CN101688217B - 在真核生物中精确替换靶dna的方法和手段 - Google Patents
在真核生物中精确替换靶dna的方法和手段 Download PDFInfo
- Publication number
- CN101688217B CN101688217B CN200880018868.7A CN200880018868A CN101688217B CN 101688217 B CN101688217 B CN 101688217B CN 200880018868 A CN200880018868 A CN 200880018868A CN 101688217 B CN101688217 B CN 101688217B
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- dna
- sequence
- site
- preliminary election
- enzyme
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Fee Related
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 57
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 claims abstract description 206
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims abstract description 93
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 claims abstract description 76
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims abstract description 76
- 230000006801 homologous recombination Effects 0.000 claims abstract description 39
- 238000002744 homologous recombination Methods 0.000 claims abstract description 39
- 239000003550 marker Substances 0.000 claims abstract description 38
- 210000003527 eukaryotic cell Anatomy 0.000 claims abstract description 17
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 claims description 76
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 claims description 76
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims description 64
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims description 64
- 230000005782 double-strand break Effects 0.000 claims description 47
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 claims description 39
- 235000013311 vegetables Nutrition 0.000 claims description 39
- 108010042407 Endonucleases Proteins 0.000 claims description 38
- 102000004533 Endonucleases Human genes 0.000 claims description 38
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 claims description 27
- 108060008682 Tumor Necrosis Factor Proteins 0.000 claims description 22
- 102000003390 tumor necrosis factor Human genes 0.000 claims description 14
- 241000206602 Eukaryota Species 0.000 claims description 12
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 claims description 11
- 230000008488 polyadenylation Effects 0.000 claims description 5
- 230000005030 transcription termination Effects 0.000 claims description 5
- HCHKCACWOHOZIP-UHFFFAOYSA-N Zinc Chemical compound [Zn] HCHKCACWOHOZIP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- 230000008569 process Effects 0.000 claims description 4
- 239000011701 zinc Substances 0.000 claims description 4
- 229910052725 zinc Inorganic materials 0.000 claims description 4
- 230000002123 temporal effect Effects 0.000 abstract 1
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 82
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 15
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 11
- 235000002637 Nicotiana tabacum Nutrition 0.000 description 10
- 108010077850 Nuclear Localization Signals Proteins 0.000 description 10
- 102000007260 Deoxyribonuclease I Human genes 0.000 description 8
- 108010008532 Deoxyribonuclease I Proteins 0.000 description 8
- 108010043121 Green Fluorescent Proteins Proteins 0.000 description 8
- 102000004144 Green Fluorescent Proteins Human genes 0.000 description 8
- 238000013461 design Methods 0.000 description 8
- 239000005090 green fluorescent protein Substances 0.000 description 8
- 230000009261 transgenic effect Effects 0.000 description 8
- 244000061176 Nicotiana tabacum Species 0.000 description 7
- 230000008859 change Effects 0.000 description 7
- 108700039691 Genetic Promoter Regions Proteins 0.000 description 6
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 6
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 6
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 6
- 241000208125 Nicotiana Species 0.000 description 5
- 150000001413 amino acids Chemical group 0.000 description 5
- 238000009395 breeding Methods 0.000 description 5
- 230000001488 breeding effect Effects 0.000 description 5
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 5
- 238000013467 fragmentation Methods 0.000 description 5
- 238000006062 fragmentation reaction Methods 0.000 description 5
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 5
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 5
- 210000004940 nucleus Anatomy 0.000 description 5
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 5
- 241000589158 Agrobacterium Species 0.000 description 4
- 108091092195 Intron Proteins 0.000 description 4
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 4
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 3
- 240000001980 Cucurbita pepo Species 0.000 description 3
- 230000004568 DNA-binding Effects 0.000 description 3
- 108010060309 Glucuronidase Proteins 0.000 description 3
- 102000053187 Glucuronidase Human genes 0.000 description 3
- 241001446187 Kermes Species 0.000 description 3
- 240000007594 Oryza sativa Species 0.000 description 3
- 235000007164 Oryza sativa Nutrition 0.000 description 3
- 244000078534 Vaccinium myrtillus Species 0.000 description 3
- 240000008042 Zea mays Species 0.000 description 3
- 235000005824 Zea mays ssp. parviglumis Nutrition 0.000 description 3
- 235000002017 Zea mays subsp mays Nutrition 0.000 description 3
- 235000013339 cereals Nutrition 0.000 description 3
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 3
- 235000005822 corn Nutrition 0.000 description 3
- 230000008034 disappearance Effects 0.000 description 3
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 3
- 230000017730 intein-mediated protein splicing Effects 0.000 description 3
- CXORMDKZEUMQHX-UHFFFAOYSA-N kermesic acid Chemical compound O=C1C2=C(O)C(O)=CC(O)=C2C(=O)C2=C1C=C(O)C(C(O)=O)=C2C CXORMDKZEUMQHX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 210000001161 mammalian embryo Anatomy 0.000 description 3
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 3
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 3
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 3
- 235000009566 rice Nutrition 0.000 description 3
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 3
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 3
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 3
- 108010000700 Acetolactate synthase Proteins 0.000 description 2
- 241000589155 Agrobacterium tumefaciens Species 0.000 description 2
- 235000000832 Ayote Nutrition 0.000 description 2
- 241000193830 Bacillus <bacterium> Species 0.000 description 2
- 241000167854 Bourreria succulenta Species 0.000 description 2
- 235000001169 Brassica oleracea var oleracea Nutrition 0.000 description 2
- 244000025254 Cannabis sativa Species 0.000 description 2
- 235000005979 Citrus limon Nutrition 0.000 description 2
- 244000131522 Citrus pyriformis Species 0.000 description 2
- 229920000742 Cotton Polymers 0.000 description 2
- 235000009854 Cucurbita moschata Nutrition 0.000 description 2
- 235000009804 Cucurbita pepo subsp pepo Nutrition 0.000 description 2
- 102000002322 Egg Proteins Human genes 0.000 description 2
- 108010000912 Egg Proteins Proteins 0.000 description 2
- 235000010469 Glycine max Nutrition 0.000 description 2
- 244000068988 Glycine max Species 0.000 description 2
- 239000005562 Glyphosate Substances 0.000 description 2
- 244000299507 Gossypium hirsutum Species 0.000 description 2
- 108010033040 Histones Proteins 0.000 description 2
- 240000005979 Hordeum vulgare Species 0.000 description 2
- 235000007340 Hordeum vulgare Nutrition 0.000 description 2
- 101710128836 Large T antigen Proteins 0.000 description 2
- 241000209499 Lemna Species 0.000 description 2
- 241000218922 Magnoliophyta Species 0.000 description 2
- 108700026244 Open Reading Frames Proteins 0.000 description 2
- IAJOBQBIJHVGMQ-UHFFFAOYSA-N Phosphinothricin Natural products CP(O)(=O)CCC(N)C(O)=O IAJOBQBIJHVGMQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 2
- 235000007238 Secale cereale Nutrition 0.000 description 2
- 244000082988 Secale cereale Species 0.000 description 2
- XUIMIQQOPSSXEZ-UHFFFAOYSA-N Silicon Chemical compound [Si] XUIMIQQOPSSXEZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 235000002595 Solanum tuberosum Nutrition 0.000 description 2
- 244000061456 Solanum tuberosum Species 0.000 description 2
- 244000046109 Sorghum vulgare var. nervosum Species 0.000 description 2
- 235000021307 Triticum Nutrition 0.000 description 2
- 244000098338 Triticum aestivum Species 0.000 description 2
- 235000003095 Vaccinium corymbosum Nutrition 0.000 description 2
- 235000017537 Vaccinium myrtillus Nutrition 0.000 description 2
- 241000251539 Vertebrata <Metazoa> Species 0.000 description 2
- 230000000735 allogeneic effect Effects 0.000 description 2
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 2
- 210000004436 artificial bacterial chromosome Anatomy 0.000 description 2
- 235000021014 blueberries Nutrition 0.000 description 2
- 235000019693 cherries Nutrition 0.000 description 2
- 108010050663 endodeoxyribonuclease CreI Proteins 0.000 description 2
- IAJOBQBIJHVGMQ-BYPYZUCNSA-N glufosinate-P Chemical compound CP(O)(=O)CC[C@H](N)C(O)=O IAJOBQBIJHVGMQ-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 2
- XDDAORKBJWWYJS-UHFFFAOYSA-N glyphosate Chemical compound OC(=O)CNCP(O)(O)=O XDDAORKBJWWYJS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229940097068 glyphosate Drugs 0.000 description 2
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 2
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 2
- 230000000394 mitotic effect Effects 0.000 description 2
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 2
- 210000004681 ovum Anatomy 0.000 description 2
- 108010082527 phosphinothricin N-acetyltransferase Proteins 0.000 description 2
- 230000037039 plant physiology Effects 0.000 description 2
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 2
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 2
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 2
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 2
- 235000015136 pumpkin Nutrition 0.000 description 2
- 230000008929 regeneration Effects 0.000 description 2
- 238000011069 regeneration method Methods 0.000 description 2
- 210000000582 semen Anatomy 0.000 description 2
- 229910052710 silicon Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000010703 silicon Substances 0.000 description 2
- 230000000392 somatic effect Effects 0.000 description 2
- 239000010421 standard material Substances 0.000 description 2
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 2
- 230000002477 vacuolizing effect Effects 0.000 description 2
- QUTYKIXIUDQOLK-PRJMDXOYSA-N 5-O-(1-carboxyvinyl)-3-phosphoshikimic acid Chemical compound O[C@H]1[C@H](OC(=C)C(O)=O)CC(C(O)=O)=C[C@H]1OP(O)(O)=O QUTYKIXIUDQOLK-PRJMDXOYSA-N 0.000 description 1
- 235000009436 Actinidia deliciosa Nutrition 0.000 description 1
- 244000298697 Actinidia deliciosa Species 0.000 description 1
- 244000291564 Allium cepa Species 0.000 description 1
- 235000002732 Allium cepa var. cepa Nutrition 0.000 description 1
- 244000144730 Amygdalus persica Species 0.000 description 1
- 244000099147 Ananas comosus Species 0.000 description 1
- 235000007119 Ananas comosus Nutrition 0.000 description 1
- 240000007087 Apium graveolens Species 0.000 description 1
- 235000015849 Apium graveolens Dulce Group Nutrition 0.000 description 1
- 235000010591 Appio Nutrition 0.000 description 1
- 235000017060 Arachis glabrata Nutrition 0.000 description 1
- 244000105624 Arachis hypogaea Species 0.000 description 1
- 235000010777 Arachis hypogaea Nutrition 0.000 description 1
- 235000018262 Arachis monticola Nutrition 0.000 description 1
- 244000189799 Asimina triloba Species 0.000 description 1
- 235000006264 Asimina triloba Nutrition 0.000 description 1
- 244000003416 Asparagus officinalis Species 0.000 description 1
- 235000005340 Asparagus officinalis Nutrition 0.000 description 1
- 241000020089 Atacta Species 0.000 description 1
- 244000075850 Avena orientalis Species 0.000 description 1
- 235000007319 Avena orientalis Nutrition 0.000 description 1
- 235000007558 Avena sp Nutrition 0.000 description 1
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 1
- 235000016068 Berberis vulgaris Nutrition 0.000 description 1
- 241000335053 Beta vulgaris Species 0.000 description 1
- 235000006008 Brassica napus var napus Nutrition 0.000 description 1
- 240000007124 Brassica oleracea Species 0.000 description 1
- 235000003899 Brassica oleracea var acephala Nutrition 0.000 description 1
- 235000011299 Brassica oleracea var botrytis Nutrition 0.000 description 1
- 235000011301 Brassica oleracea var capitata Nutrition 0.000 description 1
- 240000003259 Brassica oleracea var. botrytis Species 0.000 description 1
- 235000004936 Bromus mango Nutrition 0.000 description 1
- 241000282470 Canis latrans Species 0.000 description 1
- 235000002566 Capsicum Nutrition 0.000 description 1
- 235000009467 Carica papaya Nutrition 0.000 description 1
- 235000003255 Carthamus tinctorius Nutrition 0.000 description 1
- 244000020518 Carthamus tinctorius Species 0.000 description 1
- 241001674939 Caulanthus Species 0.000 description 1
- 244000241235 Citrullus lanatus Species 0.000 description 1
- 235000012828 Citrullus lanatus var citroides Nutrition 0.000 description 1
- 235000001759 Citrus maxima Nutrition 0.000 description 1
- 244000276331 Citrus maxima Species 0.000 description 1
- 235000013162 Cocos nucifera Nutrition 0.000 description 1
- 244000060011 Cocos nucifera Species 0.000 description 1
- 108020004635 Complementary DNA Proteins 0.000 description 1
- 102100024342 Contactin-2 Human genes 0.000 description 1
- 244000241257 Cucumis melo Species 0.000 description 1
- 235000009847 Cucumis melo var cantalupensis Nutrition 0.000 description 1
- 240000008067 Cucumis sativus Species 0.000 description 1
- 235000010799 Cucumis sativus var sativus Nutrition 0.000 description 1
- 235000009852 Cucurbita pepo Nutrition 0.000 description 1
- 108010044289 DNA Restriction-Modification Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 102000006465 DNA Restriction-Modification Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 102100035186 DNA excision repair protein ERCC-1 Human genes 0.000 description 1
- 101100162704 Emericella nidulans I-AniI gene Proteins 0.000 description 1
- 101000889905 Enterobacteria phage RB3 Intron-associated endonuclease 3 Proteins 0.000 description 1
- 101000889904 Enterobacteria phage T4 Defective intron-associated endonuclease 3 Proteins 0.000 description 1
- 101000889900 Enterobacteria phage T4 Intron-associated endonuclease 1 Proteins 0.000 description 1
- 101000889899 Enterobacteria phage T4 Intron-associated endonuclease 2 Proteins 0.000 description 1
- 235000016623 Fragaria vesca Nutrition 0.000 description 1
- 240000009088 Fragaria x ananassa Species 0.000 description 1
- 235000011363 Fragaria x ananassa Nutrition 0.000 description 1
- 235000003222 Helianthus annuus Nutrition 0.000 description 1
- 244000020551 Helianthus annuus Species 0.000 description 1
- 101000876529 Homo sapiens DNA excision repair protein ERCC-1 Proteins 0.000 description 1
- 101000856513 Homo sapiens Inactive N-acetyllactosaminide alpha-1,3-galactosyltransferase Proteins 0.000 description 1
- 101000579423 Homo sapiens Regulator of nonsense transcripts 1 Proteins 0.000 description 1
- 101000864057 Homo sapiens Serine/threonine-protein kinase SMG1 Proteins 0.000 description 1
- 206010020649 Hyperkeratosis Diseases 0.000 description 1
- 102100025509 Inactive N-acetyllactosaminide alpha-1,3-galactosyltransferase Human genes 0.000 description 1
- 208000026350 Inborn Genetic disease Diseases 0.000 description 1
- 235000009496 Juglans regia Nutrition 0.000 description 1
- 240000007049 Juglans regia Species 0.000 description 1
- 108010025815 Kanamycin Kinase Proteins 0.000 description 1
- 101100288095 Klebsiella pneumoniae neo gene Proteins 0.000 description 1
- 235000003228 Lactuca sativa Nutrition 0.000 description 1
- 240000008415 Lactuca sativa Species 0.000 description 1
- 241000234435 Lilium Species 0.000 description 1
- 101001084667 Lilium longiflorum Histone H3-like 2 Proteins 0.000 description 1
- 235000004431 Linum usitatissimum Nutrition 0.000 description 1
- 240000006240 Linum usitatissimum Species 0.000 description 1
- 235000007688 Lycopersicon esculentum Nutrition 0.000 description 1
- 235000011430 Malus pumila Nutrition 0.000 description 1
- 244000070406 Malus silvestris Species 0.000 description 1
- 235000015103 Malus silvestris Nutrition 0.000 description 1
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 1
- 235000014826 Mangifera indica Nutrition 0.000 description 1
- 240000007228 Mangifera indica Species 0.000 description 1
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 1
- 240000005561 Musa balbisiana Species 0.000 description 1
- 235000018290 Musa x paradisiaca Nutrition 0.000 description 1
- 229930193140 Neomycin Natural products 0.000 description 1
- 108010033272 Nitrilase Proteins 0.000 description 1
- 101710163270 Nuclease Proteins 0.000 description 1
- 235000005305 Nypa fruticans Nutrition 0.000 description 1
- 244000004005 Nypa fruticans Species 0.000 description 1
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 description 1
- 235000000370 Passiflora edulis Nutrition 0.000 description 1
- 244000288157 Passiflora edulis Species 0.000 description 1
- 239000006002 Pepper Substances 0.000 description 1
- 235000010627 Phaseolus vulgaris Nutrition 0.000 description 1
- 244000046052 Phaseolus vulgaris Species 0.000 description 1
- 235000016761 Piper aduncum Nutrition 0.000 description 1
- 240000003889 Piper guineense Species 0.000 description 1
- 235000017804 Piper guineense Nutrition 0.000 description 1
- 235000008184 Piper nigrum Nutrition 0.000 description 1
- 240000008135 Piscidia piscipula Species 0.000 description 1
- 235000003447 Pistacia vera Nutrition 0.000 description 1
- 240000006711 Pistacia vera Species 0.000 description 1
- 240000004713 Pisum sativum Species 0.000 description 1
- 241001529246 Platymiscium Species 0.000 description 1
- 240000005860 Portulaca grandiflora Species 0.000 description 1
- 235000009827 Prunus armeniaca Nutrition 0.000 description 1
- 244000018633 Prunus armeniaca Species 0.000 description 1
- 235000006029 Prunus persica var nucipersica Nutrition 0.000 description 1
- 235000006040 Prunus persica var persica Nutrition 0.000 description 1
- 244000017714 Prunus persica var. nucipersica Species 0.000 description 1
- 241000220324 Pyrus Species 0.000 description 1
- 108020005093 RNA Precursors Proteins 0.000 description 1
- 244000088415 Raphanus sativus Species 0.000 description 1
- 235000006140 Raphanus sativus var sativus Nutrition 0.000 description 1
- 102100028287 Regulator of nonsense transcripts 1 Human genes 0.000 description 1
- 108091081062 Repeated sequence (DNA) Proteins 0.000 description 1
- 235000017848 Rubus fruticosus Nutrition 0.000 description 1
- 235000011034 Rubus glaucus Nutrition 0.000 description 1
- 244000235659 Rubus idaeus Species 0.000 description 1
- 235000009122 Rubus idaeus Nutrition 0.000 description 1
- 241000235070 Saccharomyces Species 0.000 description 1
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 1
- 240000000111 Saccharum officinarum Species 0.000 description 1
- CWHJIJJSDGEHNS-MYLFLSLOSA-N Senegenin Chemical compound C1[C@H](O)[C@H](O)[C@@](C)(C(O)=O)[C@@H]2CC[C@@]3(C)C(CC[C@]4(CCC(C[C@H]44)(C)C)C(O)=O)=C4[C@@H](CCl)C[C@@H]3[C@]21C CWHJIJJSDGEHNS-MYLFLSLOSA-N 0.000 description 1
- 102100029938 Serine/threonine-protein kinase SMG1 Human genes 0.000 description 1
- 240000003768 Solanum lycopersicum Species 0.000 description 1
- 101000690440 Solanum lycopersicum Floral homeotic protein AGAMOUS Proteins 0.000 description 1
- 235000002597 Solanum melongena Nutrition 0.000 description 1
- 244000061458 Solanum melongena Species 0.000 description 1
- 235000009337 Spinacia oleracea Nutrition 0.000 description 1
- 244000300264 Spinacia oleracea Species 0.000 description 1
- 235000009184 Spondias indica Nutrition 0.000 description 1
- 235000009470 Theobroma cacao Nutrition 0.000 description 1
- 244000299461 Theobroma cacao Species 0.000 description 1
- 241000219793 Trifolium Species 0.000 description 1
- 240000001717 Vaccinium macrocarpon Species 0.000 description 1
- 235000009754 Vitis X bourquina Nutrition 0.000 description 1
- 235000012333 Vitis X labruscana Nutrition 0.000 description 1
- 240000006365 Vitis vinifera Species 0.000 description 1
- 235000014787 Vitis vinifera Nutrition 0.000 description 1
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 1
- 235000021029 blackberry Nutrition 0.000 description 1
- 235000019519 canola oil Nutrition 0.000 description 1
- 239000000828 canola oil Substances 0.000 description 1
- 230000036978 cell physiology Effects 0.000 description 1
- 210000002421 cell wall Anatomy 0.000 description 1
- 210000002711 centrocyte Anatomy 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 230000002759 chromosomal effect Effects 0.000 description 1
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 1
- 239000002131 composite material Substances 0.000 description 1
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 1
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 1
- 238000012937 correction Methods 0.000 description 1
- 238000010168 coupling process Methods 0.000 description 1
- 235000021019 cranberries Nutrition 0.000 description 1
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 1
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 1
- 235000013399 edible fruits Nutrition 0.000 description 1
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 1
- 239000003623 enhancer Substances 0.000 description 1
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 1
- 230000004720 fertilization Effects 0.000 description 1
- 230000004992 fission Effects 0.000 description 1
- 230000001448 gametogenic effect Effects 0.000 description 1
- 238000012239 gene modification Methods 0.000 description 1
- 230000030279 gene silencing Effects 0.000 description 1
- 238000001415 gene therapy Methods 0.000 description 1
- 208000016361 genetic disease Diseases 0.000 description 1
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 1
- 230000005017 genetic modification Effects 0.000 description 1
- 235000013617 genetically modified food Nutrition 0.000 description 1
- 230000002779 inactivation Effects 0.000 description 1
- 230000000977 initiatory effect Effects 0.000 description 1
- 230000010354 integration Effects 0.000 description 1
- XUWPJKDMEZSVTP-LTYMHZPRSA-N kalafungina Chemical compound O=C1C2=C(O)C=CC=C2C(=O)C2=C1[C@@H](C)O[C@H]1[C@@H]2OC(=O)C1 XUWPJKDMEZSVTP-LTYMHZPRSA-N 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 1
- 229960004927 neomycin Drugs 0.000 description 1
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 1
- 210000001672 ovary Anatomy 0.000 description 1
- 235000020232 peanut Nutrition 0.000 description 1
- 235000021017 pears Nutrition 0.000 description 1
- 239000000575 pesticide Substances 0.000 description 1
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 1
- 230000002265 prevention Effects 0.000 description 1
- 108700022487 rRNA Genes Proteins 0.000 description 1
- 230000001172 regenerating effect Effects 0.000 description 1
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 1
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 1
- 238000002864 sequence alignment Methods 0.000 description 1
- 230000001568 sexual effect Effects 0.000 description 1
- 230000003584 silencer Effects 0.000 description 1
- 241000894007 species Species 0.000 description 1
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 1
- 239000009871 tenuigenin Substances 0.000 description 1
- 230000002103 transcriptional effect Effects 0.000 description 1
- 239000005418 vegetable material Substances 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
- C12N15/8201—Methods for introducing genetic material into plant cells, e.g. DNA, RNA, stable or transient incorporation, tissue culture methods adapted for transformation
- C12N15/8213—Targeted insertion of genes into the plant genome by homologous recombination
Abstract
本发明提供了在真核细胞如植物细胞中通过同源重组将靶DNA序列精确交换为目的DNA序列的方法和手段，由此采用去除侧接同向重复的两核苷酸序列的选择DNA的方法，能够随后去除可选择或可筛选标记而不不留足迹，该可选择或可筛选标记在同源重组阶段为临时选择基因替换事件而使用。
Description
技术领域
本发明涉及在真核细胞和真核生物(如植物细胞和植物)中通过同源重组将靶DNA序列精确交换为目的DNA序列的改进的方法和手段，其中能够随后去除可选择或可筛选标记，而不引入任何其他序列变异，该可选择或可筛选标记在同源重组阶段为临时选择基因替换事件而使用。
背景技术
同源重组允许在原核生物及选择的真核生物中进行众多靶向遗传修饰，包括选择的缺失、插入或替换。
在高等真核生物中，可通过借助于罕见切割内切核酸酶(rare-cuttingendonuclease)如I-SceI诱导双链DNA断裂来促进同源重组。
WO2004/067753描述了兆碱基大范围核酸酶在脊椎动物体细胞组织中诱导离体和整体同源重组的用途，及其用于基因组工程和基因治疗的应用。
WO2000/46386描述了通过I-SceI诱导的双链断裂在细胞中修饰、修复、弱化和失活基因或其他染色体DNA的方法。还公开了对需要的个体治疗或预防遗传疾病的方法。
已证明在植物中，利用I-SceI诱导双链DNA断裂使利用农杆菌向植物细胞中递送修复DNA的同源重组频率增加至少两个数量级(Puchta等人，1996，Proc.Natl.Acad.Sci.美国，93，5055-5060页)。Chilton和Que(2003，Plant Physiol.133：956-965页)和Tzifira等人(2003，Plant Physiol.133：1011-1023页)报道T-DNA优先整合由罕见切割酶I-SceI或I-CeuI人工诱导的双链DNA断裂。所述报道还包括含有相应罕见切割酶识别位点的供体T-DNA载体。
另外，允许设计罕见切割内切核酸酶以改变该酶的底物或序列特异性的方法已有描述，从而允许在几乎任何目的基因座诱导双链断裂，而不依赖于任何天然罕见切割内切核酸酶识别位点的存在。简言之，可利用设计用以识别特异性核苷酸序列的锌指结构域与来自天然限制酶如FokI的非特异性DNA切割结构域之间的杂合体来制备嵌合限制酶。此类方法已经在例如WO 03/080809、WO94/18313或WO95/09233以及Isalan等人，2001，Nature Biotechnology 19，656-660；Liu等人1997，Proc.Natl.Acad.Sci.美国94，5525-5530)中描述。另一种通过在变体文库中选择而产生定制的兆碱基大范围核酸酶的方法在WO2004/067736中描述。定制的具有改变的序列特异性和DNA结合亲和力的兆碱基大范围核酸酶也可以通过如WO2007/047859所述的理性设计而获得。
WO2007/049095描述了在两个分开的、分别结合修饰的DNA靶半位点不同部分的亚结构域中具有突变的“LADGLIDADG”寻靶内切核酸酶变体，从而该内切核酸酶变体能够切割包含各亚结构域所结合的核苷酸的嵌合DNA靶序列。
WO2007/049156和WO 2007/093836描述了具有新的切割特异性的I-CreI寻靶内切核酸酶变体及其用途。
WO2007/047859描述了理性设计的、具有改变的序列特异性和DNA结合亲和力的兆碱基大范围核酸酶。
WO2006/105946描述了在植物细胞和植物中通过同源重组将靶DNA序列精确交换为目的DNA序列的方法，其中能够在随后去除在同源重组阶段为临时选择基因替换事件所使用的可选择或可筛选标记而不留足迹，且在去除步骤中也无需采取体外培养，其中所述的方法采用通过小孢子特异性表达诱导双链断裂的罕见切割内切核酸酶而去除选择的DNA。
美国临时专利申请60/828,042和欧洲专利申请06020370.0以及WO2008/037436描述了WO2006/105946中的方法和手段的变通方式，其中由诱导双链断裂的罕见切割内切核酸酶所诱导的选择DNA片段的去除步骤处于种系特异性启动子的控制之下。该方法的其他实施方案有赖于修 复DNA一端的非同源性末端联接以及另一端的同源重组。
上述鉴别的将靶DNA片段精确交换为目的DNA片段的方法和手段的一些实施方案需要引入的修复DNA在双链断裂诱导酶的存在下引入到植物细胞中。修复DNA通常也含有诱导双链断裂的罕见切割内切核酸酶所识别的预选位点，所以修复DNA也倾向于DNA切割。因此，可能降低同源重组的DNA插入效率。为避免这种效率降低，可以改变修复DNA中的预选位点，从而使之不再被诱导双链断裂的罕见切割内切核酸酶识别。然而，与靶DNA相比，除了期望的变化之外，这还需要在修复DNA中引入额外的变化。
本发明就此问题提供了备选解决办法，这不需要修饰修复DNA中的预选位点，所以允许交换仅具有期望核苷酸变化的靶DNA，而无需修饰预选位点。这些及其他问题如下文本发明详述的不同实施方案以及权利要求书中所述的那样得到解决。
发明概述
在本发明的一个实施方案中，提供了在真核细胞或真核生物的基因组中将靶DNA序列交换为目的DNA序列的方法，其包括如下步骤：
a.在真核生物细胞基因组的预选位点诱导第一双链DNA断裂，所述预选位点位于靶DNA序列内部或靶DNA序列附近，且所述预选位点被第一双链断裂诱导(DSBI)酶识别；
b.向所述真核细胞中引入修复DNA分子，所述修复DNA分子包含：
i.位于两侧翼DNA区域之间的目的DNA序列，所述侧翼DNA区域与侧接靶DNA序列的DNA区域，优选与侧接真核细胞基因组中预选位点的DNA区域具有至少80％的序列同源性；
ii.位于所述侧翼DNA区域之间的可选择或可筛选标记基因，所述可选择或可筛选标记基因还位于由预选位点5’端部分组成的第一重复序列和由预选位点3’端部分组成的第二序列之间，其中第一和第二重复序列之间共同的序列是同向重复；和
iii.位于一个侧翼DNA区域与第一第二重复序列之间的第二DSBI酶的至少一个识别位点，优选位于第一和序列同向重复序列之间的第二DSBI酶的至少一个识别位点；
c.选择含有可选择或可筛选标记的细胞群；
d.选择已经通过侧翼DNA区域的同源重组引入了可选择或可筛选标记的细胞；
e.在细胞中第二DSBI酶的识别位点处引入双链断裂；
f.选择通过同向重复之间的同源重组缺失了可选择或可筛选标记基因，由此重建了预选位点的子代细胞。
在本发明的另一实施方案中，提供了在植物基因组、特别是核基因组中将靶DNA序列交换为目的DNA序列的方法，其包括如下步骤：
a)在植物细胞基因组的预选位点诱导第一双链DNA断裂，所述预选位点位于靶DNA序列内部或靶DNA序列附近，且所述预选位点被第一双链断裂诱导(DSBI)酶识别；
b)向所述真核细胞中引入修复DNA分子，所述修复DNA分子包含：
i)位于两侧翼DNA区域之间的目的DNA序列，所述侧翼DNA区域与侧接靶DNA序列的DNA区域，优选与侧接真核细胞基因组中预选位点的DNA区域具有至少80％的序列同源性；
ii)位于所述侧翼DNA区域之间的可选择或可筛选标记基因，所述可选择或可筛选标记基因还位于由预选位点5’端部分组成的第一重复序列和由预选位点3’端部分组成的第二序列之间，其中第一和第二重复序列之间共同的序列是同向重复；和
iii)位于一个侧翼DNA区域与第一第二重复序列之间的第二DSBI酶的至少一个识别位点；
c)选择含有可选择或可筛选标记的植物细胞群；
d)选择已经通过侧翼DNA区域的同源重组引入了目的DNA序列(和可选择或可筛选标记)的植物细胞，并从植物细胞再生植物；
e)使含有可选择标记基因的再生植物或其子代植物与含有编码罕见 切割双链断裂诱导(“DSBI”)酶的嵌合基因的植物杂交，所述嵌合基因包含如下有效连接的DNA区段：
i.种系特异性启动子；
ii.编码识别位于目的DNA中的识别位点的双链DNA断裂诱导酶(即第二双链DNA断裂诱导酶)的DNA区域；
iii.转录终止和聚腺苷酸化区域；
f)选择含有所述可选择或可筛选标记基因和编码DSBI酶的嵌合基因的子代植物(F1植物)；
g)使子代植物与其他植物杂交，其中子代植物用作为花粉供体；
h)选择含有编码DSBI酶的嵌合基因的子代植物群(F2群)；和
i)选择通过第一和第二同向重复序列之间的同源重组缺失了可选择或可筛选标记基因的子代植物。
本发明涉及可通过上文所述的方法获得的真核细胞和植物。
附图概述
图1和2代表在植物细胞中交换靶DNA和目的DNA而不进行任何额外修饰的方法的不同实施方案。这些附图仅用于举例说明目的，而不应用于以限制方式解释权利要求书。
图1是允许用替换DNA序列精确替换靶DNA序列的方法的示意图。DSB1：第一双链断裂诱导酶的识别位点；FS1：侧翼序列1；FS2：侧翼序列2；DSB2：第二双链断裂诱导酶的识别位点；SMG1：可选择标记基因1或可筛选标记基因1；SMG2：可选择标记基因2或可筛选标记基因2；DSBIE：双链断裂诱导酶；dr1：包含在DSBIE1识别的预选位点5’部分内部的同向重复序列1；dr2：包含在DSBIE1识别的预选位点5’部分内部的同向重复序列2；GSP：种系特异性启动子；3’：转录终止和聚腺苷酸化信号。在图1中，预选位点位于靶DNA附近。
图2是与图1图示的方法类似的、允许用替换DNA序列精确替换靶DNA序列的方法的示意图。在此实施方案中，预选位点位于靶DNA内部。
图3是诱导双链断裂的罕见切割酶假定的20个核苷酸长的识别位点(N1-N20)的示意图。显示了别处所述的第一和第二重复序列，其中dr1对应于识别位点的5’部分(这里示例为N1-N17)，而dr2对应于识别位点的3’部分(这里示例为N4-N20)。同向重复位于核苷酸N4-N17之间。
本发明详细的实施方案
本发明基于这样的认识，即例如WO2006/105946描述的方法中有几种(特别是有赖于修复DNA两侧的同源重组的实施方案)的效率能够通过提供特异性修复DNA而提高，其中直接DNA重复(在可筛选或可选择标记的去除步骤中使用)一端由预选位点(被第一双链断裂诱导酶识别)5’端部分组成，而另一端由预选位点3’端部分组成。这样修复DNA不含倾向于被第一双链断裂诱导酶切割的预选位点。然而，一经诱导同向重复中预选位点5’端和3’端部分共同的核苷酸序列之间的同源重组(这导致去除中断性(intermittent)的可选择或可筛选标记基因)，则预选位点的原始核苷酸序列得以重建。
因此，在第一实施方案中，本发明提供了在植物基因组、特别是核基因组中将靶DNA序列交换为目的DNA序列的方法，其包括如下步骤：
a)在植物细胞基因组的预选位点诱导第一双链DNA断裂，所述预选位点位于靶DNA序列内部或靶DNA序列附近，且所述预选位点被第一双链断裂诱导(DSBI)酶识别；
b)向植物细胞中引入修复DNA分子，所述修复DNA分子包含：
i)位于两侧翼DNA区域之间的目的DNA序列，所述侧翼DNA区域与侧接靶DNA序列的DNA区域，优选与侧接真核细胞基因组中预选位点的DNA区域具有至少80％的序列同源性；
ii)位于所述侧翼DNA区域之间的可选择或可筛选标记基因，所述可选择或可筛选标记基因还位于由预选位点5’端部分组成的第一重复序列和由预选位点3’端部分组成的第二序列之间，其中第一和第二重复序列之间共同的序列是同向重复；和
iii)位于一个侧翼DNA区域与第一第二重复序列之间的第二DSBI酶的至少一个识别位点；
c)选择含有可选择或可筛选标记的植物细胞群；
d)选择已经通过侧翼DNA区域的同源重组引入了目的DNA序列(和可选择或可筛选标记)的植物细胞，并从植物细胞再生植物；
e)使含有可选择标记基因的再生植物或其子代植物与含有编码罕见切割双链断裂诱导(“DSBI”)酶的嵌合基因的植物杂交，所述嵌合基因包含如下有效连接的DNA区段：
i.种系特异性启动子，如小孢子特异性启动子；
ii.编码识别位于目的DNA中的识别位点的双链DNA断裂诱导酶的DNA区域；
iii.转录终止和聚腺苷酸化区域；
f)选择含有所述可选择或可筛选标记基因和编码DSBI酶的嵌合基因的子代植物(F1植物)；
g)使子代植物与其他植物杂交，其中如果种系特异性启动子是在小孢子发生期间表达的启动子，则子代植物用作为花粉供体；或者其中如果种系特异性启动子是在大孢子发生期间表达的启动子，则子代植物用作为花粉受体；
h)选择含有编码DSBI酶的嵌合基因的子代植物群(F2群)；和
i)选择通过一个侧翼DNA区域与包含一个侧翼DNA区域一部分的部分侧翼DNA区域之间的同源重组缺失了可选择或可筛选标记基因的子代植物。
如本文所用，“诱导双链DNA断裂的罕见切割内切核酸酶”是能够在称为“识别位点”的特定核苷酸序列处诱导双链DNA断裂的酶。罕见切割内切核酸酶有时也称为兆碱基大范围核酸酶，具有14-40个连续核苷酸的识别位点。因此，罕见切割内切核酸酶具有非常低的切割频率，即便是较大的植物基因组也是如此。寻靶内切核酸酶组成此类罕见切割内切核酸酶的家族。它们可由内含子、独立基因或间插序列编码，并呈现出惊人的结 构和功能特性，使之有别于更为经典的限制酶，通常有别于II型细菌限制修饰体系。其识别位点具有一般的非对称性，这与大多数限制酶识别位点的特征性二对称性形成对照。已证明由内含子或内含肽编码的若干寻靶内切核酸酶促进其相应的遗传元件寻靶进入等位基因无内含子或无内含肽的位点。这些核酸酶通过在无内含子或无内含肽的等位基因中产生位点特异性双链断裂而创建重组发生末端，其参与基因转换过程，复制编码序列并导致在DNA水平插入内含子或间插序列。
一种充分表征的寻靶内切核酸酶是I-SceI。I-SceI是位点特异性内切核酸酶，负责酿酒酵母(Saccharomyces cerevisea)线粒体中的内含子移动。该酶由21S rRNA基因的任选内含子Sc LSU.1编码，并在内含子插入位点处引发双链DNA断裂，生成具有3’OH突出端的4bp交错切口。I-SceI内切核酸酶的识别位点延及18bp的非对称序列(Colleaux等人1988 Proc.Natl.Acad.Sci.美国85：6022-6026)。I-SceI的氨基酸序列和线粒体I-SceI基因的通用密码子等同体已经由例如WO 96/14408提供。WO 96/14408还公开了许多仍有功能的I-SceI蛋白变体。
PCT申请PCT/EP04/013122(并入本文作为参考)提供了已经为在植物中表达而优化的合成的I-SceI变体核苷酸序列。此合成的I-Sce编码区的核苷酸序列如SEQ ID No 1所示(UIPAC密码)。UIPAC密码符号具有其通常的含义，即N＝A或C或G或T；R＝A或G；Y＝C或T；B＝C或G或T(非A)；V＝A或C或G(非T)；D＝A或G或T(非C)；H＝A或C或T(非G)；K＝G或T；M＝A或C；S＝G或C；W＝A或T。
其他罕见切割DSB诱导酶及其相应识别位点的列表在WO 03/004659表I(17至20页)(并入本文作为参考)中提供。这些包括I-Sce I、I-Chu I、I-Dmo I、I-Cre I、I-Csm I、PI-Fli I、Pt-Mtu I、I-Ceu I、I-Sce II、I-Sce III、HO、PI-Civ I、PI-Ctr I、PI-Aae I、PI-BSU I、PI-DhaI、PI-Dra I、PI-MavI、PI-Mch I、PI-Mfu I、PI-Mfl I、PI-Mga I、PI-Mgo I、PI-Min I、PI-MkaI、PI-Mle I、PI-Mma I、PI-Msh I、PI-Msm I、PI-Mth I、PI-Mtu I、PI-MxeI、PI-Npu I、PI-Pfu I、PI-Rma I、PI-Spb I、PI-Ssp I、PI-Fac I、PI-Mja I、PI-Pho I、PI-Tag I、PI-Thy I、PI-Tko I或PI-Tsp I。
此外，可利用种种方法设计定制的识别基本上任何选择靶核苷酸序列的罕见切割内切核酸酶。简言之，可利用设计用以识别特异性核苷酸序列的锌指结构域与来自天然限制酶如FokI的非特异性DNA切割结构域之间的杂合体来制备嵌合限制酶。此类方法已经在例如WO 03/080809、WO94/18313或WO95/09233以及Isalan等人，2001，Nature Biotechnology19，656-660；Liu等人1997，Proc.Natl.Acad.Sci.美国94，5525-5530)中描述。另一种通过在变体文库中选择而产生定制的兆碱基大范围核酸酶的方法在WO2004/067736中描述。定制的具有改变的序列特异性和DNA结合亲和力的兆碱基大范围核酸酶也可以通过如WO2007/047859所述的理性设计而获得。
如本文所用，“预选位点”表示植物核基因组中期望在该位点插入外来DNA或交换靶DNA序列、位于靶DNA序列之中或其附近的特定核苷酸序列。本领域技术人员能够选择识别选择的靶核苷酸序列的双链DNA断裂诱导(“DSBI”)酶或改造这样的DSBI内切核酸酶。可选地，可利用任何常规转化方法或利用基因组中具有DSBI内切核酸酶识别位点的植物株系通过常规育种向植物基因组中引入DSBI内切核酸酶识别位点，之后可向先前引入的预选靶位点中引入任何期望的外来DNA。
可通过瞬时引入植物可表达的嵌合基因而便利地诱导转化DNA分子中的双链DNA断裂，所述嵌合基因包含有效连接于编码双链断裂诱导酶的DNA区域的植物可表达的启动子区域。编码双链断裂诱导酶的DNA区域可以是具有植物-优化密码子使用的合成DNA区域。内切核酸酶本身作为蛋白质也可通过例如电穿孔引入到植物细胞中。然而，内切核酸酶也可以瞬时方式提供：向植物细胞或植物中引入包含有效连接于诱导型植物可表达启动子的内切核酸酶编码区的嵌合基因，并在有限的时间内、在引入转化DNA分子之前、期间或之后即刻提供适当的诱导化合物。内切核酸酶也可作为编码该内切核酸酶的RNA前体提供。
双链断裂诱导酶可以包含但不必需包含核定位信号(NLS)，如SV40大 T抗原的NLS[Raikhel，Plant Physiol.100：1627-1632(1992)及其中的参考文献][Kalderon等人Cell 39：499-509(1984)]。核定位信号可位于蛋白质的任何地方，但便利地位于蛋白质的N-末端。核定位信号可替换双链断裂诱导酶的一个或多个氨基酸。
如本文所用，“靶DNA序列”是位于植物细胞基因组中的、通过添加、缺失或取代修饰的DNA序列。
如本文所用，“侧翼DNA区域”是与分别位于靶DNA序列上游或下游的DNA区域具有同源性的DNA序列。这允许更好地控制外来DNA或目的DNA分子的插入。实际上，通过同源重组的整合将允许外来DNA片段与植物核基因组在核苷酸水平上精确接合。
侧翼DNA区域长度可变，且应当至少约10个核苷酸长。然而，侧翼区域可如实践上可能的那样长(例如长达约100-150kb，如完整的细菌人工染色体(BAC))。优选侧翼区域将是约50bp至约2000bp。而且，侧接外来目的DNA的区域无需与侧接预选位点的DNA区域完全相同，而可以与侧接预选位点的DNA区域具有约80％至约100％的序列同一性，优选约95％至约100％的序列同一性。侧翼区域越长，同源性要求越不严格。此外，优选在精确插入外来DNA的位置附近的序列同一性如实践上可能的那样高。此外，为实现靶DNA序列的交换而不改变邻近DNA序列的DNA序列，侧翼DNA序列应当优选与侧接预选位点的DNA区域相同。
而且，侧接外来目的DNA的区域无需与直接侧接预选位点的区域具有同源性，但是可与核基因组中离该预选位点更远的DNA区域具有同源性。则插入外来DNA将导致去除位于预选插入位点和同源DNA区域之间的靶DNA。换句话说，位于同源区域之间的靶DNA将被外来目的DNA取代。
优选预选位点和另外提及的识别序列被不同的罕见切割双链断裂诱导内切核酸酶识别。
如本文所用，侧接“同向重复排列”的两DNA序列表示待从引入的DNA分子中去除的序列两端一前一后紧跟着两个DNA区域，其中两个 DNA区域在核苷酸序列上基本上相似。根据本发明，同向重复排列的DNA序列是待去除序列(即可选择或可筛选标记基因)上游的第一DNA序列，由预选位点(即诱导第一双链断裂的罕见切割酶所选择的位点)5’端部分组成，而待去除序列下游的第二DNA序列由预选位点3’端部分组成。本领域技术人员将会立刻明白，不同的预选位点可能长度和范围有所不同，例如15个核苷酸至50个核苷酸。从而，对应于预选序列5’端部分的序列是对应于预选序列(或识别位点)中在该序列3’末端缺少一个或多个核苷酸的核苷酸序列的序列，从而所述“5’端序列”不再被诱导双链断裂的罕见切割酶识别和/或切割。与之类似，对应于预选序列3’端部分的序列是对应于预选序列(或识别位点)中在该序列5’末端缺少一个或多个核苷酸的核苷酸序列的序列，从而所述“3’端序列”不再被诱导双链断裂的罕见切割酶识别和/或切割。5’端部分和3’端部分可缺少1、2、3、4、5、6、7、8或更多个核苷酸。而且，5’端和3’端部分所缺少的核苷酸数无需对应。例如，虽然5’端部分可在3’末端缺少识别位点的2个核苷酸，但是3’端部分可在5’末端缺少识别位点的5个核苷酸。同向重复中的实际序列将允许去除位于其间的核苷酸序列，对应于5’端部分和3’端部分之间共同的核苷酸序列。虽然实际同向重复序列的长度将取决于识别位点或预选位点的长度以及分别在3’和5’末端缺少的核苷酸的量，但是优选共同的核苷酸序列包含至少5、或10、或14或更多个核苷酸。请参见图3有关假定预选位点或识别位点5’端部分(dr1)和3’端部分的示意图。
本领域技术人员将会立刻明白，为本发明目的计，修复DNA不含预选位点。为此，可选择或可筛选标记应当优选直接侧接同向重复序列或者预选位点的5’端部分和3’端部分。优选两序列之一(5’端部分或3’端部分)应当位于修复DNA中就靶DNA而言的对应位置上。
为避免疑问，如果核苷酸序列相似的两个DNA区域包含在双链DNA分子之中，则这些DNA序列应当以相同的5’-＞3’方向位于同一DNA链上。
为了本发明的目的，表达为百分比的两相关核苷酸或氨基酸序列的“序列同一性”是指两最佳比对序列中具有相同残基的位置数(×100)除以比较 的位置数。空位，即比对中一个序列中存在残基而另一序列中不存在的位置，视为具有不一样残基的位置。两序列的比对通过Needleman和Wunsch算法(Needleman和Wunsch 1970)执行。计算机辅助的序列比对可便利地利用标准软件程序如10.1版Wisconsin包(Genetics Computer Group，Madison，Wisconsin，美国)一部分的GAP执行，应用默认计分矩阵，空位创建罚分为50，而空位延伸罚分为3。
如本文所用，“位于附近”是指DSBI位于离参照DNA序列500bp、1kbp至10kbp的距离。
根据本发明，诱导第二双链断裂的罕见切割酶的至少一个识别位点位于同向重复之间。在存在两个这样的识别位点的情况下，这样的识别位点或其部分可存在于同向重复中，且这样的位点或其亚部分之间的同源重组可以去除可选择或可筛选标记。然而，一经这样的同源重组，则诱导第二双链断裂的罕见切割酶的完整识别位点得以生成，且作为预选位点部分的第一和第二同向重复序列借助于间插序列的缺失得以更近地接触。同向重复序列密切邻近、侧接双链断裂诱导酶识别位点这样的格局有益于诱导两同向重复序列之间的高效重组，缺失余留的间插序列。
本文所述的应用于植物的方法可利用编码罕见切割双链断裂诱导酶的嵌合基因而便利地进行，其中内切核酸酶的编码区处于种系特异性启动子片段的控制之下。
如本文所用，“种系特异性启动子”是能够选择性地启动转录的启动子区域、启动子或片段，其优选特异性地在最终产生始于大孢子母细胞或性母细胞的配子的植物细胞中启动转录。因而，如本文所定义的种系特异性启动子包括配子体特异性启动子、配子特异性启动子、在小孢子和/或大孢子或其相应的直接前体细胞中控制表达的启动子。
如本文所用，“特异于配子发生的启动子”是能够选择性地启动转录的启动子区域、启动子或片段，其优选特异性地在作为配子直接前体细胞的植物细胞中启动转录。
在被子植物中，有性生殖需要产生可存活的雄配子体和雌配子体。花 粉作为雄配子体在花药内部形成，并始于发育为性母细胞的造孢细胞。性母细胞历经减数分裂，形成单倍体小孢子的四分体，随后释放到药室(anther locule)中。在扩增和空泡化之后，小孢子的不对称有丝分裂产生二胞花粉(bicellular pollen)，含有一个营养细胞和一个生殖细胞。在绝大多数物种中，花粉在二胞条件下释放。雌配子体、胚囊始于子房中大孢子母细胞的两次减数分裂，导致形成单倍体大孢子的线性四分体。合点大孢子增大为进行雌配子体发育的第一次有丝分裂做准备，而其他三个大孢子退化。有丝分裂在三代细胞核(three generations of nuclei)中发生，从而形成八核胚囊。在这些分裂过程中，从前的大孢子细胞增大并变得更加空泡化。八核细胞通过6个细胞核的细胞壁和附随的细胞质定界而组织成为七细胞的胚囊。珠孔端的三个细胞组成卵器，由卵细胞和两个助细胞组成。胚囊相反端是三个反足细胞。在这两群细胞之间是含有两个极核的大的中央细胞，极核可在受精前融合并形成二倍体次生胚乳核。
如本文所用，“小孢子特异性启动子区域”或“小孢子特异性启动子”或“小孢子特异性启动子片段”是能够选择性地启动转录的启动子区域、启动子或启动子片段，其优选特异性地在植物的单细胞小孢子中启动转录。适宜的小孢子特异性启动子区域在WO 97/30166(并入本文作为参考)中描述为来自烟草NTM19基因的启动子区域，而其在植物靶向交换方法中的用途在WO2006/105946中举例说明。
如本文所用，“大孢子特异性启动子区域”或“大孢子特异性启动子”或“大孢子特异性启动子片段”是能够选择性地启动转录的启动子区域、启动子或启动子片段，其优选特异性地在植物的单细胞大孢子中启动转录，优选在发育为胚囊的大孢子中启动转录。
特定启动子如BnSKP1γ1在植物的小孢子和大孢子中均可特异性地或选择性控制转录(Drouad等人2000 Sex Plant Reprod.13：29-35)。
更多在美国临时专利申请60/828,042和欧洲专利申请06020370.0中举例说明的种系特异性启动子可以是如下任一(以下引述文献并入本文作为参考)：
i.如Yang等人，2005，Plant Physiol.139(3)：1421-1432所述的包含融合于最小启动子元件如最小35S启动子的拟南芥卵器(EA)特异性增强子的启动子，
ii.如Galli等人，2003 Genetics.165(4)：2093-2105(在雄配子体和雌配子体中表达)所述的拟南芥TAG1启动子，
iii.如Rotman等人，2005 Curr Biol.15(3)：244-248所述的拟南芥Duo1启动子(雄性生殖细胞和精细胞活性)，
iv.如Yu等人，2005 Plant Physiology 139(4)：1853-1869所述的能够从雌配子体基因中分离的启动子，
v.来自百合属(lilum)植物LGC1的启动子，在雄性生殖细胞和精细胞中表达(Xu等人，1999 Proc Natl Acad Sci美国96(5)：2554-2558；Singh等人2003 FEBS Lett.2003 542(1-3)：47-52)，
vi.来自ERCC1同源物的启动子，在雄性精细胞中表达(Xu等人1998 Plant J.13(6)：823-829)，
vii.来自H2A或H3组蛋白基因的启动子(Xu等人1999 Malegametic cell-specific expression of H2A and H3 histone genes.PlantMolecular Biology 39，607-614；Okada等人(2005)Transcriptionalactivity of male gamete-specific histone gcH3 promoter in sperm cell ofLilium longiflorum.Plant and Cell Physiology 46，797-802)，
viii.如在稻(Chen，Schuan University，GenBank记录BE225314至BE225323，BF475189至BF475237)中以及在玉米(Engel等人，2003 ThePlant Journal 34：697-707)中鉴定的来自精细胞基因的启动子，
ix.分别特异于卵器和胚囊的Zmea1启动子(Marton等人Science.2005，307：573-576)和Zmes启动子(Cordts等人Plant J.200125(1)：103-114)，
x.包含GRSF识别的沉默子元件或种系限制性沉默因子的启动子(Haerizadeh等人2006 Science 28 313：496-499页)，
xi.如Guerche等人1999(Plant Molecular Biology 40：857-872)所 述的BnM1或BnM3.4启动子以及驱动小孢子特异性cDNAs M21表达的启动子。
如本文所用，“罕见切割双链断裂诱导内切核酸酶的编码区”或“罕见切割双链断裂诱导酶的编码区”是编码表征为罕见切割DSBI酶如寻靶内切核酸酶或本申请别处所述的嵌合内切核酸酶的多肽的核苷酸序列。因而编码区可包含编码任何下表所列寻靶内切核酸酶氨基酸序列的任何核苷酸序列，所述酶可根据提及的检索号在公共数据库中找到(全都并入本文作为参考)：
| DSBI酶 | 检索号 |
| I-AniI | P03880 |
| I-CvuI | P56347 |
| I-CreI | P05725 |
| I-ChuI | Q32001 |
| I-CpaI-I-CpaIII-I-Cpa IV-I-CpaV | Q39562/Q8WKZ5/Q8WKZ6/Q8WKZ8 |
| I-CpaII | Q39559 |
| I-CeuI | P32761 |
| I-DmoI | P21505 |
| I-SceI | P03882 |
| I-SceII | P03878 |
| I-SceIII | Q9ZZX3 |
| PI-SceI | P17255 |
| I-NanI | Q25535 |
| I-NitI | Q25567 |
| I-NjaI | Q25568 |
| I-PpoI | Q94702 |
| PI-PfuI | O73954 |
| PI-PkoI | P77933 |
| PI-PkoII | P77933 |
| PI-PspI | Q51334 |
| PI-TfuI | P74918 |
| PI-TfuII | P74918 |
| PI-ThyI | Q9HH05 |
| PI-ThyII | Q9HH05 |
| PI-TliI | P30317 |
| PI-TliII | P30317 |
| I-TevI | P13299 |
| I-TevII | P07072 |
| I-TevIII | Q38419 |
[0106] 显而易见的是，为在小孢子特异性启动子片段的控制下表达内切核酸酶，应当调整编码区，从而利用通用密码子语言编码上述多肽。编码区可进一步优化以便在植物中表达，且合成编码区可具有经设计满足如下标准的核苷酸序列：
a)核苷酸序列编码功能性罕见切割双链断裂诱导内切核酸酶；
b)核苷酸序列具有约50％至约60％的GC含量；
c)核苷酸序列不含选自以下的核苷酸序列：GATAAT、TATAAA、AATATA、AATATT、GATAAA、AATGAA、AATAAG、AATAAA、AATAAT、AACCAA、ATATAA、AATCAA、ATACTA、ATAAAA、ATGAAA、AAGCAT、ATTAAT、ATACAT、AAAATA、ATTAAA、AATTAA、AATACA和CATAAA；
d)核苷酸不含选自以下的核苷酸序列：CCAAT、ATTGG、GCAAT和ATTGC；
e)核苷酸序列不含选自以下的序列：ATTTA、AAGGT、AGGTA、GGTA或GCAGG；
f)核苷酸序列不含由选自G或C的7个连续核苷酸组成的GC链；
g)核苷酸序列不含由选自A或T的5个连续核苷酸组成的GC链；和
h)核苷酸序列不含在第2和3位含TA或CG对的、编码Leu、Ile、Val、Ser、Pro、Thr、Ala的密码子(即，核苷酸序列不含密码子TTA、CTA、ATA、GTA、TCG、CCG、ACG和GCG)。
双链断裂诱导酶可以包含但不必需包含核定位信号(NLS)[Raikhel，Plant Physiol.100：1627-1632(1992)及其中的参考文献]，如SV40大T抗原的NLS[Kalderon等人Cell 39：499-509(1984)]。核定位信号可位于蛋白质的任何地方，但便利地位于蛋白质的N-末端。核定位信号可替换双链断裂诱导酶的一个或多个氨基酸。
本领域技术人员在理解了本发明的基本原理之后，将会意识到该方法 可在不同于植物的真核生物细胞中应用。
因而，在本发明的另一实施方案中，提供了在真核细胞或真核生物的基因组中将靶DNA序列交换为目的DNA序列的方法，其包括如下步骤：
a.在真核生物细胞基因组的预选位点诱导第一双链DNA断裂，所述预选位点位于靶DNA序列内部或靶DNA序列附近，且所述预选位点被第一双链断裂诱导(DSBI)酶识别；
b.向所述真核细胞中引入修复DNA分子，所述修复DNA分子包含：
i.位于两侧翼DNA区域之间的目的DNA序列，所述侧翼DNA区域与侧接靶DNA序列的DNA区域，优选与侧接真核细胞基因组中预选位点的DNA区域具有至少80％的序列同源性；
ii.位于所述侧翼DNA区域之间的可选择或可筛选标记基因，所述可选择或可筛选标记基因还位于由预选位点5’端部分组成的第一重复序列和由预选位点3’端部分组成的第二序列之间，其中第一和第二重复序列之间共同的序列是同向重复；和
iii.位于一个侧翼DNA区域与第一第二重复序列之间的第二DSBI酶的至少一个识别位点；
c.选择含有可选择或可筛选标记的细胞群；
d.选择已经通过侧翼DNA区域的同源重组引入了可选择或可筛选标记的细胞；
e.在细胞中第二DSBI酶的识别位点处引入双链断裂；
f.选择通过同向重复之间的同源重组缺失了可选择或可筛选标记基因，由此重建了预选位点的子代细胞。
本文定义的就其在植物细胞中的含义而言的术语，能够作必要的修正而应用于真核细胞，特别是高等真核细胞，如一般意义上的脊椎动物、动物、哺乳动物。
同样显而易见的是，用于说明诸如“引入DNA片段”以及“从细胞再生植物”等方法的术语并不意味着这样的DNA片段必须需要通过转化技术引入。实际上，本领域技术人员将会立刻明白目的DNA分子也可以通过育种或杂交技术从一种植物引入到另一种植物中。
然而，显而易见的是目的DNA分子可通过任何本领域已知的方法引入到植物细胞中，包括农杆菌介导的转化以及通过直接DNA转移法。转化DNA分子可利用任何常规方法转移到植物细胞中，该方法包括但不限于直接DNA转移法。如本文所用，“直接DNA转移”是DNA引入到植物细胞中的任何方法，其不涉及使用天然农杆菌属物种(Agrobacterium spp.)，且能够将DNA引入到植物细胞中。这包括本领域熟知的方法，例如通过电穿孔将DNA引入到原生质体中，通过电穿孔将DNA引入到完整的植物细胞或部分降解的组织或植物细胞中，通过试剂如PEG等的作用将DNA引入到原生质体中，利用晶须硅(silicon whisker)，以及用DNA包裹的微弹轰击。
DNA可通过同源重组或非同源性末端联接方法而整合，后者包括在例如PCT/EP04/013122中所述的预选位点进行双链断裂诱导。
如本文所用的“可选择或可筛选标记”具有本领域通常的含义，并且包括但不限于植物可表达的膦丝菌素乙酰转移酶、新霉素磷酸转移酶、草甘膦氧化酶、草甘膦耐受性EPSP酶、腈水解酶基因、突变乙酰乳酸合酶或乙酰羟酸合酶基因、β-葡糖苷酸酶(β-glucoronidase，GUS)、R基因座位基因、绿色荧光蛋白等。
例如，可通过筛选存在于转化DNA之中但位于侧翼DNA区域外侧的序列的缺失，来实现已经通过侧翼DNA区域的同源重组引入了可选择或可筛选标记及其余外来DNA分子的植物细胞或植物的选择。实际上，有来自转化DNA侧翼DNA区域外侧的序列将说明转化的植物细胞来源于随机DNA插入。为此，可选择或可筛选标记可包括在转化DNA分子中侧翼DNA区域的外侧，接着可利用之鉴定没有位于转化DNA外侧的可选择或可筛选标记、且可能通过侧翼DNA区域的同源重组产生的那些植物细胞。可选地，转化DNA分子可含有这样的可选择标记，其位于侧翼DNA区域外侧，允许进行没有此类基因的选择(负选择标记基因)。
可以领会的是，本发明的手段和方法可在任何能够通过花粉或卵细胞繁殖的植物中使用，包括玉米、烟草、谷类植物，该谷类植物包括小麦、燕麦、大麦、黑麦、稻、草坪草、高粱、粟或甘蔗植物。本发明的方法也可应用于任何植物(被子植物门或裸子植物门)，包括但不限于棉花、卡诺拉油菜、油菜籽油菜、大豆、蔬菜、马铃薯、浮萍属物种(Lemna spp.)、烟草属物种(Nicotiana spp.)、拟南芥、苜蓿、大麦、豆类、玉米、棉花、亚麻、豌豆、油菜、稻、黑麦、红花、高粱、大豆、向日葵、烟草、小麦、芦笋、甜菜、椰菜、甘蓝、胡萝卜、花椰菜、芹菜、黄瓜、茄子、莴苣、洋葱、油菜籽油菜、胡椒、马铃薯、南瓜、萝卜、菠菜、倭瓜、番茄、西葫芦、杏属植物、苹果、李属植物、香蕉、黑莓、蓝莓、可可、樱桃、椰子、酸果蔓、海枣、葡萄、柚子、番石榴、猕猴桃、柠檬、莱檬、芒果、甜瓜、油桃、橙、木瓜、西番莲果、桃、花生、梨、菠萝、阿月浑子、李子、悬钩子、草莓、橘子、胡桃和西瓜。
本发明还有一个目的是提供根据本发明方法生成的植物细胞和植物。通过传统育种方法产生的、包含DNA插入事件的植物配子、种子、胚(合子胚或体细胞胚)、子代或杂合体，也包括在本发明范围之内。这样的植物可含有异源DNA序列而非靶序列，并且仅仅因为在交换后存在此异源DNA或DNA序列而有别于其祖先植物。
通过本文所述方法获得的植物可进一步通过传统育种技术与其他植物杂交，以获得根据本发明获得的包含靶向DNA插入事件的子代植物。
如下非限制性的实施例说明了利用双链DNA断裂诱导酶如I-SceI以及作为I-CeuI识别位点亚片段的同向重复，而从引入的DNA分子中去除选择的亚片段。
除非实施例中另有说明，所有重组DNA技术根据如Sambrook等人(1989)Molecular Cloning：A Laboratory Manual，Second Edition，ColdSpring Harbor Laboratory Press，NY和Ausubel等人(1994)CurrentProtocols in Molecular Biology，Current Protocols，美国第1和2卷，所述的标准方案进行。植物分子工作的标准材料和方法由R.D.D.Croy在PlantMolecular Biology Labfax(1993)中描述，由BIOS Scientific Publications Ltd(UK)和Blackwell Scientific Publications，UK联合出版。标准分子生物学技术的其他参考文献包括Sambrook和Russell(2001)Molecular Cloning：A Laboratory Manual，第三版，Cold Spring Harbor Laboratory Press，NY，Brown(1998)Molecular Biology LabFax，第二版，第I和II卷，AcademicPress(UK)。聚合酶链式反应的标准材料和方法可见Dieffenbach和Dveksler(1995)PCR Primer：A Laboratory Manual，Cold Spring HarborLaboratory Press，以及McPherson等人(2000)PCR-Basics：FromBackground to Bench，第一版，Springer Verlag，德国。
本说明书和实施例通篇述及如下序列：
SEQ ID No 1：合成I-SceI编码区的核苷酸序列(UIPAC密码)。
SEQ ID No 2：合成I-SceI编码区的核苷酸序列。
SEQ ID No 3：I-SceI识别位点的核苷酸序列。
SEQ ID No 4：I-CeuI识别位点的核苷酸序列。
实施例
利用常规重组DNA技术，构建了含有如下有效连接的DNA片段的T-DNA载体：
●CaMV 35S启动子区域
●编码可筛选标记(例如β-葡糖苷酸酶)无功能的N端部分的DNA区域
●由22个核苷酸的I-CeuI识别位点(SEQ ID No 4)的5’端区域组成的DNA序列
●可选择标记基因(如植物可表达的膦丝菌素乙酰转移酶)
●I-SceI识别位点(SEQ ID No 3)
●由22个核苷酸的I-CeuI识别位点的3’端区域组成的DNA序列
●编码可筛选标记无功能的C端部分的DNA区域(从而一经两I-CeuI来源的重复序列之间的同源重组，则生成可筛选标记的功能性编码区)
●参与转录终止和聚腺苷酸化的3’末端区域。
将T-DNA引入到烟草植物细胞中，并如本领域常规的那样再生转基因植物。可利用这些转基因烟草植物株系便利地确定I-CeuI识别位点的两个亚部分之间是否发生了同源重组，导致去除可选择标记基因并再生完整的可筛选标记。
在连接于新霉素抗性基因的NTM19小孢子特异性启动子的控制下表达I-SceI的转基因烟草植物已经在WO2006/105946中描述过。以类似的方式生成了在NTM19基因小孢子特异性启动子的控制下表达I-CeuI的转基因烟草植物。
使含有测试构建体的转基因植物与在NTM19小孢子特异性启动子的控制下表达I-SceI的转基因烟草植物或与在NTM19小孢子特异性启动子的控制下表达I-CeuI的转基因烟草植物杂交，并鉴定既含测试构建体又含嵌合I-SceI或I-CeuI区域的子代植物。利用这些植物作为花粉供体对非转基因植物进行授粉。
来自含有测试构建体的转基因植物与I-CeuI表达植物之间的最初杂交的子代植物并不表现出增加的同源重组频率，而来自含有测试构建体的转基因植物与I-SceI表达植物之间的最初杂交的子代植物呈现出增加的同源重组频率。
为测试同源重组是否能够在16个相同核苷酸长的短DNA序列之间发生，已构建了含有左右T-DNA边界序列的T-DNA载体，其在T-DNA边界之间具有可选择嵌合基因，其包含胭脂合酶启动子，有效连接于nptII编码区和来自胭脂合酶基因的终止子区域，并构建了另一嵌合构建体，其按顺序包含：
a.组成型启动子区域
b.16个核苷酸的核苷酸序列
c.I-SceI识别位点
d.编码绿色荧光蛋白(GFP)的DNA区域
e.与c)小项的I-SceI位点呈反向的I-SceI识别位点
f.与b)小项相同的16个核苷酸的核苷酸序列
g.编码β-葡糖苷酸酶(GUS)的DNA区域
h.来自胭脂合酶基因的终止子区域
已利用含有上述T-DNA载体的根癌农杆菌(Agrobacteriumtumefaciens)(EHA105)通过叶盘转化生成了转基因烟草植物，其中就卡那霉素抗性植物细胞进行了选择。
如所预期的那样，未观察到GUS在转基因植物的叶中表达，并选择了具有清晰GFP表达而无GUS表达的4个不同的转基因T0株系。
利用含有T-DNA载体的农杆菌菌株，对所选择的转基因株系的叶盘进行农杆菌介导的转化，所述T-DNA载体在T-DNA边界之间包含处于植物可表达启动子控制之下的嵌合I-SceI编码区和编码膦丝菌素抗性的可选择基因。就膦丝菌素抗性植物细胞进行了选择。
从所选择的植物细胞中获得转基因愈伤组织并再生植物。对植物组织和/或愈伤组织就GFP和GUS表达进行筛选。在16个核苷酸的同向重复序列之间已经发生了同源重组的植物中，缺失了GFP编码区，而GUS编码区置于组成型启动子的控制之下。从而植物材料为GFP表达阴性而GUS表达阳性。通过PCR从GFP阴性GUS阳性植物材料中扩增组成型启动子下游的DNA片段，并测定核苷酸序列，以确定同源重组是否通过16核苷酸的同向重复发生。
序列表
<110>拜尔生物科学公司(BAYER BIOSCIENCE N.V.)
拜尔作物科学有限公司(BAYER CROPSCIENCE S.A.)
<120>在真核生物中精确替换靶DNA的方法和手段
<130>BCS 07-2009
<150>EP07010998.8
<151>2007-06-05
<150>US 60/933814
<151>2007-06-08
<160>4
<170>PatentIn版本3.3
<210>1
<211>732
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>合成I-SceI编码区(UIPAC)
<220>
<221>变异
<222>(25)..(27)
<223>AGA
<220>
<221>变异
<222>(73)..(75)
<223>AGC
<220>
<221>变异
<222>(97)..(99)
<223>AGC
<220>
<221>变异
<222>(169)..(171)
<223>AGA
<220>
<221>变异
<222>(172)..(174)
<223>AGC
<220>
<221>变异
<222>(175)..(177)
<223>AGA
<220>
<221>变异
<222>(268)..(270)
<223>AGC
<220>
<221>变异
<222>(289)..(291)
<223>AGA
<220>
<221>变异
<222>(436)..(438)
<223>AGC
<220>
<221>变异
<222>(490)..(492)
<223>AGC
<220>
<221>变异
<222>(502)..(504)
<223>AGC
<220>
<221>变异
<222>(523)..(525)
<223>AGC
<220>
<221>变异
<222>(565)..(567)
<223>AGA
<220>
<221>变异
<222>(631)..(633)
<223>AGC
<220>
<221>变异
<222>(637)..(639)
<223>AGC
<220>
<221>变异
<222>(712)..(714)
<223>AGC
<220>
<221>变异
<222>(715)..(717)
<223>AGC
<400>1
atggcyaarc chcchaaraa raarcgsaaa gtsaacatya araaraacca ggtsatgaac 60
ctsggmccha actcmaarct sctsaargag tacaartcmc arctsatyga rctsaacaty 120
garcarttcg argcyggmat cggmctsaty ctsggmgayg cytacatycg stcmcgsgay 180
garggmaara cytactgyat gcagttcgar tggaaraaca argcytacat ggaycaygts 240
tgyctsctst acgaycartg ggtsctstcm cchcchcaya araargarcg sgtsaaccay 300
ctsggmaacc tsgtsatyac ytggggmgcy caracyttca arcaycargc yttcaacaar 360
ctsgcsaacc tsttcatyct saacaacaar aaracyatyc chaacaacct sgtsgaraac 420
tacctsacyc cyatgtcmct sgcytactgg ttcatggayg ayggmggmaa rtgggaytac 480
aacaaraact cmacyaacaa rtcmatygts ctsaacacyc artcmttcac yttcgargar 540
gtsgartacc tsgtsaargg mctscgsaac aarttccarc tsaactgyta cgtsaagaty 600
aacaaraaca arccyatyat ctacatygay tcmatgtcmt acctsatytt ctacaaccts 660
atyaarccht acctsatycc hcaratgatg tacaarctsc chaacacyat ytcmtcmgar 720
acyttcctsa ar 732
<210>2
<211>732
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>合成I-SceI编码区
<400>2
atggccaagc ctcccaagaa gaagcgcaaa gtgaacatca agaagaacca ggtgatgaac 60
ctgggaccta acagcaagct cctgaaggag tacaagagcc agctgatcga actgaacatc 120
gagcagttcg aagctggcat cggcctgatc ctgggcgatg cctacatcag atcccgggac 180
gaaggcaaga cctactgcat gcagttcgag tggaagaaca aggcctacat ggaccacgtg 240
tgtctgctgt acgaccagtg ggtcctgagc cctcctcaca agaaggagcg cgtgaaccat 300
ctgggcaacc tcgtgatcac ctggggagcc cagaccttca agcaccaggc cttcaacaag 360
ctggccaacc tgttcatcgt gaacaacaag aagaccatcc ccaacaacct cgtggagaac 420
tacctcactc ccatgagcct ggcctactgg ttcatggacg acggaggcaa gtgggactac 480
aacaagaaca gcaccaacaa gtcaattgtg ctgaacaccc aaagcttcac cttcgaagaa 540
gtggagtacc tcgtcaaggg cctgcgcaac aagttccagc tgaactgcta cgtgaagatc 600
aacaagaaca agcctatcat ctacatcgac agcatgagct acctgatctt ctacaacctg 660
atcaagccat acctgatccc tcagatgatg tacaagctgc ccaacaccat cagcagcgag 720
accttcctga ag 732
<210>3
<211>18
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>I-SceI识别位点
<400>3
tagggataac agggtaat 18
<210>4
<211>29
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>I-CeuI识别位点
<400>4
cgtaactata acggtcctaa ggtagcgaa 29
Claims (13)
1.在真核细胞或真核生物的基因组中将靶DNA序列交换为目的DNA序列的方法，其包括如下步骤：
a.在所述真核生物细胞基因组中的预选位点诱导第一双链DNA断裂，所述预选位点位于所述靶DNA序列内部，且所述预选位点被第一双链断裂诱导酶，DSBI酶识别；
b.向所述真核细胞中引入修复DNA分子，所述修复DNA分子包含：
i.位于两侧翼DNA区域之间的所述目的DNA序列，所述侧翼DNA区域与侧接所述靶DNA序列的DNA区域，与侧接所述真核细胞基因组中所述预选位点的DNA区域具有至少80％的序列同源性；
ii.位于所述侧翼DNA区域之间的可选择或可筛选标记基因，所述可选择或可筛选标记基因位于由所述预选位点5’端部分组成的第一重复序列和由所述预选位点3’端部分组成的第二序列之间，其中所述第一和第二重复序列之间共同的序列是同向重复；和
iii.位于所述一个侧翼DNA区域与所述第一第二重复序列之间的第二DSBI酶的至少一个识别位点；
c.选择含有所述可选择或可筛选标记的细胞群；
d.选择已经通过所述侧翼DNA区域的同源重组引入了所述可选择或可筛选标记的细胞；
e.在所述细胞中所述第二DSBI酶的识别位点处引入双链断裂；和
f.选择通过所述同向重复之间的同源重组缺失了所述可选择或可筛选标记基因，由此重建了所述预选位点的子代细胞。
2.权利要求1的方法，其中通过引入第一DSBI酶来诱导所述预选位点处的所述第一双链断裂，所述第一DSBI酶不识别位于所述修复DNA中的所述第二DSBI诱导酶的所述识别位点。
3.权利要求1的方法，其中所述第一DSBI酶和所述第二DSBI酶是选自以下的两种不同的DSBI酶：I-Sce I、I-Chu I、I-Dmo I、I-Cre I、I-CsmI、PI-Fli I、Pt-Mtu I、I-Ceu I、I-Sce II、I-Sce III、HO、PI-Civ I、PI-CtrI、PI-Aae I、PI-BSU I、PI-DhaI、PI-Dra I、PI-Mav I、PI-Mch I、PI-MfuI、PI-Mfl I、PI-Mga I、PI-Mgo I、PI-Min I、PI-Mka I、PI-Mle I、PI-MmaI、PI-Msh I、PI-Msm I、PI-Mth I、PI-Mtu I、PI-Mxe I、PI-Npu I、PI-PfuI、PI-Rma I、PI-Spb I、PI-Ssp I、PI-Fac I、PI-Mja I、PI-Pho I、PI-TagI、PI-Thy I、PI-Tko I或PI-Tsp I，或包含锌指DNA结合结构域和DNA切割结构域的嵌合内切核酸酶，或定制的兆碱基大范围核酸酶。
4.权利要求1的方法，其中所述第一DSBI酶是识别所述预选位点的定制的兆碱基大范围核酸酶。
5.权利要求1至4中任一项的方法，其中所述第二DSBI酶是I-SceI。
6.权利要求5的方法，其中所述第二DSBI酶是核苷酸序列SEQ IDNo 1或SEQ ID No 2编码的酶。
7.权利要求1至6中任一项的方法，其中所述真核细胞是植物细胞，或者所述真核生物是植物。
8.在植物基因组、特别是植物核基因组中将靶DNA序列交换为目的DNA序列的方法，其包括如下步骤：
a)在所述植物细胞基因组中的预选位点诱导第一双链DNA断裂，所述预选位点位于所述靶DNA序列内部，且所述预选位点被第一双链断裂诱导酶，DSBI酶识别；
b)向所述真核细胞中引入修复DNA分子，所述修复DNA分子包含：
i)位于两侧翼DNA区域之间的所述目的DNA序列，所述侧翼DNA区域与侧接所述靶DNA序列的DNA区域，与侧接所述真核细胞基因组中所述预选位点的DNA区域具有至少80％的序列同源性；
ii)位于所述侧翼DNA区域之间的可选择或可筛选标记基因，所述可选择或可筛选标记基因位于由所述预选位点5’端部分组成的第一重复序列和由所述预选位点3’端部分组成的第二序列之间，其中所述第一和第二重复序列之间共同的序列是同向重复；和
iii)位于所述一个侧翼DNA区域与所述第一第二重复序列之间的第二DSBI酶的至少一个识别位点；
c)选择含有可选择或可筛选标记的植物细胞群；
d)选择已经通过侧翼DNA区域的同源重组引入了目的DNA序列和可选择或可筛选标记的植物细胞，并从植物细胞再生植物；
e)使含有可选择标记基因的再生植物或其子代植物与含有编码罕见切割双链断裂诱导酶，“DSBI”酶的嵌合基因的植物杂交，所述嵌合基因包含如下有效连接的DNA区段：
i.种系特异性启动子；
ii.编码识别位于目的DNA中的识别位点的双链DNA断裂诱导酶的DNA区域；
iii.转录终止和聚腺苷酸化区域；
f)选择含有所述可选择或可筛选标记基因和编码DSBI酶的嵌合基因的子代植物，F1植物；
g)使子代植物与其他植物杂交，其中如果所述种系特异性启动子是小孢子特异性启动子，则子代植物用作为花粉供体；且其中如果所述种系特异性启动子是大孢子特异性启动子，则所述子代植物用作为花粉受体或雌性植物；
h)选择含有编码DSBI酶的嵌合基因的子代植物群，F2群；和
i)选择通过第一和第二同向重复序列之间的同源重组缺失了可选择或可筛选标记基因的子代植物。
9.权利要求8的方法，其中通过引入第一DSBI酶来诱导所述预选位点处的第一双链断裂，所述第一DSBI酶不识别位于所述修复DNA中的所述第二DSBI酶的所述识别位点。
10.权利要求8的方法，其中所述第一DSBI酶和所述第二DSBI酶是选自以下的两种不同的DSBI酶：I-Sce I、I-Chu I、I-Dmo I、I-Cre I、I-CsmI、PI-Fli I、Pt-Mtu I、I-Ceu I、I-Sce II、I-Sce III、HO、PI-Civ I、PI-CtrI、PI-Aae I、PI-BSU I、PI-DhaI、PI-Dra I、PI-Mav I、PI-Mch I、PI-MfuI、PI-Mfl I、PI-Mga I、PI-Mgo I、PI-Min I、PI-Mka I、PI-Mle I、PI-MmaI、PI-Msh I、PI-Msm I、PI-Mth I、PI-Mtu I、PI-Mxe I、PI-Npu I、PI-PfuI、PI-Rma I、PI-Spb I、PI-Ssp I、PI-Fac I、PI-Mja I、PI-Pho I、PI-TagI、PI-Thy I、PI-Tko I或PI-Tsp I，或包含锌指DNA结合结构域和DNA切割结构域的嵌合内切核酸酶，或定制的兆碱基大范围核酸酶。
11.权利要求8的方法，其中所述第一DSBI酶是识别所述预选位点的定制的兆碱基大范围核酸酶。
12.权利要求8至11中任一项的方法，其中所述第二DSBI酶是I-SceI。
13.DNA载体，其用于通过在靶DNA序列内部的预选位点处诱导双链断裂而在植物细胞基因组中将所述靶序列交换为目的DNA序列，所述DNA载体包含：
a.位于两侧翼DNA区域之间的所述目的DNA序列，所述侧翼DNA区域与侧接所述靶DNA序列并侧接所述预选位点的DNA区域具有至少80％的序列同源性；
b.位于所述侧翼DNA区域之间的可选择或可筛选标记基因，所述可选择或可筛选标记基因位于由所述预选位点5’端部分组成的第一重复序列和由所述预选位点3’端部分组成的第二序列之间，其中所述第一和第二重复序列之间共同的序列是同向重复；和
c.位于所述一个侧翼DNA区域与所述位于同向重复中的部分侧翼DNA区域之间的DSBI酶识别位点。
Applications Claiming Priority (5)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| EP07010998.8 | 2007-06-05 | ||
| EP07010998 | 2007-06-05 | ||
| US93381407P | 2007-06-08 | 2007-06-08 | |
| US60/933,814 | 2007-06-08 | ||
| PCT/EP2008/004524 WO2008148559A1 (en) | 2007-06-05 | 2008-06-03 | Methods and means for exact replacement of target dna in eukaryotic organisms |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN101688217A CN101688217A (zh) | 2010-03-31 |
| CN101688217B true CN101688217B (zh) | 2013-04-03 |
Family
ID=39673536
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN200880018868.7A Expired - Fee Related CN101688217B (zh) | 2007-06-05 | 2008-06-03 | 在真核生物中精确替换靶dna的方法和手段 |
Country Status (7)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US8765448B2 (zh) |
| EP (1) | EP2160467B1 (zh) |
| CN (1) | CN101688217B (zh) |
| AU (1) | AU2008258782B2 (zh) |
| BR (1) | BRPI0812233B1 (zh) |
| CA (1) | CA2689345C (zh) |
| WO (1) | WO2008148559A1 (zh) |
Families Citing this family (20)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP2568048A1 (en) | 2007-06-29 | 2013-03-13 | Pioneer Hi-Bred International, Inc. | Methods for altering the genome of a monocot plant cell |
| WO2009114321A2 (en) | 2008-03-11 | 2009-09-17 | Precision Biosciencs, Inc. | Rationally-designed meganucleases for maize genome engineering |
| ES2551318T3 (es) | 2008-04-21 | 2015-11-18 | Danziger Innovations Ltd. | Vectores de expresión virales de plantas y uso de los mismos para generar variaciones genotípicas en genomas de plantas |
| WO2011048600A1 (en) * | 2009-10-21 | 2011-04-28 | Danziger Innovations Ltd. | Generating genotypic variations in plant genomes by gamete infection |
| CA2801836A1 (en) | 2010-06-09 | 2011-12-15 | Bayer Cropscience Nv | Methods and means to modify a plant genome at a nucleotide sequence commonly used in plant genome engineering |
| US9593317B2 (en) | 2010-06-09 | 2017-03-14 | Bayer Cropscience Nv | Methods and means to modify a plant genome at a nucleotide sequence commonly used in plant genome engineering |
| CN102559704B (zh) * | 2010-12-23 | 2014-08-27 | 中国科学院上海生命科学研究院 | 一种在丙酮丁醇梭菌中敲除基因的方法 |
| MX2013010911A (es) * | 2011-03-23 | 2015-03-03 | Pioneer Hi Bred Int | Metodos para producir un locus de rasgo transgenico complejo. |
| MX348785B (es) * | 2011-06-06 | 2017-06-28 | Bayer Cropscience Nv | Metodos y medios para modificar un genoma vegetal en un sitio preseleccionado. |
| BR112014003919A2 (pt) | 2011-08-22 | 2017-03-14 | Bayer Cropscience Ag | métodos e meios para modificar um genoma de planta |
| EP2612918A1 (en) | 2012-01-06 | 2013-07-10 | BASF Plant Science Company GmbH | In planta recombination |
| US11518997B2 (en) | 2012-04-23 | 2022-12-06 | BASF Agricultural Solutions Seed US LLC | Targeted genome engineering in plants |
| BR112015025006A2 (pt) | 2013-04-02 | 2017-10-10 | Bayer Cropscience Nv | engenharia genômica alvejada em eucariontes |
| CA2922823C (en) | 2013-09-04 | 2023-01-17 | Dow Agrosciences Llc | Rapid targeting analysis in crops for determining donor insertion |
| US10077449B2 (en) | 2013-11-04 | 2018-09-18 | Dow Agrosciences Llc | Universal donor system for gene targeting |
| EP3191595B1 (en) | 2014-09-12 | 2019-12-25 | E. I. du Pont de Nemours and Company | Generation of site-specific-integration sites for complex trait loci in corn and soybean, and methods of use |
| CA2968808A1 (en) | 2014-11-27 | 2016-06-02 | Danziger Innovations Ltd. | Nucleic acid constructs for genome editing |
| US10767190B2 (en) | 2015-12-15 | 2020-09-08 | Basf Agricultural Solutions Seed, Us Llc | Brassicaceae plants resistant to Plasmodiophora brassicae (clubroot) |
| US20190225974A1 (en) | 2016-09-23 | 2019-07-25 | BASF Agricultural Solutions Seed US LLC | Targeted genome optimization in plants |
| US20230059309A1 (en) * | 2020-01-09 | 2023-02-23 | Pioneer Hi-Bred International, Inc. | Two-step gene swap |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN1480530A (zh) * | 2002-09-02 | 2004-03-10 | 大连科源农业生物工程有限公司 | 具有生物安全性的植物基因工程操作方法 |
| WO2006105946A2 (en) * | 2005-04-04 | 2006-10-12 | Bayer Bioscience N.V. | Methods and means for removal of a selected dna sequence |
Family Cites Families (14)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5436150A (en) | 1992-04-03 | 1995-07-25 | The Johns Hopkins University | Functional domains in flavobacterium okeanokoities (foki) restriction endonuclease |
| US5792632A (en) | 1992-05-05 | 1998-08-11 | Institut Pasteur | Nucleotide sequence encoding the enzyme I-SceI and the uses thereof |
| CA2154581C (en) | 1993-02-12 | 2008-12-16 | Srinivasan Chandrasegaran | Functional domains in flavobacterium okeanokoites (foki) restriction endonuclease |
| EP0790311A1 (en) | 1996-02-16 | 1997-08-20 | Centrum Voor Plantenveredelings- En Reproduktieonderzoek | Microspore-specific promoter from tobacco |
| JP2002535995A (ja) | 1999-02-03 | 2002-10-29 | ザ チルドレンズ メディカル センター コーポレイション | 染色体標的部位での二本鎖ｄｎａ切断の誘導を含む遺伝子修復 |
| DE10131786A1 (de) | 2001-07-04 | 2003-01-16 | Sungene Gmbh & Co Kgaa | Rekombinationssysteme und Verfahren zum Entfernen von Nukleinsäuresequenzen aus dem Genom eukaryotischer Organismen |
| EP2368982A3 (en) | 2002-03-21 | 2011-10-12 | Sangamo BioSciences, Inc. | Methods and compositions for using zinc finger endonucleases to enhance homologous recombination |
| US20060206949A1 (en) | 2003-01-28 | 2006-09-14 | Sylvain Arnould | Custom-made meganuclease and use thereof |
| PL1689870T3 (pl) * | 2003-11-18 | 2009-06-30 | Bayer Cropscience Nv | Ulepszona docelowa insercja DNA w roślinach |
| EP2650365B1 (en) | 2005-10-18 | 2016-09-14 | Precision Biosciences | Rationally designed meganucleases with altered sequence specificity and DNA-binding affinity |
| WO2007049095A1 (en) | 2005-10-25 | 2007-05-03 | Cellectis | Laglidadg homing endonuclease variants having mutations in two functional subdomains and use thereof |
| WO2007060495A1 (en) | 2005-10-25 | 2007-05-31 | Cellectis | I-crei homing endonuclease variants having novel cleavage specificity and use thereof |
| WO2007093836A1 (en) | 2006-02-13 | 2007-08-23 | Cellectis | Meganuclease variants cleaving a dna target sequence from a xp gene and uses thereof |
| CA2664414C (en) | 2006-09-28 | 2016-07-12 | Bayer Bioscience N.V. | Methods and means for removal of a selected dna sequence |
-
2008
- 2008-06-03 EP EP08759067.5A patent/EP2160467B1/en active Active
- 2008-06-03 US US12/663,172 patent/US8765448B2/en active Active
- 2008-06-03 CN CN200880018868.7A patent/CN101688217B/zh not_active Expired - Fee Related
- 2008-06-03 CA CA2689345A patent/CA2689345C/en not_active Expired - Fee Related
- 2008-06-03 BR BRPI0812233-4A patent/BRPI0812233B1/pt active IP Right Grant
- 2008-06-03 WO PCT/EP2008/004524 patent/WO2008148559A1/en active Application Filing
- 2008-06-03 AU AU2008258782A patent/AU2008258782B2/en not_active Ceased
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN1480530A (zh) * | 2002-09-02 | 2004-03-10 | 大连科源农业生物工程有限公司 | 具有生物安全性的植物基因工程操作方法 |
| WO2006105946A2 (en) * | 2005-04-04 | 2006-10-12 | Bayer Bioscience N.V. | Methods and means for removal of a selected dna sequence |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN101688217A (zh) | 2010-03-31 |
| US20100175143A1 (en) | 2010-07-08 |
| AU2008258782A1 (en) | 2008-12-11 |
| US8765448B2 (en) | 2014-07-01 |
| EP2160467B1 (en) | 2015-10-28 |
| AU2008258782B2 (en) | 2013-09-19 |
| EP2160467A1 (en) | 2010-03-10 |
| WO2008148559A1 (en) | 2008-12-11 |
| BRPI0812233B1 (pt) | 2022-10-04 |
| CA2689345C (en) | 2017-07-11 |
| CA2689345A1 (en) | 2008-12-11 |
| BRPI0812233A2 (pt) | 2014-10-07 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN101688217B (zh) | 在真核生物中精确替换靶dna的方法和手段 | |
| CN102286456B (zh) | 用于去除所选择dna序列的方法和手段 | |
| US20240124884A1 (en) | Methods and compositions for use of directed recombination in plant breeding | |
| US8367890B2 (en) | Methods and means for removal of a selected DNA sequence | |
| Liu et al. | Efficient induction of haploid plants in wheat by editing of TaMTL using an optimized Agrobacterium-mediated CRISPR system | |
| Zheng et al. | CRISPR/Cas9-based gene editing using egg cell-specific promoters in Arabidopsis and soybean | |
| CN110709519A (zh) | 表达调控元件及其用途 | |
| WO2019219046A1 (zh) | 一种快速高效获得非转基因的定向基因突变植物的方法和应用 | |
| US11104910B2 (en) | Compositions and methods for regulating gene expression for targeted mutagenesis | |
| Hillary et al. | Application of CRISPR/Cas9 genome editing system in cereal crops | |
| CN105209623A (zh) | 显性雄性不育的操纵 | |
| US20230279418A1 (en) | Plant haploid induction | |
| US20200157559A1 (en) | Methods to improve plant agronomic trait using bcs1l gene and guide rna/cas endonuclease systems | |
| Kershanskaya | New breakthrough CRISPR/cas9 biotechnology of genome editing for creation of elite crops in Kazakhstan | |
| CN116529370A (zh) | 具有特征性原间隔子相邻基序或特征性指导rna识别位点的可切除植物转基因基因座 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| ASS | Succession or assignment of patent right |
Owner name: BAYER CROPSCIENCE N.V. Free format text: FORMER OWNER: BAYER BIOCHEMICAL SCIENCES S.A. Effective date: 20120428 |
|
| C41 | Transfer of patent application or patent right or utility model | ||
| TA01 | Transfer of patent application right |
Effective date of registration: 20120428 Address after: Belgium Applicant after: Bayer CropScience N.V. Co-applicant after: BAYER CROPSCIENCE GmbH Address before: Ghent Applicant before: BAYER BIOSCIENCE N.V. Co-applicant before: BAYER CROPSCIENCE GmbH |
|
| C14 | Grant of patent or utility model | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| ASS | Succession or assignment of patent right |
Owner name: BAYER CROPSCIENCE AG Free format text: FORMER OWNER: BAYER AKTIENGESELLSCHAFT Effective date: 20140318 |
|
| C41 | Transfer of patent application or patent right or utility model | ||
| C56 | Change in the name or address of the patentee | ||
| CP01 | Change in the name or title of a patent holder |
Address after: Belgium Patentee after: Bayer CropScience N.V. Patentee after: Bayer AG Address before: Belgium Patentee before: Bayer CropScience N.V. Patentee before: BAYER CROPSCIENCE GmbH |
|
| TR01 | Transfer of patent right |
Effective date of registration: 20140318 Address after: Belgium Patentee after: Bayer CropScience N.V. Patentee after: BAYER CROPSCIENCE AG Address before: Belgium Patentee before: Bayer CropScience N.V. Patentee before: Bayer AG |
|
| CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee | ||
| CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee |
Granted publication date: 20130403 Termination date: 20200603 |