JPS61135588A - 植物細胞の選択マ−カ−の遺伝子，シヤトルベクタ−，アグロバクテリア，植物細胞及び植物個体 - Google Patents
植物細胞の選択マ−カ−の遺伝子，シヤトルベクタ−，アグロバクテリア，植物細胞及び植物個体Info
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- JPS61135588A JPS61135588A JP59255008A JP25500884A JPS61135588A JP S61135588 A JPS61135588 A JP S61135588A JP 59255008 A JP59255008 A JP 59255008A JP 25500884 A JP25500884 A JP 25500884A JP S61135588 A JPS61135588 A JP S61135588A
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- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
本発明は植物細胞の選択マーカーの遺伝子、シャトルベ
クター、アゲロバクチリア、植物細胞及び植物個体に関
し、詳しくは天然におこる植物遺伝子工学系であるアゲ
ロバクチリアの遺伝子導入系を改良し、単子葉・双子葉
被子植物並びに裸子植物に目的とする遺伝子を効率的に
導入してその遺伝子を発現させ、更に、種子繁殖によっ
て導入遺伝子を安定に遺伝させていくことに関する。こ
のため本発明では上記高等植物で効率的に発現しうる遺
伝子のプロモーターを利用し、形質転換した細胞を簡便
迅速に選択する選択マーカーの遺伝子を作成し、また導
入された遺伝子が、安定に植物細胞の染色体で増殖し、
子孫に遺伝されていくように、その染色体への挿入に必
須な組換えＤＮＮ骨分子活用した。さらに選択マーカー
の遺伝子及び導入目的の遺伝子をもつシャトルベクター
は、大腸菌からアゲロバクチリアに容易に移行され、そ
の高コピー数のために、植物細胞へ高頻度に遺伝子を導
入していくものである。
クター、アゲロバクチリア、植物細胞及び植物個体に関
し、詳しくは天然におこる植物遺伝子工学系であるアゲ
ロバクチリアの遺伝子導入系を改良し、単子葉・双子葉
被子植物並びに裸子植物に目的とする遺伝子を効率的に
導入してその遺伝子を発現させ、更に、種子繁殖によっ
て導入遺伝子を安定に遺伝させていくことに関する。こ
のため本発明では上記高等植物で効率的に発現しうる遺
伝子のプロモーターを利用し、形質転換した細胞を簡便
迅速に選択する選択マーカーの遺伝子を作成し、また導
入された遺伝子が、安定に植物細胞の染色体で増殖し、
子孫に遺伝されていくように、その染色体への挿入に必
須な組換えＤＮＮ骨分子活用した。さらに選択マーカー
の遺伝子及び導入目的の遺伝子をもつシャトルベクター
は、大腸菌からアゲロバクチリアに容易に移行され、そ
の高コピー数のために、植物細胞へ高頻度に遺伝子を導
入していくものである。
一般に土壌菌アゲロバクチリアは植物の傷口に感染して
、クランボウルを形成させる（ＭｏｌｅｃｕｌａｎＢｉ
ｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｐｌａｎｔ Ｔｕｏ＋ｏｒｓ＋ Ａ
ｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ ） ６その宿主範囲は双
子葉被子植物ヒ一般に受けとられているが、裸子植物に
も感染し、更に、アゲロバクチリアの宿主とはみなされ
ていない単子葉被子植物のセトイモ科やりウゼツラン科
の植物にも感染し、ボウルを形成させることが報告され
ている（Ｂｏｔａｎｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅ一旦、３８９
−４６６（１９７６））。最近、ユリ科のアスパラガス
とヒガンバナ科のナルシサスにアゲロバクチリアの感染
が伝えられた（Ｎａｔｕｒｅ ３１１ ； ７６３−
７６４）それ故、単子葉被子植物は、クランボウル形成
の難易程度はさておき、アゲロバクチリアの宿主となり
うるちのと推察される。
、クランボウルを形成させる（ＭｏｌｅｃｕｌａｎＢｉ
ｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｐｌａｎｔ Ｔｕｏ＋ｏｒｓ＋ Ａ
ｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ ） ６その宿主範囲は双
子葉被子植物ヒ一般に受けとられているが、裸子植物に
も感染し、更に、アゲロバクチリアの宿主とはみなされ
ていない単子葉被子植物のセトイモ科やりウゼツラン科
の植物にも感染し、ボウルを形成させることが報告され
ている（Ｂｏｔａｎｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅ一旦、３８９
−４６６（１９７６））。最近、ユリ科のアスパラガス
とヒガンバナ科のナルシサスにアゲロバクチリアの感染
が伝えられた（Ｎａｔｕｒｅ ３１１ ； ７６３−
７６４）それ故、単子葉被子植物は、クランボウル形成
の難易程度はさておき、アゲロバクチリアの宿主となり
うるちのと推察される。
双子葉被子植物のタバコ、ヒマワリ、ペチュニアでは、
アゲロバクチリア感染によるクランボウル形成の機構が
解明されている。この細菌に存在するＴ１プラスミドの
一部のＴ−ＤＮＡが、感染により植物細胞の染色体に挿
入されて、Ｔ−ＤＮＡに存在する植物ホルモンのオーキ
シン合成（ｔｍｓ）とサイトカイニン合成（ｔｎ＋ｒ）
に関与する遺伝子が発現して、細胞の無秩序を増殖を促
進し、クランボウルが形成される。この分子機構は、単
子葉被子植物や裸子植物におけるクランボウル形成にも
同様に働くものと、推察されている。
アゲロバクチリア感染によるクランボウル形成の機構が
解明されている。この細菌に存在するＴ１プラスミドの
一部のＴ−ＤＮＡが、感染により植物細胞の染色体に挿
入されて、Ｔ−ＤＮＡに存在する植物ホルモンのオーキ
シン合成（ｔｍｓ）とサイトカイニン合成（ｔｎ＋ｒ）
に関与する遺伝子が発現して、細胞の無秩序を増殖を促
進し、クランボウルが形成される。この分子機構は、単
子葉被子植物や裸子植物におけるクランボウル形成にも
同様に働くものと、推察されている。
近年に至ってこの自然界におこる植物遺伝子工学システ
ムを利用して、双子葉被子植物への外来遺伝子の導入が
実施されている。例えばバクテリアの抗主物質耐性の構
造遺伝子をＴ−ＤＮＡのノーバリン合成酵素（ＳＯ５）
のプロモーター支配オマイシン・フォスフォトランスフ
ェレース（ＮｐＴＩ［） （Ｎａｔｕｒｅ ・３０
４． １８４ １８７（１９８３） 、 Ｐｒｏｃ、
Ｎａｔ）、＾ｃａｄ、Ｓｃｉ、 ＵＳＡ ８０゜４
８０３−４８０７ （１９８３）、ＥＭＢＯＪ ２（
６）９８７−９９５ （１９８３）やクロラム＼フェニ
コール耐性やメトトレキセイト耐性（Ｎａｔｕｒｅ ３
０３゜２０１−２１３ （１９８３））の構造遺伝子が
ある。又、天然の植物の遺伝子を導入したり、そのプロ
モーターの支配下に異種の遺伝子を尋人し。
ムを利用して、双子葉被子植物への外来遺伝子の導入が
実施されている。例えばバクテリアの抗主物質耐性の構
造遺伝子をＴ−ＤＮＡのノーバリン合成酵素（ＳＯ５）
のプロモーター支配オマイシン・フォスフォトランスフ
ェレース（ＮｐＴＩ［） （Ｎａｔｕｒｅ ・３０
４． １８４ １８７（１９８３） 、 Ｐｒｏｃ、
Ｎａｔ）、＾ｃａｄ、Ｓｃｉ、 ＵＳＡ ８０゜４
８０３−４８０７ （１９８３）、ＥＭＢＯＪ ２（
６）９８７−９９５ （１９８３）やクロラム＼フェニ
コール耐性やメトトレキセイト耐性（Ｎａｔｕｒｅ ３
０３゜２０１−２１３ （１９８３））の構造遺伝子が
ある。又、天然の植物の遺伝子を導入したり、そのプロ
モーターの支配下に異種の遺伝子を尋人し。
発現させることにも成功している。その例としてインゲ
ン豆の種子蛋白質ファゼオーリン（Ｓｃｉｅｎｃｅ２２
２；４７６−４８２ （１９８３））エントウのりブ
ロース・２リン酸・カルボキシラーゼの小サブユニット
（Ｓｃｉｅｎｃｅ ２２４ ； ８３８−８４３（１９
８４）、Ｎａｔｕｒｅ ３１０；１１５−１２０の遺
伝子などがある。
ン豆の種子蛋白質ファゼオーリン（Ｓｃｉｅｎｃｅ２２
２；４７６−４８２ （１９８３））エントウのりブ
ロース・２リン酸・カルボキシラーゼの小サブユニット
（Ｓｃｉｅｎｃｅ ２２４ ； ８３８−８４３（１９
８４）、Ｎａｔｕｒｅ ３１０；１１５−１２０の遺
伝子などがある。
上記の例において、異種遺伝子の植物細胞への導入が双
子葉被子植物に限られて、アゲロバクチリアの宿主範囲
として考えられる単子葉被子植物並びに裸子植物にまで
拡大されない理由は、第１に、アゲロバクチリアがこれ
らの植物を形質転換する頻度が低いこと、第２に、これ
らの植物にＤＮＡが導入された場合でもその遺伝子が全
く発現しないか発現効率が悪いことによると推察される
。本発明では、第１の問題点を解消するために、導入す
る遺伝子をＴ、プラスミドから独立した小型のシャトル
ベクターに位置させ、そのコピー数をＴ、プラスミドに
比較して数十倍になるようにすることで、植物細胞の形
質転換効率を向上させ′た。また第２の問題点を解消す
るために、単子葉被子植物と裸子植物においても発現し
うる遺伝子のプロモーターを使用、更に、選択マーカー
構造遺伝子の発現効率を向上させた。
子葉被子植物に限られて、アゲロバクチリアの宿主範囲
として考えられる単子葉被子植物並びに裸子植物にまで
拡大されない理由は、第１に、アゲロバクチリアがこれ
らの植物を形質転換する頻度が低いこと、第２に、これ
らの植物にＤＮＡが導入された場合でもその遺伝子が全
く発現しないか発現効率が悪いことによると推察される
。本発明では、第１の問題点を解消するために、導入す
る遺伝子をＴ、プラスミドから独立した小型のシャトル
ベクターに位置させ、そのコピー数をＴ、プラスミドに
比較して数十倍になるようにすることで、植物細胞の形
質転換効率を向上させ′た。また第２の問題点を解消す
るために、単子葉被子植物と裸子植物においても発現し
うる遺伝子のプロモーターを使用、更に、選択マーカー
構造遺伝子の発現効率を向上させた。
すなわち本発明は、
（ａ）植物細胞で発現可能なプロ硲−ター。
（ｂ）植物細胞を選択可能な構造遺伝子および
（ｃ） Ｐｏ１ｙ （Ａ）付着領域
を含み、かつ（ａｔ、 （ｂ）、 （ｃ）が機能的に結
合された選択マーカー遺伝子を提供し、また、 （１）野生型Ｔ１プラスミドのＴ−ＤＮＡの境界領域。
合された選択マーカー遺伝子を提供し、また、 （１）野生型Ｔ１プラスミドのＴ−ＤＮＡの境界領域。
（ＩＩ）クローニングサイト
および
（Ｉ［［）上記選択マーカー遺伝子
を含み、かつ大腸菌とアゲロバクチリヤで増殖可能なシ
ャトルベクターを提供する。さらに本発明は、 上述のシャトルベクター および Ｔ−ＤＮＡを含ますＴ−ＤＮＡの植物細胞への転移に必
須なＶｉｒｕｌｅｎｃｅ領域を含むプラスミドを含むア
ゲロバクチリアを提供するとともに、上記シャトルベク
ターの左右境界領域間のＤＮＡセグメントをその染色体
中に組みこむ植物細胞を提供し、並びに上記植物細胞か
ら再分化された植物個体を提供するものである。
ャトルベクターを提供する。さらに本発明は、 上述のシャトルベクター および Ｔ−ＤＮＡを含ますＴ−ＤＮＡの植物細胞への転移に必
須なＶｉｒｕｌｅｎｃｅ領域を含むプラスミドを含むア
ゲロバクチリアを提供するとともに、上記シャトルベク
ターの左右境界領域間のＤＮＡセグメントをその染色体
中に組みこむ植物細胞を提供し、並びに上記植物細胞か
ら再分化された植物個体を提供するものである。
本発明の選択マーカーの遺伝子は、単子葉・双子葉被子
植物並びに裸子植物の細胞で発現しうるプロモーター（
ａ）、植物細胞を選択可能な構造遺伝子（ｂ）、 Ｐｏ
１ｙ （Ａ）付着領域（Ｃ）の（ａ）、 （ｂ）、 （
Ｃ１から構成されている。上記高等植物で発現しうるプ
ロモーターの条件のひとつは、真核生物に特徴的でその
遺伝子発現調節に必須であるといわれている共通塩基配
列ＣＣＡＡＴとＴＡＴＡＡの存在である９本発明で使用
されたｔ、 ｍ ｃ ｉｌｌ壬子プロモーターや、オー
プン・リーテング・フレームエのプロモーターには、こ
れらの配列が存在するので、単子葉・双子葉被子植物並
びに裸子植物での発現に適当である （Ｐｌａｎｔ Ｍ
ｏ１ｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ２ 、 ３３５−
３５０ （１９８３））。これに比較して、現在、選択
マーカー遺伝子のプロモーターに使用されているＮＯ３
遺伝子のプロモーターには、この共通配列は存在してい
ず、わずかに類似配列があるのみである（Ｎｕｃｌｅｉ
ｃ Ａｃ１ｄ Ｒｅｓ、１上（２） ３６９−３８５
（１９８３）。又、ヒマワリの細胞中においては、ｔｍ
ｌの遺伝子が、他に比して、最も効果的に発現している
と立証されている（ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄＲｅｓ、１
０（３）１６７９−１６８９ （１９８３）以上のこと
から推察して、ｔ＋＋＋１遺伝子のプロモーターは、単
子葉・双子葉被子植物並びに裸子植物において、強く効
果的に発現するものと考えられる。
植物並びに裸子植物の細胞で発現しうるプロモーター（
ａ）、植物細胞を選択可能な構造遺伝子（ｂ）、 Ｐｏ
１ｙ （Ａ）付着領域（Ｃ）の（ａ）、 （ｂ）、 （
Ｃ１から構成されている。上記高等植物で発現しうるプ
ロモーターの条件のひとつは、真核生物に特徴的でその
遺伝子発現調節に必須であるといわれている共通塩基配
列ＣＣＡＡＴとＴＡＴＡＡの存在である９本発明で使用
されたｔ、 ｍ ｃ ｉｌｌ壬子プロモーターや、オー
プン・リーテング・フレームエのプロモーターには、こ
れらの配列が存在するので、単子葉・双子葉被子植物並
びに裸子植物での発現に適当である （Ｐｌａｎｔ Ｍ
ｏ１ｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ２ 、 ３３５−
３５０ （１９８３））。これに比較して、現在、選択
マーカー遺伝子のプロモーターに使用されているＮＯ３
遺伝子のプロモーターには、この共通配列は存在してい
ず、わずかに類似配列があるのみである（Ｎｕｃｌｅｉ
ｃ Ａｃ１ｄ Ｒｅｓ、１上（２） ３６９−３８５
（１９８３）。又、ヒマワリの細胞中においては、ｔｍ
ｌの遺伝子が、他に比して、最も効果的に発現している
と立証されている（ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄＲｅｓ、１
０（３）１６７９−１６８９ （１９８３）以上のこと
から推察して、ｔ＋＋＋１遺伝子のプロモーターは、単
子葉・双子葉被子植物並びに裸子植物において、強く効
果的に発現するものと考えられる。
植物細胞を簡便に選択しうる機能を発揮する構造遺伝子
の種類としては、抗性物質（カナマイシン、クロラムｌ
フェニコール）耐性２代謝阻害剤（メトトレキセイト）
耐性、インヒビター（オビンアナログ）解毒性などがあ
る。本発明では、カナマイシン耐性を担うＴｎ５由来の
ネオマイシン・フォスフォトランスフエレース（ＮＰＴ
ｎ）の構造遺伝子が使用されているが、従来のＮＰＴＩ
Ｉの構造遺伝子よりは勝っている。従来のＮＰＴＩＩ構
造遺伝子は、開始ＡＴＧコードンから５°側上流２４ｂ
ｐまで含み、そのため、植物では、この５′側に先行す
るＡＴＧが優先的に使用されて、ＮＰＴＩ［のｍＲＮＡ
の翻訳効率を著しく低下させていた。本発明では、ＮＰ
Ｔｎ構造遺伝子ＡＴＧから５゛側上流の４ｂｐのみを含
む塩基配列を採用しているので、遺伝子の発現効率が著
しく高められた。
の種類としては、抗性物質（カナマイシン、クロラムｌ
フェニコール）耐性２代謝阻害剤（メトトレキセイト）
耐性、インヒビター（オビンアナログ）解毒性などがあ
る。本発明では、カナマイシン耐性を担うＴｎ５由来の
ネオマイシン・フォスフォトランスフエレース（ＮＰＴ
ｎ）の構造遺伝子が使用されているが、従来のＮＰＴＩ
Ｉの構造遺伝子よりは勝っている。従来のＮＰＴＩＩ構
造遺伝子は、開始ＡＴＧコードンから５°側上流２４ｂ
ｐまで含み、そのため、植物では、この５′側に先行す
るＡＴＧが優先的に使用されて、ＮＰＴＩ［のｍＲＮＡ
の翻訳効率を著しく低下させていた。本発明では、ＮＰ
Ｔｎ構造遺伝子ＡＴＧから５゛側上流の４ｂｐのみを含
む塩基配列を採用しているので、遺伝子の発現効率が著
しく高められた。
Ｐｏ１ｙ （Ａ）付着領域のための条件は、その塩基配
列の中にＡＡＡＴＡＡＡ配列が存在することである。本
発明では、ｔｍｒの領域を利用しているが、他の遺伝子
のＰｏ１ｙ （Ａ ）付着領域でも十分可能である。
列の中にＡＡＡＴＡＡＡ配列が存在することである。本
発明では、ｔｍｒの領域を利用しているが、他の遺伝子
のＰｏ１ｙ （Ａ ）付着領域でも十分可能である。
選択マーカーの遺伝子と共に、目的とする遺伝子を７４
人することが本発明では可能である。この目的とする遺
伝子としては、２つに大別して、天然の植物のプロモー
ターの支配下にある遺伝子と天然の植物以外のプロモー
ターの支配下にある遺伝子；即ち細菌や動物由来のプロ
モーターなどがある。更に各々が下記の（１）〜（４）
の交換を含む。
人することが本発明では可能である。この目的とする遺
伝子としては、２つに大別して、天然の植物のプロモー
ターの支配下にある遺伝子と天然の植物以外のプロモー
ターの支配下にある遺伝子；即ち細菌や動物由来のプロ
モーターなどがある。更に各々が下記の（１）〜（４）
の交換を含む。
（１）プロモーターと構造遺伝子が同し遺伝子に由来す
る場合。（２）プロモーターと構造遺伝子とが異なる遺
伝子に由来し、結合されて、機能的なキメラ遺伝子を形
成する場合。（３）プロモーターや構造遺伝子がＤＮＡ
フラグメントの挿入及び欠失、又は、塩基配列の交換に
よって修飾される場合。（４）プロモーターと構造遺伝
子の１部のシグナルペプチドに相当する塩基配列が１つ
の遺伝子に由来し、これに異なる構造遺伝子が結合され
て９機能的なキメラ遺伝子が形成される場合。
る場合。（２）プロモーターと構造遺伝子とが異なる遺
伝子に由来し、結合されて、機能的なキメラ遺伝子を形
成する場合。（３）プロモーターや構造遺伝子がＤＮＡ
フラグメントの挿入及び欠失、又は、塩基配列の交換に
よって修飾される場合。（４）プロモーターと構造遺伝
子の１部のシグナルペプチドに相当する塩基配列が１つ
の遺伝子に由来し、これに異なる構造遺伝子が結合され
て９機能的なキメラ遺伝子が形成される場合。
アゲロバクチリアがＴ−ＤＮＡを植物細胞の染色体に専
大するためには、野生型Ｔ＋プラスミドのＶｉｒｕｌｅ
ｎｃｅ ｊｆｌ域とＴ−ＤＮＡ境界領域との存在が必要
である（第１図参照）。この２つの領域が−りとして同
じプラスミド上に存在しても、又本発明の場合のように
ｔｒａｎｓとして別々のプラスミド上に存在してもよい
（Ｎａｔｕｒｅ ３０３． １７９−１８０ （１９
８３） ；Ｂｉｏ’ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ上、２６２−
２６９ （１９８３））。境界領域には、一般に、２
４ｂｐの境界反復配列が存在して、Ｔ−ＤＮＡの植物細
胞への転移に必須といわれている（ＰｌｅｎｔＭｏ）、
Ｂｉｏ）、２． ３３５ ３５０ （１９８３） 。
大するためには、野生型Ｔ＋プラスミドのＶｉｒｕｌｅ
ｎｃｅ ｊｆｌ域とＴ−ＤＮＡ境界領域との存在が必要
である（第１図参照）。この２つの領域が−りとして同
じプラスミド上に存在しても、又本発明の場合のように
ｔｒａｎｓとして別々のプラスミド上に存在してもよい
（Ｎａｔｕｒｅ ３０３． １７９−１８０ （１９
８３） ；Ｂｉｏ’ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ上、２６２−
２６９ （１９８３））。境界領域には、一般に、２
４ｂｐの境界反復配列が存在して、Ｔ−ＤＮＡの植物細
胞への転移に必須といわれている（ＰｌｅｎｔＭｏ）、
Ｂｉｏ）、２． ３３５ ３５０ （１９８３） 。
Ｃｅ１ｌ ３８．４５５−４６２ （１９８４） ）ｏ
本発明で使用した ＰＴ＋１５９５５のＴ−ＤＮＡには
４つの境界配列の存在がＪｏられていて、そのいずれか
が機能しているようである。その中、左と右端の境界領
域はＫｐｎ ＩとＢｇｌＩ［とで１．０と１．４Ｋｂの
ＤＮＡフラグメントとして切り出され、各々、境界反復
配列としてＧＧＣＡＧＧＡＴＡＴＡＴＴＣＡＡＴＴＧＴ
ＡＡＡＴとＧＧＣＡＧＧＡＴＡＴＡＴＧＣＧＧＴＴＧ−
ＴＡＡＴＴを有している（第２図参照）。この両フラグ
メントには、ＢａｍＨＩ。
本発明で使用した ＰＴ＋１５９５５のＴ−ＤＮＡには
４つの境界配列の存在がＪｏられていて、そのいずれか
が機能しているようである。その中、左と右端の境界領
域はＫｐｎ ＩとＢｇｌＩ［とで１．０と１．４Ｋｂの
ＤＮＡフラグメントとして切り出され、各々、境界反復
配列としてＧＧＣＡＧＧＡＴＡＴＡＴＴＣＡＡＴＴＧＴ
ＡＡＡＴとＧＧＣＡＧＧＡＴＡＴＡＴＧＣＧＧＴＴＧ−
ＴＡＡＴＴを有している（第２図参照）。この両フラグ
メントには、ＢａｍＨＩ。
ＥｃｏＲＩ 、 ＨｉｎｄＩ［［、Ｈｐａ Ｉ 、Ｓ＋
ｗａ Ｉのサイトがないので、組換えＤＮＡ操作に有利
である。Ｔ−ＤＮＡの境界領域のみを利用して腫瘍性に
関与する展とｔｍｒの遺伝子などを含むＴ−ＤＮＡの内
部のＤＮＡを除去して、他のＤＮＡフラグメントに入れ
換える場合には、境界領域間のＤＮＡフラグメントが細
胞の染色体に導入され、安定に増殖して、種子繁殖によ
り子孫に遺伝されてい＜ （ＥＭ８０ Ｊ３ （８
） １６８１−１６８９ （１９８４） ）。本発明の
場合、Ｔ−ＤＮＡの境界領域間に、選択マーカーの遺伝
子と遺伝子クローニングサイト及び／又は導入を目的と
する遺伝子を含んでいて、これらが植物細胞染色体に導
入され、遺伝されていく。
ｗａ Ｉのサイトがないので、組換えＤＮＡ操作に有利
である。Ｔ−ＤＮＡの境界領域のみを利用して腫瘍性に
関与する展とｔｍｒの遺伝子などを含むＴ−ＤＮＡの内
部のＤＮＡを除去して、他のＤＮＡフラグメントに入れ
換える場合には、境界領域間のＤＮＡフラグメントが細
胞の染色体に導入され、安定に増殖して、種子繁殖によ
り子孫に遺伝されてい＜ （ＥＭ８０ Ｊ３ （８
） １６８１−１６８９ （１９８４） ）。本発明の
場合、Ｔ−ＤＮＡの境界領域間に、選択マーカーの遺伝
子と遺伝子クローニングサイト及び／又は導入を目的と
する遺伝子を含んでいて、これらが植物細胞染色体に導
入され、遺伝されていく。
シャトルベクターを利用して、Ｖｉｒｕｌｅｎｃｅの領
域とＴ−ＤＮＡ境界領域とをｔｒａｎｓとして別々のプ
ラスミドに存在させて、遺伝子を植物細胞に導入する方
法は、両領域をｃｉｓとして同じプラスミドに存在させ
る在来の方法に比較して、多（の利点がある。従来の方
法ではＴ１プラスミドのＴ−ＤＮＡに遺伝子を導入する
ために中間ベクターを採用し、中間ベクターに植物への
導入を目的とする遺伝子とＴ−ＤＮＡとの相同領域とを
組み入れ苦笑。中間ベクターに、Ｔ−ＤＮＡとの相同領
域が１ケ所ある場合には、単一乗換えによるＴ＋プラス
ミドと中間ベクターＬの共存プラスミドが出来る（Ｐｒ
ｏｃ、 Ｎａｔ）、＾ｃａｄ、 Ｓｃｉ、 ＵＳＡ
８０．４８０３−４８０７ （１９８３）、Ｎａｔｕ
ｒｅ ３０３，２０９−２１３ （１９８３））。又
、相同領域が２ケ所ある場合には、二重乗換えにより目
的とする遺伝子だけがＴ１プラスミドと導入される（Ｊ
Ｍｏｌ。
域とＴ−ＤＮＡ境界領域とをｔｒａｎｓとして別々のプ
ラスミドに存在させて、遺伝子を植物細胞に導入する方
法は、両領域をｃｉｓとして同じプラスミドに存在させ
る在来の方法に比較して、多（の利点がある。従来の方
法ではＴ１プラスミドのＴ−ＤＮＡに遺伝子を導入する
ために中間ベクターを採用し、中間ベクターに植物への
導入を目的とする遺伝子とＴ−ＤＮＡとの相同領域とを
組み入れ苦笑。中間ベクターに、Ｔ−ＤＮＡとの相同領
域が１ケ所ある場合には、単一乗換えによるＴ＋プラス
ミドと中間ベクターＬの共存プラスミドが出来る（Ｐｒ
ｏｃ、 Ｎａｔ）、＾ｃａｄ、 Ｓｃｉ、 ＵＳＡ
８０．４８０３−４８０７ （１９８３）、Ｎａｔｕ
ｒｅ ３０３，２０９−２１３ （１９８３））。又
、相同領域が２ケ所ある場合には、二重乗換えにより目
的とする遺伝子だけがＴ１プラスミドと導入される（Ｊ
Ｍｏｌ。
ＡｐＰ）、 Ｑｅｎｅｔ、１．３９−４９ （１９８１
）。
）。
５ｃｉｅｎｃｅ ２２２；４７６ ４８２ （１９８
３））。
３））。
この在来の方法の欠点は、第１に中間ベクターとＴ１プ
ラスミドとの乗換えを利用しているため、乗換えが期待
通りに進行したかどうか、乗換え産物を、ひとつひとつ
検証しなければならない。この場合、往々にして、不規
則な乗換え産物が検出されることが報告されている。
ラスミドとの乗換えを利用しているため、乗換えが期待
通りに進行したかどうか、乗換え産物を、ひとつひとつ
検証しなければならない。この場合、往々にして、不規
則な乗換え産物が検出されることが報告されている。
第２の欠点としては、Ｔ、プラスミドが巨大公プラスミ
ドであるために、Ｔ−ＤＮＡのアゲロバクチリア中のコ
ピー数が細胞当り１〜２個に限定されてしまう。これに
比較して、シャトルベクターを利用する方法には次の利
点がある。第１に、シャトルベクターとＶｉｒｕｌｅｎ
ｃｅ Ｎ域を含むプラスミドの間には、相同領域がない
ので、両者は１乗換えを行えず、独立のプラスミドとし
て存在しつづける。そして第２に、独立に存在するシャ
トルベクターは、Ｔ１プラスミドに比してｌ／２０程の
小さなプラスミドであるため、そのコピー数は、Ｔ、プ
ラスミドの１０倍以上にもなる。第３に、このため、’
ｌ’ ＤＮＡ境界領域間のＤＮＡセグメントも高いコ
ピー数を示し、その結果、これらのＤＮＡセグメントが
植物細胞に導入される効率も著しく上昇する。
ドであるために、Ｔ−ＤＮＡのアゲロバクチリア中のコ
ピー数が細胞当り１〜２個に限定されてしまう。これに
比較して、シャトルベクターを利用する方法には次の利
点がある。第１に、シャトルベクターとＶｉｒｕｌｅｎ
ｃｅ Ｎ域を含むプラスミドの間には、相同領域がない
ので、両者は１乗換えを行えず、独立のプラスミドとし
て存在しつづける。そして第２に、独立に存在するシャ
トルベクターは、Ｔ１プラスミドに比してｌ／２０程の
小さなプラスミドであるため、そのコピー数は、Ｔ、プ
ラスミドの１０倍以上にもなる。第３に、このため、’
ｌ’ ＤＮＡ境界領域間のＤＮＡセグメントも高いコ
ピー数を示し、その結果、これらのＤＮＡセグメントが
植物細胞に導入される効率も著しく上昇する。
シャトルベクター用のプラスミドとしては、大 □腸
菌とアゲロバクチリアとの両者で増殖しうる広宿主範囲
のプラスミドを利用出来る。この例として、不和合性Ｐ
タイプ（Ｊ、 Ｂａｃｔ＠ｒＬｓｉ、 １５０□
り ３２７−３３１ （１９８２））Ｑタイプ（Ｊ、 Ｂ
ａｃｔ。
菌とアゲロバクチリアとの両者で増殖しうる広宿主範囲
のプラスミドを利用出来る。この例として、不和合性Ｐ
タイプ（Ｊ、 Ｂａｃｔ＠ｒＬｓｉ、 １５０□
り ３２７−３３１ （１９８２））Ｑタイプ（Ｊ、 Ｂ
ａｃｔ。
１３３；１５２７−１５２９ （１９７８））Ｗタイ
プ（Ｇｅｎｅ上９．３６１−３６４ （１９８２）。
プ（Ｇｅｎｅ上９．３６１−３６４ （１９８２）。
Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ上；２６９＝ ２７５ （
１９８３））から由来したプラスミドが考えられる。
１９８３））から由来したプラスミドが考えられる。
本発明で利用したプラスミドは、Ｐタイププラスミドの
ｐＲＫ２から由来したもので、ｐＲＫ２９０、ｐＲＫ２
０１３．ｐＴＪ”Ｓ２６．ｐＴＪＳ７５などがある（Ｐ
ｒｏｃ、 Ｎａｔ）、＾ｃａｄ、 Ｓｃｉ、Ｕ Ｓ Ａ
７７ （１２）、７３４７−７３５１ （１９８０）
；いくつかのクローニングサイトを有し、又、ｐＲＫ２
０１３の共存条件下で、交配により大腸菌からアゲロバ
クチリアに簡便に移行させることが出来る利点がある。
ｐＲＫ２から由来したもので、ｐＲＫ２９０、ｐＲＫ２
０１３．ｐＴＪ”Ｓ２６．ｐＴＪＳ７５などがある（Ｐ
ｒｏｃ、 Ｎａｔ）、＾ｃａｄ、 Ｓｃｉ、Ｕ Ｓ Ａ
７７ （１２）、７３４７−７３５１ （１９８０）
；いくつかのクローニングサイトを有し、又、ｐＲＫ２
０１３の共存条件下で、交配により大腸菌からアゲロバ
クチリアに簡便に移行させることが出来る利点がある。
又、アゲロバクチリア細胞中で独立したプラスミドとし
て安定に増殖し、Ｖｉｒｕｌｅｎｃｅ領域を有するプラ
スミドに比して数十倍のコピー数を保っている。
て安定に増殖し、Ｖｉｒｕｌｅｎｃｅ領域を有するプラ
スミドに比して数十倍のコピー数を保っている。
Ｖｉｒｕｌｅｎｃｅ ｅｉ域をもつプラスミドとしては
、野生型Ｔ、プラスミドからＴ −Ｄ Ｎ Ａ ６１域
が欠失したプラスミドＰ Ａ Ｌ ４４０４ （Ｐｌ
ａｓｍｉｄユ、１５２９ （１９８２） ） 、 Ｖｉ
ｒ＋１１ｅｎｃｅ領域がＲプラスミド（Ｐｌａｓｏ＋ｉ
ｄ１．１０７−１１８ （１９８２））や／ｐＲＫ２５
０１プラスミド（Ｊ、 ＢａｃｔｅｒＬｏｌ。
、野生型Ｔ、プラスミドからＴ −Ｄ Ｎ Ａ ６１域
が欠失したプラスミドＰ Ａ Ｌ ４４０４ （Ｐｌ
ａｓｍｉｄユ、１５２９ （１９８２） ） 、 Ｖｉ
ｒ＋１１ｅｎｃｅ領域がＲプラスミド（Ｐｌａｓｏ＋ｉ
ｄ１．１０７−１１８ （１９８２））や／ｐＲＫ２５
０１プラスミド（Ｊ、 ＢａｃｔｅｒＬｏｌ。
１５０ （１） ３２７−３３１． （１９８２））は
□ ） 他の広宿主範囲のプラスミドに存在するものなどが考え
られる。本発明では、ｐＡＬ４４０４を含むアゲロバク
チリアＰＣ２７６０をシャトルベクターの受容体とした
。
□ ） 他の広宿主範囲のプラスミドに存在するものなどが考え
られる。本発明では、ｐＡＬ４４０４を含むアゲロバク
チリアＰＣ２７６０をシャトルベクターの受容体とした
。
アゲロバクチリアの感染機構を利用して、Ｔ。
つかの方法がある。第１は、植物個体にアゲロバクチリ
アを感染させクランボウルを形成させ、無菌の形質転換
組織を単離させる場合。第２は、無菌の茎切片にアゲロ
バクチリアを感染させて、カルスをつくらせ除菌処理し
、植物組織を取り出す場合。前二者の場合には、野生型
ＴＩプラスミドを含むアゲロバクチリアを用い、形質転
換した植物細胞が植物ホルモンを含まない培地で生育し
うる特徴を利用して、スクリーニングする。第３の場合
には、本発明で利用したように、選択マーカー遺伝子の
発現により、形質転換細胞を選択してくる。この第３の
場合が、前二者に比較して、著しく簡便な形質転換細胞
の選択方法である。本発明では、選択マーカーの遺伝子
や希望する遺伝子を植物細胞に導入するために、アゲロ
バクチリアと植物のプロトプラスト、培養細胞又は葉片
とを共存培養する。そして植物細胞ゲノムに挿入されて
効率的に発現された選択マーカーの遺伝子を含む植物細
胞を、カナマイシン抵抗性により迅速に選抜した。機能
的な選択マーカーの遺伝子を選択することによって、そ
れに隣接して導入された希望する遺伝子の存在の検討も
簡便化される。又、本発明では、カナマイシン抵抗性に
よる形質転換細胞の選抜と、植物個体への再分化とを同
時に進行させることにより、導入された選択マーカー遺
伝子が効果的に発現している植物個体を迅速に得ること
が出来る。
アを感染させクランボウルを形成させ、無菌の形質転換
組織を単離させる場合。第２は、無菌の茎切片にアゲロ
バクチリアを感染させて、カルスをつくらせ除菌処理し
、植物組織を取り出す場合。前二者の場合には、野生型
ＴＩプラスミドを含むアゲロバクチリアを用い、形質転
換した植物細胞が植物ホルモンを含まない培地で生育し
うる特徴を利用して、スクリーニングする。第３の場合
には、本発明で利用したように、選択マーカー遺伝子の
発現により、形質転換細胞を選択してくる。この第３の
場合が、前二者に比較して、著しく簡便な形質転換細胞
の選択方法である。本発明では、選択マーカーの遺伝子
や希望する遺伝子を植物細胞に導入するために、アゲロ
バクチリアと植物のプロトプラスト、培養細胞又は葉片
とを共存培養する。そして植物細胞ゲノムに挿入されて
効率的に発現された選択マーカーの遺伝子を含む植物細
胞を、カナマイシン抵抗性により迅速に選抜した。機能
的な選択マーカーの遺伝子を選択することによって、そ
れに隣接して導入された希望する遺伝子の存在の検討も
簡便化される。又、本発明では、カナマイシン抵抗性に
よる形質転換細胞の選抜と、植物個体への再分化とを同
時に進行させることにより、導入された選択マーカー遺
伝子が効果的に発現している植物個体を迅速に得ること
が出来る。
導入された遺伝子を含む植物体は、自家受粉により、種
子繁殖により導入された遺伝子が植物ゲノム中に安定に
増殖し、遺伝され、発現していくかを検討する。さらに
、選択マーカーの遺伝子や希望する遺伝子を商業化され
ている品種に導入するためには、両者の夾雑によるＦ１
雑種をつくり、次にＦｌを商業品種に戻し交配して、そ
れを繰返し、導入した遺伝子の商業品種における安定化
を計る。
子繁殖により導入された遺伝子が植物ゲノム中に安定に
増殖し、遺伝され、発現していくかを検討する。さらに
、選択マーカーの遺伝子や希望する遺伝子を商業化され
ている品種に導入するためには、両者の夾雑によるＦ１
雑種をつくり、次にＦｌを商業品種に戻し交配して、そ
れを繰返し、導入した遺伝子の商業品種における安定化
を計る。
次に、本発明を実施例によりさらに詳しく説明する。
実施例１ カナマイシン耐性を担う選択マーカーの遺伝
子の作成。
子の作成。
単子葉・双子葉被子植物並びに裸子植物で発現可能なカ
ナマイシン抵抗性を担う選択マーカーのキメラ遺伝子庖
構築するために次の戦略を用いた。
ナマイシン抵抗性を担う選択マーカーのキメラ遺伝子庖
構築するために次の戦略を用いた。
（１）真核生物に特徴的プロモーター配列をもつｔ ｍ
１遺伝子のプロモーター領域を単離する。（２）バク
テリヤのトランスボゾンＴｎ５のＮＰＴｎの構造遺伝子
を（１）の支配下に置く。（３） ｔ ｍ １遺伝子の
Ｐｏ１ｙ（Ａ）付着領域を（２）の３′側に結合させる
。
１遺伝子のプロモーター領域を単離する。（２）バク
テリヤのトランスボゾンＴｎ５のＮＰＴｎの構造遺伝子
を（１）の支配下に置く。（３） ｔ ｍ １遺伝子の
Ｐｏ１ｙ（Ａ）付着領域を（２）の３′側に結合させる
。
ｌ （１） ｔ ｍ ｌ遺伝子のプロモーターの単離。
野生型Ｔ、プラスミドのｐＴｉ１５９５５のＴ−ＤＮＡ
のｔｍ＆遺伝子のプロモーターを単離するために、下記
の戦略を用いた。（１１ｔ ｍ ｌ遺伝子をＭ１３ファ
ージにクローニングして、１本鎖の鋳型にする。（２）
ｔ ｍ １遺伝子のプロモーターの３゛端の塩基配列
をブライマーにして２本鎖目のＤＮＡを合成する。（３
）制限酵素と３１又クリアーゼでプロモーター領域２８
１ ｈＰ−＄を切り出し、ｐＢＲ３２２にクローニング
する（第３図参照）。
のｔｍ＆遺伝子のプロモーターを単離するために、下記
の戦略を用いた。（１１ｔ ｍ ｌ遺伝子をＭ１３ファ
ージにクローニングして、１本鎖の鋳型にする。（２）
ｔ ｍ １遺伝子のプロモーターの３゛端の塩基配列
をブライマーにして２本鎖目のＤＮＡを合成する。（３
）制限酵素と３１又クリアーゼでプロモーター領域２８
１ ｈＰ−＄を切り出し、ｐＢＲ３２２にクローニング
する（第３図参照）。
ｔｍ／の遺伝子を含むｐＴＤＮＡ２０３を制限酵素の３
ｍａ ＩをＥｃｏＲＩで切断し、アガロース・ゲル電気
泳動にて各断片を分離し、ｔ ｍ ｌ遺アージＭ１３ｍ
ｐ８の２＊鎖ＤＮＡをＡｍａｒｓｈａｍ社の常法にて精
製し、ＳｍａＩとＥＣ０ＲＩで切断した。ｔｍｎの１．
６ＫｂのＤＮＡフラグメント４０ｎｇとＭ１３のＤＮＡ
フラグメント１１００ｎを混合シ、２０μ１反応溶液中
にて８ユニソトノＴ、ＤＮＡライゲースにて４℃にて２
４時間井合させた。これを大腸菌ＪＭＩ ０３に形質転
換させ、Ｍ１３ＤＮＡのＥｃ ｏＲＩとＳｍａ ｒサイ
トの間にＤＮＡが挿入されると生じる白いコロニーをｌ
拾った。このコロニーからＡｍａｒｓｈａｍ社の方法で
、Ｍ１３ＤＮＡのＳｍａ ＩとＥｃ ｏＲＴサイト間に
１．６Ｋｂのフラグメントを含む１本鎖の組換えＤＮＡ
を調製した。
ｍａ ＩをＥｃｏＲＩで切断し、アガロース・ゲル電気
泳動にて各断片を分離し、ｔ ｍ ｌ遺アージＭ１３ｍ
ｐ８の２＊鎖ＤＮＡをＡｍａｒｓｈａｍ社の常法にて精
製し、ＳｍａＩとＥＣ０ＲＩで切断した。ｔｍｎの１．
６ＫｂのＤＮＡフラグメント４０ｎｇとＭ１３のＤＮＡ
フラグメント１１００ｎを混合シ、２０μ１反応溶液中
にて８ユニソトノＴ、ＤＮＡライゲースにて４℃にて２
４時間井合させた。これを大腸菌ＪＭＩ ０３に形質転
換させ、Ｍ１３ＤＮＡのＥｃ ｏＲＩとＳｍａ ｒサイ
トの間にＤＮＡが挿入されると生じる白いコロニーをｌ
拾った。このコロニーからＡｍａｒｓｈａｍ社の方法で
、Ｍ１３ＤＮＡのＳｍａ ＩとＥｃ ｏＲＴサイト間に
１．６Ｋｂのフラグメントを含む１本鎖の組換えＤＮＡ
を調製した。
ｔ ｍ １遺伝子プロモーターの３゛端の２１塩基５′
ｓ ｏ ＣＧ ＣＡ Ｇ Ｔ Ｇ Ｔ Ｔ Ｇ Ｇ Ａ
Ｔ Ｇ Ｔ Ａ ＣＴ Ａ ＣＡＯＲをＤＮＡ合成機
にて化学合成し、ＤＮＡシークエンス用の７Ｍの尿素を
含む２０％ポリアクリルアマイドにて精製し、９２μｇ
のオリゴヌクレオチドを得た。２０μモル（５４μｇ）
のｔｍｉ２遺伝子プロモーターを含む１本鎖のＤＮＡと
７４００μモル（２，９μｇ）のオリゴヌクレオチドと
を４００μ（の溶液に混合し、６５℃で５分間熱し、２
３℃で５分間おいて、２ａ類の１＊鎖ＤＮＡを２本鎖に
リアニーリングした。これに５０ユニツトのＤＮＡポリ
メラーゼのフレナラ・フラグメントを加えて３０℃で６
０分間培養してオリゴヌクレオチドのプライマーから２
本鎖目のＤＮＡを伸？容液中にて８００ユニツトの８１
ヌクレアーゼで２０℃で６０分間処理して、１本鎖ＤＮ
Ａ部分を切断した。更に、制限酵素のＡＶａ Ｉでｔｍ
７！プロモーターの５゛側上流を切断して２８１塩基対
のＤＮＡフラグメントを切り出し、これを５％のポリア
クリルアマイド・ゲル電気永動にて分離し、精製した。
Ｔ Ｇ Ｔ Ａ ＣＴ Ａ ＣＡＯＲをＤＮＡ合成機
にて化学合成し、ＤＮＡシークエンス用の７Ｍの尿素を
含む２０％ポリアクリルアマイドにて精製し、９２μｇ
のオリゴヌクレオチドを得た。２０μモル（５４μｇ）
のｔｍｉ２遺伝子プロモーターを含む１本鎖のＤＮＡと
７４００μモル（２，９μｇ）のオリゴヌクレオチドと
を４００μ（の溶液に混合し、６５℃で５分間熱し、２
３℃で５分間おいて、２ａ類の１＊鎖ＤＮＡを２本鎖に
リアニーリングした。これに５０ユニツトのＤＮＡポリ
メラーゼのフレナラ・フラグメントを加えて３０℃で６
０分間培養してオリゴヌクレオチドのプライマーから２
本鎖目のＤＮＡを伸？容液中にて８００ユニツトの８１
ヌクレアーゼで２０℃で６０分間処理して、１本鎖ＤＮ
Ａ部分を切断した。更に、制限酵素のＡＶａ Ｉでｔｍ
７！プロモーターの５゛側上流を切断して２８１塩基対
のＤＮＡフラグメントを切り出し、これを５％のポリア
クリルアマイド・ゲル電気永動にて分離し、精製した。
この２８１ｂｐのｔ ｍ ｌ遺伝子プロモーターのＤＮ
ＡにＢａ ｍ ＨＩリンカ−ＣＣＧＧＡＴＣＣＧＧを結
合させるために、まず、このＤＮＡの５゛末端の一〇Ｈ
をＴ４ポリヌクレオチドキナーゼでリン酸化し、７５ｐ
モルのＢａｍＨＩリンカ−と混合し２０μｌ溶液中で１
ユニツトのＴ４・ライゲースと２２℃で６時間反応させ
た。この反応液に１６０ユニツトのＢａｍＨＩを加えて
３時間培養して、ＢａｍＨＩリンカ−を切断し、こうし
て出来た２８８ｂｐのＤＮＡフラグメントをアガロース
・ゲル電気泳動にて分離し精製した。
ＡにＢａ ｍ ＨＩリンカ−ＣＣＧＧＡＴＣＣＧＧを結
合させるために、まず、このＤＮＡの５゛末端の一〇Ｈ
をＴ４ポリヌクレオチドキナーゼでリン酸化し、７５ｐ
モルのＢａｍＨＩリンカ−と混合し２０μｌ溶液中で１
ユニツトのＴ４・ライゲースと２２℃で６時間反応させ
た。この反応液に１６０ユニツトのＢａｍＨＩを加えて
３時間培養して、ＢａｍＨＩリンカ−を切断し、こうし
て出来た２８８ｂｐのＤＮＡフラグメントをアガロース
・ゲル電気泳動にて分離し精製した。
ｐＢＲ３２２ＤＮＡをＡｖａ ＩとＢａｍＨＩで切断し
、３．３ＫｂのＤＮＡフラグメントを〆アガロを２００
ｎｇの３．３ＫｂＤＮＡフラグメントとＹ捏合し、ｌＯ
μβ中で１ユニツトのＴ４−ライゲースと反応させ、大
腸菌に８０２に形質転換させた。
、３．３ＫｂのＤＮＡフラグメントを〆アガロを２００
ｎｇの３．３ＫｂＤＮＡフラグメントとＹ捏合し、ｌＯ
μβ中で１ユニツトのＴ４−ライゲースと反応させ、大
腸菌に８０２に形質転換させた。
こうして出来たプラスミドをｐＴｏ、３と呼ぶ。
１−（２）Ｌｍｌ遺伝子のＰｏ１ｙ （Ａ ）付着部位
の単離。
の単離。
ｔ ｍ １２遺伝子のＰｏ１ｙ （Ａ ）付着を支配す
る塩基配列ＡＡＴＡＡＡは、この遺伝子の終末コードン
ＴＧＡから３°側に２１５ｂｐ下流に位置している。こ
の配列を単離する戦略としては、この配列を含む１１３
８ｂｐのＤＮＡフラグメントを制限酵素ｐｓｔｌとＡ
Ｖ ａ ｌとで切断して単離し、これを更に５ａｕ３Ａ
で切って２９２ｂＰのフラグメントを単離し、ｐＢＲ３
２２にクローニングした。
る塩基配列ＡＡＴＡＡＡは、この遺伝子の終末コードン
ＴＧＡから３°側に２１５ｂｐ下流に位置している。こ
の配列を単離する戦略としては、この配列を含む１１３
８ｂｐのＤＮＡフラグメントを制限酵素ｐｓｔｌとＡ
Ｖ ａ ｌとで切断して単離し、これを更に５ａｕ３Ａ
で切って２９２ｂＰのフラグメントを単離し、ｐＢＲ３
２２にクローニングした。
ｔｍｌｍｌ遺伝子−コードｐＴＤＮＡ２０３プラスミド
を、先ずＡｖａ １． Ｐｓ ｔ １． Ｅｃ ｏ、Ｒ
Ｉの３制限酵素で切断し、各断片をアガロース・ゲル電
気泳動で分離し１１３８ｂｐのフラグメントをＮａｌ法
で寒天から精製した。次に、この１１３８ｂｐのＤＮＡ
を５ａｕ３Ａで切断し、Ｐｏ１ｙ （Ａ）付着サイトを
含む２９２塩基対の断片を５％ポリアクリルアマイド・
ゲル電気泳動で分離し、ゲルから溶出した。この２９２
ｂｐのＤ Ｎ Ａ、両端の１本鎖の部分をＤＮＡポリメ
ラーゼのフレナラｌフラグメントで２本鎖にし、これに
リン酸化した５ａｃｌリンカ−ＣＧＡＧＣＴＣＧを結合
させ、これを３４Ｑ Ｉで切断し、３０４ｂｐのＤＮＡ
断片を５％ポリアクリルアマイド・ゲル電気泳動にて分
離・精製した。
を、先ずＡｖａ １． Ｐｓ ｔ １． Ｅｃ ｏ、Ｒ
Ｉの３制限酵素で切断し、各断片をアガロース・ゲル電
気泳動で分離し１１３８ｂｐのフラグメントをＮａｌ法
で寒天から精製した。次に、この１１３８ｂｐのＤＮＡ
を５ａｕ３Ａで切断し、Ｐｏ１ｙ （Ａ）付着サイトを
含む２９２塩基対の断片を５％ポリアクリルアマイド・
ゲル電気泳動で分離し、ゲルから溶出した。この２９２
ｂｐのＤ Ｎ Ａ、両端の１本鎖の部分をＤＮＡポリメ
ラーゼのフレナラｌフラグメントで２本鎖にし、これに
リン酸化した５ａｃｌリンカ−ＣＧＡＧＣＴＣＧを結合
させ、これを３４Ｑ Ｉで切断し、３０４ｂｐのＤＮＡ
断片を５％ポリアクリルアマイド・ゲル電気泳動にて分
離・精製した。
１−（３）構造遺伝子の調製。
選択マーカーの〆遺伝子として、トランスボゾンＴｎ５
にある抗生物質カナマイシン抵抗性を担うネオマイシン
・フォスフオフトランスフェラーゼｎ （ＮＰＴＩ［）
の遺伝子を用いた。ＮＰＴＩＩの構造遺伝子の開始コー
ドンＡＴＧの５”側ｔｓｂｐ上流にＡＴＧがあり、この
ため、ＮＰＴ■の構造遺伝子を植物細胞に導入すると、
５′側上流のＡＴＧコードンからの翻訳が優先的に始ま
り、遺伝子発現の効率が極めて低くなる。本発明では、
ＮＰＴｎ構造遺伝子の５゛側上流４ｂｐ及び３゛側下流
１７６ｂｐを含む１５３２ｂｐのＤＮＡを単離して使用
した（第４図参照）。
にある抗生物質カナマイシン抵抗性を担うネオマイシン
・フォスフオフトランスフェラーゼｎ （ＮＰＴＩ［）
の遺伝子を用いた。ＮＰＴＩＩの構造遺伝子の開始コー
ドンＡＴＧの５”側ｔｓｂｐ上流にＡＴＧがあり、この
ため、ＮＰＴ■の構造遺伝子を植物細胞に導入すると、
５′側上流のＡＴＧコードンからの翻訳が優先的に始ま
り、遺伝子発現の効率が極めて低くなる。本発明では、
ＮＰＴｎ構造遺伝子の５゛側上流４ｂｐ及び３゛側下流
１７６ｂｐを含む１５３２ｂｐのＤＮＡを単離して使用
した（第４図参照）。
ｐＵｃ１２Δ２ＴＫは、ＮＰＴ構造遺伝子と、その開始
コードンＡＴＧの５”側上流４塩基までを含みそれがＢ
ａｍＨＩリンカ−に接続されている。しかし、構造遺伝
子の３゛側下流にはＰｓｔｌサイトが２個所あり、この
ままでは〆使用できない。ｐＵｃ１２Δ２ＴＫをＥＣ０
ＲＩとｐ ｓ ｔｒで切断し、５％ポリアクリルアミド
・ゲル電気泳動にて各断片を分離し、３２８ｂｐのフラ
グメントを精製した。
コードンＡＴＧの５”側上流４塩基までを含みそれがＢ
ａｍＨＩリンカ−に接続されている。しかし、構造遺伝
子の３゛側下流にはＰｓｔｌサイトが２個所あり、この
ままでは〆使用できない。ｐＵｃ１２Δ２ＴＫをＥＣ０
ＲＩとｐ ｓ ｔｒで切断し、５％ポリアクリルアミド
・ゲル電気泳動にて各断片を分離し、３２８ｂｐのフラ
グメントを精製した。
ｐＫＳ４は、ＮＰＴ構造遺伝子と、その５”側上流３５
塩基と３′側下流１７６塩基を含んでいる。これを制限
酵素ＰｓｔｌとＳｍａ Ｉとで切断し、５％ポリアクリ
ルアマイド・ゲル電気泳動にて各断片を分離し、８８６
ｂｐのＤＮＡを精製した。
塩基と３′側下流１７６塩基を含んでいる。これを制限
酵素ＰｓｔｌとＳｍａ Ｉとで切断し、５％ポリアクリ
ルアマイド・ゲル電気泳動にて各断片を分離し、８８６
ｂｐのＤＮＡを精製した。
ＮＰＴ構造遺伝子の前半を含む３２８ｂｐのＤＮＡ０．
５μｇと、後半を含む８８６ｂｐのＤＮＡ１．０μｇを
２０μβの溶液中に混合し、２ユニツトのＴ、ＤＮＡラ
イゲースを加えて、１５℃で１晩反応させた。これに０
．５μｇの３ａｃｌリンカ−と８２ユニツトの７４ＤＮ
Ａライゲースを加えて、１５℃で更に１晩反応させた。
５μｇと、後半を含む８８６ｂｐのＤＮＡ１．０μｇを
２０μβの溶液中に混合し、２ユニツトのＴ、ＤＮＡラ
イゲースを加えて、１５℃で１晩反応させた。これに０
．５μｇの３ａｃｌリンカ−と８２ユニツトの７４ＤＮ
Ａライゲースを加えて、１５℃で更に１晩反応させた。
この反応液に、１５Ｑユニ７トの５ａｃｌを加え、２０
０１１１中で２．５時間培養して切断し、ＤＮＡをエタ
ノール沈殿した。回収したＤＮＡフラグメントを３０ユ
ニツトのＢａｍＨＩで１時間処理し、５％ポリアクリル
アマイド・ゲルにて分離し、９８５ｂｐのＤＮＡフラグ
メントを精製した。
０１１１中で２．５時間培養して切断し、ＤＮＡをエタ
ノール沈殿した。回収したＤＮＡフラグメントを３０ユ
ニツトのＢａｍＨＩで１時間処理し、５％ポリアクリル
アマイド・ゲルにて分離し、９８５ｂｐのＤＮＡフラグ
メントを精製した。
これは、本発明の選択マーカーの構造遺伝子であった。
１−（４）選択マーカー遺伝子の各部分の結合。
カナマイシン抵抗性を担うＮＰＴ［Ｉの構造遺伝子を、
単子葉・双子葉被子植物並びに裸子植物において発現さ
せるために、この構造遺伝子にｔｍｌｌのプロモーター
とＰｏ１ｙ（Ａ）付着サイトを結合して、選択マーカー
遺伝子を作成した。このための戦略としては、（１）
ｔ ｍ （ｌ遺伝子のプロモーターをＮＰＴｎ構造遺伝
子を結合させてｐＢＲ３２２にクローニングし、（２）
とのプラスミドのＮＰＴｎ構造遺伝子の３′側にＰｏ１
ｙ（Ａ）付着領域を挿入した（第５図参照）。
単子葉・双子葉被子植物並びに裸子植物において発現さ
せるために、この構造遺伝子にｔｍｌｌのプロモーター
とＰｏ１ｙ（Ａ）付着サイトを結合して、選択マーカー
遺伝子を作成した。このための戦略としては、（１）
ｔ ｍ （ｌ遺伝子のプロモーターをＮＰＴｎ構造遺伝
子を結合させてｐＢＲ３２２にクローニングし、（２）
とのプラスミドのＮＰＴｎ構造遺伝子の３′側にＰｏ１
ｙ（Ａ）付着領域を挿入した（第５図参照）。
ｔ ｍ ｌ遺伝子のプロモーターを含む２８８ｂｐのフ
ラグメントをプラスミドｐＴ０．３から制限酵素Ｂａｍ
ＨＩとＡｖａｌで切り出し、５％ポリアクリルアマイド
・ゲル電気泳動にて分離して、電気流出した。又、クロ
ーニングベクターとして、ｐＢＲ３２２のＢａｍＨＩサ
イトに５ａｃＩリンカ−を挿入したものを用意した。こ
のためにｐＢＲ３２２をＢａｍＨＩで切断し、ＤＮＡポ
リメラーゼのフレノウ・フラグメントで１本鎖の末端を
２之 本領に変Ｍ、３ａｃｌリンカ−”ＣＧＡＯＣＴＣＧ３°
を結合させ、これを７制限酵素５ａｃＩで電気泳動にて
３．３Ｋｂフラグメントを分離精製した。
ラグメントをプラスミドｐＴ０．３から制限酵素Ｂａｍ
ＨＩとＡｖａｌで切り出し、５％ポリアクリルアマイド
・ゲル電気泳動にて分離して、電気流出した。又、クロ
ーニングベクターとして、ｐＢＲ３２２のＢａｍＨＩサ
イトに５ａｃＩリンカ−を挿入したものを用意した。こ
のためにｐＢＲ３２２をＢａｍＨＩで切断し、ＤＮＡポ
リメラーゼのフレノウ・フラグメントで１本鎖の末端を
２之 本領に変Ｍ、３ａｃｌリンカ−”ＣＧＡＯＣＴＣＧ３°
を結合させ、これを７制限酵素５ａｃＩで電気泳動にて
３．３Ｋｂフラグメントを分離精製した。
ｔｍｊ２プロモーターの２８８ｂｐフラグメント１２．
５ｎｇとＮＰＴ■構造遺伝子の９８５ｂｐのフラグメン
ト２５ｎｇとｐＢＲ３２２（ＳａｃＩ）の３．３Ｋｂフ
ラグメント１１００ｎを５μ２の反応溶液中で混合し、
０．５ユニツトのＴ、ＤＮＡライゲースを加え、１５℃
で１晩反応させて、大腸菌に８０２ Ｔｏ、３（ＦＥ
ＲＭ Ｐ−７９６５）に形質転換させた。１３ ａ
ｍ ＨＩサイトを介して、ニエ」のプロモーターとＮＰ
Ｔｎの構造遺伝子とが結合されてｐＢＲ３２２（Ｓａ
ｃ Ｉ）のＡｖａＩ、と５ａｃｌサイトに挿入されたプ
ラスミドをｐＴＮ）、３と呼ぶ。
５ｎｇとＮＰＴ■構造遺伝子の９８５ｂｐのフラグメン
ト２５ｎｇとｐＢＲ３２２（ＳａｃＩ）の３．３Ｋｂフ
ラグメント１１００ｎを５μ２の反応溶液中で混合し、
０．５ユニツトのＴ、ＤＮＡライゲースを加え、１５℃
で１晩反応させて、大腸菌に８０２ Ｔｏ、３（ＦＥ
ＲＭ Ｐ−７９６５）に形質転換させた。１３ ａ
ｍ ＨＩサイトを介して、ニエ」のプロモーターとＮＰ
Ｔｎの構造遺伝子とが結合されてｐＢＲ３２２（Ｓａ
ｃ Ｉ）のＡｖａＩ、と５ａｃｌサイトに挿入されたプ
ラスミドをｐＴＮ）、３と呼ぶ。
このプラスミドｐＴＮ１．３のＮＰＴＩＩ構造遺伝子の
３゛側下流に位置する３ａｃＩサイトを制限酵素で切り
、５゛末端のリン酸を子牛胸腺アルカリフォζシーゼで
除去した。このベクター１１００ｎとＰｏ１ｙ（Ａ）付
着領域を含む３０４ｂｐのＤＮＡ３０ｎｇとを、０．５
ユニツトの７４ＤＮＡライゲースを含む５μｌ溶液に混
合し、１６℃で１晩反応させ、大腸菌Ｋ ８０２ Ｔ
Ｎ １．３ （ＦＥＲＭＰ−７９６６）に形質転換させ
た。ＮＰＴＩＩの構造遺伝子の５゛側にＢａｍＨＩサイ
ト介してｔ ｍ １のプロモーターが位置し、３°側に
Ｓａｃ■サイトを介してｔ ｍ ｌのＰｏ１ｙ（Ａ）付
着領域が結合されているｐＢＲ３２２由来のプラスミド
をｐＴＮＡ）、６と呼ぶ。
３゛側下流に位置する３ａｃＩサイトを制限酵素で切り
、５゛末端のリン酸を子牛胸腺アルカリフォζシーゼで
除去した。このベクター１１００ｎとＰｏ１ｙ（Ａ）付
着領域を含む３０４ｂｐのＤＮＡ３０ｎｇとを、０．５
ユニツトの７４ＤＮＡライゲースを含む５μｌ溶液に混
合し、１６℃で１晩反応させ、大腸菌Ｋ ８０２ Ｔ
Ｎ １．３ （ＦＥＲＭＰ−７９６６）に形質転換させ
た。ＮＰＴＩＩの構造遺伝子の５゛側にＢａｍＨＩサイ
ト介してｔ ｍ １のプロモーターが位置し、３°側に
Ｓａｃ■サイトを介してｔ ｍ ｌのＰｏ１ｙ（Ａ）付
着領域が結合されているｐＢＲ３２２由来のプラスミド
をｐＴＮＡ）、６と呼ぶ。
実施例２０発現可能の選択マーカー遺伝子を含むシャト
ルベクターの組み立て。
ルベクターの組み立て。
大腸菌で作成した選択マーカーの遺伝子などをアグロバ
クテリウムに移行させるために、ダラム陰性菌一般に増
殖しうるｐＲＫ２プラスミド系統を用いてシャトルベク
ターを構築した。その戦略としては、＋１） Ｔ −Ｄ
Ｎ Ａの左右端の境界領域を大腸菌プラスミドにクロ
ーニングする。＋２１ （１１の間に選択マーカーの遺
伝子とクローニングサイトを挿入する。ｆ３１ （２）
を広宿主範囲プラスミドに移入させるｆ（第６図および
第７図参照）。
クテリウムに移行させるために、ダラム陰性菌一般に増
殖しうるｐＲＫ２プラスミド系統を用いてシャトルベク
ターを構築した。その戦略としては、＋１） Ｔ −Ｄ
Ｎ Ａの左右端の境界領域を大腸菌プラスミドにクロ
ーニングする。＋２１ （１１の間に選択マーカーの遺
伝子とクローニングサイトを挿入する。ｆ３１ （２）
を広宿主範囲プラスミドに移入させるｆ（第６図および
第７図参照）。
２−１１１Ｔ−ＤＮＡの左右端の境界領域の単離。
野生型Ｔ、プラスミドｐＴ＋ １５９５５のＴ−ＤＮ
Ａの境界領域には、植物の染色体に導入されるＴ−ＤＮ
Ａの左右両端を決定する境界配列が存在している。この
配列は、左端では、１．ＯＫｂのＫｐｎｌ／ＢｇｆｆＩ
ＩＤＮＡフラグメントに、右端では１．４ＫｂのＢｇｌ
Ｕ−ＫｐｎｌＤＮＡに位置する。この性質を利用して左
右の境界領域をクローニングした。
Ａの境界領域には、植物の染色体に導入されるＴ−ＤＮ
Ａの左右両端を決定する境界配列が存在している。この
配列は、左端では、１．ＯＫｂのＫｐｎｌ／ＢｇｆｆＩ
ＩＤＮＡフラグメントに、右端では１．４ＫｂのＢｇｌ
Ｕ−ＫｐｎｌＤＮＡに位置する。この性質を利用して左
右の境界領域をクローニングした。
左境界配列を含む１．ＯＫｂのフラグメントをｐＴＤＮ
Ａ５０１をＫｐｎｒとＢｇｌｍｌでｌ切り出し、アガロ
ース・ゲル電気泳動にて分離し、Ｎａｌ法でゲルから精
製した。又、右境界配列を含む１．４ＫｂのＤＮＡをｐ
ＤＮＡ１０２をＫｐｎ ＩとＢｇβ■で切断した後、ア
ガロース・ゲル電気泳動で分離し精製した。各０．３μ
ｇづつのフラグメントを２０μｌの反応液中に、２ユニ
ツトのＴ、ＤＮＡライゲースにより結合させた後、これ
をＫｐｌで切断し、２．４ＫｂのＤＮＡをｊアガロース
・ゲルより分離した。プラスミドｐＫＢｍをＫｐｎＩで
切り、５゛末端のリン酸をグアルカリフォスファターゼ
処理で除去した。このベクターのＤ’ＮＡ１００ｎｇと
左右境界配列を含む２．４にｂのＤＤＮＡｌｏｏｎを混
合し、５μｌの反応溶液中で０．５ユニツトのＴ４ライ
ゲースと１５°Ｃで１晩培養゛し、大腸菌に８０２を形
質転換させた。
Ａ５０１をＫｐｎｒとＢｇｌｍｌでｌ切り出し、アガロ
ース・ゲル電気泳動にて分離し、Ｎａｌ法でゲルから精
製した。又、右境界配列を含む１．４ＫｂのＤＮＡをｐ
ＤＮＡ１０２をＫｐｎ ＩとＢｇβ■で切断した後、ア
ガロース・ゲル電気泳動で分離し精製した。各０．３μ
ｇづつのフラグメントを２０μｌの反応液中に、２ユニ
ツトのＴ、ＤＮＡライゲースにより結合させた後、これ
をＫｐｌで切断し、２．４ＫｂのＤＮＡをｊアガロース
・ゲルより分離した。プラスミドｐＫＢｍをＫｐｎＩで
切り、５゛末端のリン酸をグアルカリフォスファターゼ
処理で除去した。このベクターのＤ’ＮＡ１００ｎｇと
左右境界配列を含む２．４にｂのＤＤＮＡｌｏｏｎを混
合し、５μｌの反応溶液中で０．５ユニツトのＴ４ライ
ゲースと１５°Ｃで１晩培養゛し、大腸菌に８０２を形
質転換させた。
Ｔ−ＤＮＡの左右の境界配列を含むプラスミドをｐＢＢ
２．４とよぶ。
２．４とよぶ。
２−（２）シャトルベクターの構築。
実施例１で作成したｐＴＮＡ）、６をＥｃｏＲＩとＮｄ
ｅＩで切断して分離した２、９ＫｂのＤＮＡフラグメン
トには、選択マーカーの遺伝子と共に、遺伝子のクロー
ニングサイトとして便利な旧ｎｄｌｌｌと（：ｆａＩサ
イトが含まれてくる。この２．９ＫｂのＤＮＡ断片の両
端をＤＮＡポリメラーゼのフレノウ・フラグメント処理
で２本鎖にし、リン酸化したＢｇβ■リンカ−と結合さ
せて、８ｇ６１１で処理し、アガロース・ゲル電気泳動
で２．９Ｋｂのフラグメントを分離し、ＮａＩ法にて１
００ｎＨのＤＮＡを精製した。次に、このＤＤＮＡｌｏ
ｏｎと、Ｂｇ＃ｎで切りアルカリ・フォスファターゼ処
理したｐＢＢ２．４ ２００ｎｇを混合して／２０μｌ
の溶液中で１５℃で１晩反応させ大腸菌に８０２ＴＮＡ
１．６（ＦＥＲＭ Ｐ−７９６７）に形質転換した。
ｅＩで切断して分離した２、９ＫｂのＤＮＡフラグメン
トには、選択マーカーの遺伝子と共に、遺伝子のクロー
ニングサイトとして便利な旧ｎｄｌｌｌと（：ｆａＩサ
イトが含まれてくる。この２．９ＫｂのＤＮＡ断片の両
端をＤＮＡポリメラーゼのフレノウ・フラグメント処理
で２本鎖にし、リン酸化したＢｇβ■リンカ−と結合さ
せて、８ｇ６１１で処理し、アガロース・ゲル電気泳動
で２．９Ｋｂのフラグメントを分離し、ＮａＩ法にて１
００ｎＨのＤＮＡを精製した。次に、このＤＤＮＡｌｏ
ｏｎと、Ｂｇ＃ｎで切りアルカリ・フォスファターゼ処
理したｐＢＢ２．４ ２００ｎｇを混合して／２０μｌ
の溶液中で１５℃で１晩反応させ大腸菌に８０２ＴＮＡ
１．６（ＦＥＲＭ Ｐ−７９６７）に形質転換した。
選択マーカーの遺伝子とクローニングｌサイトの両側に
Ｔ−ＤＮＡの左右端の境界領域を含むｐＫＢＩＩ［のプ
ラスミドをｐＢ（ＴＮＡ）Ｂと呼ぶ。
Ｔ−ＤＮＡの左右端の境界領域を含むｐＫＢＩＩ［のプ
ラスミドをｐＢ（ＴＮＡ）Ｂと呼ぶ。
大腸菌とアゲロバクチリアで増殖しうる広宿主範囲のプ
ラスミドとして、ｐＲＫ２から派出した７、５Ｋｂのｐ
ＴＪＳ７５を採用した。まず、、このプラスミドのＨｉ
ｎｄｌ［ＩサイトをＫｐｎｌサイトに変えるためＨｉ
ｎ ｄ ［［［で切断し、両端を２本鎖にし、Ｋｐｎｌ
リンカ−を結合させた。こうして出来たプラスミドをｐ
ＴＲＡ４０２と呼ぶ。このｐＴＲＡ４０１をＫｐｎｌで
切り、アルカリ・フォスファターゼ処理した。ｐＢ （
ＴＮＡ）ＢをＫｐｎＩで切り、５．３ＫｂのＤＮＡをア
ガロースゲル電気泳動で精製した。この５．３Ｋｂのフ
ラグメント２００ｎｇとｐＴＲＡ４０１ヘクター２００
ｎｇを１５μｌの反応液中で１．５ユニツトのＴ４ライ
ゲースと１６℃で１晩反応させ、大腸菌に８０２ Ｂ
（ＴＮＡ）Ｂ（ＦＥＲＭ Ｐ−７９６８）に形質転換
した。こうして出来上がったプラスミドをｐＴＲＡ４０
３と呼ふ。
ラスミドとして、ｐＲＫ２から派出した７、５Ｋｂのｐ
ＴＪＳ７５を採用した。まず、、このプラスミドのＨｉ
ｎｄｌ［ＩサイトをＫｐｎｌサイトに変えるためＨｉ
ｎ ｄ ［［［で切断し、両端を２本鎖にし、Ｋｐｎｌ
リンカ−を結合させた。こうして出来たプラスミドをｐ
ＴＲＡ４０２と呼ぶ。このｐＴＲＡ４０１をＫｐｎｌで
切り、アルカリ・フォスファターゼ処理した。ｐＢ （
ＴＮＡ）ＢをＫｐｎＩで切り、５．３ＫｂのＤＮＡをア
ガロースゲル電気泳動で精製した。この５．３Ｋｂのフ
ラグメント２００ｎｇとｐＴＲＡ４０１ヘクター２００
ｎｇを１５μｌの反応液中で１．５ユニツトのＴ４ライ
ゲースと１６℃で１晩反応させ、大腸菌に８０２ Ｂ
（ＴＮＡ）Ｂ（ＦＥＲＭ Ｐ−７９６８）に形質転換
した。こうして出来上がったプラスミドをｐＴＲＡ４０
３と呼ふ。
実施例３０選択マーカー遺伝子を含むシャトルベクター
のアゲロバクチリアへの移行。
のアゲロバクチリアへの移行。
本発明の最も重要な特徴の１つは、単子葉・双子葉被子
植物並びに裸子植物に発現可能な／１選択マーカー遺伝
子をもつシャトルベクターの採用である。このシャトル
ベクターの利点をキ約すると下記のようになる。（１）
シャトルベクターを、大腸菌からアゲロバクチリアへ簡
便な掛は合せ法で、移行することが出来る。（２）アゲ
ロバクチリア中でシャトルベクターが、Ｖｉｒｕｌｅｎ
ｃｅ ６］域を含むプラスミドとの間に乗り換えを起こ
さずに、２個の安定した独立のプラスミドとして増殖す
る。（３）Ｖｉｒｕｌｅｎｃｃｉ！領域を含むプラスミ
ドに比して、Ｔ−ＤＮＡの境界領域を含むシャトルベク
ターのコピー数が数十倍高いため、植物細胞の形質転換
の効率が高まる。
植物並びに裸子植物に発現可能な／１選択マーカー遺伝
子をもつシャトルベクターの採用である。このシャトル
ベクターの利点をキ約すると下記のようになる。（１）
シャトルベクターを、大腸菌からアゲロバクチリアへ簡
便な掛は合せ法で、移行することが出来る。（２）アゲ
ロバクチリア中でシャトルベクターが、Ｖｉｒｕｌｅｎ
ｃｅ ６］域を含むプラスミドとの間に乗り換えを起こ
さずに、２個の安定した独立のプラスミドとして増殖す
る。（３）Ｖｉｒｕｌｅｎｃｃｉ！領域を含むプラスミ
ドに比して、Ｔ−ＤＮＡの境界領域を含むシャトルベク
ターのコピー数が数十倍高いため、植物細胞の形質転換
の効率が高まる。
本発明で採用されたシャトルベクターはプラスミドＲＫ
２に由来するレプリコンをもち、また、ＲＫ２に由来す
る転移の機能を含むプラスミドｐＲＫ２０１３と共存さ
せると、他のバクテリアに移行する。移行してくるシャ
トルベクターを受入れる側のアゲロバクチリアにはＴ
−Ｄ Ｎ ｐ、 ＳＮ域を全く含まず、それ故にシャト
ルベクター内のＴ−ＤＮＡ領域を全く含まず、それ故に
シャトルベクター内のＴ−ＤＮＡの境界領域との間に組
み換えを起こさずに、Ｔ−ＤＮＡが植物細胞への転移に
必須なＶｉｒｕｌｏｎｃｅｊｉ域を含むプラスミドを有
している。この結果、シャトルベクター移行後には、ア
ゲロバクチリアは、ＶｉｒｕｌｏｎｃｅｉＩ域を有する
プラスミドと、それと独立してそれより数十倍のコピー
数を有するシャトルベクターとを含むことになる。
２に由来するレプリコンをもち、また、ＲＫ２に由来す
る転移の機能を含むプラスミドｐＲＫ２０１３と共存さ
せると、他のバクテリアに移行する。移行してくるシャ
トルベクターを受入れる側のアゲロバクチリアにはＴ
−Ｄ Ｎ ｐ、 ＳＮ域を全く含まず、それ故にシャト
ルベクター内のＴ−ＤＮＡ領域を全く含まず、それ故に
シャトルベクター内のＴ−ＤＮＡの境界領域との間に組
み換えを起こさずに、Ｔ−ＤＮＡが植物細胞への転移に
必須なＶｉｒｕｌｏｎｃｅｊｉ域を含むプラスミドを有
している。この結果、シャトルベクター移行後には、ア
ゲロバクチリアは、ＶｉｒｕｌｏｎｃｅｉＩ域を有する
プラスミドと、それと独立してそれより数十倍のコピー
数を有するシャトルベクターとを含むことになる。
Ｖｉｒｕｌｏｎｃｃ４＋Ｉ域を含むプラスミドを有する
アゲロバクチリアｐｃ２７６０をＬ−培地に抗生物質の
りファンプシン２０μｇ ／ ｍ ｌとストレプトマイ
シン５００μｇ ／ ｍ ｌを加えて３０℃で１晩培養
した。プラスミドｐＲＫ２０１３をもつ大腸菌ＨＢＩＯ
Ｉを５０μｇ ／ ｍ ｌのカナマイシンを含むし一培
地にて３７℃で１晩培養した。シャトルベクターをもつ
大腸菌に８０２ ＴＲＡ４０３（ＦＥＲＭ Ｐ−７
９６９）を１５μＦ、／ｍｆｆ１のテトラサイクリンを
含むし一培地にて３０℃で１晩培養した。翌日、Ｌ−寒
天培地に上記／３種のノ１クチリアの培養液を一滴づつ
重ね合わせて落し、３０℃で１晩培養した。増殖したバ
クテリアを無菌水に懸濁して希釈して、リフアンプシン
２０μｇ ／ ｍ ｌストレプトマイシン５００μｇ
／ ｍ！、テトラサイクリン５μｇ ／ ｍ ｌを含む
し一寒天培地にまき、３０℃で２晩培養した。増殖した
単一コロニーを、更に２回単一コロニー化した。このよ
うにして得られたアゲロバクチリア （釦暉咲翔亘ｕｎ、ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｃｅ） Ｔ
ＲＡ ５０１（ＦＥＲＭ Ｐ−７９６４）はシャトル
ベクターとＶｉｒｕｌｅｎｃｅ領域を含むプラスミドと
が存在していた。
アゲロバクチリアｐｃ２７６０をＬ−培地に抗生物質の
りファンプシン２０μｇ ／ ｍ ｌとストレプトマイ
シン５００μｇ ／ ｍ ｌを加えて３０℃で１晩培養
した。プラスミドｐＲＫ２０１３をもつ大腸菌ＨＢＩＯ
Ｉを５０μｇ ／ ｍ ｌのカナマイシンを含むし一培
地にて３７℃で１晩培養した。シャトルベクターをもつ
大腸菌に８０２ ＴＲＡ４０３（ＦＥＲＭ Ｐ−７
９６９）を１５μＦ、／ｍｆｆ１のテトラサイクリンを
含むし一培地にて３０℃で１晩培養した。翌日、Ｌ−寒
天培地に上記／３種のノ１クチリアの培養液を一滴づつ
重ね合わせて落し、３０℃で１晩培養した。増殖したバ
クテリアを無菌水に懸濁して希釈して、リフアンプシン
２０μｇ ／ ｍ ｌストレプトマイシン５００μｇ
／ ｍ！、テトラサイクリン５μｇ ／ ｍ ｌを含む
し一寒天培地にまき、３０℃で２晩培養した。増殖した
単一コロニーを、更に２回単一コロニー化した。このよ
うにして得られたアゲロバクチリア （釦暉咲翔亘ｕｎ、ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｃｅ） Ｔ
ＲＡ ５０１（ＦＥＲＭ Ｐ−７９６４）はシャトル
ベクターとＶｉｒｕｌｅｎｃｅ領域を含むプラスミドと
が存在していた。
実施例４０選択マーカー遺伝子が発現している植物細胞
および植物体の調製 本発明の特徴の１つは、植物細胞に導入されたカナマイ
シン抵抗性を担う選択マーカーの遺伝子が発現すること
により、形質転換した単子葉・双子葉被子植物並びに裸
子植物細胞又は植物体を、簡単に選択培地でスクリーニ
ング出来ることである。アゲロバクチリアで植物細胞を
感染させ、Ｔ−ＤＮＡ境界領域間のＤＮＡフラグメント
を植物細胞に導入させるために、アゲロバクチリアと植
物のプロトプラスト培養組織又は葉片を共存培養する方
法が用いられた。
および植物体の調製 本発明の特徴の１つは、植物細胞に導入されたカナマイ
シン抵抗性を担う選択マーカーの遺伝子が発現すること
により、形質転換した単子葉・双子葉被子植物並びに裸
子植物細胞又は植物体を、簡単に選択培地でスクリーニ
ング出来ることである。アゲロバクチリアで植物細胞を
感染させ、Ｔ−ＤＮＡ境界領域間のＤＮＡフラグメント
を植物細胞に導入させるために、アゲロバクチリアと植
物のプロトプラスト培養組織又は葉片を共存培養する方
法が用いられた。
アゲロバクチリフＴＲＡ３０１ （ＦＥＲＭ Ｐ〜
７９６４）を３種の抗生物質を含むＬ培地で３０ ’Ｃ
１１晩培養した。２倍体のタバコ野生種Ｎ１ｃｏｔｉａ
ｎａ ｐｌｕｎｂａｇｉｎｉｆｏｌｒａ植物体は、０．
７％の寒天を含むＬｉｎｓｍａｉｅｒ ＆ Ｓｋｏｏｇ
培地上に（Ｐｈｙｓｉｏｌ。
７９６４）を３種の抗生物質を含むＬ培地で３０ ’Ｃ
１１晩培養した。２倍体のタバコ野生種Ｎ１ｃｏｔｉａ
ｎａ ｐｌｕｎｂａｇｉｎｉｆｏｌｒａ植物体は、０．
７％の寒天を含むＬｉｎｓｍａｉｅｒ ＆ Ｓｋｏｏｇ
培地上に（Ｐｈｙｓｉｏｌ。
Ｐｌａｎｔ、 １８，１００−１２７ （１９６５）
）３０℃、連続照明下で培養された。夕ｌ〜コの葉を約
１ｃｍ四方形に切り、５枚の輩片をｌ直径６ 、０ ｃ
ｍのシャーレ中の２ｍ Ｉｔの液体再分化培地（１，Ｏ
ｒｎｇ。
）３０℃、連続照明下で培養された。夕ｌ〜コの葉を約
１ｃｍ四方形に切り、５枚の輩片をｌ直径６ 、０ ｃ
ｍのシャーレ中の２ｍ Ｉｔの液体再分化培地（１，Ｏ
ｒｎｇ。
ｐ、のｂ−べ’、ｉジＪＬ／７デニ７ （ＢＡＰ）とＱ
、１ｍｇ／ｌの１−ナフタレン酢酸（ＮＡＡ）を含む１
７．Ｓ培地）にうかせ、２Ｘ１０’数のアゲロバクチリ
アを加え、連続照明下、３０℃で４８時間、共存培養し
た。この処理により、葉片の切り端しの植物細胞がアゲ
ロバクチリアにより感染する。アゲロバクチリアを除く
ために、葉片を無菌水で５回洗浄した。この葉片から形
質転換した植物組織（カルス）や茎葉を得るために、葉
片をカルス培地（１ｍｇ／ｌのＢＡＰとＮＡＡを含むＬ
Ｓ培地）又は再分化培地に移植した。これらの培地５０
ｍ１ｌは、゛直径９ｃ＋ａのシャーレ〜に分注されてい
て、０．７％の寒天と、アゲロバクチリアを除去するた
メニ５００ｍｇ／ｊ！のカーペニシリン及びスクリーニ
ング用に５０〜５００ｍｇ／／！のカナマイシンを含ん
でいた。培養は、連続照明下、３０°Ｃて約４週間行な
われた。その後再分化培地で培養された茎葉を、ＢＡＰ
、！：ＮＡＡを含まないＬＳ培地に移植すると、根の形
成が促進され、完全な植物体か生じた。
、１ｍｇ／ｌの１−ナフタレン酢酸（ＮＡＡ）を含む１
７．Ｓ培地）にうかせ、２Ｘ１０’数のアゲロバクチリ
アを加え、連続照明下、３０℃で４８時間、共存培養し
た。この処理により、葉片の切り端しの植物細胞がアゲ
ロバクチリアにより感染する。アゲロバクチリアを除く
ために、葉片を無菌水で５回洗浄した。この葉片から形
質転換した植物組織（カルス）や茎葉を得るために、葉
片をカルス培地（１ｍｇ／ｌのＢＡＰとＮＡＡを含むＬ
Ｓ培地）又は再分化培地に移植した。これらの培地５０
ｍ１ｌは、゛直径９ｃ＋ａのシャーレ〜に分注されてい
て、０．７％の寒天と、アゲロバクチリアを除去するた
メニ５００ｍｇ／ｊ！のカーペニシリン及びスクリーニ
ング用に５０〜５００ｍｇ／／！のカナマイシンを含ん
でいた。培養は、連続照明下、３０°Ｃて約４週間行な
われた。その後再分化培地で培養された茎葉を、ＢＡＰ
、！：ＮＡＡを含まないＬＳ培地に移植すると、根の形
成が促進され、完全な植物体か生じた。
アゲロバクチリアと共存培養するタバコのプロトプラス
トは次の様にして調製された。タバコＮ１ｃｏｔｉａｎ
ａ ｔａｂａｃｕｍ Ｌ、 Ｘａｎｔｂｉｎｅ Ｎ、
Ｃ，゛は温室にて生育された。完全に生長したタバ
コの葉を早朝とり、室温にて３０分間放置してしおらせ
た。
トは次の様にして調製された。タバコＮ１ｃｏｔｉａｎ
ａ ｔａｂａｃｕｍ Ｌ、 Ｘａｎｔｂｉｎｅ Ｎ、
Ｃ，゛は温室にて生育された。完全に生長したタバ
コの葉を早朝とり、室温にて３０分間放置してしおらせ
た。
葉に７０％エタノールを散布し、１０倍希釈のアンチホ
ルミン溶液に５分間浸し、無菌水でよく洗浄した。水分
をふきとった葉の表面を上にしておき、クリーンベンチ
内で葉裏面の表皮細胞層をとり除いた。次に葉を細かく
切り刻み０．５Ｍのマニトール液にて３回洗浄した。そ
してこれを、２０ｍｊ！０．５％のマセロザイムＲ−１
０を含む０．５Ｍのマニトール（ｙ）４５．８）に浸し
、減圧下で葉裏面から空気粒を取り除いた後、２５℃で
１０分間振とう培養した。マセロザイム溶液を除いた後
に、２％のセルラーゼオノズカＲ−１０を含む０．５Ｍ
のマニトール（ｐＨ５，２）を加え、３０℃で４０〜８
０分間、振とう培養した。この培養液を１枚のガーゼで
濾過して葉脈等を取り除き、ｆ液を８０Ｏｒｐｍで遠心
して、プロトプラストを沈殿させた。このプロトプラス
トを０．５Ｍのマニトールで３回洗浄した。このプロト
プラストを１×１０’／ｍＩｌになるように液体のＮａ
ｇａｔａ Ｋ Ｔａｋｅｂｅ培地（Ｐｌａｎｔａ ９
９． ｌ ２ （１９７１）に懸濁して、６ｍｌを直
径６ｃｍのシャーレに移し、連続照明下３０℃で２日間
培養した。
ルミン溶液に５分間浸し、無菌水でよく洗浄した。水分
をふきとった葉の表面を上にしておき、クリーンベンチ
内で葉裏面の表皮細胞層をとり除いた。次に葉を細かく
切り刻み０．５Ｍのマニトール液にて３回洗浄した。そ
してこれを、２０ｍｊ！０．５％のマセロザイムＲ−１
０を含む０．５Ｍのマニトール（ｙ）４５．８）に浸し
、減圧下で葉裏面から空気粒を取り除いた後、２５℃で
１０分間振とう培養した。マセロザイム溶液を除いた後
に、２％のセルラーゼオノズカＲ−１０を含む０．５Ｍ
のマニトール（ｐＨ５，２）を加え、３０℃で４０〜８
０分間、振とう培養した。この培養液を１枚のガーゼで
濾過して葉脈等を取り除き、ｆ液を８０Ｏｒｐｍで遠心
して、プロトプラストを沈殿させた。このプロトプラス
トを０．５Ｍのマニトールで３回洗浄した。このプロト
プラストを１×１０’／ｍＩｌになるように液体のＮａ
ｇａｔａ Ｋ Ｔａｋｅｂｅ培地（Ｐｌａｎｔａ ９
９． ｌ ２ （１９７１）に懸濁して、６ｍｌを直
径６ｃｍのシャーレに移し、連続照明下３０℃で２日間
培養した。
２日間培養したプロトプラストを、アゲロバクチリアと
共存培養するために、６Ｘ１０’のアゲロバクチリアを
上記のプロトプラトに加え、更に４８時間、培養した。
共存培養するために、６Ｘ１０’のアゲロバクチリアを
上記のプロトプラトに加え、更に４８時間、培養した。
次に、アゲロバクチリアを取り除くために、プロトプラ
ストを０．５Ｍのマニトール液で５回洗浄した。洗浄し
たプロトプラストを、５００μｇ ／ ｍ ｌのカーペ
ニシリンを含む６ ｍ ｌのＮＴ培地に懸濁し、シャー
レに移し、２日間培養した。その後、フィーダー培養の
ための培地は、５００μｇ／ｌのカーペニシリンと３％
のマニトール、３％のシ＊ｔ！、０．８％の寒天を含む
ＮＴ培地である。この培地５ Ｑ ｍ ｌを直径９ａｍ
のシャーレに分注して固まらせ、次に０．３ｇのタバコ
の培養細胞をうずくまき、その上に、直径８０と７（Ｊ
のワットマンＩ！舐を重ね合せておき、その上に３Ｘ１
０３のプロトプラストを撒き、連続照明下、３０℃で、
７〜１０日間培養した。この間、プロトプラストは分裂
増殖して、小さな緑のコロニーを形成した。これを、カ
ナマイシン抵抗性でスクリーニングするために、ＬＳ培
地に５００μｇ／ｌのカーペニシリン、１００−５００
μｇ／ｌのカナマイシ：／、１ｍｇ／ｊ！のＢＡＰと０
．１＃Ｌｇ ／ ｌのＮＡＡを含む選択培地に移し、４
週間培養した。こうして、選択マーカー遺伝子の発現し
ているタバコの細胞組織が得られた。このカル、スから
、植物体を再分化するためには、上記の再分化培地と、
組形成培地を用いて処理した。
ストを０．５Ｍのマニトール液で５回洗浄した。洗浄し
たプロトプラストを、５００μｇ ／ ｍ ｌのカーペ
ニシリンを含む６ ｍ ｌのＮＴ培地に懸濁し、シャー
レに移し、２日間培養した。その後、フィーダー培養の
ための培地は、５００μｇ／ｌのカーペニシリンと３％
のマニトール、３％のシ＊ｔ！、０．８％の寒天を含む
ＮＴ培地である。この培地５ Ｑ ｍ ｌを直径９ａｍ
のシャーレに分注して固まらせ、次に０．３ｇのタバコ
の培養細胞をうずくまき、その上に、直径８０と７（Ｊ
のワットマンＩ！舐を重ね合せておき、その上に３Ｘ１
０３のプロトプラストを撒き、連続照明下、３０℃で、
７〜１０日間培養した。この間、プロトプラストは分裂
増殖して、小さな緑のコロニーを形成した。これを、カ
ナマイシン抵抗性でスクリーニングするために、ＬＳ培
地に５００μｇ／ｌのカーペニシリン、１００−５００
μｇ／ｌのカナマイシ：／、１ｍｇ／ｊ！のＢＡＰと０
．１＃Ｌｇ ／ ｌのＮＡＡを含む選択培地に移し、４
週間培養した。こうして、選択マーカー遺伝子の発現し
ているタバコの細胞組織が得られた。このカル、スから
、植物体を再分化するためには、上記の再分化培地と、
組形成培地を用いて処理した。
第１図はＴ、プラスミド各領域の分布図、第２図はＴ−
ＤＮＡの制限酵素図を示す。また第３図はｔｍｌ遺伝子
プロモーターの単離過程、第４図はｔ ｍ １プロモー
ターエＮＰＴ構造遺伝子の組み合せ過程、第５図は選択
マーカー遺伝子の各部分の結合過程をそれぞれ示し、第
６図および第７図はシャトルベクターの作成過程を示す
。 特許出願人 農林水産省農業生物資源研究所長第１図 オリジ“ン 〒−−−− ξ 星ａ■ぷ
ＤＮＡの制限酵素図を示す。また第３図はｔｍｌ遺伝子
プロモーターの単離過程、第４図はｔ ｍ １プロモー
ターエＮＰＴ構造遺伝子の組み合せ過程、第５図は選択
マーカー遺伝子の各部分の結合過程をそれぞれ示し、第
６図および第７図はシャトルベクターの作成過程を示す
。 特許出願人 農林水産省農業生物資源研究所長第１図 オリジ“ン 〒−−−− ξ 星ａ■ぷ
Claims (5)
- （１）（ａ）植物細胞で発現可能なプロモーター、（ｂ
）植物細胞を選択可能な構造遺伝子 および （ｃ）Ｐｏｌｙ（Ａ）付着領域 を含み、かつ（ａ）、（ｂ）、（ｃ）が機能的に結合さ
れた選択マーカー遺伝子。 - （２）（ I ）野生型Ｔ＿１プラスミドのＴ−ＤＮＡの
境界領域、 （II）クローニングサイト および （III）（ａ）植物細胞で発現可能なプロモーター、（
ｂ）植物細胞を選択可能な構造遺伝子 および （ｃ）Ｐｏｌｙ（Ａ）付着領域 を含み、かつ（ａ）、（ｂ）、（ｃ）が機能的に結合さ
れた選択マーカー遺伝子を含み、かつ大腸菌とアグロバ
クテリアで増殖可能なシャトルベクター。 - （３）（ I ）野生型Ｔ＿１プラスミドのＴ−ＤＮＡの
境界領域、 （II）クローニングサイト および （III）（ａ）植物細胞で発現可能なプロモーター。 （ｂ）植物細胞を選択可能な構造遺伝子 および （ｃ）Ｐｏｌｙ（Ａ）付着領域 を含み、かつ（ａ）、（ｂ）、（ｃ）が機能的に結合さ
れた選択マーカー遺伝子を含み、かつ大腸菌とアグロバ
クテリアで増殖可能なシャトルベクターおよびＴ−ＤＮ
Ａを含まずＴ−ＤＮＡの植物細胞への転移に必須なＶｉ
ｒｕｌｅｎｃｅ領域を含むプラスミドを含むアグロバク
テリア。 - （４）（ I ）野生型Ｔ＿１プラスミドのＴ−ＤＮＡの
境界領域、 （II）クローニングサイト および （III）（ａ）植物細胞で発現可能なプロモーター（ｂ
）植物細胞を選択可能な構造遺伝子 および （ｃ）Ｐｏｌｙ（Ａ）付着領域 を含み、かつ（ａ）、（ｂ）、（ｃ）が機能的に結合さ
れた選択マーカー遺伝子を含み、かつ大腸菌とアグロバ
クテリアで増殖可能なシャトルベクターの左右境界領域
間のＤＮＡセグメントをその染色体中に組みこむ植物細
胞。 - （５）（ I ）野生型Ｔ＿１プラスミドのＴ−ＤＮＡの
境界領域、 （II）クローニングサイト および （III）（ａ）植物細胞で発現可能なプロモーター（ｂ
）植物細胞を選択可能な構造遺伝子 および （ｃ）Ｐｏｌｙ（Ａ）付着領域 を含み、かつ（ａ）、（ｂ）、（ｃ）が機能的に結合さ
れた選択マーカー遺伝子を含み、かつ大腸菌とアグロバ
クテリアで増殖可能なシャトルベクターの左右境界領域
間のＤＮＡセグメントをその染色体中に組みこむ植物細
胞から再分化された植物個体。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP59255008A JPS61135588A (ja) | 1984-12-04 | 1984-12-04 | 植物細胞の選択マ−カ−の遺伝子，シヤトルベクタ−，アグロバクテリア，植物細胞及び植物個体 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP59255008A JPS61135588A (ja) | 1984-12-04 | 1984-12-04 | 植物細胞の選択マ−カ−の遺伝子，シヤトルベクタ−，アグロバクテリア，植物細胞及び植物個体 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS61135588A true JPS61135588A (ja) | 1986-06-23 |
Family
ID=17272915
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP59255008A Pending JPS61135588A (ja) | 1984-12-04 | 1984-12-04 | 植物細胞の選択マ−カ−の遺伝子，シヤトルベクタ−，アグロバクテリア，植物細胞及び植物個体 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS61135588A (ja) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH0473407U (ja) * | 1990-11-06 | 1992-06-26 | ||
| WO2004020641A1 (fr) * | 2002-09-02 | 2004-03-11 | Dalian Keyuan Agricultural Bioengineering Co., Ltd. | Procede de manipulation de genie genetique relatif aux plantes, a securite biologique |
-
1984
- 1984-12-04 JP JP59255008A patent/JPS61135588A/ja active Pending
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH0473407U (ja) * | 1990-11-06 | 1992-06-26 | ||
| WO2004020641A1 (fr) * | 2002-09-02 | 2004-03-11 | Dalian Keyuan Agricultural Bioengineering Co., Ltd. | Procede de manipulation de genie genetique relatif aux plantes, a securite biologique |
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