是TS21qPCR正向引物Mega21-190F的核苷酸序列。
SEQ ID NO：39是TS21qPCR反向引物Mega21-301R的核苷酸序列。
SEQ ID NO：40是TS21qPCR探针mega21-250T的核苷酸序列。该荧光探针用FAM标记，而FAM用MGB猝灭。
SEQ ID NO：41是TS14qPCR正向引物Mega14-13F的核苷酸序列。
SEQ ID NO：42是TS14qPCR反向引物Mega14-128R的核苷酸序列。
SEQ ID NO：43是TS14qPCR探针Mega14-85T的核苷酸序列。该荧光探针用FAM标记，而FAM用MGB猝灭。
SEQ ID NO：44是TS30qPCR正向引物Mega30-30F的核苷酸序列。
SEQ ID NO：45是TS30qPCR反向引物Mega30-87R的核苷酸序列。
SEQ ID NO：46是TS30qPCR探针Mega30-52T的核苷酸序列。该荧光探针用FAM标记，而FAM用MGB猝灭。
SEQ ID NO：47是TS5qPCR正向引物Mega5-F1的核苷酸序列。
SEQ ID NO：48是TS5qPCR反向引物Mega5-R1的核苷酸序列。
SEQ ID NO：49是TS5qPCR探针Mega5-T1的核苷酸序列。该荧光探针用FAM标记，而FAM用MGB猝灭。
SEQ ID NO：50是正义引物WOL133的核苷酸序列，其位于大豆基因组中的TS21靶位点的上游。
SEQ ID NO：51是反义引物WOL134的核苷酸序列，其位于大豆基因组中的TS21靶位点的下游。
SEQ ID NO：52是正义引物WOL190的核苷酸序列，其位于大豆基因组中的TS21靶位点的更上游，TS21HR1片段远处。
SEQ ID NO：53是反义引物WOL242的核苷酸序列，其对潮霉素编码序列具有特异性。
SEQ ID NO：54是正义引物WOL153的核苷酸序列，其对NOS终止子具有特异性。
SEQ ID NO：55是反义引物WOL247的核苷酸序列，其位于大豆基因组中的TS21靶位点的更下游，TS21HR2片段远处。
SEQ ID NO：56是正义引物WOL121的核苷酸序列，其位于大豆基因组中的TS14靶位点的上游。
SEQ ID NO：57是反义引物WOL150的核苷酸序列，其位于大豆基因组中的TS21靶位点的下游。
SEQ ID NO：58是正义引物WOL192的核苷酸序列，其位于大豆基因组中的TS14靶位点的更上游，TS14HR1片段远处。
SEQ ID NO：59是反义引物WOL193的核苷酸序列，其位于大豆基因组中的TS14靶位点的更下游，TS14HR2片段远处。
SEQ ID NO：60是正义引物WOL113的核苷酸序列，其位于大豆基因组中的TS30靶位点的上游。
SEQ ID NO：61是反义引物WOL114的核苷酸序列，其位于大豆基因组中的TS30靶位点的下游。
SEQ ID NO：62是正义引物WOL194的核苷酸序列，其位于大豆基因组中的TS30靶位点的更上游，TS30HR1片段远处。
SEQ ID NO：63是反义引物WOL195的核苷酸序列，其位于大豆基因组中的TS30靶位点的更下游，TS30HR2片段远处。
SEQ ID NO：64是正义引物WOL105的核苷酸序列，其位于大豆基因组中的TS5靶位点的上游。
SEQ ID NO：65是反义引物WOL144的核苷酸序列，其位于大豆基因组中的TS5靶位点的下游。
SEQ ID NO：66是正义引物WOL196的核苷酸序列，其位于大豆基因组中的TS5靶位点的更上游，TS5HR1片段远处。
SEQ ID NO：67是反义引物WOL197的核苷酸序列，其位于大豆基因组中的TS5靶位点的更下游，TS5HR2片段远处。
SEQ ID NO：68是玉蜀黍基因组中的MHP1靶位点的核苷酸序列。
SEQ ID NO：69是玉蜀黍基因组中的MHP14靶位点序列的核苷酸序列。
SEQ ID NO：70是玉蜀黍基因组中的MHP32靶位点序列的核苷酸序列。
SEQ ID NO：71是玉蜀黍基因组中的MHP42靶位点序列的核苷酸序列。
SEQ ID NO：72是玉蜀黍基因组中的MHP55靶位点序列的核苷酸序列。
SEQ ID NO：73是玉蜀黍基因组中的MHP67靶位点序列的核苷酸序列。
SEQ ID NO：74是玉蜀黍基因组中的MHP77靶位点序列的核苷酸序列。
SEQ ID NO：75是玉蜀黍基因组中的MHP98靶位点序列的核苷酸序列。
SEQ ID NO：76是玉蜀黍基因组中的MHP107靶位点序列的核苷酸序列。
SEQ ID NO：77是玉蜀黍基因组中的MHP115靶位点序列的核苷酸序列。
SEQ ID NO：78是包含核定位信号而缺乏内含子的MHP14的植物优化核苷酸序列。
SEQ ID NO：79是包含核定位信号而缺乏内含子的MHP14+的植物优化核苷酸序列。
SEQ ID NO：80是包含核定位信号和内含子的MHP55的植物优化核苷酸序列。
SEQ ID NO：81是包含核定位信号而缺乏内含子的MHP55的植物优化核苷酸序列。
SEQ ID NO：82是包含核定位信号而缺乏内含子的MHP55-2的植物优化核苷酸序列。
SEQ ID NO：83是包含核定位信号而缺乏内含子的MHP77的植物优化核苷酸序列。
SEQ ID NO：84是MHP14靶位点的HR1。
SEQ ID NO：85是MHP14靶位点的HR2。
SEQ ID NO：86是MHP55靶位点的HR1。
SEQ ID NO：87是MHP55靶位点的HR2。
SEQ ID NO：88是MHP77靶位点的HR1。
SEQ ID NO：89是MHP77靶位点的HR2。
SEQ ID NO：90是MHP1靶位点的HR1。
SEQ ID NO：91是MHP1靶位点的HR2。
SEQ ID NO：92是MHP32靶位点的HR1。
SEQ ID NO：93是MHP32靶位点的HR2。
SEQ ID NO：94是MHP42靶位点的HR1。
SEQ ID NO：95是MHP42靶位点的HR2。
SEQ ID NO：96是MHP67靶位点的HR1。
SEQ ID NO：97是MHP67靶位点的HR2。
SEQ ID NO：98是MHP98靶位点的HR1。
SEQ ID NO：99是MHP98靶位点的HR2。
SEQ ID NO：100是MHP107靶位点的HR1。
SEQ ID NO：101是MHP107靶位点的HR2。
SEQ ID NO：102是MHP115靶位点的HR1。
SEQ ID NO：103是MHP115靶位点的HR2。
SEQ ID NO：104是质粒(MHP14和供体DNA)的核苷酸序列。
SEQ ID NO：105是质粒PHP44779(MHP14+和供体DNA)的核苷酸序列。
SEQ ID NO：106是MHP14TS探针的核苷酸序列。
SEQ ID NO：107是M H PTS14TS_正向_MGB引物的核苷酸序列。
SEQ ID NO：108是M H PTS14TS_反向_M G B引物的核苷酸序列。
SEQ ID NO：109是基因组HR1侧的引物146775的核苷酸序列。
SEQ ID NO：110是载体HR1侧的引物146773的核苷酸序列。
SEQ ID NO：111是基因组HR2侧的引物146772的核苷酸序列。
SEQ ID NO：112是载体HR2侧的引物146778的核苷酸序列。
SEQ ID NO：113是引物mopatF2的核苷酸序列。
SEQ ID NO：114是引物mopatR2的核苷酸序列。
SEQ ID NO：115是MHP55TS探针序列的核苷酸序列。
SEQ ID NO：116是MHPTS55_正向_MGB引物的核苷酸序列。
SEQ ID NO：117是MHP55TS_反向_MGB引物的核苷酸序列。
SEQ ID NO：118是MHP77TS探针的核苷酸序列。
SEQ ID NO：119是MHP77TS_正向_MGB引物的核苷酸序列。
SEQ ID NO：120是MHP77TS_反向_MGB引物的核苷酸序列。
具体实施方式
本说明书中提及的所有出版物和专利申请指示了本发明所属领域的技术人员的水平。所有出版物和专利申请在相同程度上全文以引用方式并入本文，如同每个单独的出版物或专利申请被具体地和独立地指出全文以引用方式并入本文一样。
本文中和随附的权利要求书中所用名词形式上为单数，但包括复数指代，除非上下文清楚表明并非如此。因此，例如，提到“植物”则包括多个这种植物；提到“细胞”则包括一个或者多个细胞以及本领域技术人员知道的其等同物，以此类推。
在本公开文本的上下文中，使用了许多术语和缩写。提供了以下定义。
本文所用的“复合转基因性状基因座”是目的基因组区域内的这样的染色体区段，其包含至少两个在遗传上互相连接的变更的靶序列，并且还可包含一个或者多个如下所述的目的多核苷酸。复合转基因性状基因座中的每个变更的靶序列来源于例如通过这样的机制变更的相应靶序列，所述机制涉及该靶序列内的由本发明的双链断裂诱导剂诱导的双链断裂。在本发明的某些实施例中，变更的靶序列包含转基因。
本文所用的“目的基因组区域”是植物基因组中的适于产生复合转基因性状基因座的染色体区段，或者包含通过本发明方法产生的复合转基因性状基因座的染色体区段。目的基因组区域可包括例如一个或者多个在其中产生复合转基因性状基因座之前的目的多核苷酸。一般地讲，本发明的目的基因组区域包含0-15cM的染色体区段。
本文所用的术语“识别序列”或者“识别位点”是指植物细胞基因组中的这样的DNA序列，在该DNA序列处通过双链断裂诱导剂诱导双链断裂。术语“识别序列”和“识别位点”在本文中可互换使用。
术语“靶位点”、“靶序列”、“靶基因座”、“基因组靶位点”、“基因组靶序列”、“基因组靶基因座”在本文中可互换使用，是指植物细胞基因组中的包含双链断裂诱导剂的识别序列的多核苷酸序列。
“人工靶序列”是已被引入到植物的基因组中的靶序列。这种人工靶序列可在序列上与植物基因组中的内源或者天然靶序列相同，但可位于植物基因组中的另一不同位置(即非内源或者非天然位置)。
术语“内源靶序列”和“天然靶序列”在本文中可互换使用，是指这样的靶序列，其对于植物基因组而言是内源的或者天然的，并且处于该植物基因组中的该靶序列的内源或者天然位置。
“变更的靶序列”是指与非变更的靶序列相比，包含至少一个本发明的变更的本文所公开的靶序列。本发明的这种“变更”包括例如：(i)置换至少一个核苷酸，(ii)缺失至少一个核苷酸，(iii)插入至少一个核苷酸，或者(iv)(i)-(iii)的任何组合。
本文所用的术语“双链断裂诱导剂”是指任何能在靶序列中产生双链断裂的核酸酶。在靶序列或者其他DNA中产生双链断裂在本文中可称为“切开”或者“切割”该靶序列或者其他DNA。在本发明的一些实施例中，双链断裂诱导剂已经过工程改造(或者修饰)以切开特定的内源靶序列，其中该内源靶序列在被该经工程改造的双链断裂诱导剂切开之前不是会被天然的(非工程改造的或者非修饰的)双链断裂诱导剂所识别的序列。
本文所用的“物理连接的”、“物理连接在一起的”和“遗传上连接的”用来指属同一分子或者染色体的一部分的任何两个或者多个基因、转基因、天然基因、突变基因、变更、靶位点、标记等。
本文所用的目的基因组区域内的“目的多核苷酸”，是该目的基因组区域的任何编码和／或非编码部分，包括但不限于转基因、天然基因、突变基因和遗传标记例如单核苷酸多态性(SNP)标记和简单重复序列(SSR)标记。
“开放阅读框”缩写为ORF。
本文所用的“核酸”是指多核苷酸，包括脱氧核糖核苷酸或者核糖核苷酸碱基的单链或者双链聚合物。核酸也可包括片段和修饰的核苷酸。因此，术语“多核苷酸”、“核酸序列”、“核苷酸序列”和“核酸片段”可互换使用，表示单链或者双链的RNA和／或DNA聚合物，其任选含有合成的、非天然的或者变更的核苷酸碱基。核苷酸(通常以其5′-单磷酸盐形式存在)用如下的单字母代码指代：“A”指代腺苷或脱氧腺苷(分别对于RNA或者DNA)，“C”指代胞嘧啶或脱氧胞嘧啶，“G”指代鸟苷或脱氧鸟苷，“U”指代尿苷，“T”指代脱氧胸苷，“R”指代嘌呤(A或G)，“Y”指代嘧啶(C或者T)，“K”指代G或者T，“H”指代A或者C或者T，“I”指代肌苷，“N”指代任何核苷酸。
术语“功能上等同的亚片段”和“功能等同亚片段”在本文中可互换使用。这些术语指代分离核酸片段的这样的部分或者亚序列，其中变更基因表达或者产生某种表型的能力得到保持，无论该片段或者亚序列是否编码活性酶。例如，该片段或者亚序列可用于设计嵌合基因以在转化的植物中产生所需的表型。可通过将核酸片段或其亚片段——无论其是否编码活性酶——相对于植物启动子序列以有义或者反义方向进行连接，来设计嵌合基因用于抑制。
术语“保守结构域”或者“模体”是指在进化上相关的蛋白质的经比对的序列上特定位置处保守的一组氨基酸。虽然其他位置处的氨基酸在同源蛋白质之间可变，但在特定位置处高度保守的氨基酸表示对于蛋白质的结构、稳定性或者活性而言必需的氨基酸。由于它们因其在蛋白质同源物家族的经比对的序列中的高保守度而被鉴定，它们可用作鉴定物或者“识别标志(signature)”，以鉴定具有新确定的序列的蛋白质是否属于之前鉴定的蛋白质家族。
多核苷酸和多肽序列、其变体以及这些序列的结构关系，可用术语“同源性”、“同源的”、“实质上相同的”、“实质上相似的”和“实质上对应”描述，这些术语在本文中可互换使用。这些是指多肽或者核酸片段，其中一个或者多个氨基酸或者核苷酸碱基的变化不影响分子的功能，如介导基因表达或者产生某种表型的能力。这些术语还指核酸片段的这样的修饰，相对于初始的未修饰的片段，所述修饰不实质上改变所得的核酸片段的功能性质。这些修饰包括在核酸片段中缺失、置换和／或插入一个或者多个核苷酸。
所涵盖的实质上相似的核酸序列，可通过其与本文所例示的序列杂交，或者与本文所公开的且与任何本文所公开的核酸序列在功能上等同的核苷酸序列的任何部分杂交(在中等严格条件下，例如0.5X SSC，0.1％SDS，60℃)的能力来定义。可调整严格性条件以筛选中等相似片段，如来自远缘关系生物的同源序列，以及高度相似片段，如来自近缘关系生物的复制功能酶的基因。杂交后的洗涤决定了严格性条件。
术语“选择性杂交”包括指涉在严格杂交条件下核酸序列与指定的核酸靶序列杂交的程度比其与非靶序列杂交的程度可检测地更高(例如，至少2倍于背景)，并且实质上排除非靶核酸。选择性杂交的序列通常相互具有约至少80％的序列同一性，或者90％的序列同一性，最多至100％并包括100％的序列同一性(即完全互补性)。
术语“严格条件”或者“严格杂交条件”包括指代在体外杂交测定中探针将与其靶序列选择性杂交的条件。严格条件是序列依赖性的，并且将在不同环境下不同。通过控制杂交和／或洗涤条件的严格性，可鉴定与探针100％互补的靶序列(同源探测)。或者，可以调节严格性条件以允许序列中的一些错配，从而检测到较低程度的相似性(异源探测)。一般地讲，探针长度小于约1000个核苷酸，任选地长度小于500个核苷酸。
通常，严格条件将为其中盐浓度低于约1.5M钠离子，通常为约0.01至1.0M钠离子浓度(或者其他盐)，pH为7.0至8.3，对短探针(例如，10至50个核苷酸)而言温度为至少30℃，对长探针(例如超过50个核苷酸)而言温度为至少约60℃的那些条件。严格条件还可以通过添加去稳定剂如甲酰胺来实现。示例性的低严格性条件包括在37℃下用30至35％甲酰胺、1M NaCl、1％SDS(十二烷基硫酸钠)的缓冲溶液杂交，并在50至55℃下在1X至2X SSC(20X SSC=3.0M NaCI／0.3M柠檬酸三钠)中洗涤。示例性的中等严格性条件包括在40％至45％甲酰胺、1M NaCl、1％SDS中在37℃下杂交和在0.5X至1X SSC中在55至60℃下洗涤。示例性的高严格性条件包括在50％甲酰胺、1M NaCl、1％SDS中在37℃下杂交，并在0.1X SSC中在60至65℃下洗涤。
特异性通常决定于杂交后的洗涤，关键因素为最终洗涤溶液的离子强度和温度。对于DNA-DNA杂交体，可根据Meinkoth等人，(1984)，AnalBiochem(《分析生物化学》)，138：267-284的公式估计Tm：Tm=81.5℃+16.6(log M)+0.41(％GC)-0.61(％form)-500／L；其中M为单价阳离子的摩尔浓度，％GC为DNA中鸟嘌呤核苷酸和胞嘧啶核苷酸的百分比，％form为杂交溶液中甲酰胺的百分比，L为杂交体的长度(单位为碱基对)。Tm为50％的互补靶标序列与完美匹配的探针杂交时的温度(在确定的离子强度和pH下)。对于每1％错配，Tm下降约1℃；因此，可调节Tm、杂交和／或洗涤条件以与具有所需同一性的序列杂交。例如，如果寻求具有90％同一性的序列，则可将Tm降低10℃。通常，将严格条件选择为比特定序列及其互补序列在确定的离子强度和pH下的热解链温度(Tm)低约5℃。然而，极端严格条件可以采用比热解链温度(Tm)低1、2、3或4℃的杂交和／或洗涤；适度严格条件可以采用比热解链温度(Tm)低6、7、8、9或10℃的杂交和／或洗涤；低严格条件可以采用比热解链温度(Tm)低11、12、13、14、15或20℃的杂交和／或洗涤；利用该公式，杂交和洗涤组成以及所需的Tm，普通技术人员将认识到，杂交和／或洗涤溶液的严格性的变化固有地得到了描述。如果所需的错配程度导致Tm低于45℃(水溶液)或32℃(甲酰胺溶液)，则优选增加SSC浓度以使得可使用较高的温度。有关核酸的杂交的详尽指南见于以下文献：Tijssen，Laboratory Techniques in Biochemistry andMolecular Biology-Hybridization with Nucleic Acid Probes，Part I，Chapter 2“Overview of principles of hybridization and the strategy of nucleic acid probeassays”(《生物化学和分子生物学实验室技术——核酸探针杂交》，第I部分，第2章，核酸探针测定法的杂交原理和策略概览)，Elsevier出版社，纽约(1993)；以及Current Protocols in Molecular Biology，Chapter 2(《分子生物学实验手册》第2章，Ausubel等人编辑，Greene Publishingand Wiley-Interscience出版社，纽约(1995)。杂交和／或洗涤条件可施加至少10、30、60、90、120或者240分钟。
在核酸或多肽序列的情形中，“序列同一性”或“同一性”是指在指定的比较窗口范围为获得最大对应而比对时两条序列中相同的核酸碱基或者氨基酸残基。
术语“序列同一性百分数”意指通过在比较窗口上比较两个最佳比对的序列所确定的数值，其中多核苷酸或者多肽序列在比较窗口中的部分与参考序列(不包含添加或缺失)相比包含添加或缺失(即空位)，以便两个序列的最佳比对。通过以下方式计算这种百分数：确定在两个序列中出现相同核酸碱基或氨基酸残基的位置的数目以得到匹配的位置的数目，将匹配的位置的数目除以比较窗口中位置的总数目，然后将结果乘以100以得到序列同一性百分数。序列同一性百分数的有用例子包括但不限于50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％或者95％，或者50％至100％的任何整数百分数。这些同一性可用本文描述的任何程序确定。
序列比对和同一性百分数或者相似性计算可用多种被设计用于检测同源序列的比较方法来确定，包括但不限于LASERGENE生物信息学计算软件包(DNASTAR Inc.公司，威斯康星州麦迪逊市)的MegAlignTM程序。在本申请的上下文中，应理解，在使用序列分析软件进行分析的情况中，分析的结果将基于所提到的软件的“默认值”，除非另有指明。本文所用的“默认值”将意指软件第一次初始化时原始装载在该软件中的任何数值或者参数组。
“Clustal V比对方法”对应于标示为Clustal V的比对方法(由Higgins和Sharp，(1989)，CABIOS(《计算机在生物科学中的应用》)5：151-153；Higgins等人，(1992)，Comput ApplBiosci(《计算机在生物科学中的应用》)，8：189-191描述)，其存在于LASERGENE生物信息学计算软件包(DNASTAR Inc.公司，威斯康星州麦迪逊市)的MegAlignTM程序。对于多序列比对，默认值对应于空位罚分=10，空位长度罚分=10。使用Clustal方法进行蛋白质序列的双序列比对和同一性百分数计算的默认参数是KTUPLE=1、空位罚分=3，窗口=5，对角线保存(DIAGONALS SAVED)=5。对于核酸，这些参数是KTUPLE=2、空位罚分=5，窗口=4，对角线保存=4。在用Clustal V程序进行序列比对后，可以通过观察同一程序中的“序列距离”表来获得“百分比同一性”。
“Clustal W比对方法”对应于标示为Clustal W的比对方法(由Higgins和Sharp，(1989)，CABIOS(《计算机在生物科学中的应用》)5：151-153；Higgins等人，(1992)，Comput Appl Biosci(《计算机在生物科学中的应用》)，8：189-191描述)，其存在于LASERGENE生物信息学计算软件包(DNASTAR Inc.公司，威斯康星州麦迪逊市)的MegAlignTM v6.1程序。用于多序列比对的默认参数(空位罚分=10、空位长度罚分=0.2、延迟发散序列(Delay Divergen Seqs)(％)=30，DNA转换权重(DNA TransitionWeight)=0.5、蛋白质权重矩阵=Gonnet系列，DNA权重矩阵=IUB)。在用Clustal W程序进行序列比对后，可以通过观察同一程序中的“序列距离”表来获得“百分比同一性”。
除非另有规定，否则本文提供的序列同一性／目似性值是指使用GAP版本10(GCG，Accelrys，加利福尼亚州圣地亚哥市)采用以下参数获得的值：使用空位产生罚分权重50和空位长度延伸罚分权重3以及nwsgapdna.cmp记分矩阵，所得的核苷酸序列同一性百分数和相似性百分数；使用空位产生罚分权重8和空位长度延伸罚分权重2以及BLOSUM62记分矩阵，所得的氨基酸序列同一性百分数和相似性百分数(Henikoff和Henikoff，(1989)，Proc.Natl，Acad.Sci.USA(《美国国家科学院院刊》)，89：10915)。GAP利用Needleman和Wunsch(1970)J Mol Biol48：443-53的算法来寻找两个完整序列的比对，该比对使匹配数最大而使空位数最小。GAP考虑所有可能的比对和空位位置，并使用以匹配碱基为单位的空位产生罚分和空位延伸罚分产生出具有最大数目的匹配碱基和最少的空位的比对。
“BLAST”是美国国家生物技术信息中心(NCBI)提供的用于寻找生物序列之间的相似性区域的搜索算法。该程序将核苷酸或者蛋白质序列与序列数据库比较，并计算各匹配的统计学显著性以鉴定出与查询序列具有足够的相似性的序列，使得相似性不会被预测为随机发生。BLAST报告所鉴定的序列以及它们与查询序列的局部比对。
本领域的技术人员熟知，许多序列同一性水平可用于鉴定来自其它物种的或者经天然修饰或合成法修饰的多肽，其中这种多肽具有相同或相似的功能或活性。同一性百分数的有用例子包括但不限于50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％或者95％，或者50％至100％之间的任何整数百分数。的确，50％至100％之间的任何整数氨基酸同一性可用于描述本发明，如51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或者99％。
“基因”指表达特定蛋白质的核酸片段，包括位于编码序列之前(5′非编码序列)和之后(3′非编码序列)的调节序列。“天然基因”指如自然界中存在的那样具有其自身调节序列的基因。“嵌合基因”指任何不属天然基因、且包含在自然界中不在一起的调节序列和编码序列的基因。因此，嵌合基因可以包含源自不同来源的调节序列和编码序列，或者源自相同来源、但是以不同于自然界中存在的方式排列或者在不同于自然界中存在的遗传基因座处排列的调节序列和编码序列。“外来”基因指通常不存在于宿主生物体中、但通过基因转移导入该宿主生物体中的基因。外来基因可以包括插入非天然生物体中的天然基因或嵌合基因。
“突变基因”是已通过人类介入被变更的天然基因。这种“突变基因”的序列与相应的天然基因的序列不同之处在于至少一个核苷酸添加、缺失或者置换。在本发明的某些实施例中，突变基因包含由本文所公开的双链断裂诱导剂引起的变更。
“转基因”是已经通过转化程序导入基因组中的基因。转基因可例如编码一个或者多个蛋白质或者不被翻译成蛋白质的RNA。但是，本发明的转基因不需要编码蛋白质和／或非翻译的RNA。在本发明的某些实施例中，转基因包含一个或者多个嵌合基因，包括包含例如目的基因、表型标记、选择性标记和用于基因沉默的DNA的嵌合基因在内。
本文所用的“靶向突变”是天然基因中的通过如下方式产生的突变：使用涉及本文所公开的或者本领域知道的能够在靶序列的DNA中引起双链断裂的双链断裂诱导剂的方法，对天然基因内的靶序列进行变更。
术语“基因组”应用于植物细胞时，不仅涵盖细胞核内存在的染色体DNA，也涵盖细胞的亚细胞组分(例如线粒体或者质体)中存在的细胞器DNA。
“密码子修饰的基因”或者“密码子偏好的基因”或者“密码子优化的基因”是这样的基因，其密码子用法的频率被设计成模拟宿主细胞的偏好密码子用法的频率。
“等位基因”是基因的占据染色体上特定基因座的几种另类形式之一。当染色体上特定基因座处存在的所有等位基因都相同时，该植物在该基因座处是纯合的。如果染色体上特定基因座处存在的等位基因不同，则该植物在该基因座处是杂合的。
“编码序列”指编码特定氨基酸序列的多核苷酸序列。“调节序列”指位于编码序列上游(5′非编码序列)、内部或下游(3′非编码序列)并且影响相关编码序列的转录、RNA加工或稳定性、或翻译的核苷酸序列。调节序列可包括但不限于：启动子、翻译前导序列、5′非翻译序列、3′非翻译序列、内含子、聚腺苷酸化识别序列、RNA加工位点、效应物结合位点和茎环结构。
“植物优化核苷酸序列”是已经过优化以提高在植物中的表达、特别是提高在植物中或者一种或者多种目的植物中的表达的核苷酸序列。例如，可通过使用一个或者多个用于改进表达的植物偏好密码子，对本文所公开的编码蛋白质例如双链断裂诱导剂(例如内切核酸酶)的核苷酸序列进行修饰，来合成植物优化核苷酸序列。有关宿主偏好的密码子用法的讨论，参见例如Campbell和Gowri，(1990)，Plant Physiol.(《植物生理学》)92：1-11。本领域可获得用于合成植物优选性基因的方法。参见例如第5,380,831号和第5,436,391号美国专利，以及Murray等人，(1989)，Nucleic AcidsRes.(《核酸研究》)，17：477-498(通过引用并入本文)。已知有另外的序列修饰可增强在植物宿主中的基因表达。这些包括例如消除：一个或者多个编码假聚腺苷酸化信号的序列、一个或者多个外显子-内含子剪接位点信号、一个或者多个转座子样重复序列以及其他这种得到很好表征的可能对基因表达有害的序列。可将序列的G-C含量调整到给定的植物宿主的平均水平，这通过参考在宿主植物细胞中表达的已知基因计算得到。当可能时，修饰序列以避免一个或者多个预测的发夹二级mRNA结构。因此，本发明的“植物优化核苷酸序列”包含一个或者多个这种序列修饰。
“启动子”指能够控制编码序列或者功能RNA的表达的DNA序列。启动子序列由近端上游元件和更远端的上游元件组成，后一类元件经常称作增强子。因此，“增强子”是这样的DNA序列，其可以刺激启动子活性，并且可以是启动子的固有元件或经插入以增强启动子的水平或组织特异性的异源元件。启动子可以整体源自天然基因，或由源自自然界中存在的不同启动子的不同元件构成，或甚至包含合成的DNA区段。本领域技术人员应当理解，不同的启动子可以引导基因在不同组织或细胞类型中或在不同的发育阶段或应答于不同的环境条件时表达。还认识到，由于在大多数情况下调节序列的确切界限仍未完全确定，因此存在一定变异的各DNA片段可以具有相同的启动子活性。造成基因在大多数时间在大多数细胞类型中表达的启动子通常称为“组成型启动子”。可用于植物细胞的各种类型的新启动子不断被发现；许多例子可见于以下汇编中：Okamuro和Goldberg，(1989)，TheBiochemistry ofPlants(《植物生物化学》)，第115卷，Stumpf和Conn编辑(纽约州纽约市：学术出版社(Academic Press)，第1-82页。
“翻译前导序列”指位于基因启动子序列和编码序列之间的多核苷酸序列。翻译前导序列存在于翻译起始序列上游的充分加工的mRNA中。翻译前导序列可以影响初级转录物加工成mRNA、mRNA稳定性或翻译效率。翻译前导序列的例子已有描述(例如Turner和Foster，(1995)，MolBiotechnol(《分子生物技术》)，3：225-236)。
“3′非编码序列”、“转录终止子”或者“终止序列”指位于编码序列下游的DNA序列，包括聚腺苷酸化识别序列和其他编码能够影响mRNA加工或基因表达的调节信号的序列。聚腺苷酸化信号通常以影响聚腺苷酸串(polyadenylic acid tract)向mRNA前体3′末端的添加为特征。Ingelbrecht等人，(1989)，Plant Cell(《植物细胞》)，1：671-680举例了不同的3′非编码序列的使用。
“RNA转录物”指由RNA聚合酶催化的DNA序列的转录所产生的产物。当RNA转录物是DNA序列的完美互补拷贝时，它被称为初级转录物。当RNA转录物是由初级转录物的转录后加工衍生的RNA序列时，它被称为成熟RNA。“信使RNA”或者“mRNA”指没有内含子且可被细胞翻译成蛋白质的RNA。“cDNA”指与mRNA模板互补且用反转录酶从mRNA模板合成的DNA。cDNA可以是单链的，或者可用DNA聚合酶I从Klenow片段转化成双链形式。“有义”RNA指包括该mRNA并且可在细胞内或者在体外被翻译成蛋白质的RNA转录物。“反义RNA”指与靶初级转录物或者mRNA的全部或者部分互补，并且能阻断靶基因的表达的RNA转录物(参见例如第5,107,065号美国专利)。反义RNA的互补性可存在于特定基因转录物的任何部分，即在5′非编码序列、3′非编码序列、内含子或者编码序列。“功能RNA”指反义RNA、核酶RNA或者其他可能不被翻译但仍对细胞过程具有作用的RNA。术语“互补序列”或者“反互补序列”在本文中可互换地用来指涉mRNA转录物，并且意在定义该信息(message)的反义RNA。
术语“有效连接”指各核酸序列结合在单一核酸片段上，使得一个核酸序列的功能被另一个核酸序列调节。例如，当启动子能够调节编码序列的表达时(即，该编码序列处于该启动子的转录控制下)，则该启动子与该编码序列有效连接。编码序列可以以有义或者反义方向与调节序列有效连接。在另一个例子中，互补的RNA区域可以直接或者间接地与靶mRNA的上游(5′)有效连接，或者与靶mRNA的下游(3′)有效连接，或者在靶mRNA内部有效连接，或者第一互补区在靶mRNA的上游(5′)，而其互补序列在靶mRNA的下游(3′)。
本文所用的标准重组DNA和分子克隆技术是本领域公知的，在以下文献中有更完全的描述：Sambrook等人，Molecular Cloning：A LaboratoryManual(《分子克隆实验指南》)；冷泉港实验室；纽约冷泉港(1989)。转化方法是本领域技术人员公知的，并在下文中描述。
“PCR”或者“聚合酶链反应”是一项用于合成特定DNA区段的技术，由一系列的重复的变性、退火和延伸循环组成。通常，将双链DNA进行热变性，并将两条与靶区段的3′边界互补的引物与该DNA在低温下退火，然后在中等温度下延伸。一组这三个连续步骤称为一个“循环”。
术语“重组的”指序列的两个本来分开的区段例如通过化学合成人工组合在一起，或者通过遗传工程技术对核酸的分离的区段进行操纵。
术语“质粒”、“载体”和“盒”指这样的染色体外元件，其通常携带不是细胞的中心代谢的一部分的基因，并且通常为双链DNA的形式。这种元件可以是衍自任何来源的、单链或者双链DNA或者RNA的、线状或者环状形式的自主复制序列、基因组整合序列、噬菌体或者核苷酸序列，其中多个核苷酸序列已连接或者重组成能够将目的多核苷酸引入到细胞中的独特构建体。“转化盒”指含有外来基因并且除该外来基因之外还具有能促进特定宿主细胞的转化的元件的特定载体。“表达盒”指含有外来基因并且除该外来基因之外还具有使该基因可以在外来宿主中表达的元件的特定载体。
术语“重组DNA分子”、“重组构建体”、“表达构建体”、“嵌合构建体”、“构建体”和“重组DNA构建体”在本文中可互换使用。重组构建体包含在自然界中不全部在一起的核酸片段(例如调节序列和编码序列)的人工组合。例如，嵌合构建体可以包含源自不同来源的调节序列和编码序列，或者源自相同来源、但是以不同于自然界中存在的方式排列的调节序列和编码序列。这种构建体可单独使用或者可与载体结合使用。如果使用载体，则载体的选择取决于将被用来转化宿主细胞的方法，这是本领域技术人员公知的。例如，可以使用质粒载体。技术人员熟知为了成功地转化、选择和扩增宿主细胞而必须在载体上存在的遗传元件。技术人员也会认识到，不同的独立转化事件可导致不同的表达水平和模式(Jones等人，(1985)，EMBO J(《欧洲分子生物学组织杂志》)，4：2411-2418；De Almeida等人，(1989)，Mol Gen Genetics(《分子与普通遗传学》)，218：78-86)，从而通常筛选多个事件以获得表现出所需的表达水平和模式的株系。这种筛选可通过标准的分子生物学测定法、生物化学测定法和其他测定法完成，所述测定法包括DNA印迹分析、mRNA表达的RNA印迹分析、PCR、实时定量PCR(qPCR)、反转录PCR(RT-PCR)、蛋白质表达的免疫印迹分析、酶或者活性测定和／或表型分析。
本文所用的术语“表达”指产生前体形式或者成熟形式的功能性最终产物(例如mRNA或者蛋白质)。
术语“引入”意指向细胞提供核酸(例如表达构建体)或者蛋白质。引入包括指代核酸掺入到真核或者原核细胞中，其中该核酸可掺入到该细胞的基因组中，并且包括指代核酸或者蛋白质短暂提供到细胞。引入包括指代稳定的或者短暂的转化方法，以及有性杂交。因此，在将核酸片段(例如，重组DNA构建体／表达构建体)插入细胞中的语境中，“引入”意指“转染”或“转化”或“转导”，并且包括指代将核酸片段掺入到真核或原核细胞中，其中该核酸片段可掺入到细胞的基因组(例如染色体、质粒、质体或线粒体DNA)中，转化成自主复制子或瞬时表达(例如，转染的mRNA)。
“成熟”蛋白质指翻译后加工的多肽(即，已从初级翻译产物移除了任何存在的原肽或者前肽所得的多肽)。“前体”蛋白指mRNA的翻译的初级产物(即，仍存在原肽和前肽)。原肽和前肽可以是但不限于胞内定位信号。
“稳定转化”指核酸片段转移到宿主生物体的基因组中，包括核基因组和细胞器基因组在内，从而导致遗传上稳定的遗传(genetically stableinheritance)。相反，“短暂转化”指核酸片段转移到宿主生物体的细胞核或者其他含DNA的细胞器中，导致基因表达，但不存在整合或者稳定的遗传。含有转化的核酸片段的宿主生物体称作“转基因”生物体。
本文所用的“转基因”指在其基因组中包含异源多核苷酸的植物或者细胞。通常，异源多核苷酸稳定地整合在基因组内，使得该多核苷酸得以传递到连续世代。异源多核苷酸可以单独整合到基因组中，或者作为表达构建体的一部分整合到基因组中。“转基因”在本文中用于包括其基因型已因异源核酸的存在而变更的任何细胞、细胞系、愈伤组织、组织、植物部分或植物，包括最初经如此变更的那些转基因植物以及通过有性杂交或无性繁殖从最初的转基因植物产生的那些转基因植物。本文所用的术语“转基因(的)”不涵盖通过常规植物育种方法或通过诸如随机异花受精、非重组病毒感染、非重组细菌转化、非重组转座或自发突变之类的自然发生事件导致的基因组(染色体基因组或染色体外基因组)改变。
术语“植物”指整株植物、植物器官、植物组织、种子、植物细胞、及其种子和子代。植物细胞包括但不限于来自种子、悬浮培养物、胚、分生组织区、愈伤组织、叶、根、苗、配子体、孢子体、花粉和小孢子的细胞。植物部分包括分化的和未分化的组织，包括但不限于根、茎、苗、叶、花粉、种子、瘤组织和各种形式的细胞和培养物(例如，单细胞、原生质体、胚和愈伤组织)。植物组织可以在植物中或者在植物器官、组织或者培养物中。术语“植物器官”指构成植物的形态上和功能上不同的部分的植物组织或者一组植物组织。术语“基因组”指生物体每个细胞或者病毒或者细胞器中存在的全部遗传材料(基因和非编码序列)；和／或作为(单倍体)单位从一个亲本遗传的一整套染色体。“子代”包含植物的任何后续各代。
“能育植物”是能够产生子代植物的植物。在本发明的某些实施例中，能育植物是能产生活的雄配子和雌配子并且自身能育的植物。这种自身能育植物可在没有任何其他植物贡献配子及其中所含的遗传材料的情况下产生子代植物。本发明的其他实施例可涉及使用不自身能育的植物，因为该植物不产生活的或者能够授受精的雄配子或者雌配子。本文所用的“雄性不育植物”是不产生活的或者能够授精的雄配子的植物。本文所用的“雌性不育植物”是不产生活的或者能够受精的雌配子的植物。应认识到，雄性和雌性不育植物可以分别是雌性能育和雄性能育的。还应认识到，雄性能育(但雌性不育)植物当与雌性能育植物杂交时可产生活的子代，而雌性能育(但雄性不育)植物当与雄性能育植物杂交时可产生活的子代。
“厘摩”(cM)或者“图距单位(map unit)”是两个连接的基因、标记、靶位点、基因座或者它们的任何配对之间的距离，其中1％的减数分裂产物是重组的。因此，一厘摩与等于两个连接的基因、标记、靶位点、基因座或者它们的任何配对之间的1％平均重组频率的距离相当。
本发明可用于培育包含两个或者多个转基因性状的植物。通常，转基因性状是作为基于农杆菌、生物射弹术或者其他常用程序的转化系统的结果而随机插入在植物基因组当中。最近，已开发出了能够定向插入转基因的基因打靶方案。一种重要的技术即位点特异性整合(SSI)能使转基因靶向与之前插入的转基因相同的染色体位置。定制的大范围核酸酶和定制的锌指大范围核酸酶使研究者可以设计核酸酶以靶向特定的染色体位置，并且这些试剂使得可以将转基因靶向于被这些核酸酶切割的染色体位点。
本文所公开的核酸酶介导的基因打靶，可在用于产生包含多个转基因的复合转基因性状基因座的方法中使用。在本发明的一个实施例中，复合转基因性状基因座是具有多个在遗传上互相连接的转基因的基因座。通过插入独立的转基因使它们相互间相隔在1、2或者甚至5厘摩(cM)以内，这些转基因可培育成单个遗传基因座。图7示出两种性状如何可以在独立的转化运作中或者在相续的转化(例如转化和再转化)中以相互间例如0.2cM的遗传距离整合到基因组中的过程。在对事件进行选择之后，可将含有该两个事件的植物进行杂交以形成在不同染色体上含有所述事件的F1。在来自这些F1的子代(F2或者BC1)中,1／500的子代会具有被重组到同一染色体上的两个不同转基因。该复合基因座然后可被培育成为具有两种转基因性状的单个遗传基因座。可重复这个过程以按需堆积尽可能多的性状。
本发明提供用于在选定的基因组区域产生复合转基因性状基因座的方法，以简化用多个转基因进行的培育工作。为起动复合转基因性状基因座的开发工作，首选选择基因组的某个区域。其次，收集邻近的基因组区域的序列，并设计核酸酶试剂以便将另外的转基因靶向这些紧密连接的位点。随后，使用用于核苷酸设计的算法(例如公布号为2007／0117128 A1的美国专利申请中描述的那些算法)选择潜在靶位点。可使用另外的生物信息学分析，例如位点在靶基因组中的拷贝数、位点相对于已知的基因编码区的位置以及其他因素，将所述位点过滤得到优选位点子集。然后可使用核酸酶，采用公布的方案将新的转基因靶向这些优选位点。参见例如Halluin等人，(2008)，Plant Biotechnol.J.(《植物生物技术杂志》)，6：93-102；Shukla等人，(2009)，Nature(《自然》)，doi：10.1038／nature07992；Wright等人，Plant J.(《植物杂志》)，(2005)，44：693-705；以及WO2009／006297；所有这些文献和专利均以引用方式并入本文。
在第一个方面，本发明提供用于在植物中产生在目的基因组区域中包含至少两个变更的靶序列的复合转基因性状基因座的方法。在一个实施例中，所述方法涉及选择植物中的包含第一靶序列和第二靶序列的基因组区域。一般地讲，第一靶序列和第二靶序列在该植物基因组中相互间相隔约0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、2、3、4或者5厘摩(cM)。在本发明的某些实施例中，第一和第二靶序列物理连接到目的多核苷酸，例如转基因、天然基因或者具有靶向突变的基因，所述多核苷酸与第一和／或第二靶序列相隔在约0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20或者21cM以内。
本发明的方法还涉及提供第一双链断裂诱导剂和第二双链断裂诱导剂。第一双链断裂诱导剂能够在包含第一靶序列的DNA中诱导第一双链断裂，而第二双链断裂诱导剂能够在包含第二靶序列的DNA中诱导第二双链断裂。本发明的方法不依赖于特定的双链断裂诱导剂，只要该双链断裂诱导剂能够在本发明的靶序列中的DNA中诱导双链断裂。本文公开的或者本领域知道的任何这种双链断裂诱导剂都可在本发明的方法中使用。
另外，所述方法涉及使至少一个植物细胞与第一双链断裂诱导剂接触，鉴定出在第一靶序列包含第一变更的细胞，然后从该包含第一变更的细胞再生出第一能育植物。第一能育植物也包含第一变更。另外，所述方法涉及使至少一个植物细胞与第二双链断裂诱导剂接触，鉴定出在第二靶序列包含第二变更的细胞，然后从该包含第二变更的细胞再生出第二能育植物。所述方法还涉及从第二能育植物获得能育子代植物，其中能育子代植物包含物理连接在一起的第一和第二变更。
在这个方法的一个实施例中，通过将第一能育植物和第二能育植物杂交，并选择出包含物理连接在一起的第一和第二变更的能育子代植物，来获得能育子代植物。在另一个实施例中，使包含第一变更的第一能育植物或其子代的细胞与第二双链断裂诱导剂接触，从而第二能育植物同时包含第一和第二变更，所述第一和第二变更可以或者可以不物理连接在一起。如果需要，可将第二能育植物进行自交，并选择出包含物理连接在一起的第一和第二变更的能育子代植物。
第一和第二变更选自(i)置换至少一个核苷酸，(ii)缺失至少一个核苷酸，(iii)插入至少一个核苷酸，或者(iv)(i)-(iii)的任何组合。在本发明的一个实施例中，第一和／或第二变更包含插入目的DNA序列，包括但不限于用于基因沉默的DNA、编码表型标记的DNA和编码提供农艺优势的蛋白质的DNA。在另一个实施例中，第一和／或第二变更包含天然基因中的靶向突变。
按相同的方式，本文公开的方法可用于在植物中在包含1、2、3、4、5、6、7、8、9、10个或者更多个目的靶序列的目的基因组区域中产生包含1、2、3、4、5、6、7、8、9、10个或者更多个物理连接在一起的变更的靶序列的复合转基因性状基因座。目的基因组区域中的每个另外的目的靶序列可被基本上如上所述的双链断裂诱导剂识别和切割。
例如，如下将第三目的DNA序列插入到第三靶序列中：将植物的至少一个细胞与第三双链断裂诱导剂和包含该目的DNA序列的第三DNA分子接触，然后鉴定出包含该目的DNA序列的细胞。所述方法还可包括再生出包含第三目的DNA序列的能育植物。在一个实施例中，包含第三目的DNA序列的细胞包含有第一变更、第二变更或者同时包含第一变更和第二变更。本发明的方法还可包括产生包含物理连接在一起的第一变更、第二变更和第三目的DNA序列的能育植物。在另一个实施例中，如下产生包含第一变更、第二变更和第三目的DNA序列的能育植物：将包含第一和第二变更的能育植物与包含第三目的DNA序列的第二能育植物杂交，从该杂交选择出能育子代植物，其中该能育子代植物包含物理连接在一起的第一变更、第二变更和第三目的DNA序列。
包含第一变更、第二变更和第三目的DNA序列的能育植物可例如以如下方式产生：(i)使包含第一变更和第二变更的细胞与第三双链断裂诱导剂接触；(ii)鉴定出来自(i)的包含第三目的DNA序列的细胞，其中该细胞包含第一变更和第二变更，且其中第一变更、第二变更和第三目的DNA序列物理连接在一起；并且(iii)再生出包含物理连接在一起的第一变更、第二变更和第三目的DNA序列的能育植物。
在本发明的另一个实施例中，用于在植物中在目的基因组区域中产生包含至少两个变更的靶序列的复合转基因性状基因座的方法，涉及到获得在目的基因组区域包含第一变更的靶位点的第一能育植物和在目的基因组区域包含第二变更的靶位点的第二能育植物。在这个方法中，第一变更的靶序列来源于被第一双链断裂诱导剂识别和切割的第一靶序列，第二变更的靶序列来源于被第二双链断裂诱导剂识别和切割的第二靶序列。所述第二个方法还涉及使第一能育植物与第二能育植物杂交，然后从该杂交选择出包含物理连接在一起的第一变更和第二变更的能育子代植物。
该第二方法可任选涉及是该能育子代植物与在目的基因组区域中包含至少第三变更的靶序列的另外的能育植物杂交，然后从该杂交选择出包含物理连接在一起的第一变更、第二变更和该至少第三变更的能育子代植物。与第一和第二变更的靶序列一样，第三变更的靶序列来源于被第三双链断裂诱导剂识别和切割的第三靶序列。按相同的方式，可产生出在目的基因组区域中包含4、5、6、7、8、9、10个或者更多个物理连接在一起的变更的靶序列的复合转基因性状基因座。
在另一个方面，本发明提供植物中的复合转基因性状基因座以及包含至少一个本发明的复合转基因性状基因座的植物、植物部分、植物细胞和种子。本发明的复合转基因性状基因座包含至少两个在遗传上与目的多核苷酸连接的变更的靶序列。这种变更的靶序列来源于相应的靶序列，使用例如本文公开的方法该相应的靶序列被双链断裂诱导剂识别和切割。变更的靶序列包含变更，例如在靶序列中置换至少一个核苷酸，在靶序列中缺失至少一个核苷酸，在靶序列中插入至少一个核苷酸，或者它们的任何组合。目的多核苷酸可以例如是转基因、天然基因和突变基因。本发明提供包含至少一个本发明的复合转基因性状基因座的植物、植物部分、植物细胞和种子。
在一个实施例中，本发明的复合转基因性状基因座包含至少一个包含重组DNA分子的变更的靶序列。本发明的重组DNA分子包括但不限于用于基因沉默的DNA、编码表型标记的DNA和编码提供农艺优势的蛋白质的DNA。
一般地讲，复合转基因性状基因座的每个变更的靶位点位于目的多核苷酸0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20或者21厘摩(cM)以内。
本发明的方法涉及使用一种或者多种双链断裂诱导剂。本发明的双链断裂诱导剂可以是任何能识别和／或结合特定多核苷酸识别序列以在该识别序列之处或者附近的靶序列中产生断裂的试剂。双链断裂诱导剂的例子包括但不限于内切核酸酶、TAL效应物核酸酶和锌指核酸酶，并包括它们的修饰衍生物、变体和片段。
识别序列是任何被双链断裂诱导剂特异性识别和／或结合的多核苷酸序列。识别位点序列的长度可变，并且包括例如长度为至少4、6、8、10、12、14、16、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70个或者更多个核苷酸的序列。
识别位点有可能是回文的，即一条链上的序列在互补链上从相反方向读起来是一样的。切口／切割位点可在识别序列内部，或者切口／切割位点可在识别序列外部。在另一个变型形式中，切割可发生在互相正对着的核苷酸位置处以产生平端切口，或者在其他情况中，切口可交错以产生单链突出端，也称“粘性末端”，可以为5′突出端或者3′突出端。识别序列可以是内源的或者外源的。当识别位点为内源序列时，它可以是被自然发生的或者天然的双链断裂诱导剂识别的识别序列。作为另一种选择，内源识别位点可被经修饰的或者经工程改造的双链断裂诱导剂识别和／或结合，所述经修饰的或者经工程改造的双链断裂诱导剂被设计或者选择成特异性识别内源识别序列以产生双链断裂。经修饰的双链断裂诱导剂可衍自天然的、自然发生的双链断裂诱导剂，或者它可以是人工创造或者合成的。
有多种方法可用来鉴定那些在识别序列之处或者附近具有变更的基因组的细胞，而无须使用可筛选的标记表型。这种方法可认为是直接分析识别序列以检测识别序列中的任何变化，保留但不限于PCR方法、测序方法、核酸酶消化、DNA印迹法以及它们的任何组合。
蛋白质可通过各种方式进行变更，包括氨基酸置换、缺失、截短和插入。用于这类操作的方法是公知的。例如，可通过在DNA中作出突变来制备蛋白质的氨基酸序列变体。诱变和核苷酸序列变更的方法包括例如Kunkel，(1985)，Proc.Natl.Acad. Sci.USA(《美国国家科学院院刊》)，82：488-92；Kunkel等人，(1987)，Meth Enzymol(《酶学方法》)，154：367-82；第4,873,192号美国专利；Walker和Gaastra编辑，(1983)，Techniques in Molecular Biology(《分子生物学技术》)(MacMillan出版公司，纽约)以及其中引证的参考文献。有关不太可能影响蛋白质的生物活性的氨基酸置换的指导，见于例如Dayhoff等人，(1978)，Atlas of ProteinSequence and Structure(蛋白质序列和结构图谱集)(国家生物医学研究基金会(Natl Biomed Res Found)，美国华盛顿哥伦比亚特区)的模型。保守置换，如将一个氨基酸用另一具有相似性质的氨基酸进行交换，可以是优选的。保守缺失、插入和氨基酸置换预期不会造成蛋白质特征的根本性变化，并且任何置换、缺失、插入或者它们的组合的效应可通过常规筛选测定法进行评估。测定双链断裂诱导活性的测定法是已知的，一般是测量该试剂对含有识别位点的DNA底物的总体活性和特异性。
内切核酸酶是切割多核苷酸链内的磷酸二酯键的酶，包括切割DNA成特异性位点而不损伤碱基的限制性内切核酸酶。限制性内切核酸酶包括I型、II型、III型和IV型内切核酸酶，它们进一步包括亚型。在I型和III型系统中，甲基化酶活性和限制酶活性两者都包含在单一复合物中。
I型和III型限制内切核酸酶能识别特定识别位点，但通常在离识别位点可变的位置处切割，该位置距离识别位点可达数百个碱基对。在II型系统中，限制酶活性不依赖于任何甲基化酶活性，并且切割通常发生在识别位点之内或者附近的特定位点处。大多数的II型酶能切割回文序列，但是IIa型酶能识别非回文识别位点并在识别位点外部切割，IIb型酶切割序列两次，两个位点都在识别位点外部，而IIs型酶能识别非对称识别位点并在一侧上和离识别位点约1-20个核苷酸的确定距离处切割。
IV型限制酶能靶向甲基化的DNA。限制酶在例如以下数据库和文献中有进一步的描述和分类：REBASE数据库(网页rebase.neb.com；Roberts等人，(2003)，Nucleic Acids Res(《核酸研究》)，31：418-20)，Roberts等人，(2003)，Nucleic Acids Res(《核酸研究》)，31：1805-12，以及Belfort等人，(2002)，Mobile DNA II(《可动DNA II》)，第761-783页，Craigie等人编辑，(ASM出版社，华盛顿哥伦比亚特区)。
内切核酸酶还包括大范围核酸酶，也称归巢内切核酸酶(HE酶)，它与限制性内切核酸酶一样在特定识别序列处结合和切割，但是大范围核酸酶的识别位点通常更长，约为18bp或者更长。基于保守序列模体，大范围核酸酶已被分类为四个家族，这些家族是LAGLIDADG家族、GIY-YIG家族、H-N-H家族和His-Cys box家族。这些模体参与金属离子的配位和磷酸二酯键的水解。HE酶的显著之处在于它们的识别位点长，并且能容忍它们的DNA底物中有一定的序列多态性。大范围核酸酶的命名规范与其他限制性内切核酸酶的规范相似。对于分别由独立式ORF(free-standing ORF)、内含子和内含肽编码的大范围核酸酶，它们也通过前缀F-、I-或者PI-进行表征。例如，来自酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)的由内含子、内含肽和独立式基因编码的大范围核酸酶分别表示为I-SceI，PI-SceI和F-SceII。大范围核酸酶结构域、结构和功能是已知的，参见例如Guhan和Muniyappa，(2003)，《生物化学和分子生物学评论》(Crit Rev Biochem MolBiol)，38：199-248；Lucas等人，(2001)，Nucleic AcidsRes(《核酸研究》)，29：960-9；Jurica和Stoddard，(1999)，《细胞和分子生命科学》(Cell MolLife Sci)，55：1304-26；Stoddard，(2006)，《生物物理学季评》(Q RevBiophys)，38：49-95；以及Moure等人，(2002)，《自然-结构和分子生物学》(Nat Struct Biol)，9：764。在一些实例中，使用自然发生的变体和／或经工程改造的衍生大范围核酸酶。用于修饰动力学性质、辅因子相互作用、表达、最佳条件和／或识别位点特异性以及筛选活性的方法是已知的，参见例如Epinat等人，(2003)，Nucleic Acids Res(《核酸研究》)，31：2952-62；Chevalier等人，(2002)，Mol Cell(《分子细胞》)，10：895-905；Gimble等人，(2003)，Mol Biol(《分子生物学》)，334：993-1008；Seligman等人，(2002)，Nucleic AcidsRes(《核酸研究》)，30：3870-9；Sussman等人，(2004)，J Mol Biol(《分子生物学杂志》)，342：31-41；Rosen等人，(2006)，Nucleic Acids Res(《核酸研究》)，34：4791-800；Chames等人，(2005)，Nucleic Acids Res(《核酸研究》)，33：e178；Smith等人，(2006)，Nucleic Acids Res(《核酸研究》)，34：e149；Gruen等人，(2002)，Nucleic Acids Res(《核酸研究》)，30：e29；Chen和Zhao，(2005)，Nucleic Acids Res(《核酸研究》)，33：e154；WO2005105989；WO2003078619；WO2006097854；WO2006097853；WO2006097784；和WO2004031346。
任何大范围核酸酶都可用作双链断裂诱导剂，包括但不限于I-SceI、I-SceII、I-SceIII、I-SceIV、I-SceV、I-SceVI、I-SceVII、I-CeuI、I-CeuAIIP、I-CreI、I-CrepsbIP、I-CrepsbIIP、I-CrepsbIIIP、I-CrepsbIVP、I-TIiI、I-PpoI、PI-PspI、F-SceI、F-SceII、F-SuvI、F-TevI、F-TevII、I-AmaI、I-AniI、I-ChuI、I-CmoeI、I-CpaI、I-CpaII、I-CsmI、I-CvuI、I-CvuAIP、I-DdiI、I-DdiII、I-DirI、I-DmoI、I-HmuI、I-HmuII、I-HsNIP、I-IIaI、I-MsoI、I-NaaI、I-NanI、I-NcIIP、I-NgrIP、I-NitI、I-NjaI、I-Nsp236IP、I-PakI、I-PboIP、I-PcuIP、I-PcuAI、I-PcuVI、I-PgrIP、I-PobIP、I-PorI、I-PorIIP、I-PbpIP、I-SpBetaIP、I-ScaI、I-SexIP、I-SneIP、I-SpomI、I-SpomCP、I-SpomIP、I-SpomIIP、I-SquIP、I-Ssp6803I、I-SthPhiJP、I-SthPhiST3P、I-SthPhiSTe3bP、I-TdeIP、I-TevI、I-TevII、I-TevIII、I-UarAP、I-UarHGPAIP、I-UarHGPA13P、I-VinIP、I-ZbiIP、PI-MtuI、PI-MtuHIP PI-MtuHIIP、PI-PfuI、PI-PfuII、PI-PkoI、PI-PkoII、PI-Rma43812IP、PI-SpBetaIP、PI-SceI、PI-TfuI、PI-TfuII、PI-ThyI、PI-TIiI、PI-TIiII，或者它们的任何变体或衍生物。
内切核酸酶可以是能结合非天然或者外源识别序列而不结合天然或者内源识别序列的经修饰的内切核酸酶。内切核酸酶的修饰可少至一个核苷酸。经修饰的内切核酸酶不能够在野生型靶序列内产生双链断裂。野生型(即被修饰前)内切核酸酶能够在野生型靶序列内产生双链断裂。
内切核酸酶通过编码内切核酸酶的多核苷酸提供。这种编码内切核酸酶的多核苷酸可进行修饰，以置换上与自然发生的多核苷酸序列相比在植物中具有更高使用频率的密码子。例如，编码内切核酸酶的多核苷酸可进行修饰，以置换上与自然发生的多核苷酸序列相比在玉蜀黍或者大豆植物中具有更高使用频率的密码子。
位点特异性重组酶，也称重组酶，是催化其相容的重组位点之间的保守位点特异性重组的多肽，包括天然多肽以及保持活性的衍生物、变体和／或片段，以及编码保持活性的重组酶的天然多核苷酸、衍生物、变体和／或片段。
重组过程中的一个步骤涉及在识别位点之处或者附近进行多核苷酸切割。这个切割活性可用来产生双链断裂。有关位点特异性重组酶及其识别位点的综述，参见Sauer，(1994)，Curr Op Biotechnol(《生物技术当前述评》)，5：521-7；以及Sadowski，(1993)，FASEB(美国实验生物学学会联合会)，7：760-7。在一些实例中，重组酶来自整合酶或者解离酶家族。
重组酶的整合酶家族具有超过一百个成员，包括例如FLP、Cre、lambda整合酶和R。基于活性位点的结构，整合酶家族已被分成两类：丝氨酸重组酶和酪氨酸重组酶。酪氨酸家族包括Cre、FLP、SSV1和lambda(λ)整合酶，使用催化性的酪氨酸羟基对DNA的磷酸二酯键进行亲核攻击。通常，酪氨酸家族的成员最初在DNA上产生缺口，然后DNA形成双链断裂。在包括phiC31(ΦC31)整合酶的丝氨酸重组酶家族中，保守丝氨酸残基形成与DNA靶位点的共价连接(Grindley等人，(2006)，Ann Rev Biochem(《生物化学年评》)，16：16)。对于整合酶家族的其他成员，参见例如Esposito等人，(1997)，Nucleic Acids Res(《核酸研究》)，25：3605-14，以及Abremski等人，(1992)，Protein Eng(《蛋白质工程》)，5：87-91。
其他重组系统包括例如链霉菌噬菌体phiC31(Kuhstoss等人，(1991)，J Mol Biol(《分子生物学杂志》)，20：897-908)；来自芝田硫化叶菌(Sulfolobus shibatae)的SSV1位点特异性重组系统(Maskhelishvili等人，(1993)，(《分子与普通遗传学》)，237：334-42)；以及基于反转录病毒整合酶的整合系统(Tanaka等人，(1998)，Gene(《基因》)，17：67-76)。
有时，重组酶是不需要辅因子或者超螺旋底物的重组酶，包括但不限于Cre、FLP以及它们的活性衍生物、变体或者片段。FLP重组酶催化DNA复制过程中的位点特异性反应和酿酒酵母(S.cerevisiae)的两微米质粒的扩增。FLP重组酶催化两个FRT位点之间的位点特异性重组。FLP蛋白已被克隆和表达(Cox，(1993)，Proc.Natl.Acad. Sci.USA(《美国国家科学院院刊》)，80：4223-7)。FLP的功能衍生物、变体和片段是已知的(Buchholz等人，(1998)，Nat Biotechnol(《自然生物技术》)，16：617-8；Hartung等人，(1998)，J Biol Chem(《生物化学杂志》)，273：22884-91；Saxena等人，(1997)，Biochim Biophys Acta(《生物化学与生物物理学学报》)，1340：187-204；以及Hartley等人，(1980)，Nature(《自然》)，286：860-4)。
噬菌体重组酶Cre催化两个lox位点之间的位点特异性重组(Guo等人，(1997)，Nature(《自然》)，389：40-6；Abremski等人，(1984)，JBiol Chem(《生物化学杂志》)，259：1509-14；Chen等人，(1996)，SomatCell Mol Genet(《体细胞和分子遗传学》)，22：477-88；Shaikh等人，(1977)，J Biol Chem(《生物化学杂志》)，272：5695-702；以及Buchholz等人，(1998)，Nat Biotechnol(《自然生物技术》)，16：617-8)。可用来在识别序列处产生双链断裂的位点特异性重组酶的例子包括例如FLP、Cre、SSV1、lambda Int、phi C31、HK022和R。用于植物的位点特异性重组系统的例子可见于第5,929,301号美国专利；第6,175,056号美国专利；WO99／25821；第6,331,661号美国专利；WO99／25855；WO99／25841和WO99／25840，每个专利的内容都以引用方式并入本文。
用于修饰动力学性质、辅因子相互作用和要求、表达、最佳条件和／或识别位点特异性以及筛选重组酶和变体的活性的方法是已知的，参见例如Miller等人，(1980)，Cell(《细胞》)，20：721-9；Lange-Gustafson和Nash，(1984)，J Biol Chem(《生物化学杂志》)，259：12724-32；Christ等人，(1998)，J Mol Biol(《分子生物学杂志》)，288：825-36；Lorbach等人，(2000)，J MolBiol(《分子生物学杂志》)，296：1175-81；Vergunst等人，(2000)，Science(《科学》)，290：979-82；Dorgai等人，(1995)，JMol Biol(《分子生物学杂志》)，252：178-88；Dorgai等人，(1998)，J MolBiol(《分子生物学杂志》)，277：1059-70；Yagu等人，(1995)，J Mol Biol(《分子生物学杂志》)，252：163-7；Sclimente等人，(2001)，NucleicAcids Res(《核酸研究》)，29：5044-51；Santoro和Schultze，(2002)，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(《美国国家科学院院刊》)，99：4185-90；Buchholz和Stewart，(2001)，Nat Biotechnol(《自然生物技术》)，19：1047-52；Voziyanov等人，(2002)，Nucleic Acids Res(《核酸研究》)，30：1656-63；Voziyanov等人，(2003)，JMolBiol(《分子生物学杂志》)，326：65-76；Klippel等人，(1988)，EMBO J(《欧洲分子生物学组织杂志》)，7：3983-9；Arnold等人，(1999)，EMBO J(《欧洲分子生物学组织杂志》)，18：1407-14；WO03／08045；WO99／25840；和WO99／25841。识别位点从约30个核苷酸微小位点到几百个核苷酸不等。
可使用重组酶的任何识别位点，包括自然发生的位点以及变体。变体识别位点是已知的，参见例如Hoess等人，(1986)，Nucleic Acids Res(《核酸研究》)，14：2287-300；Albert等人，(1995)，Plant J(《植物杂志》)，7：649-59；Thomson等人，(2003)，Genesis，36：162-7；Huang等人，(1991)，Nucleic Acids Res(《核酸研究》)，19：443-8；Siebler和Bode，(1997)，Biochemistry(《生物化学》)，36：1740-7；Schlake和Bode，(1994)，Biochemistry(《生物化学》)，33：12746-51；Thygarajan等人，(2001)，Mol Cell Biol(《分子和细胞生物学》)，21：3926-34；Umlauf和Cox，(1988)，EMBO J(《欧洲分子生物学组织杂志》)，7：1845-52；Lee和Saito，(1998)，Gene(《基因》)，216：55-65；WO01／23545；WO99／25821；WO99／25851；WO01／11058；WO01／07572和第5,888,732号美国专利。
重组酶可通过编码重组酶的多核苷酸提供，或者它可通过编码重组酶的经修饰的多核苷酸提供。例如，(编码内切核酸酶的)多核苷酸可进行修饰以置换上与自然发生的多核苷酸序列相比在植物中具有更高使用频率的密码子，或者它可进行修饰以置换上与自然发生的多核苷酸序列相比在玉蜀黍或者大豆植物中具有更高使用频率的密码子。
TAL效应物核酸酶是新一类序列特异性核酸酶，可用来在植物或者其他生物体的基因组中的特定靶序列处产生双链断裂。TAL效应物核酸酶是通过将天然或者经工程改造的转录激活因子样(TAL)效应物或其功能部分与内切核酸酶的催化结构域(例如FokI)融合来产生。独特的模块式TAL效应物DNA结合结构域使得可以设计具有潜在地任何给定的DNA识别特异性的蛋白质。因此，TAL效应物核酸酶的DNA结合结构域可进行工程改造以识别特定的DNA靶位点，并因此可用来在所需的靶序列处产生双链断裂。参见WO2010／079430；Morbitzer等人，(2010)PNAS10.1073／pnas.1013133107；Schoize & Boch(2010)Virulence1：428-432；Christian等人，Genetics(《遗传学》)，(2010)，186：757-761；Li等人，(2010)，Nuc.Acids Res.(《核酸研究》)，(2010)，doi：10.1093／nar／gkq704；以及Miller等人，(2011)，Nature Biotechnology(《自然生物技术》)，29：143-148；所有这些文献和专利均以引用方式并入本文。
转座酶是介导转座子从基因组中的一个位置转座到另一个位置的多肽。转座酶通常诱导双链断裂以切除转座子，识别亚末端重复序列，并且将切除的转座子的末端连接在一起，在一些系统中在转座过程中还需要其他蛋白质来将末端连接在一起。
转座子和转座酶的例子包括但不限于：来自玉蜀黍的Ac／Ds、Dt／rdt、Mu-Ml／Mn和Spm(En)／dSpm元件，来自金鱼草的Tarn元件，来自噬菌体的Mu转座子，细菌转座子(Tn)和插入序列(IS)，酵母的Ty元件(反转录转座子)，来自拟南芥的Tal元件(反转录转座子)，来自果蝇的P元件转座子(Gloor等人，(1991)，Science(《科学》)，253：1110-1117)，来自果蝇的Copia、Mariner和Minos元件，来自家蝇的Hermes元件，来自粉纹夜蛾(Trichplusia ni)的PiggyBack元件，来自线虫(C.elegans)的Tcl元件，以及来自小鼠的IAP元件(反转录转座子)。在一些实例中，转座酶通过编码转座酶的多核苷酸提供。
有可能通过置换上与自然发生的多核苷酸序列相比在植物中具有更高使用频率的密码子，或者通过置换上与自然发生的多核苷酸序列相比在玉蜀黍或者大豆植物中具有更高使用频率的密码子，来修饰编码转座酶的多核苷酸。
DNA拓扑异构酶调节DNA二级和更高级结构和主要与复制、转录、重组和修复相关的功能。各种拓扑异构酶共享两种特征：(i)能够在两个相续的酯交换反应中切割和再封接DNA的磷酸二酯主链；以及(ii)一旦形成拓扑异构酶切割的DNA中间体，该酶能使切断的DNA末端分开，让另一单链或者双链DNA区段通过。DNA拓扑异构酶可被分类为三个进化上独立的家族：IA型、IB型和II型。
那些切割DNA的一条链并容许环状DNA的连接数出现单步骤变化的DNA拓扑异构酶，定义为I型DNA拓扑异构酶。大肠杆菌(Escherichia coli)拓扑异构酶I和拓扑异构酶III、酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)拓扑异构酶III和逆促旋酶属于IA型或者I-5′型亚家族，因为蛋白质连接到DNA的5′磷酸。IB型或者I-3′型酶的原型存在于所有的真核生物，也存在于痘苗病毒拓扑异构酶I，其中蛋白质连接到3′磷酸。尽管细菌的酶和真核生物的酶之间在机制和特异性上有差异，但酵母DNA拓扑异构酶I可补充细菌DNA拓扑异构酶I突变体(Bjornsti等人，(1987)，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(《美国国家科学院院刊》)，84：8971-5)。IA型拓扑异构酶能松开负超螺旋DNA并需要镁和DNA的单链区。拓扑异构酶IB能以同等的效率松开正和负超螺旋DNA，不需要DNA的单链区或者金属离子来发挥功能。
II型家族包括大肠杆菌DNA促旋酶、大肠杆菌拓扑异构酶IV(par E)、真核生物II型拓扑异构酶和古细菌(archaic)拓扑异构酶VI。II型酶是同型二聚的(真核生物拓扑异构酶II)或者四聚的(促旋酶)，能切割双链体的两条链。对于可供利用的拓扑异构酶，优选的切割位点是已知的。
锌指核酸酶(ZFN)是工程改造的双链断裂诱导剂，由锌指DNA结合结构域和双链断裂诱导剂结构域构成。识别位点特异性由锌指结构域赋予，锌指结构域通常包含两个、三个或者四个例如具有C2H2结构的锌指，但是其他锌指结构也是已知的并被工程构建。锌指结构域易于设计特异性结合选定的多核苷酸识别序列的多肽。ZFN由工程改造的DNA结合锌指结构域与非特异性内切核酸酶结构域连接组成，所述非特异性内切核酸酶结构域例如来自Type Ms内切核酸酶(如FokI)的核酸酶结构域。可将另外的功能性融合到锌指结合结构域，包括转录激活因子结构域、转录阻遏蛋白结构域和甲基化酶。在一些实例中，核酸酶结构域的二聚化为切割活性所需。每个锌指能识别靶DNA中的三个连续碱基对。例如，一个3锌指结构域识别9个毗连核苷酸的序列，由于该核酸酶要求二聚化，使用两组锌指三联体来结合一条18个核苷酸的识别序列。一条18个核苷酸的识别序列足够长而在哺乳动物基因组中独特(418=6.9×1010)。
到目前为止，设计的锌指模块主要识别GNN和ANN三联体(Dreier等人，(2001)，J Biol Chem(《生物化学杂志》)，276：29466-78；Dreier等人，(2000)，J Mol Biol(《生物化学杂志》)，303：489-502；Liu等人，(2002)，J Biol Chem(《生物化学杂志》)，277：3850-6)，但使用CNN或者TNN三联体也是已知的(Dreier等人，(2005)，J Biol Chem(《生物化学杂志》)，280：35588-97；Jamieson等人，(2003)，Nature Rev Drug Discov(《自然评论：药物发现》)，2：361-8)。另参见Durai等人，(2005)，Nucleic Acids Res(《核酸研究》)，33：5978-90；Segal，(2002)，Methods(《方法》)，26：76-83；Porteus和Carroll，(2005)，Nat Biotechnol(《自然生物技术》)，23：967-73；锌指协会(网站www.zincfinger.org)；Pabo等人，(2001)，Ann Rev Biochem(《生物化学年评》)，70：313-40；Wolfe等人，(2000)，Ann Rev Biophys Biomol Struct(《生物物理和生物分子结构年评》)，29：183-212；Segal和Barbas，(2001)，Curr Opin Biotechnol(《生物技术新见》)，12：632-7；Segal等人，(2003)，Biochemistry(《生物化学》)，42：2137-48；Beerli和Barbas，(2002)，Nat Biotechnol(《自然生物技术》)，20：135-41；Carroll等人，(2006)，Nature Protocols(《自然实验手册》)，1：1329；Ordiz等人，(2002)，Proc.Natl.Acad. Sci.USA(《美国国家科学院院刊》)，99：13290-5；Guan等人，(2002)，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(《美国国家科学院院刊》)，99：13296-301；WO2002099084；WO00／42219；WO02／42459；WO2003062455；公布号为20030059767的美国专利申请；公布号为2003／0108880的美国专利申请；第6,140,466号、第6,511,808号和第6,453,242号美国专利。
作为另一种选择，可将工程改造的锌指DNA结合域与其他保持DNA切口产生／切割活性的双链断裂诱导剂或其衍生物融合。例如，这个类型的融合可用来将双链断裂诱导剂导向不同的靶位点，用来改变缺口或者切割位点的位置，用来将诱导剂导向更短的靶位点，或者用来将诱导剂导向更长的靶位点。在一些实例中，将锌指DNA结合域与保持DNA切口产生／切割活性的位点特异性重组酶、转座酶、拓扑异构酶或者它们的衍生物融合。
有可能通过编码锌指核酸酶的多核苷酸提供锌指核酸酶。这个编码锌指核酸酶的多核苷酸可通过置换上与自然发生的多核苷酸序列相比在植物中具有更高使用频率的密码子，或者通过置换上与自然发生的多核苷酸序列相比在玉蜀黍或者大豆植物中具有更高使用频率的密码子来进行修饰。
充分的同源性或者序列同一性表明两个多核苷酸序列具有充分的结构相似性以充当同源重组反应的底物。结构相似性包括每个多核苷酸片段的总体长度，以及多核苷酸的序列相似性。序列相似性可通过序列的总长度上的序列同一性百分数，和／或通过包含局部化相似性的保守区域(如具有100％序列同一性的毗连核苷酸)以及序列长度的一部分上的序列同一性百分数来描述。
靶标和供体多核苷酸共享的同源性或者序列同一性的量可变，包括总长度和／或具有在以下范围内的单位整数值的区域：约1-20bp、20-50bp、50-100bp、75-150bp、100-250bp、150-300bp、200-400bp、250-500bp、300-600bp、350-750bp、400-800bp、450-900bp、500-1000bp、600-1250bp、700-1500bp、800-1750bp、900-2000bp、1-2.5kb、1.5-3kb、2-4kb、2.5-5kb、3-6kb、3.5-7kb、4-8kb、5-10kb、或者直到并包括该靶位点的总长度。这些范围包括该范围内的每个整数，例如1-20bp的范围包括1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19和20bp。同源性的量也可通过两个多核苷酸的完全比对长度上的序列同一性百分数来描述，所述序列同一性百分数包括约至少50％、55％、60％、65％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或者100％的序列同一性百分数。充分的同源性包括多核苷酸长度、全局序列同一性百分数和毗连核苷酸的任选保守区域或者局部序列同一性百分数的任何组合，例如充分的同源性可描述为75-150bp的与靶基因座区域具有至少80％序列同一性的区域。充分的同源性也可通过所预测的两个多核苷酸在高严格条件下特异性杂交的能力来描述，参见例如Sambrook等人，(1989)，Molecular Cloning：A LaboratoryManual(《分子克隆实验指南》)，(冷泉港实验室出版社，纽约)；Current Protocols in Molecular Biology(《分子生物学实验手册》)，Ausubel等人编辑，(1994)，Current Protocols，(Greene Publishing Associates，Inc.和John Wiley & Sons，Inc)；以及Tijssen，(1993)，LaboratoryTechniques in Biochemistry and Molecular Biology-Hybridization with NucleicAcid Probes(《生物化学和分子生物学实验室技术——核酸探针杂交》，(Elsevier，纽约)。
可采用任何手段将改变双子叶植物细胞的基因组所需的各种组分连接在一起。例如，在体外系统中，可通过使各组分在适于DNA切割的条件下接触来提供双链断裂诱导剂和包含识别位点的多核苷酸。
作为另一种选择，已知有多种方法可用来将核苷酸序列和多肽引入到生物体中，包括例如转化、有性杂交在内，以及将多肽、DNA或者mRNA引入细胞中。
用于接触、提供和／或引入组合物到各种生物体中的方法是已知的，包括但不限于稳定转化方法、瞬时转化方法、病毒介导的方法和有性育种。稳定转化表示所引入的多核苷酸整合到生物体的基因组中并能够被其子代遗传。瞬时转化表示所引入的组合物仅仅在生物体中暂时表达或者存在。
用于将多核苷酸或者多肽引入得到植物中的方案可根据作为转化目标的植物或者植物细胞的类型(如单子叶植物或者双子叶植物)而异。将多核苷酸和多肽引入到植物细胞中并随后插入到植物基因组中的合适方法包括显微注射(Crossway等人，(1986)，Biotechniques(《生物技术》)，4：320-34，以及第6,300,543号美国专利)、分生组织转化(第5,736,369号美国专利)、电穿孔(Riggs等人，(1986)，Proc.Natl.Acad. Sci.USA(《美国国家科学院院刊》)，83：5602-6)、农杆菌介导的转化(第5,563,055号和第5,981,840号美国专利)、直接基因转移(Paszkowski等人，(1984)，EMBOJ(《欧洲分子生物学组织杂志》)，3：2717-22)，以及弹道粒子加速(第4,945,050号；第5,879,918号；第5,886,244号；第5,932,782号美国专利；Tomes等人，(1995)，“Direct DNA Transfer into Intact Plant Cells viaMicroprojectile Bombardment”(“通过微粒轰击向完整植物细胞中直接转移DNA”)，载于Plant Cell，Tissue，and Organ Culture：FundamentalMethods(《植物细胞、组织和器官培养：基本方法》)，Gamborg &Phillips编辑(Springer-Verlag，柏林)；McCabe等人，(1988)，Biotechnology(《生物技术》)，6：923-6；Weissinger等人，(1988)，AnnRev Genet(《遗传学年评》)，22：421-77；Sanford等人，(1987)，Particulate Science and Technology(《颗粒科学和技术》)，5：27-37(洋葱)；Christou等人，(1988)，Plant Physiol(《植物生理学》)，87：671-4(大豆)；Finer和McMullen，(1991)，In Vitro Cell Dev Biol(《体外细胞发育生物学》)，27P：175-82(大豆)；Singh等人，(1998)，Theor ApplGenet(《理论和应用遗传学》)，96：319-24(大豆)；Datta等人，(1990)，Biotechnology(《生物技术》)，8：736-40(水稻)；Klein等人，(1988)，Proc.Natl.Acad. Sci.USA(《美国国家科学院院刊》)，85：4305-9(玉蜀黍)；Klein等人，(1988)，Biotechnology(《生物技术》)，6：559-63(玉蜀黍)；第5,240,855号、第5,322,783号和第5,324,646号美国专利；Klein等人，(1988)，Plant Physiol(《植物生理学》)，91：440-4(玉蜀黍)；Fromm等人，(1990)，Biotechnology，8：833-9(玉蜀黍)；Hooykaas-Van Slogteren等人，(1984)，Nature(《自然》)，311：763-4；第5,736,369号美国专利(谷类)；Bytebier等人，(1987)，Proc.Natl.Acad. Sci.USA，84：5345-9(百合科)；De Wet等人，(1985)，The Experimental Manipulationof Ovule Tissues(《胚珠组织的实验操作》)，Chapman等人编辑(Longman，纽约)，第197-209页(花粉)；Kaeppler等人，(1990)，Plant Cell Rep(《植物细胞报道》)，9：415-8)以及Kaeppler等人，(1992)，Theor Appl Genet(《理论和应用遗传学》)，84：560-6(晶须介导的转化)；D′Halluin等人，(1992)，Plant Cell(《植物细胞》)，4：1495-505(电穿孔)；Li等人，(1993)，Plant Cell Rep(《植物细胞报道》)，12：250-5；Christou和Ford(1995)，Annals Botany(《植物性年鉴》)，75：407-13(水稻)，以及Osjoda等人，(1996)，Nat Biotechnol(《自然生物技术》)，14：745-50(玉蜀黍，通过根瘤农杆菌(Agrobacteriumtumefaciens))。
作为另一种选择，可通过使植物与病毒或者病毒核酸接触来将多核苷酸引入到植物中。一般地讲，这种方法涉及将多核苷酸掺入在病毒DNA或者RNA分子内。在一些实例中，可最初将目的多肽作为病毒聚蛋白的一部分合成，后者然后在体内或者体外通过蛋白水解加工而产生所需的重组蛋白。涉及病毒DNA或者RNA分子的、用于将多核苷酸引入到植物中并表达其中所编码的蛋白质的方法是已知的，参见例如第5,889,191号、第5,889,190号、第5,866,785号、第5,589,367号和第5,316,931号美国专利。瞬时转化方法包括但不限于直接引入多肽如双链断裂诱导剂到生物体中、引入多核苷酸如DNA和／或RNA多核苷酸、引入RNA转录物如编码双链断裂诱导剂的mRNA到生物体中。这类方法包括例如微注射或粒子轰击。参见例如Crossway等人，(1986)，Mol Gen Genet(《分子与普通遗传学》)，202：179-85；Nomura等人，(1986)，Plant Sci(《植物科学》)，44：53-8；Hepler等人，(1994)，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(《美国国家科学院院刊》)，91：2176-80；以及Hush等人，(1994)，J Cell Sci(《细胞科学杂志》)，107：775-84。
标准的DNA分离、纯化、分子克隆、载体构建和验证／表征方法是确立的，参见例如Sambrook等人，(1989)，Molecular Cloning：A LaboratoryManual(《分子克隆实验指南》)，(冷泉港实验室出版社，纽约)。载体和构建体包括包含目的多核苷酸和任选其他组分的环状质粒和线状多核苷酸，所述其他组分包括接头、衔接子、调节区、内含子、限制位点、增强子、隔离子、选择性标记、目的核苷酸序列、启动子和／或其他有助于载体构建或者分析的位点。在一些实例中，识别位点和／或靶位点可包含在内含子、编码序列、5′UTR、3′UTR和／或调节区内。
本发明还提供表达构建体，所述表达构建体用于在植物、植物细胞或者植物部分中表达能够结合靶位点并在靶位点中产生双链断裂的内切核酸酶。本发明的表达构建体包含与编码本发明的内切核酸酶的核苷酸序列可操作连接的启动子。该启动子能够驱动有效连接的核苷酸序列在植物细胞中的表达。本文中公开或者本领域中知道的任何这种启动子都可在本发明中使用。在一个实施例中，内切核酸酶的靶位点选自大豆的TS21、TS14、TS30、TS5、TS7、TS4、TS22和TS24靶位点，它们的核苷酸序列分别如SEQ ID NO：1、2、3、4、5、6、7和8所示。在另一个实施例中，内切核酸酶的靶位点选自玉蜀黍的MHP1、MHP14、MHP32、MHP42、MHP55、MHP67、MHP77、MHP98、MHP107和MHP115靶位点，它们的核苷酸序列分别如SEQ ID NO：68、69、70、71、72、73、74、75、76和77所示。
在某些实施例中，表达构建体包含编码已定制或者工程改造成在上述大豆靶位点之一切割的内切核酸酶的核苷酸序列。这种核苷酸序列包括例如SEQ ID NO：9、10、11、12、13、14、15和16所示的核苷酸序列。本发明的其他核苷酸序列包括但不限于包含内切核酸酶的DNA结合域的编码序列的核苷酸序列，其中该编码序列是SEQ ID NO：9、10、11、12、13、14、15或者16的核苷酸100-261和核苷酸850-1011及其简并编码序列。这种简并编码序列编码与SEQ ID NO：9、10、11、12、13、14、15或者16的核苷酸100-261和核苷酸850-1011所示编码序列之一所编码的氨基酸序列相同的氨基酸序列，但由于遗传密码的简并性而在其核苷酸序列上不同。
在某些其他实施例中，表达构建体包含编码已定制或者工程改造成在上述玉蜀黍靶位点之一切割的内切核酸酶的核苷酸序列。这种核苷酸序列包括例如SEQ ID NO：78、79、80、81、82和83所示的核苷酸序列。本发明的其他核苷酸序列包括但不限于包含内切核酸酶的DNA结合域的编码序列的核苷酸序列，其中该编码序列是SEQ ID NO：80的核苷酸100-261和核苷酸850-1011及其简并编码序列。这种简并编码序列编码与SEQ ID NO：80的核苷酸100-261和核苷酸850-1011所示编码序列之一所编码的氨基酸序列相同的氨基酸序列，但由于遗传密码的简并性而在其核苷酸序列上不同。本发明的其他核苷酸序列包括但不限于包含内切核酸酶的DNA结合域的编码序列的核苷酸序列，其中该编码序列是SEQ ID NO：78、79、81、82或者83的核苷酸100-261和核苷酸661-822及其简并编码序列。这种简并编码序列编码与SEQ ID NO：78、79、81、82或者83的核苷酸100-261和核苷酸661-822所示编码序列之一所编码的氨基酸序列相同的氨基酸序列，但由于遗传密码的简并性而在其核苷酸序列上不同。
任何启动子都可使用，并且可根据所需的结果来选择。启动子是参与RNA聚合酶和其他蛋白质的识别和结合以起始转录的DNA区域。植物启动子是能够在植物细胞中起始转录的启动子，有关植物启动子的综述参见Potenza等人，(2004)，In Vitro Cell Dev Biol(《体外细胞发育生物学》)，40：1-22。组成型启动子包括例如WO99／43838和第6,072,050号美国专利中公开的Rsyn7启动子的核心启动子以及其他组成型启动子；核心CaMV35S启动子(Odell等人，(1985)，Nature(《自然》)，313：810-2)；水稻肌动蛋白(McElroy等人，(1990)，Plant Cell(《植物细胞》)，2：163-71)；遍在蛋白(Christensen等人，(1989)，Plant Mol Biol(《植物分子生物学》)，12：619-32；Christensen等人，(1992)，Plant Mol Biol(《植物分子生物学》)，18：675-89)；pEMU(Last等人，(1991)，TheorAppl Genet(《理论和应用遗传学》)，81：581-8)；MAS(Velten等人，(1984)，EMBO J(《欧洲分子生物学组织杂志》)，3：2723-30)；ALS启动子(第5,659,026号美国专利)等。其他的组成型启动子在例如以下各号美国专利中描述：5,608,149；5,608,144；5,604,121；5,569,597；5,466,785；5,399,680；5,268,463；5,608,142和6,177,611。在一些实例中，可使用诱导型启动子。病原体感染后被诱导的病原体诱导型启动子包括但不限于那些调节PR蛋白、SAR蛋白、β-1，3-葡聚糖酶、几丁质酶等的表达的启动子
可将化学调节启动子用于通过施加外源化学调节剂来调控基因在植物中的表达。该启动子可以是化学诱导启动子，其中化学剂的施加可诱导基因表达，或者是化学阻遏启动子，其中化学剂的施加可阻遏基因表达。化学诱导启动子包括但不限于玉蜀黍ln2-2启动子，其由苯磺酰胺除草剂安全剂激活(De Veylder等人，(1997)，Plant Cell Physiol(《植物细胞生理学》)，38：568-77)；玉蜀黍GST启动子(GST-ll-27，WO93／01294)，其由用作萌前除草剂的疏水亲电子化合物激活；以及烟草PR-1a启动子(Ono等人，(2004)，Biosci Biotechnol Biochem(《生物科学、生物技术与生物化学》)，68：803-7)，其由水杨酸激活。其他化学调节启动子包括类固醇响应性启动子(参见例如糖皮质类固醇诱导型启动子(Schena等人，(1991)，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(《美国国家科学院院刊》)，88：10421-5；McNellis等人，(1998)，Plant J(《植物杂志》)，14：247-257)；四环素诱导型和四环素阻遏型启动子(Gatz等人，(1991)，Mol Gen Genet(《分子与普通遗传学》)，227：229-37；第5,814,618号和第5,789,156号美国专利)。
组织偏好的启动子可用来使增强的表达定向于特定植物组织内。组织偏好的启动子包括例如Kawamata等人，(1997)，Plant Cell Physiol(《植物细胞生理学》)，38：792-803；Hansen等人，(1997)，Mol Gen Genet(《分子与普通遗传学》)，254：337-43；Russell等人，(1997)，Transgenic Res(《转基因研究》)，6：157-68；Rinehart等人，(1996)，Plant Physiol(《植物生理学》)，112：1331-41；Van Camp等人，(1996)，Plant Physiol(《植物生理学》)，112：525-35；Canevascini等人，(1996)，Plant Physiol(《植物生理学》)，112：513-524；Lam，(1994)，Results Probl Cell Differ(《细胞分化的结果和问题》)，20：181-96；以及Guevara-Garcia等人，(1993)，Plant J(《植物杂志》)，4：495-505。叶偏好的启动子包括例如Yamamoto等人，(1997)，Plant J(《植物杂志》)，12：255-65；Kwon等人，(1994)，Plant Physiol(《植物生理学》)，05：357-67；Yamamoto等人，(1994)Plant Cell Physiol(《植物细胞生理学》)，35：773-8；Gotor等人，(1993)，Plant J(《植物杂志》)，3：509-18；Orozco等人，(1993)，Plant MolBiol(《植物分子生物学》)，23：1129-38；Matsuoka等人，(1993)，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(《美国国家科学院院刊》)，90：9586-90；Simpson等人，(1958)，EMBO J(《欧洲分子生物学组织杂志》)，4：2723-9；Timko等人，(1988)，Nature(《自然》)，318：57-8。根偏好的启动子包括例如Hire等人，(1992)，Plant Mol Biol(《植物分子生物学》)，20：207-18(大豆根特异性谷氨酰胺合酶基因)；Miao等人，(1991)，Plant Cell(《植物细胞》)，3：11-22(胞质谷氨酰胺合酶(GS))；Keller和Baumgartner，(1991)，Plant Cell(《植物细胞》)，3：1051-61(法国菜豆的GRP1.8基因的根特异性控制元件)；Sanger等人，(1990)，Plant Mol Biol(《植物分子生物学》)，14：433-43(根瘤农杆菌(A tumefaciens)甘露氨酸合酶(MAS))的根特异性启动子)；Bogusz等人，(1990)，Plant Cell(《植物细胞》)，2：633-41(从糙叶山黄麻(Parasponia andersonii)和山黄麻(Trema tomentosa)分离的根特异性启动子)；Leach和Aoyagi，(1991)，Plant Sci(《植物科学》)，79：69-76(发根农杆菌(A rhizogenes)rolC和rolD根诱导基因)；Teeri等人，(1989)，EMBO J(《欧洲分子生物学组织杂志》)，8：343-50(农杆菌损伤诱导的TR1′和TR2′基因)；VfENOD-GRP3基因启动子(Kuster等人，(1995)，Plant Mol Biol(《植物分子生物学》)，29：759-72)；以及rolB启动子(Capana等人，(1994)，Plant Mol Biol(《植物分子生物学》)，25：681-91；菜豆蛋白基因(Murai等人，(1983)，Science(《科学》)，23：476-82；Sengopta-Gopalen等人，(1988)，Proc.Natl.Acad. Sci.USA(《美国国家科学院院刊》)，82：3320-4)。另参见以下各号美国专利：5,837,876；5,750,386；5,633,363；5,459,252；5,401,836；5,110,732和5,023,179。
种子偏好的启动子包括种子发育过程中活跃的种子特异性启动子和在种子萌发过程中活跃的种子萌发启动子。参见Thompson等人，(1989)，BioEssays(《生物学论文集》)，10：108。种子偏好的启动子包括但不限于Cim1(细胞分裂素诱导的信息)；cZ19B1(玉蜀黍19kDa玉米蛋白)；和milps(肌醇-1-磷酸合酶)；(WO00／11177；和第6,225,529号美国专利)。对于双子叶植物，种子偏好的启动子包括但不限于豆类β-菜豆蛋白、油菜籽蛋白、β-伴球蛋白、大豆凝集素、十字花科蛋白(cruciferin)等。对于单子叶植物，种子偏好的启动子包括但不限于玉蜀黍15kDa玉米醇溶蛋白、22kDa玉米醇溶蛋白、27kDaγ玉米醇溶蛋白、waxy、shrunken1、shrunken2、球蛋白1、油质蛋白和nud。另参见，WO00／12733，其中公开了来自END1和END2基因的种子偏好的启动子。
表型标记是可筛选或者可选择的标记，其包括可视标记和选择性标记，无论它是阳性还是阴性选择性标记。可使用任何表型标记。具体地讲，可选择或者可筛选的标记包含这样的DNA区段，该DNA区段使得可以常常在特定条件下鉴定或者选取或者不选取含有它的分子或者细胞。这些标记可编码活性，如但不限于RNA、肽或者蛋白质的产生，或者可为RNA、肽、蛋白质、无机和有机化合物或者组合物等提供结合位点。
选择性标记的例子包括但不限于：包含限制酶位点的DNA区段；编码能提供对本来有毒化合物的抗性的产物的DNA区段，所述有毒化合物包括抗生素如壮观霉素、氨苄青霉素、卡那霉素、四环素、Basta、新霉素磷酸转移酶II(NEO)和潮霉素磷酸转移酶(HPT))；编码本来在受体细胞中缺乏的产物的DNA区段(例如tRNA基因、营养缺陷型标记)；编码可容易鉴定的产物的DNA区段(例如表型标记如β-半乳糖苷酶、GUS；荧光蛋白如绿色荧光蛋白(GFP)、青色荧光蛋白(CFP)、黄色荧光蛋白(YFP)、红色荧光蛋白(RFP)，以及细胞表面蛋白)；PCR新引物位点的产生(例如两个之前不并列的DNA序列的并列)、限制性内切核酸酶或者其他DNA修饰酶、化学剂等不作用或者作用的DNA序列的加入；以及使其得以鉴定的特定修饰(例如甲基化)所需的DNA序列的加入。
另外的选择性标记包括能赋予对除草化合物如草铵膦、溴苯腈、咪唑啉酮和2,4-二氯苯氧乙酸(2，4-D)的抗性的基因。参见例如Yarranton，(1992)，Curr Opin Biotechnol(《生物技术新见》)，3：506-11；Christopherson等人，(1992)，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(《美国国家科学院院刊》)，89：6314-8；Yao等人，(1992)，Cell(《细胞》)，71：63-72；Reznikoff，(1992)，Mol Microbiol(《分子微生物学》)，6：2419-22；Hu等人，(1987)，Cell(《细胞》)，48：555-66；Brown等人，(1987)，Cell(《细胞》)，49：603-12；Figge等人，(1988)，Cell(《细胞》)，52：713-22；Deuschle等人，(1989)，Proc.Natl.Acad. Sci.USA(《美国国家科学院院刊》)，86：5400-4；Fuerst等人，(1989)，Proc.Natl.Acad. Sci.USA(《美国国家科学院院刊》)，86：2549-53；Deuschle等人，(1990)，Science(《科学》)，248：480-3；Gossen，(1993)，海德堡大学博士论文；Reines等人，(1993)，Proc.Natl.Acad. Sci.USA(《美国国家科学院院刊》)，90：1917-21；Labow等人，(1990)，Mol Cell Biol(《分子细胞生物学》)，10：3343-56；Zambretti等人，(1992)，Proc.Natl.Acad. Sci.USA(《美国国家科学院院刊》)，89：3952-6；Bairn等人，(1991)，Proc.Natl.Acad. Sci.USA(《美国国家科学院院刊》)，88：5072-6；Wyborski等人，(1991)，Nucleic Acids Res(《核酸研究》)，19：4647-53；Hillen和Wissman，(1989)，Topics Mol Struc Biol(《分子结构生物学专题》)，10：143-62；Degenkolb等人，(1991)，Antimicrob Agents Chemother(《抗微生物剂和化学疗法》)，35：1591-5；Kleinschnidt等人，(1988)，Biochemistry(《生物化学》)，27：1094-104；Bonin，(1993)，海德堡大学博士论文；Gossen等人，(1992)，Proc.Natl.Acad. Sci.USA(《美国国家科学院院刊》)，89：5547-51；Oliva等人，(1992)，Antimicrob AgentsChemother(《抗微生物剂和化学疗法》)，36：913-9；Hlavka等人，(1985)，Handbook of Experimental Pharmacology(《实验药理学手册》)，第78卷(Springer-Verlag，柏林)；Gill等人，(1988)，Nature(《自然》)，334：721-4。
可采用常规条件将具有所引入的序列的细胞生长或者再生成植物，参见例如McCormick等人，(1986)，Plant Cell(《植物细胞》)，Rep5：81-4。然后可使这些植物生长，并用相同转化株或者用不同转化株或未转化株进行授粉，并鉴定出具有所需特性和／或包含所引入的多核苷酸或者多肽的所得子代。可生长两代或者更多代以确保多核苷酸得到稳定保持和遗传，并收获种子。
可使用任何植物，包括单子叶植物和双子叶植物。可使用的单子叶植物的例子包括但不限于玉米(Zea mays)、水稻(Oryza sativa)、黑麦(Secalecereale)、高粱(Sorghum bicolor、Sorghum vulgare)、小米(例如珍珠粟(Pennisetum glaucun)、黄米(Panicum miliaceum)、谷子(Setaria italica)、龙爪稷(Eleusine coracana))、小麦(Triticum aestivum)、甘蔗(Saccharum spp.)、燕麦(Avena)、大麦(Hordeum)、柳枝稷(Panicum virgatum)、菠萝(Ananascomosus)、香蕉(Musa spp.)、棕榈、观赏植物、草坪草和其他草类。可使用的双子叶植物的例子包括但不限于大豆(Glycine max)、卡诺拉油菜(Brassica napus和B.campestris)、苜蓿(Medicago sativa)、烟草(Nicotianatabacum)、拟南芥(Arabidopsis thaliana)、向日葵(Helianthus annuus)、棉花(Gossypium arboreum)和花生(Arachis hypogaea)、西红柿(Solanumlycopersicum)、马铃薯(Solanum tuberosum)等。
目的转基因、重组DNA分子、DNA序列以及目的多核苷酸可包含一个或者多个目的基因。这种目的基因可编码例如为植物提供农艺优势的蛋白质。目的基因，包括但不限于那些编码提供农艺优势的蛋白质的基因，可反映那些参与农作物开发的人们的商业市场和兴趣。目的作物和市场在变化，并且随着发展中国家面向世界市场，也将出现新的作物和技术。另外，随着我们对农学性状和特性如产量和杂种优势的理解的增加，对用于转化的基因的选择将会相应变化。目的基因的大体类别包括例如涉及信息的那些基因(如锌指)、涉及通信的那些基因(如激酶)和涉及看家的那些基因(如热休克蛋白)。转基因的更具体类别例如包括编码对农艺学、昆虫抗性、病害抗性、除草剂抗性、不育性、谷粒特征和商业产品重要的性状的基因。一般而言，目的基因包括涉及油脂、淀粉、碳水化合物或营养物质代谢的那些基因以及影响仁大小、蔗糖载量等的那些基因。
除了使用传统的育种方法之外，还可用遗传法对农艺上重要的性状如油含量、淀粉含量和蛋白质含量进行改变。修饰包括提高油酸、饱和油和不饱和油的含量，提高赖氨酸和硫的水平，提供必需氨基酸以及修饰淀粉。第5,703,049号、第5,885,801号、第5,885,802号和第5,990,389号美国专利中描述了Hordothionin蛋白修饰，将这些文献以引用的方式并入本文。另一个例子是第5,850,016号美国专利中所述的由大豆2S白蛋白编码的富含赖氨酸和／或富含硫的种子蛋白，以及Williamson等人，(1987)，Eur.J. Biochem.(《欧洲生物化学杂志》)，165：99-106所述的源自大麦的胰凝乳蛋白酶抑制剂，以上公开内容以引用的方式并入本文。
可通过定点诱变产生编码序列的衍生物来增加预选氨基酸在所编码的多肽中的水平。例如，编码大麦高赖氨酸多肽(BHL)的基因源自大麦抗胰凝乳蛋白酶抑制剂，系列号为08／740,682的美国申请(1996年11月1日提交)和WO98／20133，将它们的公开内容以引用方式并入本文。其他蛋白质包括富含甲硫氨酸的植物蛋白，如来自葵花籽(Lilley等人，(1989)，Proceedings of the World Congress on Vegetable Protein Utilization in HumanFoods and Animal Feedstuffs(植物蛋白在人类食品和动物饲料中的利用世界大会会议录)，Applewhite编辑(美国油类化学家学会(American OilChemists Society)，伊利诺伊州香巴尼市)，第497-502页；以引用方式并入本文)；玉米(Pedersen等人，(1986)，J. Biol.Chem.(《生物化学杂志》)，261：6279；Kirihara等人，(1988)，Genne(《基因》)，71：359；两个文献均以引用方式并入本文)；和水稻(Musumura等人，(1989)，PlantMol.Biol.(《植物分子生物学》)，12：123，以引用方式并入本文)。其他农艺上重要的基因编码胶乳、Floury2、生长因子、种子贮藏因子和转录因子。
昆虫抗性基因可以编码针对严重影响产量的害虫的抗性，所述害虫例如是根虫、切根虫、欧洲玉蜀黍螟等。这类基因包括(例如)苏云金杆菌(Bacillus thuringiensis)毒性蛋白基因(以下各号美国专利：5,366,892；5,747,450；5,736,514；5,723,756；5,593,881；以及Geiser等人，(1986)，Gene(《基因》)，48：109)；等。
编码抗病性状的基因包括解毒基因，如针对fumonosin的解毒基因(第5,792,931号美国专利)；无毒性(avr)和抗病(R)基因(Jones等人，(1994)，Science(《科学》)，266：789；Martin等人，(1993)，Science(《科学》)，262：1432；以及Mindrinos等人，(1994)，Cell(《细胞》)，78：1089)；等。
除草剂抗性性状可包括编码针对能抑制乙酰乳酸合酶(ALS)的作用的除草剂的抗性的基因，特别是磺酰脲型除草剂(例如含有导致这种抗性的突变的乙酰乳酸合酶(ALS)基因，所述突变特别是S4和／或Hra突变)，编码针对能抑制谷氨酰胺合酶的作用的除草剂的基因，如膦丝菌素或者basta(例如bar基因)；草甘膦(例如EPSPS基因和GAT基因；参见例如美国公开号20040082770和WO03／092360)；或者本领域知道的其他此类基因。bar基因编码针对除草剂basta的抗性，nptII基因编码针对抗生素卡那霉素和遗传霉素的抗性，ALS基因突变体编码针对除草剂氯磺隆的抗性。
不育基因也可编码在表达盒中，为物理去雄提供另选方案。以这种方式使用的基因的实例包括雄性组织偏好的基因和具有雄性不育表型的基因(如QM)，在第5,583,210号美国专利中有描述。其他基因包括激酶和编码对雄性或雌性配子体发育有毒的化合物的那些。
谷粒的质量反映在诸如以下的性状：饱和及不饱和油的含量和类型、必需氨基酸的质量和数量、纤维素的含量。在玉米(corn)中，经修饰的hordothionin蛋白在第5,703,049号、第5,885,801号、第5,885,802号和第5,990,389号美国专利中有描述。
还可在(一种或多种)基因上编码商业性状，所述基因可增加例如用于乙醇生产的淀粉，或提供蛋白质的表达。经转化的植物的另一个重要商业应用是生产聚合物和生物塑料，如第5,602,321号美国专利中描述。诸如β-酮基硫解酶、PHBase(聚羟基丁酸合酶)和乙酰乙酰基-CoA还原酶(参见Schubert等人，(1988)，J. Bacteriol.(《细菌学杂志》)，170：5837-5847)有利于聚羟基链烷酸酯(PHA)的表达。
外源产物包括植物酶和产物以及来自包括原核生物和其他真核生物在内的其他来源的那些。这类产物包括酶、辅因子、激素等等。可增加蛋白质，特别是具有改善的氨基酸分布以改善植物营养价值的修饰蛋白质的水平。这可通过表达具有提高的氨基酸含量的这类蛋白质来实现。
目的转基因、重组DNA分子、DNA序列以及目的多核苷酸可包含一个或者多个用于基因沉默的DNA序列。涉及在植物中表达DNA序列的基因沉默方法是本领域知道的，包括但不限于共抑制、反义抑制、双链RNA(dsRNA)干扰、发夹RNA(hpRNA)干扰、含内含子的发夹RNA(ihpRNA)干扰、转录基因沉默以及微RNA(miRNA)干扰。
共抑制可用来抑制植物基因的表达以产生对于由这些基因编码的蛋白质而言具有不可检测的蛋白质水平的植物。参见例如Broin等人，(2002)，Plant Cell(《植物细胞》)，14：1417-1432。共抑制还可用来抑制同一植物中的多种蛋白质的表达。参见例如第5,942,657号美国专利。使用共抑制来抑制植物中的内源基因的表达的方法在以下文献中有描述：Flavell等人，(1994)，Proc.Natl.Acad. Sci.USA(《美国国家科学院院刊》)，91：3490-3496；Jorgensen等人，(1996)，Plant Mol.Biol.(《植物分子生物学》)，31：957-973；Johansen和Carrington(2001)，Plant Physiol.(《植物生理学》)，126：930-938；Broin等人，(2002)，Plant Cell(《植物细胞》)，14：1417-1432；Stoutjesdijk等人，(2002)，Plant Physiol.(《植物生理学》)，129：1723-1731；Yu等人，(2003)，Phytochemistry(《植物化学》)，63：753-763；以及第5,034,323号、第5,283,184号和第5,942,657号美国专利；每个文献和专利以引用方式并入本文。共抑制的效率可通过在表达盒中在有义序列的3′和聚腺苷酸化信号的5′位置包括poly-dT区来提高。参见公开号为20020048814的美国专利，以引用方式并入本文。通常，这种核苷酸序列与内源基因的转录物的序列具有相当大的序列同一性，优选的是高于约65％的序列同一性，更优选的是高于约85％的序列同一性，最优选的是高于约95％的序列同一性。参见第5,283,184号和第5,034,323号美国专利；将这些专利以引用方式并入本文。
反义抑制还可用来抑制同一植物中的多种蛋白质的表达。参见例如第5,942,657号美国专利。此外，反义核苷酸的部分可用来破坏靶基因的表达。一般而言，可使用至少50个核苷酸、100个核苷酸、200个核苷酸、300个、400个、450个、500个、550个或者更多个的序列。使用反义抑制来抑制植物中的内源基因的表达的方法在例如以下文献和专利中描述：Liu等人，(2002)，Plant Physiol.(《植物生理学》)，129：1732-1743，以及第5,759,829号和第5,942,657号美国专利，将每个文献和专利以引用方式并入本文。反义抑制的效率可通过在表达盒中在反义序列的3′和聚腺苷酸化信号的5′位置处包括poly-dT区来提高。参见公开号为20020048814的美国专利，以引用方式并入本文。
使用dsRNA干扰来抑制内源植物基因的表达的方法在以下文献和专利中有描述：Waterhouse等人，(1998)，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(《美国国家科学院院刊》)，95：13959-13964；Liu等人，(2002)，Plant Physiol.(《植物生理学》)，129：1732-1743，以及WO99／49029、WO99／53050、WO99／61631和WO00／49035；每个文献和专利以引用方式并入本文。
hpRNA干扰的方法在Waterhouse和Helliwell，(2003)，Nat.Rev.Genet.(《遗传学自然评论》)，4：29-38及其中引用的参考文献中有描述。这些方法在抑制内源基因表达方面是高度有效的。参见例如Chuang和Meyerowitz(2000)，Proc.Natl.Acad. Sci.USA(《美国国家科学院院刊》)，97：4985-4990；Stoutjesdijk等人，(2002)，Plant Physiol.(《植物生理学》)，129：1723-1731；以及Waterhouse和Helliwell，(2003)，Nat.Rev.Genet.(《遗传学自然评论》)，4：29-38。使用hpRNA干扰来抑制或者沉默基因的表达的方法在例如以下文献和专利中描述：Chuang和Meyerowitz(2000)，Proc.Natl.Acad. Sci.USA(《美国国家科学院院刊》)，97：4985-4990；Stoutjesdijk等人，(2002)，Plant Physiol.(《植物生理学》)，129：1723-1731；Waterhouse和Helliwell，(2003)，Nat.Rev.Genet.(《遗传学自然评论》)，4：29-38；Pandolfini等人，BMCBiotechnology(《生物医学中心生物技术学刊》)，3：7；以及公开号为20030175965的美国专利；每个文献和专利引用方式并入本文。用于测定hpRNA构建体沉默体内基因表达的效率的瞬时测定法已在以下文献中描述：Panstruga等人，(2003)，Mol.Biol.Rep.(《分子生物学报道》)，30：135-140，将其以引用方式并入本文。
对于ihpRNA，干扰分子具有与hpRNA相同的总体结构，但该RNA分子另外包含内含子，该内含子能够在表达该ihpRNA的细胞中被剪接。内含子的使用使得发夹RNA分子中的环区大小在剪接后最小化，这可提高干扰的效率。参见例如Smith等人，(2000)，Nature(《自然》)，407：319-320。事实上，Smith等人证实了使用ihpRNA介导的干扰百分之百抑制了内源基因表达。使用ihpRNA干扰来抑制内源植物基因的表达的方法在例如以下文献和专利中描述：Smith等人，(2000)，Nature(《自然》)，407：319-320；Wesley等人，(2001)，Plant J.(《植物杂志》)，27：581-590；Wang和Waterhouse，(2001)，Curr.Opin.Plant Biol.(《植物生理学当前评述》)，5：146-150；Waterhouse和Helliwell，(2003)，Nat.Rev.Genet.(《遗传学自然评论》)，4：29-38；Helliwell和Waterhouse，(2003)，Methods(《方法》)，30：289-295，以及公开号为20030180945的美国专利，每个文献和专利引用方式并入本文。
转录基因沉默(TGS)可通过使用hpRNA构建体来实现，在所述构建体中，发夹的反向重复序列与待沉默的基因的启动子区域共享序列同一性。将hpRNA加工成可与同源启动子区发生相互作用的短RNA可触发降解或者甲基化而导致沉默(Aufsatz等人，(2002)，PNAS(《美国国家科学院院刊》)，99(增刊4)：16499-16506；Mette等人，(2000)，EMBO J(《欧洲分子生物学组织杂志》)，19(19)：5194-5201)。
靶蛋白的表达的抑制可通过表达编码微RNA(miRNA)的基因进行RNA干扰来获得。miRNA是由约22个核糖核苷酸组成的调节剂。miRNA在抑制内源基因的表达方面高度有效。参见例如Javier等人，(2003)，Nature(《自然》)，425：257-263，以引用方式并入本文。对于miRNA干扰，将表达盒设计成表达模仿内源miRNA基因的RNA分子。miRNA基因编码形成发夹结构的RNA，该发夹结构含有与另一内源基因(靶序列)互补的、具有22个核苷酸的序列。miRNA分子在抑制内源基因的表达方面高度有效，并且它们所诱导的RNA干扰被后续各代植物遗传。
同源重组的频率受多个因素影响。不同的生物体在同源重组的量和同源与非同源重组的相对比例方面不同。一般地讲，同源性区域的长度影响同源重组事件的频率，同源性区域越长，频率越高。为观察到同源重组而需要的同源性区域的长度也是随物种而异的。在许多情况下，至少5kb的同源性已被利用，但在少至25-50bp的同源性的情况下就已观察到同源重组。所需要的最小同源性长度，已估计在大肠杆菌中为20-50bp(Singer等人，(1982)，Cell(《细胞》)，31：25-33；Shen和Huang，(1986)，Genetics(《遗传学》)，112：441-57；Watt等人，(1985)，Proc.Natl.Acad. Sci.USA(《美国国家科学院院刊》)，82：4768-72)，在酿酒酵母中为63-89bp(Sugawara和Haber，(1992)，MolCell Biol(《分子细胞生物学》)，12：563-75)，而在哺乳动物细胞中为163-300bp(Rubnitz和Subramani，(1984)，Mol Cell Biol(《分子细胞生物学》)，4：2253-8；Ayares等人，(1986)，Proc.Natl.Acad. Sci.USA(《美国国家科学院院刊》)，83：5199-203；Liskay等人，(1987)，Genetics(《遗传学》)，115：161-7)。
同源重组在昆虫中已得到证明。Dray和Gloor在果蝇中发现，少至3kb的总模板：靶标同源性就足够以适当的效率将大的非同源DNA区段复制到靶标中(Dray和Gloor，(1997)，Genetics(《遗传学》)，147：689-99)。Golic等人采用在果蝇中的靶标FRT处进行FLP介导的DNA整合，证实了当供体和靶标共享4.1kb的同源性时，与1.1kb的同源性时相比，整合效率大约高10倍(Golic等人，(1997)，Nucleic Acids Res(《核酸研究》)，25：3665)。来自果蝇的数据表明，2-4kb的同源性对于有效靶向是充足的，但是有一些证据证明低得多的同源性——约30bp至约100bp范围内——可能就足够(Nassif和Engels，(1993)，Proc.Natl.Acad. Sci.USA(《美国国家科学院院刊》)，90：1262-6；Keeler和Gloor，(1997)，Mol Cell Biol(《分子细胞生物学》)，17：627-34)。
也在其他生物体中实现了同源重组。例如，在寄生性原生动物利什曼虫中进行同源重组需要至少150-200bp的同源性(Papadopoulou和Dumas，(1997)，Nucleic Acids Res(《核酸研究》)，25：4278-86)。在丝状真菌构巢曲霉(Aspergillus nidulans)中，用少至50bp侧翼同源性实现了基因置换(Chaveroche等人，(2000)，Nucleic Acids Res(《核酸研究》)，28：e97)。在纤毛虫嗜热四膜虫(Tetrahymena thermophila)中也证明了定向基因置换(Gaertig等人，(1994)，Nucleic Acids Res(《核酸研究》)，22：5391-8)。在哺乳动物中，使用可培养生长、转化、选择和引入到小鼠胚胎中的多能胚胎干细胞系(ES)，同源重组在小鼠中已经是最成功的。带有插入的转基因ES细胞的胚胎发育成遗传上嵌合的后代。通过将同胞小鼠进行杂种繁殖，可获得携带选定的基因的纯合小鼠。这个方法的综述在以下文献中提供：Watson等人，(1992)，Recombinant DNA(《重组DNA》)，第2版(《科学美国人图书》(Scientific American Books)，WH Freeman&Co.发行)；Capecchi，(1989)，Trends Genet(《遗传学趋势》)，5：70-6；以及Bronson，(1994)，J BiolChem(《生物化学杂志》)，269：27155-8。由于缺乏能够移植到卵母细胞或者发育的胚胎中的干细胞，在小鼠以外的哺乳动物中的同源重组曾是有限的。但是，McCreath等人，Nature(《自然》)，405：1066-9(2000)报道了通过在原代胚胎成纤维细胞中进行转化和选择在绵羊中成功进行了同源重组。
易错DNA修复机制可在双链断裂位点产生突变。非同源末端连接(NHEJ)途径是将断裂的末端连接在一起的最普通的修复机制(Bleuyard等人，(2006)，DNA Repair(《DNA修复》)，5：1-12)。染色体的结构完整性通常通过修复来保持，但是缺失、插入或者其他重排是可能发生的。一个双链断裂的两个末端是NHEJ的最普遍的底物(Kirik等人，(2000)，EMBOJ(《欧洲分子生物学组织杂志》)，19：5562-6)，但是，如果出现两个不同的双链断裂，则来自不同断裂的游离末端可连接并导致染色体缺失(Siebert和Puchta，(2002)，Plant Cell(《植物细胞》)，14：1121-31)或者不同染色体之间的染色体易位(Pacher等人，(2007)，Genetics(《遗传学》)，175：21-9)。
也可将附加型DNA分子连接到双链断裂中，例如将T-DNA整合到染色体双链断裂中(Chilton和Que，(2003)，Plant Physiol(《植物生理学》)，133：956-65；Salomon和Puchta，(1998)，EMBO J(《欧洲分子生物学组织杂志》)，17：6086-95)。一旦双链断裂周围的序列被变更，例如被参与双链断裂成熟的外切核酸酶活性变更，则基因转换途径可恢复原始结构，如果有同源序列的话，如非分裂的体细胞中的同源染色体，或者DNA复制后的姊妹染色单体(Molinier等人，(2004)，Plant Cell(《植物细胞》)，16：342-52)。异位的和／或表成的DNA序列也可充当DNA修复模板用于同源重组(Puchta，(1999)，Genetics(《遗传学》)，152：1173-81)。
植物细胞基因组的变更，例如通过同源重组(HR)变更，是遗传工程的强大工具。尽管高等植物中的同源重组频率低，但还是有植物内源基因同源重组的少数成功例子。植物中同源重组的参数已主要通过拯救(rescue)所引入的截短的选择性标记基因进行了研究。在这些实验中，同源DNA片段通常在0.3kb至2kb之间。观察到的同源重组频率大约为10-4至10-5。参见例如Halfter等人，(1992)，Mol Gen Genet(《分子与普通遗传学》)，231：186-93；Offringa等人，(1990)，EMBO J(《欧洲分子生物学组织杂志》)，9：3077-84；Offringa等人，(1993)，Proc.Natl.Acad. Sci.USA(《美国国家科学院院刊》)，90：7346-50；Paszkowski等人，(1988)，EMBO J(《欧洲分子生物学组织杂志》)，7：4021-6；Hourda和Paszkowski，(1994)，Mol Gen Genet(《分子与普通遗传学》)，243：106-11；以及Risseeuw等人，(1995)，Plant J(《植物杂志》)，7：109-19。
使用含有与靶基因同源约7kb的区域的寻靶载体，在拟南芥中对内源非选择性基因进行寻靶，寻靶频率估计为至少3.9×10-4(Maio和Lam，(1995)，Plant J(《植物杂志》)，7：359-65)。在另一个例子中，使用阳性-阴性选择方案和含有与靶标同源最多22.9kb的序列的寻靶载体，检测到同源重组的频率低于5.3×10-5，尽管有大的侧翼序列可供重组(Thykjasr等人，(1997)，Plant Mol Biol(《植物分子生物学》)，35：523-30)。在拟南芥中，使用这样的寻靶构建体通过同源重组敲除了AGL5MADS框基因，该寻靶构建体由卡那霉素抗性盒插入到AGL5序列中(大约离5′末端3kb和离3′末端2kb)而组成。在所产生的750个卡那霉素抗性转基因株系中，有一个株系含有预期的插入(Kempin等人，(1997)，Nature(《自然》)，389：802-3)。Hanin等人使用与编码原卟啉原氧化酶的拟南芥PPO基因的3kb5′末端和2kb3′末端同源性，获得了基础频率为7×10-4的同源重组事件(Hanin等人，(2001)，Plant J(《植物杂志》)，28：671-7)。Terada等人使用农杆菌介导的转化程序在水稻中靶向了Waxy基因座。阴性选择以两个拷贝的白喉毒素基因置于T-DNA的两个末端为形式进行，使用该阴性选择消除了T-DNA的随机整合，使得可以在选定的材料中富集稀有的同源重组事件，并且它们的重组系统从仅仅150颗水稻种子产生了数千个事件。在没有包含用于增强同源重组的元件的情况下，水稻中waxy基因的同源重组频率据报道为0.65×10-3(Terada等人，(2002)，Nat Biotech(《自然生物技术》)，20：1030-4)。
到目前为止，DNA双链断裂(DSB)似乎是每个受试生物体中刺激同源重组途径的有效因素(Puchta等人，(1995)，Plant Mol Biol(《植物分子生物学》)，28：281-92；Tzfira和White，(2005)，Trends Biotechnol(《生物技术趋势》)，23：567-9；Puchta，(2005)，J Exp Bot(《实验植物学杂志》)，56：1-14)。使用DNA断裂剂，在植物中人工构建的同源DNA重复序列之间观察到同源重组增加两倍至九倍(Puchta等人，(1995)，PlantMol Biol(《植物分子生物学》)，28：281-92)。在玉蜀黍原生质体中，用线状DNA分子进行实验证明了质粒之间的同源重组增强(Lyznik等人，(1991)，Mol Gen Genet(《分子与普通遗传学》)，230：209-18)。
使用稀有切割酶以及转座子如Ac和Mutator研究了DSB对同源重组的影响(Chiurazzi等人，(1996)，Plant Cell(《植物细胞》)，8：2057-66；Puchta等人，(1996)，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(《美国国家科学院院刊》)，93：5055-60；Xiao和Peterson，(2000)，Mol Gen Genet(《分子与普通遗传学》)，263：22-9；以及Shalev和Levy，(1997)，Genetics(《遗传学》)，146：1143-51)。Chiurazzi等人，(1996)，Plant Cell(《植物细胞》)，8：2057-66使用HO内切核酸酶将DSB引入到拟南芥染色体中，观察到HO识别位点侧翼的重复序列之间同源重组频率提高10倍。Ac转座元件的切除也以甚至更高的频率刺激了所述元件侧翼的重复序列之间的同源重组(Xiao和Peterson，(2000)，Mol Gen Genet(《分子与普通遗传学》)，263：22-9)。
Puchta等人报道了当使用I-SceI产生DSB时，人工靶基因座处的同源重组频率提高最多达两个数量级(Puchta等人，(1996)，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(《美国国家科学院院刊》)，93：5055-60)。在Puchta等人报道的实验中，通过用两个分别的农杆菌菌株进行共接种，将I-SceI表达盒与寻靶构建体一起引入到转基因烟草靶株系中。含有寻靶构建体的T-DNA和靶位点之间的同源重组重构了卡那霉素抗性基因(nptII)。同源重组的频率和I-SceI表达盒的量之间有明显的相关性，提示更多的DSB产生了更高的同源重组频率。
在烟草中使用锌指核酸酶(ZFN)，在预先引入的人工靶位点处获得了高频率的同源重组(wright等人，(2005)，Plant J(《植物杂志》)，44：693-705)。将锌指核酸酶表达盒和供体DNA通过共电穿孔引入到原生质体中，并通过卡那霉素抗性和GUS活性监测定向修饰。在大约每10个转化株中观察到一个修饰事件，但是如DNA印迹分析所指示，只有20％的修饰事件含有所需的同源重组产物。
锌指核酸酶是具有变更的特异性的工程改造的内切核酸酶，例如通过将工程改造的DNA结合域与内切核酸酶融合(例如FokI)(Durai等人，(2005)，Nucleic Acids Res(《核酸研究》)，33：5978-90；Mani等人，(2005)，Biochem Biophys Res Comm(《生物化学和生物物理研究通讯》)，335：447-57)。Wright等人和Lloyd等人报道了使用锌指核酸酶在整合到烟草或者拟南芥染色体DNA中的DNA靶位点处作出高频率诱变(Wright等人，(2005)，Plant J(《植物杂志》)，44：693-705；Lloyd等人，(2005)，Proc.Natl.Acad. Sci.USA(《美国国家科学院院刊》)，102：2232-7)。使用设计的能识别烟草内源乙酰乳酸合酶(ALS)基因座的锌指核酸酶，引入了已知能赋予针对咪唑啉酮和磺脲除草剂的抗性的突变ALS基因以替换内源ALS基因，替换频率为超过2％的转化细胞(Townsend等人，(2009)，Nature(《自然》)，459：442-5)。内源基因的敲除和转基因的表达可通过基因寻靶同时实现。使用设计的锌指核酸酶，靶向了编码玉蜀黍种子中的植酸生物合成最终步骤中所需的肌醇1，3，4，5，6-五磷酸2-激酶的IPKl基因，以通过同源重组插入编码膦丝菌素乙酰转移酶对草铵膦除草剂(如双丙氨膦)的耐受性的PAT基因。插入PAT基因来破坏IPKl基因，在发育的种子中同时导致了除草剂耐受性和预期的肌醇磷酸谱(profile)变更(Shukla等人，(2009)，Nature(《自然》)，459：437-41)。
重组酶的丝氨酸家族的成员在重组位点处产生双链断裂，作为它们的催化活性的一部分(Grindley等人，(2006)，Ann Rev Biochem(《生物化学年评》)，16：16)。甜橙中的R／RS系统似乎诱导RS位点的突变，导致与位点特异性重组反应本身不相关的染色体缺失(Ballester等人，(2006)，Plant Cell Rep(《植物细胞报道》)，26：39-45)。
另一个方法采用对现有的归巢内切核酸酶进行蛋白质工程改造以变更它们的靶标特异性。归巢内切核酸酶如I-SceI或者I-CreI能结合和切割相对较长的DNA识别序列(分别为18bp和22bp)。这些序列据预测在基因组中很少天然发生，通常仅1或者2个位点／基因组。可通过对DNA结构域处的氨基酸置换进行合理设计和／或对突变的单体进行组合性装配和选择，来改变归巢内切核酸酶的切割特异性(参见例如Arnould等人，(2006)，J MolBiol(《分子生物学杂志》)，355：443-58；Ashworth等人，(2006)，Nature(《自然》)，441：656-9；Doyon等人，(2006)，JAm Chem Soc(《美国化学会志》)，128：2477-84；Rosen等人，(2006)，Nucleic Acids Res(《核酸研究》)，34：4791-800；以及Smith等人，(2006)，Nucleic Acids Res(《核酸研究》)，34：e149；Lyznik等人，(2009)，公布号为的20090133152A1美国专利申请；Smith等人，(2007)，公布号为的20070117128A1美国专利申请)。已证明了经工程改造的大范围核酸酶能切割同族突变位点而不扩大它们的特异性。将对野生型酵母I-SceI归巢核酸酶具有特异性的人工识别位点引入在玉蜀黍基因组中，检测到当转基因I-SceI通过杂交引入并且通过基因切除激活时，在1％的被分析的F1植物中存在识别序列的突变(Yang等人，(2009)，Plant Mol Biol(《植物分子生物学》)，70：669-79)。更实际的是，使用基于I-CreI大范围核酸酶序列进行设计的工程改造的单链内切核酸酶靶向玉蜀黍无舌叶基因座(liguleless locus)。当设计的归巢核酸酶通过农杆菌介导转化不成熟胚来引入时，在3％的TO转基因植物中检测到选定的无舌叶基因座识别序列的突变(Gao等人，(2010)，Plant J(《植物杂志》)，61：176-87)。
实例
以下实例进一步说明本发明，其中份和百分数是以重量计，度是指摄氏度，除非另有规定。应理解，这些实例虽然说明本发明的各实施方案，但仅以举例说明的方式给出。由以上讨论和这些实例，本领域技术人员可确定本发明的必要特征，并且在不脱离本发明的精神和范围的前提下，可作出本发明的各种变化和修改以使本发明适合于各种应用和条件。这类修改也当视为落入所附权利要求的范围内。
缩写词的含义如下：“sec”指秒，“min”指分钟，“h”指小时，“d”指天，“μL”指微升“ml”指毫升、“L”指升、“μM”指微摩尔浓度、“mM”指毫摩尔浓度、“M”指摩尔浓度、“mmol”指毫摩尔、“μmole”指微摩尔、“g”指克、“μg”指微克、“ng”指纳克、“U”指单位、“bp”指碱基对，“kb”指千碱基。
细胞的DNA修复机制是转化以引入外源DNA或者在内源基因指诱导突变的基础。DNA同源重组是细胞使用同源序列修复DNA损伤的专门DNA修复方式。在植物中，DNA同源重组发生频率过低而不能用于转化，后来发现该过程可通过DNA双链断裂刺激(Bibikova等人，(2001)Mol.Cell Biol.(《分子细胞生物学》)，21：289-297；Puchta和Baltimore，(2003)，Science(《科学》)，300：763；Wright等人，(2005)，Plant J.(《植物杂志》)，44：693-705)。
实例1
DNA双链断裂诱导的内源靶位点变更
当DNA双链断裂诱导剂识别和切割基因组中的靶位点处的特定识别序列时，形成了DNA双链断裂，从而触发细胞DNA修复机制以动员修复可能对细胞致命的损伤。该过程可在植物转化中用来特异性地在靶位点处引入突变，以敲除位于靶位点处的基因或者在靶位点处插入目的供体DNA。一旦形成DNA双链断裂，取决于相关DNA构建体的设计和实际的DNA修复过程，可获得不同的结果服务于不同的转化目的。
对于简单的位点特异性基因突变，必须在同一细胞中存在含有识别序列的靶位点(图1A)和能特异性识别该识别序列的DNA双链断裂剂如内切核酸酶(图1B)。在内切核酸酶识别和切割该DNA后，两个游离末端可凭借细胞DNA修复机构通过末端连接来修复，而无需任何外部因子的介入。该两个末端可被修复至其原始状态，从而没有变化可检测到，或者它们可在修复前被变更，从而导致在它们再次连接后有可检测的变化，如该识别序列以及可能额外周围序列的一个或者多个核苷酸被缺失(图1F)。突变是通过该后一过程引入在靶位点处的。
为实现位点特异性DNA插入，细胞中除了必须存在靶位点和内切核酸酶之外，还必须同时存在含有目的DNA的供体DNA。供体DNA可在目的基因的侧翼含有与位于靶位点侧翼的DNA序列相同的DNA序列，即同源序列(图1C)。目的DNA可通过同源重组插入在靶位点处(图1E)，这是一个受靶位点处的DNA双链断裂刺激的过程。供体DNA也可仅含有目的DNA而不含任何侧翼同源序列(图1D)。目的DNA仍可被插入在靶位点处，不过是通过非同源重组以较不可预测的方式插入。类似地，任何在该DNA结束时恰好存在的非相关DNA都可插入在靶位点处(图1G)。可在相同的转化实验中同时获得不同的结果(图1E-G)。
任何在体内产生DNA双链断裂的手段都可用作DNA双链断裂诱导剂，如最常用的能识别＞18bp序列的大范围核酸酶，这样的序列足够长而在大多数基因组中独特。还有众多的大范围核酸酶已被发现和表征得知能识别许多不同的序列，但这种序列往往不在重要作物如大豆或者玉蜀黍中天然存在，并且即使在作物基因组中可找到相似的序列，但这些序列的有限数量仍太少而不可用。某些大范围核酸酶如I-CreI可通过蛋白质工程进行修饰，使得它将不再优先识别野生型I-CreI的识别序列，相反它将优先识别具体选定的目的序列。利用I-CreI内切核酸酶的灵活性，人们可以设计和作出修饰的I-CreI以切割基因组中自己选择的靶位点，并随后在该选定的靶位点处引入突变或者插入目的基因。这个方法所提供的精确遗传工程将解决传统植物转化方法(如农杆菌感染和生物射弹轰击)目前所面临的许多问题，如不可预测的整合、不需要的内源基因中断、未预测到的转基因表达等等。
在本发明的一个实施例中，我们使用了能识别大豆基因组中选定的不同内源靶位点的工程改造的I-CreI样大范围核酸酶，并在选定的靶位点处产生了突变和插入。
实例2
使用工程改造的大范围核酸酶在大豆基因组中涉及油质量的转基因事 件附近产生复合性状基因座
使在其基因组中包含内源靶识别序列的大豆株系与衍生自I CreI的定制大范围核苷酸接触，该大范围核苷酸被设计成特异性识别内源靶序列并在内源靶序列中产生双链断裂。使包含内源靶位点的大豆胚与以下描述的组分接触，选择事件并进行表征。
A.TS21、TS14、TS30和TS5靶位点
对大豆中目的转基因事件(事件DP-305423-1，2008年12月18日公布的公布号为2008／0312082A1的美国专利申请)附近的约500000bp基因组区域进行了序列分析。选择了一系列的大豆基因组内源靶识别序列——称为TS21、TS14、TS30和TS5——来设计衍生自I-CreI大范围核酸酶的定制双链断裂诱导剂。这些靶识别序列中的每一个都是独特的22bp多核苷酸。靶识别位点具有以下序列：
Figure BDA0000410712330000631
双链断裂位点和突出端区域以粗体显示，该酶在C13后面切割，如实心三角形所指示。
在大豆基因组内，TS5与目的转基因事件在同一染色体上并位于目的转基因事件上游约600kbp。TS30、TS21和TS14与TS5在同一染色体上，并且分别在目的转基因事件下游120kbp、125kbp和500kbp(图2)。
B.TS21、TS14、TS30和TS5大范围核酸酶
按照与Precision Biosciences公司(美国北卡罗来纳州达勒姆市(Durham))的合同，将I-CreI大范围核酸酶进行修饰以产生TS21、TS14、TS30和TS5大范围核酸酶，它们被设计成识别它们相应的靶序列。野生型I-CreI大范围核酸酶是同型二聚体。为了识别它们的靶序列，对每个单体作出不同的置换。每个单体的编码序列通过接头序列连接以产生单链融合多肽。对编码所设计的大范围核酸酶的基因进行优化以在植物中表达。SEQID NO：9是TS21大范围核酸酶的植物优化核苷酸序列。SEQ ID NO：10是TS14大范围核酸酶的植物优化核苷酸序列。SEQ ID NO：11是TS30大范围核酸酶的植物优化核苷酸序列。SEQ ID NO：12是TS5大范围核酸酶的植物优化核苷酸序列。这些基因包括来自SV40病毒的细胞核定位信号(SEQ IDNO：34)和来自马铃薯ST-LS1基因的内含子。该内含子能防止所述基因在克隆过程中在细菌中表达，但对于在植物细胞中表达并非必需。在这些植物优化核苷酸序列(SEQ ID NO：9-16)中，核苷酸1-30编码SV40细胞核定位氨基酸序列、核苷酸100-261和核苷酸850-1011分别编码第一半和第二半靶位点结合氨基酸序列，核苷酸403-591是马铃薯ST-LS1内含子，核苷酸685-798编码将两个经过再工程改造的I-CreI单体连接成单链的多肽的氨基酸序列。
还构建了编码经过工程改造的大范围核酸酶的、无ST-LS1内含子的植物优化核苷酸序列(例如参见SEQ ID NO：33)。
C.大范围核酸酶基因的植物表达载体的载体构建以及用于同源重组 转基因整合的修复性DNA
使用标准的分子生物学技术，构建了包含用于适当的大范围核酸酶的表达盒的载体。所有定制的大范围核酸酶都进行了测试，包括TS21、TS14、TS30和TS5。对于每种大范围核酸酶，将包含编码所述大范围核酸酶基因之一的多核苷酸的植物表达载体与大豆组成型启动子有效连接。
制备了以下大范围核酸酶植物表达载体：
RTW317(SEQ ID NO：35，GM-EF1A pro：：TS21：：pinII)表达盒含有不具有内含子并由大豆EF1A启动子驱动的TS21大范围核酸酶植物优化序列。
RTW322(SEQ ID NO：36，GM-EF1A pro：：TS21，具有ST-LS1内含子2：：pinII)表达盒含有具有内含子并由大豆EF1A启动子驱动的TS21大范围核酸酶植物优化序列。
其他表达盒按与RT317和RTW322相似的方式制备，但含有不同的启动子或者大范围核酸酶，如：
RTW319(GM-EF1A pro：：TS14：：pinII)、RTW324(GM-EF1A pro：：TS14，具有ST-LS1内含子2：：pinII)、RTW323(GM-EF1A pro：：TS5，具有ST-LS1内含子2：：pinII)、RTW325(GM-EF1A pro：：TS30，具有ST-LS1内含子2：：pinII)、RTW345(GM-UBQ pro：：TS21：：pinII)、RTW334(GM-UBQpro：：TS21，具有ST-LS1内含子2：：pinII)、RTW351(GM-MTH1pro：：TS21：：pinII)、RTW339(GM-MTH1pro：：TS21，具有ST-LS1内含子2：：pinII)，其中GM-ETF1A为大豆ETF1A启动子，GM-UBQ为大豆遍在蛋白启动子，GM-MTH1为大豆MTH1启动子，pinII为pinII终止子。
为实现位点特异性DNA插入，细胞中除了必须存在靶位点和内切核酸酶之外，还必须同时存在含有目的基因的修复性DNA(供体DNA)。目的基因的侧翼为两个同源重组片段(HR1和HR2)，它们是位于大范围核酸酶靶位点侧翼的1-3kb长的基因组DNA序列。目的基因可通过DNA同源重组插入在靶位点处，这是一个受靶位点处的DNA双链断裂刺激的过程。
制备了修复性DNA(或者供体DNA)片段Rep-RTW328A(SEQ IDNO：37)，用于在大豆基因组的TS21靶位点处进行基因整合。RTW328修复性DNA由1020bp TS21HR1片段(SEQ ID NO：17)、潮霉素选择标记盒和1000bp TS21HR2片段(SEQ ID NO：18)组成。潮霉素选择标记由SCP1启动子和NOS终止子驱动(第6,072,050号美国专利；Suzuki等人，Gene(《基因》)，(2000)，242(1-2)：331-336)。为大豆基因组中的TS14、TS30和TS5靶位点制备了类似的修复性DNA载体。Rep-TS14修复性DNA载体由1000bp TS14HR1片段(SEQ ID NO：19)、相同的潮霉素选择标记盒和928bpTS14HR2片段(SEQ ID NO：20)组成。Rep-TS30修复性DNA载体由1000bpTS0HR1片段(SEQ ID NO：21)、相同的潮霉素选择标记盒和1009bp TS30HR2片段(SEQ ID NO：22)组成。Rep-TS5修复性DNA载体由1006bp TS5HR1片段(SEQ ID NO：23)、相同的潮霉素选择标记盒和1007bp TS5HR2片段(SEQ ID NO：24)组成。
将DNA双链断裂剂与修复性DNA同时引入以促进同源DNA重组。便利的是，在大豆转化中通过将大范围核酸酶表达载体与其相应的修复性DNA一起进行共轰击来瞬时表达定制的大范围核酸酶。ST-LS1内含子在编码大范围核酸酶的DNA核苷酸序列中存在与否不影响该大范围核酸酶的功能性。当用在表达盒中包括或者不包括ST-LS1内含子的DNA序列表达大范围核酸酶时，观察到靶位点处存在变更。
D.用定制的大范围核酸酶进行基因组序列修饰和在内源靶位点处进行 转基因整合
使用基因特异性引物和探针，按照确立的方案进行PCR测定法和qPCR测定法(Li等人，(2007)，Plant MolBiol(《植物分子生物学》)，65：329-41；Li等人，(2009)，Plant Physiol(《植物生理学》)，151：1087-95)。开发了对TS21、TS14、TS30和TS5靶序列具有特异性的qPCR测定法，以鉴定在该区域中发生的序列变化。引物和探针如下进行设计并进行测试。
TS21qPCR：
Mega21-190F(SEQ ID NO：38)
Mega21-301R(SEQ ID NO：39)
Mega21-250T(SEQ ID NO：40)
TS14qPCR：
Mega14-13F(SEQ ID NO：41)
Mega14-128R(SEQ ID NO：42)
Mega14-85T(SEQ ID NO：43)
TS30qPCR：
Mega30-30F(SEQ ID NO：44)
Mega21-87R(SEQ ID NO：45)
Mega21-52T(SEQ ID NO：46)
TS5qPCR：
Mega5-F1(SEQ ID NO：47)
Mega5-RI(SEQ ID NO：48)
Mega5-T1(SEQ ID NO：49)
首先通过对大范围核酸酶靶位点进行qPCR测定，分析所有潮霉素抗性大豆转基因事件。因DNA切割和修复而引起的大范围核酸酶靶序列的改变，导致大范围核酸酶靶位点的拷贝数从野生型大豆基因组中的两个拷贝降低到转基因事件中的一个或者零个拷贝。选择这些具有降低的靶位点拷贝数的“qPCR命中”事件进行进一步的基因组PCR和测序分析。由TS21、TS14、TS30和TS5靶位点的qPCR分析证实，大多数阳性转基因事件中的靶位点拷贝数下降一半，这表明大豆基因组中的靶位点的一个等位基因被大范围核酸酶切割／DNA修复机制破坏。
进行了两组基因组PCR扩增以进一步表征得自qPCR测定的这些候选事件，以便了解基因组序列修饰和转基因整合。设计了第一组基因组PCR，以通过使用在HR1中退火的引物和在HR2中退火的另一引物扩增含有TS21靶位点的基因组片段来鉴定大范围核酸酶靶位点中的突变。例如，对于TS21，使用引物组WOL133和WOL134(SEQ ID NO：50和51)扩增含有TS12靶位点的基因组片段(图3A)。将PCR产物进行克隆和测序以鉴定TS21靶位点处的突变。在一些情况中，采用大范围核酸酶体外切割测定法切割未经修饰的靶位点的PCR产物，来测试该靶位点是否已被修饰。在体外切割测定法中，将使用针对靶位点的引物扩增的PCR产物用大范围核酸酶在37℃下消化过夜。用蛋白酶K和SDS处理具有大范围核酸酶的样品以使该蛋白质变性。将消化产物在1.5-2％琼脂糖凝胶上进行分离。未消化的产物表明靶位点被修饰。然后将未消化的PCR产物进行克隆和测序以验证基因组序列修饰。TS21靶位点上的大豆基因组序列修饰的一个例子在图3B中显示。
采用这个方法，在TS5、TS14和TS30靶位点检测到大豆基因组序列修饰(图4和表1)。
表1
TS30靶位点、pinII(代表大范围核酸酶盒)和Hygro(代表修复性 DNA盒)的qPCR拷贝数分析
克隆代号 TS30qPCR拷贝数 pinII qPCR拷贝数 Hygro qPCR拷贝数
A7052.2.5 0.56 0.00 1.98
A7052.10.26 0.55 0.00 1.55
A7052.10.28 0.54 0.00 1.96
A7034.1.11 0.53 0.00 2.98
A7034.3.1 0.54 1.70 3.41
A7034.3.15 0.52 0.96 4.54
野生型对照 0.96 2.23 5.19
阳性转基因事件中的TS30靶位点拷贝数下降一半，这表明大豆基因组中的靶位点的一个等位基因被大范围核酸酶切割／DNA修复机制破坏。这些结果证明，将大范围核酸酶基因引入到植物细胞中可导致目的基因组区域中的修饰。
野生型大豆和转基因胚都已被用于大豆转化。在野生型大豆和转基因事件中，TS21的靶标修饰率(qPCR)相同。这些结果证明，我们可以直接在转基因事件中引入基因组修饰，或者将基因组修饰引入到野生型大豆中的相同基因座。
第二组的基因组PCR修饰更聚焦于用边界特异性PCR进行转基因整合。例如，对于TS21(图3A)，设计了引物组WOL190(SEQ ID NO：52)和WOL242(SEQ ID NO：53)并用来扩增由转基因整合得到的左边界DNA片段。WOL190是大豆基因组中位于TS21HR1区上游的序列特异性引物，WOL242是反向取向的5′潮霉素抗性标记基因编码序列的序列特异性引物。当RTW328A修复性DNA通过同源重组进行整合，而该同源重组通过由TS21大范围核酸酶在基因组靶位点处引入的双链断裂促进时，仅可获得1860bp PCR产物。还设计了另一组引物WOL153(SEQ ID NO：54)和WOL247(SEQ ID NO：55)并用来扩增由转基因整合得到的右边界DNA片段。WOL153是来自NOS终止子的正义引物，而WOL247是大豆基因组中位于TS21HR2区的下游的序列特异性引物。当RTW328A修复性DNA通过同源重组进行整合，而该同源重组通过由TS21大范围核酸酶在基因组靶位点处引入的双链断裂促进时，仅可获得1727bp PCR产物。对于其他的定制大范围核酸酶，设计了相似的基因组PCR引物并进行了测试。
TS21qPCR
靶位点引物
WOL133(SEQ ID NO：50)
WOL134(SEQ ID NO：51)
左边界引物
WOL190(SEQ ID NO：52)
WOL242(SEQ ID NO：53)
右边界引物
WOL153(SEQ ID NO：54)
WOL247(SEQ ID NO：55)
TS14qPCR
靶位点引物
WOL121(SEQ ID NO：56)
WOL150(SEQ ID NO：57)
左边界引物
WOL192(SEQ ID NO：58)
WOL242(SEQ ID NO：53
右边界引物
WOL153(SEQ ID NO：54)
WOL193(SEQ ID NO：59)
TS30qPCR
靶位点引物
WOL113(SEQ ID NO：60)
WOL114(SEQ ID NO：61)
左边界引物
WOL194(SEQ ID NO：62)
WOL242(SEQ ID NO：53)
右边界引物
WOL153(SEQ ID NO：54)
WOL195(SEQ ID NO：63)
TS5qPCR
靶位点引物
WOL105(SEQ ID NO：64)
WOL144(SEQ ID NO：65)
左边界引物
WOL196(SEQ ID NO：66)
WOL242(SEQ ID NO：53)
右边界引物
WOL153(SEQ ID NO：54)
WOL197(SEQ ID NO：67)
设计了引物对，其中一个引物能够与靶位点的5′或者3′侧翼序列退火，另一引物能够与潜在的插入物(即转基因)内的序列退火。对于TS14靶位点，通过qPCR分析从总共68个事件鉴定了18个qPCR阳性事件。在这18个qPCR阳性事件中，有三个事件被证实是完美的由TS14大范围核酸酶介导的同源重组转基因整合事件。
这些结果证明，大豆细胞具有天然DNA修复机构，该机构可通过简单的末端连接或者通过同源重组修复DNA双链断裂末端。因此预期，使用对靶识别序列具有特异性的适当双链断裂诱导剂，可在大豆基因组中的任何靶位点处实现通过同源重组进行的定点诱变和基因插入的相似速率。使用本文描述的简单PCR筛选程序鉴定这种插入和突变事件是可行的。当左边界PCR和右边界PCR都表明靶位点处有插入时，可鉴定到完美的转基因整合事件。在目的基因组区域内的预定靶位点处的转基因整合提供了一种新型的基因堆积技术。图5是将新的性状基因堆积到紧邻目的转基因事件的单个靶位点中的示意性例子。
实例3
使用工程改造的大范围核酸酶在大豆基因组中除草剂抗性转基因事件 附近产生复合性状基因座
A.TS7、TS4、TS22和TS24靶位点
除草剂抗性转基因事件(公开号为2010／0184079、2009／0036308和2008／0051288的美国专利申请中描述的事件3560.4.3.5)的转基因边界分析表明，基于分子标记分析，该转基因插入在大豆染色体中离三个抗病标记约12cM处(图6)。对这个目的基因组区域中的约400000bp进行了序列分析，鉴定到了四个大范围核酸酶靶位点(TS7、TS4、TS22和TS24)，这些靶位点和附近的抗病标记和除草剂抗性转基因事件之间有合乎需要的遗传距离。这些靶识别序列中的每一个都是独特的22bp多核苷酸。靶识别位点具有以下序列：
Figure BDA0000410712330000711
双链断裂位点和突出端区域以粗体显示，该酶在C13后面切割，如实心三角形所指示。
B.TS7、TS4、TS22和TS24大范围核酸酶
按照与Precision Biosciences公司(美国北卡罗来纳州达勒姆市(Durham))的合同，将I-CreI大范围核酸酶进行修饰以产生TS7、TS4、TS22和TS24大范围核酸酶，它们被设计成识别它们相应的靶序列。野生型I-CreI大范围核酸酶是同型二聚体。为了识别它们的靶序列，对每个单体作出不同的置换。每个单体的编码序列通过接头序列连接以产生单链融合多肽。所有这些靶位点都离三个抗病标记的簇约1-10cM。
编码TS7大范围核酸酶(SEQ ID NO：13)、TS4大范围核酸酶(SEQ IDNO：14)、TS22大范围核酸酶(SEQ ID NO：15)和TS24大范围核酸酶(SEQ IDNO：16)的植物优化核苷酸序列包括编码SV40核定位信号(MAPKKKRKVH；SEQ ID NO：34)的DNA片段(bp1-30)以及ST-LS1内含子(SEQ ID13-16的bp403至bp591)，以消除在大肠杆菌和农杆菌中的表达。SEQ ID NO：13-16的核苷酸685-798编码将两个经工程改造的I-CreI单体连接成单链的多肽的氨基酸序列。SEQ ID NO：13-16的核苷酸100-261和SEQ ID NO：13-16的核苷酸850-1011分别编码第一半和第二半靶位点结合氨基酸序列。
C.大范围核酸酶基因的植物表达载体的载体构建以及用于同源重组 转基因整合的修复性DNA
使用标准的分子生物学技术，构建了包含用于适当的大范围核酸酶的表达盒的载体。所有定制的大范围核酸酶都进行了测试，包括TS7、TS4、TS22和TS24。对于每种大范围核酸酶，将包含编码所述大范围核酸酶基因之一的多核苷酸的植物表达载体与大豆组成型启动子有效连接。
为实现位点特异性DNA插入，细胞中除了必须存在靶位点和内切核酸酶之外，还必须同时存在含有目的DNA的修复性DNA(供体DNA)。目的DNA的侧翼为两个同源重组片段(HR1和HR2)，它们是位于大范围核酸酶靶位点侧翼的1-3kb长的基因组DNA序列。目的DNA可通过DNA同源重组插入在靶位点处，这是一个受靶位点处的DNA双链断裂刺激的过程。
TS7、TS4、TS22和TS24的HR1结构域和HR2结构域分别为SEQ IDNO：25和26、SEQ ID NO：27和28、SEQ ID NO：29和30以及SEQ ID NO：31和32。
如实例2C中所描述制备修复性DNA载体。
将DNA双链断裂剂与修复性DNA同时引入以促进同源DNA重组。便利的是，在大豆转化中通过将大范围核酸酶表达载体与其相应的修复性DNA一起进行共轰击来瞬时表达定制的大范围核酸酶。
实例4
大豆基因组的短区域中的大范围核酸酶靶位点簇，用于堆积多个性状 基因
如图7中所示，可鉴定到一系列的大范围核酸酶靶位点，这些靶位点之间有合乎需要的遗传距离。可使用定制的大范围核酸酶，通过依序转化或者通过与一系列性状基因中的各个性状基因进行遗传杂交，将该一系列的性状基因靶向到这个确定的基因组基因座中。使用图7中所示的这个方法，可在包含例如目的转基因或者天然基因以及其他转基因性状或者天然性状基因座如抗病标记的目的基因组区域中堆积多个性状。
实例5
通过工程改造的大范围核酸酶在玉蜀黍内源基因座处产生复合性状基 因座
A.MHP靶位点
选择玉蜀黍染色体上涵盖约180万个核苷酸并代表大约4.3厘摩(cM)的遗传区域的基因组区域，作为用于产生复合性状基因座的靶区域。对该基因组进行扫描以寻找这样的含22个核苷酸的序列，所述序列可充当含有诱导双链断裂的大范围核酸酶的识别序列的靶位点，并可用于插入另外的转基因以产生复合性状基因座。在紧邻转基因插入位点的2cM区域(图8)中选择了一系列35个推定的靶位点(SEQ ID NO：68-77)，以设计衍生自I-CreI大范围核酸酶的定制双链断裂诱导剂。图8显示MHP靶位点相对于彼此以及目的转基因的遗传和物理位置。
B.MHP大范围核酸酶
对I-CreI大范围核酸酶进行修饰以产生内切核酸酶，它们被设计成识别它们相应的靶序列(SEQ ID NO：68-77)。定制的大范围核酸酶的设计已在公开号为US2007／0117128A1的美国专利申请中描述。
对编码设计的大范围核酸酶的基因进行优化以便在植物中表达。工程改造的内切核酸酶表达盒含有玉蜀黍密码子优化的核苷酸序列以便在玉蜀黍细胞中有更好的表现。还将内切核酸酶基因序列用编码SV40核定位信号(SEQ ID NO：34)的DNA序列补充。玉蜀黍遍在蛋白启动子和马铃薯蛋白酶抑制剂II基因终止子序列完成了内切核酸酶基因设计。还另外通过将ST-LS1内含子添加到第一个单体的编码序列对MHP55(SEQ ID NO：80)表达盒进行修饰，以消除其在大肠杆菌和农杆菌中的表达。SEQ ID NO：82是含有核定位信号而不具有内含子的MHP55-2的植物优化核苷酸序列。SEQ IDNO：78是MHP14大范围核酸酶的植物优化核苷酸序列。还制备了称为MHP14+的定制大范围核酸酶。SEQ ID NO：79是MHP14+大范围核酸酶的植物优化核苷酸序列。SEQ ID NO：83是MHP77大范围核酸酶的植物优化核苷酸序列。
C.大范围核酸酶基因的植物表达载体的载体构建以及用于同源重组 转基因整合的修复性(供体)DNA
使用标准的分子生物学技术，构建了包含用于适当的大范围核酸酶的表达盒的载体。对于每种大范围核酸酶，将包含编码所述大范围核酸酶基因之一的多核苷酸的植物表达载体与玉蜀黍组成型启动子有效连接。
为实现位点特异性DNA插入，细胞中除了必须存在靶位点和内切核酸酶之外，还必须同时存在含有目的基因的修复性DNA(供体DNA)。使用标准的分子生物学技术，构建了含有编码工程改造的大范围核酸酶MHP14或者优化的大范围核酸酶MHP14+的多核苷酸的载体PHP44285(SEQ IDNO：104)或者PHP44779(SEQ ID NO：105)。供体DNA含有用作转化的选择标记的除草剂抗性基因。除草剂抗性基因MoPAT编码膦丝菌素乙酰转移酶，其侧翼为两个同源重组片段HR1(SEQ ID NO：84)和HR2(SEQ ID NO：85)，它们是位于大范围核酸酶靶位点的侧翼的约1kb长的基因组DNA序列。载体PHP44285或者PHP44779各自含有大范围核酸酶盒、供体DNA及同源序列HR1和HR2。
使用来自玉蜀黍可转化株系的玉蜀黍不成熟胚9-12DAP(DAP指授粉后天数，尺寸大约1.5-2.0mm)，通过轰击进行基因转化(实例6)。将不成熟胚置于560Y培养基上于26℃保持4小时，或者作为另一种选择，将不成熟胚在26℃至37℃的温度下温育8-24小时后再置于560Y上，然后在进行轰击(如实例6中所描述)。在通过共轰击进行的实验中(实例7)，包括了发育基因ODP2(AP2结构域转录因子ODP2(胚珠发育蛋白2)；US20090328252A1)和Wushel。玉蜀黍不成熟胚用载体PHP44285或者PHP44779进行转化。
D.用定制的大范围核酸酶进行基因组序列修饰和在内源靶位点处进 行转基因整合
MHP14供体载体(PHP44285或者PHP44779)的成功递送赋予了双丙氨膦除草剂抗性，并被用来通过在含除草剂的培养基上进行愈伤组织选择来鉴定推定的事件。对使用标准的培养和再生条件从稳定转化株再生的愈伤组织和／或植物筛选内源MHP14靶位点的修饰。
使用实时PCR(qPCR)来确定靶位点拷贝数。两个拷贝的靶位点表示两个等位基因都是野生型并且在靶位点处没有发生修饰。一个拷贝意味着在修复由MHP14或者MHP14+产生的双链断裂的过程中靶位点的一个等位基因发生了改变，而靶位点(null)的不存在是两个等位基因被修饰的结果。由于愈伤组织样品的嵌合性质，拷贝数也可在1-2之间。MHP14靶位点的qPCR的探针序列为CAGATTCACGTCAGATTT(SEQ ID NO：106)，MHPTS14_正向引物为AGCGACATAGTGGTGTATAAAAGGAA(SEQ ID NO：107)，MHPTS14_反向引物为TGGATTGTAATATGTGTACCTCATGCT(SEQ IDNO：108)。扩增子为大约100bp。
为研究提高温度是否会提高靶位点的修饰率，将玉蜀黍胚用几种大范围核酸酶轰击后在不同温度下温育。表2显示由靶位点修饰所确定的温度对MHP14的大范围核酸酶活性的影响。表2表示提高温度导致靶位点突变率提高。
表2
轰击后在提高的温度下温育玉蜀黍胚对大范围核酸酶的靶位点突变率 的影响
大范围核酸酶 温度(℃) 靶位点突变率
MHP14 28 14％
MHP14 32 46％
在轰击后，将胚在560P(维持培养基)上28℃或者32℃温育12-48小时，然后置于28℃下。通过使用qPCR测量靶位点拷贝数对除草剂抗性事件筛选靶位点处的修饰。靶位点突变率间接地测量大范围核酸酶活性。TSMutRate(靶位点突变率)表示MHP14或者LIG3／4靶位点的修饰率(具有修饰的事件数目／事件数目*100％)。如表2中所示，与没有经提高温度处理相比，若胚在轰击后置于32℃下48小时，MHP14和LIG34的靶位点突变率提高大约3倍。
还通过junction PCR对玉蜀黍愈伤组织筛选来自供体DNA(PHP44285或者PHP44779)的转基因盒在MHP14靶位点处的整合，并将选出的愈伤组织事件再生成T0植物。图9A显示筛选供体DNA片段通过同源重组在MHP14靶位点处的整合的PCR的示意图(PHP44779供体)。箭头指示引物位置。图9B显示MHP14愈伤组织事件的PCR：B1-B12，用引物146773／146775进行Junction PCR；b1-b12，用引物146772／146778进行Junction PCR。两个事件(B2和B5)产生了预测的1-1.2kb PCR片段，所述片段由两个接界(junction)的同源重组整合得到。对来自从这些愈伤组织事件衍生的T0植物的PCR产物进行测序以验证愈伤组织结果。PCR筛选揭示了除草剂抗性转基因盒在MHP14靶位点处整合。引物来自供体载体的同源性外面的基因组区域和来自接近该同源性的末端的转基因盒。
图10A显示用来证实UBI：moPAT：PinII盒在内源MHP14靶标处的整合的长片段PCR反应的示意图。图10B：显示对来自其中整合发生在靶位点处的三个事件的T0植物进行长片段PCR的结果。植物A5来自事件#1、A6-A8来自事件#2，C4-C6来自事件#3。10B左边显示了使用基因组引物(146775)和moPAT引物(mopatR2)在HR1侧进行的长接界片段PCR；10B右边显示了在HR2侧进行的长接界片段PCR(mopatF2／146772)。箭头表示PCR引物位置。引物组146772／mopatF2扩增了4kb片段，其从moPAT基因横跨UBI内含子、UBI启动子和HR序列到邻近的基因组区域。引物组146775／mopatR2扩增了2.2kb片段，其从moPAT基因横跨HR1到邻近的基因组区域。这两个片段重叠并覆盖MHP14靶位点处的整个插入片段。两个长PCR产物的尺寸表明供体基因盒在MHP14靶位点处的完美整合。
为测定子代中的整合事件的分离模式，将从自交的T0植物得到的T1种子种植在浅箱(flats)中，并用PCR和／或qPCR对T1植物进行基因型分析。整合基因型的分离比符合转基因在MHP14靶位点处的1：2：1野生型(无整合)、杂合(一个等位基因有整合，另一个等位基因为野生型)和纯合整合，这证明为孟德尔遗传。在纯合或者杂合的整合植物中没有观察到可见的表型。
通过用在HR1和HR2(146772／146775)外面的基因组区域中的引物，对来自纯合T1植物的DNA进行PCR，获得了UBI：moPAT：PinII的整个插入片段。如所预期从纯合植物扩增了5kb的PCR产物。从来自野生型植物的未经修饰的完整基因组序列扩增了2kb PCR产物。
可通过由工程改造的大范围核酸酶介导的同源重组，将性状基因盒引入在复合性状基因座的其他靶位点处。工程改造的大范围核酸酶被设计成将双链断裂导向于复合性状基因座内的两个其他MHP靶位点处，即MHP55(SEQ ID NO：72)和MHP77(SEQ ID NO：74)。使用qPCR测定靶位点修饰。MHP55靶位点的qPCR筛选的探针序列为AACCGTCGTGAGACCT(SEQID NO：115)，MHPTS55_正向_MGB引物序列为AAGGCGCAGCCGTTGAG(SEQ ID NO：116)，MHP55_反向_MGB引物为CTACCGGTTTCGCGTGCTCT(SEQ ID NO：117)。MHP77靶位点的qPCR的探针序列为TAGTATGACATACATACCGCC(SEQ ID NO：118)，MHPTS77_正向_MGB引物序列为TCCTTAGGGCGGTATGTATGTCA(SEQID NO：119)，MHP77_反向_MGB引物为CATCGGTCAAAAAACACATAAACTTT(SEQ ID NO：120)。通过采用轰击的转化技术，将编码MHP14、MHP55和MHP77的性状基因盒引入到玉蜀黍体细胞胚中，并在轰击后将胚在560P(维持培养基)上在温育48小时。如表3中所示，含有用分别包括编码MHP55或者MHP55.2大范围核酸酶的基因的PHP45782或者PHP46924轰击的MHP55靶位点的玉蜀黍愈伤组织，也导致了观察到修饰的MHP55.2变体的靶位点突变率提高。另外，含有用分别包括编码MHP77或者MHP77.3大范围核酸酶的基因的PHP45970或者PHP50238轰击的MHP77靶位点的玉蜀黍愈伤组织，与用修饰的变体MHP77.3轰击的愈伤组织相比突变的靶位点频率更高。总之，和MHP14一样，这些大范围核酸酶将突变导向它们相应的靶位点，并且修饰的版本导致靶位点突变率提高(与它们的原始版本相比提高大约2-10倍)，这提示新设计的大范围核酸酶版本比原始核酸酶更有活性。
表3
原始的和修饰的大范围核酸酶的大范围核酸酶活性(定义为靶位点突 变率)
大范围核酸酶 靶位点突变率
MHP55 0％
MHP55-2 5％
MHP77 1％
MHP77-3 11％
MHP14 29％
MHP14+ 40％
在这些靶位点处观察到的突变表明，工程改造的大范围核酸酶具有功能，并且靶位点可用于另外的性状基因的整合。
E.通过杂交在玉蜀黍内源基因座处产生复合性状基因座
如上所述，鉴定了通过随机整合获得的含有目的转基因DNA的玉蜀黍事件，并且鉴定了目的转基因DNA周围的MHP14、MHP55和MHP77靶位点。还鉴定了在MHP14、MHP55和MHP77靶位点处含有修饰(通过如上所述添加除草剂抗性)的其他玉蜀黍事件。
将对于除草剂抗性基因在MHP14靶位点处的整合而言纯合的植物与含有目的转基因DNA的纯合玉蜀黍植物进行杂交。该杂交得到产F1种子的能育植物。将F1种子种植并与良种近交系远交，并筛选堆积的表型。可通过将含有n转基因的一个转基因事件与在另外的靶位点含有另外的性状基因的其他转基因事件杂交，将另外的性状基因添加到复合性状基因座，并对子代筛选n+1转基因的存在。可将这个过程重复许多次，次数与复合性状基因座中存在的靶位点数量相同。
F.通过系列转化在玉蜀黍内源基因座处产生复合性状基因座
还可通过系列转化产生复合性状基因座。可使用含有整合在第一MHP靶位点处的第一性状基因的第一转化株系来提供胚。第一转化株系可用第二性状基因和编码第二工程改造的大范围核酸酶进行再转化；导致第二性状基因通过由第二工程改造的大范围核酸酶介导的同源重组被整合在第二MHP靶位点处。可使用在MHP14靶位点处含有选择性标记的纯合整合植物来提供胚。两轮的转化将在MHP基因座处产生两个性状。可使用对于在MHP靶位点处有两个性状基因的整合事件而言纯合的转化株系给另一再转化提供胚，并可将第三性状基因引入第三靶位点。
实例6
玉蜀黍不成熟胚的转化
可通过各种已知在植物中有效的方法来完成转化，包括粒子介导的递送、农杆菌介导的转化、PEG介导的递送和电穿孔。
a.粒子介导的递送
如下使用粒子递送进行玉蜀黍不成熟胚的转化。培养基配方见下文。
将穗去壳并在30％C1orox漂白剂加0.5％Micro洗涤剂中表面灭菌20分钟，然后用无菌水漂洗两次。将不成熟胚分离，并以胚轴一侧朝下(盾片一侧朝上)放置，每板25个胚，在560Y培养基上放置4小时，然后在2.5cm靶区内排成一行准备进行轰击。作为另一种选择，将分离的胚放在560L(起始培养基)上，并在暗处26℃至37℃温度下放置8-24小时，然后在560Y上26℃放置4小时后如上所述进行轰击。
构建了包含与启动子有效连接的Zm-BBM(也称Zm-ODP2)编码序列(SEQ ID NO：9所示)的质粒。这可以是弱启动子如nos、组织特异性启动子如球蛋白-1或者油质蛋白、诱导型启动子如In2、或者强启动子如遍在蛋白，加上含有能赋予对双丙氨膦除草剂的抗性的选择性标记基因膦丝菌素N-乙酰转移酶(PAT；Wohlleben等人，(1988)，Gene(《基因》)，70：2537)的质粒。此外，如上所述构建了含有双链断裂诱导剂和供体DNA如PHP44285或者PHP44779的质粒，并与含有发育基因ODP2(AP2结构域转录因子ODP2(胚珠发育蛋白2)；US20090328252A1)和Wushel的质粒一起进行共轰击。
使用氯化钙(CaCl2)沉淀程序，通过混合100μl在水中制备的钨粒子、10μl(1μg)DNA／Tris EDTA缓冲液(1μg总DNA)、100μl2.5M CaCl2、10μl0.1M亚精胺，将质粒沉淀到1.1μm(平均直径)钨小丸上。每种试剂依序加到钨粒子悬浮液，同时进行混合。将最终的混合物进行短暂超声处理，并且允许其在恒定漩涡混合下温育10分钟。在沉淀期间，将管短暂离心，移除液体，将粒子用500ml100％乙醇洗涤，然后进行30秒离心。再次移除液体，将105μl100％乙醇加到最终的钨粒子小丸。对于粒子枪轰击，将钨／DNA粒子进行短暂超声处理。将10μl的钨／DNA粒子点滴到每个巨载体(macrocarrier)的中央上，然后让点滴的粒子干燥约2分钟再进行轰击。
用Biorad氦枪以水平#4对样品板进行轰击。所有样品接受450PSI的单次射击，每管的制备粒子／DNA共取十个等分试样。
在轰击后，将胚在560P(维持培养基)上在26℃至37℃的温度下温育12-48小时，然后置于26℃下。在5-7天后，将胚转移到含有3mg／L双丙氨膦的560R选择培养基，每隔2个星期在26℃下进行传代培养。在进行大约10个星期的选择后，将抗选择的愈伤组织克隆转移到288J培养基以引发植物再生。在体细胞胚成熟后(2-4个星期)，将发育良好的体细胞胚转移到培养基中进行发芽并转移到有光照的培养室。大约7-10天后，将发育的小植物转移到管中的272V无激素培养基7-10天，直到小植物完全长好。然后将植物转移到含有盆栽土的浅箱嵌块(inserts in flats)(相当于2.5英寸盆)，在生长室中生长1个星期，随后在温室中另外生长1-2个星期，然后转移到Classic600盆(1.6加仑)并生长至成熟。对植物进行监测并进行转化效率的打分和／或进行再生能力的修饰的打分。
起始培养基(560L)包含4.0g／l N6基础盐(SIGMA C-1416)、1.0ml／lEriksson复合维生素(1000X SIGMA-1511)、0.5mg／l盐酸硫胺、20.0g／l蔗糖、1.0mg／l2,4-D和2.88g/l L-脯氨酸(在用KOH调至pH5.8后用去离子水定容)；2.0g／l Gelrite(在去离子水定容后加入)；及8.5mg／L硝酸银(在将培养基灭菌并冷却到室温后加入)。
维持培养基(560P)包含4.0g／l N6基础盐(SIGMA C-1416)、1.0ml／lEriksson复合维生素(1000X SIGMA-1511)、0.5mg／l盐酸硫胺、30.0g／l蔗糖、2.0mg/l2,4-D和0.69g/l L-脯氨酸(在用KOH调至pH5.8后用去离子水定容)；3.0g/l Gelrite(在去离子水定容后加入)；及0.85mg/l硝酸银(在将培养基灭菌并冷却到室温后加入)。
轰击培养基(560Y)包含4.0g／l N6基础盐(SIGMA C-1416)、1.0ml／lEriksson复合维生素(1000X SIGMA-1511)、0.5mg/l盐酸硫胺、120.0g/l蔗糖、1.0mg／l2,4-D和2.88g／l L-脯氨酸(在用KOH调至pH5.8后用去离子水定容)；2.0g／l Gelrite(在去离子水定容后加入)；及8.5mg／L硝酸银(在将培养基灭菌并冷却到室温后加入)。
选择培养基(560R)包含4.0g／l N6基础盐(SIGMA C-1416)、1.0ml／1Eriksson复合维生素(1000X SIGMA-1511)、0.5mg／l盐酸硫胺、30.0g／l蔗糖和2.0mg/l2,4-D(在用KOH调至pH5.8后用去离子水定容)；3.0g/l Gelrite(在去离子水定容后加入)；及0.85mg／L硝酸银和3.0mg／L双丙氨膦(两者均在将培养基灭菌并冷却到室温后加入)。
植物再生培养基(288J)包含4.3g／l MS盐(GIBCO11117-074)、5.0ml／l MS维生素储备溶液(0.100g烟酸、0.02g／l盐酸硫胺、0.10g／l盐酸吡哆辛和0.40g/l甘氨酸，用精炼(polished)去离子水定容)(Murashige和Skoog，(1962)，Physiol.Plant.(《植物生理学》)，15：473)、100mg/l肌醇、0.5mg/l玉米素、60g/l蔗糖和1.0ml／l的0.1mM脱落酸(在调至pH5.6后用精炼去离子水定容)；3.0g／l Gelrite(在用去离子水定容后定容)；以及1.0mg/l吲哚乙酸和3.0mg/l双丙氨膦(在将培养基灭菌并冷却到60℃后加入)。
无激素培养基(272V)包含4.3g/l MS盐(GIBCO11117-074)、5.0ml／l MS维生素储备溶液(0.100g/l烟酸、0.02g/l盐酸硫胺、0.10g/l盐酸吡哆辛和0.40g/l甘氨酸，用精炼去离子水定容)、0.1g/l肌醇和40.0g/l蔗糖(在调至pH5.6后用精炼去离子水定容)；以及6g／l细菌琼脂(在用精炼去离子水定容后加入)，灭菌并冷却至60℃。
b.农杆菌介导的转化
基本上如Djukanovic等人，(2006)，Plant Biotech J(《植物生物技术杂志》)，4：345-57中所描述进行农杆菌介导的转化。简单地讲，从经灭菌的种仁切下10-12日龄的不成熟胚(尺寸0.8-2.5mm)并放入液体培养基(4.0g／l N6基础盐(Sigma C-1416)、1.0ml／L Eriksson复合维生素(Sigma E-1511)、1.0mg／l盐酸硫胺、1.5mg／l2，4-D、0.690g／l L-脯氨酸、68.5g／l蔗糖、36.0g／l葡萄糖、pH5.2)中。在收集胚后，用1ml浓度为0.35-0.45OD550的农杆菌更换培养基。将玉蜀黍胚与农杆菌在室温下温育5分钟，然后将该混合物倒到培养基板上，该培养基板含有4.0g／l N6基础盐(Sigma C-1416)、1.0ml／L Eriksson复合维生素(Sigma E-1511)、1.0mg／l盐酸硫胺、1.5mg/l2，4-D、0.690g／l L-脯氨酸、30.0g／l蔗糖、0.85mg／l硝酸银、0.1nM乙酰丁香酮和3.0g／l Gelrite，pH5.8。将胚以胚轴朝下在暗处20℃下温育3天，然后在暗处28℃下温育4天，然后转移到新的培养基板上，该培养基板含有4.0g／lN6基础盐(Sigma C-1416)、1.0ml／L Eriksson复合维生素(Sigma E-1511)、1.0mg／l盐酸硫胺、1.5mg／l2，4-D、0.69g／l L-脯氨酸、30.0g／l蔗糖、0.5g／lMES缓冲液、0.85mg／l硝酸银、3.0mg／l双丙氨膦、100mg／l羧苄西林和6.0g／l琼脂，pH5.8。将胚每隔三个星期进行传代培养，直到鉴定到转基因事件。如下诱导体细胞胚发生：将少量的组织转移到再生培养基上(4.3g／lMS盐(Gibco11117)、5.0ml／L MS维生素储备溶液、100mg／l肌醇、0.1μMABA、1mg/l IAA、0.5mg/l玉米素、60.0g/l蔗糖、1.5mg/l双丙氨膦、100mg/l羧苄西林、3.0g／l Gelrite，pH5.6)，并在暗处28℃下温育两个星期。将所有具有可见的苗和根的材料转移到含有4.3g／l MS盐(Gibco11117)、5.0ml／LMS维生素储备溶液、100mg/l肌醇、40.0g/l蔗糖、1.5g／l Gelrite，pH5.6的培养基上，并在人工灯光、28℃下温育。一个星期后，将小植物移到含有相同培养基的玻璃管中，并生长至对它们进行采样和／或移植到土壤中为止。
实例7
BBM的瞬时表达能增强转化
可对转化方案的参数进行修改以确保BBM活性是瞬时的。一个这种方法涉及例如使用化学品PEL将含BBM的质粒进行沉淀，使得可以进行转录和表达，但又排除随后DNA释放。
在一个例子中，用PEI将BBM质粒沉淀到金粒子上，同时用标准的氯化钙方法将待整合的转基因表达盒(UBI：：moPAT～GFPm：：PinII；moPAT为玉蜀黍优化的PAT基因)沉淀到金粒子上。
简单地讲，如下用PEI包覆金粒子。首先，洗涤金粒子。称取35mg平均直径为1.0的金粒子(A.S.I.#162-0010)到微量离心管中，加入1.2ml无水乙醇并漩涡混合一分钟。将管在室温下温育15分钟，然后使用微量离心机在4℃下高速离心15分钟。弃去上清液，加入新鲜的1.2ml乙醇等分试样，漩涡混合一分钟，离心一分钟，再次弃去上清液(重复这一操作两次)。加入新鲜的1.2ml乙醇等分试样，将此悬浮液(金粒子在乙醇中)在-20℃下保存数星期。为用聚乙基亚胺(PEI；Sigma#P3143)涂覆粒子，将250μl的经洗涤的金粒子／乙醇混合物离心，然后弃去乙醇。将粒子在100μl双蒸水中洗涤一次以除去残余乙醇，加入250μl的0.25mM PEI，接着进行脉冲超声处理以使粒子悬浮，然后将管投入干冰／乙醇浴中以将悬浮液快速冷冻，然后将悬浮液冷冻干燥过夜。此时，干燥的涂覆粒子可在-80℃下保存至少3个星期。在使用前，将粒子用2.5mM HEPES缓冲液(pH7.1)的250μl等分试样漂洗3次，进行1次脉冲超声处理，然后每次离心前进行快速漩涡混合。然后将粒子悬浮于最终体积250μl HEPES缓冲液中。将25μl粒子等分试样加到新鲜管中，以便随后连接DNA。为连接未包覆的DNA，将粒子进行脉冲超声处理，然后加入1μg的DNA(在5μl水中)，接着用Pipetteman上下吹吸几次进行混合，然后温育10分钟。将粒子稍作离心(即10秒钟)，去除上清液，然后加入60μl乙醇。将具有PEI沉淀的DNA-1的粒子在60μl乙醇中洗涤两次。将粒子离心，弃去上清液，然后将粒子重新悬浮于45μl水中。为连接第二DNA(DNA-2)，使用TFX-50进行沉淀。将45μl的粒子／DNA-1悬浮液稍作超声处理，然后加入5μl的100ng/μl DNA-2和2.5μl的TFX-50。将溶液置于旋转摇荡器上10分钟，在10,000g下离心1分钟。去除上清液，将粒子重新悬浮于60μl的乙醇中。将溶液点滴到巨载体(macrocarrier)上，使用用于PDS-1000的标准方案将其上依序连接了DNA-1和DNA-2的金粒子递送到10DAP Hi-II不成熟胚的小盾片细胞中。对于这个实验，DNA-1质粒含有UBI：：RFP：：pinII表达盒，DNA-2含有UBI：：CFP：：pinII表达盒。轰击后两天，观察到CFP和RFP荧光标记都有瞬时表达，因为在不成熟胚的表面上有许多红色和蓝色细胞。然后将胚放在非选择性培养基上，让其生长3个星期后对稳定集落进行打分。在这个3星期期间后，观察到10个多细胞的稳定表达的蓝色集落，相比之下只有一个红色集落。这证明PEI沉淀可用来有效引入DNA进行瞬时表达，同时大大减少PEI引入的DNA的整合，从而减少表达RFP的转基因事件的恢复。这样，PEI沉淀可用来递送BBM和／或WUS2的瞬时表达。
例如，首先使用PEI使粒子包覆上UBI：：BBM：：pinII，接着使用TFX-50包覆上UBI：：moPAT～YFP，然后轰击到不成熟胚的表面上的小盾片细胞中。PEI介导的沉淀可导致不成熟胚的表面上的瞬时表达细胞的频率高，而稳定转化株的恢复频率极低(相对于TFX-50方法)。因此，预期PEI沉淀的BBM盒可在经轰击的组织表面(即小盾片表面)上瞬时表达和刺激一阵胚发生生长，但这个质粒不会发生整合。从Ca++／金粒子释放的PAT-GFP质粒预期会发生整合并以会导致转基因事件的实质上改进的恢复的频率表达选择性标记。作为对照处理，将含有UBI：：GUS：：pinII(代替BBM)的PEI沉淀的粒子与PAT～GFP／Ca++粒子混合。将来自两个处理的不成熟胚移到含有3mg／l双丙氨膦的培养基上。6-8个星期后，预期在PEI／BBM处理中观察到的GFP+、双丙氨膦抗性愈伤组织的频率要比对照处理(PEI／GUS)高得多。
作为一个可供选择的方法，用PEI将BBM质粒沉淀到金粒子上，然后引入到不成熟胚的表面上的小盾片细胞中，随后BBM基因的瞬时表达引发胚发生生长的快速增殖。在这个诱导的生长期间，使用用于玉蜀黍的标准方法(参见实例1)，用农杆菌处理外植体，T-DNA递送到细胞中，引入转基因表达盒如UBI：：moPAT～GFPm：：pinII。在进行了共培养后，让外植体在正常生长培养基上恢复，然后移到含有3mg／l双丙氨膦的培养基上。6-8个星期后，预期在PEI／BBM处理中观察到的GFP+、双丙氨膦抗性愈伤组织的频率要比对照处理(PEI／GUS)高得多。
通过瞬时表达BBM和／或WUS2多核苷酸产物来“启动”愈伤组织生长可能是合宜的。这可通过递送BBM和WUS25′加帽的聚腺苷酸化RNA、含有BBM和WUS2DNA的表达盒或者BBM和／或WUS2蛋白来完成。所有这些分子可用生物射弹粒子枪来递送。例如，5′加帽的聚腺苷酸化BBM和／或WUS2RNA可容易地使用Ambion公司的mMessage mMachine试剂盒在体外制备。将RNA与含有目的多核苷酸和用于选择／筛选的标记如Ubi：：moPAT～GFPm：：PinII的DNA一起进行共递送。预期接受了RNA的细胞将立即开始更快速地分裂，并且这些细胞中有很大一部分将整合了该农艺基因。这些事件可进一步被确认为转基因克隆集落，因为它们也将表达PAT-GFP融合蛋白(从而将在适当的照明下显示绿色荧光)。然后可对从这些胚再生的植株筛选目的多核苷酸的存在。
虽然为了清楚地理解而已经通过举例说明和实例较详细地描述了本发明，但显然可以在权利要求书范围内实施一些改变和修改。
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Claims (79)

1.一种在植物中的复合转基因性状基因座，所述复合转基因性状基因座包含与目的多核苷酸遗传地连接的至少两个变更的靶序列，其中所述至少两个变更的靶序列中的每一个都来源于被双链断裂诱导剂识别和切割的相应靶序列。
2.根据权利要求1所述的复合转基因性状基因座，其中所述至少两个变更的靶序列具有选自以下的变更：(i)置换至少一个核苷酸，(ii)缺失至少一个核苷酸，(iii)插入至少一个核苷酸，和(iv)(i)-(iii)的任何组合。
3.根据权利要求1所述的复合转基因性状基因座，其中所述变更的靶序列中的至少一个包含重组DNA分子。
4.根据权利要求1所述的复合转基因性状基因座，其中所述至少两个变更的靶序列位于所述目的多核苷酸0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或最多21厘摩(cM)以内。
5.根据权利要求1所述的复合转基因性状基因座，其中所述目的多核苷酸选自转基因、天然基因和突变基因。
6.根据权利要求3所述的复合转基因性状基因座，其中所述重组DNA分子选自用于基因沉默的DNA、编码表型标记的DNA和编码提供农艺优势的蛋白质的DNA。
7.根据权利要求1所述的复合转基因性状基因座，其中所述靶序列中的至少一个选自SEQ ID NO：1、2、3和4。
8.根据权利要求1所述的复合转基因性状基因座，其中所述靶序列中的至少一个选自SEQ ID NO：5、6、7和8。
9.根据权利要求1所述的复合转基因性状基因座，其中所述靶序列中的至少一个选自SEQ ID NO：68、69、70、71、72、73、74、75、76和77。
10.根据权利要求1所述的复合转基因性状基因座，其中所述植物是单子叶植物或者双子叶植物。
11.根据权利要求10所述的复合转基因性状基因座，其中所述单子叶植物选自玉蜀黍、水稻、高粱、黑麦、大麦、小麦、小米、燕麦、甘蔗、草坪草或者柳枝稷。
12.根据权利要求10所述的复合转基因性状基因座，其中所述双子叶植物选自大豆、卡诺拉油菜、苜蓿、向日葵、棉花、烟草、花生、马铃薯、烟草、拟南芥或者红花。
13.根据权利要求10所述的复合转基因性状基因座，其中所述双子叶植物是大豆。
14.一种包含根据权利要求1所述的复合转基因性状基因座的植物或者种子。
15.一种用于在植物中产生在目的基因组区域中包含至少两个变更的靶序列的复合转基因性状基因座的方法，所述方法包括：
(a)选择植物中的基因组区域，其中所述基因组区域包含第一靶序列和第二靶序列；
(b)提供第一双链断裂诱导剂和第二双链断裂诱导剂，其中所述第一双链断裂诱导剂能够在包含所述第一靶序列的DNA中诱导第一双链断裂，并且其中所述第二双链断裂诱导剂能够在包含所述第二靶序列的DNA中诱导第二双链断裂；
(c)使至少一个植物细胞与所述第一双链断裂诱导剂接触；
(d)鉴定出来自(c)的在所述第一靶序列处包含第一变更的细胞；
(e)从(d)的所述细胞再生出第一能育植物，所述第一能育植物包含所述第一变更；
(f)使至少一个植物细胞与所述第二双链断裂诱导剂接触；
(g)鉴定出来自(f)的在所述第二靶序列处包含第二变更的细胞；
(h)从(g)的所述细胞再生出第二能育植物，所述第二能育植物包含所述第二变更；
(i)从(h)的所述第二能育植物获得能育子代植物，所述能育子代植物包含所述第一变更和所述第二变更，其中所述第一变更和所述第二变更物理连接在一起。
16.根据权利要求15所述的方法，其中(j)的所述能育子代植物是通过使所述第一能育植物和所述第二能育植物杂交而获得。
17.根据权利要求15所述的方法，其中(f)的所述植物是(e)的所述第一能育植物。
18.根据权利要求15所述的方法，其中步骤(c)和(f)中的至少一个步骤的所述细胞在所述目的基因组区域中包含另外的变更的靶序列。
19.根据权利要求15所述的方法，其中步骤(c)-(e)在进行步骤(f)-(h)之前、同时或者之后进行。
20.根据权利要求15所述的方法，其中所述第一变更和第二变更中的至少一个包含靶向突变。
21.根据权利要求15所述的方法，其中所述复合转基因性状基因座还在所述目的基因组区域中包含至少一个目的多核苷酸。
22.根据权利要求15所述的方法，其中所述靶序列中的至少一个选自SEQ ID NO：1、2、3和4。
23.根据权利要求15所述的方法，其中所述靶序列中的至少一个选自SEQ ID NO：5、6、7和8。
24.根据权利要求15所述的方法，其中所述靶序列中的至少一个选自SEQ ID NO：68、69、70、71、72、73、74、75、76和77。
25.根据权利要求15所述的方法，其中所述植物是大豆。
26.根据权利要求15所述的方法，其中所述植物是玉米。
27.根据权利要求21所述的方法，其中步骤(c)和(f)中的至少一个步骤的所述细胞包含所述至少一种目的多核苷酸。
28.根据权利要求21所述的方法，其中所述至少一种目的多核苷酸包含选自以下的成员：转基因、天然基因以及在其中作出靶向突变之前属天然基因的基因。
29.根据权利要求15或者21所述的方法，其中还使步骤(c)的所述细胞与包含第一目的DNA序列的第一DNA分子接触。
30.根据权利要求29所述的方法，其中所述第一变更包含所述第一目的DNA序列或其部分向所述第一靶序列中的插入。
31.根据权利要求29所述的方法，其中所述第一目的DNA序列选自：用于基因沉默的DNA、编码表型标记的DNA和编码提供农艺优势的蛋白质的DNA。
32.根据权利要求15或者21所述的方法，其中还将步骤(f)的所述细胞与包含第二目的DNA序列的第二DNA分子接触。
33.根据权利要求32所述的方法，其中所述第二变更包含所述第二目的DNA序列或其部分向所述第二靶序列中的插入。
34.根据权利要求32所述的方法，其中所述第二目的DNA序列选自：用于基因沉默的DNA、编码表型标记的DNA和编码提供农艺优势的蛋白质的DNA。
35.根据权利要求15所述的方法，其中所述第一变更、所述第二变更或者两者通过在所述细胞中的同源重组产生。
36.根据权利要求15所述的方法，其中所述第一靶序列和所述第二靶序列在所述植物的基因组中彼此相隔约0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8.、0.9、1、2、3、4或5厘摩(cM)。
37.根据权利要求15所述的方法，其中所述复合转基因性状基因座在所述目的基因组区域中还包含一个、两个、三个或者更多个另外的目的靶序列，其中每个另外的靶序列可被双链断裂诱导剂识别和切割。
38.根据权利要求37所述的方法，其中将第三目的DNA序列插入到第三靶序列中，包括使植物的至少一个细胞与第三双链断裂诱导剂和包含所述第三目的DNA序列的第三DNA分子接触，并鉴定出包含所述第三目的DNA序列的细胞。
39.根据权利要求38所述的方法，还包括再生出包含所述第三目的DNA序列的能育植物。
40.根据权利要求38所述的方法，其中所述包含所述第三目的DNA序列的细胞包含所述第一变更、所述第二变更或者所述第一变更和所述第二变更两者。
41.根据权利要求38-40中任一项所述的方法，还包括产生出包含所述第一变更、所述第二变更和所述第三目的DNA序列的能育植物，其中所述第一变更、所述第二变更和所述第三目的DNA序列物理连接在一起。
42.根据权利要求41所述的方法，其中所述包含所述第一变更、所述第二变更和所述第三目的DNA序列的能育植物如下产生：使所述包含所述第一变更和第二变更的能育植物与包含所述第三目的DNA序列的第二能育植物杂交，并从所述杂交选择出能育子代植物，所述能育子代植物包含所述第一变更、所述第二变更和所述第三目的DNA序列。
43.根据权利要求41所述的方法，其中所述包含所述第一变更、所述第二变更和所述第三目的DNA序列的能育植物如下产生：
(i)使包含所述第一变更和所述第二变更的细胞与所述第三双链断裂诱导剂接触；
(ii)鉴定出来自(i)的包含所述第三目的DNA序列的细胞，其中所述细胞包含所述第一变更和所述第二变更，并且所述第一变更、所述第二变更和所述第三目的DNA序列物理连接在一起；以及
(iii)再生出包含物理连接在一起的所述第一变更、所述第二变更和所述第三目的DNA序列的能育植物。
44.根据权利要求15所述的方法，其中所述双链断裂诱导剂是内切核酸酶、锌指核酸酶或者TAL效应物核酸酶。
45.根据权利要求44所述的方法，其中所述内切核酸酶被修饰成在所述第一靶序列处或者在所述第二靶序列处特异性切割，其中所述经修饰的内切核酸酶不再在其野生型内切核酸酶靶序列处切割。
46.根据权利要求15所述的方法，其中所述第一靶序列和所述第二靶序列中的至少一者是人工靶序列。
47.根据权利要求15所述的方法，其中所述植物是单子叶植物或者双子叶植物。
48.根据权利要求47所述的方法，其中所述单子叶植物选自玉蜀黍、水稻、高粱、黑麦、大麦、小麦、小米、燕麦、甘蔗、草坪草或者柳枝稷。
49.根据权利要求47所述的方法，其中所述双子叶植物选自大豆、卡诺拉油菜、苜蓿、向日葵、棉花、烟草、花生、马铃薯、烟草、拟南芥或者红花。
50.根据权利要求47所述的方法，其中所述双子叶植物是大豆。
51.一种包含根据权利要求15所述的复合转基因性状基因座的植物或者种子。
52.一种用于在植物中产生在目的基因组区域中包含至少两个变更的靶序列的复合转基因性状基因座的方法，所述方法包括：
(a)获得在目的基因组区域处包含第一变更的靶序列的第一能育植物，其中所述第一变更的靶序列来源于被第一双链断裂诱导剂识别和切割的第一靶序列；
(b)获得在目的基因组区域处包含第二变更的靶序列的第二能育植物，其中所述第二变更的靶序列来源于被第二双链断裂诱导剂识别和切割的第二靶序列；
(c)使所述第一能育植物和所述第二能育植物杂交；
(d)从(c)的所述杂交选择出能育子代植物，所述能育子代植物包含所述第一变更和所述第二变更，其中所述第一变更和所述第二变更物理连接在一起。
53.根据权利要求52所述的方法，还包括：
(e)使(d)的所述能育子代植物与另外的能育植物杂交，其中所述另外的能育植物在所述目的基因组区域中包含至少第三变更的靶序列，其中所述第三变更的靶序列来源于被第三双链断裂诱导剂识别和切割的第三靶序列；
(f)从(e)的所述杂交选择出能育子代植物，所述能育子代植物包含所述第一变更、所述第二变更和所述至少第三变更，其中所述第一变更、所述第二变更和所述至少第三变更物理连接在一起。
54.根据权利要求52所述的方法，其中所述植物是单子叶植物或者双子叶植物。
55.一种包含根据权利要求52所述的复合转基因性状基因座的植物或者种子。
56.一种包含表达构建体的植物，所述表达构建体包含与编码内切核酸酶的核苷酸序列可操作连接的启动子，其中所述内切核酸酶能够特异性结合选自SEQ ID NO：1、2、3、4、5、6、7、8、68、69、70、71、72、73、74、75、76和77的靶序列并在所述靶序列中产生双链断裂，并且其中所述启动子能够驱动可操作连接的核苷酸序列在植物细胞中的表达。
57.根据权利要求56所述的植物，其中所述核苷酸序列包含内切核酸酶的DNA结合域的编码序列，并且其中所述编码序列选自：
(a)SEQ ID NO：9、10、11、12、13、14、15、16或者80的核苷酸100-261和核苷酸850-1011；
(b)SEQ ID NO：78、79、81、82或者83的核苷酸100-261和核苷酸661-822；以及
(c)(a)或者(b)的简并编码序列。
58.根据权利要求56所述的植物，其中所述核苷酸序列选自SEQ IDNO：9、10、11、12、13、14、15、16、78、79、80、81、82和83。
59.一种表达构建体，所述表达构建体包含与选自SEQ ID NO：9、10、11、12、13、14、15、16、78、79、80、81、82和83的核苷酸序列可操作连接的启动子。
60.一种包含至少一个变更的靶序列的植物，其中所述至少一个变更的靶序列来源于被双链断裂诱导剂识别和切割的相应的靶序列，并且其中所述至少一个变更的靶序列在这样的目的基因组区域中，所述目的基因组区域：
(a)从SEQ ID NO：4所示的靶序列延伸到SEQ ID NO：2所示的靶序列；或者
(b)从SEQ ID NO：5所示的靶序列延伸到SEQ ID NO：8所示的靶序列；或者
(c)从SEQ ID NO：68所示的靶序列延伸到SEQ ID NO：77所示的靶序列。
61.根据权利要求60所述的植物，其中所述至少一个变更的靶序列具有选自以下的变更：(i)置换至少一个核苷酸，(ii)缺失至少一个核苷酸，(iii)插入至少一个核苷酸，和(iv)(i)-(iii)的任何组合。
62.根据权利要求60所述的植物，其中所述至少一个变更的靶序列包含重组DNA分子。
63.根据权利要求60所述的植物，其中所述植物包含至少两个变更的靶序列，其中所述变更的靶序列中的每一个来源于被双链断裂诱导剂识别和切割的相应的靶序列，并且其中所述相应的靶序列选自SEQID NO：1、2、3、4、5、6、7、8、68、69、70、71、72、73、74、75、76和77。
64.根据权利要求63所述的植物，其中所述植物包含第一变更的靶序列和第二变更的靶序列，并且其中所述相应的靶序列选自SEQ ID NO：1、2、3和4。
65.根据权利要求63所述的植物，其中所述植物包含第一变更的靶序列和第二变更的靶序列，并且其中所述相应的靶序列选自SEQ ID NO：5、6、7和8。
66.根据权利要求63所述的植物，其中所述植物包含第一变更的靶序列和第二变更的靶序列，并且其中所述相应的靶序列选自SEQ ID NO：68、69、70、71、72、73、74、75、76和77。
67.一种包含至少一个变更的靶序列的植物，其中所述植物通过包括以下步骤的方法产生：
(a)提供至少一种能够在包含靶序列的DNA中诱导双链断裂的双链断裂诱导剂，其中所述靶序列在这样的目的基因组区域中，所述目的基因组区域：
(i)从SEQ ID NO：4所示的靶序列延伸到SEQ ID NO：2所示的靶序列，
(ii)从SEQ ID NO：5所示的靶序列延伸到SEQ ID NO：8所示的靶序列；或者
(iii)从SEQ ID NO：68所示的靶序列延伸到SEQ ID NO：77所示的靶序列；
(b)使至少一个植物细胞与所述双链断裂诱导剂接触；
(c)鉴定出来自(b)的在所述靶序列处包含变更的细胞；以及
(d)从(c)的所述细胞再生出能育植物，所述能育植物包含所述变更。
68.根据权利要求67所述的植物，其中所述至少一个变更的靶序列具有选自以下的变更：(i)置换至少一个核苷酸，(ii)缺失至少一个核苷酸，(iii)插入至少一个核苷酸，和(iv)(i)-(iii)的任何组合。
69.根据权利要求67所述的植物，其中所述至少一个变更的靶序列包含重组DNA分子。
70.根据权利要求67所述的植物，其中所述被变更的相应的靶序列选自SEQ ID NO：1、2、3、4、5、6、7、8、68、69、70、71、72、73、74、75、76和77。
71.根据权利要求67所述的植物，其中所述植物包含至少两个变更的靶序列，其中所述变更的靶序列中的每一个通过包括步骤(a)-(d)的方法在所述植物中产生。
72.根据权利要求71所述的植物，其中所述植物包含第一变更的靶序列和第二变更的靶序列，并且其中所述被变更的相应的靶序列选自SEQ ID NO：1、2、3和4。
73.根据权利要求71所述的植物，其中所述植物包含第一变更的靶序列和第二变更的靶序列，并且其中所述被变更的相应的靶序列选自SEQ ID NO：5、6、7和8。
74.根据权利要求71所述的植物，其中所述植物包含第一变更的靶序列和第二变更的靶序列，并且其中所述被变更的相应的靶序列选自SEQ ID NO：68、69、70、71、72、73、74、75、76和77。
75.根据权利要求67所述的植物，其中所述双链断裂诱导剂是内切核酸酶、锌指核酸酶或者TAL效应物核酸酶。
76.根据权利要求75所述的方法，其中所述内切核酸酶被修饰成在所述第一靶序列处或者在所述第二靶序列处特异性切割，其中所述经修饰的内切核酸酶不再在其野生型内切核酸酶靶序列处切割。
77.根据权利要求67所述的植物，其中所述双链断裂诱导剂能够结合选自SEQ ID NO：1、2、3、4、5、6、7、8、68、69、70、71、72、73、74、75、76和77的靶位点并在所述靶位点中产生双链断裂。
78.根据权利要求77所述的植物，其中所述双链断裂诱导剂由包含内切核酸酶的DNA结合域的编码序列的核苷酸序列编码，并且其中所述编码序列选自：
(iv)SEQ ID NO：9、10、11、12、13、14、15、16或者80的核苷酸100-261和核苷酸850-1011；
(v)SEQ ID NO：78、79、81、82或者83的核苷酸100-261和核苷酸661-822；以及
(vi)(iv)或者(v)的简并编码序列。
79.根据权利要求77所述的植物，其中所述双链断裂诱导剂由选自SEQID NO：9、10、11、12、13、14、15、16、78、79、80、81、82和83的核苷酸序列编码。
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