【具体实施方式】
以下是本发明提供的六个最佳实施例。实施例1 含有T-DNA边界序列和植酸酶基因转化元件的构建及花粉管通道法转化玉米和大豆(a)植酸酶基因phyI的获得
用马铃薯培养基30℃震荡培养无花果曲霉A.ficuum As3.324,24小时后收集菌体提取基因组DNA。以A.ficuum NRRL3135的phyA核苷酸序列作参考,设计两条PCR引物(F15’-AGGTGGGATGAAGGG GTTAT-3’,R1 5’-CAGCGGCCGCCTAAGCAAAACTCTCCGCCC-3’),PCR扩增获得全长为1515bp的phyI结构基因(GenBank,AY013315),+46-+156的11个核苷酸为内含子序列,其中含有真菌内含子的特征保守序列(Doner序列:GTATGC;Lariat序列:GCTGAC;Acceptor序列:CAG)。phyI共编码467个氨基酸,N端的19个氨基酸为信号肽。在phyI编码的氨基酸序列中存在10个潜在的糖基化位点,81-88位氨基酸为植酸酶的活性位点保守序列:RHGARYPT。
phyI基因序列如下:
1 gaggaccggc tggtccggtg caatggccat cgccatcaat tgctgctgtg caagaaattt
61 ctcctcatag gtatcatggg tgtctctgcc gttctacttc ctttgtacct cctgtccgga
241 ggactggcag tccccgcctc gagaaatcaa tccacttgcg atacggtcga tcaggggtat
301 caatgcttct cggagacttc gcatctttgg ggccaatacg cgccgttctt ttctctggca
361 aacaaatcgg ccatctcccc tgatgttcct gccggatgcc atgtcacttt cgcccaggtt
481 atcgaggaga tccagcagaa cgcgacaacc ttcgagggga aatatgcctt cctgaagaca
541 tacaactaca gcctgggcgc ggatgacctg actcccttcg gagagcagga gctggtcaac
601 tccggcgtca agttctacca gcgatacgaa tcgctcacaa gaaacattgt cccgttcatc
661 cgatcctcag gctccagccg cgtgattgcc tctggcaata aattcatcga gggcttccag
721 agcactaagc tgaaggatcc tcgtgcccag cccggccaat cgtcgcccaa gatcgacgtg
781 gtcatttcag aggccagcac atccaacaac actctcgatc cgggcacctg caccgttttc
841 gaagatagcg aattggccga tgacatcgaa gccaatttca ccgccacgtt cgtcccctcc
901 attcgtcaac gtctggagaa cgacttgtct ggcgtgtctc tcacggacac agaagtgacc
961 tacctcatgg acatgtgctc cttcgacacc atctccacca gcaccgtcga caccaagctg
1021 tcccccttct gtgacctgtt cacccatgaa gaatggatca actacgacta cctccagtcc
1081 ctgaacaaat actacggcca tggcgcaggt aacccgctcg gcccgaccca gggcgtcggc
1141 tacgctaacg agctcatcgc ccgtctcacc cactcgcctg tccacgatga caccagctcc
1201 aaccacacat tggactccaa cccggctact ttcccgctca actccactct ctatgcggac
1261 ttttcgcatg ataacggcat catctctatc ctctttgctt tgggtctgta caacggcacc
1321 aagccgctgt cttccacgac cgcggagaat atcacccaga ccgatgggtt ctcatctgcc
1381 cggacggttc ctttcgcgtc gcgcatgtac gtcgagatga tgcaatgcca gtccgagcag
1441 gagcctttgg tccgtgtctt ggttaatgat cgtgttgttc cgctgcatgg ctgtccggtt
1501 gatgctttgg gaagatgtac gcgggatagc ttcgtgaagg ggttgagctt tgccagatct
1561 ggcggtgatt gggcggagtg ttttgcttag
注:
翻译起始密码子;
翻译终止密码子;
内含子序列
酶活性中心编码序列。(b)基因转化元件TCPNT的构建
基因转化元件TCPNT结构为:
5’-T-DNA-CaMV35S-phyII-Nos-T-DNA-3’
具体策略如下:利用PCR方法获得去掉内含子的植酸酶基因phyII。克隆至植物表达载体pBI121中,构成pBI121/phyII重组质粒,用PCR方法扩增获得带有T-DNA边界序列的转化元件TCPNT。引物序列如下:TR:5’
-GTTTACCCGCCAATATATCCTGTCACCGATCTAGTAACATAGATGACACCGC-3’TF:5’
-TGGCAGGATATATTGTGGTGTAAACTGCCTGCAGGTCCCCAGATTAGCCTT-3’注:下划线为T-DNA边界序列。
PCR反应条件如下:94℃预变性5min,94℃变性30sec,55℃退火1min,72℃延伸1.5min,共30个循环,最后72℃延伸10min。
PCR扩增TCpNT片段大小约2.7kb,经氯仿/异戊醇抽提,吸取上清,无水乙醇沉淀,吹干后溶于0.1×SSC溶液,终浓度为300ng/ul,待用于转化。(c)花粉管通道法转化玉米和大豆
种植玉米自交系137、K12和C8605-2,待生长至开花期做雌、雄花套袋隔离,雄花套袋隔离24小时后自花授粉。24小时后切除部分雌花柱头,将100ulTCPNT溶液滴于切口处,套袋。对照植株只转化0.1×SSC溶液(不含TCPNT)。成熟后收获种子。
选择大豆品种早熟91025-7、辽豆16和铁丰29,在大豆自花授粉后6-32小时(花冠高于花萼1mm左右)切除柱头,将5ulTCPNT溶液滴于切口处。如果气温较高,补滴一次。标记处理的花朵,并摘除该花所在果枝的顶心。成熟后收获种子。(d)转化植株的检测PCR检测 根据phyII基因序列设计引物:
F4:5’-CCAAGGGCAAGAAATACTCC-3’
R4:5’-GAGAGACACGCCAGACAAG-3’
以玉米幼叶基因组DNA为模板进行PCR扩增,获得0.5kb的目的基因片段。检测137品系1019株,其中阳性植株132株;检测C8605-2品系960株,获得阳性植株94株。
以大豆幼叶基因组DNA为模板进行PCR扩增,获得0.5kb的目的基因片段。检测早熟91025-7品种121株,其中阳性植株19株;检测辽豆16品种259株,其中阳性植株57株,检测铁丰29品种78株,其中阳性植株6株。SOUTHERN BLOT分析 PCR检测阳性植株的玉米和大豆基因组DNA经EcoRI酶切,琼脂糖电泳,转膜。以R4和F4为引物,以pBI121/phyII质粒为模板进行PCR扩增获得约0.5KbDNA片段,用ECL试剂盒(amersham pharmaciabiotech)标记探针,进行SOUTHERN杂交。SOUTHERN杂交分析表明,转化的植酸酶基因已经整合到玉米和大豆的基因组上。酶活性分析 取PCR检测阳性的玉米或大豆叶片及对照植株叶片于研钵中,加入适量的pH5.5的醋酸-醋酸钠缓冲溶液,研磨、离心,取上清液用于植酸酶活性测定。取0.1ml待测液(空白对照为0.1ml蒸馏水),加0.9ml1.25mM植酸钠溶液摇匀,37℃水浴保温反应15min后,立即加入1ml10%TCA摇匀终止反应(对照样品为先加入1ml10%TCA,然后37℃水浴保温反应15min),加入2ml0.5%对苯二酚溶液摇匀,用蒸馏水定容至20ml,静置30min后,在660nm处用分光光度计测定吸光值。酶活性计算公式如下:
U:酶活性单位(nmol/min.ml)
OD:测定样品660nm下的吸光度
OD0:对照样品660nm下的吸光度
N:样品的稀释倍数
3l:磷的原子量
K:标准曲线斜率
T:酶作用时间透明圈筛选首先配制植酸钙溶液:3克醋酸钙溶于100毫升去离子水中,1克植酸溶于400毫升去离子水中。将醋酸钙溶液在不断搅拌下缓缓加入到植酸溶液中,将混合液加热至沸,并不断搅拌,混合液冷至室温后于4℃下过夜。用此植酸钙溶液中,按PDA培养基配方加入各种组分,151bf/in2(1.034×105Pa)高压下蒸汽灭菌20min,倒平板备用。
选取8株玉米转基因幼苗,接种于植酸酶菌株筛选培养基上,30℃,倒置培养72小时。水解培养基中的不溶性植酸钙形成水解圈。8株被检幼苗中,5株有水解圈,证明植酸酶基因已获得表达。(e)转基因植株遗传稳定性分析
对于子二代的玉米植株采用上述检测手段分析。实验数据表明外源植酸酶基因已在玉米基因组内稳定遗传,其它形态性状没有变化。实施例2 含有核基质区(MAR)边界序列和胆碱单加氧酶(CMO)基因转化元件的构建及花粉管通道法转化水稻(a)胆碱单加氧酶(choline monooxygenase,CMO)基因的获得
用RT-PCR和RACE技术获得盐生植物辽宁碱蓬(Suaeda liaotungensiskitag)胆碱单加氧酶基因(CMO,GenBank,AF354442)cDNA全序列。CMOcDNA全长1820bp,5′端非编码区123bp,3′端非编码区368bp,含有2个可能的加polyA信号:AATAA、AATTAA,开放阅读框1329个核苷酸,编码442个氨基酸,其中含有成熟肽链起始区“AVA”,具备Rieske-type〔2Fe-S〕蛋白的保守Cys-His对“CTH”和“CPYH”,包括保守的多铁原子核结合域“DNYLD”和“HVPYAH”。
CMO基因序列如下:
1 gcacaaactt gttagttgta taactctaca caacacaagc aagaagctaa gccaaaccaa
61 gctaagctta aggaggaata acatttcatc atataatctt aatttaattt aaggtcttgt
121 ttgatggctg catcagcaag tgctaccaca atgttgctaa aatacccaac tatttgtgga
181 gtaccaaaca atgaatcttc atcttgttca ccaaaagata atcatctcaa tgtttctcaa
241 caacaaaaca acaacaaccc tttactcaaa tttagaacac aaccaactaa actagttgcc
301 aacgcagtcg cttcgccggt tttccctgct tcttcaacca caacatcatc accttcttct
361 tcttccatca atcaacttgt tcatgaattt gatcctaaaa ttccacctga agatgctttt
421 actcctccta gctcttggta tactgaacct gccttctact ctcatgaact tgaccgtatc
481 ttttacaaag gatggcaagt tgcaggaata agtgaccaaa tcaaggagaa aaaccagtac
541 ttcactggca ctttaggaaa tgttgaatat gtggtgagcc gagatggtga aggaaaagtt
601 catgcatttc acaatgtttg cactcaccgt gcttctattc ttgcttgtgg aagtggcaaa
661 aagtcctgct ttgtgtgccc ttaccatgga tgggtgtttg gcatggatgg agacctcaca
721 aaagccaccc aaacaactga tgcacaaaca tttgatccta aagaatatgg cttaaaaccc
781 ctaaaggttg cagtatgggg accattcgtt ctcatcagtt tggacaaaac tcttccggaa
841 agtgatgttg gcactgagtg gcttggttct agtgccgaag atgttaaggc ccatgccttt
901 gatccctctc tcaaattcat tcatagaagt gaattcccca tggaatgtaa ctggaaggtc
961 tttagtgaca actacttgga tagctcatac catgttcctt acgcacacaa atactatgca
1021 actgaacttg actttgatac ttatgacact caaacaatcg gcaaagttgt gatccaaaga
1081 gttggaagca acacaaacag gcctgatggt ttcgatagac ttggagagaa agcattctat
1141 gcttttactt atcccaactt tgctgtggaa aggtatggcc cttggatgac aacaatgcat
1201 gttcagccaa tagctcaaag gaaatgcaaa ttagtggtgg actattacat tgaagactct
1261 ttgctggata acaaggatta catcgaaaaa ggaatagcaa tcaacgacaa cgtacagaaa
1321 gaagataagg tgttgtgtga aagtgtccaa aagggtctgg agacaccagc atatcgttct
1381 ggcagatatg tgatgccaat tgagaaagga atccaccatt tccactgctg gttgcaccaa
1441 attttgaagt gatttaattt gccctaagtt tcattgttcc atggatatta attataaaga
1501 gtcgaagtcg aattccgcat aattaaaact gttgtcaaac atatggtctt aatgtagtat
1561 tttttatgta tgttgtatgg tcataagcaa atgttttatt gcttgtgttc ttggaaaaca
1621 atttggtgct aatgtctatt ataaataaac accaccatag caccctctcc ccgaaaagaa
1681 tctcgaatat tcccaaagag gatgggaatc tgagattgtt gatgaatgat gaacatgtat
1741 tgagaactat gtatgatttt tcatcagtta tattatagaa tgaaagaaca atgtgtgttg
1801 attaaaaaaa aaaaaaaaaa(b)基因转化元件MCCNM的构建
基因转化元件MCCNM结构为:
5’-MAR-CaMV35S-CMO-Nos-MAR-3’
具体策略如下:
利用PCR方法获得CMO基因的编码区,克隆到植物表达载体pBI121中,构成pBI121/CMO重组质粒,引物序列如下:
CF 5’-GGGGATCCAATTTAAGGTCTTGTTTGATGGCTG-3’
CR 5’-GGGAGCTCTCACTTCAAAATTTGGTGCAACC-3’
通过PCR方法从烟草基因组DNA中获得MAR序列(上游引物5’-CGATTAAAAATCCCAATTATATTTGG-3’,下游引物5’-CCCTTGAAGAAGACTTTTATCA-3’),长度为1167bp。将两个MAR片段同向连接在pUC19载体上。
MAR序列如下:
1 cgattaaaaa tcccaattat atttggtcta atttagtttg gtattgagta aaacaaattc
61 gaaccaaacc aaaatataaa tatatagttt ttatatatat gcctttaaga ctttttatag
121 aattttcttt aaaaaatatc tagaaatatt tgcgactctt ctggcatgta atatttcgtt
181 aaatatgaag tgctccattt ttattaactt taaataattg gttgtacgat cactttctta
241 tcaagtgtta ctaaaatgcg tcaatctctt tgttcttcca tattcatatg tcaaaatcta
301 tcaaaattct tatatatctt tttcgaattt gaagtgaaat ttcgataatt taaaattaaa
361 tagaacatat cattatttag gtatcatatt gatttttata cttaattact aaatttggtt
421 aactttgaaa gtgtacatca acgaaaaatt agtcaaacga ctaaaataaa taaatatcat
481 gtgttattaa gaaaattctc ctataagaat attttaatag atcatatgtt tgtaaaaaaa
541 attaattttt actaacacat atatttactt atcaaaaatt tgacaaagta agattaaaat
601 aatattcatc taacaaaaaa aaaaccagaa aatgctgaaa acccggcaaa accgaaccaa
661 tccaaaccga tatagttggt ttggtttgat tttgatataa accgaaccaa ctcggtccat
721 ttgcacccct aatcataata gctttaatat ttcaagatat tattaagtta acgttgtcaa
781 tatcctggaa attttgcaaa atgaatcaag cctatatggc tgtaatatga atttaaaagc
841 agctcgatgt ggtggtaata tgtaatttac ttgattctaa aaaaatatcc caagtattaa
901 taatttctgc taggaagaag gttagctacg atttacagca aagccagaat acaaagaacc
961 ataaagtgat tgaagctcga aatatacgaa ggaacaaata tttttaaaaa aatacgcaat
1021 gacttggaac aaaagaaagt gatatatttt ttgttcttaa acaagcatcc cctctaaaga
1081 atggcagttt tcctttgcat gtaactatta tgctcccttc gttacaaaaa ttttggacta
1141 ctattgggaa cttcttctga aaatagt
用PstI/EcoRI酶切pBI121/CMO重组质粒,获得含有CaMV35S-CMO-Nos的片段,并插入到pUC19/MAR片段之间,构成基因转化元件MCCNM。
酶切获得MCCNM片段大小约4.9kb,经氯仿/异戊醇抽提,吸取上清,无水乙醇沉淀,吹干后溶于0.1×SSC溶液,终浓度为300ng/ul,待用于转化。(c)花粉管通道法转化水稻
选择水稻品种辽粳294、辽粳454和铁粳4号。在水稻开花后1-3小时内,剪掉已开过的颖花和当日不能开的颖花,选择当日开放的颖花,逐个将颖壳剪掉1/3,用微量注射器滴注MCCNM溶液,每朵颖花10ul,套袋。对照植株只转化0.1×SSC溶液(不含MCCNM)。成熟后收获种子。(d)转化植株的检测PCR检测 用CF和CR引物,以转化的水稻幼苗基因组DNA为模板进行PCR扩增,获得1.4kb的目的基因片段。SOUTHERN BLOT分析 PCR检测阳性植株的水稻基因组DNA经EcoRI酶切,琼脂糖电泳,转膜。以CF和CR1(5’-GAATAGAAGCACGGTGAGTGC-3’)为引物,以pBI121/CMO质粒为模板进行PCR扩增获得约0.52KbDNA片段,用ECL试剂盒(Amersham Pharmacia Biotech)标记探针,进行SOUTHERN杂交。SOUTHERN杂交分析表明,转化的CMO基因已经整合到水稻基因组上。甜菜碱含量测定 取1.5g植物材料加入10ml甜菜碱提取液(甲醇∶氯仿∶水=12∶5∶3(V/V))后进行研磨。匀浆液在60~70℃水浴中保温10min。冷却后,于20℃下1000×g离心10min,收集水相。氯仿相再加入10ml提取液,反复振荡,离心取上层水相合并,调pH至5~7,在70℃下蒸干,用3ml超纯水重新溶解。
在10~400g/ml范围内分别制作甜菜碱和胆碱标准曲线。
甜菜碱的标准曲线:配制QACs沉淀溶液。每个浓度的标准溶液0.5ml加入0.2mlQACs沉淀溶液混匀,0℃下保温90min,间歇振荡。加入2ml预冷水,迅速加入20ml经10℃预冷的二氯乙烷,在4℃下剧烈振荡5min,4℃下静置至两相完全分开。恢复至室温,取下相测OD365。
胆碱的标准曲线:步骤同上,但反应试剂为胆碱沉淀溶液。
按标准曲线制作方法分别测得四价铵化合物与胆碱在365nm处的吸收值,通过标准曲线得到相应的四价铵化合物与胆碱的含量,两项相减,即求出甜菜碱的含量。耐盐能力检测 在转化水稻三叶期开始用1%-1.5%Nacl溶液浇灌,每2-3天一次,共筛选4-6周,存活植株经缓苗后移栽。相对电导率测定 将新鲜叶片用300mmol/L NaCl胁迫处理4h,分别称取0.2g叶片两份,各加5ml超纯水,一份于25℃、170rpm/min振荡2h,另一份于沸水浴中加热30min,分别用DDS-12数字电导仪测定电导率(所用的电极参数为0.95)。前者定义为Rc,后者定义为Rc′,相对电导率为Rc/Rc′×100%。(e)转基因植株遗传稳定性分析
对于子代的水稻植株采用上述检测手段分析,实验数据表明外源CMO基因在水稻基因组内稳定遗传。实施例3 含有核基质区(MAR)边界序列和甜菜碱醛脱氢酶(BADH)基因转化元件的构建及花粉管通道法转化小麦(a)甜菜碱醛脱氢酶(betaine aldehyde dehydrogenase,BADH)基因的获得
用RT-PCR和RACE技术获得辽宁碱蓬(Suaeda liaotungensis kitag)甜菜碱醛脱氢酶基因(BADH,GenBank,AF359282)cDNA全序列。BADH cDNA全长1901bp,5’端非编码区66bp,3’端非编码区329bp,含有2个可能的加polyA信号:AATAA,开放阅读框1506bp,编码502个氨基酸,其中有醛脱氢酶的保守序列VTLELGGKSP和半胱氨酸残基C。
BADH序列如下:
1 gcttctcact ctttcccttt tctctcctcc catttttcat cgtcaactca atttctttct
61 gcaacaatgt cgatccctat accttctcgt cagctattca ttgatggaga gtggagagaa
121 cccatcaaac gaaatcgtct cccaattatt aatccttcca ctgaagaaac cattggggaa
181 attccagcag caacagctga ggatgttgaa gcagcagtaa gtgctgctag aagagcactt
241 aagaggaaca aagggagaga ttgggctgct acttctggag ctcaccgtgc tagatacttg
301 cgtgctattg ctgctaaggt atcagaaaaa aaagaccatt ttgttaaact tgaaaccatg
361 gattctggga aaccactgga tgaagcagtg ttggacatag atgacgtttc gacatgtttt
421 gaatattttg ctgatcaagc agaagctctg gacaacaagc aaaagtatcc agtcaaactt
481 cctatggaca gatttaaaag tcatgttctc aggcagccta ttggtgttgt gggattaatt
541 tcgccatgga attacccact tttgatggcg acatggaaaa tcgctccagc tcttgctgca
601 ggctgtacag ctgtacttaa gccatccgag ttggcatctg tgacttgtct agaattcggt
661 gaagtttgca acgaagtggg acttcctcct ggtgtgttaa atattttgac gggattaggt
721 ccagatgcgg gtgcaccatt agtgtctcat cctgatgttg acaaggttgc attcactggg
781 agtagtgcta ctggaagcaa ggttatgggt tctgctgccc aattggttaa gcctgtcacc
841 ttggaacttg gaggtaaaag tcctataatc gtgttcgaag atgttgttga tcttgatgta
901 gctgctgaat ggactatctt tggtgttttc tggacaaatg gtcaaatatg tagcgcaact
961 tctagactgc ttgtgcatga gagtattgca gctgaatttg ttgaaaagct tgtaaaatgg
1021 tccaagaaaa taaagatttc tgatccattt gaagaaggat gccggcttgg ccctgttatt
1081 agcaagggac agtatgacaa aattatgaag tacatatcga cagcaaagag tgagggggca
1141 actattttgt gtggaggatc tcgtcctgag catctgaaga agggatactt cattgagcca
1201 accattgtaa ctgatatcac cacatccatg caaatttgga aggaggaagt ttttggccct
1261 gtcttatgtg ttaaaacatt tagtaccgaa gaggaagccc ttgaattagc aaatgacaca
1321 gaatatggtt tagctgctgc tgtgttttct aaagaccttg aaaggtgtga gagggtaaca
1381 aaggctctag aagttggggc tgtctgggtg aattgctcac agccatgctt ttgccatgct
1441 ccatggggag gcgtcaagcg tagcggtttt ggacgtgagc ttggagaatg gggtattgaa
1501 aattacttga acattaagca agtgactagc gatatttccg atgaaccatg ggggtggtac
1561 aagtctcctt aaaggcaaaa gaggatattt gcaagataat gctgttatca agtgaactgt
1621 gacacaagag tgacgaccat gtaatgttgt ataacgatct agctcacagt ttgtctattt
1681 gattaaataa gggtcgtgcg atgctggagt tccataggca ttgattgatt ttgctatttg
1741 tgttattttg gaccattgag aaaatttttg gaccagggat aagatgcttg catataacat
1801 taagcctgtt atatttgcaa gtttaaatta tatttgggtg tgttatgtaa ctaatgtttc
1861 attaataaaa ttctccttcg tctcgaaaaa aaaaaaaaaa a(b)基因转化元件MCBNM的构建
基因转化元件MCBNM结构为:
5’-MAR-CaMV35S-BADH-Nos-MAR-3’
具体策略如下:
利用PCR方法获得BADH基因的编码区,克隆到植物表达载体pBI121中,构成pBI121/BADH重组质粒。引物序列如下:
BF:5’-TCGATCCCTATACCTTCTTCGTC-3’
BR:5’-CATGGTCACCTTAAGGAGACTTGTACCACC-3’
SphI/EcoRI酶切pBI121/BADH重组质粒,获得含有CaMV35S-CMO-Nos的片段,并按照实施例2方法构成基因转化元件MCBNM。
酶切获得MCBNM片段大小约5.1kb,经氯仿/异戊醇抽提,吸取上清,无水乙醇沉淀,吹干后溶于0.1×SSC溶液,终浓度为300ng/ul,待用于转化。(c)花粉管通道法转化小麦
选择小麦品种辽春9、辽春10和辽春13。在小麦开花后1-3小时内,剪掉已开过的颖花和当日不能开的颖花,选择当日开放的颖花,逐个将颖壳剪掉1/3,用微量注射器滴注MCCNM溶液,每朵颖花10ul,套袋。对照植株只转化0.1×SSC溶液(不含MCBNM)。成熟后收获种子。(d)转化植株的检测PCR检测 用BF和BR引物,以小麦幼苗基因组DNA为模板进行PCR扩增,获得1.5kb的目的基因片段。SOUTHERN BLOT分析 PCR检测阳性植株的小麦基因组DNA经EcoRI酶切,琼脂糖电泳,转膜。以BF和BR1(5’-TAGGCTGCCTGAGAACAT GAC-3’)为引物,以pBI121/BADH质粒为模板进行PCR扩增获得约0.45Kb DNA片段,用ECL试剂盒(Amersham Pharmacia Biotech)标记探针,进行SOUTHERN杂交。SOUTHERN杂交分析表明,转化的BADH基因已经整合到小麦基因组上。
甜菜碱含量测定 同实施例2。
耐盐能力检测 同实施例2。
相对电导率测定 同实施例2。
(e)转基因植株遗传稳定性分析
对于子代的小麦植株采用上述检测手段分析。实验数据表明外源BADH基因在小麦基因组内稳定遗传。实施例4 含有玉米LKRSDH基因边界序列和植酸酶基因转化元件的构建及花粉管通道法转化玉米(a)植酸酶基因的获得 同实施例1。(b)基因转化元件LCPNL的构建
基因转化元件LCPNL结构为:
-LKRSDH5’端部分序列-CaMV35S-phyII-Nos-LKRSDH3’端部分序列-
具体策略为:根据LKRSDH基因序列设计合成引物,从玉米的基因组DNA中分别获得5’和3’端部分序列,连接在pUC19上。
用DNA Extraction Kit for GMO Detection试剂盒,提取玉米的DNA后,用引物L1(5’-TGGCTACTACTGAGAGTGATCGTTG-3’)和L2(5’-GTCATCATACTTACGCTGTCCGAGAC-3’),获得LKRSDH基因的5’端部分序列,长度为1350bp。LKRSDH基因5’端部分序列如下:
1 tggctactac tgagagtgat cgttgcgccg ttcaagccgt gcgaagacca gttcatagta
61 caggagaaaa ggaagcggac atgttcttca atcatcttac actagtagtg aagtcacatg
121 ctacactact atcgtctctt tgtcgggtag taatcttgat ttggaacctt ccgttgcttt
181 ggagtttgga ctggttcatt cagtggctga cactgggatg gtgtactctg tccgacagct
241 acctttccga cagctacctg gttggactac tagctttctc ttttgtttct ttgcccgcca
301 gcgcctggcg actatattca gattcagtaa aatgggcgaa tttcaactag taatttgtta
361 tcgtagctcg tagcaccaga ttgccatgcc gtctttgaac tgtattccgt cccctgacaa
421 catctcactg tattaatttt gacactttct aacggcctga ctgtgtaaac tcacttcatt
481 ttcaggaggt tgtggatttc atgtccgtga tctaggcgcc ttacttggac tcaggtatgg
541 gttctgctgc tactgaggtg tgtaatctga ccccttttgt tgttgcaaac cgtgcggtgt
601 ttgataacct tgttctttaa tgtgacggtt aattatgttg attcaatttc cactcgcagg
661 gcaatgacac cttgctgggc aatggagttg ttgggattct tgctgagact tgtaatatgt
721 gggaaagaag ggcgccgtta actccttccc attgtgcccg ccttctgcta ggaggaggca
781 agaacggacc tcgagtaaac cggattattg tgcagccaag cacaaggagg atccatcatg
841 acgctcagta tgaggatgca ggatgcgaga tttcagaaga cctgtcagaa tgcggcctta
901 tcataggcat caaacaaccc aaggtcatat ttctcattaa gttagatact ctattggaca
961 gtgctctata ccaatatcag atatcaccat ggttctgaaa cgcttggagg tgtcttcact
1021 tgggcagctg cagatgattc tttcagatag agcgtacgct ttcttttcac acacacacaa
1081 agcccaaaaa gagaatatgc cactgttaga caaggtatta aacataagct cgtaccttca
1141 tcatttcagt cgtcaactgc cattgtcatt catgtaggat attaaatcat tgactaatgt
1201 cctcagatcc ttgaagaaag ggtgtccttg tttgattatg agctaattgt tggagatgat
1261 gggaaaagat cactagcatt tgggaaattt gctggtagag ctggactgat agatttctta
1321 catggtctcg gacagcgtaa gtatgatgac
用另一对引物L3(5’-TAAAGATAGTATGATATAGCAGG-3’)和L4(5’-TTTCGGTGATTGTGTCATCGTGAG-3’)进行PCR扩增获得LKRSDH基因的3’端部分序列,长度为0.9Kb。LKRSDH基因3’端部分序列如下:
1 taaagatagt atgatatagc agggcacatg tatcttttgt attaactccg ttctggaata
61 tatatttgtg aactaaaatg tgacaaataa aaagaacggg tggagtatat tgtaagagac
121 ggcaaagaaa cctctgtata tatgacctgt cgatatcaaa taatgccgat cagttagttg
181 gcttggctct tttgagggtt tagtttatac tagtaaatga gagcaaccag cgaagcataa
241 acaagatgag acgtcagagc agcaacaaca acctgcgttg cctttggttt atattgcatc
301 ggttctccga atgaactttg catcctgtgc acatcagaca tgtcccagag ggatttcatt
361 ttcattaaat tgacatatca gcaaatctgc ttatgcgtcg agatatttat gagaggggaa
421 gagagcttca tgaaaccaaa ccggtcctca cgactaccca ggcgatgaaa tccccgctag
481 gctgattgct tgatctatct actgcggctg ctccagttcc tcaggtgggc accggcgcct
541 ccttccacgg ctgctacagt ccagactctt cctgtttcgc gccaactccc tcaagcccct
601 accctacaaa cccgcttcaa cggctgttcc tcaggtggac agtttctttt tcagtcagta
661 atacaacgct atatttaaac aggcacccac tgtatttctt ccttttcaac actcactgta
721 gcctgtttct gactttatgt tcagttcggt gtcggcaaca attgccacag gtacagtgaa
781 ccaccaagcg gataaccttg tcttaaaaac atgtggtaca ggatgcaatc cctggggatc
841 cagatttcaa aacaaacaac aatccttgca tagaacctca cgatgacaca atcaccgaaa
酶切实施例1中的pBI121/phyII重组质粒,获得含有CaMV35S-phyII-Nos的片段,并插入到pUC19/LKRSDH片段之间,构成基因转化元件LCPNL。
酶切获得LCPNL片段大小约4.55kb,经氯仿/异戊醇抽提,吸取上清,无水乙醇沉淀,吹干后溶于0.1×SSC溶液,终浓度为300ng/ul,待用于转化。(c)花粉管通道法转化玉米 同实施例1。(b)转化植株的检测赖氨酸含量检测 赖氨酸含量以每100克玉米所含赖氨酸克数或每100克玉米总蛋白质所含赖氨酸克数表示。玉米种子粉碎后,采用剀氏定氮法测出总蛋白含量。酶法水解(6mol/L HCl于110℃,在真空或充氮的安瓶内进行水解10-24小时)获得样液,利用氨基酸分析仪进行HPLC(茚三酮柱后衍生)检测氨基酸组成,并计算氨基酸含量。其它检测方法 同实施例1。实施例5 含有玉米绒毡层特异表达的MZm3-4基因边界序列和植酸酶基因转化元件的构建及花粉管通道法转化玉米(a)植酸酶基因的获得 同实施例1。(b)基因转化元件MCPNM的构建
基因转化元件MCPNM结构为:5’-MZm3-4部分序列-CaMV35S-phyII-Nos-MZm3-4部分序列-
具体策略为:根据MZm3-4基因cDNA序列设计引物,从玉米基因组DNA中分别获得5’和3’端部分MZm3-4序列,连接在pUC19上。
用引物MZ1(5’-GACTAGAGTGGGATCGCGAGGAAGAA-3’)和MZ2(5’-GTCGCAGGTGCAGCTGGC-3’)进行PCR扩增,获得MZm3-4基因的5’端部分序列,长度为约0.24Kb。碱基序列如下:
1 gactagagtg ggatcgcgag gaagaaggat gtcgtgctgc ggaggaaact gcgggtgcgg
61 cagcggatgc aagtgcggca gcgggtgcgg agggtgcaag atgtacccgg acatggctga
121 gcaggtgacc accaccacca ccatcatggg tgttgcacca tccaagggcg ggttcgaggc
181 ggccgccgga gctgagaacg gcgggtgcaa gtgcggcgcc gccagctgca cctgcgac
用引物MZ3(5’-TGCACCTGCAAGTGAGGA-3’)和MZ4(5’-CCATGTGGATTAGGCGTTATTGAGTCG-3’)进行PCR扩增,获得MZm3-4基因的3’端部分序列,长度为约0.41Kb。碱基序列如下:
1 tgcacctgca agtgaggatg accgggtgca gcatgcaggc ccgtgacgat ggaggaagta
61 gatcggaagg acacccttca gtatctctag ctaaatcaag ctctgagagt atgttgtagc
121 agcgtcgtct gtgtttgccg ccatgcgtag ctagctagct agtggtggta aacgaataat
181 tgtcctgttc ttcttcctcc tcggcccctg ccagtgttgc gtcgtgtggg ccggccgggt
241 gcatgcacag caccaggcca tgcccgctgc tatgtaagtg ctcgagccag tagcatcgta
301 actcggtttg ttaccgctag agctcgagcc agttcgagag tagccatttt aaaatgaagt
361 ctgcgcttgt gtgttatgga tttaaatcga ctcaataacg cctaatccac atgg
酶切实施例1中构建的pBI121/phyII重组质粒,获得含有CaMV35S-phyII-Nos的片段,并插入到pUC19/MZm3-4片段之间,构成基因转化元件MCPNM。
酶切获得MCPNM片段大小约3.4kb,经氯仿/异戊醇抽提,吸取上清,无水乙醇沉淀,吹干后溶于0.1×SSC溶液,终浓度为300ng/ul,待用于转化。(c)花粉管通道法转化玉米 同实施例1。(b)转化植株的检测花粉败育检测 取转化植株雄花穗,挑取花药在解剖镜下观察花粉粒,根据花粉形态判断败育的花粉比例情况。其它检测方法 同实施例1。实施例6 含有水稻醇溶蛋白(种子贮藏蛋白)基因ssp边界序列和植酸酶基因转化元件的构建及花粉管通道法转化水稻(a)植酸酶基因的获得 同实施例1。(b)基因转化元件SPS的构建
基因转化元件SPS结构为:
5’-ssp5’调控序列(包括启动子区)-phyII-ssp3’调控序列-3’
具体策略为:根据水稻ssp基因序列设计引物,从水稻基因组DNA中分别获得ssp基因5’调控序列(包括启动子区)和3’端调控序列,连接在pUC19上。
用引物1(5’-CTTGCATGGTGTCAGTAGTGCCTG-3’)和引物2(5’-GGGCAAAGATCTTGCTGGTGTATG-3’)进行PCR扩增,获得ssp基因的5’端调控序列(包括启动子区序列),长度为约0.8Kb。碱基序列如下:
1 cttgcatggt gtcagtagtg cctgcctaag aaatgtgtct tgtcataata tgattacatg
61 aaatatgttt acttcctcgt ttctctttat ttgtaagata aagaactaga tatgtggaaa
121 gtaggatagc aaagagtatg gccaaactct aatctttgct ttattttttg ggatggaccc
181 aaaatttgtt tctcctttac ttctttccct ttacaacaat gttctttact tccaattctt
241 attaacaaaa ctccaaatac atgccaaact gcatatgtat gtatgctatt aaggcacatt
301 tacaaagctc caagtttacc tactcaatca ttcacatatg gcgatgactc aaactcttaa
361 ttgttatctg tgtaagctgt gacttgtgta acacattcta caagtcccat acgaattctg
421 ttcacaaaag tttctttgtc cagctcataa tttacaaaac tgcaaaatgc caaagcaatc
481 tggcacaacc ttatcatcat attttctttc cacgcattaa agcactggca gaattatctt
541 tgtgtagata ttccaaaagt attggttgaa taaatgtcca aataaattcc atgcctcatg
601 atttccagct tatgtggcct ccactaggtg gttttgcaaa ggccaaactc tttcctggct
661 tacacagcta ccagcatgta taaataggcc cctaggcaac cattattcca tcatcctcaa
721 caatattgtc tacaccatct ggaatcttgt ttaacactag tattgtagaa tcagcaatgg
781 cagcatacac cagcaagatc tttgccc
用引物3(5’-ATCAAACGTTGGTTACATGTACTC-3’)和引物4(5’-ATAGGGATATGTTAATGAGACATC-3’)进行PCR扩增,获得ssp基因的3’端调控序列,长度为约0.3Kb。碱基序列如下:
1 atcaaacgtt ggttacatgt actctagtaa taaggtgttg catactatcg tgtgcaaaca
61 ctagaaataa gaaccattga ataaaatatc aatcattttc agacttgcaa atattgggta
121 tttggatttc tgtcccatgt ccctcttgaa agccatgctg tacatgttgg agttccccct
181 tggacccaac ctactccatg ctcccatgtt gatcttaaat tccctgttcc cccagagcat
241 gtaaattttc ttatgctaat cagagcaagc tcgatgtctc attaacatat ccctatttga
酶切实施例1中构建的pBI121/phyII重组质粒,获得含有phyII的片段,并插入到pUC19/ssp片段之间,构成基因转化元件SPS。
酶切获得片段SPS大小约2.2kb,经氯仿/异戊醇抽提,吸取上清,无水乙醇沉淀,吹干后溶于0.1×SSC溶液,终浓度为300ng/ul,待用于转化。(c)花粉管通道法转化水稻 同实施例2。(b)转化植株的检测 同实施例1。