RU2687369C2 - Универсальная донорная система для направленного воздействия на гены - Google Patents
Универсальная донорная система для направленного воздействия на гены Download PDFInfo
- Publication number
- RU2687369C2 RU2687369C2 RU2016122038A RU2016122038A RU2687369C2 RU 2687369 C2 RU2687369 C2 RU 2687369C2 RU 2016122038 A RU2016122038 A RU 2016122038A RU 2016122038 A RU2016122038 A RU 2016122038A RU 2687369 C2 RU2687369 C2 RU 2687369C2
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- sequence
- seq
- gene
- plant
- dna
- Prior art date
Links
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 title claims abstract description 263
- 230000009471 action Effects 0.000 title description 3
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 claims abstract description 200
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 claims abstract description 200
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 claims abstract description 199
- 230000027455 binding Effects 0.000 claims abstract description 114
- 101710163270 Nuclease Proteins 0.000 claims abstract description 98
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 claims abstract description 82
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 claims abstract description 79
- 230000009466 transformation Effects 0.000 claims abstract description 46
- 230000009261 transgenic effect Effects 0.000 claims abstract description 37
- HCHKCACWOHOZIP-UHFFFAOYSA-N Zinc Chemical compound [Zn] HCHKCACWOHOZIP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 82
- 229910052725 zinc Inorganic materials 0.000 claims description 82
- 239000011701 zinc Substances 0.000 claims description 82
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims description 77
- 108700019146 Transgenes Proteins 0.000 claims description 44
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 claims description 24
- 238000003556 assay Methods 0.000 claims description 12
- 108700008625 Reporter Genes Proteins 0.000 claims description 10
- 239000005562 Glyphosate Substances 0.000 claims description 7
- 229940097068 glyphosate Drugs 0.000 claims description 7
- XDDAORKBJWWYJS-UHFFFAOYSA-N glyphosate Chemical compound OC(=O)CNCP(O)(O)=O XDDAORKBJWWYJS-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- 229930027917 kanamycin Natural products 0.000 claims description 6
- 229960000318 kanamycin Drugs 0.000 claims description 6
- SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N kanamycin Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CN)O[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N 0.000 claims description 6
- 229930182823 kanamycin A Natural products 0.000 claims description 6
- 101150113864 pat gene Proteins 0.000 claims description 5
- 101100442689 Caenorhabditis elegans hdl-1 gene Proteins 0.000 claims description 4
- 101150054900 gus gene Proteins 0.000 claims description 3
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 abstract description 72
- 238000003780 insertion Methods 0.000 abstract description 41
- 230000037431 insertion Effects 0.000 abstract description 41
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 31
- 230000010354 integration Effects 0.000 abstract description 7
- 238000012216 screening Methods 0.000 abstract description 3
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract description 3
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 297
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 156
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 146
- 238000000034 method Methods 0.000 description 102
- 108010017070 Zinc Finger Nucleases Proteins 0.000 description 94
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 88
- 240000008042 Zea mays Species 0.000 description 87
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 72
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 72
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 70
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 59
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 59
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 58
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 57
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 56
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 55
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 52
- 235000007244 Zea mays Nutrition 0.000 description 51
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 49
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 47
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 47
- 230000004568 DNA-binding Effects 0.000 description 42
- 210000001938 protoplast Anatomy 0.000 description 41
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 38
- 235000002017 Zea mays subsp mays Nutrition 0.000 description 35
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 33
- OPTASPLRGRRNAP-UHFFFAOYSA-N cytosine Chemical compound NC=1C=CNC(=O)N=1 OPTASPLRGRRNAP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 33
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 33
- 235000016383 Zea mays subsp huehuetenangensis Nutrition 0.000 description 30
- 235000009973 maize Nutrition 0.000 description 30
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 30
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 28
- UYTPUPDQBNUYGX-UHFFFAOYSA-N guanine Chemical compound O=C1NC(N)=NC2=C1N=CN2 UYTPUPDQBNUYGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 28
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 27
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 27
- 239000000047 product Substances 0.000 description 27
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 27
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 26
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 21
- 239000004009 herbicide Substances 0.000 description 21
- 238000002844 melting Methods 0.000 description 21
- 230000008018 melting Effects 0.000 description 21
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 20
- 239000013600 plasmid vector Substances 0.000 description 20
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 20
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 description 19
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 description 19
- 230000008685 targeting Effects 0.000 description 19
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 18
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 17
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 17
- 229940104302 cytosine Drugs 0.000 description 16
- 244000061176 Nicotiana tabacum Species 0.000 description 15
- 235000002637 Nicotiana tabacum Nutrition 0.000 description 15
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 15
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 15
- 102000014914 Carrier Proteins Human genes 0.000 description 14
- ZHNUHDYFZUAESO-UHFFFAOYSA-N Formamide Chemical compound NC=O ZHNUHDYFZUAESO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 14
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 14
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 14
- 108091008324 binding proteins Proteins 0.000 description 14
- 230000011559 double-strand break repair via nonhomologous end joining Effects 0.000 description 14
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 14
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 13
- 108010042407 Endonucleases Proteins 0.000 description 13
- 102000004533 Endonucleases Human genes 0.000 description 13
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 13
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 13
- 238000007857 nested PCR Methods 0.000 description 13
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 13
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 13
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 13
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 13
- 241000238631 Hexapoda Species 0.000 description 12
- 240000007594 Oryza sativa Species 0.000 description 12
- 230000008859 change Effects 0.000 description 12
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 12
- 230000006870 function Effects 0.000 description 12
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 12
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 11
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 11
- 230000002363 herbicidal effect Effects 0.000 description 11
- 238000005215 recombination Methods 0.000 description 11
- 230000006798 recombination Effects 0.000 description 11
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 11
- 235000007164 Oryza sativa Nutrition 0.000 description 10
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 10
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 10
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 description 10
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 10
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 10
- 238000011069 regeneration method Methods 0.000 description 10
- 108010073062 Transcription Activator-Like Effectors Proteins 0.000 description 9
- 238000002744 homologous recombination Methods 0.000 description 9
- 230000006801 homologous recombination Effects 0.000 description 9
- 230000008569 process Effects 0.000 description 9
- 230000001131 transforming effect Effects 0.000 description 9
- 241000589155 Agrobacterium tumefaciens Species 0.000 description 8
- 108091079001 CRISPR RNA Proteins 0.000 description 8
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 description 8
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 8
- 238000011161 development Methods 0.000 description 8
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 8
- 238000002866 fluorescence resonance energy transfer Methods 0.000 description 8
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 8
- 235000009566 rice Nutrition 0.000 description 8
- 108091093088 Amplicon Proteins 0.000 description 7
- WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N Glutamic acid Natural products OC(=O)C(N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 241000209140 Triticum Species 0.000 description 7
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 7
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 7
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 7
- 238000013461 design Methods 0.000 description 7
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 7
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 7
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 7
- 230000008929 regeneration Effects 0.000 description 7
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 7
- 230000003007 single stranded DNA break Effects 0.000 description 7
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 7
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 6
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 6
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 description 6
- DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M Sodium laurylsulphate Chemical compound [Na+].CCCCCCCCCCCCOS([O-])(=O)=O DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 6
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 6
- -1 but not limited to Chemical class 0.000 description 6
- 239000000539 dimer Substances 0.000 description 6
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 6
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 6
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 6
- 230000001965 increasing effect Effects 0.000 description 6
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 6
- 230000000670 limiting effect Effects 0.000 description 6
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 6
- 239000011859 microparticle Substances 0.000 description 6
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 description 6
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 description 6
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 6
- 230000008439 repair process Effects 0.000 description 6
- 238000011426 transformation method Methods 0.000 description 6
- 241000589158 Agrobacterium Species 0.000 description 5
- 240000002791 Brassica napus Species 0.000 description 5
- 244000068988 Glycine max Species 0.000 description 5
- 244000020551 Helianthus annuus Species 0.000 description 5
- 235000003222 Helianthus annuus Nutrition 0.000 description 5
- 240000005979 Hordeum vulgare Species 0.000 description 5
- 235000007340 Hordeum vulgare Nutrition 0.000 description 5
- 241000227653 Lycopersicon Species 0.000 description 5
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 5
- 241000723873 Tobacco mosaic virus Species 0.000 description 5
- 235000021307 Triticum Nutrition 0.000 description 5
- 241000589634 Xanthomonas Species 0.000 description 5
- 235000005824 Zea mays ssp. parviglumis Nutrition 0.000 description 5
- 150000007513 acids Chemical class 0.000 description 5
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 5
- 210000002421 cell wall Anatomy 0.000 description 5
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 5
- 235000005822 corn Nutrition 0.000 description 5
- 238000006471 dimerization reaction Methods 0.000 description 5
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 5
- 239000000411 inducer Substances 0.000 description 5
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 5
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 5
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 5
- 230000000306 recurrent effect Effects 0.000 description 5
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 5
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 5
- 238000011282 treatment Methods 0.000 description 5
- 238000010200 validation analysis Methods 0.000 description 5
- 239000005631 2,4-Dichlorophenoxyacetic acid Substances 0.000 description 4
- KDCGOANMDULRCW-UHFFFAOYSA-N 7H-purine Chemical compound N1=CNC2=NC=NC2=C1 KDCGOANMDULRCW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 241000589156 Agrobacterium rhizogenes Species 0.000 description 4
- 108020004774 Alkaline Phosphatase Proteins 0.000 description 4
- 102000002260 Alkaline Phosphatase Human genes 0.000 description 4
- 235000004977 Brassica sinapistrum Nutrition 0.000 description 4
- 108091033409 CRISPR Proteins 0.000 description 4
- FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N D-Mannitol Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N 0.000 description 4
- 241000710188 Encephalomyocarditis virus Species 0.000 description 4
- 101710186901 Globulin 1 Proteins 0.000 description 4
- 241000219146 Gossypium Species 0.000 description 4
- NYHBQMYGNKIUIF-UUOKFMHZSA-N Guanosine Chemical compound C1=NC=2C(=O)NC(N)=NC=2N1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@H]1O NYHBQMYGNKIUIF-UUOKFMHZSA-N 0.000 description 4
- 206010020649 Hyperkeratosis Diseases 0.000 description 4
- IMQLKJBTEOYOSI-GPIVLXJGSA-N Inositol-hexakisphosphate Chemical compound OP(O)(=O)O[C@H]1[C@H](OP(O)(O)=O)[C@@H](OP(O)(O)=O)[C@H](OP(O)(O)=O)[C@H](OP(O)(O)=O)[C@@H]1OP(O)(O)=O IMQLKJBTEOYOSI-GPIVLXJGSA-N 0.000 description 4
- 235000007688 Lycopersicon esculentum Nutrition 0.000 description 4
- 229930195725 Mannitol Natural products 0.000 description 4
- 235000010627 Phaseolus vulgaris Nutrition 0.000 description 4
- 244000046052 Phaseolus vulgaris Species 0.000 description 4
- 241000592344 Spermatophyta Species 0.000 description 4
- 241000607479 Yersinia pestis Species 0.000 description 4
- 229920002494 Zein Polymers 0.000 description 4
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 4
- 230000000692 anti-sense effect Effects 0.000 description 4
- 238000009395 breeding Methods 0.000 description 4
- 238000004422 calculation algorithm Methods 0.000 description 4
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 4
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 4
- 210000003483 chromatin Anatomy 0.000 description 4
- 235000013399 edible fruits Nutrition 0.000 description 4
- 230000009368 gene silencing by RNA Effects 0.000 description 4
- 238000010348 incorporation Methods 0.000 description 4
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 4
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 4
- 239000000594 mannitol Substances 0.000 description 4
- 235000010355 mannitol Nutrition 0.000 description 4
- 238000000520 microinjection Methods 0.000 description 4
- 244000052769 pathogen Species 0.000 description 4
- 235000002949 phytic acid Nutrition 0.000 description 4
- 238000003976 plant breeding Methods 0.000 description 4
- 238000004153 renaturation Methods 0.000 description 4
- 230000008263 repair mechanism Effects 0.000 description 4
- 230000004044 response Effects 0.000 description 4
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 4
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 4
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 4
- 230000002123 temporal effect Effects 0.000 description 4
- RWQNBRDOKXIBIV-UHFFFAOYSA-N thymine Chemical compound CC1=CNC(=O)NC1=O RWQNBRDOKXIBIV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 description 4
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 description 4
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 4
- 229940093612 zein Drugs 0.000 description 4
- 239000005019 zein Substances 0.000 description 4
- IAJOBQBIJHVGMQ-UHFFFAOYSA-N 2-amino-4-[hydroxy(methyl)phosphoryl]butanoic acid Chemical compound CP(O)(=O)CCC(N)C(O)=O IAJOBQBIJHVGMQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- KKADPXVIOXHVKN-UHFFFAOYSA-N 4-hydroxyphenylpyruvic acid Chemical compound OC(=O)C(=O)CC1=CC=C(O)C=C1 KKADPXVIOXHVKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 229930024421 Adenine Natural products 0.000 description 3
- GFFGJBXGBJISGV-UHFFFAOYSA-N Adenine Chemical compound NC1=NC=NC2=C1N=CN2 GFFGJBXGBJISGV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 241000724328 Alfalfa mosaic virus Species 0.000 description 3
- 241000219195 Arabidopsis thaliana Species 0.000 description 3
- 108090001008 Avidin Proteins 0.000 description 3
- 240000007124 Brassica oleracea Species 0.000 description 3
- 235000003255 Carthamus tinctorius Nutrition 0.000 description 3
- 244000020518 Carthamus tinctorius Species 0.000 description 3
- 108010022172 Chitinases Proteins 0.000 description 3
- 102000012286 Chitinases Human genes 0.000 description 3
- 108010077544 Chromatin Proteins 0.000 description 3
- 230000007018 DNA scission Effects 0.000 description 3
- 102000052510 DNA-Binding Proteins Human genes 0.000 description 3
- AOJJSUZBOXZQNB-TZSSRYMLSA-N Doxorubicin Chemical compound O([C@H]1C[C@@](O)(CC=2C(O)=C3C(=O)C=4C=CC=C(C=4C(=O)C3=C(O)C=21)OC)C(=O)CO)[C@H]1C[C@H](N)[C@H](O)[C@H](C)O1 AOJJSUZBOXZQNB-TZSSRYMLSA-N 0.000 description 3
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 3
- 239000005561 Glufosinate Substances 0.000 description 3
- 235000010469 Glycine max Nutrition 0.000 description 3
- 108010033040 Histones Proteins 0.000 description 3
- 108091092195 Intron Proteins 0.000 description 3
- 108700026244 Open Reading Frames Proteins 0.000 description 3
- 241000219843 Pisum Species 0.000 description 3
- 108091030071 RNAI Proteins 0.000 description 3
- 241000589771 Ralstonia solanacearum Species 0.000 description 3
- 238000012300 Sequence Analysis Methods 0.000 description 3
- 244000062793 Sorghum vulgare Species 0.000 description 3
- 108091028113 Trans-activating crRNA Proteins 0.000 description 3
- 101710185494 Zinc finger protein Proteins 0.000 description 3
- 102100023597 Zinc finger protein 816 Human genes 0.000 description 3
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 description 3
- 108020002494 acetyltransferase Proteins 0.000 description 3
- 229960000643 adenine Drugs 0.000 description 3
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 3
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 3
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 3
- 244000052616 bacterial pathogen Species 0.000 description 3
- JFDZBHWFFUWGJE-UHFFFAOYSA-N benzonitrile Chemical compound N#CC1=CC=CC=C1 JFDZBHWFFUWGJE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 244000275904 brauner Senf Species 0.000 description 3
- 230000001488 breeding effect Effects 0.000 description 3
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 3
- 229960005091 chloramphenicol Drugs 0.000 description 3
- WIIZWVCIJKGZOK-RKDXNWHRSA-N chloramphenicol Chemical compound ClC(Cl)C(=O)N[C@H](CO)[C@H](O)C1=CC=C([N+]([O-])=O)C=C1 WIIZWVCIJKGZOK-RKDXNWHRSA-N 0.000 description 3
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 3
- 239000013078 crystal Substances 0.000 description 3
- 239000005547 deoxyribonucleotide Substances 0.000 description 3
- 125000002637 deoxyribonucleotide group Chemical group 0.000 description 3
- 239000012636 effector Substances 0.000 description 3
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 3
- 235000004426 flaxseed Nutrition 0.000 description 3
- 230000002538 fungal effect Effects 0.000 description 3
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 3
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 3
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 3
- 230000011987 methylation Effects 0.000 description 3
- 238000007069 methylation reaction Methods 0.000 description 3
- 238000002703 mutagenesis Methods 0.000 description 3
- 231100000350 mutagenesis Toxicity 0.000 description 3
- 235000016709 nutrition Nutrition 0.000 description 3
- 230000036961 partial effect Effects 0.000 description 3
- 230000037039 plant physiology Effects 0.000 description 3
- 210000002706 plastid Anatomy 0.000 description 3
- 101150075980 psbA gene Proteins 0.000 description 3
- 238000010791 quenching Methods 0.000 description 3
- 230000000171 quenching effect Effects 0.000 description 3
- 230000001172 regenerating effect Effects 0.000 description 3
- 238000011160 research Methods 0.000 description 3
- HBMJWWWQQXIZIP-UHFFFAOYSA-N silicon carbide Chemical compound [Si+]#[C-] HBMJWWWQQXIZIP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 229910010271 silicon carbide Inorganic materials 0.000 description 3
- 241000894007 species Species 0.000 description 3
- 229960000268 spectinomycin Drugs 0.000 description 3
- UNFWWIHTNXNPBV-WXKVUWSESA-N spectinomycin Chemical compound O([C@@H]1[C@@H](NC)[C@@H](O)[C@H]([C@@H]([C@H]1O1)O)NC)[C@]2(O)[C@H]1O[C@H](C)CC2=O UNFWWIHTNXNPBV-WXKVUWSESA-N 0.000 description 3
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- LWTDZKXXJRRKDG-KXBFYZLASA-N (-)-phaseollin Chemical compound C1OC2=CC(O)=CC=C2[C@H]2[C@@H]1C1=CC=C3OC(C)(C)C=CC3=C1O2 LWTDZKXXJRRKDG-KXBFYZLASA-N 0.000 description 2
- MJYQFWSXKFLTAY-OVEQLNGDSA-N (2r,3r)-2,3-bis[(4-hydroxy-3-methoxyphenyl)methyl]butane-1,4-diol;(2r,3r,4s,5s,6r)-6-(hydroxymethyl)oxane-2,3,4,5-tetrol Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O.C1=C(O)C(OC)=CC(C[C@@H](CO)[C@H](CO)CC=2C=C(OC)C(O)=CC=2)=C1 MJYQFWSXKFLTAY-OVEQLNGDSA-N 0.000 description 2
- 102000040650 (ribonucleotides)n+m Human genes 0.000 description 2
- HXKWSTRRCHTUEC-UHFFFAOYSA-N 2,4-Dichlorophenoxyaceticacid Chemical compound OC(=O)C(Cl)OC1=CC=C(Cl)C=C1 HXKWSTRRCHTUEC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- ZTTKDUXKVPEXCG-UHFFFAOYSA-N 2-cyano-3-cyclopropyl-1-(2-mesyl-4-trifluoromethylphenyl)propan-1,3-dione Chemical compound CS(=O)(=O)C1=CC(C(F)(F)F)=CC=C1C(=O)C(C#N)C(=O)C1CC1 ZTTKDUXKVPEXCG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- QUTYKIXIUDQOLK-PRJMDXOYSA-N 5-O-(1-carboxyvinyl)-3-phosphoshikimic acid Chemical compound O[C@H]1[C@H](OC(=C)C(O)=O)CC(C(O)=O)=C[C@H]1OP(O)(O)=O QUTYKIXIUDQOLK-PRJMDXOYSA-N 0.000 description 2
- 108010011619 6-Phytase Proteins 0.000 description 2
- 108700028369 Alleles Proteins 0.000 description 2
- 102000000383 Alpha-Ketoglutarate-Dependent Dioxygenase FTO Human genes 0.000 description 2
- 108010016119 Alpha-Ketoglutarate-Dependent Dioxygenase FTO Proteins 0.000 description 2
- 108020005544 Antisense RNA Proteins 0.000 description 2
- 241000219194 Arabidopsis Species 0.000 description 2
- 244000105624 Arachis hypogaea Species 0.000 description 2
- KHBQMWCZKVMBLN-UHFFFAOYSA-N Benzenesulfonamide Chemical compound NS(=O)(=O)C1=CC=CC=C1 KHBQMWCZKVMBLN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000219310 Beta vulgaris subsp. vulgaris Species 0.000 description 2
- 241000219198 Brassica Species 0.000 description 2
- 235000005156 Brassica carinata Nutrition 0.000 description 2
- 244000257790 Brassica carinata Species 0.000 description 2
- 244000178993 Brassica juncea Species 0.000 description 2
- 235000014698 Brassica juncea var multisecta Nutrition 0.000 description 2
- 235000011293 Brassica napus Nutrition 0.000 description 2
- 235000003899 Brassica oleracea var acephala Nutrition 0.000 description 2
- 235000011301 Brassica oleracea var capitata Nutrition 0.000 description 2
- 235000001169 Brassica oleracea var oleracea Nutrition 0.000 description 2
- 102000000584 Calmodulin Human genes 0.000 description 2
- 108010041952 Calmodulin Proteins 0.000 description 2
- 241001515826 Cassava vein mosaic virus Species 0.000 description 2
- 244000018436 Coriandrum sativum Species 0.000 description 2
- 235000002787 Coriandrum sativum Nutrition 0.000 description 2
- 229920000742 Cotton Polymers 0.000 description 2
- MIKUYHXYGGJMLM-GIMIYPNGSA-N Crotonoside Natural products C1=NC2=C(N)NC(=O)N=C2N1[C@H]1O[C@@H](CO)[C@H](O)[C@@H]1O MIKUYHXYGGJMLM-GIMIYPNGSA-N 0.000 description 2
- 241000219122 Cucurbita Species 0.000 description 2
- NYHBQMYGNKIUIF-UHFFFAOYSA-N D-guanosine Natural products C1=2NC(N)=NC(=O)C=2N=CN1C1OC(CO)C(O)C1O NYHBQMYGNKIUIF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000007067 DNA methylation Effects 0.000 description 2
- 108700020911 DNA-Binding Proteins Proteins 0.000 description 2
- IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N Dimethylsulphoxide Chemical compound CS(C)=O IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 206010013883 Dwarfism Diseases 0.000 description 2
- 238000012286 ELISA Assay Methods 0.000 description 2
- 101000889905 Enterobacteria phage RB3 Intron-associated endonuclease 3 Proteins 0.000 description 2
- 101000889904 Enterobacteria phage T4 Defective intron-associated endonuclease 3 Proteins 0.000 description 2
- 101000889899 Enterobacteria phage T4 Intron-associated endonuclease 2 Proteins 0.000 description 2
- 101710091045 Envelope protein Proteins 0.000 description 2
- 108010060309 Glucuronidase Proteins 0.000 description 2
- 102000053187 Glucuronidase Human genes 0.000 description 2
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 235000009438 Gossypium Nutrition 0.000 description 2
- 235000004341 Gossypium herbaceum Nutrition 0.000 description 2
- 240000002024 Gossypium herbaceum Species 0.000 description 2
- 108010043121 Green Fluorescent Proteins Proteins 0.000 description 2
- 102000004144 Green Fluorescent Proteins Human genes 0.000 description 2
- 102100033636 Histone H3.2 Human genes 0.000 description 2
- 102000004157 Hydrolases Human genes 0.000 description 2
- 108090000604 Hydrolases Proteins 0.000 description 2
- 102000006496 Immunoglobulin Heavy Chains Human genes 0.000 description 2
- 108010019476 Immunoglobulin Heavy Chains Proteins 0.000 description 2
- SIKJAQJRHWYJAI-UHFFFAOYSA-N Indole Chemical compound C1=CC=C2NC=CC2=C1 SIKJAQJRHWYJAI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108700005090 Lethal Genes Proteins 0.000 description 2
- 235000004431 Linum usitatissimum Nutrition 0.000 description 2
- 240000006240 Linum usitatissimum Species 0.000 description 2
- 108060001084 Luciferase Proteins 0.000 description 2
- 239000005089 Luciferase Substances 0.000 description 2
- 241000710118 Maize chlorotic mottle virus Species 0.000 description 2
- 241000723994 Maize dwarf mosaic virus Species 0.000 description 2
- WSMYVTOQOOLQHP-UHFFFAOYSA-N Malondialdehyde Chemical compound O=CCC=O WSMYVTOQOOLQHP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000220225 Malus Species 0.000 description 2
- 240000003183 Manihot esculenta Species 0.000 description 2
- 241000219823 Medicago Species 0.000 description 2
- 235000017587 Medicago sativa ssp. sativa Nutrition 0.000 description 2
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 2
- 108010033272 Nitrilase Proteins 0.000 description 2
- 108091092724 Noncoding DNA Proteins 0.000 description 2
- 239000004677 Nylon Substances 0.000 description 2
- 108020005187 Oligonucleotide Probes Proteins 0.000 description 2
- 108010038807 Oligopeptides Proteins 0.000 description 2
- 102000015636 Oligopeptides Human genes 0.000 description 2
- 102000004316 Oxidoreductases Human genes 0.000 description 2
- 108090000854 Oxidoreductases Proteins 0.000 description 2
- 238000010222 PCR analysis Methods 0.000 description 2
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 2
- 244000062780 Petroselinum sativum Species 0.000 description 2
- 108700019535 Phosphoprotein Phosphatases Proteins 0.000 description 2
- 241000709664 Picornaviridae Species 0.000 description 2
- 108010059820 Polygalacturonase Proteins 0.000 description 2
- 241000710078 Potyvirus Species 0.000 description 2
- 101710188315 Protein X Proteins 0.000 description 2
- CZPWVGJYEJSRLH-UHFFFAOYSA-N Pyrimidine Chemical compound C1=CN=CN=C1 CZPWVGJYEJSRLH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000220324 Pyrus Species 0.000 description 2
- 101100087805 Ralstonia solanacearum rip19 gene Proteins 0.000 description 2
- 240000000528 Ricinus communis Species 0.000 description 2
- 235000004443 Ricinus communis Nutrition 0.000 description 2
- 240000000111 Saccharum officinarum Species 0.000 description 2
- 235000007201 Saccharum officinarum Nutrition 0.000 description 2
- 241000209056 Secale Species 0.000 description 2
- 244000044822 Simmondsia californica Species 0.000 description 2
- 235000004433 Simmondsia californica Nutrition 0.000 description 2
- 108020004682 Single-Stranded DNA Proteins 0.000 description 2
- 235000011684 Sorghum saccharatum Nutrition 0.000 description 2
- 235000021536 Sugar beet Nutrition 0.000 description 2
- 229940100389 Sulfonylurea Drugs 0.000 description 2
- 108010069584 Type III Secretion Systems Proteins 0.000 description 2
- 108090000848 Ubiquitin Proteins 0.000 description 2
- 102000044159 Ubiquitin Human genes 0.000 description 2
- ISAKRJDGNUQOIC-UHFFFAOYSA-N Uracil Chemical compound O=C1C=CNC(=O)N1 ISAKRJDGNUQOIC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108010003533 Viral Envelope Proteins Proteins 0.000 description 2
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000001594 aberrant effect Effects 0.000 description 2
- 102000005421 acetyltransferase Human genes 0.000 description 2
- 239000000443 aerosol Substances 0.000 description 2
- 108090000637 alpha-Amylases Proteins 0.000 description 2
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 2
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 2
- 239000003392 amylase inhibitor Substances 0.000 description 2
- 229930002877 anthocyanin Natural products 0.000 description 2
- 235000010208 anthocyanin Nutrition 0.000 description 2
- 239000004410 anthocyanin Substances 0.000 description 2
- 150000004636 anthocyanins Chemical class 0.000 description 2
- 239000000729 antidote Substances 0.000 description 2
- 229940075522 antidotes Drugs 0.000 description 2
- 101150037081 aroA gene Proteins 0.000 description 2
- MXWJVTOOROXGIU-UHFFFAOYSA-N atrazine Chemical compound CCNC1=NC(Cl)=NC(NC(C)C)=N1 MXWJVTOOROXGIU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- WPYMKLBDIGXBTP-UHFFFAOYSA-N benzoic acid Chemical compound OC(=O)C1=CC=CC=C1 WPYMKLBDIGXBTP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 235000013734 beta-carotene Nutrition 0.000 description 2
- 239000011648 beta-carotene Substances 0.000 description 2
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 2
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 description 2
- 239000001506 calcium phosphate Substances 0.000 description 2
- 229910000389 calcium phosphate Inorganic materials 0.000 description 2
- 235000011010 calcium phosphates Nutrition 0.000 description 2
- 238000004364 calculation method Methods 0.000 description 2
- 150000001720 carbohydrates Chemical class 0.000 description 2
- 235000014633 carbohydrates Nutrition 0.000 description 2
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 2
- 239000013043 chemical agent Substances 0.000 description 2
- 108010031100 chloroplast transit peptides Proteins 0.000 description 2
- 239000003593 chromogenic compound Substances 0.000 description 2
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 description 2
- 239000003184 complementary RNA Substances 0.000 description 2
- 238000004590 computer program Methods 0.000 description 2
- 230000021615 conjugation Effects 0.000 description 2
- 238000005520 cutting process Methods 0.000 description 2
- 108010082025 cyan fluorescent protein Proteins 0.000 description 2
- OILAIQUEIWYQPH-UHFFFAOYSA-N cyclohexane-1,2-dione Chemical class O=C1CCCCC1=O OILAIQUEIWYQPH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 2
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 2
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 2
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 2
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 2
- 229960004679 doxorubicin Drugs 0.000 description 2
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 2
- 230000009977 dual effect Effects 0.000 description 2
- VLCYCQAOQCDTCN-UHFFFAOYSA-N eflornithine Chemical compound NCCCC(N)(C(F)F)C(O)=O VLCYCQAOQCDTCN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 108010050663 endodeoxyribonuclease CreI Proteins 0.000 description 2
- 210000002472 endoplasmic reticulum Anatomy 0.000 description 2
- 239000002158 endotoxin Substances 0.000 description 2
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 2
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 2
- 239000013613 expression plasmid Substances 0.000 description 2
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 2
- 108020002326 glutamine synthetase Proteins 0.000 description 2
- 239000005090 green fluorescent protein Substances 0.000 description 2
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 2
- 108010072285 growth inhibitory proteins Proteins 0.000 description 2
- 239000003630 growth substance Substances 0.000 description 2
- 229940029575 guanosine Drugs 0.000 description 2
- 239000000833 heterodimer Substances 0.000 description 2
- 239000005556 hormone Substances 0.000 description 2
- 229940088597 hormone Drugs 0.000 description 2
- 230000003301 hydrolyzing effect Effects 0.000 description 2
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 description 2
- 238000003384 imaging method Methods 0.000 description 2
- 230000000749 insecticidal effect Effects 0.000 description 2
- 229930014550 juvenile hormone Natural products 0.000 description 2
- 239000002949 juvenile hormone Substances 0.000 description 2
- 150000003633 juvenile hormone derivatives Chemical class 0.000 description 2
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 2
- 231100000518 lethal Toxicity 0.000 description 2
- 230000001665 lethal effect Effects 0.000 description 2
- 239000002502 liposome Substances 0.000 description 2
- 239000002207 metabolite Substances 0.000 description 2
- 230000000877 morphologic effect Effects 0.000 description 2
- 238000007481 next generation sequencing Methods 0.000 description 2
- 230000030648 nucleus localization Effects 0.000 description 2
- 229920001778 nylon Polymers 0.000 description 2
- 239000002751 oligonucleotide probe Substances 0.000 description 2
- 238000005457 optimization Methods 0.000 description 2
- 210000003463 organelle Anatomy 0.000 description 2
- 230000002018 overexpression Effects 0.000 description 2
- 230000001575 pathological effect Effects 0.000 description 2
- 235000011197 perejil Nutrition 0.000 description 2
- 150000002989 phenols Chemical class 0.000 description 2
- 125000001997 phenyl group Chemical group [H]C1=C([H])C([H])=C(*)C([H])=C1[H] 0.000 description 2
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K phosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 2
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 description 2
- 230000026731 phosphorylation Effects 0.000 description 2
- 238000006366 phosphorylation reaction Methods 0.000 description 2
- 230000009894 physiological stress Effects 0.000 description 2
- 230000008488 polyadenylation Effects 0.000 description 2
- 230000029279 positive regulation of transcription, DNA-dependent Effects 0.000 description 2
- 230000004481 post-translational protein modification Effects 0.000 description 2
- 102000021127 protein binding proteins Human genes 0.000 description 2
- 108091011138 protein binding proteins Proteins 0.000 description 2
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 2
- 125000002652 ribonucleotide group Chemical group 0.000 description 2
- JQXXHWHPUNPDRT-WLSIYKJHSA-N rifampicin Chemical compound O([C@](C1=O)(C)O/C=C/[C@@H]([C@H]([C@@H](OC(C)=O)[C@H](C)[C@H](O)[C@H](C)[C@@H](O)[C@@H](C)\C=C\C=C(C)/C(=O)NC=2C(O)=C3C([O-])=C4C)C)OC)C4=C1C3=C(O)C=2\C=N\N1CC[NH+](C)CC1 JQXXHWHPUNPDRT-WLSIYKJHSA-N 0.000 description 2
- 229960001225 rifampicin Drugs 0.000 description 2
- YGSDEFSMJLZEOE-UHFFFAOYSA-N salicylic acid Chemical compound OC(=O)C1=CC=CC=C1O YGSDEFSMJLZEOE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 2
- 238000002864 sequence alignment Methods 0.000 description 2
- 229910001415 sodium ion Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000002689 soil Substances 0.000 description 2
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 2
- 230000009870 specific binding Effects 0.000 description 2
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 2
- UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N streptomycin Chemical compound CN[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@](C=O)(O)[C@H](C)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@H]1O UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N 0.000 description 2
- 230000035882 stress Effects 0.000 description 2
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 2
- YROXIXLRRCOBKF-UHFFFAOYSA-N sulfonylurea Chemical class OC(=N)N=S(=O)=O YROXIXLRRCOBKF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 2
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 2
- 238000005382 thermal cycling Methods 0.000 description 2
- 229940113082 thymine Drugs 0.000 description 2
- 231100000167 toxic agent Toxicity 0.000 description 2
- 231100000701 toxic element Toxicity 0.000 description 2
- 230000002103 transcriptional effect Effects 0.000 description 2
- QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H tricalcium bis(phosphate) Chemical compound [Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H 0.000 description 2
- 238000002604 ultrasonography Methods 0.000 description 2
- 239000013603 viral vector Substances 0.000 description 2
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 2
- 230000001018 virulence Effects 0.000 description 2
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 2
- 108091005957 yellow fluorescent proteins Proteins 0.000 description 2
- OENHQHLEOONYIE-JLTXGRSLSA-N β-Carotene Chemical compound CC=1CCCC(C)(C)C=1\C=C\C(\C)=C\C=C\C(\C)=C\C=C\C=C(/C)\C=C\C=C(/C)\C=C\C1=C(C)CCCC1(C)C OENHQHLEOONYIE-JLTXGRSLSA-N 0.000 description 2
- CXNPLSGKWMLZPZ-GIFSMMMISA-N (2r,3r,6s)-3-[[(3s)-3-amino-5-[carbamimidoyl(methyl)amino]pentanoyl]amino]-6-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)-3,6-dihydro-2h-pyran-2-carboxylic acid Chemical compound O1[C@@H](C(O)=O)[C@H](NC(=O)C[C@@H](N)CCN(C)C(N)=N)C=C[C@H]1N1C(=O)N=C(N)C=C1 CXNPLSGKWMLZPZ-GIFSMMMISA-N 0.000 description 1
- FCHBECOAGZMTFE-ZEQKJWHPSA-N (6r,7r)-3-[[2-[[4-(dimethylamino)phenyl]diazenyl]pyridin-1-ium-1-yl]methyl]-8-oxo-7-[(2-thiophen-2-ylacetyl)amino]-5-thia-1-azabicyclo[4.2.0]oct-2-ene-2-carboxylate Chemical compound C1=CC(N(C)C)=CC=C1N=NC1=CC=CC=[N+]1CC1=C(C([O-])=O)N2C(=O)[C@@H](NC(=O)CC=3SC=CC=3)[C@H]2SC1 FCHBECOAGZMTFE-ZEQKJWHPSA-N 0.000 description 1
- FYADHXFMURLYQI-UHFFFAOYSA-N 1,2,4-triazine Chemical compound C1=CN=NC=N1 FYADHXFMURLYQI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 150000005206 1,2-dihydroxybenzenes Chemical class 0.000 description 1
- XUHGTGGPZFJRMF-UHFFFAOYSA-N 1,3-dihydropyrazole-2-carboxylic acid Chemical class OC(=O)N1CC=CN1 XUHGTGGPZFJRMF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101150028074 2 gene Proteins 0.000 description 1
- GOCUAJYOYBLQRH-UHFFFAOYSA-N 2-(4-{[3-chloro-5-(trifluoromethyl)pyridin-2-yl]oxy}phenoxy)propanoic acid Chemical compound C1=CC(OC(C)C(O)=O)=CC=C1OC1=NC=C(C(F)(F)F)C=C1Cl GOCUAJYOYBLQRH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- NEAQRZUHTPSBBM-UHFFFAOYSA-N 2-hydroxy-3,3-dimethyl-7-nitro-4h-isoquinolin-1-one Chemical compound C1=C([N+]([O-])=O)C=C2C(=O)N(O)C(C)(C)CC2=C1 NEAQRZUHTPSBBM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102100027328 2-hydroxyacyl-CoA lyase 2 Human genes 0.000 description 1
- AOPRXJXHLWYPQR-UHFFFAOYSA-N 2-phenoxyacetamide Chemical class NC(=O)COC1=CC=CC=C1 AOPRXJXHLWYPQR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- CZMRCDWAGMRECN-UHFFFAOYSA-N 2-{[3,4-dihydroxy-2,5-bis(hydroxymethyl)oxolan-2-yl]oxy}-6-(hydroxymethyl)oxane-3,4,5-triol Chemical compound OCC1OC(CO)(OC2OC(CO)C(O)C(O)C2O)C(O)C1O CZMRCDWAGMRECN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108020005345 3' Untranslated Regions Proteins 0.000 description 1
- UPMXNNIRAGDFEH-UHFFFAOYSA-N 3,5-dibromo-4-hydroxybenzonitrile Chemical compound OC1=C(Br)C=C(C#N)C=C1Br UPMXNNIRAGDFEH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- CAAMSDWKXXPUJR-UHFFFAOYSA-N 3,5-dihydro-4H-imidazol-4-one Chemical compound O=C1CNC=N1 CAAMSDWKXXPUJR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- XMTQQYYKAHVGBJ-UHFFFAOYSA-N 3-(3,4-DICHLOROPHENYL)-1,1-DIMETHYLUREA Chemical compound CN(C)C(=O)NC1=CC=C(Cl)C(Cl)=C1 XMTQQYYKAHVGBJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010020183 3-phosphoshikimate 1-carboxyvinyltransferase Proteins 0.000 description 1
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 description 1
- 235000007173 Abies balsamea Nutrition 0.000 description 1
- 244000283070 Abies balsamea Species 0.000 description 1
- 235000004710 Abies lasiocarpa Nutrition 0.000 description 1
- 108010000700 Acetolactate synthase Proteins 0.000 description 1
- 101710103719 Acetolactate synthase large subunit Proteins 0.000 description 1
- 101710182467 Acetolactate synthase large subunit IlvB1 Proteins 0.000 description 1
- 101710171176 Acetolactate synthase large subunit IlvG Proteins 0.000 description 1
- 101710176702 Acetolactate synthase small subunit Proteins 0.000 description 1
- 101710147947 Acetolactate synthase small subunit 1, chloroplastic Proteins 0.000 description 1
- 101710095712 Acetolactate synthase, mitochondrial Proteins 0.000 description 1
- 101000818108 Acholeplasma phage L2 Uncharacterized 81.3 kDa protein Proteins 0.000 description 1
- 101710159080 Aconitate hydratase A Proteins 0.000 description 1
- 101710159078 Aconitate hydratase B Proteins 0.000 description 1
- HRPVXLWXLXDGHG-UHFFFAOYSA-N Acrylamide Chemical compound NC(=O)C=C HRPVXLWXLXDGHG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101710197633 Actin-1 Proteins 0.000 description 1
- 102000007469 Actins Human genes 0.000 description 1
- 108010085238 Actins Proteins 0.000 description 1
- 108010021809 Alcohol dehydrogenase Proteins 0.000 description 1
- 101710171801 Alpha-amylase inhibitor Proteins 0.000 description 1
- 235000003840 Amygdalus nana Nutrition 0.000 description 1
- 244000296825 Amygdalus nana Species 0.000 description 1
- 229940122816 Amylase inhibitor Drugs 0.000 description 1
- 108010065511 Amylases Proteins 0.000 description 1
- 102100030988 Angiotensin-converting enzyme Human genes 0.000 description 1
- 102000044503 Antimicrobial Peptides Human genes 0.000 description 1
- 108700042778 Antimicrobial Peptides Proteins 0.000 description 1
- 108020004491 Antisense DNA Proteins 0.000 description 1
- 101710081722 Antitrypsin Proteins 0.000 description 1
- 238000006677 Appel reaction Methods 0.000 description 1
- 102000007347 Apyrase Human genes 0.000 description 1
- 108010007730 Apyrase Proteins 0.000 description 1
- 101100004864 Arabidopsis thaliana ZFN1 gene Proteins 0.000 description 1
- 101100272917 Arabidopsis thaliana ZFN2 gene Proteins 0.000 description 1
- 241000209524 Araceae Species 0.000 description 1
- 235000010777 Arachis hypogaea Nutrition 0.000 description 1
- 241000203069 Archaea Species 0.000 description 1
- 235000005340 Asparagus officinalis Nutrition 0.000 description 1
- 241000228245 Aspergillus niger Species 0.000 description 1
- 241001465318 Aspergillus terreus Species 0.000 description 1
- 235000005781 Avena Nutrition 0.000 description 1
- 244000075850 Avena orientalis Species 0.000 description 1
- 235000000832 Ayote Nutrition 0.000 description 1
- 108010029675 Bacillus licheniformis alpha-amylase Proteins 0.000 description 1
- 241000194110 Bacillus sp. (in: Bacteria) Species 0.000 description 1
- 101900040182 Bacillus subtilis Levansucrase Proteins 0.000 description 1
- 241000193388 Bacillus thuringiensis Species 0.000 description 1
- 239000005711 Benzoic acid Substances 0.000 description 1
- 108010006654 Bleomycin Proteins 0.000 description 1
- 241000611157 Brachiaria Species 0.000 description 1
- 235000011331 Brassica Nutrition 0.000 description 1
- 235000011303 Brassica alboglabra Nutrition 0.000 description 1
- 235000003351 Brassica cretica Nutrition 0.000 description 1
- 235000011332 Brassica juncea Nutrition 0.000 description 1
- 235000014700 Brassica juncea var napiformis Nutrition 0.000 description 1
- 235000006008 Brassica napus var napus Nutrition 0.000 description 1
- 235000011302 Brassica oleracea Nutrition 0.000 description 1
- 240000008100 Brassica rapa Species 0.000 description 1
- 235000011292 Brassica rapa Nutrition 0.000 description 1
- 235000006618 Brassica rapa subsp oleifera Nutrition 0.000 description 1
- 235000000540 Brassica rapa subsp rapa Nutrition 0.000 description 1
- 235000003343 Brassica rupestris Nutrition 0.000 description 1
- 239000005489 Bromoxynil Substances 0.000 description 1
- 229910000906 Bronze Inorganic materials 0.000 description 1
- 101150061009 C1 gene Proteins 0.000 description 1
- 101150003288 C2 gene Proteins 0.000 description 1
- 101100189378 Caenorhabditis elegans pat-3 gene Proteins 0.000 description 1
- UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L Calcium chloride Chemical compound [Cl-].[Cl-].[Ca+2] UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 241000189662 Calla Species 0.000 description 1
- 235000002566 Capsicum Nutrition 0.000 description 1
- 240000008574 Capsicum frutescens Species 0.000 description 1
- 241000701489 Cauliflower mosaic virus Species 0.000 description 1
- 108010059892 Cellulase Proteins 0.000 description 1
- 229930186147 Cephalosporin Natural products 0.000 description 1
- 241000195585 Chlamydomonas Species 0.000 description 1
- 108010035563 Chloramphenicol O-acetyltransferase Proteins 0.000 description 1
- 235000007516 Chrysanthemum Nutrition 0.000 description 1
- 244000189548 Chrysanthemum x morifolium Species 0.000 description 1
- 108020004638 Circular DNA Proteins 0.000 description 1
- 241000219109 Citrullus Species 0.000 description 1
- 241000207199 Citrus Species 0.000 description 1
- 241000755729 Clivia Species 0.000 description 1
- 235000013162 Cocos nucifera Nutrition 0.000 description 1
- 244000060011 Cocos nucifera Species 0.000 description 1
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 1
- 108700010070 Codon Usage Proteins 0.000 description 1
- 108091035707 Consensus sequence Proteins 0.000 description 1
- RYGMFSIKBFXOCR-UHFFFAOYSA-N Copper Chemical compound [Cu] RYGMFSIKBFXOCR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101710190853 Cruciferin Proteins 0.000 description 1
- 241000724252 Cucumber mosaic virus Species 0.000 description 1
- 235000009854 Cucurbita moschata Nutrition 0.000 description 1
- 240000001980 Cucurbita pepo Species 0.000 description 1
- 235000009852 Cucurbita pepo Nutrition 0.000 description 1
- 235000009804 Cucurbita pepo subsp pepo Nutrition 0.000 description 1
- 101710095468 Cyclase Proteins 0.000 description 1
- 102100028007 Cystatin-SA Human genes 0.000 description 1
- 101710144510 Cysteine proteinase inhibitor Proteins 0.000 description 1
- 102000000311 Cytosine Deaminase Human genes 0.000 description 1
- 108010080611 Cytosine Deaminase Proteins 0.000 description 1
- IGXWBGJHJZYPQS-SSDOTTSWSA-N D-Luciferin Chemical compound OC(=O)[C@H]1CSC(C=2SC3=CC=C(O)C=C3N=2)=N1 IGXWBGJHJZYPQS-SSDOTTSWSA-N 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-QTVWNMPRSA-N D-mannopyranose Chemical compound OC[C@H]1OC(O)[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-QTVWNMPRSA-N 0.000 description 1
- 102000012410 DNA Ligases Human genes 0.000 description 1
- 108010061982 DNA Ligases Proteins 0.000 description 1
- 230000007035 DNA breakage Effects 0.000 description 1
- 238000007400 DNA extraction Methods 0.000 description 1
- 238000007399 DNA isolation Methods 0.000 description 1
- 238000001712 DNA sequencing Methods 0.000 description 1
- 101710096438 DNA-binding protein Proteins 0.000 description 1
- 102000016928 DNA-directed DNA polymerase Human genes 0.000 description 1
- 108010014303 DNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 1
- 241000208175 Daucus Species 0.000 description 1
- 235000002767 Daucus carota Nutrition 0.000 description 1
- 244000000626 Daucus carota Species 0.000 description 1
- CYCGRDQQIOGCKX-UHFFFAOYSA-N Dehydro-luciferin Natural products OC(=O)C1=CSC(C=2SC3=CC(O)=CC=C3N=2)=N1 CYCGRDQQIOGCKX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010008532 Deoxyribonuclease I Proteins 0.000 description 1
- 102000007260 Deoxyribonuclease I Human genes 0.000 description 1
- 239000005504 Dicamba Substances 0.000 description 1
- 108090000204 Dipeptidase 1 Proteins 0.000 description 1
- 108010016626 Dipeptides Proteins 0.000 description 1
- 241000238791 Diploptera punctata Species 0.000 description 1
- 208000035240 Disease Resistance Diseases 0.000 description 1
- 101710173731 Diuretic hormone receptor Proteins 0.000 description 1
- 239000005510 Diuron Substances 0.000 description 1
- 241001057636 Dracaena deremensis Species 0.000 description 1
- 241000512897 Elaeis Species 0.000 description 1
- 235000001942 Elaeis Nutrition 0.000 description 1
- 235000001950 Elaeis guineensis Nutrition 0.000 description 1
- 244000127993 Elaeis melanococca Species 0.000 description 1
- 101100491986 Emericella nidulans (strain FGSC A4 / ATCC 38163 / CBS 112.46 / NRRL 194 / M139) aromA gene Proteins 0.000 description 1
- 102100038132 Endogenous retrovirus group K member 6 Pro protein Human genes 0.000 description 1
- 101000889900 Enterobacteria phage T4 Intron-associated endonuclease 1 Proteins 0.000 description 1
- YQYJSBFKSSDGFO-UHFFFAOYSA-N Epihygromycin Natural products OC1C(O)C(C(=O)C)OC1OC(C(=C1)O)=CC=C1C=C(C)C(=O)NC1C(O)C(O)C2OCOC2C1O YQYJSBFKSSDGFO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000132521 Erigeron Species 0.000 description 1
- 108090000371 Esterases Proteins 0.000 description 1
- 241000206602 Eukaryota Species 0.000 description 1
- 108060002716 Exonuclease Proteins 0.000 description 1
- 241000282326 Felis catus Species 0.000 description 1
- BJGNCJDXODQBOB-UHFFFAOYSA-N Fivefly Luciferin Natural products OC(=O)C1CSC(C=2SC3=CC(O)=CC=C3N=2)=N1 BJGNCJDXODQBOB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- GHASVSINZRGABV-UHFFFAOYSA-N Fluorouracil Chemical compound FC1=CNC(=O)NC1=O GHASVSINZRGABV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000005558 Fluroxypyr Substances 0.000 description 1
- 235000016623 Fragaria vesca Nutrition 0.000 description 1
- 240000009088 Fragaria x ananassa Species 0.000 description 1
- 235000011363 Fragaria x ananassa Nutrition 0.000 description 1
- 241000233866 Fungi Species 0.000 description 1
- 241000223221 Fusarium oxysporum Species 0.000 description 1
- 102000048120 Galactokinases Human genes 0.000 description 1
- 108700023157 Galactokinases Proteins 0.000 description 1
- 102100034013 Gamma-glutamyl phosphate reductase Human genes 0.000 description 1
- 101710198928 Gamma-glutamyl phosphate reductase Proteins 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 1
- 108010070675 Glutathione transferase Proteins 0.000 description 1
- 102000005720 Glutathione transferase Human genes 0.000 description 1
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 1
- 108700037728 Glycine max beta-conglycinin Proteins 0.000 description 1
- 101000912350 Haemophilus phage HP1 (strain HP1c1) DNA N-6-adenine-methyltransferase Proteins 0.000 description 1
- 102000002812 Heat-Shock Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010004889 Heat-Shock Proteins Proteins 0.000 description 1
- 108091027305 Heteroduplex Proteins 0.000 description 1
- 229920000209 Hexadimethrine bromide Polymers 0.000 description 1
- MAJYPBAJPNUFPV-BQBZGAKWSA-N His-Cys Chemical compound SC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CC1=CN=CN1 MAJYPBAJPNUFPV-BQBZGAKWSA-N 0.000 description 1
- 241000209219 Hordeum Species 0.000 description 1
- 102000018251 Hypoxanthine Phosphoribosyltransferase Human genes 0.000 description 1
- 108010091358 Hypoxanthine Phosphoribosyltransferase Proteins 0.000 description 1
- 108010042889 Inulosucrase Proteins 0.000 description 1
- 244000017020 Ipomoea batatas Species 0.000 description 1
- 235000002678 Ipomoea batatas Nutrition 0.000 description 1
- 108010025815 Kanamycin Kinase Proteins 0.000 description 1
- 101000790844 Klebsiella pneumoniae Uncharacterized 24.8 kDa protein in cps region Proteins 0.000 description 1
- WTDRDQBEARUVNC-UHFFFAOYSA-N L-Dopa Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=C(O)C(O)=C1 WTDRDQBEARUVNC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- FBOZXECLQNJBKD-ZDUSSCGKSA-N L-methotrexate Chemical compound C=1N=C2N=C(N)N=C(N)C2=NC=1CN(C)C1=CC=C(C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O)C=C1 FBOZXECLQNJBKD-ZDUSSCGKSA-N 0.000 description 1
- QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N L-tryptophane Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@H](N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N 0.000 description 1
- OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N L-tyrosine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 1
- 108010029541 Laccase Proteins 0.000 description 1
- 241000208822 Lactuca Species 0.000 description 1
- 235000003228 Lactuca sativa Nutrition 0.000 description 1
- 240000008415 Lactuca sativa Species 0.000 description 1
- 108091026898 Leader sequence (mRNA) Proteins 0.000 description 1
- 108090001090 Lectins Proteins 0.000 description 1
- 102000004856 Lectins Human genes 0.000 description 1
- 244000207740 Lemna minor Species 0.000 description 1
- 235000006439 Lemna minor Nutrition 0.000 description 1
- 108090001060 Lipase Proteins 0.000 description 1
- 102000004882 Lipase Human genes 0.000 description 1
- 239000004367 Lipase Substances 0.000 description 1
- 239000000232 Lipid Bilayer Substances 0.000 description 1
- 241000209082 Lolium Species 0.000 description 1
- DDWFXDSYGUXRAY-UHFFFAOYSA-N Luciferin Natural products CCc1c(C)c(CC2NC(=O)C(=C2C=C)C)[nH]c1Cc3[nH]c4C(=C5/NC(CC(=O)O)C(C)C5CC(=O)O)CC(=O)c4c3C DDWFXDSYGUXRAY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000002262 Lycopersicon Nutrition 0.000 description 1
- 101001133631 Lysinibacillus sphaericus Penicillin acylase Proteins 0.000 description 1
- JLVVSXFLKOJNIY-UHFFFAOYSA-N Magnesium ion Chemical compound [Mg+2] JLVVSXFLKOJNIY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000011430 Malus pumila Nutrition 0.000 description 1
- 235000015103 Malus silvestris Nutrition 0.000 description 1
- 235000016735 Manihot esculenta subsp esculenta Nutrition 0.000 description 1
- 108091022912 Mannose-6-Phosphate Isomerase Proteins 0.000 description 1
- 108010087870 Mannose-Binding Lectin Proteins 0.000 description 1
- XUMBMVFBXHLACL-UHFFFAOYSA-N Melanin Natural products O=C1C(=O)C(C2=CNC3=C(C(C(=O)C4=C32)=O)C)=C2C4=CNC2=C1C XUMBMVFBXHLACL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101100261636 Methanothermobacter marburgensis (strain ATCC BAA-927 / DSM 2133 / JCM 14651 / NBRC 100331 / OCM 82 / Marburg) trpB2 gene Proteins 0.000 description 1
- 108010059724 Micrococcal Nuclease Proteins 0.000 description 1
- 208000031888 Mycoses Diseases 0.000 description 1
- 102100026933 Myelin-associated neurite-outgrowth inhibitor Human genes 0.000 description 1
- BKAYIFDRRZZKNF-VIFPVBQESA-N N-acetylcarnosine Chemical compound CC(=O)NCCC(=O)N[C@H](C(O)=O)CC1=CN=CN1 BKAYIFDRRZZKNF-VIFPVBQESA-N 0.000 description 1
- 108091061960 Naked DNA Proteins 0.000 description 1
- 101710202365 Napin Proteins 0.000 description 1
- 229930193140 Neomycin Natural products 0.000 description 1
- 108090000189 Neuropeptides Proteins 0.000 description 1
- 102000003797 Neuropeptides Human genes 0.000 description 1
- 241000208125 Nicotiana Species 0.000 description 1
- 239000000020 Nitrocellulose Substances 0.000 description 1
- 206010067482 No adverse event Diseases 0.000 description 1
- 238000000636 Northern blotting Methods 0.000 description 1
- 108010077850 Nuclear Localization Signals Proteins 0.000 description 1
- 102000007999 Nuclear Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010089610 Nuclear Proteins Proteins 0.000 description 1
- 108020004711 Nucleic Acid Probes Proteins 0.000 description 1
- 108091007494 Nucleic acid- binding domains Proteins 0.000 description 1
- 108010047956 Nucleosomes Proteins 0.000 description 1
- 241000207836 Olea <angiosperm> Species 0.000 description 1
- 241000795633 Olea <sea slug> Species 0.000 description 1
- 229940122060 Ornithine decarboxylase inhibitor Drugs 0.000 description 1
- 102000052812 Ornithine decarboxylases Human genes 0.000 description 1
- 108700005126 Ornithine decarboxylases Proteins 0.000 description 1
- 241001233986 Orychophragmus Species 0.000 description 1
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 1
- 241000209094 Oryza Species 0.000 description 1
- 101710149663 Osmotin Proteins 0.000 description 1
- 101150084044 P gene Proteins 0.000 description 1
- 238000002944 PCR assay Methods 0.000 description 1
- 108091081548 Palindromic sequence Proteins 0.000 description 1
- 102000016387 Pancreatic elastase Human genes 0.000 description 1
- 108010067372 Pancreatic elastase Proteins 0.000 description 1
- 241000222291 Passalora fulva Species 0.000 description 1
- 108010029182 Pectin lyase Proteins 0.000 description 1
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 description 1
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 1
- 108090000882 Peptidyl-Dipeptidase A Proteins 0.000 description 1
- 101710132602 Peroxidase 5 Proteins 0.000 description 1
- 241000218196 Persea Species 0.000 description 1
- 240000007377 Petunia x hybrida Species 0.000 description 1
- 101710163504 Phaseolin Proteins 0.000 description 1
- 241000219833 Phaseolus Species 0.000 description 1
- 102100035362 Phosphomannomutase 2 Human genes 0.000 description 1
- 102000045595 Phosphoprotein Phosphatases Human genes 0.000 description 1
- 108090000608 Phosphoric Monoester Hydrolases Proteins 0.000 description 1
- 102000004160 Phosphoric Monoester Hydrolases Human genes 0.000 description 1
- 102000014750 Phosphorylase Kinase Human genes 0.000 description 1
- 108010064071 Phosphorylase Kinase Proteins 0.000 description 1
- 101100124346 Photorhabdus laumondii subsp. laumondii (strain DSM 15139 / CIP 105565 / TT01) hisCD gene Proteins 0.000 description 1
- 108010060806 Photosystem II Protein Complex Proteins 0.000 description 1
- IMQLKJBTEOYOSI-UHFFFAOYSA-N Phytic acid Natural products OP(O)(=O)OC1C(OP(O)(O)=O)C(OP(O)(O)=O)C(OP(O)(O)=O)C(OP(O)(O)=O)C1OP(O)(O)=O IMQLKJBTEOYOSI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000218657 Picea Species 0.000 description 1
- 108700001094 Plant Genes Proteins 0.000 description 1
- 239000004698 Polyethylene Substances 0.000 description 1
- 229920001030 Polyethylene Glycol 4000 Polymers 0.000 description 1
- 108010068086 Polyubiquitin Proteins 0.000 description 1
- 102100037935 Polyubiquitin-C Human genes 0.000 description 1
- 235000001855 Portulaca oleracea Nutrition 0.000 description 1
- 241000709992 Potato virus X Species 0.000 description 1
- 241000723762 Potato virus Y Species 0.000 description 1
- 101710196435 Probable acetolactate synthase large subunit Proteins 0.000 description 1
- 101710181764 Probable acetolactate synthase small subunit Proteins 0.000 description 1
- 229940124158 Protease/peptidase inhibitor Drugs 0.000 description 1
- 102000001253 Protein Kinase Human genes 0.000 description 1
- 108020001991 Protoporphyrinogen Oxidase Proteins 0.000 description 1
- 102000005135 Protoporphyrinogen oxidase Human genes 0.000 description 1
- 235000011432 Prunus Nutrition 0.000 description 1
- 241000589615 Pseudomonas syringae Species 0.000 description 1
- 241000589626 Pseudomonas syringae pv. tomato Species 0.000 description 1
- 101710104000 Putative acetolactate synthase small subunit Proteins 0.000 description 1
- 235000014443 Pyrus communis Nutrition 0.000 description 1
- 238000012181 QIAquick gel extraction kit Methods 0.000 description 1
- 101150041925 RBCS gene Proteins 0.000 description 1
- 238000002123 RNA extraction Methods 0.000 description 1
- 238000012228 RNA interference-mediated gene silencing Methods 0.000 description 1
- 102000044126 RNA-Binding Proteins Human genes 0.000 description 1
- 230000004570 RNA-binding Effects 0.000 description 1
- 101710105008 RNA-binding protein Proteins 0.000 description 1
- MUPFEKGTMRGPLJ-RMMQSMQOSA-N Raffinose Natural products O(C[C@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H](O[C@@]2(CO)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O2)O1)[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O1 MUPFEKGTMRGPLJ-RMMQSMQOSA-N 0.000 description 1
- 101100272715 Ralstonia solanacearum (strain GMI1000) brg11 gene Proteins 0.000 description 1
- 241000220259 Raphanus Species 0.000 description 1
- 108091081062 Repeated sequence (DNA) Proteins 0.000 description 1
- 108010003581 Ribulose-bisphosphate carboxylase Proteins 0.000 description 1
- 241000220317 Rosa Species 0.000 description 1
- 241000607142 Salmonella Species 0.000 description 1
- 241000239226 Scorpiones Species 0.000 description 1
- 108091081021 Sense strand Proteins 0.000 description 1
- 241000270295 Serpentes Species 0.000 description 1
- CSPPKDPQLUUTND-NBVRZTHBSA-N Sethoxydim Chemical compound CCO\N=C(/CCC)C1=C(O)CC(CC(C)SCC)CC1=O CSPPKDPQLUUTND-NBVRZTHBSA-N 0.000 description 1
- XUIMIQQOPSSXEZ-UHFFFAOYSA-N Silicon Chemical compound [Si] XUIMIQQOPSSXEZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108020004459 Small interfering RNA Proteins 0.000 description 1
- 235000002634 Solanum Nutrition 0.000 description 1
- 241000207763 Solanum Species 0.000 description 1
- 235000002595 Solanum tuberosum Nutrition 0.000 description 1
- 244000061456 Solanum tuberosum Species 0.000 description 1
- 238000002105 Southern blotting Methods 0.000 description 1
- 235000009337 Spinacia oleracea Nutrition 0.000 description 1
- 244000300264 Spinacia oleracea Species 0.000 description 1
- 229920002472 Starch Polymers 0.000 description 1
- 235000021355 Stearic acid Nutrition 0.000 description 1
- 241000194017 Streptococcus Species 0.000 description 1
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 1
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 1
- 239000005618 Sulcotrione Substances 0.000 description 1
- 102000004523 Sulfate Adenylyltransferase Human genes 0.000 description 1
- 108010022348 Sulfate adenylyltransferase Proteins 0.000 description 1
- 241001648840 Thosea asigna virus Species 0.000 description 1
- 108091036066 Three prime untranslated region Proteins 0.000 description 1
- 108010022394 Threonine synthase Proteins 0.000 description 1
- 241000723573 Tobacco rattle virus Species 0.000 description 1
- 108090000340 Transaminases Proteins 0.000 description 1
- 102000003929 Transaminases Human genes 0.000 description 1
- 108091023040 Transcription factor Proteins 0.000 description 1
- 102000040945 Transcription factor Human genes 0.000 description 1
- 206010044625 Trichorrhexis Diseases 0.000 description 1
- 239000005627 Triclopyr Substances 0.000 description 1
- 244000098338 Triticum aestivum Species 0.000 description 1
- 235000007264 Triticum durum Nutrition 0.000 description 1
- 241000209143 Triticum turgidum subsp. durum Species 0.000 description 1
- 102000004142 Trypsin Human genes 0.000 description 1
- 108090000631 Trypsin Proteins 0.000 description 1
- 102000018690 Trypsinogen Human genes 0.000 description 1
- 108010027252 Trypsinogen Proteins 0.000 description 1
- QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N Tryptophan Natural products C1=CC=C2C(CC(N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010027697 Type I Site-Specific Deoxyribonucleases Proteins 0.000 description 1
- 108060008724 Tyrosinase Proteins 0.000 description 1
- MUPFEKGTMRGPLJ-UHFFFAOYSA-N UNPD196149 Natural products OC1C(O)C(CO)OC1(CO)OC1C(O)C(O)C(O)C(COC2C(C(O)C(O)C(CO)O2)O)O1 MUPFEKGTMRGPLJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000219977 Vigna Species 0.000 description 1
- 208000036142 Viral infection Diseases 0.000 description 1
- 235000009392 Vitis Nutrition 0.000 description 1
- 241000219095 Vitis Species 0.000 description 1
- 208000027418 Wounds and injury Diseases 0.000 description 1
- 101001036768 Zea mays Glucose-1-phosphate adenylyltransferase large subunit 1, chloroplastic/amyloplastic Proteins 0.000 description 1
- 101001040871 Zea mays Glutelin-2 Proteins 0.000 description 1
- 101000662549 Zea mays Sucrose synthase 1 Proteins 0.000 description 1
- 101500015412 Zea mays Ubiquitin Proteins 0.000 description 1
- 241001520823 Zoysia Species 0.000 description 1
- MNOGBRROKHFONU-CJUKMMNNSA-N ac1l2wzw Chemical compound C1N2C(C(C(C)=C(NCCOP(O)(O)=O)C3=O)=O)=C3[C@@H](COC(N)=O)[C@@]2(OC)[C@@H]2[C@H]1N2 MNOGBRROKHFONU-CJUKMMNNSA-N 0.000 description 1
- 229940121373 acetyl-coa carboxylase inhibitor Drugs 0.000 description 1
- 230000021736 acetylation Effects 0.000 description 1
- 238000006640 acetylation reaction Methods 0.000 description 1
- JUGOREOARAHOCO-UHFFFAOYSA-M acetylcholine chloride Chemical compound [Cl-].CC(=O)OCC[N+](C)(C)C JUGOREOARAHOCO-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 210000005221 acidic domain Anatomy 0.000 description 1
- 230000003213 activating effect Effects 0.000 description 1
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 1
- 125000002252 acyl group Chemical group 0.000 description 1
- 230000006978 adaptation Effects 0.000 description 1
- 230000033289 adaptive immune response Effects 0.000 description 1
- IRLPACMLTUPBCL-FCIPNVEPSA-N adenosine-5'-phosphosulfate Chemical compound C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1[C@@H]1O[C@@H](CO[P@](O)(=O)OS(O)(=O)=O)[C@H](O)[C@H]1O IRLPACMLTUPBCL-FCIPNVEPSA-N 0.000 description 1
- 244000193174 agave Species 0.000 description 1
- 230000002776 aggregation Effects 0.000 description 1
- 238000004220 aggregation Methods 0.000 description 1
- 239000000556 agonist Substances 0.000 description 1
- OENHQHLEOONYIE-UKMVMLAPSA-N all-trans beta-carotene Natural products CC=1CCCC(C)(C)C=1/C=C/C(/C)=C/C=C/C(/C)=C/C=C/C=C(C)C=CC=C(C)C=CC1=C(C)CCCC1(C)C OENHQHLEOONYIE-UKMVMLAPSA-N 0.000 description 1
- 102000004139 alpha-Amylases Human genes 0.000 description 1
- 229940024171 alpha-amylase Drugs 0.000 description 1
- 229910052782 aluminium Inorganic materials 0.000 description 1
- XAGFODPZIPBFFR-UHFFFAOYSA-N aluminium Chemical compound [Al] XAGFODPZIPBFFR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229940126575 aminoglycoside Drugs 0.000 description 1
- 239000005557 antagonist Substances 0.000 description 1
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 1
- 230000001458 anti-acid effect Effects 0.000 description 1
- 230000000340 anti-metabolite Effects 0.000 description 1
- 230000001475 anti-trypsic effect Effects 0.000 description 1
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 description 1
- 229940100197 antimetabolite Drugs 0.000 description 1
- 239000002256 antimetabolite Substances 0.000 description 1
- 239000003816 antisense DNA Substances 0.000 description 1
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 1
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 1
- 229940097012 bacillus thuringiensis Drugs 0.000 description 1
- 101150103518 bar gene Proteins 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 1
- 235000010233 benzoic acid Nutrition 0.000 description 1
- 108010051210 beta-Fructofuranosidase Proteins 0.000 description 1
- TUPZEYHYWIEDIH-WAIFQNFQSA-N beta-carotene Natural products CC(=C/C=C/C=C(C)/C=C/C=C(C)/C=C/C1=C(C)CCCC1(C)C)C=CC=C(/C)C=CC2=CCCCC2(C)C TUPZEYHYWIEDIH-WAIFQNFQSA-N 0.000 description 1
- 229960002747 betacarotene Drugs 0.000 description 1
- GINJFDRNADDBIN-FXQIFTODSA-N bilanafos Chemical compound OC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H](N)CCP(C)(O)=O GINJFDRNADDBIN-FXQIFTODSA-N 0.000 description 1
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 description 1
- 229920001222 biopolymer Polymers 0.000 description 1
- QKSKPIVNLNLAAV-UHFFFAOYSA-N bis(2-chloroethyl) sulfide Chemical compound ClCCSCCCl QKSKPIVNLNLAAV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- CXNPLSGKWMLZPZ-UHFFFAOYSA-N blasticidin-S Natural products O1C(C(O)=O)C(NC(=O)CC(N)CCN(C)C(N)=N)C=CC1N1C(=O)N=C(N)C=C1 CXNPLSGKWMLZPZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960001561 bleomycin Drugs 0.000 description 1
- OYVAGSVQBOHSSS-UAPAGMARSA-O bleomycin A2 Chemical compound N([C@H](C(=O)N[C@H](C)[C@@H](O)[C@H](C)C(=O)N[C@@H]([C@H](O)C)C(=O)NCCC=1SC=C(N=1)C=1SC=C(N=1)C(=O)NCCC[S+](C)C)[C@@H](O[C@H]1[C@H]([C@@H](O)[C@H](O)[C@H](CO)O1)O[C@@H]1[C@H]([C@@H](OC(N)=O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1)O)C=1N=CNC=1)C(=O)C1=NC([C@H](CC(N)=O)NC[C@H](N)C(N)=O)=NC(N)=C1C OYVAGSVQBOHSSS-UAPAGMARSA-O 0.000 description 1
- 210000000988 bone and bone Anatomy 0.000 description 1
- 235000020113 brazil nut Nutrition 0.000 description 1
- 239000010974 bronze Substances 0.000 description 1
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 1
- 239000006227 byproduct Substances 0.000 description 1
- 239000001110 calcium chloride Substances 0.000 description 1
- 229910001628 calcium chloride Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000001390 capsicum minimum Substances 0.000 description 1
- 150000001768 cations Chemical class 0.000 description 1
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 1
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 1
- 229940106157 cellulase Drugs 0.000 description 1
- 210000002230 centromere Anatomy 0.000 description 1
- 229940124587 cephalosporin Drugs 0.000 description 1
- 150000001780 cephalosporins Chemical class 0.000 description 1
- 235000013339 cereals Nutrition 0.000 description 1
- 230000007073 chemical hydrolysis Effects 0.000 description 1
- 238000007385 chemical modification Methods 0.000 description 1
- 210000003763 chloroplast Anatomy 0.000 description 1
- 230000002759 chromosomal effect Effects 0.000 description 1
- 210000001726 chromosome structure Anatomy 0.000 description 1
- 235000020971 citrus fruits Nutrition 0.000 description 1
- 238000003501 co-culture Methods 0.000 description 1
- 238000004891 communication Methods 0.000 description 1
- 238000005094 computer simulation Methods 0.000 description 1
- 238000012790 confirmation Methods 0.000 description 1
- 230000001276 controlling effect Effects 0.000 description 1
- 229910052802 copper Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000010949 copper Substances 0.000 description 1
- KUNSUQLRTQLHQQ-UHFFFAOYSA-N copper tin Chemical compound [Cu].[Sn] KUNSUQLRTQLHQQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000012937 correction Methods 0.000 description 1
- 210000004748 cultured cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000001351 cycling effect Effects 0.000 description 1
- 239000002852 cysteine proteinase inhibitor Substances 0.000 description 1
- SESMVOSHGGZZQF-KRUJRXCESA-N dT8 Chemical compound O=C1NC(=O)C(C)=CN1[C@@H]1O[C@H](COP(O)(=O)O[C@@H]2[C@H](O[C@H](C2)N2C(NC(=O)C(C)=C2)=O)COP(O)(=O)O[C@@H]2[C@H](O[C@H](C2)N2C(NC(=O)C(C)=C2)=O)COP(O)(=O)O[C@@H]2[C@H](O[C@H](C2)N2C(NC(=O)C(C)=C2)=O)COP(O)(=O)O[C@@H]2[C@H](O[C@H](C2)N2C(NC(=O)C(C)=C2)=O)COP(O)(=O)O[C@@H]2[C@H](O[C@H](C2)N2C(NC(=O)C(C)=C2)=O)COP(O)(=O)O[C@@H]2[C@H](O[C@H](C2)N2C(NC(=O)C(C)=C2)=O)COP(O)(=O)O[C@@H]2[C@H](O[C@H](C2)N2C(NC(=O)C(C)=C2)=O)CO)[C@@H](O)C1 SESMVOSHGGZZQF-KRUJRXCESA-N 0.000 description 1
- 238000007405 data analysis Methods 0.000 description 1
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 1
- 230000000368 destabilizing effect Effects 0.000 description 1
- 230000001066 destructive effect Effects 0.000 description 1
- 239000010432 diamond Substances 0.000 description 1
- IWEDIXLBFLAXBO-UHFFFAOYSA-N dicamba Chemical compound COC1=C(Cl)C=CC(Cl)=C1C(O)=O IWEDIXLBFLAXBO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000015872 dietary supplement Nutrition 0.000 description 1
- 102000004419 dihydrofolate reductase Human genes 0.000 description 1
- MHUWZNTUIIFHAS-CLFAGFIQSA-N dioleoyl phosphatidic acid Chemical compound CCCCCCCC\C=C/CCCCCCCC(=O)OCC(COP(O)(O)=O)OC(=O)CCCCCCC\C=C/CCCCCCCC MHUWZNTUIIFHAS-CLFAGFIQSA-N 0.000 description 1
- 238000010494 dissociation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000005593 dissociations Effects 0.000 description 1
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 1
- 230000003828 downregulation Effects 0.000 description 1
- 238000009510 drug design Methods 0.000 description 1
- 210000005069 ears Anatomy 0.000 description 1
- 108010057988 ecdysone receptor Proteins 0.000 description 1
- 150000002061 ecdysteroids Chemical class 0.000 description 1
- 230000008030 elimination Effects 0.000 description 1
- 238000003379 elimination reaction Methods 0.000 description 1
- 239000003623 enhancer Substances 0.000 description 1
- 230000007613 environmental effect Effects 0.000 description 1
- 239000003344 environmental pollutant Substances 0.000 description 1
- 230000007071 enzymatic hydrolysis Effects 0.000 description 1
- 238000006047 enzymatic hydrolysis reaction Methods 0.000 description 1
- 238000001952 enzyme assay Methods 0.000 description 1
- 238000001976 enzyme digestion Methods 0.000 description 1
- 210000003527 eukaryotic cell Anatomy 0.000 description 1
- 102000013165 exonuclease Human genes 0.000 description 1
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 1
- 230000004129 fatty acid metabolism Effects 0.000 description 1
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 description 1
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 description 1
- 244000037666 field crops Species 0.000 description 1
- 239000000945 filler Substances 0.000 description 1
- 238000011049 filling Methods 0.000 description 1
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 1
- 230000004992 fission Effects 0.000 description 1
- 229930003935 flavonoid Natural products 0.000 description 1
- 229930002879 flavonoid pigment Natural products 0.000 description 1
- 150000004638 flavonoid pigments Chemical class 0.000 description 1
- 150000002215 flavonoids Chemical class 0.000 description 1
- 235000017173 flavonoids Nutrition 0.000 description 1
- XRECTZIEBJDKEO-UHFFFAOYSA-N flucytosine Chemical compound NC1=NC(=O)NC=C1F XRECTZIEBJDKEO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960004413 flucytosine Drugs 0.000 description 1
- 229960002949 fluorouracil Drugs 0.000 description 1
- MEFQWPUMEMWTJP-UHFFFAOYSA-N fluroxypyr Chemical compound NC1=C(Cl)C(F)=NC(OCC(O)=O)=C1Cl MEFQWPUMEMWTJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000011888 foil Substances 0.000 description 1
- 239000004459 forage Substances 0.000 description 1
- 229930182830 galactose Natural products 0.000 description 1
- 108010062699 gamma-Glutamyl Hydrolase Proteins 0.000 description 1
- 238000012215 gene cloning Methods 0.000 description 1
- 230000030279 gene silencing Effects 0.000 description 1
- 238000010363 gene targeting Methods 0.000 description 1
- 238000001415 gene therapy Methods 0.000 description 1
- 210000004602 germ cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 1
- 239000003862 glucocorticoid Substances 0.000 description 1
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 1
- 235000013922 glutamic acid Nutrition 0.000 description 1
- 239000004220 glutamic acid Substances 0.000 description 1
- ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N glutamine Natural products OC(=O)C(N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000005396 glutamine synthetase Human genes 0.000 description 1
- 230000002414 glycolytic effect Effects 0.000 description 1
- 230000013595 glycosylation Effects 0.000 description 1
- 238000006206 glycosylation reaction Methods 0.000 description 1
- PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N gold Chemical compound [Au] PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052737 gold Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000010931 gold Substances 0.000 description 1
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 1
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 1
- 229910001385 heavy metal Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 1
- 101150113423 hisD gene Proteins 0.000 description 1
- HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N histidine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000000710 homodimer Substances 0.000 description 1
- 239000001257 hydrogen Substances 0.000 description 1
- 229910052739 hydrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 description 1
- 108010002685 hygromycin-B kinase Proteins 0.000 description 1
- 238000003018 immunoassay Methods 0.000 description 1
- 238000012744 immunostaining Methods 0.000 description 1
- 239000002596 immunotoxin Substances 0.000 description 1
- 231100000608 immunotoxin Toxicity 0.000 description 1
- 230000002637 immunotoxin Effects 0.000 description 1
- 229940051026 immunotoxin Drugs 0.000 description 1
- 230000001976 improved effect Effects 0.000 description 1
- 238000000126 in silico method Methods 0.000 description 1
- 238000007901 in situ hybridization Methods 0.000 description 1
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 1
- 230000002779 inactivation Effects 0.000 description 1
- 230000000937 inactivator Effects 0.000 description 1
- PZOUSPYUWWUPPK-UHFFFAOYSA-N indole Natural products CC1=CC=CC2=C1C=CN2 PZOUSPYUWWUPPK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- RKJUIXBNRJVNHR-UHFFFAOYSA-N indolenine Natural products C1=CC=C2CC=NC2=C1 RKJUIXBNRJVNHR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 1
- 230000000977 initiatory effect Effects 0.000 description 1
- 208000014674 injury Diseases 0.000 description 1
- 230000002452 interceptive effect Effects 0.000 description 1
- 210000000936 intestine Anatomy 0.000 description 1
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 description 1
- 150000002545 isoxazoles Chemical class 0.000 description 1
- 108010080576 juvenile hormone esterase Proteins 0.000 description 1
- 230000002147 killing effect Effects 0.000 description 1
- 239000002523 lectin Substances 0.000 description 1
- 229960004502 levodopa Drugs 0.000 description 1
- 235000019421 lipase Nutrition 0.000 description 1
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 description 1
- 230000002366 lipolytic effect Effects 0.000 description 1
- 230000002101 lytic effect Effects 0.000 description 1
- 229920002521 macromolecule Polymers 0.000 description 1
- 229910001425 magnesium ion Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000012423 maintenance Methods 0.000 description 1
- 230000014759 maintenance of location Effects 0.000 description 1
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 1
- 235000005739 manihot Nutrition 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 1
- SGDBTWWWUNNDEQ-LBPRGKRZSA-N melphalan Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(N(CCCl)CCCl)C=C1 SGDBTWWWUNNDEQ-LBPRGKRZSA-N 0.000 description 1
- 229960001924 melphalan Drugs 0.000 description 1
- 230000000442 meristematic effect Effects 0.000 description 1
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 1
- 230000002503 metabolic effect Effects 0.000 description 1
- 230000007102 metabolic function Effects 0.000 description 1
- 229960000485 methotrexate Drugs 0.000 description 1
- 235000019713 millet Nutrition 0.000 description 1
- 230000003278 mimic effect Effects 0.000 description 1
- 230000000394 mitotic effect Effects 0.000 description 1
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 1
- 239000000178 monomer Substances 0.000 description 1
- 150000004712 monophosphates Chemical class 0.000 description 1
- 229930003658 monoterpene Natural products 0.000 description 1
- 150000002773 monoterpene derivatives Chemical class 0.000 description 1
- 235000002577 monoterpenes Nutrition 0.000 description 1
- 210000003097 mucus Anatomy 0.000 description 1
- 238000002887 multiple sequence alignment Methods 0.000 description 1
- 235000010460 mustard Nutrition 0.000 description 1
- 239000002105 nanoparticle Substances 0.000 description 1
- 229960004927 neomycin Drugs 0.000 description 1
- 239000002581 neurotoxin Substances 0.000 description 1
- 231100000618 neurotoxin Toxicity 0.000 description 1
- 229920001220 nitrocellulos Polymers 0.000 description 1
- 108091027963 non-coding RNA Proteins 0.000 description 1
- 102000042567 non-coding RNA Human genes 0.000 description 1
- VZORGPCQYCYZLZ-UHFFFAOYSA-E nonasodium;2-hydroxypropane-1,2,3-tricarboxylate Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[Na+].[Na+].[Na+].[Na+].[Na+].[Na+].[O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O.[O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O.[O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O VZORGPCQYCYZLZ-UHFFFAOYSA-E 0.000 description 1
- 108010058731 nopaline synthase Proteins 0.000 description 1
- 238000007899 nucleic acid hybridization Methods 0.000 description 1
- 239000002853 nucleic acid probe Substances 0.000 description 1
- 210000001623 nucleosome Anatomy 0.000 description 1
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 1
- 230000035764 nutrition Effects 0.000 description 1
- QIQXTHQIDYTFRH-UHFFFAOYSA-N octadecanoic acid Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCCCC(O)=O QIQXTHQIDYTFRH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- OQCDKBAXFALNLD-UHFFFAOYSA-N octadecanoic acid Natural products CCCCCCCC(C)CCCCCCCCC(O)=O OQCDKBAXFALNLD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000003921 oil Substances 0.000 description 1
- 239000003960 organic solvent Substances 0.000 description 1
- 239000002818 ornithine decarboxylase inhibitor Substances 0.000 description 1
- 230000001590 oxidative effect Effects 0.000 description 1
- 101150041247 p1 gene Proteins 0.000 description 1
- FJKROLUGYXJWQN-UHFFFAOYSA-N papa-hydroxy-benzoic acid Natural products OC(=O)C1=CC=C(O)C=C1 FJKROLUGYXJWQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000001769 paralizing effect Effects 0.000 description 1
- 244000045947 parasite Species 0.000 description 1
- 230000007918 pathogenicity Effects 0.000 description 1
- 230000037361 pathway Effects 0.000 description 1
- 235000020232 peanut Nutrition 0.000 description 1
- 101150009166 pehA gene Proteins 0.000 description 1
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 1
- 239000000137 peptide hydrolase inhibitor Substances 0.000 description 1
- 239000010451 perlite Substances 0.000 description 1
- 235000019362 perlite Nutrition 0.000 description 1
- 238000002823 phage display Methods 0.000 description 1
- LWTDZKXXJRRKDG-UHFFFAOYSA-N phaseollin Natural products C1OC2=CC(O)=CC=C2C2C1C1=CC=C3OC(C)(C)C=CC3=C1O2 LWTDZKXXJRRKDG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229930015704 phenylpropanoid Natural products 0.000 description 1
- 150000002995 phenylpropanoid derivatives Chemical class 0.000 description 1
- 239000003016 pheromone Substances 0.000 description 1
- 125000002467 phosphate group Chemical group [H]OP(=O)(O[H])O[*] 0.000 description 1
- UEZVMMHDMIWARA-UHFFFAOYSA-M phosphonate Chemical compound [O-]P(=O)=O UEZVMMHDMIWARA-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 230000029553 photosynthesis Effects 0.000 description 1
- 238000010672 photosynthesis Methods 0.000 description 1
- 230000004962 physiological condition Effects 0.000 description 1
- 230000035479 physiological effects, processes and functions Effects 0.000 description 1
- 229940085127 phytase Drugs 0.000 description 1
- 239000000467 phytic acid Substances 0.000 description 1
- 229940068041 phytic acid Drugs 0.000 description 1
- 229930195732 phytohormone Natural products 0.000 description 1
- 230000003032 phytopathogenic effect Effects 0.000 description 1
- 239000000049 pigment Substances 0.000 description 1
- 230000019612 pigmentation Effects 0.000 description 1
- 239000003375 plant hormone Substances 0.000 description 1
- 238000013492 plasmid preparation Methods 0.000 description 1
- 229920003023 plastic Polymers 0.000 description 1
- 239000004033 plastic Substances 0.000 description 1
- 231100000719 pollutant Toxicity 0.000 description 1
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 description 1
- 230000032361 posttranscriptional gene silencing Effects 0.000 description 1
- 235000012015 potatoes Nutrition 0.000 description 1
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 1
- 230000019525 primary metabolic process Effects 0.000 description 1
- 210000001236 prokaryotic cell Anatomy 0.000 description 1
- 108060006633 protein kinase Proteins 0.000 description 1
- 235000014774 prunus Nutrition 0.000 description 1
- 235000015136 pumpkin Nutrition 0.000 description 1
- 238000012175 pyrosequencing Methods 0.000 description 1
- MUPFEKGTMRGPLJ-ZQSKZDJDSA-N raffinose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO[C@@H]2[C@@H]([C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O2)O)O1 MUPFEKGTMRGPLJ-ZQSKZDJDSA-N 0.000 description 1
- 238000002708 random mutagenesis Methods 0.000 description 1
- 230000022532 regulation of transcription, DNA-dependent Effects 0.000 description 1
- 230000003362 replicative effect Effects 0.000 description 1
- 238000012552 review Methods 0.000 description 1
- 101150021296 rip2 gene Proteins 0.000 description 1
- 230000002786 root growth Effects 0.000 description 1
- 229960004889 salicylic acid Drugs 0.000 description 1
- 239000004576 sand Substances 0.000 description 1
- 238000003345 scintillation counting Methods 0.000 description 1
- 239000013049 sediment Substances 0.000 description 1
- 238000010187 selection method Methods 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 1
- 229930004725 sesquiterpene Natural products 0.000 description 1
- 150000004354 sesquiterpene derivatives Chemical class 0.000 description 1
- 230000035939 shock Effects 0.000 description 1
- 239000013605 shuttle vector Substances 0.000 description 1
- 230000019491 signal transduction Effects 0.000 description 1
- 229910052710 silicon Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000010703 silicon Substances 0.000 description 1
- 238000002741 site-directed mutagenesis Methods 0.000 description 1
- 239000004055 small Interfering RNA Substances 0.000 description 1
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 1
- 239000007790 solid phase Substances 0.000 description 1
- 108010048090 soybean lectin Proteins 0.000 description 1
- 238000002798 spectrophotometry method Methods 0.000 description 1
- 238000001228 spectrum Methods 0.000 description 1
- 230000002269 spontaneous effect Effects 0.000 description 1
- 239000007921 spray Substances 0.000 description 1
- 238000005507 spraying Methods 0.000 description 1
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 1
- 239000008107 starch Substances 0.000 description 1
- 235000019698 starch Nutrition 0.000 description 1
- 108010031092 starch-branching enzyme II Proteins 0.000 description 1
- 239000008117 stearic acid Substances 0.000 description 1
- 239000003270 steroid hormone Substances 0.000 description 1
- 150000003431 steroids Chemical class 0.000 description 1
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 1
- 229960005322 streptomycin Drugs 0.000 description 1
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 1
- PQTBTIFWAXVEPB-UHFFFAOYSA-N sulcotrione Chemical compound ClC1=CC(S(=O)(=O)C)=CC=C1C(=O)C1C(=O)CCCC1=O PQTBTIFWAXVEPB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229940124530 sulfonamide Drugs 0.000 description 1
- 150000003456 sulfonamides Chemical class 0.000 description 1
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 1
- 238000004114 suspension culture Methods 0.000 description 1
- 230000001360 synchronised effect Effects 0.000 description 1
- 108700020534 tetracycline resistance-encoding transposon repressor Proteins 0.000 description 1
- 239000003104 tissue culture media Substances 0.000 description 1
- 239000003440 toxic substance Substances 0.000 description 1
- 239000003053 toxin Substances 0.000 description 1
- 231100000765 toxin Toxicity 0.000 description 1
- 108091006106 transcriptional activators Proteins 0.000 description 1
- 230000007704 transition Effects 0.000 description 1
- REEQLXCGVXDJSQ-UHFFFAOYSA-N trichlopyr Chemical compound OC(=O)COC1=NC(Cl)=C(Cl)C=C1Cl REEQLXCGVXDJSQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- PIEPQKCYPFFYMG-UHFFFAOYSA-N tris acetate Chemical compound CC(O)=O.OCC(N)(CO)CO PIEPQKCYPFFYMG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101150081616 trpB gene Proteins 0.000 description 1
- 101150111232 trpB-1 gene Proteins 0.000 description 1
- 239000012588 trypsin Substances 0.000 description 1
- 239000002753 trypsin inhibitor Substances 0.000 description 1
- 238000010396 two-hybrid screening Methods 0.000 description 1
- OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N tyrosine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000010798 ubiquitination Methods 0.000 description 1
- 101150101900 uidA gene Proteins 0.000 description 1
- 241000701447 unidentified baculovirus Species 0.000 description 1
- 241001478887 unidentified soil bacteria Species 0.000 description 1
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 1
- 229940035893 uracil Drugs 0.000 description 1
- 150000003672 ureas Chemical class 0.000 description 1
- 235000013311 vegetables Nutrition 0.000 description 1
- 230000017260 vegetative to reproductive phase transition of meristem Effects 0.000 description 1
- 239000002435 venom Substances 0.000 description 1
- 231100000611 venom Toxicity 0.000 description 1
- 210000001048 venom Anatomy 0.000 description 1
- 239000010455 vermiculite Substances 0.000 description 1
- 235000019354 vermiculite Nutrition 0.000 description 1
- 229910052902 vermiculite Inorganic materials 0.000 description 1
- 108700026220 vif Genes Proteins 0.000 description 1
- 230000009385 viral infection Effects 0.000 description 1
- 230000000007 visual effect Effects 0.000 description 1
- 108091009357 vitamin binding proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000028728 vitamin binding proteins Human genes 0.000 description 1
- 239000003643 water by type Substances 0.000 description 1
- 101150074257 xylE gene Proteins 0.000 description 1
- 235000020138 yakult Nutrition 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
- C12N15/8201—Methods for introducing genetic material into plant cells, e.g. DNA, RNA, stable or transient incorporation, tissue culture methods adapted for transformation
- C12N15/8213—Targeted insertion of genes into the plant genome by homologous recombination
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
- C12N15/8201—Methods for introducing genetic material into plant cells, e.g. DNA, RNA, stable or transient incorporation, tissue culture methods adapted for transformation
- C12N15/8209—Selection, visualisation of transformants, reporter constructs, e.g. antibiotic resistance markers
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
- C12N15/8201—Methods for introducing genetic material into plant cells, e.g. DNA, RNA, stable or transient incorporation, tissue culture methods adapted for transformation
- C12N15/8209—Selection, visualisation of transformants, reporter constructs, e.g. antibiotic resistance markers
- C12N15/821—Non-antibiotic resistance markers, e.g. morphogenetic, metabolic markers
- C12N15/8212—Colour markers, e.g. beta-glucoronidase [GUS], green fluorescent protein [GFP], carotenoid
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
- C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
- C12N15/8261—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield
- C12N15/8271—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance
- C12N15/8274—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance for herbicide resistance
- C12N15/8275—Glyphosate
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Zoology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Breeding Of Plants And Reproduction By Means Of Culturing (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Abstract
Группа изобретений относится к биотехнологии, а именно к области точной трансформации растений, направленной геномной интеграции и экспрессии белка у растений. Предложена полинуклеотидная донорная кассета для трансформации растения, которая содержит связывающий домен сайт-специфической нуклеазы, аналитический домен, включающий полинуклеотидную последовательность с по меньшей мере 99% идентичностью последовательности с SEQ ID NO: 142, и плазмидный домен. Полинуклеотидную донорную кассету используют для получения трансгенной клетки для трансформации растения. Изобретения обеспечивают направленное встраивание универсальной полинуклеотидной донорной кассеты в геном клетки растения, быстрый скрининг сайтов-мишеней и нуклеаз, а также минимизируют последовательности, которые сложно амплифицировать. 3 н. и 12 з.п. ф-лы, 17 ил., 8 табл., 4 пр.
Description
ПЕРЕКРЕСТНАЯ ССЫЛКА НА СВЯЗАННЫЕ ЗАЯВКИ
[0001] По данной заявке испрашивают приоритет, согласно 35 U.S.C. §119(e), предварительной патентной заявки США № 61/899,543, поданной 4 ноября 2013 года, содержание которой включено в данном документе посредством ссылки в полном объеме в настоящую заявку.
ОТСЫЛКА К СПИСКУ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ, ПОДАННОМУ В ЭЛЕКТРОННОМ ВИДЕ
[0002] Официальная копия списка последовательностей подана в электронном виде через EFS-Web в виде ASCII форматированного списка последовательностей в файле с названием «74435_ST25.txt», созданном 3 ноября 2014 года и имеющим размер 100 килобайт, который подан одновременно с описанием. Список последовательностей, содержащийся в ASCII форматированном документе, представляет собой часть описания и включен в настоящий документ посредством ссылки в полном объеме.
ОБЛАСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ
[0003] Раскрытие относится к области точной трансформации растений, направленного воздействия на гены, направленной геномной интеграции и экспрессии белка у растений. В одном из вариантов осуществления в раскрытии описана универсальная донорная полинуклеотидная молекула, которую можно вставлять в целевые местоположения в геномах растений и анализировать высокопроизводительным и эффективным образом.
ПРЕДПОСЫЛКИ ИЗОБРЕТЕНИЯ
[0004] Введение агрономически значимых признаков в растения можно использовать для того, чтобы улучшать критерии питательной ценности, увеличивать урожай, обеспечивать устойчивость к вредителям или заболеваниям, увеличивать переносимость засухи и стресса, повышать садоводческие качества (например, пигментация и цветение), придавать устойчивость к гербицидам, делать возможным получение промышленно-применимых соединений и/или материалов из растения и/или делать возможным получение фармацевтических средств. Трансгенные растения типично создают путем технологии опосредованной агробактериями трансформации. Другие технологии трансформации, такие как PEG-опосредованный захват ДНК в протопластах, бомбардировка микрочастицами и опосредованная кремниевыми нитевидными кристаллами трансформация, также можно использовать для получения трансгенных растений. Введение клонированных генов в клетки растений и восстановление стабильных плодоносящих трансгенных растений можно использовать для того, чтобы выполнять такие модификации растения и делать возможной генетическую инженерию растений для улучшения культуры. Используя эти способы, чужеродную ДНК случайным образом встраивают в ядерную или пластидную ДНК эукариотической клетки растения, после чего следует выделение клеток, которые содержат чужеродную ДНК, встроенную в ДНК клетки, чтобы получать стабильно трансформированные клетки растений.
[0005] Способы трансформации растений, описанные выше, ведут ко встраиванию трансгенов в случайных местоположениях генома растения и с различными числами копий. Часто происходит встраивание трансгенов в виде повторов или всего трансгена или его частей. Сложные паттерны встраивания могут влиять на уровень экспрессии трансгенов (например, посредством разрушения транскрибированной РНК через механизмы посттранскрипционного сайленсинга генов, или посредством индукции метилирования введенной ДНК), тем самым осуществляя понижающую регуляцию транскрипции трансгена. Кроме того, на уровень экспрессии трансгена может влиять местоположение встраивания (например, эффект положения) в геноме растения. Комбинация этих факторов ведет к широкой вариации уровней экспрессии трансгенов или чужеродной ДНК, представляющей интерес, среди различных трансгенных клеток растений и линий растений. Кроме того, встраивание чужеродной ДНК, представляющей интерес, может оказывать разрушающий эффект на область генома, где происходит встраивание, и может оказывать влияние или нарушать нормальную функцию этой целевой области, что тем самым ведет к часто нежелательным побочным эффектам.
[0006] Приведенное выше неизбежно влечет то, что всякий раз когда исследуют эффект введения конкретной чужеродной ДНК в растение, создают и анализируют большое число трансгенных линий растений для того, чтобы получать значимые результаты. Аналогичным образом, при создании трансгенных сельскохозяйственных культур, когда конкретную ДНК, представляющую интерес, вводят в растения, чтобы предоставлять трансгенное растение с желаемым фенотипом, создают большую популяцию независимо созданных трансгенных линий растений для того, чтобы сделать возможным селекцию линий растений с оптимальной экспрессией трансгенов и с минимальными или нулевыми побочными эффектами, оказываемыми на общий фенотип трансгенного растения. В частности, в этой области желательно иметь более направленные трансгенные подходы, например, ввиду обременительных регуляторных требований и высоких расходов, связанных с повторными полевыми испытаниями, которые необходимы для устранения нежелательных трансгенных событий. Кроме того, ясно, что возможность направленной инсерции ДНК также полезна в процессе стэкинга трансгенов.
[0007] Несколько способов разработано с целью управления инсерцией трансгенов в растениях. См., например, Kumar and Fladung (2001) Trends Plant Sci. 6:155-9. Эти способы опираются на встраивание трансгена, основанное на гомологичной рекомбинации. Эту стратегию успешно применяли у прокариотов и низших эукариотов. Paszkowski et al. (1988) EMBO J. 7:4021-6. Однако, для растений до последнего времени преобладающий механизм встраивания трансгенов основан на неправильной рекомбинации, при которой используют небольшую гомологию между цепями ДНК, участвующими в рекомбинации. Следовательно, основная проблема в этой области состоит в обнаружении редких событий гомологичной рекомбинации, которые скрыты за значительно более эффективным встраиванием введенной чужеродной ДНК через неправильную рекомбинацию.
[0008] Специально разработанные нуклеазы с цинковыми пальцами (ZFN) представляют собой белки, разработанные для того, чтобы специфично создавать двухцепочечных разрыв ДНК в целевом сайте, с последующей рекомбинацией расщепленных концов. ZFN объединяют неспецифичный расщепляющий домен рестрикционной эндонуклеазы, такой как, например, FokI, с ДНК-связывающими белками с цинковыми пальцами. См., например, Huang et al. (1996) J. Protein Chem. 15:481-9; Kim et al. (1997) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94:3616-20; Kim et al. (1996) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:1156-60; Kim et al. (1994) Proc Natl. Acad. Sci. USA 91:883-7; Kim et al. (1997b) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94:12875-9; Kim et al. (1997c) Gene 203:43-9; Kim et al. (1998) Biol. Chem. 379:489-95; Nahon and Raveh (1998) Nucleic Acids Res. 26:1233-9; Smith et al. (1999) Nucleic Acids Res. 27:674-81. Индивидуальные мотивы цинковых пальцев можно разрабатывать для нацеливания и связывания с широким диапазоном сайтов ДНК. Канонические Cys2His2, а также неканонические Cys3His белки с цинковыми пальцами связывают ДНК, вставляя α-спираль в большую бороздку двойной спирали. Распознавание ДНК цинковыми пальцами происходит модульно: каждый палец контактирует в основном с тремя последовательными парами оснований в мишени, и несколько ключевых остатков в белке опосредуют распознавание. Показано, что рестрикционная эндонуклеаза FokI должна образовать димер через домен нуклеазы для того, чтобы расщеплять ДНК, создавая двухцепочечный разрыв. Аналогичным образом, для ZFN также необходима димеризация домена нуклеазы для того, чтобы резать ДНК. Mani et al. (2005) Biochem. Biophys. Res. Commun. 334:1191-7; Smith et al. (2000) Nucleic Acids Res. 28:3361-9. Димеризации ZFN способствуют два смежных, противоположно ориентированных сайта связывания. id.
[0009] Приведенные выше примеры из связанной области и ограничения, связанные с ними, предназначены в качестве иллюстрации, а не ограничения. Другие ограничения связанной области будут видны специалистам в данной области при прочтении описания.
КРАТКАЯ СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ
[0010] В предпочтительном варианте осуществления раскрытие относится к полинуклеотидной донорной кассете, которая содержит связывающий домен сайт-специфической нуклеазы, аналитический домен и плазмидный домен. В дополнительном варианте осуществления полинуклеотидная донорная кассета содержит отрезок меньше чем 3 т.п.о. Дополнительные варианты осуществления включают трансгенную клетку, которая содержит полинуклеотидную донорную кассету. В некоторых аспектах, трансгенная клетка представляет собой трансгенную клетку растения. В другом варианте осуществления раскрытие относится к трансгенному растению, которое содержит трансгенную клетку растения. Дополнительные аспекты включают трансгенное растение, в которых растение представляет собой односеменодольное растение или двусеменодольное растение. В других вариантах осуществления односеменодольное растение выбирают из группы, состоящей из растения кукурузы, растения пшеницы и растения риса. В других вариантах осуществления двусеменодольное растение выбирают из группы, состоящей из растения соевых бобов, растения хлопка и растения канолы. Кроме того, раскрытие относится к трансгенному семени, полученному от трансгенного растения.
[0011] В еще одном другом варианте осуществления рассматриваемое раскрытие относится к полинуклеотидной донорной кассете, в котором полинуклеотидную донорную кассету выбирают из группы, состоящей из полинуклеотидной последовательности с по меньшей мере 90% идентичности последовательностей с SEQ ID NO: 132, полинуклеотидной последовательности с 90% идентичности последовательностей с SEQ ID NO: 133, полинуклеотидной последовательности с по меньшей мере 90% идентичности последовательностей с SEQ ID NO: 134, полинуклеотидной последовательности с по меньшей мере 90% идентичности последовательностей с SEQ ID NO: 135, полинуклеотидной последовательности с по меньшей мере 90% идентичности последовательностей с SEQ ID NO: 136, полинуклеотидной последовательности с по меньшей мере 90% идентичности последовательностей с SEQ ID NO: 137, полинуклеотидной последовательности с по меньшей мере 90% идентичности последовательностей с SEQ ID NO: 138, полинуклеотидной последовательности с по меньшей мере 90% идентичности последовательностей с SEQ ID NO: 139, полинуклеотидной последовательности с по меньшей мере 90% идентичности последовательностей с SEQ ID NO: 140 и полинуклеотидной последовательности с по меньшей мере 90% идентичности последовательностей с SEQ ID NO: 141.
[0012] В дополнительных вариантах осуществления полинуклеотидная донорная кассета состоит из связывающего домена сайт-специфической нуклеазы, который выполнен из одной или нескольких связывающих последовательностей сайт-специфической нуклеазы. В одном из аспектов связывающий домен сайт-специфической нуклеазы, содержащий одну или несколько связывающих последовательностей сайт-специфической нуклеазы, связывается связывающим белком с цинковыми пальцами, связывающим белком мегануклеазы, CRISPR связывающим белком или TALEN связывающим белком.
[0013] В других вариантах осуществления полинуклеотидная донорная кассета содержит аналитический домен, выбранный из группы, состоящей из полинуклеотидной последовательности с по меньшей мере 90% идентичности последовательностей с SEQ ID NO: 142 и полинуклеотидной последовательности с по меньшей мере 90% идентичности последовательностей с SEQ ID NO: 143. В некоторых аспектах аналитический домен содержит одну или несколько последовательностей рестрикционных ферментов. В других аспектах аналитический домен имеет процентную долю пары оснований гуанин и цитозин от 40 до 60%. В дополнительных аспектах аналитический домен содержит полинуклеотид, который не содержит множество повторяющихся последовательностей, в котором повторяющаяся последовательность составляет по меньшей мере 9 п.о. в длину. В дополнительных аспектах аналитический домен содержит полинуклеотид, который не содержит серию последовательностей из идентичных пар оснований больше чем 9 п.о. в длину. В одном из аспектов аналитический домен содержит полинуклеотид со вторичной структурой больше чем -19 ккал/моль свободной энергии (ΔG). В различных других аспектах аналитический домен содержит одну или несколько связывающих праймер последовательностей.
[0014] В одном из вариантов осуществления полинуклеотидная донорная кассета содержит одну или несколько последовательностей гомологичных звеньев. В других аспектах одна или несколько последовательностей гомологичных звеньев составляют между 50 и 100 парами оснований в длину. В другом варианте осуществления аналитический домен не кодирует пептид. В еще одном другом варианте осуществления, аналитический домен кодирует пептид. В одном из аспектов аналитический домен содержит кассету экспрессии гена, которая содержит трансген. В дополнительном аспекте, кассета экспрессии гена содержит промотор. В еще одном аспекте трансген содержит репортерный ген. В дополнительном аспекте, репортерный ген выбирают из группы, состоящей из гена yfp, гена gus, гена rfp, гена gfp, гена устойчивости к канамицину, гена aad-1, гена aad-12, гена pat и гена устойчивости к глифосату. В дополнительном варианте осуществления, плазмидный домен содержит плазмиду pUC19. В одном из аспектов плазмидный домен содержит высококопийный участок начала репликации. В дополнительном аспекте, высококопийный участок начала репликации содержит участок начала репликации cole1. В дополнительном аспекте, плазмидный домен содержит селективный маркер. В дополнительном аспекте, селективный маркер выбирают из группы, состоящей из канамицинового селективного маркера, ампициллинового селективного маркера, спектиномицинового селективного маркера, хлорамфениколового селективного маркера и рифампицинового селективного маркера.
[0015] В одном из вариантов осуществления рассматриваемое раскрытие относится к способу направленного встраивания полинуклеотидной донорной кассеты в геном клетки растения. В одном из аспектов способ относится к экспрессированию сайт-специфической ДНК-связывающей нуклеазы, которая содержит по меньшей мере один ДНК-связывающий домен и по меньшей мере один домен нуклеазы, в котором по меньшей мере один ДНК-связывающий домен связывается с сайтом-мишенью в геноме клетки растения; приведению клетки растения в контакт с полинуклеотидной донорной кассетой; расщеплению сайта-мишени в геноме клетки растения сайт-специфической ДНК-связывающей нуклеазой; и встраиванию полинуклеотидной донорной кассеты в сайт-мишень в геноме клетки растения. В дополнительном аспекте, по меньшей мере один ДНК-связывающий домен выбирают из группы, состоящей из связывающего домена цинкового пальца, связывающего домена мегануклеазы, TALEN связывающего домена, мегануклеазы и CRISPR связывающего домена. В другом аспекте домен нуклеазы происходит из рестрикционной эндонуклеазы IIS типа. В другом аспекте рестрикционную эндонуклеазу IIS типа выбирают из группы, состоящей из FokI и StsI. В дополнительном аспекте, полинуклеотидная донорная кассета экспрессирует полипептид. В еще одном аспекте полинуклеотидная донорная кассета содержит некодирующую последовательность нуклеиновой кислоты. В одном из аспектов полинуклеотидная донорная кассета содержит одну или несколько связывающих последовательностей цинковых пальцев. В другом аспекте полинуклеотидная донорная кассета содержит одну или несколько связывающих праймер последовательностей. В дополнительном аспекте, встраивание полинуклеотидной донорной кассеты происходит через механизм репарации по гомологии. В дополнительном аспекте, встраивание полинуклеотидной донорной кассеты происходит через механизм репарации через соединение негомологичных концов. В одном из вариантов осуществления клетка растения, выбранная для встраивания полинуклеотидной донорной кассеты, представляет собой клетку односеменодольного или двусеменодольного растения. В одном из вариантов осуществления клетка растения представляет собой клетку односеменодольного растения, выбранную из группы, состоящей из клетки растения кукурузы, клетки растения пшеницы и клетки растения риса. В одном из вариантов осуществления клетка растения представляет собой клетку двусеменодольного растения, выбранную из группы, состоящей из клетки растения соевых бобов, клетки растения хлопка и клетки растения канолы.
[0016] В дополнение к образцовым аспектам и вариантам осуществления, описанным выше, дополнительные аспекты и варианты осуществления станут очевидны при изучении следующего описания.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ФИГУР
[0017] На фиг. 1 проиллюстрирована плазмидная карта pDAB111845. Пронумерованные элементы (т.е. 5, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 15, 16, 25 и 26) соответствуют связывающим последовательностям нуклеаз с цинковыми пальцами приблизительно от 20 до 35 пар оснований в длину, которые распознают и расщепляют соответствующие белки нуклеаз с цинковыми пальцами. Эти связывающие последовательности цинковых пальцев и аннотированная «последовательность UZI» (которая представляет собой матричную область 100-150 п.о., содержащую участки рестрикции и ДНК последовательности для разработки праймеров или кодирующие последовательности) содержат универсальную донорную кассету.
[0018] На фиг. 2 проиллюстрирована плазмидная карта pDAB111846. Пронумерованные элементы (т.е. 1, 2, 5, 6, 11, 12, 15, 16, 21, 22, 29 и 30) соответствуют связывающим последовательностям нуклеаз с цинковыми пальцами приблизительно от 20 до 35 пар оснований в длину, которые распознают и расщепляют соответствующие белки нуклеаз с цинковыми пальцами. Эти связывающие последовательности цинковых пальцев и аннотированная «последовательность UZI» (которая представляет собой матричную область 100-150 п.о., содержащую участки рестрикции и ДНК последовательности для разработки праймеров или кодирующие последовательности) содержат универсальную донорную кассету.
[0019] На фиг, 3 проиллюстрирована плазмидная карта pDAB117415. Пронумерованные элементы (т.е. ZFN51 и ZFN52) соответствуют связывающим последовательностям нуклеаз с цинковыми пальцами приблизительно от 20 до 35 пар оснований в длину, которые распознают и расщепляют соответствующие белки нуклеаз с цинковыми пальцами. Эти связывающие последовательности цинковых пальцев и аннотированная «последовательность UZI» (которая представляет собой матричную область 100-150 п.о., содержащую участки рестрикции и ДНК последовательности для разработки праймеров или кодирующие последовательности) содержат универсальную донорную кассету. Дополнительно в эту конструкцию плазмиды включено «перекрытие 104113», которое представляет собой последовательности, которые обладают гомологией с плазмидным вектором для высокопроизводительной сборки универсальных донорных кассет в плазмидном векторе (т.е. через сборку по Гибсону).
[0020] На фиг. 4 проиллюстрирована плазмидная карта pDAB117416. Пронумерованные элементы (т.е. ZFN54 и ZFN53) соответствуют связывающим последовательностям нуклеаз с цинковыми пальцами приблизительно от 20 до 35 пар оснований в длину, которые распознают и расщепляют соответствующие белки нуклеаз с цинковыми пальцами. Эти связывающие последовательности цинковых пальцев и аннотированная «последовательность UZI» (которая представляет собой матричную область 100-150 п.о., содержащую участки рестрикции и ДНК последовательности для разработки праймеров или кодирующие последовательности) содержат универсальную донорную кассету. Дополнительно в эту конструкцию плазмиды включено «перекрытие 104113», которое представляют собой последовательности, которые имеют гомологию с плазмидным вектором для высокопроизводительной сборки универсальных донорных кассет в плазмидном векторе (т.е. через сборку по Гибсону).
[0021] На фиг. 5 проиллюстрирована плазмидная карта pDAB117417. Пронумерованный элемент (т.е. ZFN55) соответствует связывающим последовательностям нуклеаз с цинковыми пальцами приблизительно от 20 до 35 пар оснований в длину, которые распознают и расщепляют соответствующие белки нуклеаз с цинковыми пальцами. Эти связывающие последовательности цинковых пальцев и аннотированная «последовательность UZI» (которая представляет собой матричную область 100-150 п.о., содержащую участки рестрикции и ДНК последовательности для разработки праймеров или кодирующие последовательности) содержат универсальную донорную кассету. Дополнительно в эту конструкцию плазмиды включено «перекрытие 104113», которое представляет собой последовательности, которые имеют гомологию с плазмидным вектором для высокопроизводительной сборки универсальных донорных кассет в плазмидном векторе (т.е. через сборку по Гибсону).
[0022] На фиг. 6 проиллюстрирована плазмидная карта pDAB117419. Пронумерованные элементы (т.е. ZFN59 и ZFN60) соответствуют связывающим последовательностям нуклеаз с цинковыми пальцами приблизительно от 20 до 35 пар оснований в длину, которые распознают и расщепляют соответствующие белки нуклеаз с цинковыми пальцами. Эти связывающие последовательности цинковых пальцев и аннотированная «последовательность UZI» (которая представляет собой матричную область 100-150 п.о., содержащую участки рестрикции и ДНК последовательности для разработки праймеров или кодирующие последовательности) содержат универсальную донорную кассету. Дополнительно в эту конструкцию плазмиды включено «перекрытие 104113», которое представляет собой последовательности, которые имеют гомологию с плазмидным вектором для высокопроизводительной сборки универсальных донорных кассет в плазмидном векторе (т.е. через сборку по Гибсону).
[0023] На фиг. 7 проиллюстрирована плазмидная карта pDAB117434. Пронумерованные элементы (т.е. ZFN66, ZFN67, ZFN68 и ZFN69) соответствуют связывающим последовательностям нуклеаз с цинковыми пальцами приблизительно от 20 до 35 пар оснований в длину, которые распознают и расщепляют соответствующие белки нуклеаз с цинковыми пальцами. Эти связывающие последовательности цинковых пальцев и аннотированная «последовательность UZI» (которая представляет собой матричную область 100-150 п.о., содержащую участки рестрикции и ДНК последовательности для разработки праймеров или кодирующие последовательности) содержат универсальную донорную кассету. Дополнительно в эту конструкцию плазмиды включено «перекрытие 104113», которое представляет собой последовательности, которые имеют гомологию с плазмидным вектором для высокопроизводительной сборки универсальных донорных кассет в плазмидном векторе (т.е. через сборку по Гибсону).
[0024] На фиг. 8 проиллюстрирована плазмидная карта pDAB117418. Пронумерованные элементы (т.е. ZFN56, ZFN57 и ZFN58) соответствуют связывающим последовательностям нуклеаз с цинковыми пальцами приблизительно от 20 до 35 пар оснований в длину, которые распознают и расщепляют соответствующие белки нуклеаз с цинковыми пальцами. Эти связывающие последовательности цинковых пальцев и аннотированная «последовательность UZI» (которая представляет собой матричную область 100-150 п.о., содержащую участки рестрикции и ДНК последовательности для разработки праймеров или кодирующие последовательности) содержат универсальную донорную кассету. Дополнительно в эту конструкцию плазмиды включено «перекрытие 104113», которое представляет собой последовательности, которые имеют гомологию с плазмидным вектором для высокопроизводительной сборки универсальных донорных кассет в плазмидном векторе (т.е. через сборку по Гибсону).
[0025] На фиг. 9 проиллюстрирована плазмидная карта pDAB117420. Пронумерованные элементы (т.е. ZFN61 и ZFN62) соответствуют связывающим последовательностям нуклеаз с цинковыми пальцами приблизительно от 20 до 35 пар оснований в длину, которые распознают и расщепляют соответствующие белки нуклеаз с цинковыми пальцами. Эти связывающие последовательности цинковых пальцев и аннотированная «последовательность UZI» (которая представляет собой матричную область 100-150 п.о., содержащую участки рестрикции и ДНК последовательности для разработки праймеров или кодирующие последовательности) содержат универсальную донорную кассету. Дополнительно в эту конструкцию плазмиды включено «перекрытие 104113», которое представляет собой последовательности, которые имеют гомологию с плазмидным вектором для высокопроизводительной сборки универсальных донорных кассет в плазмидном векторе (т.е. через сборку по Гибсону).
На фиг. 10 проиллюстрирована плазмидная карта pDAB117421. Пронумерованные элементы (т.е. PPL17 пара 3, PPL17 пара 1 и PPL17 пара 2) соответствуют связывающим последовательностям нуклеаз с цинковыми пальцами приблизительно от 20 до 35 пар оснований в длину, которые распознают и расщепляют соответствующие белки нуклеаз с цинковыми пальцами. Эти связывающие последовательности цинковых пальцев и аннотированная «последовательность UZI» (которая представляет собой матричную область 100-150 п.о., содержащую участки рестрикции и ДНК последовательности для разработки праймеров или кодирующие последовательности) содержат универсальную донорную кассету. Дополнительно в эту конструкцию плазмиды включено «перекрытие 104113», которое представляет собой последовательности, которые имеют гомологию с плазмидным вектором для высокопроизводительной сборки универсальных донорных кассет в плазмидном векторе (т.е. через сборку по Гибсону).
[0026] На фиг. 11 представление универсальной донорной полинуклеотидной последовательности для встраивания через соединение негомологичных концов (NHEJ). Два предложенных вектора предусматривают ДНК, представляющую интерес (ДНК X), которая содержит один или несколько (т.е. «1-N») сайтов связывания цинковых пальцев (ZFN BS) на любом конце ДНК, представляющей интерес. Вертикальные стрелки показывают уникальные участки рестрикции и горизонтальные стрелки представляют потенциальные сайты праймеров для ПЦР.
[0027] На фиг. 12 представление универсальной донорной полинуклеотидной последовательности для встраивания через репарацию по гомологии (HDR). ДНК, представляющая интерес, (ДНК X) содержит две области гомологичных последовательностей (HA), фланкирующих ДНК, представляющую интерес, с сайтами связывания нуклеаз с цинковыми пальцами (ZFN), окружающими ДНК X и HA последовательности. Вертикальные стрелки показывают уникальные участки рестрикции и горизонтальные стрелки представляют потенциальные сайты праймеров для ПЦР.
[0028] На фиг. 13A-13C проиллюстрированы конструкции, используемые для направленного воздействия и валидации встраивания универсальной донорной полинуклеотидной системы при направленном воздействии и валидаци для оптимальных геномных локусов Zea mays. Фиг. 13A: пространство разработки ZFN с местоположением пар ZFN, как предварительно показано на pDAB111845 с фиг. 5. Пары ZFN пронумерованы и соответствуют конкретным связывающим ZFN последовательностям, которые специфически распознают ZFN белки для связывания и расщепления. Фиг. 13B: конфигурация конструкции для экспрессии ZFN белка. Конструкция для ZFN экспрессии содержит конститутивный промотор растения (Zm Ubi1), который используют для управления экспрессией ZFN белка. ZFN белок содержит последовательность ядерной локализации (NLS), белки с цинковыми пальцами (ZFP-L и ZFP-R, где L обозначает левый связывающий ZFN белок и R обозначает правый связывающий белок), эндонуклеазу Fok-1 (Fok1) и самостоятельно гидролизующий 2A (2A). Фиг. 13C: универсальный донорный полинуклеотид для NHEJ-опосредованного направленного воздействия на оптимальные геномные локусы Zea mays. Z1-Z6 представляют сайты связывания ZFN, специфичные для направленного воздействия на оптимальные геномные локусы Zea mays. Число ZFN сайтов может варьировать от 3 до 6. Вертикальные стрелки показывают уникальные участки рестрикции и горизонтальные стрелкы представляют потенциальные сайты праймеров для ПЦР. Универсальная донорная полинуклеотидная система представляет собой короткую (110 п.о.) последовательность, которая является общей для доноров, используемых для встраивания в оптимальные геномные локусы Zea mays.
[0029] На фиг. 14 проиллюстрирована плазмидная карта pDAB8393.
[0030] На фиг. 15 проиллюстрирована расщепляющая активность ZFN в выбранных целевых геномных локусах Zea mays. Расщепляющую активность представляют как число последовательностей с инсерциями и делециями в сайте расщепления ZFN на 1 миллион высококачественных ридов.
[0031] На фиг. 16 проиллюстрирована валидация выбранных целевых геномных локусов Zea mays с использованием способа быстрого анализа направленного воздействия (RTA) на основе NHEJ.
[0032] На фиг. 17 проиллюстрированы плазмидные конструкции, которыми трансформировали Zea mays через случайное встраивание, которое содержит события, используемые для анализа фланкирующих последовательностей и исследования экспрессии трансгенов.
ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ
I. Обзор
[0033] Настоящее раскрытие в различных аспектах предусматривает полинуклеотидные донорные кассеты, которые содержат связывающий домен нуклеазы с цинковыми пальцами, аналитический домен и плазмидный домен. В других аспектах, настоящее раскрытие предусматривает способы, которые обеспечивают направленное встраивание полинуклеотидных донорных кассет в геном клетки растения. В соответствии с раскрытыми способами, сайт-специфическую ДНК-связывающую нуклеазу, которая содержит по меньшей мере один ДНК-связывающий домен и по меньшей мере один домен нуклеазы, экспрессируют так, что по меньшей мере один ДНК-связывающий домен связывается с сайтом-мишенью в геноме клетки растения. Кроме того, клетку растения приводят в контакт с полинуклеотидной донорной кассетой. Впоследствии сайт-мишень в геноме клетки растения расщепляют сайт-специфической ДНК-связывающей нуклеазой и интегрируют полинуклеотидную донорную кассету в сайт-мишень в геноме клетки растения.
II. Термины
[0034] Пока не определено иное, все технические и научные термины, используемые в настоящем документе, имеют то же значение, в котором их обыкновенно понимает специалист в той области, к которой относится это раскрытие. В случае противоречия, настоящая заявка, содержащая определения, будет иметь определяющее значение. Пока контекст не требует иного, термины в единственном числе включают множественное число и термины во множественном числе включают единственное число. Все публикации, патенты и другие литературные источники, упомянутые в настоящем документе, включены посредством ссылки во всей их полноте для всех целей, как если бы было конкретно и индивидуально указано, что каждая отдельная публикация или патентная заявка включена посредством ссылки, если только не указано, что конкретные разделы патентов или патентных публикаций подлежат включению посредством ссылки.
[0035] Для того чтобы дополнительно разъяснить это раскрытие, приведены следующие термины, сокращения и определения.
[0036] Как используют в настоящем документе, термины «содержит», «содержащий», «включает», «включающий», «имеет» или «имеющий» или какие-либо другие их вариации предназначены для того, чтобы быть неисключающими или открытыми. Например, композиция, смесь, процесс, способ, изделие или аппарат, которые содержат список элементов, не обязательно ограничены только этими элементами, и могут включать другие элементы, в явной форме не перечисленные или присущие такой композиции, смеси, процессу, способу, изделию или аппарату. Кроме того, пока в явной форме не указано иное, «или» относится ко включающему или и не к исключающему или. Например, условие A или B отвечает любому одному из следующего: A является истиной (или присутствует) и B является ложью (или не присутствует), A является ложью (или не присутствует) и B является истиной (или присутствует) и как A, так и B являются истиной (или присутствуют).
[0037] Термин «изобретение» или «настоящее изобретение», как используют в настоящем документе, представляет собой неограничивающий термин, который не предназначен для обозначения какого-либо одного варианта осуществления конкретного изобретения, и охватывает все возможные варианты осуществления, как раскрыто в заявке.
[0038] Как используют в настоящем документе, термин «растение» включает целое растение и любого потомка, клетку, ткань или часть растения. Термин «часть растения» включает любую часть(части) растения, в том числе, например, без ограничения: семя (в том числе созревшее семя, несозревший зародыш без семенной оболочки и несозревшее семя); черенок растения; клетку растения; растительную клеточную культуру; орган растения (например, пыльцу, зародыши, цветки, фрукты, побеги, листья, корни, стебли и связанные эксплантаты). Ткань растения или орган растения может представлять собой семя, каллюс или какую-либо другую группу клеток растений, которая организована в структурную или функциональную единицу. Культура клеток или ткани растения может быть способна к регенерации растения, которое имеет физиологические и морфологические характеристики растения, от которого получали клетку или ткань, и к регенерации растения, которое имеет по существу тот же генотип, что и растение. В отличие от этого, некоторые клетки растений не способны к регенерации, чтобы получать растения. Регенеративные клетки в культуре клеток или ткани растения могут представлять собой зародыши, протопласты, меристематические клетки, каллюс, пыльцу, листя, пыльники, корни, корневые кончики, шелк, цветки, косточки, колосья, початки, кожицу или цветоножки.
[0039] Части растения включают собираемые части и части, которые можно использовать для размножения растений-потомков. Части растения, которые можно использовать для размножения, включают, например, без ограничения: семя; фрукт; черенок; сеянец; клубень; и корневище. Собираемая часть растения может представлять собой какую-либо полезную часть растения, в том числе, например, без ограничения: цветок; пыльцу; сеянец; клубень; лист; стебель; фрукт; семя; и корень.
[0040] Клетка растения представляет собой структурную и физиологическую единицу растения. Клетки растений, как используют в настоящем документе, включают протопласты и протопласты с частичной клеточной стенкой. Клетка растения может быть в форме отдельной изолированной клетки или агрегации клеток (например, рыхлый каллюс и культивированная клетка), и может представлять собой часть более высоко организованной единицы (например, ткань растения, орган растения и растение). Таким образом, клетка растения может представлять собой протопласт, гаметопродуцирующую клетку или клетку или совокупность клеток, которые могут регенировать в целое растение. По существу, семя, которое содержит множество клеток растения и которое способно к регенерации в целое растение, считают «частью растения» в вариантах осуществления в настоящем документе.
[0041] Термин «протопласт», как используют в настоящем документе, относится к клетке растения, у которой ее клеточная стенка полностью или частично удалена, с обнаженной ее липидной бислойной мембраной. Типично, протопласт представляет собой выделенную клетку растения без клеточных стенок, которая имеет способность к регенерации в клеточную культуру или целое растение.
[0042] Как используют в настоящем документе, «эндогенная последовательность» определяет нативную форму полинуклеотида, гена или полипептида в его естественном местоположении в организме или в геноме организма.
[0043] Термин «выделенный», как используют в настоящем документе, обозначает удаление из естественного окружения.
[0044] Термин «очищенный», как используют в настоящем документе, относится к выделению молекулы или соединения в форме, которая по существу не содержит загрязнители, обычно связанные с молекулой или соединением в нативном или естественном окружении, и обозначает увеличение чистоты в результате отделения от других компонентов исходной композиции. Термин «очищенная нуклеиновая кислота» используют в настоящем документе для того, чтобы описывать последовательность нуклеиновой кислоты, которая отделена от других соединений, включая в качестве неограничивающих примеров полипептиды, липиды и углеводы.
[0045] Как используют в настоящем документе, термины «полинуклеотид», «нуклеиновая кислота» и «молекула нуклеиновой кислоты» используют взаимозаменяемо, и они могут охватывать одну нуклеиновую кислоту; множество нуклеиновых кислот; фрагмент нуклеиновой кислоты, ее вариант или производное; и конструкцию из нуклеиновой кислоты (например, информационная РНК (мРНК) и плазмидная ДНК (пДНК)). Полинуклеотид или нуклеиновая кислота может содержать нуклеотидную последовательность полноразмерной кДНК последовательности, или ее фрагмент, в том числе нетранслируемые 5’ и/или 3’ последовательности и кодирующую последовательность(последовательности). Полинуклеотид или нуклеиновая кислота может состоять из любого полирибонуклеотида или полидезоксирибонуклеотида, который может включать немодифицированные рибонуклеотиды или дезоксирибонуклеотиды или модифицированные рибонуклеотиды или дезоксирибонуклеотиды. Например, полинуклеотид или нуклеиновая кислота может состоять из одно- и двухцепочечной ДНК; ДНК, которая представляет собой смесь одно- и двухцепочечных областей; одно- и двухцепочечной РНК; и РНК, которая представляет собой смесь одно- и двухцепочечных областей. Гибридные молекулы, которые содержат ДНК и РНК, могут быть одноцепочечными, двухцепочечными или смесью одно- и двухцепочечных областей. Приведенные выше термины также включают химически, ферментативно и метаболически модифицированные формы полинуклеотида или нуклеиновой кислоты.
[0046] Понятно, что конкретная ДНК также относится к ее комплементарной цепи, последовательность которой определяют согласно правилам образования пар дезоксирибонуклеотидов.
[0047] Как используют в настоящем документе, термин «ген» относится к нуклеиновой кислоте, которая кодирует функциональный продукт (РНК или полипептид/белок). Ген может содержать регуляторные последовательности, предшествующие (5’ некодирующие последовательности) последовательности, кодирующей функциональный продукт и/или следующие за ней (3’ некодирующие последовательности).
[0048] Как используют в настоящем документе, термин «кодирующая последовательность» относится к последовательности нуклеиновой кислоты, которая кодирует конкретную аминокислотную последовательность. «Регуляторная последовательность» относится к нуклеотидной последовательности расположенной выше по направлению считывания (например, 5’ некодирующие последовательности) по относительно кодирующей последовательности, внутри нее или ниже по направлению считывания (например, 3’ некодирующие последовательности), которая влияет на транскрипцию, процессинг или стабильность РНК или трансляцию ассоциированной кодирующей последовательности. Регуляторные последовательности включают, например, без ограничения: промоторы; трансляционные лидерные последовательности; интроны; последовательности распознавания полиаденилирования; сайты процессинга РНК; сайты связывания эффекторов; и структуры «стебель-петля».
[0049] Как используют в настоящем документе, термин «аналитический домен» определяет последовательность нуклеиновой кислоты, которая содержит функциональные элементы, которые способствуют направленной инсерции последовательностей нуклеиновой кислоты. Например, аналитический домен может содержать специально разработанные сайты рестрикционных ферментов, сайты связывания цинковых пальцев, сконструированные посадочные площадки или сконструированные платформы для встраивания трансгенов и могут содержать или не содержать генные регуляторные элементы или открытую рамку считывания. См., например, публикацию патента США № 20110191899, включенную в настоящий документ посредством ссылки в полном объеме.
[0050] Как определено в настоящем документе «связывающий домен сайт-специфической нуклеазы» представляет собой последовательность нуклеиновой кислоты, которая содержит одну или несколько сайт-специфических связывающих последовательностей. Как используют в настоящем документе, сайт-специфическая связывающая последовательность представляет собой последовательность нуклеиновой кислоты, которая связывается с белком при специфическом взаимодействии с последовательностью.
[0051] Как используют в настоящем документе, термин «полипептид» включает один полипептид, множество полипептидов и их фрагменты. Этот термин относится к молекуле, состоящей из мономеров (аминокислот), линейно связанных амидными связями (также известными как пептидные связи). Термин «полипептид» относится к какой-либо цепи или цепям двух или более аминокислот и не относится к конкретной длине или размеру продукта. Соответственно, пептиды, дипептиды, трипептиды, олигопептиды, белок, аминокислотная цепь и какой-либо другой термин, используемый для того, чтобы отослать к цепи или цепям из двух или более аминокислот, включены в определение «полипептида», и приведенные выше термины используют в настоящем документе взаимозаменяемо с «полипептидом». Полипептид можно выделять из естественного биологического источника или получать посредством рекомбинантной технологии, но конкретный полипептид не обязательно транслируют с конкретной нуклеиновой кислоты. Полипептид можно создавать любым подходящим образом, в том числе, например, без ограничения, посредством химического синтеза.
[0052] В отличие от этого, термин «гетерологичный» относится к полинуклеотиду, гену или полипептиду, который обычно не находят в его местоположении в эталонном организме (хозяине). Например, гетерологичная нуклеиновая кислота может представлять собой нуклеиновую кислоту, которую обычно находят в эталонном организме в другом геномном местоположении. В качестве дополнительного примера, гетерологичная нуклеиновая кислота может представлять собой нуклеиновую кислоту, которую обычно не находят в эталонном организме. Организм-хозяин, содержащий гетерологичный полинуклеотид, ген или полипептид, можно получать посредством введения гетерологичного полинуклеотида, гена или полипептида в организм-хозяин. В конкретных примерах гетерологичный полинуклеотид содержит нативную кодирующую последовательность или ее часть, которую повторно вводят в организм-источник в форме, которая отличается от соответствующего нативного полинуклеотида. В конкретных примерах гетерологичный ген содержит нативную кодирующую последовательность или ее часть, которую повторно вводят в организм-источник в форме, которая отличается от соответствующего нативного гена. Например, гетерологичный ген может содержать нативную кодирующую последовательность, которая представляет собой часть химерного гена, содержащего ненативные регуляторные области, который повторно вводят нативному хозяину. В конкретных примерах гетерологичный полипептид представляет собой нативный полипептид, который повторно вводят в организм-источник в форме, которая отличается от соответствующего нативного полипептида.
[0053] Гетерологичный ген или полипептид может представлять собой ген или полипептид, который содержит функциональный полипептид или последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую функциональный полипептид, которые сливают с другим геном или полипептидом для того, чтобы получать химерный или слитный полипептид или ген, кодирующий его. Гены и белки в конкретных вариантах осуществления включают конкретно проиллюстрированные полноразмерные последовательности и части, сегменты, фрагменты (в том числе непрерывные фрагменты и внутренние и/или концевые делеции по сравнению с полноразмерными молекулами), варианты, мутанты, химерные и слитные конструкции из этих последовательностей.
[0054] Как используют в настоящем документе, термин «модификация» может относиться к изменению в полинуклеотиде, описанном в настоящем документе, которое ведет к сниженной, по существу устраненной или устраненной активности полипептида, кодируемого полинуклеотидом, а также к изменению в полипептиде, описанном в настоящем документе, которое ведет к сниженной, по существу устраненной или устраненной активности полипептида. Альтернативно, термин «модификация» может относиться к изменению в полинуклеотиде, описанном в настоящем документе, которое ведет к увеличенной или усиленной активности полипептида, кодируемого полинуклеотидом, а также к изменению в полипептиде, описанном в настоящем документе, которое ведет к увеличенной или усиленной активности полипептида. Такие изменения можно выполнять с помощью способов, хорошо известных в данной области, включая в качестве неограничивающих примеров введение делеций, мутаций (например, самопроизвольный мутагенез, случайный мутагенез, мутагенез, обусловленный генами-мутаторами, или транспозонный мутагенез), замен, вставок, понижающую регуляцию, изменение клеточного местоположения, изменение состояния полинуклеотида или полипептида (например, метилирование, фосфорилирование или убиквитинилирование), удаление кофактора, введение антисмысловой РНК/ДНК, введение интерферирующей РНК/ДНК, химической модификации, ковалентной модификации, облучение УФ или рентгеновскими лучами, гомологичную рекомбинацию, митотическую рекомбинацию, способы с заменой промоторов и/или их сочетания. Руководство по определению тех нуклеотидов или аминокислотных остатков, которые можно модифицировать, можно найти посредством сравнения последовательности конкретного полинуклеотида или полипептида с таковыми для гомологичных полинуклеотидов или полипептидов, и максимизации числа модификаций, выполненных в областях высокой гомологии (консервативных областях) или консенсусных последовательностях.
[0055] Термин «производное», как используют в настоящем документе, относится к модификации последовательности, приведенной в настоящем раскрытии. Иллюстрацией таких модификаций будет замена, инсерция и/или делеция одного или нескольких оснований, относящихся к последовательности нуклеиновой кислоты для кодирующей последовательности, описанной в настоящем документе, которые предохраняют, слегка изменяют или увеличивают функцию кодирующей последовательности, описанной в настоящем документе, в сельскохозяйственной культуре. Такие производные может легко определять специалист в данной области, например, с использованием способов предсказания по компьютерным моделям и оптимизации структуры последовательности. Термин «производное», таким образом, также включает последовательности нуклеиновой кислоты, которые обладают такой существенной идентичностью последовательностей с кодирующими последовательностями, раскрытыми в настоящем документе, что они способны обладать раскрытыми функциональностями для использования при получении вариантов осуществления по настоящему раскрытию.
[0056] Термин «промотор» относится к последовательности ДНК, способной управлять экспрессией кодирующей последовательности нуклеиновой кислоты или функциональной РНК. В примерах, управляемая кодирующая последовательность расположена в направлении 3’-конца относительно последовательности промотора. Промотор можно извлекать в полном объеме из нативного гена, промотор может состоять из различных элементов, полученных из различных промоторов, найденных в природе, или промотор даже может содержать рационально разработанные сегменты ДНК. Специалистам в данной области понятно, что различные промоторы могут управлять экспрессией гена в тканях или клетках различных типов или на различных этапах развития или в ответ на различные условия окружающей среды или физиологические условия. Примеры всех приведенных выше промоторов известны и используются в данной области для того, чтобы управлять экспрессией гетерологичных нуклеиновых кислот. Промоторы, которые управляют экспрессией гена в клетках большинства типов наиболее часто, обыкновенно обозначают как «конститутивные промоторы». Кроме того, хотя в данной области предпринимались попытки (во многих случаях неуспешные) определить точные границы регуляторных последовательностей, стало понятно, что фрагменты ДНК различной длины могут иметь идентичную промоторную активность. Промоторную активность конкретной нуклеиновой кислоты можно анализировать с использованием способов, знакомых специалистам в данной области.
[0057] Термин «функционально связанный» относится к связи последовательностей нуклеиновой кислоты в одной нуклеиновой кислоте, в которой на функцию одной из последовательностей нуклеиновой кислоты влияет другая. Например, промотор функционально связан с кодирующей последовательностью, когда промотор способен осуществлять экспрессию этой кодирующей последовательности (например, кодирующая последовательность находится под транскрипционным управлением промотора). Кодирующая последовательность может быть функционально связана с регуляторной последовательностью в смысловой или антисмысловой ориентации.
[0058] Термин «экспрессия», как используют в настоящем документе, может относиться к транскрипции и стабильному накоплению смысловой (мРНК) или антисмысловой РНК, получаемой на основе ДНК. Экспрессия также может относиться к трансляции мРНК в полипептид. Как используют в настоящем документе, термин «сверхэкспрессия» относится к экспрессии, которая выше, чем эндогенная экспрессия того же гена или родственного гена. Таким образом, «сверхэкспрессия» гетерологичного гена имеет место, если его экспрессия выше, чем таковая у сравнимого эндогенного гена.
[0059] Как используют в настоящем документе, термин «трансформация» или «трансформирующий» относится к переносу и встраиванию нуклеиновой кислоты или ее фрагмента в организм-хозяин, что ведет к генетически стабильному наследованию. Организмы-хозяева, содержащие трансформирующую нуклеиновую кислоту, обозначают как «трансгенные», «рекомбинантные» или «трансформированные» организмы. Известны способы трансформации, в том числе, например: трансформация, опосредованная Agrobacterium tumefaciens или A. rhizogenes; трансформация с фосфатом кальция; трансформация с полибреном; слияние протопластов; электропорация; ультразвуковые способы (например, сонопорация); трансформация липосомами; микроинъекции; трансформация с депротеинизированной ДНК; трансформация плазмидными векторами; трансформация вирусными векторами; биолистическая трансформация (бомбардировка микрочастицами); трансформация, опосредованная нитевидными кристаллами карбида кремния; струи аэрозоля; и PEG-опосредованная трансформация.
[0060] Как используют в настоящем документе, термин «введенный» (в контексте введения нуклеиновой кислоты в клетку) включает трансформацию клетки, а также скрещивание растения, которое содержит нуклеиновую кислоту, со вторым растением так, что второе растение содержит нуклеиновую кислоту, что можно осуществлять с использованием стандартных способов селекции растений. Такие способы селекции известны в данной области. Обзор способов селекции растений см. в Poehlman (1995) Breeding Field Crops, 4th Edition, AVI Publication Co., Westport CT.
[0061] Способы обратного скрещивания можно использовать для того, чтобы вводить нуклеиновую кислоту в растение. Этот способ использовали в течение десятилетий для того, чтобы вводить признаки в растения. Пример описания обратного скрещивания (и других способов селекции растений) можно найти, например, в Poelman (1995), выше; и Jensen (1988) Plant Breeding Methodology, Wiley, New York, NY. В образцовом протоколе обратного скрещивания исходное растение, представляющее интерес, («рекурентного родителя») скрещивают со вторым растением («нерекурентным родителем»), которое несет нуклеиновую кислоту для введения. Получаемое от этого скрещивания потомство затем снова скрещивают с рекурентным родителем, и процесс повторяют до тех пор, пока не получают преобразованное растение, где по существу все желаемые морфологические и физиологические характеристики рекурентного родителя восстанавливают в преобразованном растении, в дополнение к нуклеиновой кислоте от нерекурентного родителя.
[0062] «Свазывание» относится к нековалентному взаимодействию со специфичной последовательностью между макромолекулами (например, между белком и нуклеиновой кислотой). Не все компоненты связывающего взаимодействия должны происходить со специфичной последовательностью (например, контакты с остатками фосфата в остове ДНК) до тех пор, пока взаимодействие вцелом происходит со специфичной последовательностью. Такие взаимодействия в целом отличаются константой диссоциации (Kd) 10-6 M-1 или ниже. «Аффинность» относится к прочности связывания: увеличенная аффинность связывания коррелирует с более низкой Kd.
[0063] «Связывающий белок» представляет собой белок, который способен нековалентно связываться с другой молекулой. Связывающий белок может связываться, например, с молекулой ДНК (ДНК-связывающий белок), молекулой РНК (РНК-связывающий белок) и/или белковой молекулой (белок-связывающий белок). В случае белок-связывающего белка, он может связываться с самим собой (для того чтобы формировать гомодимеры, гомотримеры и т.д.) и/или он может связываться с одной или несколькими молекулами другого белка или белков. Связывающий белок может обладать связывающей активностью больше чем одного типа. Например, белки с цинковыми пальцами обладают ДНК-связывающей, РНК-связывающей и белок-связывающей активностью.
[0064] «Рекомбинация» относится к процессу обмена генетической информацией между двумя полинуклеотидами, включая в качестве неограничивающих примеров захват донора посредством соединения негомологичных концов (NHEJ) и гомологичную рекомбинацию. Для целей этого раскрытия «гомологичная рекомбинация (HR)» относится к специализированной форме такого обмена, который имеет место, например, во время репарации двухцепочечных разрывов в клетках через механизмы репарации по гомологии. В этом процессе, требующем гомологии нуклеотидных последовательностей, используется «донорная» молекула для репарации «целевой» молекулы (т.е. той, которая подверглась двухцепочечному разрыву) по матрице, и он различно известен как «конверсия генов без кроссинговера» или «конверсия генов по короткому пути», поскольку он ведет к переносу генетической информации от донора к мишени. Не желая ограничиваться какой-либо конкретной теорией, такой перенос может содержать коррекцию несоответствий в гетеродуплексной ДНК, которая образуется между поврежденной мишенью и донором, и/или «синтез-зависимую ренатурацию цепей», при которой донор используют для того, чтобы повторно синтезировать генетическую информацию, которая станет частью мишени, и/или связанные процессы. Такая специализированная HR часто ведет к изменению последовательности целевой молекулы так, что часть или всю последовательность донорного полинуклеотида вводят в целевой полинуклеотид. Для HR-направленного встраивания донорная молекула содержит по меньшей мере одну область гомологии с геномом («гомологичные звенья») по меньшей мере 50-100 пар оснований в длину. См., например, публикацию патента США № 20110281361.
[0065] В способах по раскрытию одна или несколько направленных нуклеаз, как описано в настоящем документе, создают двухцепочечный разрыв в целевой последовательности (например, клеточном хроматине) в предварительно определяемом сайте, и в клетку можно вводить «донорный» полинуклеотид, который имеет гомологию с нуклеотидной последовательностью в области разрыва. Присутствие двухцепочечного разрыва показано для того, чтобы содействовать встраиванию донорной последовательности. Донорная последовательность может быть физически встроена или, альтернативно, донорный полинуклеотид используют в качестве матрицы для репарации разрыва через гомологичную рекомбинацию, что ведет к введению всей нуклеотидной последовательности или ее части, как в доноре, в клеточный хроматин. Таким образом, можно изменять первую последовательность в клеточном хроматине и, в определенных вариантах осуществления, можно превращать в последовательность, присутствующую в донорном полинуклеотиде. Таким образом, использование терминов «заменять» или «замена» можно понимать как обозначение замены одной нуклеотидной последовательности на другую (т.е. замены последовательности в информационном смысле), которое не обязательно требует физической или химической замены одного полинуклеотида на другой.
[0066] «Расщепление» относится к разрыву ковалентного остова молекулы ДНК. Расщепление можно инициировать различными способами, включая в качестве неограничивающих примеров ферментативный или химический гидролиз фосфодиэфирной связи. Возможно как одноцепочечное расщепление, так и двухцепочечное расщепление, и двухцепочечное расщепление может возникать в результате двух отдельных событий одноцепочечного расщепления. Расщепление ДНК может вести к образованию или тупых концов или ступенчатых концов. В определенных вариантах осуществления слитные полипептиды используют для направленного двухцепочечного расщепления ДНК.
[0067] Термины «плазмида» и «вектор», как используют в настоящем документе, относятся к внехромосомным элементам, которые могут нести один или несколько генов, которые не являются частью центрального метаболизма клетки. Плазмиды и векторы типично представляют собой кольцевые двухцепочечные молекулы ДНК. Однако плазмиды и векторы могут представлять собой линейные или кольцевые нуклеиновые кислоты, из одно- или двухцепочечной ДНК или РНК, и могут нести ДНК, полученную по существу из любого источника, в которой множество нуклеотидных последовательностей соединены или рекомбинированы в уникальную конструкцию, которая способна ко введению промоторного фрагмента и кодирующей последовательности ДНК наряду с любой подходящей 3’ нетранслируемой последовательностью в клетку. В примерах плазмиды и векторы могут содержать автономно реплицирующиеся последовательности для размножения в бактериальных организмах-хозяевах.
[0068] Полипептид и «белок» используют взаимозаменяемо в настоящем документе, и они включают молекулярную цепь из двух или более аминокислот, связанных через пептидные связи. Термины не относятся к продукту конкретной длины. Таким образом, «пептиды» и «олигопептиды» включены в определение полипептида. Термины включают посттрансляционные модификации полипептида, например, гликозилирование, ацетилирование, фосфорилирование и т.п. Кроме того, фрагменты, аналоги, варианты белка или мутировавшие белки, слитные белки и т.п. включены в значение полипептида. Термины также включают молекулы, в которые включены один или несколько аналогов аминокислот или неканонических или неприродных аминокислот, как можно синтезировать или рекомбинантно экспрессировать с использованием известных способов белковой инженерии. Кроме того, можно получать производные патентоспособных слитных белков, как описано в настоящем документе, с помощью общеизвестных способов органической химии.
[0069] Термин «слитный белок» указывает на то, что белок включает полипептидные компоненты, полученные из больше чем одного родительского белка или полипептида. Типично, слитный белок экспрессируют из слитного гена, в котором нуклеотидная последовательность, кодирующая полипептидную последовательность из одного белка, соединена с сохранением рамки считывания с нуклеотидной последовательностью, кодирующей полипептидную последовательность из другого белка, и необязательно отделена от нее линкером. Тогда слитный ген можно экспрессировать с помощью рекомбинантной клетки-хозяина в виде единого белка.
III. Варианты осуществления настоящего изобретения
[0070] В одном из вариантов осуществления по настоящему раскрытию предусмотрена полинуклеотидная донорная кассета, которая содержит связывающий домен нуклеазы с цинковыми пальцами, аналитический домен и плазмидный домен.
[0071] В определенном варианте осуществления полинуклеотидная донорная кассета по п. 1, полинуклеотидная донорная кассета содержит отрезок меньше чем 3 т.п.о. Образцовые длины полинуклеотидных донорных кассет могут составлять приблизительно 3 т.п.о., 2,9 т.п.о., 2,8 т.п.о., 2,7 т.п.о., 2,6 т.п.о., 2,5 т.п.о., 2,4 т.п.о., 2,3 т.п.о., 2,2 т.п.о., 2,1 т.п.о., 2,0 т.п.о., 1,9 т.п.о., 1,8 т.п.о., 1,7 т.п.о., 1,6 т.п.о., 1,5 т.п.о., 1,4 т.п.о., 1,3 т.п.о., 1,2 т.п.о., 1,1 т.п.о., 1,0 т.п.о., 0,9 т.п.о., 0,8 т.п.о., 0,7 т.п.о., 0,6 т.п.о., 0,5 т.п.о., 0,4 т.п.о., 0,3 т.п.о., 0,2 т.п.о. или 0,1 т.п.о. Термин «пара оснований» (также обозначаемый как «п.о.») относится к паре нуклеотидных оснований (нуклеотидов), каждое в отдельной одноцепочечной нуклеиновой кислоте, в которой каждое основание из пары нековалентно связано с другим (например, через водородные связи). Например, пара оснований по Уотсону-Крику обычно содержит один пурин и один пиримидин. Гуанозин может образовывать пару с цитозином (G-C), аденин может образовывать пару с тимином (A-T) и урацил может образовывать пару с аденином (U-A). Два основания в паре оснований являются так называемыми комплементарными друг другу. Пары оснований можно обозначать как тысячи пар оснований (т.п.о.), миллионы пар оснований (млн. п.о.) или миллиарды пар оснований (млрд. п.о.), где тысячу иногда обозначают «кило», миллион обозначают «мега», а миллиард обозначают «гига».
[0072] В других вариантах осуществления клетку трансформируют с использованием полинуклеотидной донорной кассеты, которая содержит связывающий домен сайт-специфической нуклеазы, аналитический домен и плазмидный домен, и полинуклеотидную донорную кассету интегрируют в ДНК клетки-хозяина. Термин «клетка», как обозначают в настоящем документе, включает живой организм, способный к самостоятельной репликации, и может представлять собой эукариотическую или прокариотическую клетку. В некоторых вариантах осуществления трансформированная клетка представляет собой клетку растения. В некоторых вариантах осуществления клетка растения может относиться, но не ограничиваясь этим, к какому-либо высшему растению, включая как двусеменодольные, так и односеменодольные растения, и употребляемые растения, в том числе сельскохозяйственные культуры и растения, используемые ради их масел. Таким образом, растения любого вида или клетку растения можно выбирать для трансформации, как дополнительно описано ниже.
[0073] В некоторых вариантах осуществления клетка растения, трансформированная в соответствии с настоящим раскрытием, включает, но не ограничиваясь этим, какие-либо высшие растения, включая как двусеменодольные, так и односеменодольные растения, и, в частности, употребляемые растения, в том числе сельскохозяйственные культуры. Такие растения могут включать, но не ограничиваясь этим, например: люцерну, соевые бобы, хлопок, семя рапса (также обозначаемого как канола), льняное семя, кукурузу, рис, брахиарию, пшеницу, сафлор, сорго, сахарную свеклу, подсолнечник, табак и газонные травы. Таким образом, можно выбирать любые виды растений или клетку растения. В некоторых вариантах осуществления клетки растений, используемые в настоящем документе, и растения, выраженные или произведенные из них, включают, но не ограничиваясь этим, клетки, получаемые из семени рапса (Brassica napus); индийской горчицы (Brassica juncea); эфиопской горчицы (Brassica carinata); репы (Brassica rapa); капусты (Brassica oleracea); соевых бобов (Glycine max); льняного семени/льна (Linum usitatissimum); кукурузы (также обозначаемой как маис) (Zea mays); сафлора (Carthamus tinctorius); подсолнечника (Helianthus annuus); табака (Nicotiana tabacum); Arabidopsis thaliana; бразильского ореха (Betholettia excelsa); касторовых бобов (Ricinus communis); кокоса (Cocus nucifera); кориандра (Coriandrum sativum); хлопка (Gossypium spp.); арахиса (Arachis hypogaea); жожоба (Simmondsia chinensis); масличной пальмы (Elaeis guineeis); оливы (Olea eurpaea); риса (Oryza sativa); тыквы (Cucurbita maxima); ячменя (Hordeum vulgare); сахарного тростника (Saccharum officinarum); риса (Oryza sativa); пшеницы (Triticum spp., включая Triticum durum и Triticum aestivum); и ряски (Lemnaceae sp.). В некоторых вариантах осуществления генетический фон у вида растения может варьировать.
[0074] В отношении получения генетически модифицированных растений, способы генетической инженерии растений хорошо известны в данной области. Например, разработано множество способов трансформации растений, в том числе протоколы биологической и физической трансформации для двусеменодольных растений, а также односеменодольных растений (например, Goto-Fumiyuki et al., Nature Biotech 17:282-286 (1999); Miki et al., Methods in Plant Molecular Biology and Biotechnology, Glick, B. R. and Thompson, J. E. Eds., CRC Press, Inc., Boca Raton, стр. 67-88 (1993)). Кроме того, доступны векторы и способы культивирования in vitro для трансформации клеток или тканей растения и регенерации растений, например, в Gruber et al., Methods in Plant Molecular Biology and Biotechnology, под редакцией Glick, B. R. and Thompson, J. E., CRC Press, Inc., Boca Raton, стр. 89-119 (1993).
[0075] Доступно большое число способов инсерции ДНК в клетку-хозяина растения. Эти способы включают трансформацию неокогенной Т-ДНК с использованием Agrobacterium tumefaciens или Agrobacterium rhizogenes в качестве трансформирующего агента, трансфекцию с фосфатом кальция, трансформацию с полибреном, слияние протопластов, электропорацию, ультразвуковые способы (например, сонопорацию), трансформацию липосомами, микроинъекции, депротеинизированную ДНК, плазмидные векторы, вирусные векторы, биолистические средства (бомбардировку микрочастицами), трансформацию, опосредованную нитевидными кристаллами карбида кремния, струи аэрозоля или PEG, а также другие возможные способы.
[0076] Например, ДНК-конструкцию можно вводить непосредственно в геномную ДНК клетки растения с использованием таких способов, как электропорация и микроинъекции протопластов клеток растения, или ДНК-конструкции можно вводить непосредственно в ткань растения с использованием биолистических способов, таких как бомбардировка частицами ДНК (см., например, Klein et al. (1987) Nature 327:70 73). Дополнительные способы трансформации клеток растения включают микроинъекции через захват ДНК, опосредованный нитевидными кристаллами карбида кремния (Kaeppler et al. (1990) Plant Cell Reporter 9:415 418). Альтернативно, ДНК-конструкцию можно вводить в клетку растения через трансформацию наночастицами (см., например, патентную заявку США № 12/245,685, включенную в настоящий документ посредством ссылки в полном объеме).
[0077] Другим известным способом трансформации растений является трансформация бомбардировкой микрочастицами, при которой ДНК переносят на поверхности микрочастиц. В этом способе вектор вводят в ткани растения с использованием биолистического устройства, которое ускоряет микрочастицы до скоростей, достаточных для проникновения через клеточные стенки и мембраны растений. Sanford et al., Part. Sci. Technol. 5:27 (1987), Sanford, J. C., Trends Biotech. 6:299 (1988), Sanford, J. C., Physiol. Plant 79:206 (1990), Klein et al., Biotechnology 10:268 (1992).
[0078] Альтернативно, способы переноса генов и трансформации включают, но не ограничиваясь этим, трансформацию протопластов через преципитацию с хлоридом кальция, опосредованный полиэтиленгликолем (PEG) или электропорацией захват депротеинизированной ДНК (см. Paszkowski et al. (1984) EMBO J 3:2717 2722, Potrykus et al. (1985) Molec. Gen. Genet. 199:169 177; Fromm et al. (1985) Proc. Nat. Acad. Sci. USA 82:5824 5828; и Shimamoto (1989) Nature 338:274 276) и электропорацию тканей растения (D’Halluin et al. (1992) Plant Cell 4:1495 1505).
[0079] Широко используемый способ введения экспрессирующего вектора в растения основан на природной системе трансформации агробактерии. Horsch et al., Science 227:1229 (1985). A. tumefaciens и A. rhizogenes представляют собой известные патогенные почвенные бактерии растений, которые можно использовать для генетической трансформации клеток растений. Плазмиды Ti и Ri из A. tumefaciens и A. rhizogenes, соответственно, несут гены, отвечающие за генетическую трансформацию растения. Kado, C. I., Crit. Rev. Plant. Sci. 10:1 (1991). Описания векторных систем агробактерий и способов опосредованного агробактериями переноса генов также доступны, например, в Gruber et al., выше, Miki et al., выше, Moloney et al., Plant Cell Reports 8:238 (1989) и в патентах США №№ 4,940,838 и 5,464,763.
[0080] Если агробактерии используют для трансформации, ДНК, подлежащую инсерции, следует клонировать в специальные плазмиды, а именно или в промежуточный вектор или в бинарный вектор. Промежуточные векторы не способны к самостоятельной репликации в агробактериях. Промежуточный вектор можно переносить в Agrobacterium tumefaciens с использованием плазмиды-помощника (конъюгация). Japan Tobacco Superbinary System представляет собой пример такой системы (рассмотрено у Komari et al., (2006) Methods in Molecular Biology (K. Wang, ed.) № 343: Agrobacterium Protocols (2-е издание, том 1) Humana Press Inc., Totowa, NJ, стр.15-41; и Komori et al., (2007) Plant Physiol. 145:1155-1160). Бинарные векторы способны к самостоятельной репликации как в E. coli, так и в агробактериях. Они содержат селективный маркерный ген и линкер или полилинкер, которые окружены левой и правой граничными областями Т-ДНК. Ими можно непосредственно трансформировать агробактерии (Holsters, 1978). Агробактерии, используемые в качестве клеток-хозяев, должны содержать плазмиду, несущую область vir. Плазмида Ti или Ri также содержит область vir, необходимую для переноса Т-ДНК. Область vir необходима для переноса Т-ДНК в клетку растения. Может содержаться дополнительная Т-ДНК.
[0081] Функции вирулентности хозяина Agrobacterium tumefaciens управляют инсерцией T-нитей, содержащих конструкцию и смежный маркер, в ДНК клетки растения, когда клетку инфицируют бактериями с использованием бинарного T-ДНК вектора (Bevan (1984) Nuc. Acid Res. 12:8711 8721) или процедуры совместного культивирования (Horsch et al. (1985) Science 227:1229 1231). В целом, систему трансформации агробактериями используют для конструирования двусеменодольных растений (Bevan et al. (1982) Ann. Rev. Genet 16:357 384; Rogers et al. (1986) Methods Enzymol. 118:627 641). Систему трансформации агробактериями также можно использовать для трансформации, а также переноса ДНК в односеменодольные растения и клетки растений. См. патент США № 5,591,616; Hernalsteen et al. (1984) EMBO J 3:3039 3041; Hooykass Van Slogteren et al. (1984) Nature 311:763 764; Grimsley et al. (1987) Nature 325:1677 179; Boulton et al. (1989) Plant Mol. Biol. 12:31 40; и Gould et al. (1991) Plant Physiol. 95:426 434. После введения генетической конструкции в конкретные клетки растений, клетки растений можно выращивать и после появления дифференцирующейся ткани, такой как побеги и корни, можно создавать взрослые растения. В некоторых вариантах осуществления можно создавать множество растений. Способы регенерации растений известны специалистам в данной области, и их можно найти, например, в: Plant Cell and Tissue Culture, 1994, под редакцией Vasil и Thorpe. Kluwer Academic Publishers и в: Plant Cell Culture Protocols (Methods in Molecular Biology 111, 1999, под редакцией Hall, Humana Press). Генетически модифицированное растение, описанное в настоящем документе, можно культивировать в ферментационной среде или растить в подходящей среде, такой как почва. В некоторых вариантах осуществления подходящая среда для выращивания высших растений может включать какую-либо среду для выращивания растений, включая в качестве неограничивающих примеров почву, песок, какие-либо другие дискретные среды, которые поддерживают рост корней (например, вермикулит, перлит и т.д.), или гидропоническую культуру, а также подходящие свет, воду и питательные добавки, которые оптимизируют рост высшего растения.
[0082] Трансформированные клетки растений, которые получают посредством какого-либо из приведенных выше способов трансформации, можно культивировать для того, чтобы регенерировать целое растение, которое обладает трансформированным генотипом и, таким образом, желаемым фенотипом. Такие способы регенерации основаны на воздействии определенными фитогормонами в среде для выращивания тканевой культуры, типично с использованием биоцидных и/или гербицидных маркеров, которые введены вместе с желаемыми нуклеотидными последовательностями. Регенерация растений из культивируемых протопластов описана в Evans, et al., «Protoplasts Isolation and Culture» в Handbook of Plant Cell Culture, стр. 124 176, Macmillian Publishing Company, New York, 1983; и Binding, Regeneration of Plants, Plant Protoplasts, стр. 21 73, CRC Press, Boca Raton, 1985. Также можно получать регенерацию из каллюса, эксплантатов, органов, пыльцы, зародышей растений или их частей. Такие способы регенерации в целом описаны в Klee et al. (1987) Ann. Rev. of Plant Phys. 38:467 486.
[0083] В других вариантах осуществления клетки растений, которые трансформируют, не способны к регенерации, чтобы получать растение. Такие клетки называют временно трансформированными. Временно трансформированные клетки можно получать для того, чтобы анализировать экспрессию и/или функциональность конкретного трансгена. Способы временной трансформации известны в данной области, и включают незначительные модификации способов трансформации, которые описаны выше. Специалисты в данной области могут выбирать использование временной трансформации для того, чтобы быстро анализировать экспрессию и/или функциональность конкретных трансгенов, поскольку временная трансформация выполнятся быстро и не требует так много ресурсов (например, культивирования растений для развития целых растений, самостоятельной фертилизации или скрещивания растений для фиксации трансгена в геноме и т.д.), как способы стабильной трансформации.
[0084] В одном из вариантов осуществления универсальный донорный полинуклеотид можно вводить в по существу любое растение. Широкий спектр растений и систем клеток растений можно конструировать для сайт-специфического встраивания универсального донорного полинуклеотида по настоящему раскрытию и различных указанных выше способов трансформации. В одном из вариантов осуществления целевые растения и клетки растений для конструирования включают, но не ограничиваясь этим, односеменодольные и двусеменодольные растения, такие как культуры, включающие зерновые культуры (например, пшеница, кукуруза, рис, просо, ячмень), фруктовые культуры (например, томат, яблоко, груша, клубника, апельсин), кормовые культуры (например, люцерна), корнеплодные культуры (например, морковь, картофель, сахарная свекла, батат), листовые овощные культуры (например, латук, шпинат); цветочные растения (например, петуния, роза, хризантема), иглолистные и хвойные деревья (например, бальзамическая пихта, ель); растения, используемые в фиторекультивации (например, растения, накапливающие тяжелые металлы); масличные культуры (например, подсолнечник, семя рапса) и растения, используемые для экспериментальных целей (например, Arabidopsis). Таким образом, раскрытые способы и композиции имеют применение для широкого диапазона растений, включая в качестве неограничивающих примеров виды из родов Asparagus, Avena, Brassica, Citrus, Citrullus, Capsicum, Cucurbita, Daucus, Erigeron, Glycine, Gossypium, Hordeum, Lactuca, Lolium, Lycopersicon, Malus, Manihot, Nicotiana, Orychophragmus, Oryza, Persea, Phaseolus, Pisum, Pyrus, Prunus, Raphanus, Secale, Solanum, Sorghum, Triticum, Vitis, Vigna и Zea mays.
[0085] В других вариантах осуществления полинуклеотидная донорная кассета содержит конкретную полинуклеотидную последовательность. Примеры конкретных полинуклеотидных последовательностей включают, но не ограничиваясь этим; SEQ ID NO: 132, SEQ ID NO: 133, SEQ ID NO: 134, SEQ ID NO: 135, SEQ ID NO: 136, SEQ ID NO: 137, SEQ ID NO: 138, SEQ ID NO: 139, SEQ ID NO: 140 и SEQ ID NO: 141. В различных вариантах осуществления последовательности с по меньшей мере 90% идентичности последовательностей с конкретными полинуклеотидными последовательностями SEQ ID NO: 132, SEQ ID NO: 133, SEQ ID NO: 134, SEQ ID NO: 135, SEQ ID NO: 136, SEQ ID NO: 137, SEQ ID NO: 138, SEQ ID NO: 139, SEQ ID NO: 140 и SEQ ID NO: 141 описаны в настоящем документе. В других вариантах осуществления последовательности с по меньшей мере 95% идентичности последовательностей с конкретными полинуклеотидными последовательностями SEQ ID NO: 132, SEQ ID NO: 133, SEQ ID NO: 134, SEQ ID NO: 135, SEQ ID NO: 136, SEQ ID NO: 137, SEQ ID NO: 138, SEQ ID NO: 139, SEQ ID NO: 140 и SEQ ID NO: 141 описаны в настоящем документе. В других вариантах осуществления последовательности с по меньшей мере 97% идентичности последовательностей с конкретными полинуклеотидными последовательностями SEQ ID NO: 132, SEQ ID NO: 133, SEQ ID NO: 134, SEQ ID NO: 135, SEQ ID NO: 136, SEQ ID NO: 137, SEQ ID NO: 138, SEQ ID NO: 139, SEQ ID NO: 140 и SEQ ID NO: 141 описаны в настоящем документе. В других вариантах осуществления последовательности с по меньшей мере 99% идентичности последовательностей с конкретными полинуклеотидными последовательностями SEQ ID NO: 132, SEQ ID NO: 133, SEQ ID NO: 134, SEQ ID NO: 135, SEQ ID NO: 136, SEQ ID NO: 137, SEQ ID NO: 138, SEQ ID NO: 139, SEQ ID NO: 140 и SEQ ID NO: 141 описаны в настоящем документе. В одном из вариантов осуществления полинуклеотидная донорная кассета содержит последовательность, которая имеет по меньшей мере 90, 93, 95, 97 или 99% идентичности последовательностей с последовательностью, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 142 и 143.
[0086] Термин «процент идентичности» (или «% идентичности»), как известно в данной области, представляет собой зависимость между двумя или более полипептидными последовательностями или двумя или более полинуклеотидными последовательностями, как определяют посредством сравнения последовательностей. В данной области, «идентичность» также обозначает степень родства последовательностей между полипептидными или полинуклеотидными последовательностями, в зависимости от случая, как определяют посредством сопоставления между строками таких последовательностей. «Идентичность» и «сходство» можно легко вычислять с помощью известных способов, включая в качестве неограничивающих примеров те, которые раскрыты в: 1.) Computational Molecular Biology (под редакцией Lesk, A. M.) Oxford University: NY (1988); 2.) Biocomputing: Informatics and Genome Projects (под редакцией Smith, D. W.) Academic: NY (1993); 3.) Computer Analysis of Sequence Data, Part I (под редакцией Griffin, A. M., и Griffin, H. G.) Humania: NJ (1994); 4.) Sequence Analysis in Molecular Biology (под редакцией von Heinje, G.) Academic (1987); и 5.) Sequence Analysis Primer (под редакцией Gribskov, M. и Devereux, J.) Stockton: NY (1991).
[0087] Способы определения идентичности последовательностей нуклеиновых кислот и аминокислот известны в данной области. Типично такие способы включают определение нуклеотидной последовательности мРНК для гена и/или определение аминокислотной последовательности, кодируемой им, и сравнение этих последовательностей со второй нуклеотидной или аминокислотной последовательностью. Геномные последовательности также можно определять и сравнивать таким же образом. В целом, идентичность относится к точному соответствию между нуклеотидами или между аминокислотами в двух полинуклеотидных или полипептидных последовательностях, соответственно. Две или более последовательности (полинуклеотидных или аминокислотных) можно сравнивать посредством определения их процента идентичности. Процент идентичности двух последовательностей, будь то последовательности нуклеиновых кислот или аминокислот, представляет собой число точных совпадений между двумя выровненными последовательностями, деленное на длину более короткой последовательности и умноженное на 100. См. Russell, R., and Barton, G., «Structural Features can be Unconserved in Proteins with Similar Folds». J. Mol. Biol. 244, 332-350 (1994), стр. 337, которая включена в настоящий документ посредством ссылки в полном объеме.
[0088] Кроме того, способы определения идентичности и сходства закодированы в общедоступных компьютерных программах. Выравнивание последовательностей и вычисление процента идентичности можно осуществлять, например, с использованием программы AlignX из пакета Vector NTI® (Invitrogen, Carlsbad, CA) или программы MegAlignTM из биоинформационного вычислительного пакета LASERGENE (DNASTAR Inc., Madison, WI). Множественное выравнивание последовательностей осуществляют с использованием способа выравнивания «Clustal», который охватывает несколько разновидностей алгоритма, в том числе «Clustal V method of alignment», соответствующий способу выравнивания, обозначаемому Clustal V (раскрыто у Higgins and Sharp, CABIOS. 5:151-153 (1989); Higgins, D.G. et al., Comput. Appl. Biosci., 8:189-191 (1992)) и найденному в программе MegAlignTM биоинформационного вычислительного пакета LASERGENE (DNASTAR Inc.). Для множественного выравнивания значения по умолчанию соответствуют GAP PENALTY=10 и GAP LENGTH PENALTY=10. Параметры по умолчанию для парного выравнивания и вычисления процента идентичности белковых последовательностей с использованием способа Clustal представляют собой KTUPLE=1, GAP PENALTY=3, WINDOW=5 и DIAGONALS SAVED=5. Для нуклеиновых кислот эти параметры составляют KTUPLE=2, GAP PENALTY=5, WINDOW=4 и DIAGONALS SAVED=4. После выравнивания последовательностей с использованием программы Clustal V можно получать «процент идентичности» посредством просмотра таблицы «расстояний последовательностей» в той же программе. Кроме того, доступен «Clustal W method of alignment», который соответствует способу выравнивания, обозначаемому Clustal W (описано у Higgins and Sharp, CABIOS. 5:151-153 (1989); Higgins, D.G. et al., Comput. Appl. Biosci. 8:189-191(1992)) и найденному в программе MegAlignTM v6.1 из биоинформационного вычислительного пакета LASERGENE (DNASTAR Inc.). Параметры по умолчанию для множественного выравнивания (GAP PENALTY=10, GAP LENGTH PENALTY=0,2, Delay Divergen Seqs(%)=30, DNA Transition Weight=0.5, Protein Weight Matrix=Gonnet Series, DNA Weight Matrix=IUB). После выравнивания последовательностей с использованием программы Clustal W можно получать «процент идентичности» посредством просмотра таблицы «расстояний последовательностей» в той же программе.
[0089] Термин «программное обеспечение для анализа последовательностей» относится к какому-либо компьютерному алгоритму или программе программного обеспечения, которые можно использовать для анализа нуклеотидных или аминокислотных последовательностей. «Программное обеспечение для анализа последовательностей» может быть коммерчески доступным или разрабатываемым независимо. Типичное программное обеспечение для анализа последовательностей будет включать, но не ограничиваясь этим: 1.) пакет программ GCG (Wisconsin Package Version 9.0, Genetics Computer Group (GCG), Madison, WI); 2.) BLASTP, BLASTN, BLASTX (Altschul et al., J. Mol. Biol., 215:403 410 (1990)); 3.) DNASTAR (DNASTAR, Inc. Madison, WI); 4.) Sequencher (Gene Codes Corporation, Ann Arbor, MI); и 5.) программу FASTA, содержащую алгоритм Смита-Ватермана (W. R. Pearson, Comput. Methods Genome Res., [Proc. Int. Symp.] (1994), Meeting Date 1992, 111 20. Под редакцией: Suhai, Sandor. Plenum: New York, NY). В рамках контекста этой заявки понятно, что когда программное обеспечение для анализа последовательностей используют для анализа, эти результаты анализа будут основаны на «значениях по умолчанию» для упомянутых программ, если не указано иное. Как используют в настоящем документе, «значения по умолчанию» обозначают любой набор значений или параметров, которые исходно загружены с программным обеспечением при первой инициализации.
[0090] В отношении способов гибридизации, всю известную нуклеотидную последовательность или ее часть можно использовать в качестве зонда, который избирательно гибридизуется с другими соответствующими нуклеотидными последовательностями, присутствующими в популяции фрагментов клонированной геномной ДНК или фрагментов кДНК (т.е. библиотеки геномной или кДНК) из выбранного организма. Зонды для гибридизации могут представлять собой фрагменты геномной ДНК, фрагменты плазмидной ДНК, фрагменты кДНК, фрагменты РНК, ПЦР-амплифицированные фрагменты ДНК, олигонуклеотиды или другие полинуклеотиды, и их множно метить поддающейся обнаружению группой, такой как 32P, или каким-либо другим поддающимся обнаружению маркером. Таким образом, например, зонды для гибридизации можно получать посредством мечения синтетических олигонуклеотидов на основе последовательностей ДНК по вариантам осуществления из раскрытия. Способы получения зондов для гибридизации и для конструирования кДНК и геномных библиотек в целом известны в данной области и раскрыты (Sambrook et al., 1989).
[0091] Зонды и праймеры нуклеиновых кислот по вариантам осуществления из настоящего раскрытия гибридизуются при строгих условиях с целевой последовательностью ДНК. Любой стандартный способ гибридизации или амплификации нуклеиновой кислоты можно использовать для того, чтобы идентифицировать присутствие ДНК от трансгенного события в образце. Молекулы нуклеиновой кислоты или ее фрагменты способны к специфичной гибридизации с другими молекулами нуклеиновой кислоты при определенных условиях. Как используют в настоящем документе, две молекулы нуклеиновой кислоты так сказать способны к специфичной гибридизации друг с другом, если две молекулы способны образовать структуру антипараллельной двухцепочечной нуклеиновой кислоты. Молекула нуклеиновой кислоты представляет собой так называемый «комплемент» другой молекулы нуклеиновой кислоты, если две молекулы нуклеиновой кислоты демонстрируют полную комплементарность. Как используют в настоящем документе, о молекулах говорят, что они демонстрируют «полную комплементарность», когда каждый нуклеотид одной из молекул комплементарен нуклеотиду в другой. Молекулы, которые демонстрируют полную комплементарность, в целом будут образовывать гибрид друг с другом с достаточной стабильностью, чтобы позволять им оставаться ренатурированными друг с другом при стандартных условиях «высокой степени строгости». Стандартные условия высокой степени строгости описаны у Sambrook et al., 1989.
[0092] О двух молекулах говорят, что они демонстрируют «минимальную комплементарность», если они могут образовывать гибрид друг с другом с достаточной стабильностью, чтобы позволять им оставаться ренатурированными друг с другом при по меньшей мере стандартных условиях «низкой степени строгости». Стандартные условия низкой степени строгости описаны у Sambrook et al., 1989. Для того чтобы молекула нуклеиновой кислоты служила в качестве праймера или зонда, она должна демонстрировать только минимальную комплементарность последовательности, чтобы быть способной формировать стабильную двухцепочечную структуру с конкретными используемыми растворителем и концентрациями солей.
[0093] Факторы, которые влияют на степень строгости гибридизации хорошо известны специалистам в данной области и включают, но не ограничиваясь этим, температуру, pH, ионную силу и концентрацию органических растворителей, таких как, например, формамид и диметилсульфоксид. Как известно специалистам в данной области, степень строгости гибридизации возрастает с ростом температуры, снижением ионной силы и снижением концентрации растворителя.
[0094] Термин «строгие условия» или «степень строгости условий» функционально определяют по отношению к гибридизации зонда нуклеиновой кислоты с целевой нуклеиновой кислотой (т.е. с конкретнлй последовательностью нуклеиновой кислоты, представляющей интерес) посредством конкретной процедуры гибридизации, рассмотренной в Sambrook et al., 1989, в 9.52-9.55. См. также Sambrook et al., 1989, в 9.47-9.52 и 9.56-9.58.
[0095] Типично, строгие условия представляют собой те, в которых концентрация соли меньше чем приблизительно концентрация 1,5 М ионов Na+, типично приблизительно от 0,01 до 1,0 M ионов Na+ (или других солей) при pH от 7,0 до 8,3 и температура составляет по меньшей мере приблизительно 30°C для коротких зондов (например, от 10 до 50 нуклеотидов) и по меньшей мере приблизительно 60°C для длинных зондов (например, больше чем 50 нуклеотидов). Строгие условия также можно получать при добавлении дестабилизирующих средств, таких как формамид. Образцовые условия низкой степени строгости включают гибридизацию с буферным раствором из от 30 до 35% формамида, 1,0 М NaCl, 0,1% SDS (додецилсульфат натрия) при 37°C и промывание в от 1× до 2×SSC (20×SSC=3,0 М NaCl/0,3 М трицитрат натрия) при от 50 до 55°C. Образцовые условия умеренной степени строгости включают гибридизацию в 40-45% формамиде, 1,0 М NaCl, 0,1% SDS при 37°C и промывание в от 0,5× до 1×SSC при от 55 до 60°C. Образцовые условия с высокой строгостью включают гибридизацию в 50% формамиде, 1,0 М NaCl, 0,1% SDS при 37°C и промывание в 0,1×SSC при 60-65°C.
[0096] Специфичность типично представляет собой функцию промываний после гибридизации, критическими факторами являются ионная сила и температура конечного промывающего раствора. Для гибридов ДНК-ДНК Tm можно аппроксимировать по уравнению Tm=81,5°C+16,6(logM)+0,41(%GC)-0,61(%форм.)-500/L, где M представляет собой молярность одновалентных катионов, %GC представляет собой процентную долю нуклеотидов гуанозин и цитозин в ДНК, %форм. представляет собой процентную долю формамида в гибридизационном растворе и L представляет собой длину гибрида в парах оснований (Meinkoth and Wahl, 1984). Tm представляет собой температуру (при определенных ионной силе и pH), при которой 50% комплементарной целевой последовательности образует гибрид с полностью совпадающим зондом. Tm снижается приблизительно на 1°C для каждого 1% несовпадения; таким образом, Tm, гибридизацию и/или условия промывания можно корректировать для гибридизации последовательностей желаемой идентичности. Например, если желательны последовательности с 90% идентичности, Tm можно снижать на 10°C. В целом, строгие условия выбирают так, чтобы они были приблизительно на 5°C ниже, чем температура теплового плавления (Tm) для конкретной последовательности и ее комплемента при определенных ионной силе и pH. Однако крайне строгие условия могут использовать гибридизацию и/или промывание при на 1, 2, 3 или 4°C ниже, чем температура теплового плавления (Tm); умеренно строгие условия могут использовать гибридизацию и/или промывание при на 6, 7, 8, 9 или 10°C ниже, чем температура теплового плавления (Tm); условия низкой степени строгости могут использовать гибридизацию и/или промывание при на 11-20°C ниже, чем температура теплового плавления (Tm). Используя уравнение, композиции для гибридизации и промывания и желаемую Tm, средние специалисты поймут, что вариации в степени строгости гибридизации и/или промывающих растворах по существу описаны. Если желаемая степень несовпадения ведет к Tm меньше чем 45°C (водный раствор) или 32°C (раствор формамида), предпочтительно увеличивать концентрацию SSC с тем, чтобы можно было использовать более высокую температуру. Обширное руководство по гибридизации нуклеиновых кислот можно найти в (1997) Ausubel et al, Short Protocols in Molecular Biology, стр. 2-40, 3-е издание, (1997) и в Sambrook et al. (1989).
[0097] В одном из вариантов осуществления полинуклеотидная донорная кассета содержит один или несколько связывающих доменов нуклеазы с цинковыми пальцами. По существу, вариант осуществления полинуклеотидной донорной кассеты содержит 1 связывающий домен нуклеазы с цинковыми пальцами, 2 связывающих домена нуклеазы с цинковыми пальцами, 3 связывающих домена нуклеазы с цинковыми пальцами, 4 связывающих домена нуклеазы с цинковыми пальцами, 5 связывающих доменов нуклеазы с цинковыми пальцами, 6 связывающих доменов нуклеазы с цинковыми пальцами, 7 связывающих доменов нуклеазы с цинковыми пальцами, 8 связывающих доменов нуклеазы с цинковыми пальцами, 9 связывающих доменов нуклеазы с цинковыми пальцами, 10 связывающих доменов нуклеазы с цинковыми пальцами, или больше связывающих доменов цинкового пальца.
[0098] Выбор сайтов-мишеней, ZFP и способов разработки и конструирования слитных белков (и полинуклеотидов, кодирующих их) известны специалистам в данной области и подробно описаны в патентах США №№ 6,140,081; 5,789,538; 6,453,242; 6,534,261; 5,925,523; 6,007,988; 6,013,453; 6,200,759; WO 95/19431; WO 96/06166; WO 98/53057; WO 98/54311; WO 00/27878; WO 01/60970 WO 01/88197; WO 02/099084; WO 98/53058; WO 98/53059; WO 98/53060; WO 02/016536 и WO 03/016496.
[0099] В последующих вариантах осуществления связывающий домен нуклеазы с цинковыми пальцами, содержащий одну или несколько связывающих последовательностей цинковых пальцев, связывается связывающим белком с цинковыми пальцами, связывающим белком мегануклеазы, CRIPSR или TALEN связывающим белком.
[00100] В определенных вариантах осуществления композиция и способы, описанные в настоящем документе, используют связывающий белок мегануклеазы (хоуминг-эндонуклеазы) или ДНК-связывающий домен мегануклеазы для связывания с донорной молекулой и/или связывания с областью, представляющей интерес, в геноме клетки. Встречающиеся в природе мегануклеазы распознают сайты расщепления в 15-40 пар оснований и обыкновенно образуют четыре семейства: семейство LAGLIDADG, семейство GIY-YIG, семейство бокса His-Cys и семейство HNH. Образцовые хоуминг-эндонуклеазы включают I-SceI, I-CeuI, PI-PspI, PI-Sce, I-SceIV, I-CsmI, I-PanI, I-SceII, I-PpoI, I-SceIII, I-CreI, I-TevI, I-TevII и I-TevIII. Их последовательности распознавания известны. См. также патент США № 5,420,032; патент США № 6,833,252; Belfort et al. (1997) Nucleic Acids Res. 25:3379-3388; Dujon et al. (1989) Gene 82:115-118; Perler et al. (1994) Nucleic Acids Res. 22, 1125-1127; Jasin (1996) Trends Genet. 12:224-228; Gimble et al. (1996) J. Mol. Biol. 263:163-180; Argast et al. (1998) J. Mol. Biol. 280:345-353 и каталог New England Biolabs.
[0100] В определенных вариантах осуществления способы и композиции, описанные в настоящем документе, используют нуклеазу, которая содержит сконструированную (не встречающуюся в природе) хоуминг-эндонуклеазу (мегануклеазу). Известны последовательности распознавания хоуминг-эндонуклеаз и мегануклеаз, таких как I-SceI, I-CeuI, PI-PspI, PI-Sce, I-SceIV, I-CsmI, I-PanI, I-SceII, I-PpoI, I-SceIII, I-CreI, I-TevI, I-TevII и I-TevIII. См. также патент США № 5,420,032; патент США № 6,833,252; Belfort et al. (1997) Nucleic Acids Res. 25:3379-3388; Dujon et al. (1989) Gene 82:115-118; Perler et al. (1994) Nucleic Acids Res. 22, 1125-1127; Jasin (1996) Trends Genet. 12:224-228; Gimble et al. (1996) J. Mol. Biol. 263:163-180; Argast et al. (1998) J. Mol. Biol. 280:345-353 и каталог New England Biolabs. Кроме того, специфичность связывания ДНК хоуминг-эндонуклеазами и мегануклеазами можно конструировать для того, чтобы связывать неприродные сайты-мишени. См., например, Chevalier et al. (2002) Molec. Cell 10:895-905; Epinat et al. (2003) Nucleic Acids Res. 31:2952-2962; Ashworth et al. (2006) Nature 441:656-659; Paques et al. (2007) Current Gene Therapy 7:49-66; публикацию патента США № 20070117128. ДНК-связывающие домены хоуминг-эндонуклеаз и мегануклеаз можно изменять в контексте нуклеазы в целом (т.е. так, что нуклеаза содержит родственный расщепляющий домен) или можно сливать с гетерологичным расщепляющим доменом.
[0101] В других вариантах осуществления ДНК-связывающий домен одной или нескольких из нуклеаз, используемых в способах и композициях, описанных в настоящем документе, содержит встречающийся в природе или сконструированный (не встречающийся в природе) ДНК-связывающий домен TAL эффектора. См., например, публикацию патента США № 20110301073, включенную посредством ссылки в полном объеме в настоящий документ. Известно, что патогенные бактерии растений рода Xanthomonas вызывают многие заболевания у важных сельскохозяйственных культур. Патогенность Xanthomonas зависит от консервативной системы секреции III типа (T3S), которая вводит больше чем 25 различных эффекторных белков в клетку растения. Среди этих введенных белков подобные активатору транскрипции (TAL) эффекторы, которые имитируют транскрипционные активаторы растений и влияют на транскриптом растения (см. Kay et al (2007) Science 318:648-651). Эти белки содержат ДНК-связывающий домен и домен транскрипционной активации. Одним из наиболее хорошо описанных TAL-эффекторов является AvrBs3 из Xanthomonas campestgris pv. Vesicatoria (см. Bonas et al (1989) Mol Gen Genet 218: 127-136 и WO2010079430). TAL-эффекторы содержат центрированный домен из тандемных повторов, каждый повтор содержит приблизительно 34 аминокислоты, которые являются ключевыми для специфичности связывания ДНК у этих белков. Кроме того, они содержат последовательность ядерной локализации и кислый домен транскрипционной активации (обзор см. в Schornack S, et al (2006) J Plant Physiol 163(3): 256-272). Кроме того, в фитопатогенных бактериях Ralstonia solanacearum найдены два гена, обозначаемые brg11 и hpx17, которые гомологичны семейству AvrBs3 из Xanthomonas, в штамме GMI1000 биовара 1 и в штамме RS1000 биовара 4 R. solanacearum (см. Heuer et al (2007) Appl and Envir Micro 73(13): 4379-4384). Эти гены идентичны друг другу на 98,9% по нуклеотидной последовательности, но различаются делецией 1575 п.о. в домене повтора hpx17. Однако, оба продукта гена имеют меньше чем 40% идентичности последовательностей с белками семейства AvrBs3 из Xanthomonas. См., например, публикации патента США №№ 20110239315, 20110145940 и 20110301073, включенные посредством ссылки в полном объеме в настоящий документ.
[0102] Специфичность этих TAL эффекторов зависит от последовательностей, найденных в тандемных повторах. Повторяющаяся последовательность содержит приблизительно 102 п.о., а повторы типично на 91-100% гомологичны друг другу (Bonas et al, там же). Полиморфизм повторов обычно расположен в положениях 12 и 13, и по-видимому имеет место соответствие один-к-одному между отличительными чертами двух гипервариабельных остатков в положениях 12 и 13 и отличительными чертами непрерывных нуклеотидов в целевой последовательности TAL-эффектора (см. Moscou and Bogdanove, (2009) Science 326:1501 и Boch et al (2009) Science 326:1509-1512). В эксперименте определен природный код этих TAL-эффекторов для распознавания ДНК так, что HD последовательность в положениях 12 и 13 ведет к связыванию с цитозином (C), NG связывается с T, NI с A, C, G или T, NN связывается с A или G, а ING связывается с T. Эти ДНК-связывающие повторы собраны в белках с новыми комбинациями и числом повторов, чтобы создавать искусственные факторы транскрипции, которые способны взаимодействовать с новыми последовательностями и активировать экспрессию неэндогенного репортерного гена в клетках растений (Boch et al, там же). Сконструированные TAL белки соединены с расщепляющим полудоменом FokI, чтобы получать слитный белок нуклеазы и TAL эффекторного домена (TALEN), который проявляет активность в репортерном анализе дрожжей (плазмидная мишень). См., например, публикацию патента США № 20110301073; Christian et al ((2010)<Genetics epub 10.1534/genetics.110.120717).
[0103] В других вариантах осуществления нуклеаза представляет собой систему, которая содержит CRISPR (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats)/Cas (CRISPR-ассоциированную) нуклеазную систему. CRISPR/Cas представляет собой недавно сконструированную нуклеазную систему на основе бактериальной системы, которую можно использовать для конструирования генома. Она основана на части адаптивного иммунного ответа многих бактерий и архей. Когда вирус или плазмида захватывает бактерию, сегменты ДНК захватчика превращаются в CRISPR РНК (crРНК) с помощью «иммунного» ответа. Затем эта crРНК соединяется, через область частичной комплементарности, с РНК другого типа, называемой tracrРНК, чтобы направлять Cas9 нуклеазу в область, гомологичную crРНК в целевой ДНК рядом со смежным с протоспейсером мотивом (PAM) NGG. Cas9 расщепляет ДНК для того, чтобы генерировать тупые концы в разрыве двухцепочечной ДНК в сайтах, точно определяемых 20-нуклеотидной направляющей последовательностью, содержащейся в транскрипте crРНК. Для Cas9 необходима как crРНК, так и tracrРНК для сайт-специфического распознавания и расщепления ДНК. Эта система сейчас сконструирована так, что crРНК и tracrРНК можно комбинировать в одной молекуле («единой направляющей РНК»), и эквивалентную crРНК часть единой направляющей РНК можно конструировать для того, чтобы направлять нуклеазу Cas9 для направленного воздействия на какую-либо желаемую последовательность, смежную с PAM (см. Jinek et al (2012) Science 337, стр. 816-821, Jinek et al, (2013), eLife 2:e00471, и David Segal, (2013) eLife 2:e00563). Таким образом, систему CRISPR/Cas можно конструировать для того, чтобы создавать разрыв двухцепочечной ДНК в желаемой мишени в геноме, а на репарацию разрыва двухцепочечной ДНК можно влиять с помощью ингибиторов репарации, чтобы вызывать увеличение репарации с внесением ошибок.
[0104] В определенных вариантах осуществления ДНК-связывающий домен одной или нескольких из нуклеаз, используемых для расщепления и/или направленного расщепления генома клетки in vivo, содержит белок с цинковым пальцем. Предпочтительно, белок с цинковым пальцем является не встречающимся в природе, поскольку его конструируют для связывания с предпочтительным сайтом-мишенью. См., например, Beerli et al. (2002) Nature Biotechnol. 20:135-141; Pabo et al. (2001) Ann. Rev. Biochem. 70:313-340; Isalan et al. (2001) Nature Biotechnol. 19:656-660; Segal et al. (2001) Curr. Opin. Biotechnol. 12:632-637; Choo et al. (2000) Curr. Opin. Struct. Biol. 10:411-416; патенты США №№ 6,453,242; 6,534,261; 6,599,692; 6,503,717; 6,689,558; 7,030,215; 6,794,136; 7,067,317; 7,262,054; 7,070,934; 7,361,635; 7,253,273; и публикации патентов США №№ 2005/0064474; 2007/0218528; 2005/0267061, все включены в настоящий документ посредством ссылки в полном объеме.
[0105] Сконструированный связывающий домен цинкового пальца может иметь новую специфичность связывания по сравнению со встречающимся в природе белком с цинковым пальцем. Способы конструирования включают, но не ограничиваясь этим, рациональную разработку и различные типы отбора. Рациональная разработка включает, например, использование баз данных, которые содержат триплетные (или квадруплетные) нуклеотидные последовательности и индивидуальные аминокислотные последовательности цинковых пальцев, в которых каждая триплетная или квадруплетная нуклеотидная последовательность связана с одной или несколькими аминокислотными последовательностями цинковых пальцев, которые связывают конкретную триплетную или квадруплетную последовательность. См., например, совместно принадлежащие патенты США 6,453,242 и 6,534,261, включенные посредством ссылки в настоящий документ в полном объеме.
[0106] Образцовые способы отбора, включая фаговый дисплей и двугибридные системы, раскрыты в патентах США 5,789,538; 5,925,523; 6,007,988; 6,013,453; 6,410,248; 6,140,466; 6,200,759; и 6,242,568; а также WO 98/37186; WO 98/53057; WO 00/27878; WO 01/88197 и GB 2,338,237. Кроме того, улучшение специфичности связывания для связывающих доменов цинковых пальцев описано, например, в совместно принадлежащей WO 02/077227.
[0107] Кроме того, как раскрыто в этих и других литературных источниках, домены цинковых пальцев и/или белки с множеством цинковых пальцев могут быть соединены вместе с использованием любых подходящих линкерных последовательностей, включая, например, линкеры из пяти или больше аминокислот в длину. Также образцовые линкерные последовательности 6 или больше аминокислот в длину см. в патентах США №№ 6,479,626; 6,903,185; и 7,153,949. Белки, описанные в настоящем документе, могут содержать какую-либо комбинацию подходящих линкеров между отдельными цинковыми пальцами белка.
[0108] В настоящем документе описаны композиции, в частности, нуклеазы, которые можно использовать для расщепления донорной молекулы, несущей трансген, in vivo, и нуклеазы для расщепления генома клетки так, что трансген интегрируют в геном направленным образом. В определенных вариантах осуществления одна или несколько из нуклеаз являются встречающимися в природе. В других вариантах осуществления одна или несколько из нуклеаз являются не встречающимися в природе, т.е., сконструированными в ДНК-связывающем домене и/или расщепляющем домене. Например, ДНК-связывающий домен встречающейся в природе нуклеазы можно изменять для того, чтобы связываться с выбранным сайтом-мишенью (например, мегануклеаза, которую сконструировали для того, чтобы связываться с сайтом, отличающимся от родственного сайта связывания). В других вариантах осуществления нуклеаза содержит гетерологичные ДНК-связывающий и расщепляющий домены (например, нуклеаза с цинковыми пальцами; ДНК связывающие белки с TAL-эффекторным доменом; ДНК-связывающие домены мегануклеазы с гетерологичными расщепляющими доменами).
[0109] Любой подходящий расщепляющий домен может быть функционально связан с ДНК-связывающим доменом для того, чтобы формировать нуклеазу. Например, ZFP ДНК-связывающие домены слиты с доменами нуклеазы для того, чтобы создавать ZFN - функциональную единицу, которая способна распознавать предназначенную для нее целевую нуклеиновую кислоту через ее сконструированный (ZFP) ДНК-связывающий домен и вызывать разрезание ДНК около сайта связывания ZFP через нуклеазную активность. См., например, Kim et al. (1996) Proc Natl Acad Sci USA 93(3):1156-1160. Совсем недавно ZFN использованы для модификации генома у различных организмов. См., например, публикации патентов США 20030232410; 20050208489; 20050026157; 20050064474; 20060188987; 20060063231; и международную публикацию WO 07/014275. Аналогичным образом, TALE ДНК-связывающие домены слиты с доменами нуклеазы для того, чтобы создавать TALEN. См., например, публикацию США № 20110301073.
[0110] Как указано выше, расщепляющий домен может быть гетерологичным по отношению к ДНК-связывающему домену, например, ДНК-связывающий домен с цинковым пальцем и расщепляющий домен из нуклеазы или TALEN ДНК-связывающий домен и расщепляющий домен или ДНК-связывающий домен мегануклеазы и расщепляющий домен из другой нуклеазы. Гетерологичные расщепляющие домены можно получать из конкретной эндонуклеазы или экзонуклеазы. Образцовые эндонуклеазы, из которых можно получать расщепляющий домен, включают, но не ограничиваясь этим, определенные рестрикционные эндонуклеазы и хоуминг-эндонуклеазы. См., например, каталог New England Biolabs 2002-2003, Beverly, MA; и Belfort et al. (1997) Nucleic Acids Res. 25:3379-3388. Известны дополнительные ферменты, которые расщепляют ДНК (например, S1 нуклеаза; нуклеаза золотистой фасоли; панкреатическая ДНКаза I; микрококковая нуклеаза; HO эндонуклеаза дрожжей; см. также Linn et al. (редакторы), Nucleases, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1993). Один или несколько этих ферментов (или их функциональные фрагменты) можно использовать в качестве источника расщепляющих доменов и расщепляющих полудоменов.
[0111] Аналогичным образом, расщепляющий полудомен можно получать из какой-либо нуклеазы или ее части, как изложено выше, для которой нужна димеризация для расщепляющей активности. В целом, для расщепления необходимы два слитных белка, если слитные белки содержат расщепляющие полудомены. Альтернативно, можно использовать один белок, содержащий два расщепляющих полудомена. Два расщепляющих полудомена можно получать из одной и той же эндонуклеазы (или ее функциональных фрагментов), или каждый расщепляющий полудомен можно получать из отличающейся эндонуклеазы (или ее функциональных фрагментов). Кроме того, сайты-мишени для двух слитных белков предпочтительно располагают относительно друг друга так, что связывание двух слитных белков с соответствующими им сайтами-мишенями размещает расщепляющие полудомены в пространственной ориентации относительно друг друга, которая позволяет расщепляющим полудоменам формировать функциональный расщепляющий домен, например, посредством димеризации. Таким образом, в определенных вариантах осуществления соседние края сайтов-мишеней разделяют 5-8 нуклеотидами или 15-18 нуклеотидами. Однако между двумя сайтами-мишенями может находиться какое-либо целое число нуклеотидов или пар нуклеотидов (например, от 2 до 50 пар нуклеотидов или больше). В целом, сайт расщепления лежит между сайтами-мишенями.
[0112] Рестрикционные эндонуклеазы (рестрикционные ферменты) присутствуют у многих биологических видов и способны связываться со специфичной последовательностью ДНК (в сайте распознавания) и расщеплять ДНК в сайте связывания или около него. Определенные рестрикционные ферменты (например, IIS типа) расщепляют ДНК в сайтах, удаленных от сайта распознавания, и имеют разделяемые связывающий и расщепляющий домены. Например, фермент FokI IIS типа катализирует расщепление двухцепочечной ДНК в 9 нуклеотидах от его сайта распознавания на одной нити и в 13 нуклеотидах от его сайта распознавания в другой. См., например, патенты США 5,356,802; 5,436,150 и 5,487,994; а также Li et al. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:4275-4279; Li et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:2764-2768; Kim et al. (1994a) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:883-887; Kim et al. (1994b) J. Biol. Chem. 269:31,978-31,982. Таким образом, в одном из вариантов осуществления слитные белки содержат расщепляющий домен (или расщепляющий полудомен) из по меньшей мере одного рестрикционного фермента IIS типа и один или несколько связывающих доменов цинковых пальцев, которые могут быть сконструированы или не сконструированы.
[0113] Образцовым рестрикционным ферментом IIS типа, расщепляющий домен которого можно отделить от связывающего домена, является FokI. Этот конкретный фермент активен в виде димера. Bitinaite et al. (1998) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95: 10,570-10,575. Соответственно, для целей настоящего раскрытия часть фермента FokI, используемую в раскрытых слитных белках, считают расщепляющим полудоменом. Таким образом, для направленного двухцепочечного расщепления и/или направленной замены ДНК последовательностей с использованием слитных белков из цинкового пальца и FokI, два слитных белка, каждый содержит расщепляющий полудомен FokI, можно использовать для восстановления каталитически активного расщепляющего домена. Альтернативно, также можно использовать одну полипептидную молекулу, содержащую связывающий домен цинкового пальца и два расщепляющих полудомена FokI. Параметры для направленного расщепления и направленного изменения последовательности с использованием слитных белков из цинкового пальца и FokI предоставлены в другом месте в этом раскрытии.
[0114] Расщепляющий домен или расщепляющий полудомен может представлять собой какую-либо часть белка, которая сохраняет расщепляющую активность, или которая сохраняет способность к мультимеризации (например, димеризации) для того, чтобы формировать функциональный расщепляющий домен.
[0115] Образцовые рестрикционные ферменты IIS типа описаны в международной публикации WO 07/014275, включенной в настоящий документ в полном объеме. Дополнительные рестрикционные ферменты также содержат отделяемые связывающие и расщепляющие домены, и они предусмотрены настоящим раскрытием. См., например, Roberts et al. (2003) Nucleic Acids Res. 31:418-420.
[0116] В определенных вариантах осуществления расщепляющий домен содержит один или несколько сконструированных расщепляющих полудоменов (также обозначаемых как мутанты димеризующихся доменов), которые минимизируют или предотвращают гомодимеризацию, как описано, например, в публикациях патентов США №№ 20050064474; 20060188987; 20070305346 и 20080131962, все их раскрытия включены в настоящий документ посредством ссылки в полном объеме. Все аминокислотные остатки в положениях 446, 447, 479, 483, 484, 486, 487, 490, 491, 496, 498, 499, 500, 531, 534, 537 и 538 в FokI представляют собой мишени для воздействия на димеризацию расщепляющих полудоменов FokI.
[0117] Образцовые сконструированные расщепляющие полудомены FokI, которые формируют необходимые гетеродимеры, включают пару, в которой первый расщепляющий полудомен содержит мутации в аминокислотных остатках в положениях 490 и 538 в FokI, а второй расщепляющий полудомен содержит мутации в аминокислотных остатках 486 и 499.
[0118] Таким образом, в одном из вариантов осуществления мутация в 490 заменяет Glu (E) на Lys (K); мутация в 538 заменяет Iso (I) на Lys (K); мутация в 486 заменяет Gln (Q) на Glu (E); и мутация в положении 499 заменяет Iso (I) на Lys (K). В частности, сконструированные расщепляющие полудомены, описанные в настоящем документе, получали посредством введения мутаций в положения 490 (E→K) и 538 (I→K) в одном расщепляющем полудомене для того, чтобы получать сконструированный расщепляющий полудомен, обозначаемый «E490K:I538K», и посредством введения мутаций в положения 486 (Q→E) и 499 (I→L) в другом расщепляющем полудомене для того, чтобы получать сконструированный расщепляющий полудомен, обозначаемый «Q486E:I499L». Сконструированные расщепляющие полудомены, описанные в настоящем документе, представляют собой обязательные гетеродимерные мутанты, у которых аберрантное расщепление минимизировано или устранено. См., например, публикацию патента США № 2008/0131962, раскрытие которого включено посредством ссылки в полном объеме для всех целей. В определенных вариантах осуществления сконструированный расщепляющий полудомен содержит мутации в положениях 486, 499 и 496 (нумерация относительно FokI дикого типа), например, мутации, которые заменяют остаток Gln (Q) дикого типа в положении 486 на остаток Glu (E), остаток Iso (I) дикого типа в положении 499 на остаток Leu (L) и остаток Asn (N) дикого типа в положении 496 на остаток Asp (D) или Glu (E) (также обозначаемые как домены «ELD» и «ELE», соответственно). В других вариантах осуществления сконструированный расщепляющий полудомен содержит мутации в положениях 490, 538 и 537 (нумерация относительно FokI дикого типа), например, мутации, которые заменяют остаток Glu (E) дикого типа в положении 490 на остаток Lys (K), остаток Iso (I) дикого типа в положении 538 на остаток Lys (K) и остаток His (H) дикого типа в положении 537 на остаток Lys (K) или остаток Arg (R) (также обозначаемые как домены «KKK» и «KKR», соответственно). В других вариантах осуществления сконструированный расщепляющий полудомен содержит мутации в положениях 490 и 537 (нумерация относительно FokI дикого типа), например, мутации, которые заменяют остаток Glu (E) дикого типа в положении 490 на остаток Lys (K) и остаток His (H) дикого типа в положении 537 на остаток Lys (K) или остаток Arg (R) (также обозначаемые как домены «KIK» и «KIR», соответственно) (см. публикацию патента США № 20110201055). В других вариантах осуществления сконструированный расщепляющий полудомен содержит мутации «Sharkey» (см. Guo et al, (2010) J. Mol. Biol. 400(1):96-107).
[0119] Сконструированные расщепляющие полудомены, описанные в настоящем документе, можно получать с использованием любых подходящих способов, например, посредством сайт-специфического мутагенеза расщепляющих полудоменов дикого типа (FokI) как описано в публикациях патентов США №№ 20050064474; 20080131962; и 20110201055.
[0120] Альтернативно, нуклеазы можно собирать in vivo в сайте-мишени нуклеиновой кислоты с использованием так называемой технологии «разделенный фермент» (см., например, публикацию патента США № 20090068164). Компоненты таких разделенных ферментов можно экспрессировать или с отдельных экспрессионных конструкций или можно соединять в одной открытой рамке считывания, где отдельные компоненты разделяют, например, посредством саморасщепления пептида 2A или последовательности IRES. Компоненты могут представлять собой отдельные связывающие домены цинковых пальцев или домены из связывающего нуклеиновые кислоты домена мегануклеазы.
[0121] Перед использованием можно осуществлять скрининг нуклеаз на активность, например, в дрожжевой хромосомной системе, как описано в WO 2009/042163 и 20090068164. Экспрессионные конструкции нуклеаз можно легко разрабатывать с использованием известных в данной области способов. См., например, публикации патентов США 20030232410; 20050208489; 20050026157; 20050064474; 20060188987; 20060063231; и международную публикацию WO 07/014275. Экспрессия нуклеазы может быть под управлением конститутивного промотора или индуцибельного промотора, например, промотора галактокиназы, который активируется (происходит устранение репрессии) в присутствии раффинозы и/или галактозы и подвергается репрессии в присутствии глюкозы.
[0122] В одном из вариантов осуществления полинуклеотидная донорная кассета содержит аналитический домен. В других вариантах осуществления аналитический домен содержит конкретную полинуклеотидную последовательность. Примеры конкретных полинуклеотидных последовательностей включают, но не ограничиваясь этим, SEQ ID NO: 142 и SEQ ID NO: 143. В различных вариантах осуществления, последовательности с по меньшей мере 90% идентичности последовательностей с конкретными полинуклеотидными последовательностями SEQ ID NO: 142 и SEQ ID NO: 143 описаны в настоящем документе. В других вариантах осуществления последовательности с по меньшей мере 95% идентичности последовательностей с конкретными полинуклеотидными последовательностями SEQ ID NO: 142 и SEQ ID NO: 143 описаны в настоящем документе. В других вариантах осуществления последовательности с по меньшей мере 97% идентичности последовательностей с конкретными полинуклеотидными последовательностями SEQ ID NO: 142 и SEQ ID NO: 143 описаны в настоящем документе. В других вариантах осуществления, последовательности с по меньшей мере 99% идентичности последовательностей с конкретными полинуклеотидными последовательностями SEQ ID NO: 142 и SEQ ID NO: 143 описаны в настоящем документе.
[0123] В одном из вариантов осуществления аналитический домен имеет долю гуанина и цитозина от 40 до 60%. В других вариантах осуществления аналитический домен имеет долю гуанина и цитозина от 42,25 до 57,5%. В других вариантах осуществления аналитический домен имеет долю гуанина и цитозина от 45 до 55%. В другом варианте осуществления аналитический домен имеет долю гуанина и цитозина от 47,75 до 52,25%. Долю содержания гуанина и цитозина в области, содержащей определенную полинуклеотидную последовательность, можно вычислять посредством подсчета числа остатков гуанина и цитозина в полинуклеотидной последовательности и деления этого числа на общее число пар оснований во фрагменте полинуклеотидной последовательности и последующего умножения результата на 100 для того, чтобы определять процентную долю гуанина и цитозина для полинуклеотидной последовательности. Праймеры, которые имеют долю гуанина и цитозина 40-60% ведут к более стабильному связыванию с матричной ДНК во время ПЦР амплификации. Однако ДНК молекулы с долей гуанина и цитозина больше чем 60% сложно амплифицировать через ПЦР, поскольку такие последовательности могут формировать стебель-петлю, димер и другие вторичные структуры.
[0124] Температуру плавления (Tm) определяют как температуру, при которой половина нитей ДНК находится в состоянии двойной спирали и половина находится в состояниях случайных спиралей. Температура плавления может зависеть от переменных, в том числе длины молекулы, конкретной композиции нуклеотидной последовательности этой молекулы и молярности соли и нуклеиновой кислоты в растворе. Стабильность дуплексов и температура плавления важны при амплификации нуклеиновых кислот, в которой может быть использовано термоциклирование. Во время таких стадий термоциклирования температуру поднимают выше температуры плавления в достаточной мере, чтобы происходила диссоциация дуплексов целевой нуклеиновой кислоты и ее комплемента. На последующих стадиях температуру повторной ренатурации опускают ниже температуры плавления так, что целевая нуклеиновая кислота и праймер(праймеры) и/или зонд(зонды) способны формировать дуплексы, но при этом сохраняя ее достаточно высокой для того, чтобы избегать неспецифичной гибридизации. В данной области тщательно описаны температура плавления и то, как ее измерять. См. например, Nucleinic Acids Research (1990) 18, 6409-6412 и Bioinformatics, V. 12(12), стр. 1226-1227. Теоретические или эмпирические модели, которые связывают стабильность дуплекса с нуклеотидной последовательностью, можно использовать для того, чтобы предсказывать температуру плавления нуклеиновых кислот. Например, в Proc. Natl. Acad. Sci: U.S.A. 1986, 83:3746-3750, Biochemistry 1996, 35:3555-3562; и Proc. Natl. Acad Sci. U.S.A. 1998, 95:1460-1465 описана модель для предсказания температуры плавления, которую широко используют в данной области и которая известна как «модель ближайших соседей». Эта модель учитывает как длину олигонуклеотида, так и последовательность оснований в нем.
[0125] Предсказанная температура плавления относится к теоретически вычисленной температуре плавления олигонуклеотида, который не конъюгирован с какими-либо фрагментами. Обычно она представляет собой оценку фактической температуры плавления олигонуклеотида и основана на последовательности олигонуклеотида, типично без учета эффекта каких-либо меток и каких-либо ассоциированных линкеров и т.п. Учитывая точную последовательность олигонуклеотида, температуру плавления олигонуклеотида можно предсказывать, как рассмотрено выше. Предсказанную температуру плавления в соответствии с настоящим изобретением вычисляют в одном из вариантов осуществления с использованием модели ближайших соседей. В дополнительном варианте осуществления предсказанную температуру плавления в соответствии с настоящим изобретением вычисляют с использованием термодинамической теории ближайших соседей с использованием значений SantaLucia (SantaLucia, J., Jr. (1998) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. (1998) 95, 1460-1465). Значения SantaLucia содержатся в различных компьютерных программах, которые можно использовать для того, чтобы предсказывать температуру плавления. В одном из вариантов осуществления используют пакет программного обеспечения «Beacon Designer». В одном из вариантов осуществления значения SantaLucia используют при следующих условиях реакции; концентрация нуклеиновой кислоты 0,25 нМ; концентрация одновалентных ионов 50 мМ; концентрация свободных ионов магния 5 мМ; эквивалент общего Na+ 332,84 мМ; и температура для вычисления свободной энергии 25°C. Независимо от выбора конкретных программ программного обеспечения или используемых способов, те же программы программного обеспечения или способы по желанию используют подходящим образом с их настройками по умолчанию для определения предсказанной температуры плавления праймера(праймеров) и зонда(зондов), используемых в настоящем изобретении.
[0126] Термины «минимальная свободная энергия» (MFE), «свободная энергия» и «свободная энергия Гиббса» используют в настоящем документе взаимозаменяемо. Свободная энергия Гиббса представляет собой термодинамическое количество, которое является разницей между энтальпией и произведением абсолютной температуры и энтропии системы. Свободная энергия Гиббса представляет собой способность системы выполнять немеханическую работу, а ΔG измеряет немеханическую работу, выполненную в ней. (Perrot, Pierre. A to Z of Thermodynamics. Oxford University Press (1998)). Свободную энергию Гиббса определяют как G=H−TS, где H представляет собой энтальпию, T представляет собой температуру и S представляет собой энтропию (H=U+pV, где p представляет собой давление и V представляет собой объем).
[0127] В целом считают, что все системы стремятся достигнуть минимальной свободной энергии. Таким образом, когда изменение свободной энергии Гиббса, ΔG, является отрицательным, тогда реакция предпочтительна, и происходит высвобождение энергии. Количество высвобождаемой энергии равно максимальному количеству работы, которую можно осуществлять в результате этой конкретной химической реакции. Когда условия ведут к изменению свободной энергии Гиббса, ΔG, которая является положительной, тогда в систему следует добавлять энергию, чтобы вызвать протекание реакции. В изотермических изобарических системах свободная энергия Гиббса является репрезентативной мерой конкурирующих эффектов энтальпии и энтропии, которые вовлечены в термодинамический процесс. Таким образом, свободную энергию Гиббса можно рассматривать как динамическое количество.
[0128] Следует отметить, что на измерение свободной энергии может влиять длина нуклеотидной последовательности. Более длинные нуклеотидные последовательности имеют больший диапазон свободных энергий, чем короткие нуклеотидные последовательности. Таким образом, нуклеотидные последовательности переменной длины можно сравнивать посредством нормализации вычисления свободной энергии (ккал/моль) путем деления свободной энергии на длину последовательности (т.е. средняя свободная энергия=ΔG/длина нуклеотидной последовательности (ккал/моль/пара оснований)).
[0129] Соответственно, как используют в настоящем документе, минимальная свободная энергия (т.е. свободная энергия, свободная энергия Гиббса) определяет значение для структуры, найденной путем термодинамической оптимизации (т.е. реализация алгоритма Зукера (M. Zuker and P. Stiegler, Nucleic Acids Research 9:133-148 (1981)), которая имеет наименьшее значение свободной энергии (т.е. свободная энергия Гиббса; ΔG (ккал/моль); ΔG/длина нуклеотидной последовательности (ккал/моль/пара оснований)). Свободную энергию Гиббса для последовательности можно вычислять, например, с использованием RNAfold™ или PRIMER EXPRESS™ (версии 1.0, Applied Biosystems, Foster City, CA) или программа программного обеспечения mFOLD™ (сейчас UNIFold™) (IDT, San Jose, CA), как известно специалистам в данной области. (См., например, Id., Hofacker et al. Monatshefte f. Chemie 125: 167-188 (1994); McCaskill J S. Biopolymers 29 (6-7):1105-19. (1990); и Hofacker et al. Bioinformatics 22 (10):1172-6 (2006)).
[0130] В одном из вариантов осуществления аналитический домен содержит полинуклеотид, который не содержит множества повторяющихся последовательностей, в котором повторяющаяся последовательность по меньшей мере 9 п.о. в длину. В некоторых вариантах осуществления множество повторяющихся последовательностей содержит 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 или больше полинуклеотидных фрагментов по меньшей мере 9 п.о. в длину. В одном из вариантов осуществления первая полинуклеотидная последовательность образует повторяющуюся последовательность, когда вторая полинуклеотидная последовательность, содержащая ту же последовательность, расположена непосредственно ниже по направлению считывания от первой полинуклеотидной последовательности (например, первая полинуклеотидная последовательность содержит 5’-gaaaaataacaa-3’, эта полинуклеотидная последовательность составляет повторяющуюся последовательность, когда вторая полинуклеотидная последовательность (подчеркнутая), содержащая ту же последовательность, расположена непосредственно ниже по направлению считывания от первой полинуклеотидной последовательности 5’-gaaaaataacaagaaaaataacaa-3’). В одном из вариантов осуществления аналитический домен содержит полинуклеотид, который не содержит множества таких повторяющихся последовательностей.
[0131] В одном из вариантов осуществления аналитический домен содержит полинуклеотид, который не содержит серию последовательностей из идентичных пар оснований больше чем 9 п.о. в длину. Идентичные пары оснований представляют собой любое число пар оснований, больше чем 9 п.о., из пар одинаковых пуриновых (аденин или гуанин) или пиримидиновых (цитозин или тимин) оснований, которые идут одно за другим в пространственной или временной очередности. Соответственно, такой фрагмент из нуклеотидов, как; 5’-AAAAAAAAA-3’, 5’-GGGGGGGGG-3’, 5’-CCCCCCCCC-3’ или 5’-TTTTTTTTT-3’, содержит серию из девяти идентичных пар оснований. В одном из вариантов осуществления серия последовательностей из идентичных пар оснований может быть больше чем 9 п.о., 10 п.о., 11 п.о., 12 п.о., 13 п.о., 14 п.о., 15 п.о. или больше п.о. в длину.
[0132] В других вариантах осуществления аналитический домен полинуклеотидной донорной кассеты содержит одну или несколько последовательностей рестрикционных ферментов. Рестрикционный фермент представляет собой фермент, способный расщеплять ДНК на фрагменты. Расщепление геномной ДНК с большой молекулярной массой рестрикционным ферментом на фрагменты из фрагментов с более низкой молекулярной массой делает возможными более эффективные выделение и манипуляции фрагментами ДНК для последующего анализа.
[0133] Расщепление рестрикционными ферментами, также обозначаемое как расщепление рестрикционными эндонуклеазами, осуществляют, когда фермент нуклеазу используют для того, чтобы расщеплять полинуклеотидные последовательности. Существует множество рестрикционных ферментов, доступных специалистам в данной области. Как описано в www.neb.com/nebecomm/tech_reference/restriction_enzymes/overview.asp, используют четыре классификации для определения характеристик рестрикционных ферментов. Эти классификации выполняют на основании композиции субъединиц, положения расщепления, специфичности последовательности и требований к кофакторам.
[0134] Ферменты I типа случайно разрезают ДНК в местоположениях, которые удалены (на >1000 п.о.) от распознающей/связывающей последовательности. Сайты распознавания, которые связывает фермент I типа, являются асимметричными. Как результат, эти ферменты не используют для клонирования генов, поскольку эти ферменты не дают дискретных рестрикционных фрагментов или четких паттернов полос на геле. Ферменты I типа являются мультифункциональными, и различные субъединицы, которые содержит рестрикционный фермент I типа, отвечают за различные активности (т.е. субъединица HsdR кодирует рестрикцию, субъединица HsdM кодирует метилирование ДНК, а субъединица HsdS кодирует специфичность последовательности распознавания).
[0135] Ферменты II типа расщепляют ДНК в положениях, расположенных в непосредственной близости от последовательностей распознавания. Эти ферменты функционируют как димеры, в которых субъединица связывается со смысловой цепью, а вторая копия субъединицы связывается с антисмысловой цепью в палиндромной последовательности, которая типично составляет 4-8 нуклеотидов в длину. Димер II типа, который связывается с ДНК, может представлять собой или гомодимер, который связывается с симметричными последовательностями ДНК, или гетеродимер, который связывается с асимметричными последовательностями ДНК. Ферменты могут распознавать или непрерывные последовательности или прерывающиеся последовательности. Ферменты II типа коммерчески доступны и широко используются для анализа ДНК и клонирования генов. Широкое использование этих ферментов является результатом четких рестрикционных фрагментов, которые могут быть получены и и разрешены на агарозном геле.
[0136] Ферменты II типа представляют собой совокупность неродственных белков, сходство аминокислотных последовательностей которых обладает высокой дивергенцией. Ферменты II типа разделены на подкатегории, которые помечены буквенным суффиксами. Рестрикционные ферменты IIB типа представляют собой мультимеры, которые содержат больше чем одну субъединицу. Эти ферменты разрезают последовательности распознавания с обеих сторон, тем самым приводя к удалению последовательности распознавания. Рестрикционные ферменты IIE типа и IIF типа расщепляют ДНК после взаимодействия с двумя копиями своей последовательности распознавания. Рестрикционные ферменты IIG типа состоят из одной субъединицы. N-концевая часть фермента содержит ДНК расщепляющий домен и ДНК модифицирующий домен. C-концевая часть фермента содержит связывающий последовательность ДНК домен. Эти ферменты осуществляют расщепление за пределами своей последовательности распознавания. Рестрикционные ферменты IIM типа распознают и разрезают метилированную ДНК. Рестрикционные ферменты IIS типа функционируют в качестве димера и расщепляют ДНК в местоположении, которое находится за пределами непалиндромных асимметричных сайтов распознавания. Эти ферменты состоят из двух отдельных доменов, один для связывания ДНК, а другой для расщепления ДНК.
[0137] Ферменты III типа представляют собой комбинированные ферменты рестрикции и модификации. Эти ферменты распознают две отдельные непалиндромные последовательности и осуществляют расщепление за пределами своих последовательностей распознавания. Ферментам III типа для выполнения расщепления необходимы две последовательности распознавания в противоположных ориентациях в одной и той же молекуле ДНК.
[0138] Ферменты IV типа распознают метилированную ДНК. Примеры включают системы McrBC и Mrr из E. coli.
[0139] В одном из вариантов осуществления аналитический домен полинуклеотидной донорной кассеты содержит одну или несколько связывающих праймеры последовательностей. Термин «связывающая праймер последовательность» относится к области аналитического домена или какой-либо другой полинуклеотидной последовательности, типично к последовательности, фланкирующей целевую область и/или ампликон, которые может служить непосредственно или опосредовано через свой комплемент в качестве матрицы, с которой праймер может ренатурировать для любой подходящей реакции достройки праймера или реакции амплификации, известной в данной области, например, но не ограничиваясь этим, ПЦР. Специалисты в данной области примут во внимание, что когда два сайта связывания праймеров присутствуют на одном полинуклеотиде, ориентация двух сайтов связывания праймеров в целом является различной. Например, один праймер из пары праймеров комплементарен первому сайту связывания праймера и может гибридизоваться с ним, тогда как соответствующий праймер из пары праймеров разрабатывают для гибридизации с комплементом второго сайта связывания праймера. Иначе говоря, в некоторых вариантах осуществления первый сайт связывания праймера может находиться в смысловой ориентации, а второй сайт связывания праймера может находиться в антисмысловой ориентации. Сайт связывания праймера ампликона может содержать, но не обязательно содержит ту же последовательность, что и последовательность целевой фланкирующей последовательности или ее комплемента, или по меньшей мере ее часть.
[0140] Праймер можно разрабатывать для связывания с аналитическим доменом, который содержит вторичную структуру, для которой вычисленная свободная энергия (ΔG) составляет от -1 до -18 ккал/моль. В одном из вариантов осуществления можно разрабатывать праймер с температурой плавления (Tm) по меньшей мере на 10°C больше чем область аналитического домена, содержащая вторичную структуру со свободной энергией (ΔG) от -1 до -18 ккал/моль, как вычисляют с использованием программного обеспечения для укладки и гибридизации нуклеиновых кислот UNAFold, Markham, N. R. & Zuker, M. (2008). В Bioinformatics, том II, под под редакцией Keith, J. M., Structure, Function and Applications, номер 453 в Methods in Molecular Biology, глава 1, стр. 3-31. Humana Press, Totowa, NJ. ISBN 978-1-60327-428-9.
[0141] В одном из вариантов осуществления аналитический домен полинуклеотидной донорной кассеты содержит одну или несколько последовательностей гомологичных звеньев. Последующие варианты осуществления одной или нескольких последовательностей гомологичных звеньев состоят из отрезков от 50 до 100 пар оснований. Гомологичные звеня, состоящие из случайных фрагментов нуклеотидов, можно легко разрабатывать и синтезировать для различных применений. Универсальные полинуклеотидные донорные последовательности могут содержать одно или несколько гомологичных звеньев, которые используют для гомологичного встраивания полинуклеотида в геном организма-хозяина. В некоторых вариантах осуществления на гомологичное звено направленно воздействуют посредством введения двухцепочечного разрыва внутри гомологичного звена или рядом с ним и встраивания второго полинуклеотида, который может содержать кассету экспрессии гена, которая содержит трансген, в область гомологичного звена. Типично, встраивание второго полинуклеотида происходит через репарацию с гомологичной рекомбинацией.
[0142] В одном из вариантов осуществления область гомологичного звена имеет по меньшей мере 80, 90, 93, 95, 99 или 100% идентичности последовательностей с оптимальными геномными локусами. В одном из вариантов осуществления, вариант осуществления области гомологичного звена имеет по меньшей мере 80, 90, 93, 95, 99 или 100% идентичности последовательностей с оптимальными геномными локусами клетки растения. В одном из вариантов осуществления оптимальные геномные локусы представляют собой негенную последовательность односеменодольных или двусеменодольный, которая является гипометилированной, экспрессируемой, воплощает свидетельство рекомбинации и расположена в проксимальном местоположении относительно генной области в геноме растения.
[0143] В одном из вариантов осуществления оптимальные геномные локусы представляют собой гипометилированную негенную последовательность, которая имеет следующие свойства или характеристики:
a) уровень метилирования указанной негенной последовательности составляет 1% или меньше;
b) негенная последовательность имеет меньше чем 40% идентичности последовательностей с какой-либо другой последовательностью, содержащейся в геноме;
c) негенная последовательность имеет меньше чем 40% идентичности последовательностей с какой-либо другой последовательностью, содержащейся в геноме;
d) негенная последовательность расположена в пределах области в 40 т.о. от известной или предсказанной экспрессионной кодирующей последовательности; и,
e) негенная последовательность демонстрирует частоту рекомбинаций в геноме больше 0,00041 сМ/млн. о.
[0144] В одном из вариантов осуществления оптимальные геномные локусы представляют собой гипометилированную негенную последовательность, которая имеет 1, 2, 3, 4 или 5 из следующих свойств или характеристик:
a) имеет известную или предсказанную генную кодирующую последовательность в пределах 40 т.о. от указанной негенной последовательности;
b) имеет последовательность, которая содержит на 2 т.о. выше по направлению считывания и/или 1 т.о. ниже по направлению считывания от известного гена в пределах 40 т.о. один конец указанной негенной последовательности;
c) не содержит больше чем 1% метилирования ДНК в негенной последовательности;
d) не содержит последовательность 1 т.о., которая имеет больше чем 40% идентичности последовательностей с какой-либо другой последовательностью в геноме; и
e) воплощает свидетельство рекомбинации с частотой рекомбинации больше чем 0,00041 сМ/млн. о.
[0145] В соответствии с один из вариантов осуществления выбранная негенная последовательность содержит 2, 3, 4, 5, 6, 7 или 8 следующих характеристик:
a) негенная последовательность не содержит метилированный полинуклеотид;
b) негенная последовательность демонстрирует частоту рекомбинации от 0,00041 до 62,42 сМ/млн. о. в геноме;
c) негенная последовательность демонстрирует уровень заполнения генома нуклеосомами от 0 до 0,962;
d) негенная последовательность имеет меньше чем 40% идентичности последовательностей с какой-либо другой последовательностью 1 т.о., содержащейся в геноме;
e) негенная последовательность имеет значение относительного местоположения от 0,00373 до 0,99908, которое представляет долю геномного расстояния от центромеры хромосомы;
f) негенная последовательность имеет процентное содержание гуанина/цитозина в диапазоне от 25,17 до 68,3%;
g) негенная последовательность расположена проксимально к генной последовательности; и,
h) область геномной последовательности в 1 млн. о., содержащая указанную негенную последовательность, содержит одну или несколько негенных последовательностей.
[0146] В одном из вариантов осуществления аналитический домен полинуклеотидной донорной кассеты содержит последовательность, которая не кодирует пептид.
[0147] В одном из вариантов осуществления аналитический домен полинуклеотидной донорной кассеты содержит последовательность, которая кодирует пептид. Чтобы экспрессировать пептид, нуклеотидные последовательности, кодирующие пептидную последовательность, типично субклонируют в экспрессирующий вектор, который содержит промотор для управления транскрипцией. Подходящие бактериальные и эукариотические промоторы хорошо известны в данной области и описаны, например, в Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual (2-е издание. 1989; 3-е издание., 2001); Kriegler, Gene Transfer and Expression: A Laboratory Manual (1990); и Current Protocols in Molecular Biology (Ausubel et al., выше.). Бактериальные экспрессирующие системы для экспрессии пептида доступны, например, у E. coli, Bacillus sp. и Salmonella (Palva et al., Gene 22:229-235 (1983)). Наборы для таких экспрессирующих систем коммерчески доступны. Эукариотические экспрессирующие системы для клеток млекопитающих, дрожжей и клеток насекомых хорошо известны специалистам в данной области и также коммерчески доступны.
[0148] В одном из вариантов осуществления полинуклеотидная донорная кассета содержит кассету экспрессии гена, которая содержит трансген. Кассета экспрессии гена типично содержит транскрипционную единицу или экспрессирующую кассету, которая содержит все дополнительные элементы, необходимые для экспрессии нуклеиновой кислоты в клетках-хозяевах, прокариотических или эукариотических. Типичная кассета экспрессии гена, таким образом, содержит промотор, функционально связанный, например, с последовательностью нуклеиновой кислоты, кодирующей белок, и сигналы, которые необходимы, например, для эффективного полиаденилирования транскрипта, терминации транскрипции, участков связывания рибосомы или терминации трансляции. Дополнительные элементы кассеты могут включать, например, энхансеры и гетерологичные сигналы сплайсинга.
[0149] В одном из вариантов осуществления кассета экспрессии гена также содержит на 3’-конце гетерологичной нуклеотидной последовательности, представляющей интерес, область терминации транскрипции и трансляции, функциональную у растений. Область терминации может быть нативной для нуклеотидной последовательности промотора из вариантов осуществления по настоящему раскрытию, может быть нативной для последовательности ДНК, представляющей интерес, или может быть получена из другого источника. Удобные области терминации доступны в плазмиде Ti из A. tumefaciens, например, области терминации октопинсинтазы и нопалинсинтазы (nos) (Depicker et al., Mol. и Appl. Genet. 1:561-573 (1982) и Shaw et al. (1984) Nucleic Acids Research, том 12, № 20 стр. 7831-7846 (nos)); см. также Guerineau et al. Mol. Gen. Genet. 262:141-144 (1991); Proudfoot, Cell 64:671-674 (1991); Sanfacon et al. Genes Dev. 5:141-149 (1991); Mogen et al. Plant cell 2:1261-1272 (1990); Munroe et al. Gene 91:151-158 (1990); Ballas et al. Nucleic Acids Res. 17:7891-7903 (1989); Joshi et al. Nucleic Acid Res. 15:9627-9639 (1987).
[0150] В других вариантах осуществления кассеты экспрессии генов могут дополнительно содержать 5’ лидерные последовательности. Такие лидерные последовательности могут действовать для того, чтобы усиливать трансляцию. Трансляционные лидерные последовательности известны в данной области и включают в качестве примера лидерные последовательности пикорнавирусов, лидерную последовательность EMCV (5’ некодирующая область вируса энцефаломиокардита), Elroy-Stein et al. Proc. Nat. Acad. Sci. USA 86:6126-6130 (1989); лидерные последовательности потивирусов, например, лидерную последовательность TEV (вирус гравировки табака) Carrington and Freed, Journal of Virology, 64:1590-1597 (1990), лидерную последовательность MDMV (вирус мозаичной карликовости кукурузы), Allison et al., Virology 154:9-20 (1986); белок, связывающий тяжелую цепь иммуноглобулина человека (BiP), Macejak et al. Nature 353:90-94 (1991); нетранслируемую лидерную последовательность из мРНК белка оболочки вируса мозаики люцерны (AMV RNA 4), Jobling et al. Nature 325:622-625 (1987); лидерную последовательность вируса табачной мозаики (TMV), Gallie et al. (1989) Molecular Biology of RNA, стр. 237-256; и лидерную последовательность вируса бледной крапчатости кукурузы (MCMV) Lommel et al. Virology 81:382-385 (1991). См. также Della-Cioppa et al. Plant Physiology 84:965-968 (1987). Конструкция также может содержать последовательности, которые усиливают трансляцию и/или стабильность мРНК, например, интроны. Примером одного такого интрона является первый интрон гена II варианта гистона H3.III из Arabidopsis thaliana. Chaubet et al. Journal of Molecular Biology, 225:569-574 (1992).
[0151] В одном из вариантов осуществления кассета экспрессии гена полинуклеотидной донорной последовательности содержит промотор. Промотор, используемый для управления экспрессией нуклеиновой кислотой, кодирующей пептид, зависит от конкретного применения. Например, сильный конститутивный промотор, подходящий для клетки-хозяина, типично используют для экспрессии и очистки белков. Неограничивающие примеры предпочтительных промоторов растений включают последовательности промоторов, полученные из убиквитина-10 (ubi-10) A. thaliana (Callis, et al., 1990, J. Biol. Chem., 265:12486-12493); маннопинсинтазы A. tumefaciens (Δmas) (Petolino et al., патент США № 6,730,824); и/или вируса мозаики прожилок маниоки (CsVMV) (Verdaguer et al., 1996, Plant Molecular Biology 31:1129-1139).
[0152] В способах, описанных в настоящем документе, можно использовать несколько промоторов, которые могут управлять экспрессией гена у растения. Такие промоторы можно выбирать из конститутивных, химически регулируемых, индуцибельных, тканеспецифических и предпочтительных промоторов для семени.
[0153] Конститутивные промоторы включают, например, 35S промотор кора вируса мозаики цветной капусты (Odell et al. (1985) Nature 313:810-812); промотор актина риса (McElroy et al. (1990) Plant cell 2:163-171); промотор убиквитина кукурузы (патент США № 5,510,474; Christensen et al. (1989) Plant Mol. Biol. 12:619-632 и Christensen et al. (1992) Plant Mol. Biol. 18:675-689); промотор pEMU (Last et al. (1991) Theor. Appl. Genet. 81:581-588); промотор ALS (патент США № 5,659,026); промотор гистона кукурузы (Chabouté et al. Plant Molecular Biology, 8:179-191 (1987)); и т.п.
[0154] Спектр доступных промоторов, совместимых с растениями, включает тканеспецифические и индуцибельные промоторы. Индуцибельным регуляторным элементом является тот, которые способен непосредственно или опосредованно активировать транскрипцию одной или нескольких последовательностей ДНК или генов в ответ на индуктор. В отсутствие индуктора не будет происходить транскрипция последовательностей ДНК или генов. Типично белковый фактор, который специфично связывается с индуцибельным регуляторным элементом для того, чтобы активировать транскрипцию, присутствует в неактивной форме, которую затем непосредственно или опосредованно превращают в активную форму с помощью индуктора. Индуктор может представлять собой химическое средство, такое как белок, метаболит, регулятор роста, гербицид или феноловое соединение, или физиологический стресс, вызванный непосредственно теплом, холодом, солью или токсичными элементами или опосредованно через действие патогена или патологического агента такого как вирус. Типично белковый фактор, который специфично связывается с индуцибельным регуляторным элементом для того, чтобы активировать транскрипцию, присутствует в неактивной форме, которую затем непосредственно или опосредованно превращают в активную форму с помощью индуктора. Индуктор может представлять собой химическое средство, такое как белок, метаболит, регулятор роста, гербицид или феноловое соединение, или физиологический стресс, вызванный непосредственно теплом, холодом, солью или токсичными элементами или опосредованно через действие патогена или патологического агента, такого как вирус. На клетку растения, которая содержит индуцибельный регуляторный элемент, можно воздействовать индуктором посредством внешнего применения индуктора к клетке или растению, например, посредством распыления, полива, нагрева или схожих способов.
[0155] Любой индуцибельный промотор можно использовать в вариантах осуществления по данному раскрытию. См. Ward et al. Plant Mol. Biol. 22: 361-366 (1993). Образцовые индуцибельные промоторы включают промоторы рецептора экдизона (патент США № 6,504,082); промоторы из системы ACE1, которая реагирует на медь (Mett et al. PNAS 90: 4567-4571 (1993)); ген In2-1 и In2-2 из кукурузы, которые реагируют на бензолсульфонамидные гербицидные антидоты (патент США № 5,364,780; Hershey et al., Mol. Gen. Genetics 227: 229-237 (1991) и Gatz et al., Mol. Gen. Genetics 243: 32-38 (1994)); репрессор Tet из Tn10 (Gatz et al., Mol. Gen. Genet. 227: 229-237 (1991); или промоторы из гена стероидного гормона, транскрипционную активность которого индуцируют глюкокортикостероидным гормоном, Schena et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 88: 10421 (1991) и McNellis et al., (1998) Plant J. 14(2):247-257; промотор GST кукурузы, который активируют гидрофобными электрофильными соединениями, которые используют в качестве предвсходовых гербицидов (см. патент США № 5,965,387 и международную патентную заявку, публикацию № WO 93/001294); и промотор PR-1a табака, который активируют салициловой кислотой (см. Ono S, Kusama M, Ogura R, Hiratsuka K., «Evaluation of the Use of the Tobacco PR-1a Promoter to Monitor Defense Gene Expression by the Luciferase Bioluminescence Reporter System», Biosci Biotechnol Biochem. 2011 Sep 23;75(9):1796-800). Другие химически регулируемые промоторы, представляющие интерес, включают тетрациклин-индуцибельные и тетрациклин-репрессируемые промоторы (см., например, Gatz et al., (1991) Mol. Gen. Genet. 227:229-237, и патенты США №№ 5,814,618 и 5,789,156).
[0156] Другие регулируемые промоторы, представляющие интерес, включают чувствительный к холоду регуляторный элемент или регуляторный элемент теплового шока, транскрипцию которого можно вызывать в ответ на воздействие холода или тепла, соответственно (Takahashi et al., Plant Physiol. 99:383-390, 1992); промотор гена алкогольдегидрогеназы (Gerlach et al., PNAS USA 79:2981-2985 (1982); Walker et al., PNAS 84(19):6624-6628 (1987)), индуцируемый анаэробными условиями; и индуцируемый светом промотор, полученный из гена rbcS гороха или гена psaDb гороха (Yamamoto et al. (1997) Plant J. 12(2):255-265); индуцируемый светом регуляторный элемент (Feinbaum et al., Mol. Gen. Genet. 226:449, 1991; Lam and Chua, Science 248:471, 1990; Matsuoka et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90(20):9586-9590; Orozco et al. (1993) Plant Mol. Bio. 23(6):1129-1138), индуцибельный регуляторный элемент растительного гормона (Yamaguchi-Shinozaki et al., Plant Mol. Biol. 15:905, 1990; Kares et al., Plant Mol. Biol. 15:225, 1990) и т.п. Индуцибельный регуляторный элемент также может представлять собой промотор гена In2-1 или In2-2 кукурузы, который реагирует на бензолсульфонамидные гербицидные антидоты (Hershey et al., Mol. Gen. Gene. 227:229-237, 1991; Gatz et al., Mol. Gen. Genet. 243:32-38, 1994), и репрессор Tet транспозона Tn10 (Gatz et al., Mol. Gen. Genet. 227:229-237, 1991). Индуцируемые стрессом промоторы включают индуцируемые солевым/водным стрессом промоторы, такие как P5CS (Zang et al. (1997) Plant Sciences 129:81-89); индуцируемые холодом промоторы, такие как cor15a (Hajela et al. (1990) Plant Physiol. 93:1246-1252), cor15b (Wilhelm et al. (1993) Plant Mol Biol 23:1073-1077), wsc120 (Ouellet et al. (1998) FEBS Lett. 423-324-328), ci7 (Kirch et al. (1997) Plant Mol Biol. 33:897-909), ci21A (Schneider et al. (1997) Plant Physiol. 113:335-45); индуцируемые засухой промоторы, такие как Trg-31 (Chaudhary et al (1996) Plant Mol. Biol. 30:1247-57), rd29 (Kasuga et al. (1999) Nature Biotechnology 18:287-291); индуцируемые осмосом промоторы, такие как Rab17 (Vilardell et al. (1991) Plant Mol. Biol. 17:985-93) и осмотин (Raghothama et al. (1993) Plant Mol Biol 23:1117-28); и индуцируемые теплом промоторы, такие как белки теплового шока (Barros et al. (1992) Plant Mol. 19:665-75; Marrs et al. (1993) Dev. Genet. 14:27-41), smHSP (Waters et al. (1996) J. Experimental Botany 47:325-338) и индуцируемый теплом элемент из промотора убиквитина петрушки (WO 03/102198). Другие индуцируемые стрессом промоторы включают rip2 (патент США № 5,332,808 и публикация США № 2003/0217393) и rd29a (Yamaguchi-Shinozaki et al. (1993) Mol. Gen. Genetics 236:331-340). Определенные промоторы можно индуцировать ранением, в том числе промотор pMAS агробактерий (Guevara-Garcia et al. (1993) Plant J. 4(3):495-505) и промотор ORF13 агробактерий (Hansen et al., (1997) Mol. Gen. Genet. 254(3):337-343).
[0157] Предпочтительные промоторы для ткани можно использовать для направленного увеличения транскрипции и/или экспрессии в конкретной ткани растения. При упоминании о предпочтительной экспрессии подразумевают экспрессию на более высоком уровне в конкретной ткани растения, чем в другой ткани растения. Примеры промоторов этих типов включают предпочтительную экспрессию в семени, такую как та, которую обеспечивает промотор фазеолина (Bustos et al.1989. Plant cell, том 1, 839-853), и ген глобулина-1 кукурузы, Belanger, et al. 1991 Genetics 129:863-972. Для двусеменодольных предпочтительные семенные промоторы включают, но не ограничиваясь этим, β-фазеолин фасоли, напин, β-конглицинин, лектин соевых бобов, круциферин и т.п. Для односеменодольных предпочтительные семенные промоторы включают, но не ограничиваясь этим, 15 кДа зеин, 22 кДа зеин, 27 кДа зеин, γ-зеин, waxy, shrunken 1, shrunken 2, глобулин 1 кукурузы и т.д. Предпочтительные семенные промоторы также включают те промоторы, которые направляют экспрессию гена преимущественно в конкретных тканях в семени, например, таких как предпочтительный промотор эндосперма из γ-зеина, криптический промотор из табака (Fobert et al. 1994. T-DNA tagging of a seed coat-specific cryptic promoter in tobacco. Plant J. 4: 567-577), промотор гена P из кукурузы (Chopra et al. 1996. Alleles of the maize P gene with distinct tissue specificities encode Myb-homologous proteins with C-terminal replacements. Plant Cell 7:1149-1158, список опечаток в Plant Cell. 1997, 1:109), промотор глобулина-1 из кукурузы (Belenger and Kriz. 1991. Molecular basis for Allelic Polymorphism of the maize Globulin-1 gene. Genetics 129: 863-972), и промоторы, которые управляют экспрессией в семенной оболочке или кожице зерен кукурузы, например, промотор глутаминсинтетазы со специфичностью к перикарпию (Muhitch et al., 2002. Isolation of a Promoter Sequence From the Glutamine Synthetase1-2 Gene Capable of Conferring Tissue-Specific Gene Expression in Transgenic Maize. Plant Science 163:865-872).
[0158] Кассета экспрессии гена может содержать 5’ лидерную последовательность. Такие лидерные последовательности могут действовать для усиления трансляции. Трансляционные лидерные последовательности известны в данной области и включают в качестве примера лидерные последовательности пикорнавирусов, лидерную последовательность EMCV (5’ некодирующая область вируса энцефаломиокардита), Elroy-Stein et al. Proc. Nat. Acad. Sci. USA 86:6126-6130 (1989); лидерные последовательности потивируса, например, лидерную последовательность TEV (вирус гравировки табака) Carrington and Freed, Journal of Virology, 64:1590-1597 (1990), лидерную последовательность MDMV (вирус мозаичной карликовости кукурузы), Allison et al., Virology 154:9-20 (1986); белок, связывающий тяжелую цепь иммуноглобулина человека (BiP), Macejak et al. Nature 353:90-94 (1991); нетранслируемую лидерную последовательность из белка оболочки мРНК вируса мозаики люцерны (AMV RNA 4), Jobling et al. Nature 325:622-625 (1987); лидерную последовательность вируса табачной мозаики (TMV), Gallie et al. (1989) Molecular Biology of RNA, стр. 237-256; и лидерную последовательность вируса бледной крапчатости кукурузы (MCMV) Lommel et al. Virology 81:382-385 (1991). См. также Della-Cioppa et al. Plant Physiology 84:965-968 (1987).
[0001] Конструкция также может содержать последовательности, которые усиливают трансляцию и/или стабильность мРНК, например, интроны. Примером одного такого интрона является первый интрон гена II варианта гистона H3.III из Arabidopsis thaliana. Chaubet et al. Journal of Molecular Biology, 225:569-574 (1992).
[0002] В тех случаях, когда желательно иметь экспрессированный продукт гетерологичной нуклеотидной последовательности, направленный в конкретную органеллу, в частности, пластид, амилопласт или эндоплазматический ретикулум, или секретированный на поверхности клетки или внеклеточно, экспрессирующая кассета дополнительно может содержать кодирующую последовательность для транзитного пептида. Такие транзитные пептиды хорошо известны в данной области и включают, но не ограничиваясь этим, транзитный пептид ацилового белка-переносчика, малую субъединицу из RUBISCO, EPSP синтазу растений и Helianthus annuus (см. Lebrun et al., патент США 5,510,417), транзитный пептид хлоропласта Brittle-1 из Zea mays (Nelson et al. Plant Physiol 117(4):1235-1252 (1998); Sullivan et al. Plant cell 3(12):1337-48; Sullivan et al., Planta (1995) 196(3):477-84; Sullivan et al., J. Biol. Chem. (1992) 267(26):18999-9004) и т.п. Кроме того, химерные транзитные пептиды хлоропластов известны в данной области, такие как оптимизированный транзитный пептид (см., патент США № 5,510,471). Дополнительные транзитные пептиды хлоропластов описаны ранее в патентах США №№ 5,717,084; 5,728,925. Специалист в данной области без труда примет во внимание многие возможности, доступные при экспрессировании продукта в конкретной органелле. Например, последовательность α-амилазы ячменя часто используют для того, чтобы управлять экспрессией в эндоплазматическом ретикулуме. Rogers, J. Biol. Chem. 260:3731-3738 (1985).
[0159] В одном из вариантов осуществления полинуклеотидная донорная кассета содержит трансген. Некоторые варианты осуществления в настоящем документе предусматривают трансген, который кодирует полипептид, содержащий кассету экспрессии гена. Такой трансген можно использовать в любом из широкого спектра применений для того, чтобы получать трансгенные растения. Конкретные примеры кассеты экспрессии гена, содержащей трансген, приведены в настоящем документе в иллюстративных целях и включают экспрессию гена, содержащего ген признака, ген RNAi или репортерный ген/ген селективного маркера.
[0160] При конструировании гена для экспрессии у растений, предпочтение кодонов предполагаемого растения-хозяина можно определять, например, через использование общедоступных баз данных о последовательностях ДНК, чтобы находить информацию относительно распределения кодонов в геномах растений или кодирующих белки областях в различных генах растений. После разработки оптимизированной (например, оптимизированной к определенному растению) ДНК последовательности на бумаге или in silico, фактические молекулы ДНК можно синтезировать в лаборатории так, чтобы последовательность точно соответствовали разработанной последовательности. Такие синтетические молекулы нуклеиновой кислоты можно клонировать и иным образом манипулировать с ними точно так же, как если бы они были получены из природных или нативных источников.
[0161] В одном из вариантов осуществления трансген, подлежащий экспрессии, раскрыт в данной заявке. Кассета экспрессии гена может содержать репортерный ген/ген селективного маркера, ген признака или ген RNAi. Примеры гена селективного маркера, гена признака и гена RNAi дополнительно предоставлены далее. Способы, раскрытые в настоящей заявке, благоприятны в том отношении, что они предоставляют способ отбора трансформантов зародышевой линии, который не зависит от конкретной функции белкового продукта или другой функции трансгена.
[0162] Трансгены или кодирующие последовательности, которые придают устойчивость к вредителям или заболеваниям
(A) Гены устойчивости к заболеваниям растений. Активация защиты растения часто происходит посредством специфичного взаимодействия между продуктом гена устойчивости к заболеванию (R) у растения и продуктом соответствующего гена невирулентности (Avr) у патогена. Различные растения можно трансформировать клонированным геном устойчивости для того, чтобы конструировать растения, которые устойчивы к конкретным патогенным штаммам. Примеры таких генов включают ген Cf-9 томата для устойчивости к Cladosporium fulvum (Jones et al., 1994 Science 266:789), ген Pto томата, который кодирует протеинкиназу, для устойчивости к Pseudomonas syringae pv. tomato (Martin et al., 1993 Science 262:1432), и ген RSSP2 Arabidopsis для устойчивости к Pseudomonas syringae (Mindrinos et al., 1994 Cell 78:1089).
(B) Белок Bacillus thuringiensis, его производное или синтетический полипептид, смоделированный из него, например, нуклеотидная последовательность гена Bt δ-эндотоксина (Geiser et al., 1986, Gene 48:109), и вегетативный инсектицидный (VIP) ген (см., например, Estruch et al. (1996) Proc. Natl. Acad. Sci. 93:5389-94). Кроме того, молекулы ДНК, кодирующие гены δ-эндотоксина, можно приобретать в American Type Culture Collection (Rockville, Md.), под номерами доступа ATCC 40098, 67136, 31995 и 31998.
(C) Лектин, например, нуклеотидные последовательности нескольких генов маннозу-связывающих лектинов Clivia miniata (Van Damme et al., 1994 Plant Molec. Biol. 24:825).
(D) Витамин-связывающий белок, такой как авидин и гомологи авидина, которые можно использовать в качестве ларвицидов против насекомых вредителей. См. патент США № 5,659,026.
(E) Ферментативный ингибитор, например, ингибитор протеазы или ингибитор амилазы. Примеры таких генов включают ингибитор цистеинпротеиназы риса (Abe et al., 1987 J. Biol. Chem. 262:16793), ингибитор I протеиназы табака (Huub et al., 1993 Plant Molec. Biol. 21:985) и ингибитор α-амилазы (Sumitani et al., 1993 Biosci. Biotech. Biochem. 57:1243).
(F) Специфичный для насекомых гормон или феромон, такой как экдистероид и ювенильный гормон его вариант, миметик на его основе или его антагонист или агонист, например, бакуловирусная экспрессия клонированного ювенильного гормона эстеразы, инактиватор ювенильного гормона (Hammock et al., 1990 Nature 344:458).
(G) Специфичный для насекомых пептид или нейропептид, который, при экспрессии, нарушает физиологию пораженного вредителя (J. Biol. Chem. 269:9). Примеры таких генов включают рецептор диуретического гормона насекомых (Regan, 1994), аллостатин, идентифицированный у Diploptera punctata (Pratt, 1989), и специфичные для насекомых паралитические нейротоксины (патент США № 5,266,361).
(H) Специфичный для насекомых яд, образуемый в природе змеей, осой и т.д., такой как инсектотоксичный пептид скорпиона (Pang, 1992, Gene 116:165).
(I) Фермент, отвечающий за гипернакопление монотерпена, сесквитерпена, стероида, гидроксамовой кислоты, производного фенилпропаноида или другой небелковой молекулы с инсектицидной активностью.
(J) Фермент, участвующий в модификации, в том числе посттрансляционной модификации, биологически активной молекулы; например, гликолитического фермента, протеолитического фермента, липолитического фермента, нуклеазы, циклазы, трансаминазы, эстеразы, гидролазы, фосфатазы, киназы, фосфорилазы, полимеразы, эластазы, хитиназы и глюканазы, природной или синтетической. Примеры таких генов включают ген callas (опубликованная заявка PCT WO93/02197), кодирующие хитиназу последовательности (которые можно получать, например, из ATCC под номерами доступа 3999637 и 67152), хитиназу анкилостомы табака (Kramer et al., 1993 Insect Molec. Biol. 23:691) и ген полиубиквитина ubi4-2 петрушки (Kawalleck et al., 1993 Plant Molec. Biol. 21:673).
(K) Молекула, которая стимулирует сигнальную трансдукцию. Примеры таких молекул включают нуклеотидные последовательности для клонов кДНК кальмодулина золотистой фасоли (Botella et al., 1994 Plant Molec. Biol. 24:757) и нуклеотидную последовательность клона кДНК кальмодулина кукурузы (Griess et al., 1994 Plant Physiol. 104:1467).
(L) Пептид с гидрофобным моментом. См. патенты США №№ 5,659,026 и 5,607,914; последний повествует о синтетических противомикробных пептидах, которые придают устойчивость к заболеваниям.
(M) Мембранная пермеаза, формирователь каналов или блокатор каналов, такой как литический пептидный аналог цекропина-β (Jaynes et al., 1993 Plant Sci. 89:43), который делает трансгенные растения табака устойчивыми к Pseudomonas solanacearum.
(N) Вирусный инвазивный белок или комплексный токсин, полученный из него. Например, накопление белков вирусной оболочки в трансформированных клетках растений придает устойчивость к вирусной инфекции и/или развитию заболевания, вызываемого вирусом, из которого извлекают ген белка оболочки, а также родственными вирусами. Трансформированным растениям придавали опосредованную белками оболочки устойчивость к вирусу мозаики люцерны, вирусу мозаики огурца, вирусу полосы табака, вирусу X картофеля, вирусу Y картофеля, вирусу гравировки табака, вирусу погремковости табака и вирусу табачной мозаики. См., например, Beachy et al. (1990) Ann. Rev. Phytopathol. 28:451.
(O) Специфичное для насекомых антитело или полученный из него иммунотоксин. Таким образом, антитело, направленное на критическую метаболическую функцию в кишечнике насекомого, будет инактивировать пораженный фермент, убивая насекомое. Например, Taylor et al. (1994) Abstract #497, Seventh Int’l. Symposium on Molecular Plant-Microbe Interactions shows enzymatic inactivation in transgenic tobacco via production of single-chain antibody fragments.
(P) Специфичное к вирусу антитело. См., например, Tavladoraki et al. (1993) Nature 266:469, которые показали, что трансгенные растения, экспрессирующие гены рекомбинантных антител, защищены от вирусной атаки.
(Q) Тормозящий развитие белок, образуемый в природе патогеном или паразитом. Таким образом, грибковые эндо-α-1,4-D полигалактуроназы содействуют грибковой колонизации и высвобождению питательных веществ растения посредством растворения гомо-α-1,4-D-галактуроназы клеточной стенки растения (Lamb et al., 1992) Bio/Technology 10:1436. Клонирование и определение характеристик гена, который кодирует ингибирующий эндополигалактуроназу белок фасоли, описано у Toubart et al. (1992 Plant J. 2:367).
(R) Тормозящий развитие белок, образуемый в природе растением, такой как инактивирующий рибосому ген ячменя, который обеспечивает повышенную устойчивость к заболеванию грибком (Longemann et al., 1992). Bio/Technology 10:3305.
(S) РНК-интерференция, при которой молекулу РНК используют для того, чтобы ингибировать экспрессию целевого гена. Молекула РНК в одном из примеров является частично или полностью двухцепочечной, что запускает сайленсинг-реакцию, что ведет к расщеплению дцРНК на малые интерферирующие РНК, которые затем встраиваются в направляющий комплекс, который разрушает гомологичную мРНК. См., например, Fire et al., патент США 6,506,559; Graham et al.6,573,099.
[0163] Гены, которые придают устойчивость к гербицидам
(A) Гены, кодирующие устойчивость или переносимость гербицидов, которые ингибируют точку роста или меристему, таких как гербициды имидазалинон, сульфонанилид или сульфонилмочевина. Образцовые гены в этой категории кодируют мутантный фермент ALS (Lee et al., 1988 EMBOJ. 7:1241), который также известен как фермент AHAS (Miki et al., 1990 Theor. Appl. Genet. 80:449).
(B) Один или несколько дополнительных генов, кодирующих устойчивость или переносимость глифосата, придаваемую мутантной синтазой EPSP и генами aroA, или через метаболическую инактивацию с помощью таких генов, как GAT (глифосатацетилтрансфераза) или GOX (глифосатоксидаза), и других фосфоно-соединений, таких как глюфосинат (гены pat и bar; DSM-2), и арилоксифеноксипропановых кислот и циклогександионов (гены, кодирующие ингибиторы ацетил-КоА карбоксилазы). См., например, патент США № 4,940,835, в котором раскрыта нуклеотидная последовательность формы EPSP, которая может придавать устойчивость к глифосату. Молекулу ДНК, кодирующую мутантный ген aroA, можно получать по померу доступа ATCC 39256, а нуклеотидная последовательность мутантного гена раскрыта в патенте США № 4,769,061. В европейской патентной заявке № 0 333 033 и патенте США № 4,975,374 раскрыты нуклеотидные последовательности генов глутаминсинтетаз, которые придают устойчивость к гербицидам, таким как L-фосфинотрицин. Нуклеотидная последовательность гена фосфинотрицинацетил-трансферазы предоставлена в европейской заявке № 0 242 246. De Greef et al. (1989) Bio/Technology 7:61 описывают получение трансгенных растений, которые экспрессируют химерные гены bar, кодирующие фосфинотрицинацетилтрансферазную активность. Образцовые гены, придающие устойчивость к арилоксифеноксипропановым кислотам и циклогександионам, таким как сетоксидим и галоксифоп, представляют собой гены Accl-S1, Accl-S2 и Accl-S3, описанные Marshall et al. (1992) Theor. Appl. Genet. 83:435.
(C) Гены, кодирующие устойчивость или переносимость гербицида, который ингибирует фотосинтез, такого как триазин (гены psbA и gs+) и бензонитрил (ген нитрилазы). Przibilla et al. (1991) Plant cell 3:169 описывают использование плазмид, кодирующих мутантные гены psbA, для трансформации Chlamydomonas. Нуклеотидные последовательности для генов нитрилаз раскрыты в патенте США № 4,810,648, а молекулы ДНК, содержащие эти гены, доступны по номерам доступа ATCC 53435, 67441 и 67442. Клонирование и экспрессия ДНК, кодирующей глутатион S-трансферазы, описано у Hayes et al. (1992) Biochem. J. 285:173.
(D) Гены, кодирующие устойчивость или переносимость гербицида, который связывается с гидроксифенилпируватдиоксигеназамиами (HPPD), ферментами, которые катализируют реакцию, в которой п-гидроксифенилпируват (HPP) превращают в гомогентисат. Это включает такие гербициды, как изоксазолы (EP418175, EP470856, EP487352, EP527036, EP560482, EP682659, патент США № 5,424,276), в частности изоксафлутол, который представляет собой селективный гербицид для кукурузы, дикетонитрилы (EP496630, EP496631), в частности 2-циано-3-циклопропил-1-(2-SO2CH3-4-CF3 фенил)пропан-1,3-дион и 2-циано-3-циклопропил-1-(2-SO2CH3-4-2,3Cl2фенил)пропан-1,3-дион, трикетоны (EP625505, EP625508, патент США № 5,506,195), в частности сулкотрион, и пиразолинаты. Ген, который создает чрезмерное относительное содержание HPPD в растениях, может обеспечивать переносимость или устойчивость к таким гербицидам, в том числе, например, гены, описанные в патентах США №№ 6,268,549 и 6,245,968 и публикации патентной заявки США № 20030066102.
(E) Гены, кодирующие устойчивость или переносимость феноксиауксиновых гербицидов, таких как 2,4-дихлорфеноксиуксусная кислота (2,4-D), и которые также могут придавать устойчивость или переносимость арилоксифеноксипропионатных (AOPP) гербицидов. Примеры таких генов включают ген фермента α-кетоглутарат-зависимая диоксигеназа (aad-1), описанный в патенте США № 7,838,733.
(F) Гены, кодирующие устойчивость или переносимость феноксиауксиновых гербицидов, таких как 2,4-дихлорфеноксиуксусная кислота (2,4-D), и которые также могут придавать устойчивость или переносимость пиридилоксиауксиновых гербицидов, таких как флуроксипир или триклопир. Примеры таких генов включают ген фермента α-кетоглутарат-зависимая диоксигеназа (aad-12), описанный в WO 2007/053482 A2.
(G) Гены, кодирующие устойчивость или переносимость дикамбы (см., например, публикацию патента США № 20030135879).
(H) Гены, обеспечивающие устойчивость или переносимость гербицидов, которые ингибируют фотопорфириногеноксидазу (PPO) (см. патент США № 5,767,373).
(I) Гены, обеспечивающие устойчивость или переносимость триазиновых гербицидов (таких как атразин) и гербицидных производных мочевины (таких как диурон), которые связываются с ядерными белками реакционных центров фотосистемы II (PS II) (см. Brussian et al., (1989) EMBO J. 1989, 8(4): 1237-1245.
[0164] Гены, которые придают признак добавленной стоимости или вносят вклад в него
(A) Модифицированный метаболизм жирных кислот, например, посредством трансформации кукурузы или капусты антисмысловым геном или десатуразы стеароил-ацилпереносящего белка, чтобы увеличивать содержание стеариновой кислоты в растении (Knultzon et al., 1992) Proc. Nat. Acad. Sci. USA 89:2624.
(B) Сниженное содержание фитата
(1) Введение гена, кодирующего фитазу, такого как ген фитазы Aspergillus niger (Van Hartingsveldt et al., 1993, Gene 127:87), усиливает расщепление фитата, добавляя больше свободного фосфата в трансформированное растение.
(2) Можно вводить ген, который снижает содержание фитата. У кукурузы это можно выполнять, например, посредством клонирования и последующего повторного введения ДНК, ассоциированной с одним аллелем, который отвечает за мутанты кукурузы, отличающиеся низкими уровнями фитиновой кислоты (Raboy et al., 1990 Maydica 35:383).
(C) Модифицированная композиция углеводов, которую получают, например, посредством трансформации растений геном, кодирующим фермент, который изменяет паттерн ветвления крахмала. Примеры таких ферментов включают ген фруктозилтрансферазы Streptococcus mucus (Shiroza et al., 1988) J. Bacteriol. 170:810, ген левансахаразы Bacillus subtilis (Steinmetz et al., 1985 Mol. Gen. Genel. 200:220), α-амилазу Bacillus licheniformis (Pen et al., 1992 Bio/Technology 10:292), гены инвертазы томата (Elliot et al., 1993), ген амилазы ячменя (Sogaard et al., 1993 J. Biol. Chem. 268:22480) и крахмал-ветвящий фермент II эндосперма кукурузы (Fisher et al., 1993 Plant Physiol. 102:10450).
[0165] В следующем варианте осуществления трансген содержит репортерный ген. В различных вариантах осуществления репортерный ген выбирают из группы, состоящей из гена yfp, гена gus, гена rfp, гена gfp, гена устойчивости к канамицину, гена aad-1, гена aad-12, гена pat и гена устойчивости к глифосату. Репортерные или маркерные гены для отбора трансформированных клеток или тканей или частей растения или растении можно включать в трансформирующие векторы. Примеры селективных маркеров включают те, которые придают устойчивость к антиметаболитам, таким как гербициды или антибиотики, например, дигидрофолатредуктазу, которая придает устойчивость к метотрексату (Reiss, Plant Physiol. (Life Sci. Adv.) 13:143-149, 1994; см. также Herrera Estrella et al., Nature 303:209-213, 1983; Meijer et al., Plant Mol. Biol. 16:807-820, 1991); неомицинфосфотрансферазу, которая придает устойчивость к аминогликозиду неомицину, канамицину и паромицину (Herrera-Estrella, EMBO J. 2:987-995, 1983 и Fraley et al. Proc. Natl. Acad. Sci USA 80:4803 (1983)); гигромицинфосфотрансферазу, которая придает устойчивость к гигромицину (Marsh, Gene 32:481-485, 1984; см. также Waldron et al., Plant Mol. Biol. 5:103-108, 1985; Zhijian et al., Plant Science 108:219-227, 1995); trpB, который позволяет клеткам использовать индол вместо триптофана; hisD, который позволяет клеткам использовать гистинол вместо гистидина (Hartman, Proc. Natl. Acad. Sci., USA 85:8047, 1988); манноза-6-фосфатизомеразу, которая позволяет клеткам использовать маннозу (WO 94/20627); орнитиндекарбоксилазу, которая придает устойчивость к ингибитору орнитиндекарбоксилазы, 2(дифторметил)-DL-орнитину (DFMO; McConlogue, 1987, в: Current Communications in Molecular Biology, Cold Spring Harbor Laboratory ed.); и дезаминазу из Aspergillus terreus, которая придает устойчивость к бластицидину S (Tamura, Biosci. Biotechnol. Biochem. 59:2336-2338, 1995).
[0166] Дополнительные селективные маркеры включают, например, мутантную ацетолактатсинтазу, которая придает устойчивость к имидазолинону или сульфонилмочевине (Lee et al., EMBO J. 7:1241-1248, 1988), мутантный psbA, который придает устойчивость к атразину (Smeda et al., Plant Physiol. 103:911-917, 1993), или a мутантную протопорфириногеноксидазу (см. патент США № 5,767,373) или другие маркеры, придающие устойчивость к гербициду, такому как глюфосинат. Примеры подходящих генов селективных маркеров включают, но не ограничиваясь этим, гены, кодирующие устойчивость к хлорамфениколу (Herrera Estrella et al., EMBO J. 2:987-992, 1983); стрептомицину (Jones et al., Mol. Gen. Genet. 210:86-91, 1987); спектиномицину (Bretagne-Sagnard et al., Transgenic Res. 5:131-137, 1996); блеомицину (Hille et al., Plant Mol. Biol. 7:171-176, 1990); сульфонамиду (Guerineau et al., Plant Mol. Biol. 15:127-136, 1990); бромоксинилу (Stalker et al., Science 242:419-423, 1988); глифосату (Shaw et al., Science 233:478-481, 1986); фосфинотрицину (DeBlock et al., EMBO J. 6:2513-2518, 1987) и т.п.
[0167] Одна возможность использования селективного гена представляет собой ДНК, кодирующую устойчивость к глюфосинату, и в одном из вариантов осуществления может представлять собой фосфинотрицинацетилтрансферазу (pat), оптимизированный для кукурузы ген pat или ген bar под управлением промотора вируса мозаики прожилок маниоки. Эти гены придают устойчивость к биалафосу. См. Wohlleben et al., (1988) Gene 70: 25-37); Gordon-Kamm et al., Plant cell 2:603; 1990; Uchimiya et al., BioTechnology 11:835, 1993; White et al., Nucl. Acids Res. 18:1062, 1990; Spencer et al., Theor. Appl. Genet. 79:625-631, 1990; и Anzai et al., Mol. Gen. Gen. 219:492, 1989). Версия гена pat представляет собой оптимизированный для кукурузы ген pat, описанный в патенте США № 6,096,947.
[0168] Кроме того, можно использовать маркеры, которые облегчают идентификацию клетки растения, содержащей полинуклеотид, кодирующий маркер. Можно использовать маркеры, поддающиеся оценке или скринингу, где присутствие последовательности создает поддающийся измерению продукт и может создавать продукт без разрушения клетки растения. Примеры включают β-глюкуронидазу или ген uidA (GUS), который кодирует фермент, для которого известны различные хромогенные субстраты (например, патенты США 5,268,463 и 5,599,670); хлорамфениколацетилтрансферазу (Jefferson et al. The EMBO Journal, том 6, № 13, стр. 3901-3907); и щелочную фосфатазу. В предпочтительном варианте осуществления используемый маркер представляет собой β-каротин или провитамин A (Ye et al, Science 287:303-305 (2000)). Ген использовали для того, чтобы улучшать питание риса, но в этом случае его используют взамен маркера, поддающегося скринингу, и присутствие гена, связанного с геном, представляющим интерес, обнаруживают посредством обеспечения золотой окраски. в отличие от ситуации, где ген используют за его питательный вклад в растение, меньшее количество белка является достаточным для маркерных целей. Другие поддающиеся скринингу маркеры в целом включают гены антоцианина/флавоноидов (см. обсуждение у Taylor and Briggs, Plant cell (1990)2:115-127), в том числе, например, среди прочих, ген R-локуса, который кодирует продукт, который регулирует образование антоцианиновых пигментов (красная окраска) в тканях растений (Dellaporta et al., in Chromosome Structure and Function, Kluwer Academic Publishers, Appels and Gustafson eds., стр. 263-282 (1988)); гены, которые управляют биосинтезов флавоноидных пигментов, такие как ген C1 кукурузы (Kao et al., Plant cell (1996) 8: 1171-1179; Scheffler et al. Mol. Gen. Genet. (1994) 242:40-48) и ген C2 кукурузы (Wienand et al., Mol. Gen. Genet. (1986) 203:202-207); ген B (Chandler et al., Plant cell (1989) 1:1175-1183), ген p1 (Grotewold et al, Proc. Natl. Acad. Sci USA (1991) 88:4587-4591; Grotewold et al., Cell (1994) 76:543-553; Sidorenko et al., Plant Mol. Biol. (1999)39:11-19); гены локуса bronze (Ralston et al., Genetics (1988) 119:185-197; Nash et al., Plant cell (1990) 2(11): 1039-1049).
[0169] Дополнительные примеры подходящих маркеров включают ген голубого флуоресцентного белка (CYP) (Bolte et al. (2004) J. Cell Science 117: 943-54 и Kato et al. (2002) Plant Physiol 129: 913-42), ген желтого флуоресцентного белка (PHIYFPTM из Evrogen; см. Bolte et al. (2004) J. Cell Science 117: 943-54); ген lux, который кодирует люциферазу, присутствие которой можно обнаруживать, например, с использованием рентгеновской пленки, подсчета сцинтилляции, флуоресцентной спектрофотометрии, видеокамеры с высокой светочувствительностью, камер счета фотонов или многолуночной люминометрии (Teeri et al. (1989) EMBO J. 8:343); ген зеленого флуоресцентного белка (GFP) (Sheen et al., Plant J. (1995) 8(5):777-84); и DsRed2, где клетки растений, трансформированных маркерным геном, имеют красный цвет, и таким образом доступны для визуального отбора (Dietrich et al. (2002) Biomethods 2(2):286-293). Дополнительные примеры включают ген β-лактамазы (Sutcliffe, Proc. Nat’l. Acad. Sci. U.S.A. (1978) 75:3737), который кодирует фермент, для которого известны различные хромогенные субстраты (например, PADAC, хромогенный цефалоспорин); ген xylE (Zukowsky et al., Proc. Nat’l. Acad. Sci. U.S.A. (1983) 80:1101), который кодирует катехолдиоксигеназу, которая может преобразовывать хромогенные катехолы; ген α-амилазы (Ikuta et al., Biotech. (1990) 8:241); и ген тирозиназы (Katz et al., J. Gen. Microbiol. (1983) 129:2703), который кодирует фермент, способный окислять тирозин до DOPA и допахинона, который в свою очередь конденсируется с образованием легко поддающегося обнаружению соединения меланина. Ясно, что многие такие маркеры доступны и известны специалисту в данной области.
[0170] В следующем варианте осуществления аналитический домен полинуклеотидного донора содержит SEQ ID NO: 142 или SEQ ID NO: 143. Модификации и производные SEQ ID NO: 142 или SEQ ID NO: 143 рассматривают в сфере применения рассматриваемого раскрытия. Такие модификации и производные SEQ ID NO: 142 или SEQ ID NO: 143 могут вести к последовательностям, которые имеют конкретные уровни идентичности последовательностей. В различных вариантах осуществления, последовательности с модификациями 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10 п.о. относительно SEQ ID NO: 142 описаны в настоящем документе. В других вариантах осуществления последовательности с модификациями 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10 п.о. относительно SEQ ID NO: 143 описаны в настоящем документе.
[0171] В других вариантах осуществления плазмидный домен универсальной полинуклеотидной донорной кассеты содержит плазмидные последовательности. Плазмиду или вектор можно описывать или обозначать как прокариотические векторы, челночные векторы, векторы насекомых или эукариотические векторы. Типично, плазмиды представляют собой внехромосомные элементы, часто круглую ДНК, которые состоят из участка начала репликации и гена селективного маркера. Иногда может быть предпочтительно иметь плазмиду, которая функциональна в E. coli (например, анализ последовательности ДНК, конструкция вставок, получение определенных количеств нуклеиновых кислот). Конкретную плазмиду, используемую для универсального полинуклеотидного донора, можно выбирать с учетом предполагаемого использования (например, экспрессия у растений, животных, бактерий, грибов или простейших). Стандартные экспрессирующие плазмиды для бактерий и животных известны в данной области и описаны подробно, например, в публикации патента США 20050064474A1 и публикациях международных патентов WO 05/084190, WO05/014791 и WO03/080809.
[0172] В других вариантах осуществления плазмидный домен полинуклеотидной донорной кассеты содержит последовательности плазмиды pUC19. pUC19 представляет собой небольшое кольцо двухцепочечной ДНК. Плазмида содержит высококопийный участок начала репликации, который допускает бактериальную репликацию и содержит множество сайтов клонирования. См. Yanisch-Perron, C., Vieira, J. and Messing, J. (1985). Gene. 33, 103-119. В данной области известны и широко используются другие плазмиды. Например, pUC18, pBR322, pBR325, pBR328, pACYC184, pAT153, pUC118 и pUC119 представляют собой плазмиды, которые общеизвестны в данной области.
[0173] В других вариантах осуществления плазмидный домен полинуклеотидной донорной кассеты содержит высококопийный участок начала репликации. Следующие варианты осуществления высококопийных участков начала репликации включают участок начала репликации cole1. Термин «участок начала репликации» или «ORI», как используют в настоящем документе, предназначен для того, чтобы охватывать области нуклеотидов, которые необходимы для репликации плазмиды. Некоторые примеры участков начала репликации: нуклеотиды 1766-3148 в pBR322; нуклеотиды 1667-2892 в ColE1; и нуклеотиды 580-1407 в pACC184. В одном из вариантов осуществления плазмидный домен полинуклеотидной донорной кассеты может содержать два или более различных участка начала репликации.
[0174] В определенных вариантах осуществления плазмидный домен содержит селективный маркер. В следующих вариантах осуществления плазмидного домена селективные маркеры выбирают из группы, состоящей из канамицинового селективного маркера, ампициллинового селективного маркера, спектиномицинового селективного маркера, хлорамфениколового селективного маркера и рифампицинового селективного маркера. Подходящие селективные маркеры представляют собой гены устойчивости к антибиотикам. Другие селективные маркеры могут включать маркерные гены, поддающиеся оценке, например β-глюкуронидазу (GUS) (Kononov, et al., Plant J. 11, 945-957, 1997), могут обеспечивать средство обнаружения присутствия остова ДНК, но не предоставлять средство отбора клеток, которые содержат их, и анализ является разрушительным для ткани. В остове ДНК также можно использовать гены негативных селективных маркеров, которые являются условно-летальными. Репрезентативные примеры других условно-летальных продуктов генов включают: гуанинфосфорибозилтрансферазу E. coli, которая превращает тиоксантин в токсичный тиоксантинмонофосфат (Besnard et al., Mol. Cell. Biol. 7:4139-4141, 1987); щелочную фосфатазу, которая превращает неактивные фосфорилированные соединения, такие как митомицин-фосфат и доксорубицин-фосфат, в токсичные дефосфорилированные соединения; грибковую (например, Fusarium oxysporum) или бактериальную цитозиндезаминазу (codA), которая превращает 5-фторцитозин в токсичное соединение 5-фторурацил (Mullen, PNAS 89:33, 1992); карбоксипептидазу G2, которая отщепляет глутаминовую кислоту от п-N-бис(2-хлорэтил)аминобензоилглутаминовой кислоты, тем самым создавая токсичный иприт бензойной кислоты; и амидазу пенициллина-V, которая превращает феноксиацетамидные производные доксорубицина и мелфалана в токсичные соединения (в целом см. Vrudhula et al., J. of Med. Chem. 36(7):919-923, 1993; Kern et al., Canc. Immun. Immunother. 31(4):202-206, 1990); и гидролазу сложных фосфонатмоноэфиров, pehA (патент США № 5,254,801). Однако следует добавлять экзогенные субстраты, чтобы предоставлять токсичный продукт, который летален для клетки, содержащей остов ДНК. Настоящее изобретение не требует добавления дополнительных субстратов в среды для культивирования или экзогенной обработки культуры клеток растения субстратом, который необходим для условно-летального продукта гена.
[0175] В другом варианте осуществления по настоящему раскрытию раскрыт способ направленного встраивания универсальной полинуклеотидной донорной кассеты в геном клетки растения. В определенных вариантах осуществления экспрессируют сайт-специфическую ДНК-связывающую нуклеазу, содержащую по меньшей мере один ДНК-связывающий домен и по меньшей мере один домен нуклеазы, в которой по меньшей мере один ДНК-связывающий домен связывается с сайтом-мишенью в геноме клетки растения. В других вариантах осуществления клетку растения приводят в контакт с универсальной полинуклеотидной донорной кассетой. В дополнительных вариантах осуществления сайт-мишень в геноме клетки растения расщепляют сайт-специфической ДНК-связывающей нуклеазой. В еще одном другом варианте осуществления универсальную полинуклеотидную донорную кассету интегрируют в сайт-мишень в геноме клетки растения.
[0176] В одном из вариантов осуществления раскрыто направленное встраивание универсальной полинуклеотидной донорной кассеты в геном клетки растения через механизм репарации по гомологии. В другом варианте осуществления раскрыто направленное встраивание универсальной полинуклеотидной донорной кассеты в геном клетки растения через механизм репарации через соединение негомологичных концов.
[0177] Донорные молекулы, описанные в настоящем документе, встраивают в геном клетки через направленные, не зависящие от гомологии способы. Для такого направленного встраивания геном расщепляют в желаемом местоположении (или местоположениях) с использованием нуклеазы, например, слитого белка из ДНК-связывающего домена (например, связывающий домен цинкового пальца или домен TAL эффектора конструируют, чтобы связывать сайт-мишень в предварительно определяемом сайте расщепления или около него) и домена нуклеазы (например, расщепляющий домен или расщепляющий полудомен). В определенных вариантах осуществления в клетке экспрессируют два слитных белка, каждый содержит ДНК-связывающий домен и расщепляющий полудомен, которые связываются с сайтами-мишенями, которые расположены рядом таким образом, что вблизи от сайтов-мишеней происходит воссоздание функционального расщепляющего домена и расщепление ДНК. В одном из вариантов осуществления расщепление происходит между сайтами-мишенями двух ДНК-связывающих доменов. Один или оба ДНК-связывающих домена могут быть сконструированными. Также см. патент США № 7,888,121; публикацию патента США 20050064474 и публикации международных патентов WO05/084190, WO05/014791 и WO 03/080809.
[0178] Нуклеазы, как описано в настоящем документе, можно вводить в виде полипептидов и/или полинуклеотидов. Например, два полинуклеотиды, каждый содержит последовательности, кодирующие один из указанных выше полипептидов, можно вводить в клетку, и, когда происходит экспрессия полипептидов и связывание каждого с его целевой последовательностью, в целевой последовательности или около нее происходит расщепление. Альтернативно, один полинуклеотид, содержащий последовательности, кодирующие оба слитных полипептида, вводят в клетку. Полинуклеотиды могут представлять собой ДНК, РНК или какие-либо модифицированные формы или аналоги ДНК и/или РНК.
[0179] После введения двухцепочечного разрыва в область, представляющую интерес, трансген интегрируют в область, представляющую интерес, направленным образом с помощью способов, не зависящих от гомологии (например, соединение негомологичных концов (NHEJ)), после линеаризации двухцепочечной донорной молекулы, как описано в настоящем документе. Двухцепочечный донор предпочтительно линеаризуют in vivo с использованием нуклеазы, например, одной или нескольких из одинаковых или различных нуклеаз, которые используют для того, чтобы вводить двухцепочечный разрыв в геном. Синхронное расщепление хромосомы и донора в клетке может ограничивать разрушение донорной ДНК (по сравнению с линеаризацией донорной молекулы перед введением в клетку). Сайты-мишени нуклеаз, используемых для линеаризации донора, предпочтительно не нарушают последовательность(последовательности) трансгена(трансгенов).
[0180] Трансген можно встраивать в геном в направлении, предполагаемом простым лигированием нуклеазных липких концов (обозначаемом как «прямая» или «AB» ориентация), или в альтернативном направлении (обозначаемом как «обратная» или «BA» ориентация). В определенных вариантах осуществления трансген интегрируют после точного лигирования липких концов донора и хромосомы. В других вариантах осуществления встраивание трансгена в ориентации BA или AB ведет к делеции нескольких нуклеотидов.
IV. Анализы для обнаружения универсального донорного полинуклеотида
[0181] Различные анализы можно использовать для того, чтобы обнаруживать универсальный донорный полинуклеотид, описанный в определенных вариантах осуществления по раскрытию. Следующие способы можно использовать в различных ситуациях, и в одном из вариантов осуществления можно использовать при обнаружении присутствия молекулы нуклеиновой кислоты и/или трансгена, кодирующего полипептид, в клетке растения. Например, присутствие молекулы можно определять различными способами, в том числе с использованием праймера или зонда последовательности, анализа ELISA для того, чтобы обнаруживать кодируемый белок, вестерн-блоттинг для того, чтобы обнаруживать белок, или нозерн- или саузерн-блоттинг для того, чтобы обнаруживать РНК или ДНК. Можно использовать ферментативные анализы для обнаружения универсального донорного полинуклеотида. Кроме того, антитело, которое может обнаруживать присутствие белка универсального донорного полинуклеотида, можно создавать с использованием принятых в данной области процедур. Дополнительные способы, такие как гибридизация in situ, ферментативное окрашивание и иммуноокрашивание, также можно использовать для того, чтобы обнаруживать присутствие или экспрессию рекомбинантной конструкции в конкретных органах и тканях растения. Трансген, содержащийся в универсальном донорном полинуклеотиде, можно избирательно экспрессировать в некоторых тканях растения или на некоторых этапах развития, или трансген, содержащийся в универсальном донорном полинуклеотиде, можно экспрессировать по существу во всех тканях растения, по существу весь его жизненный цикл. Однако также можно применять любой режим комбинаторной экспрессии.
[0182] Саузерн-анализ представляет собой широко используемый способ обнаружения, в котором ДНК режут рестрикционными эндонуклеазами и фракционируют на агарозном геле, чтобы разделять ДНК по молекулярной массе и затем переносить на нейлоновые мембраны. Затем их гибридизуют с фрагментом зонда, который радиоактивно мечен 32P (или другими метками зондов) и промывают в растворе SDS.
[0183] Аналогичным образом, в нозерн-анализе используют схожий протокол, в котором РНК режут рестрикционными эндонуклеазами и фракционируют на агарозном геле, чтобы разделять РНК по молекулярной массе и затем переносить на нейлоновые мембраны. Затем ее гибридизуют с фрагментом зонда, который радиоактивно мечен 32P (или другими метками зондов) и промывают в растворе SDS. Анализ РНК (например, мРНК), выделенной из тканей, представляющих интерес, может показывать относительные уровни экспрессии. Типично, если мРНК присутствует или количество мРНК увеличено, можно делать предположение о том, что имеет место экспрессия соответствующего трансгена. Нозерн-анализ или другие протоколы анализа мРНК можно использовать для того, чтобы определять уровни экспрессии введенного трансгена или нативного гена.
[0184] В вестерн-анализе вместо выделения ДНК/РНК, извлекают белок, представляющий интерес, и помещают его на акриламидный гель. Затем белок переносят на мембрану и приводят в контакт с метящим веществом. См., например, Hood et al., «Commercial Production of Avidin from Transgenic Maize; Characterization of Transformants, Production, Processing, Extraction and Purification» Molecular Breeding 3:291-306 (1997); Towbin et al, (1979) «Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: procedure and some applications» Proc Natl Acad Sci USA 76(9): 4350-4354; Renart et al. «Transfer of proteins from gels to diazobenzyloxymethyl-paper and detection with antisera: a method for studying antibody specificity and antigen structure» Proc Natl Acad Sci USA 76(7): 3116-3120.
[0185] Универсальный донорный полинуклеотид или его сегменты можно использовать в качестве праймеров для ПЦР амплификации. При выполнении ПЦР амплификации между праймером и матрицей может быть допустима определенная степень несовпадения. Следовательно, мутации, делеции и инсерции (в частности, добавления нуклеотидов на 5’-конец) в образцовых праймерах входят в объем рассматриваемого раскрытия. Мутации, инсерции и делеции можно получать в данном праймере способами, которые известны среднему специалисту в данной области.
[0186] Другим примером способа обнаружения является способ пиросеквенирования, как описано у Winge (Innov. Pharma. Tech. 00:18-24, 2000). В этом способе разрабатывают олигонуклеотид, который перекрывает сочленение смежной геномной ДНК и ДНК вставки. Олигонуклеотид гибридизуют с одноцепочечным продуктом ПЦР из области, представляющей интерес, (один праймер во вставленной последовательности и один во фланкирующей геномной последовательности) и инкубируют в присутствии ДНК полимеразы, АТФ, сульфурилазы, люциферазы, апиразы, аденозин-5’-фосфосульфата и люциферина. dNTP добавляют индивидуально и встраивание ведет к световому сигналу, который измеряют. Световой сигнал указывает на присутствие трансгенной вставки/фланкирующей последовательности благодаря успешной амплификации, гибридизации и удлинения на одно или несколько оснований (этот способ используют для начального секвенирования, не для обнаружения конкретного гена, когда он известен).
[0187] Описаны молекулярные маяки для использования при обнаружении последовательностей. В кратком изложении, разработан олигонуклеотидный зонд FRET, который перекрывает сочленение фланкирующей геномной ДНК и ДНК вставки. Уникальная структура зонда FRET ведет к тому, что он содержит вторичную структуру, которая содержит флуоресцентные и гасящие фрагменты в непосредственной близости. Зонд FRET и ПЦР праймеры (один праймер в последовательности ДНК вставки и один во фланкирующей геномной последовательности) циклируют в присутствии термостабильной полимеразы и dNTP. После успешной ПЦР амплификации гибридизация зонда(зондов) FRET с целевой последовательностью ведет к удалению вторичной структуры зонда и пространственному разделению флуоресцентных и гасящих фрагментов. Флуоресцентный сигнал указывает на присутствие фланкирующей геномной последовательности/последовательности трансгенной вставки благодаря успешной амплификации и гибридизации.
[0188] Гидролитический анализ зондов, иначе известный как TAQMAN® (Life Technologies, Foster City, Calif.), представляет собой способ обнаружения и количественного определения присутствия последовательности ДНК. В кратком изложении, разрабатывают олигонуклеотидный зонд FRET с одним олигонуклеотидом в трансгене и одним во фланкирующей геномной последовательности обнаружения конкретного события. Зонд FRET и ПЦР праймеры (один праймер в последовательности ДНК вставки и один во фланкирующей геномной последовательности) циклируют в присутствии термостабильной полимеразы и dNTP. Гибридизация зонда FRET ведет к расщеплению и освобождению флуоресцентного фрагмента от гасящего фрагмента зонда FRET. Флуоресцентный сигнал указывает на присутствие фланкирующей последовательности/последовательности трансгенной вставки благодаря успешной амплификации и гибридизации.
[0189] ELISA или иммуноферментный анализ известен с 1971 года. В целом, антигенами, солюбилизированными в буфере, покрывают поверхность пластмассы. Когда добавляют сыворотку, антитела могут прикрепляться к антигену на твердой фазе. Присутствие или отсутствие этих антител можно демонстрировать при конъюгации с ферментов. Добавление подходящего субстрата обнаруживает количество связанного конъюгата, по которому можно определять количество. В обыкновенном анализе ELISA используют конъюгат биотинилированных поликлональных антител против белка и щелочной фосфатазы. Например, в ELISA, используемом для количественного определения уровней лакказы, можно использовать сэндвич-анализ антител, в котором применяют поликлональные антитела кролика, полученные на коммерческой основе. Для обнаружения антитело конъюгируют с щелочными фосфатазами. В другом примере в анализе ELISA для того, чтобы обнаруживать трипсин или трипсиноген, используют биотинилированные поликлональные антитела против трипсина или против трипсиногена и конъюгат стрептавидина и щелочной фосфатазы.
[0190] Варианты осуществления по рассматриваемому раскрытию дополнительно проиллюстрированы в следующих примерах. Следует понимать, что эти примеры приведены только в качестве иллюстрации. Из приведенных выше вариантов осуществления и следующих примеров специалист в данной области может установить главные характеристики этого раскрытия и, не отступая от его сущности и объема, может создавать различные изменения и модификации вариантов осуществления по раскрытию для того, чтобы адаптировать их к различным использованиям и условиям. Таким образом, различные модификации вариантов осуществления по раскрытию, в дополнение к тем, что показаны и описаны в настоящем документе, будут видны специалистам в данной области из приведенного выше описания. Подразумевают, что такие модификации также включены в объем приложенной формулы изобретения. Следующее приведено в качестве иллюстрации и не предназначено для того, чтобы ограничивать объем изобретения.
ПРИМЕРЫ
Пример 1: разработка цинковых пальцев для связывания геномных локусов в Zea mays
[0191] Белки с цинковыми пальцами, направленные против идентифицированных последовательностей ДНК геномных локусов Zea mays, подверженных направленному воздействию, разрабатывали как описано ранее. См., например, Urnov et al., (2005) Nature 435:646-551. Образцовые целевые последовательности и распознающие спирали представлены в таблице 1 (конструкции областей распознающей спирали) и таблице 2 (сайты-мишени). В таблице 2 нуклеотиды в сайте-мишени, с которыми контактируют распознающие спирали ZFP, показаны заглавными буквами, а те нуклеотиды, с которыми не контактируют, показаны строчными буквами. Сайты-мишени нуклеаз с цинковыми пальцами (ZFN) разрабатывали для всех 72 выбранных геномных локусов в Zea mays. Разработано и протестировано множество конструкций ZFP, чтобы идентифицировать пальцы, которые связываются с наивысшим уровнем эффективности в промежуточной дрожжевой системе с 72 различными репрезентативными сайтами-мишенями геномных локусов, которые идентифицировали и отбирали в Zea mays. Конкретные распознающие спирали ZFP (таблица 1), которые связываются с наивысшим уровнем эффективности с последовательностями распознавания цинковых пальцев, использовали для направленного воздействия и встраивания донорной последовательности в геном Zea mays.
[0192] Таблица 1
Конструкции цинковых пальцев для отобранных геномных локусов Zea mays (N/A обозначает «не применимо»). |
|||||||
Номер pDAB | Номер ZFP | F1 | F2 | F3 | F4 | F5 | F6 |
111879 | 111879 ZFN5 | SEQ ID NO: 1 QSGDLTR | SEQ ID NO: 2 RKDQLVA | SEQ ID NO: 3 RSDDLTR | SEQ ID NO: 4 TSSNRKT | SEQ ID NO: 5 RSDTLSE | SEQ ID NO: 6 ARSTRTN |
111879 ZFN7 | SEQ ID NO: 7 RSDSLSV | SEQ ID NO: 8 DRSNRKT | SEQ ID NO: 9 QSSHLTR | SEQ ID NO: 10 RSDALAR | SEQ ID NO: 11 RSDDLTR | SEQ ID NO: 12 DPSALRK | |
111885 | 111885 ZFN1 | SEQ ID NO: 13 RSDNLSQ | SEQ ID NO: 14 ASNDRKK | SEQ ID NO: 15 ERGTLAR | SEQ ID NO: 16 RSDHLSR | SEQ ID NO: 17 ERGTLAR | SEQ ID NO: 18 QSGHLSR |
111885 ZFN2 | SEQ ID NO: 19 RSANLAR | SEQ ID NO: 20 DRSDLSR | SEQ ID NO: 21 RSDTLSQ | SEQ ID NO: 22 RSADLSR | SEQ ID NO: 23 DRSNLSR | SEQ ID NO: 24 NSRNLRN | |
117404 | SIG115737_31v1 | SEQ ID NO: 25 RSDSLSV | SEQ ID NO: 26 DRSHLAR | SEQ ID NO: 27 DRSNLSR | SEQ ID NO: 28 RRSDLKR | SEQ ID NO: 29 RSDTLSE | SEQ ID NO: 30 QNATRIN |
SIG115737_32v1 | SEQ ID NO: 31 QSGSLTR | SEQ ID NO: 32 QSGDLTR | SEQ ID NO: 33 RSDVLSE | SEQ ID NO: 34 TRNGLKY | N/A | N/A | |
117408 | SIG120523_11v1 | SEQ ID NO: 35 RSDNLSR | SEQ ID NO: 36 DNSNRKT | SEQ ID NO: 37 QNAHRKT | SEQ ID NO: 38 QKATRIT | SEQ ID NO: 39 DRSHLTR | SEQ ID NO: 40 RSDDRKK |
SIG120523_12v1 | SEQ ID NO: 41 ASKTRTN | SEQ ID NO: 42 QSGSLTR | SEQ ID NO: 43 LRHHLTR | SEQ ID NO: 44 QSAHLKA | N/A | N/A | |
117400 | SIG115246_5 | SEQ ID NO: 45 QSGDLTR | SEQ ID NO: 46 ASHNLRT | SEQ ID NO: 47 DRSNLTR | SEQ ID NO: 48 QSSDLSR | SEQ ID NO: 49 DAGNRNK | N/A |
SIG115246_6 | SEQ ID NO: 50 DRSDLSR | SEQ ID NO: 51 RSDNLTR | SEQ ID NO: 52 DRSHLSR | SEQ ID NO: 53 TSGNLTR | SEQ ID NO: 54 QSSDLSR | N/A | |
117402 | SIG115636_1v1 | SEQ ID NO: 55 QSSDLSR | SEQ ID NO: 56 HRSTRNR | SEQ ID NO: 57 RSDDLTR | SEQ ID NO: 58 DRSNLKA | SEQ ID NO: 59 DRSHLTR | SEQ ID NO: 60 QRSTLKS |
SIG115636_2v1 | SEQ ID NO: 61 RSDALSR | SEQ ID NO: 62 RSDDLTR | SEQ ID NO: 63 DRSHLTR | SEQ ID NO: 64 TSSNRKT | SEQ ID NO: 65 RSDTLSE | SEQ ID NO: 66 DRSHLAR | |
117406 | SIG120417_11v1 | SEQ ID NO: 67 DRSARTR | SEQ ID NO: 68 QSGHLSR | SEQ ID NO: 69 QSGNLAR | SEQ ID NO: 70 RSDVLST | SEQ ID NO: 71 RYAYLTS | SEQ ID NO: 72 RRWTLVG |
SIG120417_12v1 | SEQ ID NO: 73 RSDNLSQ | SEQ ID NO: 74 ASNDRKK | SEQ ID NO: 75 QSGDLTR | SEQ ID NO: 76 LKDTLRR | SEQ ID NO: 77 QSGNLAR | N/A | |
117411 | SIG120621_15v1 | SEQ ID NO: 78 QSGDLTR | SEQ ID NO: 79 MQNYLSR | SEQ ID NO: 80 RSDHLSE | SEQ ID NO: 81 QNANRKT | SEQ ID NO: 82 RSADLTR | N/A |
SIG120621_16v1 | SEQ ID NO: 83 RSDNLSE | SEQ ID NO: 84 QSANRTK | SEQ ID NO: 85 RSDALSR | SEQ ID NO: 86 DRSALAR | SEQ ID NO: 87 RSDHLSE | SEQ ID NO: 88 DSQNRIK | |
117413 | SIG12078_11v1 | SEQ ID NO: 89 QSGDLTR | SEQ ID NO: 90 DKGNLTK | SEQ ID NO: 91 RSADLTR | SEQ ID NO: 92 DRSHLAR | SEQ ID NO: 93 RSDTLSE | SEQ ID NO: 94 DRSNRKT |
SIG12078_12v1 | SEQ ID NO: 95 DRSNLSR | SEQ ID NO: 96 LRQDLKR | SEQ ID NO: 97 RSDHLSE | SEQ ID NO: 98 DRSALAR | SEQ ID NO: 99 DRSALSR | SEQ ID NO: 100 NRRGRWS | |
117429 | SIG157315_1v1 | SEQ ID NO: 101 RPYTLRL | SEQ ID NO: 102 HRSSLRR | SEQ ID NO: 103 RSDSLLR | SEQ ID NO: 104 WLSSLSA | SEQ ID NO: 105 QSGDLTR | SEQ ID NO: 106 DRSHLAR |
SIG157315_2v1 | SEQ ID NO: 107 DRSNLSR | SEQ ID NO: 108 LKQHLNE | SEQ ID NO: 109 LRHHLTR | SEQ ID NO: 110 QSGNLHV | SEQ ID NO: 111 TSGHLSR | N/A |
[0193] Таблица 2
Сайт-мишень отобранных геномных локусов Zea mays. |
|||||
Идентификатор локуса | Название | Номер pDAB | Номер ZFP и сайт связывания (5’→3’) | SEQ ID NO: сайта-мишени | Оптимальные геномные локусы SEQ ID NO: |
оптимальные_ локусы_204637 |
OGL1 | pDAB111879 | 111879ZFN5:ctACTCCGTATGCGAAGGCAcg | 112 | 210 |
111879ZFN7: taTTCGCGGTGGGACACTTGat | 113 | ||||
оптимальные_ локусы_204726 |
OGL2 | pDAB111885 | 111885ZFN1: ccGGAGCCGGGGCCTCCCAGgc | 114 | 211 |
111885ZFN2: atCGCGACGCGACGcGACGAGac | 115 | ||||
оптимальные_ локусы_156393 |
OGL 12 | pDAB117404 | SIG115737_31v1: TGCATGCGCAGTA | 116 | 212 |
SIG115737_32v1: ACACCGGCGCACGGCACG | 117 | ||||
оптимальные_ локусы_198387 |
OGL 15 | pDAB117408 | SIG120523_11v1: AGAGGTGTAACC | 118 | 213 |
SIG120523_12v1: TCGGGCACAAGAAACGAG | 119 | ||||
оптимальные_ локусы_31710 |
OGL 08 | pDAB117400 | SIG115246_5: TACGCTGACAATGCA | 120 | 214 |
SIG115246_6: CCAGCTGATGGAGAGGAC | 121 | ||||
оптимальные_ локусы_64542 |
OGL 11 | pDAB117402 | SIG115636_1v1: AGAGCAGGCGAG | 122 | 215 |
SIG115636_2v1: AGCAAAGTGAGTAGTT | 123 | ||||
оптимальные_ локусы_197372 |
OGL14 | pDAB117406 | SIG120417_11v1: TGGATGGAAGGAATC | 124 | 216 |
SIG120417_12v1: GAAGCTACATCCCAG | 125 | ||||
оптимальные_ локусы_232228 |
OGL 16 | pDAB117411 | SIG120621_15v1: TACGCGCAACGGAACGCA | 126 | 217 |
SIG120621_16v1: CACCGGTGTCGTGTAACAG | 127 | ||||
оптимальные_ локусы_285621 |
OGL17 | pDAB117413 | SIG12078_11v1: CCCGGACGACGCCGAG | 128 | 218 |
SIG12078_12v1: GACATGGCACGCGCATCGAG | 129 | ||||
оптимальные_ локусы_157315 |
OGL 13 | pDAB117429 | SIG157315_1v1: GCATGTGTGGTTTTG | 130 | 219 |
SIG157315_2v1: GGTCAAGGTAGTGAC | 131 |
[0194] Конструкции цинковых пальцев репрезентативных геномных локусов Zea mays встраивали в экспрессирующие векторы цинковых пальцев, кодирующие белок, который имеет по меньшей мере один палец со структурой CCHC. См. публикацию патента США № 2008/0182332. В частности, последний палец в каждом белке имел CCHC остов для распознающей спирали. Неканонические последовательности, кодирующие цинковые пальцы, сливали с нуклеазным доменом рестрикционного фермента FokI IIS типа (аминокислоты 384-579 из последовательности Wah et al., (1998) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95:10564-10569) через линкер из четырех аминокислот и сигналом ядерной локализации opaque-2, полученным из Zea mays для того, чтобы формировать нуклеазы с цинковыми пальцами (ZFN). См. патент США № 7,888,121. Цинковые пальцы для различных функциональных доменов выбирали для использования in vivo. Среди множества ZFN, которые разрабатывали, получали и тестировали на связывание с предполагаемым геномным сайтом-мишенью, ZFN, описанные выше в таблице 2, идентифицировали как обладающие активностью in vivo и охарактеризовали как способные к эффективному связыванию и расщеплению уникальных геномных полинуклеотидных сайтов-мишеней Zea mays in planta.
[0195] Сборка конструкции ZFN
[0196] Плазмидные векторы, содержащие конструкции экспрессии генов ZFN, которые идентифицировали, как описано ранее, разрабатывали и выполняли с использованием навыков и способов, обыкновенно известных в данной области (см., например, Ausubel или Maniatis). Каждую кодирующую ZFN последовательность сливали с последовательностью, кодирующей сигнал ядерной локализации opaque-2 (Maddaloni et al., (1989) Nuc. Acids Res. 17:7532), который располагали выше по направлению считывания от нуклеазы с цинковыми пальцами. Неканонические последовательности, кодирующие цинковые пальцы, сливали с доменом нуклеазного рестрикционного фермента IIS типа FokI (аминокислоты 384-579 из последовательности Wah et al. (1998) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95:10564-10569). Экспрессией слитных белков управлял сильный конститутивный промотор из гена убиквитина Zea mays (который содержит 5’-нетранслируемую область (UTR) (Toki et al., (1992) Plant Physiology 100;1503-07). Экспрессирующая кассета также содержала 3’ UTR (содержащий терминатор транскрипции и сайт полиаденилирования) из гена пероксидазы 5 (Per5) Zea mays (публикация патента США № 2004/0158887). Самостоятельно гидролизующую 2A, кодирующую нуклеотидную последовательность из вируса Thosea asigna (Szymczak et al., (2004) Nat Biotechnol. 22:760-760), добавляли между двумя слитными белками нуклеаз с цинковыми пальцами, которые клонировали в конструкцию.
[0197] Плазмидные векторы собирали с использованием IN-FUSION™ Advantage Technology (Clontech, Mountain View, CA). Рестрикционные эндонуклеазы получали из New England BioLabs (Ipswich, MA) и для лигирования ДНК использовали ДНК лигазу T4 (Invitrogen, Carlsbad, CA). Препараты плазмид получали с использованием NUCLEOSPIN® Plasmid Kit (Macherey-Nagel Inc., Bethlehem, PA) или Plasmid Midi Kit (Qiagen), следуя инструкциям поставщиков. Фрагменты ДНК выделяли с использованием QIAQUICK GEL EXTRACTION KIT™ (Qiagen) после электрофореза в агарозном геле с трис-ацетатом. Сначала проводили скрининг колоний из всех реакций лигирования посредством рестрикционного расщепления минипрепаратов ДНК. Плазмидную ДНК выбранных клонов секвенировали с помощью коммерческого поставщика секвенирования (Eurofins MWG Operon, Huntsville, AL). Данные о последовательностях собирали и анализировали с использованием программного обеспечения SEQUENCHER™ (Gene Codes Corp., Ann Arbor, MI).
[0198] Плазмиды конструировали и подтверждали через расщепление рестрикционными ферментами и через секвенирование ДНК.
[0199] Сборка универсальной донорной конструкции
[0200] Чтобы поддерживать быстрое тестирование большого числа целевых локусов, разрабатывали и конструировали последовательность новой гибкой универсальной донорной системы. Универсальная донорная полинуклеотидная последовательность совместима со способами и анализом для высокопроизводительных векторных конструкций. Универсальная донорная система состояла по меньшей мере из трех модульных доменов: невариабельный связывающий домен ZFN, аналитический домен и домен определяемых пользователем признаков, а также простой плазмидный остов для воспроизведения вектора. Невариабельная универсальная донорная полинуклеотидная последовательность является общей для всех доноров и делает возможной разработку конечного набора анализов, которые можно использовать для всех сайтов-мишеней Zea mays, таким образом обеспечивая однородность оценки направленного воздействия и уменьшая число циклов анализа. Модульная природа этих доменов допускает высокопроизводительную сборку донора. Дополнительно, универсальная донорная полинуклеотидная последовательность имеет другие уникальные признаки, направленные на упрощение последующего анализа и расширение интерпретации результатов. Она содержит асимметричную последовательность участка рестрикции, что делает возможным расщепление продуктов ПЦР диагностических предсказуемых размеров. Удаляли последовательности, содержащие вторичные структуры, которые предположительно могли вызывать проблемы при ПЦР амплификации. Универсальная донорная полинуклеотидная последовательность имеет небольшой размер (меньше чем 3,0 т.о.). Наконец, универсальную донорную полинуклеотидную последовательность строили в высококопийном остове pUC19, который позволяет своевременно создавать большое количество тестовой ДНК.
[0201] В качестве варианта осуществления, образцовая плазмида, которая содержит последовательность универсальной полинуклеотидной донорной кассеты, предоставлена в виде SEQ ID NO: 132 и фиг. 1. В дополнительном варианте осуществления последовательность полинуклеотидной донорной кассеты предоставлена в виде: pDAB111846, SEQ ID NO: 133, фиг. 2; pDAB117415, SEQ ID NO: 134, фиг. 3; pDAB117416, SEQ ID NO: 135, фиг. 4; pDAB117417, SEQ ID NO: 136, фиг. 5; pDAB117419, SEQ ID NO: 137, фиг. 6; pDAB117434 SEQ ID NO: 138, фиг. 7; pDAB117418, SEQ ID NO: 139, фиг. 8; pDAB117420, SEQ ID NO: 140, фиг. 9; и pDAB117421, SEQ ID NO: 141, фиг. 10. В другом варианте осуществления можно конструировать дополнительные последовательности, которые содержат универсальную донорную полинуклеотидную последовательность с функциональной экспрессируемой кодирующей последовательностью или нефункциональными (без промотора) экспрессируемыми кодирующими последовательностями. Различные домены (невариабельный связывающий домен ZFN, аналитический домен и домен определяемых пользователем признаков, а также простой плазмидный остов), которые составляют универсальную донорную систему, аннотированы для конструкций, как описано выше, в таблице 3.
[0202] Таблица 3
Аннотация векторов универсальной донорной системы для того, чтобы идентифицировать невариабельные связывающие домены ZFN, аналитические домены и домены определяемых пользователем признаков, а также плазмидный остов. |
||||
Название вектора | Связывающий домен ZFN | Аналитический домен | Области гомологичных звеньев | Плазмидный остов |
pDAB111845 | 2244-144 п.о. | 145-254 п.о. | --- | 255-2243 п.о. |
pDAB111846 | 2243-143 п.о. | 144-253 п.о. | --- | 254-2242 п.о. |
pDAB117415 | 1961-2069 п.о. | 2081-2190 п.о. | 1920-1954 п.о., 2191-2225 п.о. | 2226-1919 п.о. |
pDAB117416 | 51-155 п.о. | 171-280 п.о. | 1-35 п.о., 281-315 п.о. | 316-2234 п.о. |
pDAB117417 | 51-86 п.о. | 102-211 п.о. | 1-35 п.о., 212-246 п.о. | 247-2165 п.о. |
pDAB117419 | 51-119 п.о. | 201-310 п.о. | 1-35 п.о., 311-345 п.о. | 345-2264 п.о. |
pDAB117434 | 1970-2213 п.о. | 2229-2338 п.о. | 1920-1954 п.о., 2339-2373 п.о. |
1-1919 п.о. |
pDAB117418 | 51-162 п.о. | 178-287 п.о. | 1-35 п.о., 288-322 п.о. |
323-2241 п.о. |
pDAB117420 | 37-116 п.о. | 132-241 п.о. | 1-35 п.о., 242-276 п.о. | 277-2195 п.о. |
pDAB117421 | 51-143 п.о. | 159-268 п.о. | 1-35 п.о., 269-303 п.о. | 304-2222 п.о. |
[0203] В другом варианте осуществления универсальная донорная полинуклеотидная последовательность представляет собой небольшую модульную донорную систему 2-3 т.о., доставляемую в виде плазмиды. Это минимальный донор, который содержит любое число сайтов связывания ZFN, короткую матричную область 100-150 п.о., обозначаемую как «ДНК X» или «последовательность UZI» или «аналитический домен» (SEQ ID NO: 142 и SEQ ID NO: 143), который несет участки рестрикции и последовательности ДНК для разработки праймеров (праймеры разрабатывают для Tm на 10°C больше, чем любые вычисленные вторичные структуры) или кодирующие последовательности, и простой плазмидный остов (фиг. 11). В одном из вариантов осуществления разрабатывают аналитический домен, который: имеет процентную долю пары оснований гуанин и цитозин от 40 до 60%; не содержит повторяющиеся последовательности больше чем 9 п.о. (например, 5’-gtatttcatgtatttcat-3’); не содержит серию идентичных пар оснований больше чем 9 п.о.; и не имеет вторичной структуры, где вторичная структура меньше чем -18 ккал/моль свободной энергии, как вычисляют с использованием программного обеспечения для укладки и гибридизации нуклеиновых кислот UNAFold, Markham, N. R. & Zuker, M. (2008). В Bioinformatics, том II. Structure, Function and Applications, № 453, под редакцией Keith, J. M., в Methods in Molecular Biology, глава 1, стр. 3-31, Humana Press, Totowa, NJ. ISBN 978-1-60327-428-9. См. таблицу 4. Всю плазмиду вставляют через NHEJ после двухцепочечного разрыва ДНК в подходящем сайте связывания ZFN; сайты связывания ZFN можно встраивать тандемно. Этот вариант осуществления универсальной донорной полинуклеотидной последовательности является наиболее подходящим для быстрого скрининга сайтов-мишеней и ZFN, а также в доноре минимизируют последовательности, которые сложно амплифицировать.
[0204] Таблица 4
Анализ композиции аналитического домена на свободную энергию ΔG, число серий идентичных пар оснований по 9 п.о., число повторяющихся последовательностей больше чем 9 п.о. и процентная доля гуанина/цитозина. |
||||
SEQ ID NO: | Свободная энергия ΔG | Число серий идентичных пар оснований по 9 п.о. | Число повторяющихся последовательностей больше чем 9 п.о. | GC% |
SEQ ID NO: 142 | -12,42 ккал/моль | Нет | Нет | 50,9% |
SEQ ID NO: 143 | -12,78 ккал/моль | Нет | Нет | 47,5% |
[0205] В дополнительном варианте осуществления универсальные донорные полинуклеотидные последовательности выполняют по меньшей мере из четырех модулей, и они несут частичные сайты связывания ZFN, гомологичные звенья, ДНК X с аналитическим фрагментом приблизительно 100 п.о. или кодирующие последовательности. Этот вариант осуществления универсальной донорной полинуклеотидной последовательности подходит для попыток NHEJ-опосредованной инсерции генов в различные сайты-мишени полинуклеотида, с использованием нескольких ZFN (фиг. 12).
[0206] Универсальную донорную полинуклеотидную последовательность можно использовать со всеми направленными молекулами с определенными ДНК-связывающими доменами, с двумя режимами направленной инсерции донора (NHEJ/HDR). По существу, когда универсальную донорную полинуклеотидную последовательность доставляют совместно с подходящей конструкцией для ZFN экспрессии, и донорный вектор и геном кукурузы расщепляют в одном конкретном местоположении, определяемом связыванием конкретной ZFN. После линеаризации донор можно встраивать в геном посредством NHEJ или HDR. Тогда различные аналитические соображения при разработке вектора можно использовать для того, чтобы определять цинковый палец, который максимизирует эффективную доставку направленного встраивания (фиг. 13).
Пример 2: процедуры трансформации Zea mays
[0207] Перед доставкой в протопласты культурного сорта Hi-II Zea mays, плазмидную ДНК для каждой ZFN конструкции получали из культур E. coli с использованием PURE YIELD PLASMID MAXIPREP SYSTEM® (Promega Corporation, Madison, WI) или PLASMID MAXI KIT® (Qiagen, Valencia, CA), следуя инструкциям поставщиков.
[0208] Выделение протопластов
[0209] Суспензии клеток культурного сорта Hi-II Zea mays поддерживали согласно 3,5-суточному протоколу поддержания, объем осажденных клеток (PCV) 4 мл собирали и переносили в 50 мл стерильные конические пробирки (Fisher Scientific), содержащие 20 мл раствора фермента (0,6% PECTOLYASE™, 6% ЦЕЛЛЮЛАЗА™ («Onozuka» R10; Yakult Pharmaceuticals, Japan), 4 мМ MES (pH 5,7), 0,6 M маннит, 15 мМ MgCl2). Культуры закрывали крышками и оборачивали PARAFILM™ и помещали на платформенную качалку (платформенная качалка Thermo Scientific, Vari Mix), устанавливали скорость на 10 для инкубации в течение 16-18 часов при комнатной температуре до высвобождения протопластов. После инкубации микроскопически оценивали качество расщепления клеток. Расщепленные клетки фильтровали через 100 мкм клеточный фильтр, промывали 10 мл среды W5 [2 мМ MES (pH5,7), 205 мМ NaCl, 167 мМ CaCl2, 6,7 мМ KCl], после чего следовало фильтрование через 70 мкм и 40 мкм клеточные фильтры. 100 мкм и 40 мкм фильтры промывали 10 мл среды W5. Отфильтрованные протопласты вместе с промывной средой собирали в 50 мл пробирке для центрифуги, конечный объем составлял приблизительно 40 мл. Затем 8 мл «Heavy Gradient solution» [500 мМ сахароза, 1 мМ CaCl2, 5 мМ MES (pH6,0)] медленно добавляли в нижнюю часть раствора протопластов/ферментов, центрифугировали на центрифуге с ротором со стаканами на качающемся кронштейне в течение 15 минут на 300-350×g. После центрифугирования приблизительно 7-8 мл полосы протопластов удаляли, промывали в 25 мл W5 и центрифугировали в течение 15 минут на 180-200×g. Затем протопласты ресуспендировали в 10 мл раствора MMG [4 мМ MES (pH 5,7), 0,6 M маннит, 15 мМ MgCl2]. Протопласты считали с использованием гемоцитометра или проточного цитометра и разбавляли до 1,67 миллиона на мл с использованием MMG.
[0210] Трансформация протопластов, полученных из суспензионной культуры культурного сорта Hi-II Zea mays, с использованием PEG
[0211] Приблизительно 0,5 миллиона протопластов (300 мкл в растворе MMG) переносили в 2 мл пробирки, смешивали с 40 мкл ДНК и инкубировали при комнатной температуре в течение 5-10 минут. Затем добавляли 300 мкл свежеполученного раствора PEG (36% PEG 4000, 0,3 M маннит, 0,4M CaCl2) и смесь инкубировали при комнатной температуре 15-20 минут при периодическом перемешивании переворачиванием. После инкубации медленно добавляли 1 мл промывочной W5, клетки мягко перемешивали и осаждали протопласты посредством центрифугирования на 180-200×g в течение 15 минут. Осадок ресуспендировали в 1 мл среды WI [4 мМ MES (pH 5,7), 0,6 M маннит, 20 мМ KCl], пробирку оборачивали алюминиевой фольгой и инкубировали при комнатной температуре в течение ночи в течение приблизительно 16 часов.
[0212] Трансформация ZFN и донора
[0213] Для каждого из выбранных геномных локусов протопласты Zea mays трансфицировали с использованием контроля экспрессии гена yfp, только ZFN, только донора и смеси ZFN и донора в соотношении 1:10 (по массе). Общее количество ДНК для трансфекции 0,5 миллиона протопластов составляло 80 мкг. Все воздействия проводили повторно, три или шесть раз. Использованный контроль экспрессии гена yfp представлял собой pDAB8393 (фиг. 14), которая содержит кассеты экспрессии генов с промотором убиквитина 1 Zea mays -кодирующей последовательностью желтого флуоресцентного белка - Per5 3’UTR Zea mays и промотором актина 1 риса - кодирующей последовательностью pat - 3’UTR липазы Zea mays. В типичном эксперименте по направленному воздействию совместно трансфицировали 4 мкг только ZFN или с 36 мкг донора, 40 мкг репортерной генной конструкции yfp добавляли к каждой обработке. Включение подходящих количеств экспрессирующей плазмиды гена yfp в качестве наполнителя делает возможной оценку качества трансфекции среди множества локусов и повторных обработок. Кроме того, использование подходящих количеств экспрессирующих плазмид гена yfp делает возможным быстрое решение проблем любого технического характера в быстром анализе направленного воздействия инсерции донора.
Пример 3: расщепление геномных локусов у Zea mays с помощью нуклеазы с цинковыми пальцами
[0214] Трансфицированные ZFN протопласты культурного сорта Hi-II Zea mays собирали через 24 часа после трансфекции посредством центрифугирования на 1600 об./мин в 2 мл пробирках EPPENDORF™ и удаляли супернатант. Геномную ДНК экстрагировали из осадка протопластов с использованием QIAGEN PLANT DNA EXTRACTION KIT™ (Qiagen, Valencia, CA). Выделенную ДНК ресуспендировали в 50 мкл воды и определяли концентрацию посредством NANODROPTM (Invitrogen, Grand Island, NY). Целостность ДНК оценивали посредством электрофореза образцов в 0,8% агарозном геле. Все образцы нормализовали (20-25 нг/мкл) для ПЦР амплификации для того, чтобы создавать ампликоны для секвенирования (Illumina, Inc., San Diego, CA). ПЦР праймеры со штриховыми кодами для амплификации областей, окружающих каждую тестовую последовательность распознавания ZFN из обработанных и контрольных образцов, разрабатывали и приобретали в IDT (Coralville, IA, очищенные ВЭЖХ). Оптимальные условия амплификации идентифицировали посредством градиентной ПЦР с использованием 0,2 мкМ подходящих праймеров со штриховыми кодами, ACCUPRIME PFX SUPERMIX™ (Invitrogen, Carlsbad, CA) и 100 нг матричной геномной ДНК в реакции 23,5 мкл. Параметры циклирования: начальная денатурация при 95°C (5 мин), после чего следует 35 циклов денатурации (95°C, 15 с), ренатурации (55-72°C, 30 с), элонгации (68°C, 1 мин), и конечная элонгация (68°C, 7 мин). Продукты амплификации анализировали на 3,5% TAE агарозных гелях, а подходящую температуру ренатурации для каждой комбинации праймеров определяли и использовали для амплификации ампликонов из контрольных и обработанных ZFN образцов, как описано выше. Все ампликоны очищали на 3,5% агарозных гелях, элюировали водой и определяли концентрации с помощью NANODROP™. Для секвенирования следующего поколения приблизительно 100 нг ПЦР ампликона из обработанных ZFN и соответствующих контрольных протопластов кукурузы объединяли вместе и секвенировали с использованием секвенирования следующего поколения Illumina (NGS).
[0215] Анализировали расщепляющую активность подходящих ZFN в каждом из выбранных геномных локусов Zea mays. Короткие ампликоны, окружающие сайты расщепления ZFN, амплифицировали из геномной ДНК из обработанных ZFN и контрольных протопластов и подвергали Illumina NGS. Вызванное ZFN расщепление или двухцепочечный разрыв ДНК разрешали с помощью клеточного пути NHEJ репарации посредством инсерции или делеции нуклеотидов (инсерции и делеции) в сайте расщепления, присутствие инсерций и делеций в сайте расщепления, таким образом, представляет собой меру ZFN активности, и определяли посредством NGS. Расщепляющую активность целевых конкретных ZFN оценивали как число последовательностей с инсерциями и делециями на один миллион высококачественных последовательностей с использованием программного обеспечения для NGS анализа (публикация патента 2012-0173,153, data Analysis of DNA sequences) (фиг. 15). Для выбранных целевых геномных локусов Zea mays наблюдали активности в диапазоне от 5 до 100 раз выше контролей, которые дополнительно подтверждали посредством выравнивания последовательностей, которое демонстрировало отпечаток разнообразия от инсерций и делеций в каждом сайте расщепления ZFN. Эти данные показывают, что выбранные геномные локусы Zea mays подвержены расщеплению с помощью ZFN. Дифференциальная активность в каждой мишени отражает ее состояние хроматина и подверженность расщеплению, а также эффективность экспрессии каждой ZFN.
Пример 4: быстрый анализ направленного воздействия для встраивания полинуклеотидного донора
[0216] Последовательность в геномных локусах Zea mays с использованием нуклеазы с цинковыми пальцами
[0217] Валидацию направленного воздействия универсальной донорной полинуклеотидной последовательностью в выбранных целевых геномных локусах Zea mays через инсерцию донора, опосредованную соединением негомологичных концов (NHEJ), осуществляли с использованием полупропускного способа быстрого анализа направленного воздействия на основе протопластов. Для каждого выбранного целевого геномного локуса Zea mays тестировали от трех до шести конструкций ZFN и оценивали направленное воздействие путем измерения опосредованного ZFN расщепления с помощью способов секвенирования следующего поколения (фиг. 15) и инсерцию донора посредством инвертированной ПЦР сочленения (фиг. 16). Выбранные геномные локусы Zea mays, которые были положительными в обоих анализах, идентифицировали как локус, подверженный направленному воздействию.
[0218] Быстрый анализ направленного воздействия для инсерции ZFN донора
[0219] Для того чтобы определять, если на выбранные целевые геномные локусы Zea mays можно направленно воздействовать для инсерции донора, конструкцию ZFN и конструкцию универсального донорного полинуклеотида совместно доставляли в протопласты кукурузы, которые инкубировали в течение 24 часов прежде, чем экстрагировали геномную ДНК для анализа. Если экспрессируемые ZFN могли резать сайт-мишень связывания как в выбранных целевых геномных локусах Zea mays, так и в доноре, то линеаризованный донор можно было вставлять в расщепленный сайт-мишень в геноме кукурузы через путь соединения негомологичных концов (NHEJ). Подтверждение направленного встраивания в выбранных целевых геномных локусах Zea mays выполняли на основании стратегии инвертированной ПЦР, где внешний праймер распознает последовательность в нативных геномных локусах, а внутренний праймер связывается с последовательностью внутри донорной ДНК. Праймеры разрабатывают таким образом, что только когда донорную ДНК вставляют в выбранные целевые геномные локусы Zea mays, анализ ПЦР будет давать продукт амплификации ожидаемого размера. Анализ инвертированной ПЦР осуществляют как на 5’-, так и на 3’-концах инсерционного сочленения. Праймеры, используемые для анализа встроенных полинуклеотидных донорных последовательностей, приведены в таблице 5.
[0220] Инсерция ZFN донора в целевые локусы с использованием вложенной инвертированной ПЦР
[0221] Все ПЦР амплификации проводили с использованием набора TAKARA EX TAQ HS™ (Clonetech, Mountain View, CA). Первую инвертированную ПЦР осуществляли в конечном объеме реакции 20 мкл, который содержал 1× буфер TAKARA EX TAQ HS™, 0,2 мМ dNTP, 0,2 мкМ внешнего праймера (таблица 5), 0,05 мкМ внутреннего праймера (разработанного из универсальной донорной кассеты, которая описана выше), 0,75 единицы полимеразы TAKARA EX TAQ HS™ и 10 нг экстрагированной ДНК протопластов кукурузы. Затем осуществляли реакцию с использованием программы ПЦР, которая состояла из 94°C в течение 2 мин, 20 циклов из 98°C в течение 12 с и 68°C в течение 2 мин, после чего следовало 72°C в течение 10 мин и удержание на 4°C. Конечные ПЦР продукты прогоняли на агарозном геле вместе с 1KB PLUS DNA LADDER™ (Life Technologies, Grand Island, NY) для визуализации.
[0222] Вложенную инвертированную ПЦР проводили в конечном объеме реакции 20 мкл, который содержал 1× буфер TAKARA EX TAQ HS™, 0,2 мМ dNTP, 0,2 мкМ внешнего праймера (таблица 5), 0,1 мкМ внутреннего праймера (разработанного из универсальной донорной кассеты, которая описана выше, таблица 6), 0,75 единицы полимеразы TAKARA EX TAQ HS™ и 1 мкл первого ПЦР продукта. После этого осуществляли реакцию с использованием программы ПЦР, которая состояла из 94°C в течение 2 мин, 31 цикла из 98°C в течение 12 с, 66°C в течение 30 с и 68°C в течение 45 с, после чего следовало 72°C в течение 10 мин и удержание на 4°C. Конечные ПЦР продукты прогоняли на агарозном геле вместе с 1KB PLUS DNA LADDER™ (Life Technologies, Grand Island, NY) для визуализации.
[0223] Таблица 5
Список всех внешних праймеров для анализа вложенной инвертированной ПЦР оптимальных геномных локусов. |
||||
OGL1 | Первая ПЦР | 5’-конец | APL02-5PriF1 | SEQ ID NO: 144 CGCCACAAATCTGAACCAGCA |
Spec-PriR1 | SEQ ID NO: 145 CCACGATCGACATTGATCTGGCTA | |||
3’-конец | APL02-3PriR1 | SEQ ID NO: 146 GCGACATATCAGGCCAACAGG | ||
Uzi-PriF1 | SEQ ID NO: 147 GGGATATGTGTCCTACCGTATCAGG | |||
Вложенная ПЦР | 5’-конец | APL02-5nstPriF1 | SEQ ID NO: 148 CCAGCATACAGTTAGGGCCCA | |
Spec-nstPriR1 | SEQ ID NO: 149 GTTGCCTTGGTAGGTCCAGC | |||
3’-конец | APL02-3nstPriR1 | SEQ ID NO: 150 CGAAAACTCAGCATGCGGGAA | ||
Uzi-nstPriF1 | SEQ ID NO: 151 GAGCCATCAGTCCAACACTGC | |||
OGL2 | Первая ПЦР | 5’-конец | APL01-5PriF1 | SEQ ID NO: 152 ACAGGCGTACAGCAACACCA |
3’-конец | APL01-3PriR1 | SEQ ID NO: 153 GACCCTATGGTGTTGGATCCCA | ||
Вложенная ПЦР | 5’-конец | APL01-5nstPriF1 | SEQ ID NO: 154 CGGGAGCTAGGCAACAAATCG | |
3’-конец | APL01-3nstPriR1 | SEQ ID NO: 155 TCTGACTAAACGGGTGGATGCTG | ||
OGL8 | Первая ПЦР | 5’-конец | OGL08-5nstPriF2 | SEQ ID NO: 156 CGGATCAGTTGATTCGCTCACTTTCA |
3’-конец | OGL08-3PriR | SEQ ID NO: 157 GCCGAAAAGCAGCAACTGGAA | ||
Вложенная ПЦР | 5’-конец | OGL08-5nstPriF | SEQ ID NO: 158 GATTGCTACGCAGACCGCCTA | |
3’-конец | OGL08-3nstPriR | SEQ ID NO: 159 CACTATTCCTCCGGCATGCAG | ||
OGL11 | Первая ПЦР | 5’-конец | OGL11-5PriF | SEQ ID NO: 160 TGACCTATTGATCGGTCGGCTC |
3’-конец | OGL11-3PriR2 | SEQ ID NO: 161 TGCCTTGAATCTCAGGGATGCA | ||
Вложенная ПЦР | 5’-конец | OGL11-5nstPriF | SEQ ID NO: 162 GCCGAAGCTAACTAGCGGACA | |
3’-конец | OGL11-3nstPriR2 | SEQ ID NO: 163 CATGGAGTAGCAGCTGTGCTG | ||
OGL12 | Первая ПЦР | 5’-конец | OGL12-5PriF | SEQ ID NO: 164 GAAAAGCAGTCACCGGCTCTG |
3’-конец | OGL12-3PriR | SEQ ID NO: 165 CCATGGACATGAATTCGGCACG | ||
Вложенная ПЦР | 5’-конец | OGL12-5nstPriF | SEQ ID NO: 166 CTTTTGCACCACGGAGCAGAC | |
3’-конец | OGL12-3nstPriR | SEQ ID NO: 167 GCTAGCAAAACTTTGAAGCTCGCTC | ||
OGL13 | Первая ПЦР | 5’-конец | OGL13-5PriF | SEQ ID NO: 168 GAGGTCCCTTACGGGTCATCG |
3’-конец | OGL13-3PriR | SEQ ID NO: 169 ACCAGGTCTATCTTGCGCAGAC | ||
Вложенная ПЦР | 5’-конец | OGL13-5nstPriF | SEQ ID NO: 170 AATAGCGTGGTCGGGTCCTAG | |
3’-конец | OGL13-3nstPriR | SEQ ID NO: 171 ACGAACGATCCAAGGTGCAGT | ||
OGL14 | Первая ПЦР | 5’-конец | OGL14-5PriF | SEQ ID NO: 172 TAGAGACGAGGACTCTGGGCT |
3’-конец | OGL14-3PriR | SEQ ID NO: 173 AAGTCCAACATGGGCACAACC | ||
Вложенная ПЦР | 5’-конец | OGL14-5nstPriF | SEQ ID NO: 174 CCTCGTTAAGGGTGCAGGTTG | |
3’-конец | OGL14-3nstPriR | SEQ ID NO: 175 CCAAGTCAGCTTCTAAGCCATCAAAC | ||
OGL15 | Первая ПЦР | 5’-конец | OGL15-5PriF | SEQ ID NO: 176 AACCCTAGACTTCTGCCTGGTG |
3’-конец | OGL15-3PriR | SEQ ID NO: 177 GCTCACTTACGAGCAGATCCCA | ||
Вложенная ПЦР | 5’-конец | OGL15-5nstPriF | SEQ ID NO: 178 GGTGCACGCATGTTCTCATGT | |
3’-конец | OGL15-3nstPriR | SEQ ID NO: 179 TGTTTACCGCAGCCATGCTTG | ||
OGL16 | Первая ПЦР | 5’-конец | OGL16-5PriF | SEQ ID NO: 180 GTTGTATACGGCATCCATCCGCT |
3’-конец | OGL16-3PriR | SEQ ID NO: 181 GAATGAAACTGGTGGTCTGCTCC | ||
Вложенная ПЦР | 5’-конец | OGL16-5nstPriF | SEQ ID NO: 182 CCGACGAGGTACAAGTAGCAGG | |
3’-конец | OGL16-3nstPriR | SEQ ID NO: 183 CCCGTAGTCCAGATTCTTGTGGT | ||
OGL17 | Первая ПЦР | 5’-конец | OGL17-5PriF | SEQ ID NO: 184 GTCGTTTGTTCGGAAGGGGAG |
3’-конец | OGL17-3PriR | SEQ ID NO: 185 CGTAGTTGTCCGGCATGTCCT | ||
Вложенная ПЦР | 5’-конец | OGL17-5nstPriF | SEQ ID NO: 186 TGTATCCCTTCGGTGAGCACG | |
3’-конец | OGL17-3nstPriR | SEQ ID NO: 187 TGAATCGACTCGCTGACAGGTG |
[0224] Таблица 6
Список всех внутренних праймеров для анализа вложенной инвертированной ПЦР оптимальных геномных локусов. |
||||
Все реакции | Первая ПЦР | 5’-конец | Spec-PriR1 | SEQ ID NO: 188 CCACGATCGACATTGATCTGGCTA |
3’-конец | Uzi-PriF1 | SEQ ID NO: 189 GGGATATGTGTCCTACCGTATCAGG | ||
Вложенная ПЦР | 5’-конец | Spec-nstPriR1 | SEQ ID NO: 190 GTTGCCTTGGTAGGTCCAGC | |
3’-конец | Uzi-nstPriF1 | SEQ ID NO: 191 GAGCCATCAGTCCAACACTGC |
[0225] Таблица 7
Праймеры для расщепляющей активности ZFN |
||
OGL 1 | Контроль/ZFN 111879 | SEQ ID NO: 192 TGGCACTAATCTCACCGGCT |
SEQ ID NO: 193 AGTCTTAGAAGTACGCTACCGT | ||
OGL 2 | Контроль/ZFN 111885 | SEQ ID NO: 194 TACTTGGCTTCGGCGGCGA |
SEQ ID NO: 195 GGGTGACTTTTACGCGTCTCG | ||
OGL 11 | Контроль/ZFN 117402 | SEQ ID NO: 196 GGTCACGACGCATGGCCTAA |
SEQ ID NO: 197 AGGATGCATGGATCACCGTC | ||
OGL 12 | Контроль/ZFN 117404 | SEQ ID NO: 198 GCTCTGTTGTGCAGCCGTAC |
SEQ ID NO: 199 CGTTGCAGATACCACAGTGTAC | ||
OGL 13 | Контроль/ZFN 117429 | SEQ ID NO: 200 GCTAGTAGCTGTTTACACGGCGTCT |
SEQ ID NO: 201 AGGTCGAGACAACCAAGTAGAG | ||
OGL 14 | Контроль/ZFN 117406 | SEQ ID NO: 202 ACAGGACATCGAGCTTGCAT |
SEQ ID NO: 203 CAGAAGAAAGGCATCAACTCATG | ||
OGL 15 | Контроль/ZFN 117408 | SEQ ID NO: 204 CTCTTTCACCTCTACTTTTACTTCAG |
SEQ ID NO: 205 ATTGAACCGTTGTCAAAGCCA | ||
OGL 16 | Контроль/ZFN 117411 | SEQ ID NO: 206 CACAGCGTCAGGGCGGTAAC |
SEQ ID NO: 207 GGCACGCACCTGTCACTGAC | ||
OGL 17 | Контроль/ZFN 117413 | SEQ ID NO: 208 GTACGCGCCCGGGAACTCCT |
SEQ ID NO: 209 CCTGCGGCCCACGTGCATCT |
[0226] Применение анализа инвертированной ПЦР в системе направленного воздействия на протопласты было особенно сложным, поскольку для трансфекции использовали большие количества плазмидной ДНК, и большое количество плазмидной ДНК оставляли в системе направленного воздействия на протопласты и впоследствии извлекали вместе с клеточной геномной ДНК. Остаточная плазмидная ДНК может снижать относительную концентрацию геномной ДНК и снижать общую чувствительность обнаружения, а также может представлять собой значимую причину неспецифичных аберрантных реакций ПЦР. Индуцированная ZFN инсерция донора на основе NHEJ типично происходит в прямой или обратной ориентации. Анализ инвертированной ПЦР ДНК для инсерции в прямой ориентации часто демонстрирует ложноположительные полосы, возможно из-за общих областей гомологии около сайта связывания ZFN в мишени и доноре, которые могут вести к посадке праймера и достройке невстроенной донорной ДНК во время процесса амплификации. Ложноположительные результаты не наблюдали в анализах, в которых исследовали продукты инсерции в обратной ориентации, и, следовательно, весь анализ направленного встраивания донора осуществляли для изучения обратной инсерции донора в быстром анализе направленного воздействия. Для того чтобы дополнительно повышать специфичность и ослаблять фон, также использовали стратегию гнездовой ПЦР. В стратегии гнездовой ПЦР использовали вторую реакцию ПЦР амплификации, в которой амплифицировали более короткую область в первом продукте амплификации из первой ПЦР реакции. Использование асимметричных количеств внутренних и внешних праймеров дополнительно оптимизировало ПЦР сочленения для быстрого анализа направленного воздействия в выбранных геномных локусах.
[0227] Результаты анализа инвертированной ПЦР визуализировали на агарозном геле. Для всех выбранных геномных локусов Zea mays «обработка ZFN + донор» давала полосу размера, близкого к ожидаемому, на 5’- и 3’-концах. Обработка только контрольной ZFN или донором была в ПЦР отрицательной, что подсказывает, что способ специфично оценивал встраивание донора в сайт-мишень. Все обработки проводили повторно от трех до шести раз, и присутствие предполагаемого ПЦР продукта в нескольких повторениях (≥ 2 на обоих концах) использовали для того, чтобы подтверждать направленное воздействие. Инсерция донора через NHEJ часто дает низкоинтенсивные побочные продукты, которые образуются из-за обработки линеаризованных концов на сайтах ZFN мишени и/или донора. Кроме того, наблюдали, что различные ZFN давали различные уровни эффективности направленного встраивания, причем некоторые из ZFN дают сообразно высокие уровни встраивания донора, некоторые ZFN дают менее сообразные уровни встраивания донора и другие ZFN не дают встраивания. В целом, для каждого из выбранных целевых геномных локусов Zea mays, которые тестировали, направленное встраивание демонстрировали в репрезентативных целевых геномных локусах Zea mays с помощью одной или нескольких ZFN, что подтверждает, что каждый из этих локусов был подвержен направленному воздействию. Кроме того, каждый из выбранных целевых геномных локусов Zea mays подходит для точной генной трансформации. Валидацию этих выбранных целевых геномных локусов Zea mays повторяли множество раз, каждый раз со схожими результатами, таким образом подтверждая воспроизводимость процесса валидации, который включает разработку и конструирование плазмиды, трансформацию протопласта, обработку образца и анализ образца.
[0228] Заключение
[0229] Донорную плазмиду и одну ZFN, разработанную для специфичного расщепления выбранных целевых геномных локусов Zea mays, трансфицировали в протопласты культурного сорта Hi-II Zea mays и клетки собирали через 24 часа. Анализ геномной ДНК, выделенной из контрольных протопластов, протопластов, обработанных ZFN и ZFN с донором, посредством инвертированной ПЦР сочленений демонстрировал направленную инсерцию универсального донорного полинуклеотида в результате расщепления геномной ДНК с помощью ZFN (таблица 8). Эти исследования показывают, что универсальную донорную полинуклеотидную систему можно использовать для того, чтобы оценивать направленное воздействие на эндогенные сайты и осуществлять скрининг возможных ZFN. Наконец, быстрый анализ направленного воздействия на основе протопластов и новые системы универсальных донорных полинуклеотидных последовательностей предоставляют усовершенствованную систему для скрининга геномных мишеней и ZFN для точных работ по конструированию геномов растений. Способы можно распространять на оценку сайт-специфического расщепления и инсерции донора в геномные мишени в любой системе, представляющей интерес, с использованием любой нуклеазы, которая вводит двух- или одноцепочечные разрывы ДНК.
[0230] Таблица 8
Результаты встраивания универсальной донорной полинуклеотидной последовательности в выбранные целевые геномные локусы Zea mays. |
||||||
Название | Идентификатор | Местоположение | Отнесение к кластеру |
ZFN
(pDAB#) |
Донор (pDAB#) | Локус подвержен направленному воздействию (да/нет) |
OGL01 | оптимальные_локусы_204637_G1 | chr5:200298202..200301414 | 16 | 111879 | 111845 | да |
OGL02 | оптимальные_локусы_204726_G1 | chr5:200665730..200670667 | 03 | 111885 | 111846 | да |
OGL08 | оптимальные_локусы_31710 | chr1:194939396..194943360 | 23 | 117400 | 117415 | да |
OGL11 | оптимальные_локусы_64542 | chr2:72203716..72205045 | 14 | 117402 | 117416 | да |
OGL12 | оптимальные_локусы_156393 | chr4:154313884..154315253 | 10 | 117404 | 117417 | да |
OGL15 | preffered_локус**_198387 | chr5:164712378..164713567 | 25 | 117408 | 117419 | да |
OGL13 | оптимальные_локусы_157315 | chr4:158710709..158711983 | 30 | 117429 | 117434 | да |
OGL14 | оптимальные_локусы_197372 | chr5:158680601..158681681 | 26 | 117406 | 117418 | да |
OGL16 | оптимальные_локусы_232228 | chr6:144719567..144723469 | 28 | 117411 | 117420 | да |
OGL17 | оптимальные_локусы_285621 | chr8:118321357..118322528 | 06 | 117413 | 117421 | да |
[0231] Хотя аспекты данного изобретения описаны в определенных вариантах осуществления, их дополнительно можно модифицировать в пределах сущности и объема этого раскрытия. Следовательно, эта заявка предназначена для того, чтобы покрывать любые вариации, использования или адаптации вариантов осуществления изобретения с использованием его основных принципов. Кроме того, эта заявка предназначена для того, чтобы покрывать такие отклонения от настоящего раскрытия в качестве входящих в известную или принятую практику в той области, к которой относятся эти варианты осуществления, которые попадают в пределы приложенной формулы изобретения.
Claims (15)
1. Полинуклеотидная донорная кассета для трансформации растения, которая содержит связывающий домен сайт-специфической нуклеазы, аналитический домен и плазмидный домен, в которой аналитический домен включает полинуклеотидную последовательность с по меньшей мере 99% идентичностью последовательности с SEQ ID NO: 142.
2. Трансгенная клетка для трансформации растения, которая содержит полинуклеотидную донорную кассету по п. 1.
3. Трансгенная клетка по п. 2, в которой клетка представляет собой трансгенную клетку растения.
4. Трансформированное трансгенное растение, которое содержит трансгенную клетку растения по п. 3.
5. Полинуклеотидная донорная кассета по п. 1, в которой полинуклеотидная донорная кассета обладает последовательностью SEQ ID NO: 132.
6. Полинуклеотидная донорная кассета по п. 1, в которой связывающий домен сайт-специфической нуклеазы содержит две или более связывающих последовательности сайт-специфической нуклеазы.
7. Полинуклеотидная донорная кассета по п. 1, в которой связывающий домен сайт-специфической нуклеазы представляет собой связывающий домен с цинковыми пальцами.
8. Полинуклеотидная донорная кассета по п. 1, в которой аналитический домен представляет собой полинуклеотидную последовательность, состоящую из SEQ ID NO: 142.
9. Полинуклеотидная донорная кассета по п. 1, в которой полинуклеотидная донорная кассета обладает последовательностью SEQ ID NO: 133.
10. Полинуклеотидная донорная кассета по п. 1, в которой полинуклеотидная донорная кассета дополнительно содержит одну или несколько последовательностей гомологичных звеньев.
11. Полинуклеотидная донорная кассета по п. 1, в которой аналитический домен не кодирует пептид.
12. Полинуклеотидная донорная кассета по п. 1, в которой аналитический домен дополнительно содержит кодирующую последовательность, которая кодирует пептид.
13. Полинуклеотидная донорная кассета по п. 12, в которой аналитический домен содержит кассету экспрессии гена, которая содержит трансген.
14. Полинуклеотидная донорная кассета по п. 13, в которой трансген содержит репортерный ген.
15. Полинуклеотидная донорная кассета по п. 14, в которой репортерный ген выбирают из группы, состоящей из гена yfp, гена gus, гена rfp, гена gfp, гена устойчивости к канамицину, гена aad-1, гена aad-12, гена pat и гена устойчивости к глифосату.
Applications Claiming Priority (3)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US201361899543P | 2013-11-04 | 2013-11-04 | |
US61/899,543 | 2013-11-04 | ||
PCT/US2014/063732 WO2015066637A1 (en) | 2013-11-04 | 2014-11-03 | A universal donor system for gene targeting |
Publications (3)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
RU2016122038A RU2016122038A (ru) | 2017-12-11 |
RU2016122038A3 RU2016122038A3 (ru) | 2018-06-21 |
RU2687369C2 true RU2687369C2 (ru) | 2019-05-13 |
Family
ID=53005271
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
RU2016122038A RU2687369C2 (ru) | 2013-11-04 | 2014-11-03 | Универсальная донорная система для направленного воздействия на гены |
Country Status (14)
Country | Link |
---|---|
US (1) | US10077449B2 (ru) |
EP (1) | EP3066192B1 (ru) |
JP (1) | JP6560203B2 (ru) |
KR (1) | KR102248730B1 (ru) |
CN (1) | CN105683357B (ru) |
AR (1) | AR098283A1 (ru) |
AU (1) | AU2014341928B2 (ru) |
BR (1) | BR102014027448A8 (ru) |
CA (1) | CA2926534A1 (ru) |
IL (1) | IL245313B (ru) |
RU (1) | RU2687369C2 (ru) |
TW (1) | TWI669395B (ru) |
WO (1) | WO2015066637A1 (ru) |
ZA (1) | ZA201601929B (ru) |
Families Citing this family (41)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
EA201391373A1 (ru) | 2011-03-23 | 2014-07-30 | Пайонир Хай-Бред Интернэшнл, Инк. | Способы получения сложного локуса трансгенных признаков |
EP3613852A3 (en) | 2011-07-22 | 2020-04-22 | President and Fellows of Harvard College | Evaluation and improvement of nuclease cleavage specificity |
US20150044192A1 (en) | 2013-08-09 | 2015-02-12 | President And Fellows Of Harvard College | Methods for identifying a target site of a cas9 nuclease |
US9359599B2 (en) | 2013-08-22 | 2016-06-07 | President And Fellows Of Harvard College | Engineered transcription activator-like effector (TALE) domains and uses thereof |
US9526784B2 (en) | 2013-09-06 | 2016-12-27 | President And Fellows Of Harvard College | Delivery system for functional nucleases |
US9340800B2 (en) | 2013-09-06 | 2016-05-17 | President And Fellows Of Harvard College | Extended DNA-sensing GRNAS |
US9322037B2 (en) | 2013-09-06 | 2016-04-26 | President And Fellows Of Harvard College | Cas9-FokI fusion proteins and uses thereof |
CN106459995B (zh) | 2013-11-07 | 2020-02-21 | 爱迪塔斯医药有限公司 | 使用统治型gRNA的CRISPR相关方法和组合物 |
US20150166985A1 (en) | 2013-12-12 | 2015-06-18 | President And Fellows Of Harvard College | Methods for correcting von willebrand factor point mutations |
EP4079847A1 (en) | 2014-07-30 | 2022-10-26 | President And Fellows Of Harvard College | Cas9 proteins including ligand-dependent inteins |
WO2016040030A1 (en) | 2014-09-12 | 2016-03-17 | E. I. Du Pont De Nemours And Company | Generation of site-specific-integration sites for complex trait loci in corn and soybean, and methods of use |
CA2969619A1 (en) | 2014-12-03 | 2016-06-09 | Agilent Technologies, Inc. | Guide rna with chemical modifications |
CA2973903C (en) | 2015-01-27 | 2024-03-12 | Institute Of Genetics And Developmental Biology, Chinese Academy Of Sciences | A method for site-directed modification of whole plant through gene transient expression |
EP3280803B1 (en) | 2015-04-06 | 2021-05-26 | The Board of Trustees of the Leland Stanford Junior University | Chemically modified guide rnas for crispr/cas-mediated gene regulation |
EP3095870A1 (en) | 2015-05-19 | 2016-11-23 | Kws Saat Se | Methods for the in planta transformation of plants and manufacturing processes and products based and obtainable therefrom |
BR112018002026A2 (pt) | 2015-08-14 | 2018-09-18 | Institute Of Genetics And Developmental Biology, Chinese Academy Of Sciences | método para se obter arroz resistente a glifosato através da substituição de nucleotídeo direcionada ao sítio |
WO2017040967A1 (en) * | 2015-09-04 | 2017-03-09 | Octavo Systems Llc | Improved system using system in package components |
JP7067793B2 (ja) | 2015-10-23 | 2022-05-16 | プレジデント アンド フェローズ オブ ハーバード カレッジ | 核酸塩基編集因子およびその使用 |
WO2017083766A1 (en) * | 2015-11-13 | 2017-05-18 | Massachusetts Institute Of Technology | High-throughput crispr-based library screening |
US10767175B2 (en) | 2016-06-08 | 2020-09-08 | Agilent Technologies, Inc. | High specificity genome editing using chemically modified guide RNAs |
KR102547316B1 (ko) | 2016-08-03 | 2023-06-23 | 프레지던트 앤드 펠로우즈 오브 하바드 칼리지 | 아데노신 핵염기 편집제 및 그의 용도 |
US11661590B2 (en) | 2016-08-09 | 2023-05-30 | President And Fellows Of Harvard College | Programmable CAS9-recombinase fusion proteins and uses thereof |
US11542509B2 (en) | 2016-08-24 | 2023-01-03 | President And Fellows Of Harvard College | Incorporation of unnatural amino acids into proteins using base editing |
US11306324B2 (en) | 2016-10-14 | 2022-04-19 | President And Fellows Of Harvard College | AAV delivery of nucleobase editors |
US10745677B2 (en) | 2016-12-23 | 2020-08-18 | President And Fellows Of Harvard College | Editing of CCR5 receptor gene to protect against HIV infection |
CN106591293A (zh) * | 2016-12-28 | 2017-04-26 | 贵州省草业研究所 | 基于酶切连接从未知基因组中分离已知序列侧翼序列的方法 |
WO2018165504A1 (en) | 2017-03-09 | 2018-09-13 | President And Fellows Of Harvard College | Suppression of pain by gene editing |
EP3592777A1 (en) | 2017-03-10 | 2020-01-15 | President and Fellows of Harvard College | Cytosine to guanine base editor |
IL306092A (en) | 2017-03-23 | 2023-11-01 | Harvard College | Nucleic base editors that include nucleic acid programmable DNA binding proteins |
WO2018209320A1 (en) | 2017-05-12 | 2018-11-15 | President And Fellows Of Harvard College | Aptazyme-embedded guide rnas for use with crispr-cas9 in genome editing and transcriptional activation |
CN111801345A (zh) | 2017-07-28 | 2020-10-20 | 哈佛大学的校长及成员们 | 使用噬菌体辅助连续进化(pace)的进化碱基编辑器的方法和组合物 |
US11319532B2 (en) | 2017-08-30 | 2022-05-03 | President And Fellows Of Harvard College | High efficiency base editors comprising Gam |
JP2021500036A (ja) | 2017-10-16 | 2021-01-07 | ザ ブロード インスティテュート, インコーポレーテッドThe Broad Institute, Inc. | アデノシン塩基編集因子の使用 |
CN107545153B (zh) * | 2017-10-25 | 2021-06-11 | 桂林电子科技大学 | 一种基于卷积神经网络的核小体分类预测方法 |
GB2611929B (en) | 2018-10-16 | 2023-11-22 | Blueallele Corp | Methods for targeted insertion of DNA in genes |
AU2020242032A1 (en) | 2019-03-19 | 2021-10-07 | Massachusetts Institute Of Technology | Methods and compositions for editing nucleotide sequences |
BR112022022603A2 (pt) | 2020-05-08 | 2023-01-17 | Broad Inst Inc | Métodos e composições para edição simultânea de ambas as fitas de sequência alvo de nucleotídeos de fita dupla |
CN114317588B (zh) * | 2020-09-29 | 2023-06-27 | 中国农业科学院生物技术研究所 | 一种作物高温响应型基因组精准甲基化调控回路 |
KR20240055811A (ko) | 2021-09-10 | 2024-04-29 | 애질런트 테크놀로지스, 인크. | 프라임 편집을 위한 화학적 변형을 갖는 가이드 rna |
WO2023049728A1 (en) * | 2021-09-21 | 2023-03-30 | Pairwise Plants Services, Inc. | Color-based and/or visual methods for identifying the presence of a transgene and compositions and constructs relating to the same |
CN114369677A (zh) * | 2022-01-04 | 2022-04-19 | 江汉大学 | 一种检测小麦转基因成分和转基因品系的引物组合、试剂盒、检测方法及应用 |
Citations (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US20030049835A1 (en) * | 2001-01-26 | 2003-03-13 | Helliwell Christopher A. | Methods and means for producing efficient silencing construct using recombinational cloning |
US20100257638A1 (en) * | 2006-08-11 | 2010-10-07 | Dow Agrosciences Llc | Zinc finger nuclease-mediated homologous recombination |
US20110296555A1 (en) * | 2008-07-01 | 2011-12-01 | Monsanto Technology Llc | Recombinant DNA Constructs and Methods for Modulating Expression of a Target Gene |
Family Cites Families (9)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2003080809A2 (en) * | 2002-03-21 | 2003-10-02 | Sangamo Biosciences, Inc. | Methods and compositions for using zinc finger endonucleases to enhance homologous recombination |
BRPI0812233B1 (pt) * | 2007-06-05 | 2022-10-04 | Bayer Cropscience Ag | Processos para troca de uma sequência de dna-alvo no genoma de uma célula de planta ou planta por uma sequência de dna de interesse, e vetor de dna |
BRPI0922641B1 (pt) * | 2008-12-17 | 2021-10-26 | Dow Agrosciences Llc | Método de integração de uma ou mais sequências de ácido nucleico exógenas no genoma de uma célula vegetal |
US20120084882A1 (en) * | 2009-03-20 | 2012-04-05 | Basf Plant Science Company Gmbh | Nematode-resistant transgenic plants |
KR101948941B1 (ko) * | 2010-01-22 | 2019-04-22 | 다우 아그로사이언시즈 엘엘씨 | 식물에서 유전자 표적화를 위한 조작된 랜딩 패드 |
EA031356B1 (ru) | 2010-01-22 | 2018-12-28 | ДАУ АГРОСАЙЕНСИЗ ЭлЭлСи | Вырезание трансгенов в генетически измененных организмах |
WO2011154158A1 (en) * | 2010-06-09 | 2011-12-15 | Bayer Bioscience N.V. | Methods and means to modify a plant genome at a nucleotide sequence commonly used in plant genome engineering |
EP2729567B1 (en) * | 2011-07-08 | 2016-10-05 | Cellectis | Method for increasing the efficiency of double-strand break-induced mutagenssis |
EP4279496A3 (en) * | 2013-09-04 | 2024-03-13 | Corteva Agriscience LLC | Rapid targeting analysis in crops for determining donor insertion |
-
2014
- 2014-11-03 RU RU2016122038A patent/RU2687369C2/ru active
- 2014-11-03 TW TW103138081A patent/TWI669395B/zh not_active IP Right Cessation
- 2014-11-03 AU AU2014341928A patent/AU2014341928B2/en not_active Ceased
- 2014-11-03 KR KR1020167014602A patent/KR102248730B1/ko active IP Right Grant
- 2014-11-03 JP JP2016526812A patent/JP6560203B2/ja not_active Expired - Fee Related
- 2014-11-03 BR BR102014027448A patent/BR102014027448A8/pt not_active Application Discontinuation
- 2014-11-03 WO PCT/US2014/063732 patent/WO2015066637A1/en active Application Filing
- 2014-11-03 CN CN201480060417.5A patent/CN105683357B/zh not_active Expired - Fee Related
- 2014-11-03 US US14/531,710 patent/US10077449B2/en not_active Expired - Fee Related
- 2014-11-03 EP EP14858498.0A patent/EP3066192B1/en not_active Not-in-force
- 2014-11-03 AR ARP140104120A patent/AR098283A1/es unknown
- 2014-11-03 CA CA2926534A patent/CA2926534A1/en not_active Abandoned
-
2016
- 2016-03-18 ZA ZA2016/01929A patent/ZA201601929B/en unknown
- 2016-04-25 IL IL245313A patent/IL245313B/en active IP Right Grant
Patent Citations (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US20030049835A1 (en) * | 2001-01-26 | 2003-03-13 | Helliwell Christopher A. | Methods and means for producing efficient silencing construct using recombinational cloning |
US20100257638A1 (en) * | 2006-08-11 | 2010-10-07 | Dow Agrosciences Llc | Zinc finger nuclease-mediated homologous recombination |
US20110296555A1 (en) * | 2008-07-01 | 2011-12-01 | Monsanto Technology Llc | Recombinant DNA Constructs and Methods for Modulating Expression of a Target Gene |
Non-Patent Citations (2)
Title |
---|
ZHANG Y. ET AL: "Transcription activator-like effector nucleases enable efficient plant genome engineering", PLANT PHYSIOLOGY, vol. 161, no. 1, 2013, p. 20-27. * |
ЛУТОВА Л. А. Биотехнология высших растений, Издательство С.-Петербургского университета, 2010, с. 62 - 209. * |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
RU2016122038A (ru) | 2017-12-11 |
EP3066192B1 (en) | 2019-05-01 |
IL245313B (en) | 2019-05-30 |
AR098283A1 (es) | 2016-05-26 |
AU2014341928A1 (en) | 2016-04-07 |
BR102014027448A2 (pt) | 2015-09-15 |
KR20160079090A (ko) | 2016-07-05 |
TWI669395B (zh) | 2019-08-21 |
IL245313A0 (en) | 2016-06-30 |
AU2014341928B2 (en) | 2017-11-30 |
CA2926534A1 (en) | 2015-05-07 |
US10077449B2 (en) | 2018-09-18 |
WO2015066637A1 (en) | 2015-05-07 |
BR102014027448A8 (pt) | 2021-08-24 |
JP6560203B2 (ja) | 2019-08-14 |
EP3066192A4 (en) | 2017-07-19 |
KR102248730B1 (ko) | 2021-05-07 |
US20150143588A1 (en) | 2015-05-21 |
JP2016534727A (ja) | 2016-11-10 |
RU2016122038A3 (ru) | 2018-06-21 |
EP3066192A1 (en) | 2016-09-14 |
CN105683357B (zh) | 2020-10-30 |
TW201522630A (zh) | 2015-06-16 |
ZA201601929B (en) | 2019-06-26 |
CN105683357A (zh) | 2016-06-15 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
RU2687369C2 (ru) | Универсальная донорная система для направленного воздействия на гены | |
US10087492B2 (en) | Rapid assay for identifying transformants having donor insertion | |
AU2017279660B2 (en) | DNA detection methods for site specific nuclease activity |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
PD4A | Correction of name of patent owner |