BRPI0812233B1

BRPI0812233B1 - Processos para troca de uma sequência de dna-alvo no genoma de uma célula de planta ou planta por uma sequência de dna de interesse, e vetor de dna

Info

Publication number: BRPI0812233B1
Application number: BRPI0812233-4A
Authority: BR
Inventors: Anne Rolland; Manuel Dubald; Michiel Van Lookeren Campagne; Rene Ruiter
Original assignee: Bayer Cropscience Ag; Bayer Cropscience N.V.
Priority date: 2007-06-05
Filing date: 2008-06-03
Publication date: 2022-10-04
Also published as: CA2689345A1; EP2160467A1; CA2689345C; CN101688217A; EP2160467B1; AU2008258782A1; CN101688217B; WO2008148559A1; AU2008258782B2; US20100175143A1; US8765448B2; BRPI0812233A2

Abstract

PROCESSO PARA TROCA DE UMA SEQUÊNCIA DE DNA-ALVO NO GENOMA DE UMA CÉLULA EUCARIÓTICA OU OR- GANISMO EUCARIÓTICO POR UMA SEQUÊNCIA DE DNA DE INTERESSE, PROCESSO PARA TROCA DE UMA SEQUÊNCIA DE DNA-ALVO NO GENOMA DE UMA PLANTA POR UMA SEQUÊNCIA DE DNA DE INTERESSE E VETOR DE DNA A presente invenção refere-se a métodos e dispositivos para a troca exata em células eucarióticas, tais como células de planta, de uma sequência de O NA-alvo por uma sequência de DNA de interesse através de recombinação homóloga, com o que o marcador selecionável ou avaliável usado durante a fase de recombinação homóloga para seleção temporal dos eventos de substituição de gene pode ser subsequentemente removido sem deixar um "foot-print" empregando um processo para a remoção de um DNA selecionado flanqueado por duas sequências de nucleotídeo em repetições diretas.

Description

Campo da Invenção

[001] A presente invenção se refere a métodos e dispositivo aperfeiçoados para a troca exata de sequência de DNA-alvo por uma sequência de DNA de interesse através de recombinação homóloga em células e organismo eucarióticos, tais como células de planta e plantas, com o que o marcador selecionável ou avaliável usado durante a fase de recombinação homóloga para seleção temporal dos eventos de substituição de gene pode ser subsequentemente removido sem introdução de quaisquer outras variações de sequência.

Técnica Anterior

[002] Recombinação homóloga permite várias modificações genéticas direcionadas em organismos procarióticos e eucarióticos selecionados incluindo deleções, inserções ou substituições selecionadas.

[003] Em organismos eucarióticos superiores, recombinação homóloga pode ser estimulada através da indução de quebras de DNA de fita dupla por endonucleases de corte raras, tal como, por exemplo, I-SceI.

[004] O WO2004/067753 descreve o uso de meganucleases para indução de recombinação homóloga ex vivo e in toto em tecidos somáticos de vertebrado e a aplicação das mesmas para engenharia de genoma e terapia de gene.

[005] O WO2004/46386 descreve métodos de modificação, reparação, atenuação e inativação de um gene ou outro DNA cromossomal em uma célula através de quebras de fita dupla induzidas por I-SceI. São também descritos métodos de tratamento ou profilaxia de uma doença genética em um indivíduo com necessidade dos mesmos.

[006] Em plantas, indução de quebras de DNA de fita dupla usando I-SceI foi mostrada aumentar a frequência de recombinação homóloga em pelo menos duas ordens de magnitude usando Agrobacteria para aplicar o DNA de reparo às células de planta (Puchta e outros, 1996, Proc. Natl. Acad. Sci,. U.S.A., 93, pp. 50555060). Chilton e Que (2003, Plant Physiol. 133: pp. 956-965) e Tzifira e outros (2003, Plant Physiol. 133: pp1011-1023) relatam que T-DNA integra preferivelmente em quebras de DNA de fita dupla, artificialmente induzidas pela enzima de clivagem rara I-SceI ou I-CeuI. Os relatórios também incluíam vetores de T-DNA doadores que compreendiam um sítio de reconhecimento para a respectiva enzima de clivagem rara.

[007] Ainda, foram descritos métodos que permitem a elaboração de endonucleases de clivagem raras para alterar especificidade de substrato ou sequência das enzimas, então permitindo induzir uma quebra de fita dupla em virtualmente qualquer locus de interesse sem ser dependente da presença de um sítio de reconhecimento para qualquer uma das endonucleases de clivagem raras naturais. Em suma, enzimas de restrição quiméricas podem ser preparadas usando híbridos entre um domínio dedo de zinco elaborado para reconhecer uma sequência de nucleotídeo específica e o domínio de clivagem de DNA não-específico de uma enzima de restrição natural, tal como FokI. Tais métodos foram descritos, por exemplo, no WO 03/080809, WO94/18313 ou WO95/09233 e em Isalan e outros, 2001, Nature Biotechnology 19, 656-660; Liu e outros, 1997, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94, 5525-5530). Outro modo de produzir meganucleases feitas sob encomenda, através da seleção de uma biblioteca de variantes, é descrito no WO2004/067736. Meganucleases feitas sob encomenda com especificidade de sequência e afinidade de ligação de DNA alteradas podem ser também obtidas através de elaboração racional conforme descrito no WO2007/047859.

[008] O WO2007/049095 descreve variantes de endonuclease localizadoras (homing) "LADGLIDADG" tendo mutações em dois subdomínios separados, cada um se ligando a uma parte distinta de um meio-sítio-alvo de DNA modificado, de modo que a variante de endonuclease é capaz de clivar uma sequência-alvo de DNA quimérico compreendendo os nucleotídeos ligados por cada subdomínio.

[009] O WO2007/049156 e o WO2007/093836 descrevem variantes de endonuclease localizadora I-CreI tendo nova especificidade de clivagem e usos das mesmas.

[0010] O WO2007/047859 descreve meganucleases racionalmente elaboradas com especificidade de sequência e afinidade de ligação de DNA alteradas.

[0011] O WO2006/105946 descreve um método para a troca exata em células de planta e plantas de uma sequência de DNA-alvo por uma sequência de interesse através de recombinação homóloga, com o que o marcador selecionável ou avaliável usado durante a fase de recombinação homóloga para seleção temporal dos eventos de substituição de gene pode ser subsequentemente removido sem deixar um "foot-print" e sem recorrer à cultura in vitro durante a etapa de remoção, empregando o método aqui descrito para a remoção de DNA selecionado através de expressão específica de micrósporo de uma endonuclease de clivagem rara induzindo quebra de fita dupla.

[0012] O pedido de patente provisório US 60/828.042 e o pedido de patente europeu 06020370.0 e o WO2008/037436 descrevem variantes dos métodos e dispositivo do WO2006/105946 onde a etapa de remoção de um fragmento de DNA selecionado de indução por uma endonuclease de clivagem rara de indução de quebra de fita dupla está sob controle de um promotor específico de linhagem germinativa. Outras modalidades do método apoiam-se na união não- homóloga em uma extremidade do DNA de reparo e recombinação homóloga na outra extremidade.

[0013] Algumas das modalidades dos métodos e dispositivo acima identificados para a troca exata de um fragmento de DNA-alvo por um fragmento de DNA de interesse requersendo que o DNA de reparo introduzido seja introduzido na célula de planta na presença da enzima de indução de quebra de fita dupla. O DNA de reparo normalmente também contém o sítio pré-selecionado reconhecido por uma endonuclease de clivagem rara de indução de quebra de fita dupla e então o DNA de reparo está também propenso à clivagem de DNA. Deste modo, a eficiência de inserção de DNA através de recombinação homóloga pode ser diminuída. Para evitar esta diminuição em eficiência, o sítio pré-selecionado no DNA de reparo pode ser alterado de modo que ele não é mais reconhecido pela endonuclease de clivagem rara de indução de quebra de fita dupla. No entanto, isto acarreta a introdução de uma mudança extra no DNA de reparo comparado com o DNA-alvo em adição à mudança desejada.

[0014] A presente invenção provê uma solução alternativa para este problema, que não requer a modificação do sítio pré-selecionado no DNA de reparo e consequentemente permite a mudança do DNA com apenas a mudança de nucleotídeo desejada, sem modificação do sítio pré-selecionado. Esses e outros problemas são resolvidos conforme descrito a seguir nas modalidades detalhadas diferentes da invenção, bem como nas reivindicações.

Sumário da Invenção

[0015] Em uma modalidade da invenção, é provido um método para troca de uma sequência de DNA-alvo no genoma de uma célula eucariótica ou organismo eucariótico por uma sequência de DNA de interesse compreendendo as etapas que seguem: a. indução de uma primeira quebra de DNA de fita dupla em um sítio pré-selecionado no genoma de uma célula do organismo eucariótico, o sítio pré-selecionado estando localizado dentro da sequência de DNA-alvo ou na vizinhança da sequência de DNA-alvo e o sítio pré-selecionado sendo reconhecido por uma primeira enzima de indução de quebra de fita dupla (DSBI); b. introdução de uma molécula de reparo de DNA na célula eucariótica, a molécula de reparo de DNA compreendendo i. uma sequência de DNA de interesse localizada entre duas regiões de flanqueamento de DNA tendo pelo menos 80% de homologia de sequência com uma região de DNA flanqueando a sequência de DNA-alvo, e, preferivelmente, flanqueando o sítio pré- selecionado no genoma da célula eucariótica; ii. um gene marcador selecionável ou avaliável localizado entre as regiões de flanqueamento de DNA, o gene marcador selecionável ou avaliável estando ainda localizado entre uma primeira sequência de repetição consistindo na parte terminal 5’do sítio pré- selecionado e uma segunda sequência consistindo na parte terminal 3’do sítio pré-selecionado, com o que as sequências comuns entre as primeira e segunda sequências de repetição estão em repetição direta; e iii. pelo menos um sítio de repetição para uma segunda enzima DSBI localizado entre uma das regiões de flanqueamento de DNA e a primeira e a segunda sequência de repetição, preferivelmente entre a primeira e a segunda sequência de repetição direta; c. seleção de uma população de células compreendendo o marcador selecionável ou avaliável; d. seleção de uma célula onde o marcador selecionável ou avaliável foi introduzido através de recombinação homóloga através das regiões de flanqueamento de DNA; e. introdução de uma quebra de fita dupla no sítio de reconhecimento para a segunda enzima DSBI na célula; f. seleção de uma célula progênie onde o gene do marcador selecionável ou avaliável é deletado através de recombinação homóloga entre as repetições diretas deste modo recriando o sítio pré- selecionado.

[0016] Em outra modalidade da invenção, é provido um método para troca de uma sequência de DNA-alvo no genoma, particularmente no genoma nuclear, de uma planta por uma sequência de DNA de interesse compreendendo as etapas que seguem: a) indução de uma primeira quebra de DNA de fita dupla em um sítio pré-selecionado no genoma de uma célula da planta, o sítio pré-selecionado estando localizado dentro de uma sequência de DNA-alvo ou na vizinhança da sequência de DNA-alvo e o sítio pré- selecionado sendo reconhecido por uma primeira enzima de indução de quebra de fita dupla (DSBI) b) introdução de uma molécula de reparo de DNA na célula eucariótica, a molécula de reparo de DNA compreendendo i) A sequência de DNA de interesse localizada entre duas regiões de flanqueamento de DNA tendo pelo menos 80% de homologia de sequência com uma região de DNA flanqueando a sequência de DNA-alvo, e preferivelmente flanqueando o sítio pré- selecionado no genoma da célula eucariótica; ii) um gene marcador selecionável ou avaliável localizado entre as regiões de flanqueamento de DNA, o gene marcador selecionável ou avaliável estando ainda localizado entre uma primeira sequência de repetição consistindo na parte terminal 5’do sítio pré- selecionado e uma segunda sequência consistindo na parte terminal 3’ do sítio pré-selecionado, com o que as sequências comuns entre as primeira e segunda sequências de repetição estão em repetição direta; e iii) pelo menos um sítio de reconhecimento para a segunda enzima DSBI localizado entre uma das regiões de flanqueamento de DNA e a primeira e a segunda sequência de repetição; c) seleção de uma população de células de planta compreendendo o marcador selecionável ou avaliável; d) seleção de uma célula de planta onde a sequência de DNA de interesse (e o marcador selecionável ou avaliável) foi introduzido através de recombinação homóloga através das regiões de flanqueamento de DNA, e regeneração de uma planta a partir da célula de planta; e) cruzamento da planta regenerada ou de uma progênie da planta da mesma compreendendo o gene marcador selecionável com uma planta compreendendo uma enzima de indução de quebra de fita dupla ("DSBI") de clivagem rara codificando gene quimérico, o gene quimérico compreendendo os segmentos de DNA operavelmente ligados que seguem: i. um promotor específico de linhagem germinativa; ii. uma região de DNA codificando uma enzima de indução de quebra de DNA de fita dupla reconhecendo o sítio de reconhecimento localizado no DNA de interesse (isto é, a segunda enzima de indução de quebra de DNA de fita dupla); iii. uma região de terminação de transcrição e poliadenilação; f) seleção de uma progênie da planta (planta F1) compreendendo o gene marcador selecionável ou avaliável e o gene quimérico de codificação da enzima DSBI; g) cruzamento da progênie da planta com outra planta com o que a progênie da planta é usada como um doador de pólen; h) seleção de uma população de plantas progênie (população F2) que compreende o gene quimérico de codificação da enzima DSBI; e i) seleção de uma progênie da planta onde o gene marcador selecionável ou avaliável é deletado através de recombinação homóloga entre a primeira e a segunda sequência de repetição direta. A invenção se refere a células eucarióticas e plantas obteníveis através dos métodos descritos acima.

Breve Descrição dos Desenhos

[0017] As figuras 1 e 2 representam modalidades diferentes do método para troca de um DNA-alvo por um DNA em uma célula de planta sem quaisquer modificações adicionais. Essas figuras são para propósitos de ilustração apenas e não devem ser usadas para interpretar as reivindicações de uma maneira limitante.

[0018] A figura 1 é uma representação esquemática de um método que permite a substituição exata de uma sequência de DNA-alvo com uma sequência de DNA de repetição. DSB1: sítio de reconhecimento para uma primeira enzima de indução de quebra de fita dupla; FS1: sequência de flanqueamento 1; FS2; sequência de flanqueamento 2; DSB2: sítio de reconhecimento para uma segunda enzima de indução de quebra de fita dupla; SMG1: gene marcador selecionável 1 ou gene marcador avaliável 1; SMG2: gene marcador selecionável 2 ou gene marcador avaliável 2; DSBIE: enzima de indução de quebra de fita dupla; dr1: sequência de repetição direta 1 contida dentro da parte 5’ do sítio pré-selecionado reconhecido por DSBIE 1; dr2: sequência de repetição direta 2 contida dentro da parte 5’ do sítio pré-selecionado reconhecido por DSBIE1; GSP: promotor específico de linhagem germinativa; 3’: sinal de terminação de transcrição e poliadenilação. Na figura 1, o sítio pré-selecionado está localizado na vizinhança do DNA-alvo.

[0019] A figura 2 é uma representação esquemática de um método que permite substituição exata de uma sequência de DNA-alvo com uma sequência de DNA de substituição similar ao método ilustrado na figura 1. Nesta modalidade, o sítio pré-selecionado está localizado dentro do DNA-alvo.

[0020] A figura 3 é uma representação esquemática de um sítio de reconhecimento de 20 nucleotídeos de comprimento hipotético (N1- N20) para uma enzima de clivagem rara de indução de quebra de fita dupla. São indicadas primeira e segunda sequências conforme descrito em outro ponto com o que dr1 corresponde à parte 5’ do sítio de reconhecimento (aqui exemplificado como N1-N17) e dr2 corresponde à parte 3’ do sítio de reconhecimento (aqui exemplificado como N4-N20). A repetição direta está entre os nucleotídeos N4-N17.

Modalidades Detalhadas da Invenção

[0021] A presente invenção é baseada na constatação que a eficiência de vários dos métodos descritos, por exemplo, no WO2006/105946 (particularmente para as modalidades que apoiam-se na recombinação homóloga em ambos os lados do DNA de reparo) pode ser aumentada provendo um DNA de reparo específico onde a repetição de DNA direta (usada na etapa de remoção do marcador avaliável ou selecionável) consiste em uma extremidade em uma parte terminal 5’ do sítio pré-selecionado (reconhecido pela primeira enzima de indução de quebra de fita dupla) e por outro lado na parte terminal 3’ do sítio pré-selecionado. Deste modo o DNA de reparo não contém um sítio pré-selecionado propenso à clivagem pela primeira enzima de indução de quebra de fita dupla. No entanto, quando da indução de recombinação homóloga entre as sequências de nucleotídeo comuns às partes terminal 5’ e terminal 3’ do sítio pré-selecionado em repetição direta (que resulta na remoção de gene marcador selecionável ou avaliável intermitente), a sequência de nucleotídeo original do sítio pré-selecionado é reconstruída.

[0022] Então, em uma primeira modalidade, a invenção provê um método para troca de uma sequência de DNA-alvo no genoma, particularmente o genoma nuclear, de uma planta por uma sequência de DNA de interesse compreendendo as etapas que seguem: a) indução de uma primeira quebra DNA de fita dupla em um sítio pré-selecionado no genoma de uma célula da planta, o sítio pré-selecionado estando localizado dentro da sequência de DNA-alvo ou na vizinhança da sequência de DNA-alvo e o sítio pré-selecionado sendo reconhecido por uma primeira enzima de indução de quebra de fita dupla (DSBI) b) introdução de uma molécula de reparo de DNA na célula de planta, a molécula de reparo de DNA compreendendo i) a sequência de DNA de interesse localizada entre as duas regiões de flanqueamento de DNA tendo pelo menos 80% de homologia de sequência com uma região de DNA flanqueando a sequência de DNA-alvo, e preferivelmente flanqueando o sítio pré- selecionado no genoma da célula eucariótica; ii) um gene marcador selecionável ou avaliável localizado entre as regiões de flanqueamento de DNA, o gene selecionável ou avaliável estando ainda localizado entre uma primeira sequência de repetição consistindo na parte terminal 5’ do sítio pré-selecionado e uma segunda sequência consistindo na parte terminal 3’do sítio pré- selecionado, com o que as sequências comuns entre as primeira e segunda sequências de repetição estão em repetição direta; e iii) pelo menos um sítio de reconhecimento para uma segunda enzima DSBI localizada entre uma das regiões de flanqueamento de DNA e a primeira e a segunda sequência de repetição; c) seleção de uma população de células de planta compreendendo o marcador selecionável ou avaliável; d) seleção de uma célula de planta onde a sequência de DNA de interesse (e o marcador selecionável ou avaliável) foi introduzida através de recombinação homóloga através das regiões de flanqueamento de DNA, e regeneração de uma planta a partir da célula de planta; e) cruzamento da planta regenerada ou uma progênie da planta da mesma compreendendo o gene marcador selecionável com uma planta compreendendo uma enzima de indução de quebra de fita dupla ("DSBI") de clivagem rara codificando gene quimérico, o gene quimérico compreendendo os segmentos de DNA operavelmente ligados que seguem: iv. um promotor específico de linhagem germinativa, tal como um promotor específico de micrósporo; v. uma região de DNA codificando uma enzima de indução de quebra de DNA de fita dupla reconhecendo o sítio de reconhecimento localizado no DNA de interesse; vi. uma região de terminação de transcrição e poliadenilação; f) seleção de uma progênie da planta (planta F1) compreendendo o gene marcador selecionável ou avaliável e o gene quimérico de codificação da enzima DSBI. g) cruzamento da progênie da planta com outra planta com o que a progênie da planta é usada como doadora de pólen se o promotor específico de linhagem germinativa for um promotor expresso durante microsporogênese ou então a progênie da planta é usada como um aceitador de pólen se o promotor específico de linhagem germinativa for um promotor expresso durante macrosporogênese; h) seleção de uma população de plantas progênie (população F2) que compreende o gene quimérico de codificação de enzima DSBI; e i) seleção de uma progênie da planta onde o gene marcador selecionável ou avaliável é deletado através de recombinação homóloga entre uma das regiões de flanqueamento de DNA e uma região de DNA de flanqueamento parcial compreendendo parte de uma das regiões de flanqueamento de DNA.

[0023] Conforme aqui usado, "uma endonuclease de clivagem rara de indução de quebra de DNA de fita dupla" é uma enzima capaz de induzir uma quebra de DNA de fita dupla em uma sequência de nucleotídeo particular, chamado o "sítio de reconhecimento". Endonucleases de clivagem rara, também algumas vezes chamadas meganucleases têm um sítio de reconhecimento de 14 a 40 nucleotídeos consecutivos. Deste modo, as endonucleases de clivagem rara têm uma influência muito baixa de clivagem, mesmo nos genomas de planta maiores. Endonucleases homing constituem uma família de tais endonucleases de clivagem rara. Elas podem ser codificadas por íntrons, genes independentes ou sequências de intervenção, e apresentam propriedades estruturais e funcionais notáveis que as distinguem das enzimas de restrição mais clássicas, geralmente de sistemas de restrição-modificação do Tipo II bacteriano. Seus sítios de reconhecimento têm uma simetria geral que contrasta com a simetria díade característica da maioria dos sítios de reconhecimento de enzima de restrição. Várias endonucleases homing codificadas por íntrons ou inteínas foram mostradas promover a localização de seus respectivos elementos genéticos em sítios alélicos sem íntron e sem inteína. Ao realizar uma quebra de fita dupla específica de sítio em alelos sem íntron e sem inteína, essas nucleases criam extremidades recombinogênicas, que engajam em um processo de conversão de gene que duplica a sequência de codificação e leva à inserção de um íntron ou uma sequência de intervenção no nível de DNA.

[0024] Uma endonuclease homing bem-caracterizada é I-SceI. ISceI é uma endonuclease específica de sítio, responsável pela mobilidade do íntron em mitocôndria em Saccharomyces cerevisiae. A enzima é codificada pelo íntron opcional Sc LSU.1 do gene de rRNA 21S e inicia uma quebra de DNA de fita dupla no sítio de inserção de íntron gerando um corte escalonado com protuberâncias OH 3’. O sítio de reconhecimento da endonuclease I-SceI estende-se por uma sequência não-simétrica de 18 pb (Colleaux e outros, 1988, Proc. Natl. Acad. Sci, USA 85: 6022-6026). A sequência de aminoácido para ISceI e um equivalente de código universal do gene I-SceI mitocondrial foram providos pelo, por exemplo, WO 96/14408. O WO 96/14408 descreve ainda várias variantes da proteína I-SceI que são ainda funcionais.

[0025] O pedido PCT/EP04/013122 (incorporado aqui a título de referência) provê variantes de sequência de nucleotídeo sintéticas de I-SceI que foram otimizadas para expressão em plantas. A sequência de nucleotídeo de tais regiões de codificação de I-SceI é mostrada na SEQ ID NO:1 no código IUPAC. O símbolo do código IUPAC tem seu significado comum, isto é, N = A ou C ou G ou T; R = A ou G; Y = C ou T; B = C ou G ou T (não A); V = A ou C ou G (não T); D = A ou G ou T (não C); H = A ou C ou T (não G); K = G ou T; M = A ou C; S = G ou C; W = A ou T.

[0026] Uma lista de outras enzimas de indução de DSB de clivagem e seus respectivos sítios de reconhecimento é provida na Tabela I do WO 03/004659 (páginas 17 a 20) (incorporado aqui a título de referência). Essas incluem I-Sce I, I-Chu I, I-Dmo I, I-Cre I, I-Csm I, PI-Fli I, Pt-Mtu I, I-Ceu I, I-Sce II, I-Sce III, HO, PI-Civ I, PI-Ctr I, PI-Aae I, PI-BSU I, PI-DhaI, PI-Dra I, PI-Mav I, PI-Mch I, PI-Mfu I, PI-Mfl I, PI- Mga I, PI-Mgo I, PI-Min I, PI-Mka I, PI-Mle I, PI-Mma I, PI-Msh I, PI- Msm I, PI-Mth I, PI-Mtu I, PI-Mxe I, PI-Npu I, PI-Pfu I, PI-Rma I, PI-Spb I, PI-Ssp I, PI-Fac I, PI-Mja I, PI-Pho I, PI-Tag I, PI-Thy I, PI-Tko I ou PI-Tsp I.

[0027] Ainda, estão disponíveis métodos para elaborar endonucleases de clivagem raras feitas sob encomenda que reconhecem basicamente qualquer sequência de nucleotídeo-alvo de escolha. Em suma, enzimas de restrição quiméricas podem ser preparadas usando híbridos entre um domínio dedo de zinco elaborado para reconhecer uma sequência de nucleotídeo específica e o domínio de clivagem de DNA não-específico de uma enzima de restrição natural, tal como FokI. Tais métodos foram descritos, por exemplo, no WO 03/080809, WO94/18313 ou WO95/09233 e em Isalan e outros, 2001, Nature Biotechnology 19, 656-660; Liu e outros, 1997, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94, 5525-5530). Outro modo de produzir meganucleases feitas sob encomenda, através da seleção a partir de uma biblioteca de variantes, é descrito no WO2004/067736. Meganucleases feitas sob encomenda com especificidade de sequência e afinidade de ligação de DNA alteradas podem ser também obtidas através de elaboração racional conforme descrito no WO2007/047859.

[0028] Conforme aqui usado, um "sítio pré-selecionado" indica uma sequência de nucleotídeo particular no genoma nuclear da planta, localizado na ou próximo da sequência de DNA local onde é desejado inserir o DNA estranho ou trocar a sequência de DNA-alvo. Um versado na técnica seria capaz ou de escolher uma enzima de indução de quebra de DNA de fita dupla ("DSBI") reconhecendo a sequência de nucleotídeo-alvo selecionada ou engenheirar tal endonuclease DSBI. Alternativamente, um sítio de reconhecimento de endonuclease DSBI pode ser introduzido no genoma da planta usando qualquer método de transformação convencional ou através de cruzamento convencional usando uma linhagem de planta tendo um sítio de reconhecimento de endonuclease DSBI em seu genoma, e qualquer DNA estranho desejado pode em seguida ser introduzido naquele sítio-alvo pré-selecionado previamente introduzido.

[0029] As quebras de DNA de fita dupla na molécula de DNA de transformação podem ser induzidas convenientemente através da introdução transiente de um gene quimérico expressável em planta compreendendo uma região promotora expressável em planta operavelmente ligada a uma região de DNA codificando uma enzima de indução de quebra de fita dupla. A região de DNA codificando uma enzima de indução de quebra de fita dupla pode ser uma região de DNA sintético com uso de códon otimizado para planta. A própria endonuclease, como uma proteína, poderia ser também introduzida nas células de planta, por exemplo, através de eletroporação. No entanto, a endonuclease pode ser também provida de uma maneira transiente introduzindo no genoma de uma célula de planta ou planta, um gene quimérico compreendendo a região de codificação de endonuclease operavelmente ligada a um promotor expressável em planta induzível, e provisão do composto induzível apropriado por um período de tempo limitado antes, durante ou imediatamente após a introdução da molécula de DNA transformante. A endonuclease poderia ser também provida como um precursor de RNA codificando a endonuclease.

[0030] A enzima de indução de quebra de fita de DNA pode compreender, mas não precisa compreender, um sinal de localização nuclear (NLS), tal como o NLS de antígeno T grande de SV40 [Raikhel, Plant Physiol. 100: 1627-1632 (1992) e referências nele] [Kalderon e outros, Cell 39: 499-509 (1984)]. O sinal de localização nuclear pode estar localizado em qualquer lugar na proteína, mas está convenientemente localizado na extremidade N-terminal da proteína. O sinal de localização nuclear pode substituir um ou mais dos aminoácidos da enzima de indução de quebra de fita dupla.

[0031] Conforme aqui usado, a "sequência de DNA-alvo" é a sequência de DNA localizada no genoma da célula de planta que é modificada, através de adição, deleção ou substituição.

[0032] Conforme aqui usado, "regiões de flanqueamento de DNA" são sequências de DNA tendo homologia para as regiões de DNA respectivamente a montante ou a jusante da sequência de DNA-alvo. Isto permite controlar melhor a inserção do DNA estranho ou da molécula de DNA de interesse. Na verdade, integração através de recombinação homóloga vai permitir união precisa do fragmento de DNA estranho ao genoma nuclear da planta até o nível de nucleotídeo.

[0033] As regiões de flanqueamento de DNA podem variar em comprimento e devem ser de pelo menos cerca de 10 nucleotídeos de comprimento. No entanto, a região de flanqueamento pode ser o mais longo que for praticamente possível (por exemplo, até cerca de 100150 kb tais como cromossomos artificiais bacterianos completos (BACs)). Preferivelmente, a região de flanqueamento será de cerca de 50 pb a cerca de 2000 pb. Além disso, as regiões flanqueando o DNA estranho de interesse não precisam ser idênticas às regiões de DNA flanqueando o sítio pré-selecionado e podem ter entre cerca de 80% a cerca de 100% de identidade de sequência, preferivelmente cerca de 95% a cerca de 100% de identidade de sequência com as regiões de DNA flanqueando o sítio pré-selecionado. Quanto maior a região de flanqueamento, menos severa a necessidade de homologia. Ainda, é preferido que a identidade de sequência seja o mais alto praticamente possível na vizinhança da localização de inserção exata do DNA estranho. Ainda, para atingir troca da sequência de DNA-alvo sem mudança da sequência de DNA das sequências de DNA adjacentes, as sequências de DNA de flanqueamento devem preferivelmente ser idênticas às regiões de DNA flanqueando o sítio pré-selecionado.

[0034] Além disso, as regiões flanqueando o DNA estranho de interesse não precisam ter homologia com as regiões imediatamente flanqueando o sítio pré-selecionado, mas podem ter homologia com uma região de DNA do genoma nuclear mais remota daquele sítio pré- selecionado. Inserção do DNA estranho vai então resultar em uma remoção do DNA-alvo entre o sítio de inserção pré-selecionado e a região de DNA de homologia. Em outras palavras, o DNA-alvo localizado entre as regiões de homologia será substituído pelo DNA estranho de interesse.

[0035] Preferivelmente, o sítio pré-selecionado e a sequência de reconhecimento mencionada mais são reconhecidos por endonucleases de indução de quebra de fita dupla de clivagem rara diferentes.

[0036] Conforme aqui usado, flanqueada por duas sequências de DNA "dispostas em repetição direta" indica que a sequência a ser removida da molécula de DNA introduzida é imediatamente precedida e seguida por duas regiões de DNA, uma em cada extremidade, onde as regiões de DNA são essencialmente similares em sequência de nucleotídeo. De acordo com a invenção, as sequências de DNA dispostas em repetição direta são uma primeira sequência de DNA a montante da sequência a ser removida (isto é, o gene marcador selecionável ou avaliável) que consiste na parte terminal 5’ do sítio pré-selecionado (isto é, o sítio selecionado pela primeira enzima de clivagem rara de indução de quebra de fita dupla), enquanto a segunda sequência de DNA a jusante da sequência a ser removida consiste na parte terminal 3’ do sítio pré-selecionado. Ficará imediatamente claro à pessoa versada na técnica que sítios pré- selecionados diferentes podem diferir em comprimento e faixa, por exemplo, de 15 nucleotídeos a 50 nucleotídeos. Deste modo, uma sequência correspondendo à parte terminal 5’ da sequência pré- selecionada é uma sequência correspondendo à sequência de nucleotídeo da sequência pré-selecionada (ou sítio de reconhecimento) que não tem na extremidade 3’ daquela sequência um ou mais nucleotídeos, de modo que a "sequência terminal 5’" não é mais reconhecida e/ou clivada pela enzima de clivagem rara de indução de quebra de fita dupla. Similarmente, uma sequência correspondendo à parte terminal 3’ da sequência pré-selecionada é uma sequência correspondendo à sequência de nucleotídeo da sequência pré-selecionada (ou sítio de reconhecimento) que não tem na extremidade 5’ daquela sequência um ou mais nucleotídeos, de modo que a "sequência terminal 3’" não é mais reconhecida e/ou clivada pela enzima de clivagem rara de indução de quebra de fita dupla. A parte terminal 5’ e a parte terminal 3’ podem não ter 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 ou mais nucleotídeos. Além disso, não há nenhuma necessidade de que haja uma correspondência no número de nucleotídeos que não têm a parte terminal 5 e a parte terminal 3’. Por exemplo, embora a parte terminal 5’ possa não ter 2 nucleotídeos no sítio de reconhecimento na extremidade 3’, a parte terminal 3’ pode não ter 5 nucleotídeos do sítio de reconhecimento na extremidade 5’. As sequências reais em repetição direta, que vão permitir remoção da sequência de nucleotídeo localizada entre elas, correspondem à sequência de nucleotídeo comum entre a parte terminal 5’ e a parte terminal 3’. Embora o comprimento das sequências de repetição diretas reais vá depender do comprimento do sítio de reconhecimento ou sítio pré-selecionado bem como da quantidade de nucleotídeos que não têm respectivamente as extremidades 3’ e 5’, é preferido que a sequência de nucleotídeo em comum compreenda pelo menos 5 ou 10 ou 14 ou mais nucleotídeos. Referência é feita à figura 3 quanto a uma representação esquemática de uma parte terminal 5’ (dr1) e uma parte terminal 3’ de um sítio pré-selecionado hipotético ou sítio de reconhecimento.

[0037] Ficará imediatamente claro a uma pessoa versada na técnica que para o propósito da presente invenção o DNA de reparo não contém o sítio pré-selecionado. Para esta finalidade, o marcador selecionável ou avaliável deve preferivelmente ser imediatamente flanqueado pelas sequências de repetição diretas ou pela parte terminal 5’ e as partes terminais 3’ do sítio pré-selecionado. Preferivelmente, uma das sequências (parte terminal 5’ ou parte terminal 3’) deve estar localizada no DNA de reparo em sua posição correspondente com relação ao DNA-alvo.

[0038] Para evitar dúvida, se as duas regiões de DNA similares em sequência de nucleotídeo estiverem contidas dentro de uma molécula de DNA de fita dupla, essas sequências de DNA devem estar localizadas na mesma fita de DNA, na mesma direção 5’->3’.

[0039] Para o propósito da presente invenção, a "identidade de sequência" de duas sequências de nucleotídeo ou aminoácido relacionadas, expressa como uma porcentagem, se refere ao número de posições nas duas sequências otimamente alinhadas que têm resíduos idênticos (x100) dividido pelo número de posições comparado. Uma lacuna, isto é, uma posição em um alinhamento onde um resíduo está presente em uma sequência, mas não em outra, é considerada uma posição com resíduos não-idênticos. O alinhamento das duas sequências é realizado pelo algoritmo Needleman e Wunsch (Needleman e Wunsch, 1970). Alinhamento de sequência auxiliado por computador pode ser convenientemente realizado usando programa de software padrão tal como GAP que é parte do Wisconsin Package Versão 10.1 (Genetics Computer Group, Madison, Wisconsin, USA) usando a matriz de substituição padrão com uma penalidade de criação de lacuna de 50 e uma penalidade de extensão de lacuna de 3.

[0040] Conforme aqui usado, "localizado na vizinhança" se refere à DSBI estando localizada em uma distância entre 500 pb, 1 kpb a 10 kpb da sequência de DNA de referência.

[0041] De acordo com a presente invenção, pelo menos um sítio de reconhecimento para uma segunda enzima de clivagem rara de indução de quebra de fita dupla está localizado entre as repetições diretas. No caso onde dois tais sítios de reconhecimento estiverem presentes, tais sítios de reconhecimento ou partes dos mesmos podem estar presentes em repetições diretas e recombinação homóloga entre dois tais sítios ou subpartes dos mesmos pode remover o marcador selecionável ou avaliável. Quando de tal recombinação homóloga, no entanto, um sítio de reconhecimento intacto para a segunda enzima de clivagem rara de indução de quebra de fita dupla é gerado, e as primeira e segunda sequências de repetição diretas que são parte do sítio pré-selecionado são trazidas em contato mais próximo através da deleção das sequências intervenientes. Tal constelação de sequências de repetição direta em vizinhança próxima, flanqueando um sítio de reconhecimento para uma enzima de indução de quebra de fita dupla, é benéfica para induzir recombinação eficiente alta entre as duas sequências de repetição direta deletando as sequências intervenientes restantes.

[0042] Os métodos descritos aqui para uso em plantas podem ser convenientemente realizados usando um gene quimérico codificando uma enzima de indução de quebra de fita dupla de clivagem rara, com o que a região de codificação para a endonuclease está sob controle de um fragmento de promotor específico de linhagem germinativa.

[0043] Conforme aqui usado, um "promotor específico de linhagem germinativa" é uma região promotora, promotor ou fragmento que pode promover transcrição seletivamente, preferivelmente especificamente em células de planta que por fim produzem os gametas partindo da célula-mãe do megásporo de ou o meiócito. Promotores específicos de linhagem germinativa conforme aqui definido então incluem promotor específico de gametófito, promotores específicos de gameta, promotores que controlam a expressão de micrósporos e/ou megásporos ou em suas células precursoras imediatas respectivas.

[0044] Conforme aqui usado, um "promotor específico para gametogênese" é uma região promotora, promotor ou fragmento que pode promover transcrição seletivamente, preferivelmente especificamente em células de planta que são as células precursoras imediatas dos gametas.

[0045] Em plantas angiosperma, reprodução sexual requer a produção de gametófitos masculinos e femininos. Pólen, como o gametófito masculino, é formado dentro da antera e é iniciado a partir de células esporogênicas, que se desenvolvem em meiócitos. O meiócito sofre meiose para formar uma tétrade de micrósporos haplóides, que são subsequentemente liberados para o locule da antera. Seguindo expansão e vacuolização, uma mitose assimétrica do micrósporo resulta em pólen bicelular, contendo uma célula vegetativa e uma geradora. Na maioria das espécies, pólen é solto em condição bicelular. O gametófito fêmea, o saco embrionário, inicia no ovário da célula-mãe do megásporo ou megasporócito através de duas divisões meióticas, resultando na formação de uma tétrade linear de megásporos haplóides. O megásporo calazal aumenta na preparação para a primeira divisão mitótica no desenvolvimento do gametófito fêmea, enquanto os outros três megásporos degeneram. Divisões mitóticas acontecem em três gerações de núcleo de modo que oito sacos de embrião nucleados são formados. Durante essas divisões, a primeira célula de megásporo aumenta e fica muito vacuolada. A célula nucleada oito vezes é organizada no saco de embrião de sete células através da delimitação por paredes de célula de seis dos núcleos e citoplasma associado. As três células na extremidade micropilar constituem o aparelho de ovo que é composto do ovo e dois sinergídios. Na extremidade oposta do saco embrionário estão três células antipodais. Entre os dois grupos de células está a célula central grande contendo dois núcleos polares, que podem fundir antes da fertilização e formar o núcleo do endosperma secundário diplóide.

[0046] Conforme aqui usado "uma região promotora específica de micrósporo" ou "um promotor específico de micrósporo" ou "um fragmento de promotor específico de micrósporo" é uma região promotora ou promotor ou fragmento de promotor que pode promover transcrição seletivamente, preferivelmente especificamente, no micrósporo unicelular de uma planta. Uma região promotora específica de micrósporo é descrita no WO 97/30166 (incorporado aqui a título de referência) como a região promotora do gene NTM19 em tabaco e seu uso em um método para troca direcionada em plantas é exemplificado no WO2006/105946.

[0047] Conforme aqui usado "uma região promotora específica de megásporo" ou "um promotor específico de megásporo" ou um "fragmento de promotor específico de megásporo" é uma região promotora ou promotor ou fragmento de promotor que pode promover transcrição seletivamente, preferivelmente especificamente, em um megásporo unicelular de uma planta, preferivelmente um megásporo que se desenvolve em um saco embrionário.

[0048] Promotores particulares tal como BnSKP1yj podem controlar transcrição especificamente ou seletivamente ambos em micrósporos e megásporos de plantas (Drouad e outros, 2000, Sex Plant Reprod. 13:29-35).

[0049] Promotores específicos de linhagem germinativa adequados adicionais exemplificados no pedido de patente provisória US 60/828.042 e Pedido de patente europeia 06020370.0 podem ser qualquer um dos que seguem (as citações abaixo são aqui incorporadas a título de referência): i. um promotor compreendendo um aparelho de ovo (EA) de Arabidopsis fundido a um elemento promotor mínimo tal como um promotor 35S mínimo, conforme descrito por Yang e outros, 2005, Plant Physiol. 139(3):1421-1432. ii. um promotor TAG1 de Arabidopsis conforme descrito por Galli e outros, 2003, Genetics. 165(4):2093-2105 (expresso em gametófitos masculinos e femininos). iii. um promotor Duo1 de Arabidopsis (atividade de célula geradora masculina e de célula de esperma conforme descrito por Rotman e outros, 2005, Curr. Biol. 15(3):244-248. iv. promotores conforme poderiam ser isolados dos genes gametofíticos fêmeas descritos por Yu e outros, 2005, Plant Physiology, 139(4):1853-1869 v. um promotor de LGC1 de Lilium expresso em célula geradora masculina e células de esperma (Xu e outros, 1999, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96(5):2554-2558; Singh e outros, 2003 FEBS Lett. 2003 542(1-3):47-52. vi. um promotor do homólogo de ERCC1 expresso em células de esperma masculino (Xu e outros, 1998, Plant. J., 13(6):823- 829). vii. um promotor de genes da histona H2A ou H3 (Xu e outros, 1999, "Male gametic cell-specific expression of H2A and H3 histone genes". Plant Molecular Biology, 39, 607-614; Okada e outros (2005) "Transcriptional activity of male gamete-specific histone gcH3 promoter in sperm cell of Lilium longiflorum". Plant and Cell Physiology, 46, 797-802). viii. promotores de genes de célula de esperma conforme identificado em arroz (Chen, Schuam University, Acessos no GenBank BE225314 a BE225323, BF475189 a BF475237) e conforme identificado em milho (Engel e outros, 2003, The Plant Journal, 34: 697-707). ix. o promotor Zmeal (Marton e outros, Science, 2005, 307573-576) e promotores Zmes (Cordts e outros, Plant. J. 2001, 25(1):103-114). x. promotores compreendendo elementos silenciadores reconhecidos por GRSF ou fator de silenciamento restritivo de linhagem germinativa (Haerizadeh e outros, 2006, Science, 28 313: pp. 496-499). xi. promotor BnM1 ou BnM3.4 descrito por Guerche e outros, 1999, (Plant Molecular Biology, 40: 857-872) e promotores direcionando a expressão de cDNAs específicos de micrósporo M21.

[0050] Conforme aqui usado, "região de codificação para uma endonuclease de indução de quebra de fita dupla de clivagem rara" ou "região de codificação para uma enzima de indução de quebra de fita dupla de clivagem rara" é uma sequência de nucleotídeo que codifica um polipeptídeo que é caracterizado como uma enzima DSBI de clivagem rara tal como as endonucleases homing ou as endonucleases quiméricas descritas em outro ponto no presente pedido. A região de codificação pode então compreender qualquer sequência de nucleotídeo que codifique qualquer uma das sequências de aminoácido das endonucleases homing listadas na tabela que segue, que podem ser encontradas em bancos de dados públicos sob os números de acesso mencionados (todos aqui incorporados a título de referência):

[0051] Ficará claro que para expressão das endonucleases sob o controle de um fragmento de promotor específico de micrósporo, a região de codificação deve ser adaptada de modo que a linguagem de códon universal seja usada para codificar os polipeptídeos acima mencionados. A região de codificação pode ser otimizada mais para expressão em plantas e a região de codificação sintética pode ter uma sequência de nucleotídeo que foi elaborada para satisfazer os critérios que seguem: a) a sequência de nucleotídeo codifica uma endonuclease de indução de quebra de fita dupla de clivagem rara funcional b) a sequência de nucleotídeo tem um teor de GC de cerca de 50% a cerca de 60% c) a sequência de nucleotídeo não compreende uma sequência de nucleotídeo selecionada do grupo consistindo em GATAAT, TATAAA, AATATA, AATATT, GATAAA, AATGAA, AATAAG, AATAAA, AATAAT, AACCAA, ATATAA, AATCAA, ATACTA, ATAAAA, ATGAAA, AAGCAT, ATTAAT, ATACAT, AAAATA, ATTAAA, AATTAA, AATACA e CATAAA; d) o nucleotídeo não compreende uma sequência de nucleotídeo selecionada do grupo consistindo em CCAAT, ATTGG, GCAAT e ATTGC; e) a sequência de nucleotídeo não compreende uma sequência selecionada do grupo consistindo em ATTTA, AAGGT, AGGTA, GGTA ou GCAGG; f) a sequência de nucleotídeo não compreende uma extensão GC consistindo em 7 nucleotídeos consecutivos selecionados do grupo de G ou C; g) a sequência de nucleotídeo não compreende uma extensão de GC consistindo em 5 nucleotídeos consecutivos selecionados do grupo de A ou T; e h) a sequência de nucleotídeo não compreende códons codificando Leu, Ile, Val, Ser, Pro, Thr, Ala que compreendem dupletos TA ou CG nas posições 2 e 3 (isto é, a sequência de nucleotídeo não compreende os códons TTA, CTA, ATA, GTA, TCG, CCG, ACG e GCG).

[0052] A enzima de indução de quebra de fita dupla pode compreender, mas não precisa compreender, um sinal de localização nuclear (NLS) [Raikhel, Plant Physiol. 100: 1627-1632 (1992) e referências nele], tal como o NLS de antígeno T grande de SV40 [Kalderon e outros, Cell 39:499-509 (1984)]. O sinal de localização nuclear pode estar localizado em qualquer lugar na proteína, mas está convenientemente localizado na extremidade N-terminal da proteína. O sinal de localização nuclear pode substituir um ou mais dos aminoácidos da enzima de indução de quebra de fita dupla.

[0053] Tendo compreendido os princípios de base da presente invenção, um versado na técnica vai compreender que o método pode ser usado em células de organismos eucariontes diferentes de plantas.

[0054] Então, em outra modalidade da invenção, é provido um método para troca de uma sequência de DNA-alvo no genoma de uma célula eucariótica ou organismo eucariótico por uma sequência de DNA de interesse compreendendo as etapas que seguem: i) indução de uma primeira quebra de DNA de fita dupla em um sítio pré-selecionado no genoma de uma célula do organismo eucariótico, o sítio pré-selecionado estando localizado dentro da sequência de DNA-alvo ou na vizinhança da sequência de DNA-alvo e o sítio pré-selecionado sendo reconhecido por uma primeira enzima de indução de quebra de fita dupla (DSBI); j) introdução de uma molécula de reparo de DNA na célula eucariótica, a molécula de reparo de DNA compreendendo k) a sequência de DNA de interesse localizada entre duas regiões de flanqueamento de DNA tendo pelo menos 80% de homologia de sequência com uma região de DNA flanqueando a sequência de DNA-alvo e preferivelmente flanqueando o sítio pré- selecionado no genoma da célula eucariótica; l) . um gene marcador selecionável ou avaliável localizado entre as regiões de flanqueamento de DNA, o gene marcador selecionável ou avaliável estando ainda localizado entre uma primeira sequência de repetição consistindo na parte terminal 5’ do sítio pré- selecionado e uma segunda sequência consistindo na parte terminal 3’ do sítio pré-selecionado, com o que as sequências comuns entre as primeiras e segunda sequências de repetição estão em repetição direta; e m) i. pelo menos um sítio de reconhecimento para uma segunda enzima DSBI localizada entre uma das regiões de flanqueamento de DNA e a primeira e a segunda sequência de repetição; i. seleção de uma população de células compreendendo o marcador selecionável ou avaliável; j. seleção de uma célula onde o marcador selecionável ou avaliável foi introduzido através de recombinação homóloga através das regiões de flanqueamento de DNA; k. introdução de uma quebra de fita dupla no sítio de reconhecimento para a segunda enzima DSBI na célula; l. seleção de uma célula progênie onde o gene marcador selecionável ou avaliável é deletado através de recombinação homóloga entre as repetições diretas deste modo recriando o sítio pré- selecionado.

[0055] Os termos aqui definidos com relação ao seu significado em células de planta podem ser aplicados mutatis mutandis para se aplicarem a células eucarióticas, particularmente células eucarióticas superiores tais como vertebrados, animais, mamíferos em geral.

[0056] Ficará também claro que os termos usados para descrever o método tal como "introdução de um fragmento de DNA" bem como "regeneração de uma planta a partir da célula" não implicam que tal fragmento de DNA necessariamente precise ser introduzido através de técnicas de transformação. Na verdade, ficará imediatamente claro para o versado na técnica que a molécula de DNA de interesse pode ser também introduzida através de técnicas de reprodução ou cruzamento de uma planta para a outra.

[0057] No entanto, ficará claro que a molécula de DNA de interesse pode ser introduzida nas células de planta através de qualquer método conhecido na técnica, incluindo transformação mediada por Agrobacterium, mas também através de métodos de transferência de DNA. A molécula de DNA transformante pode ser transferida para células de planta usando qualquer método convencional incluindo, mas não limitado a, método de transferência de DNA direta. Conforme aqui usado, "transferência de DNA direta" é qualquer método de introdução de DNA em células de planta que não envolve o uso de Agrobacterium spp. natural e que é capaz de introduzir DNA em células de planta. Isto inclui métodos bem- conhecidos no campo tal como introdução de DNA através de eletroporação em protoplastos, introdução de DNA através de eletroporação em células de planta intactas ou tecidos ou células de planta parcialmente degradados, introdução de DNA através da ação de agentes tal como PEG e similar, em protoplastos, uso de filamentos de silício e bombardeamento com microprojéteis revestidos com DNA.

[0058] O DNA pode ser integrado através de recombinação homóloga ou métodos de união de extremidade não-homólogos envolvendo uma indução de quebra de fita dupla em um local predeterminado conforme descrito, por exemplo, no PCT/EP04/013122.

[0059] "Marcadores selecionáveis ou avaliáveis" conforme aqui usado têm seu significado comum na técnica e incluem, mas não estão limitados a, fosfinotricina acetiltransferase, neomicina fosfotransferase, glifosato oxidase, enzimas EPSP tolerantes a glifosato, gene nitrilase, acetolactato sintase mutante ou gene da aceto-hidroxiácido sintase, β-glucuronidase (GUS), genes de lócus R, proteína verde fluorescente e similar expressáveis em planta.

[0060] A seleção da célula de planta ou planta onde o marcador selecionável ou avaliável e o resto da molécula de DNA estranha foram introduzidos através de recombinação homóloga através das regiões de flanqueamento de DNA pode, por exemplo, ser conseguida através da avaliação da ausência de sequências presentes no DNA transformante, mas localizadas fora das regiões de flanqueamento de DNA. Na verdade, presença de sequências do DNA transformante fora das regiões de flanqueamento de DNA indicaria que as células de planta transformadas se originaram através de inserção de DNA aleatória. Para esta finalidade, marcadores selecionados ou avaliáveis podem ser incluídos na molécula de DNA transformante fora das regiões de flanqueamento de DNA, que podem então ser usados para identificar aquelas células de planta que não têm os marcadores selecionáveis ou avaliáveis localizados fora do DNA de transformação e que podem ter surgido através de recombinação homóloga através das regiões de flanqueamento de DNA. Alternativamente, a molécula de DNA transformante pode conter marcadores selecionáveis fora das regiões de flanqueamento de DNA para permitir seleção quanto à ausência de tais genes (genes marcadores selecionáveis negativos).

[0061] Será compreendido que o meio e métodos da invenção podem ser usados em qualquer planta capaz de reprodução através de pólen ou células ovo, incluindo milho, tabaco, plantas cereais incluindo plantas de trigo, aveia, cevada, centeio, arroz, grama, sorgo, painço ou cana-de-açúcar. Os métodos da invenção podem ser também aplicados a qualquer planta (Angiospermae ou Gymnospermae) incluindo, mas não limitado a, algodão, canola, óleo de semente de colza, soja, vegetais, batatas, Lemna spp., Nicotiana spp., Arabidopsis, alfafa, cevada, feijão, milho, algodão, cânhamo, ervilha, colza, arroz, centeio, açafrão, sorgo, soja, girassol, tabaco, trigo, aspargo, beterraba, brócolis, repolho, cenoura, couve-flor, aipo, pepino, berinjela, alface, cebola, óleo de semente de colza, pimenta, batata, abóbora, rabanete, espinafre, abóbora, tomate, abobrinha, amêndoa, maçã, damasco, banana, amora silvestre, mirtilo, cacau, cereja, coco, amora, tâmara, uva, toranja, goiaba, kiwi, limão, lima, manga, melão, nectarina, laranja, mamão, maracujá, pêssego, amendoim, pera, abacaxi, pistache, ameixa, framboesa, morango, tangerina, noz e melancia.

[0062] É também um objetivo da invenção prover células de planta e plantas geradas de acordo com os métodos da invenção. Gametas, sementes, embriões, ou zigóticos ou somáticos, progênie ou híbridos de plantas compreendendo os eventos de inserção de DNA, que são produzidos através de métodos de reprodução tradicionais, são também incluídos no escopo da presente invenção. Tais plantas podem conter uma sequência de DNA heteróloga ao invés de uma sequência-alvo, e será apenas diferente de suas plantas progenitoras pela presença deste DNA ou sequência de DNA heterólogo pós-troca.

[0063] As plantas obtidas através dos métodos descritos aqui podem ser cruzadas ainda através de técnicas de reprodução tradicionais com outras plantas para obter plantas progênies compreendendo os eventos de inserção de DNA-alvo obtidos de acordo com a presente invenção.

[0064] Os Exemplos não-limitantes que seguem descrevem a remoção de um subfragmento selecionado de uma molécula de DNA introduzida usando uma enzima de indução de quebra de DNA de fita dupla, tal como I-SceI, e repetições diretas que são subfragmentos de um sítio de reconhecimento de I-CeuI.

[0065] A menos que de outro modo declarado nos Exemplos, todas as técnicas de DNA recombinante são realizadas de acordo com protocolos padrão conforme descrito em Sambrook e outros (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Segunda Edição, Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY e nos Volumes 1 e 2 de Ausubel e outros (1994) Current Protocols in Molecular Biology, Current Protocols, USA. Materiais e métodos padrão para trabalho molecular em planta são descritos em Plant Molecular Biology Labfax (1993) de R.D.D. Croy, publicado em conjunto pela BIOS Scientific Publications Ltd. (RU) e Blacwell Scientific Publications, RU. Outras referências a técnicas de biologia molecular padrão incluem Sambrook e Russell (2001) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Terceira Edição, Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY, Volumes I e II de Brown (1998), Molecular Biology LabFlax, Segunda Edição, Academic Press (RU). Materiais e métodos padrão para reações em cadeia de polimerase podem ser encontrados em Dieffenbach e Dveksler (1995) PCR Primer: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press e em McPherson e outros (2000) PCR - Basics: From Backgroun to Bench, Primeira Edição, Springer Verlag, Alemanha.

[0066] Em todo o relatório descritivo e Exemplos, referência é feita às sequências que seguem: SEQ ID NO:1 : Sequência de nucleotídeo de região de codificação de I-SceI sintética (código IUPAC) SEQ ID NO:2 : sequência de nucleotídeo de região de codificação de I-SceI sintética. SEQ ID NO: 3 sequência de nucleotídeo do sítio de reconhecimento de I-SceI. SEQ ID NO:4 : sequência de nucleotídeo do sítio de reconhecimento de I-CeuI

Exemplos

[0067] Usando técnicas de DNA recombinante convencionais um vetor de T-DNA é construído compreendendo os fragmentos de DNA operavelmente ligados que seguem: • uma região de promotor 35S de CaMV • uma região de DNA codificando a parte N-terminal não- funcional de marcador avaliável (por exemplo, β-glucuronidase) • uma sequência de DNA consistindo na região terminal 5’ de 22 nucleotídeos do sítio de reconhecimento de I-CeuI (SEQ ID NO:4) • um gene marcador selecionável (tal como fosfinotricina acetiltransferase expressável por planta) • um sítio de reconhecimento de I-SceI (SEQ ID NO:3) • uma sequência de DNA consistindo na região terminal 3’ de 22 nucleotídeos do sítio de reconhecimento de I-CeuI • uma região de DNA codificando a parte C-terminal não- funcional do marcador avaliável (de modo que quando da recombinação homóloga entre as duas sequências de repetição derivadas de I-CeuI uma região de codificação funcional para o marcador selecionável é gerada). • uma região de extremidade 3’ envolvida em terminação de transcrição e poliadenilação.

[0068] O T-DNA é introduzido em células de planta de tabaco, e plantas transgênicas são regeneradas como convencional na técnica. Essas linhagens de planta de tabaco transgênicas podem ser usadas convenientemente para determinar se recombinação homóloga acontece entre as duas subpartes do sítio de reconhecimento de I- CeuI, resultando em uma remoção do gene marcador selecionável e geração de um marcador avaliável intacto.

[0069] Plantas de tabaco transgênicas expressando I-SceI sob controle do promotor específico de micrósporo de NTM19 ligado a um gene de resistência à neomicina foram descritas no WO2006/105946. De uma maneira similar, plantas de tabaco transgênicas expressando I-CeuI sob controle do promotor específico de micrósporo do gene NTM19 são geradas.

[0070] Plantas transgênicas contendo o construto de teste são cruzadas com plantas de tabaco transgênicas expressando I-SceI sob controle de promotor específico de micrósporo do NTM19 ou com plantas de tabaco transgênicas expressando I-CeuI sob controle do promotor específico de micrósporo do NTM19, e plantas progênies compreendendo ambos o construto de teste e a região de I-SceI ou I- CeuI quimérica são identificadas. Essas plantas são usadas como doadores de pólen para polinar uma planta não-transgênica.

[0071] Plantas progênies do cruzamento inicial entre plantas transgênicas contendo o construto de teste e plantas expressando I- CeuI não mostram uma frequência aumentada de recombinação homóloga, enquanto plantas progênies do cruzamento inicial entre plantas transgênicas contendo o construto de teste e plantas expressando I-SceI exibem uma frequência aumentada de recombinação homóloga.

[0072] Para testar se recombinação homóloga pode acontecer entre sequências de DNA curtas de 16 nucleotídeos idênticas em comprimento, um vetor de T-DNA foi construído o qual contém sequências de borda de T-DNA direita e esquerda com um gene quimérico selecionável no meio das bordas de T-DNA compreendendo um promotor de nopalina sintase, operavelmente ligado a uma região de codificação nptII e uma região de terminação do gene da nopalina sintase e um construto quimérico adicional compreendendo em ordem: a. uma região promotora constitutiva b. uma sequência de nucleotídeo de 16 nucleotídeos c. um sítio de reconhecimento para I-SceI d. uma região de DNA codificando proteína verde fluorescente (GFP) e. um sítio de reconhecimento para I-SceI em orientação invertida com relação ao sítio de I-SceI sub c) f. a mesma sequência de nucleotídeo de 16 nucleotídeos como sub b) g. uma região de DNA codificando β-glucuronidase (GUS) h. uma região terminadora do gene nopalina sintase

[0073] Plantas de tabaco transgênicas foram geradas através de transformação de disco de folha usando Agrobacterium tumefaciens (EHA105) compreendendo o vetor de T-DNA descrito acima com o que seleção foi realizada para células de planta resistentes à canamicina.

[0074] Conforme esperado, nenhuma expressão de GUS foi observada em folhas de plantas transgênicas, e quatro linhagens T0 transgênicas diferentes com uma expressão de GFP clara e nenhuma expressão de GUS foram selecionadas.

[0075] A partir das células de planta selecionadas, calos transgênicos são obtidos e plantas são regeneradas. Tecido de planta e/ou tecido de calo são avaliados quanto à expressão de GFP e GUS. Em plantas onde uma recombinação homóloga aconteceu entre a sequência de repetição direta de 16 nucleotídeos, a região de codificação para GFP é deletada e a região de codificação para GUS é posta sob controle do promotor constitutivo. O material de planta é consequentemente negativo para expressão de GFP e positivo para expressão de GUS. Do material de planta negativo para GFP, positivo para GUS, o fragmento de DNA a jusante do promotor constitutivo é amplificado através de PCR e a sequência de nucleotídeo determinada para determinação de se recombinação homóloga aconteceu através da repetição direta de 16 nt.

Claims

1. Processo para troca de uma sequência de DNA-alvo no genoma de uma célula de planta ou planta por uma sequência de DNA de interesse, caracterizado pelo fato de que compreende as etapas que seguem: a. indução de uma primeira quebra de DNA de fita dupla em um sítio pré-selecionado no genoma de uma célula da dita planta, o dito sítio pré-selecionado estando localizado dentro da dita sequência de DNA-alvo ou na vizinhança da dita sequência de DNA-alvo e o dito sítio pré-selecionado sendo reconhecido por uma primeira enzima de indução de quebra de fita dupla (DSBI); b. introdução de uma molécula de reparo de DNA na dita célula de planta, a dita molécula de reparo de DNA compreendendo: i. a dita sequência de DNA de interesse localizada entre duas regiões de flanqueamento de DNA compreendendo uma sequência de pelo menos 10 nt da região de DNA flanqueando a sequência de DNA- alvo, no genoma da dita célula de planta; ii. um gene marcador selecionável ou avaliável localizado entre as ditas regiões de flanqueamento de DNA, o dito gene marcador selecionável ou avaliável estando ainda localizado entre uma primeira sequência de DNA a montante do dito gene marcador selecionável ou avaliável, a dita primeira sequência de DNA consistindo na parte termi-nal 5’ do dito sítio pré-selecionado e uma segunda sequência de DNA a jusante do dito gene marcador selecionável ou avaliável, a dita segunda sequência de DNA consistindo na parte terminal 3’ do sítio pré-selecio- nado, sendo que a dita parte terminal 5’ do dito sítio pré-selecionado consiste na sequência de nucleotídeo do sítio pré-selecionado que não possui no terminal 3’ da dita sequência um ou mais nucleotídeos de forma que a dita parte terminal 5’ do dito sítio pré-selecionado não é mais reconhecida ou clivada pela dita primeira enzima DSBI, e sendo que a dita parte terminal 3’ do dito sítio pré-selecionado consiste na se-quência de nucleotídeo do sítio pré-selecionado que não possui no ter-minal 5’ da dita sequência um ou mais nucleotídeos de forma que a dita parte terminal 3’ não é mais reconhecida ou clivada pela dita primeira enzima DSBI, através da qual as sequências de nucleotídeos comuns entre a dita parte terminal 5’ e a dita parte terminal 3’ compreende pelo menos 10 nucleotídeos e as ditas primeira e segunda sequências de DNA estão localizadas na mesma fita de DNA na mesma direção 5’ para 3’; e iii. pelo menos um sítio de reconhecimento para uma se-gunda enzima DSBI localizada entre a dita uma das regiões de flanque- amento de DNA e as ditas primeira e a segunda sequências de DNA a montante e a jusante do dito gene marcador selecionável ou avaliável; c. seleção de uma população de células compreendendo o dito marcador selecionável ou avaliável; d. seleção de uma célula onde o dito marcador selecionável ou avaliável foi introduzido através de recombinação homóloga através das ditas regiões de flanqueamento de DNA; e. introdução de uma quebra de fita dupla no sítio de reco-nhecimento para a dita segunda enzima DSBI na dita célula e, f. seleção de uma progênie celular onde o gene marcador selecionável ou avaliável é deletado através de recombinação homó-loga entre as ditas primeira e a segunda sequências de DNA a montante e a jusante do dito gene marcador selecionável ou avaliável, deste modo recriando o dito sítio pré-selecionado.

2. Processo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a dita primeira quebra de fita dupla no dito sítio pré- selecionado é induzida através da introdução de uma primeira enzima DSBI, a dita primeira enzima DSBI não reconhecendo o dito sítio de re-conhecimento para a dita segunda enzima DSBI localizada no dito DNA de reparo.

3. Processo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a dita primeira enzima DSBI e a dita segunda enzima DSBI são duas enzimas DSBI diferentes selecionadas do grupo de I- Sce I, I-Chu I, I-Dmo I, I-Cre I, I-Csm I, PI-Fli I, Pt-Mtu I, I-Ceu I, I-Sce II, I-Sce III, HO, PI-Civ I, PI-Ctr I, PI-Aae I, PI-BSU I, PI-DhaI, PI-Dra I, PI- Mav I, PI-Mch I, PI-Mfu I, PI-Mfl I, PI-Mga I, PI-Mgo I, PI-Min I, PI-Mka I, PI-Mle I, PI-Mma I, PI-Msh I, PI-Msm I, PI-Mth I, PI-Mtu I, PI-Mxe I, PI- Npu I, PI-Pfu I, PI-Rma I, PI-Spb I, PI-Ssp I, PI-Fac I, PI-Mja I, PI-Pho I, PI-Tag I, PI-Thy I, PI-Tko I ou PI-Tsp I ou uma endonuclease quimérica compreendendo um domínio de ligação de DNA dedo de Zn e um domínio de clivagem de DNA.

4. Processo, de acordo com qualquer uma das reivindica-ções 1 a 3, caracterizado pelo fato de que a dita segunda enzima DSBI é I-SceI.

5. Processo, de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo fato de que a dita segunda enzima DSBI é uma enzima codificada pela sequência de nucleotídeo da SEQ ID NO:1 ou SEQ ID NO:2.

6. Processo para troca de uma sequência de DNA-alvo no genoma, particularmente o genoma nuclear, de uma planta por uma se-quência de DNA de interesse, caracterizado pelo fato de que compre-ende as etapas que seguem: (a) indução de uma primeira quebra de DNA de fita dupla em um sítio pré-selecionado no genoma de uma célula da dita planta, o dito sítio pré-selecionado estando localizado dentro da dita sequência de DNA-alvo ou na vizinhança da dita sequência de DNA-alvo e o dito sítio pré-selecionado sendo reconhecido por uma primeira enzima de indução de quebra de fita dupla (DSBI) (b) introdução de uma molécula de reparo de DNA na dita célula de planta, a dita molécula de reparo de DNA compreendendo (i) a dita sequência de DNA de interesse localizada entre duas regiões de flanqueamento de DNA compreendendo uma sequên-cia de pelo menos 10 nt da região de DNA flanqueando a dita sequência de DNA-alvo no genoma da dita célula de planta; (ii) um gene marcador selecionável ou avaliável localizado entre as ditas regiões de flanqueamento de DNA, o dito gene marcador selecionável ou avaliável estando ainda localizado entre uma primeira sequência de DNA a montante do dito gene marcador selecionável ou avaliável, a dita primeira sequência de DNA consistindo na parte termi-nal 5’ do dito sítio pré-selecionado e uma segunda sequência de DNA a jusante do dito gene marcador selecionável ou avaliável, a dita segunda sequência de DNA consistindo na parte terminal 3’do dito sítio pré-sele- cionado, sendo que a dita parte terminal 5’ do dito sítio pré-selecionado consiste na sequência de nucleotídeo do sítio pré-selecionado que não possui no terminal 3’ da dita sequência um ou mais nucleotídeos de forma que a dita parte terminal 5’ do dito sítio pré-selecionado não é mais reconhecida ou clivada pela dita primeira enzima DSBI, e sendo que a dita parte terminal 3’ do dito sítio pré-selecionado consiste na sequência de nucleotídeo do sítio pré-selecionado que não possui no terminal 5’ da dita sequência um ou mais nucleotídeos de forma que a dita parte terminal 3’ não é mais reconhecida ou clivada pela dita primeira enzima DSBI, através da qual as sequências de nucleotídeos comuns entre a dita parte terminal 5’ e a dita parte terminal 3’ compreende pelo menos 10 nucleotídeos e as ditas primeira e segunda sequências de DNA estão localizadas na mesma fita de DNA na mesma direção 5’ para 3’; e (iii) pelo menos um sítio de reconhecimento para uma se-gunda enzima DSBI localizada entre uma das ditas regiões de flanque- amento de DNA e a dita primeira e a dita segunda sequência de DNA a montante e a jusante do dito gene marcador selecionável ou avaliável; (c) seleção de uma população de células de planta compre-endendo o marcador selecionável ou avaliável; (d) seleção de uma célula de planta onde a sequência de DNA de interesse e o marcador selecionável ou avaliável foi introduzida através de recombinação homóloga através das regiões de flanquea- mento de DNA, e regeneração de uma planta a partir da célula de planta; (e) cruzamento da planta regenerada ou de uma progênie da plantada mesma compreendendo o gene marcador selecionável com uma planta compreendendo uma enzima de indução de quebra de fita dupla ("DSBI") de clivagem rara codificando gene quimérico, o gene quimérico compreendendo os segmentos de DNA operavelmente ligados que seguem: (i) um promotor específico de linhagem germinativa; (ii) uma região de DNA codificando uma enzima de indução de quebra de DNA de fita dupla reconhecendo o sítio de reconhecimento localizado no DNA de interesse; (iii) uma região de terminação de transcrição e de poliadeni- lação; (f) seleção de uma progênie da planta F1 compreendendo o gene marcador selecionável ou avaliável e o gene quimérico de codifi-cação da enzima DSBI; (g) cruzamento da progênie da planta com outra planta atra-vés da qual a progênie da planta é usada como um doador de pólen se o dito promotor específico de linhagem germinativa for um promotor es-pecífico de micrósporo e através do qual a dita progênie da planta é usada como um aceitador de pólen ou planta fêmea se o dito promotor específico de linhagem germinativa for um promotor específico de me- gásporo; (h) seleção de uma população de progênie de plantas F2 que compreende o gene quimérico de codificação da enzima DSBI; e (i) seleção de uma progênie da planta onde o gene marcador selecionável ou avaliável é deletado através de recombinação homóloga entre a primeira e a segunda sequência de DNA, a montante e a jusante do dito gene marcador selecionável ou avaliável, deste modo recriando o dito sítio pré-selecionado.

7. Processo, de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo fato de que a dita primeira quebra de fita dupla no dito sítio pré- selecionado é induzida através da introdução de uma primeira enzima de indução DSBI, a dita primeira enzima de indução DSBI não reconhecendo o dito sítio de reconhecimento para a dita enzima de indução DSBI localizada no dito DNA de reparo.

8. Processo, de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo fato de que a dita primeira enzima DSBI e a dita segunda enzima DSBI são duas enzimas DSBI diferentes selecionadas do grupo de I- Sce I, I-Chu I, I-Dmo I, I-Cre I, I-Csm I, PI-Fli I, Pt-Mtu I, I-Ceu I, I-Sce II, I-Sce III, HO, PI-Civ I, PI-Ctr I, PI-Aae I, PI-BSU I, PI-DhaI, PI-Dra I, PI- Mav I, PI-Mch I, PI-Mfu I, PI-Mfl I, PI-Mga I, PI-Mgo I, PI-Min I, PI-Mka I, PI-Mle I, PI-Mma I, PI-Msh I, PI-Msm I, PI-Mth I, PI-Mtu I, PI-Mxe I, PI- Npu I, PI-Pfu I, PI-Rma I, PI-Spb I, PI-Ssp I, PI-Fac I, PI-Mja I, PI-Pho I, PI-Tag I, PI-Thy I, PI-Tko I ou PI-Tsp I ou uma endonuclease quimérica compreendendo um domínio de ligação de DNA dedo de Zn e um do-mínio de clivagem de DNA.

9. Processo, de acordo com qualquer uma das reivindica-ções 6 a 8, caracterizado pelo fato de que a dita segunda enzima DSBI é I-SceI.

10. Processo, de acordo com qualquer uma das reivindica-ções 1 a 9, caracterizado pelo fato de que as ditas regiões de flanquea- mento de DNA compreendem uma sequência de pelo menos 10 nt da região de DNA flanqueando o dito sítio pré-selecionado no genoma da dita célula de planta.

11. Vetor de DNA, caracterizado pelo fato de que é para troca de uma sequência de DNA-alvo no genoma de uma célula de planta por uma sequência de DNA de interesse através da indução de uma quebra de fita dupla em um sítio pré-selecionado dentro da dita sequência-alvo ou na vizinhança da mesma, o dito vetor de DNA compreendendo: a. a dita sequência de DNA de interesse localizada entre duas regiões de flanqueamento de DNA compreendendo uma sequên-cia de pelo menos 10 nt da região de DNA flanqueando a dita sequência de DNA-alvo e flanqueando o dito sítio pré-selecionado; b. um gene marcador selecionável ou avaliável localizado entre as ditas regiões de flanqueamento de DNA, o dito gene marcador selecionável ou avaliável estando ainda localizado entre uma primeira sequência de DNA a montante e a jusante do dito gene marcador sele- cionável ou avaliável consistindo na parte terminal 5’ do dito sítio pré- selecionado e uma segunda sequência de DNA a jusante do dito gene marcador selecionável ou avaliável, a dita segunda sequência de DNA consistindo na parte terminal 3’ do dito sítio pré-selecionado sendo que a dita parte terminal 5’ do dito sítio pré-selecionado consiste na sequên-cia de nucleotídeo do sítio pré-selecionado que não possui no terminal 3’ da dita sequência um ou mais nucleotídeos de forma que a dita parte terminal 5’ do dito sítio pré-selecionado não é mais reconhecida ou cli-vada pela dita primeira enzima DSBI, e sendo que a dita parte terminal 3’ do dito sítio pré-selecionado consiste na sequência de nucleotídeo do sítio pré-selecionado que não possui no terminal 5’ da dita sequência um ou mais nucleotídeos de forma que a dita parte terminal 3’ não é mais reconhecida ou clivada pela dita primeira enzima DSBI, através da qual as sequências de nucleotídeos comuns entre a dita parte terminal 5’ e a dita parte terminal 3’ compreende pelo menos 10 nucleotídeos e as ditas primeira e segunda sequências de DNA estão localizadas na mesma fita de DNA na mesma direção 5’ para 3’; e c. um sítio de reconhecimento para uma enzima DSBI localizado entre a dita uma das regiões de flanqueamento de DNA e a dita primeira e segunda sequências de DNA a montante e a jusante do dito gene marcador selecionável ou avaliável.

12. Vetor, de acordo com a reivindicação 11, caracterizado pelo fato de que as ditas duas regiões de flanqueamento de DNA com-preendem uma sequência de pelo menos 10 nt da região de DNA flan-queando o dito sítio pré-selecionado no genoma da dita célula de planta.