JPS62175185A - Ｔ▲Ｒ▼に基づくサブ−Ｔｉプラスミド - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （以下余白） −Ｊ−σ詳１ト鷺−説割− （産業上の利用分野） 本発明は遺伝子工学および農業の分野にあり。

特に植物形質転換に有用なベクター、および植物での転
写終結を促進する方法を提供する。

（従来の技術） 以下は本発明に密接に関連する従来技術の情報を開示す
る文献である。これらの文献はこの従来の技術の項で充
分詳細に議論される。Ｒ，Ｆ、　Ｒａｒｋｅｒｅｔ　　
ａｌ−、（ｉ９８３）　Ｐｌａｎｔ　Ｍｏ１．　Ｂｉｏ
）、幻−：　３３５−３５０ばオクトピン型プラスミド
　ｐＴｉ１５９５５のＴ−ＯＮへの全配列を開示してお
り、他のＴｉプラスミドの相同な既報の配列はそこに引
用されている。ＴＲ−ＤＮＡに枯づき、植物と細菌の両
方で発現可能なＯＲＦ２４に基づく選択マーカーを有す
るザブ−Ｔｉプラスミドが、　　Ｓ、　　Ｂ、　　Ｇｅ
１ｖｉｎ　　ｅｔ　　ａ）、　　（ｉ９８５）　　Ｍｏ
１．　　Ｇｅｎ。

Ｇｅｎｅｔ、　　１９９　：　２４０−２４８により開
示されている。

７　））’　Ｌｌ　ｙ＜タラＬ■り祷−（Ａ、、ｇ　ｒ
リリ旦ｔｅｒｉ−ｕ−甲方Φ−概−説−ダラム陰性のア
グロバクテリウム（Ａ４ｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属菌
の毒性（ヴイルレン１〜）株は、アゲロバクチリウム・
チューメファシエンス（！３ｌ−（０胚力仄ｉｕｍ−ｔ
ｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）では、　Ｔｉ　（腫瘍誘導）プ
ラスミド（ｐＴｉ）、そしてアグロバクテリウム・リゾ
ゲネス（Ａ　ｒｏｂ　ｃｔｅｒｉｕｍ　　リＬＬ４９月
舌、ｎｅｓ）ではＲｉ　（＋艮ｉｉ導）プラスミド（ｐ
Ｒｉ）として知られている巨大プラスミドと保持してお
り、これはしばしば代謝されるオピンにより分類される
。ＴｉプラスミドおよびＲｉプラスミドは共にＴ−ＤＮ
Ａ　　（転移する一ＤＮＡ）として知られているＤＮＡ
配列を含んでおり、これば腫瘍では宿主植物のゲノムに
Ｍｉ　ｉｔ込まれたものとして見出される。いくつかの
Ｔ−ＤＮＡ遺伝子は、構造」二標で１を的な真核プロモ
ーターに類似したＴ−ＤＮＡプロモーターの支配下にあ
る。

アグロバクテリウム（卸μ声基旦−ｒｊ−υ−りに起因
する病気の一般的総説に、　Ｄ、　Ｊ、　Ｍｅｒｌｏ　
（ｉ９８２）、　Ａｃ１ｖ。

Ｐｌａｎｔ　Ｐａｔｈｏ）、　−＋　：　１３９−１７
８；　Ｌ、　Ｗ、　Ｒｅａｍ　ａｎｄ　Ｍ。

Ｐ、　Ｇｏｒｄｏｎ　（ｉ９８２）、　５ｃｉｅｎｃｅ
　　２１Ｅｉ　：　８５４−８５９；　Ｍ。

Ｗ、　Ｂｅｖａｎ　ａｎｄ　Ｍ、−Ｄ、　Ｃｈｉｌｔｏ
ｎ　（］９８２Ｌ　Ａｎｎ、Ｒｅｖ。

Ｇｅｎｅｔ、　　１６　：　３５７−３８４：　Ｇ、　
Ｋａｈｌ　ａｎｄ　Ｊ、　５ｃｈｅｌｌ（ｉ９８２）−
風竪ｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇ　　ｏｆ　Ｐｌａｎｔ　Ｔ
ｕｍｏｒｓ；　Ｋ。

八、　　Ｂａｒｔｏｎ　　ａｎｄ　　Ｍ、−１１，Ｃｈ
ｉｌｔｏｎ　　（ｉ９８３）Ｍｅｔｈ、　　Ｅｎｚｙｍ
ｏｌ。

１０１　　：　　５２７−５３９；　　八、　　Ｄｅｐ
ｉｃｋｅｒ　　　ｅｔ　　　ａ）、　　（ｉ９８３）　
　ｉｎβｅｎｅｔｉＣ３−如エ−（」ｅｅｒｉｎｇ　ｏ
ｆ　Ｐｌａｎｔｓ　：　ａｎ　Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａ
ｌＰｅｒｓｐｅｃｔｉｖｅ、　　ｅｄｓ：　Ｔ、　　Ｋ
ｏｓｕｇｅ　ａｔ　　ａ）、＋　　ｐｐ、　　１４３−
１７６；　Ａ、　Ｃａｐｌａｎ　　ｅｔ　　計、　　（
ｉ９８３）Ｓｃｉｅｎｃｅ　２２２　：８１５−８２１
；　Ｔ、　　Ｃ，ｌ１ａｌｌ　ｅｔ　　ａ）、、　　Ｅ
ｕｒｏｐｃａｎ　Ｐａｔｅｎｔａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ
　１２６，５４６；およびΔ、　Ｎ、Ｂ１ｎｎ５　（ｉ
９８４）Ｏｘｆｏｒｄ　５ｕｒｖｅｙＳＰｌａｎｔ　Ｍ
ｏ１．　Ｃｅ１ｌ　Ｂｉｏ）、　　ニー：　１３０−１
．６０によるものがある。多くのより専門的な総説Ｒ１
八、　　５ｃｈｉｌｐｅｒｏｏｒｔ　　（ｉ９８４）、
　　　Ｕｆｆｉｃ↓ｅｎｃ　　　ｉｎ　　ＰｌａｎｔＢ
ｒｅｅ＋↓ｉｎ−ｇ　　（Ｐｒｏｃ、　　１０ｔｈ　　
Ｃｏｎｇｒ、　　Ｅｕｒ、　　八５ｓｏｃ、　　Ｒｅｓ
。

Ｐｌａｎｔ　Ｂｒｅｅｄｉｎｇ）、　ｅｄｓ：　ｆｉ）
、　Ｌｎａｇｅ　　ｅｔ　　ａ）、、　ｐｐ。

２５１−２８５．は植物遺伝子操作と植物改良の技術に
関して、アグロバクテリウム（Ａ　Ｂ−ｒ　Ｏ！］　ａ
　ｐ　ｔ　ｅ　ｒ　ｉ　ｕ　ｍ　）に基づく植物形質転
換を論じている。

范ｔ１０帽死亀架 植物細胞は当該分野の多くの方法によりアグロバクテリ
ウムｊＡ−，ａｃｔｅｒｉｕｍ）により形質転換され得
る。最近の研究の総説に関しては、　Ｋ、　５ｙｏｎ。

（ｉ９８４）　０ｘｆｏｒｄ　５ｕｒｖｅｙｓ　Ｐｌａ
ｎｔ　Ｍｏ１．　Ｃｅ１ｌ　Ｂｉｏｌ。

１　：　２１７−２１９を参照。本発明では、有糸分裂
および減数分裂を通して遺伝子が安定に伝達される限り
、いずれの方法でも良い。

アグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）に
よる植物組織の感染は当業者に周知の単純な技術である
。

典型的には、傷をつげた後、植物に腫瘍誘導細菌の懸濁
液を植えつげる。あるいは１組織断片３例えば葉のディ
スク（Ｒ，Ｂ、　Ｈｏｒｓｃｈ　　ｅｔ　　ａ）、　（
］９８５）Ｓｃｉｅｎｃｅ　２２７　：　１２２９−１
２３１）または倒置した茎切片（Ｋ、　　八、　　Ｂａ
ｒｔｏｎ　　　ｅｔ　　　ａ）、　　（ｉ９８３）　　
Ｃｅ１ｌ　　３２　　：　　１０３３−１０４３）　、
に植菌する。誘導後、腫瘍は５通常非形質転換植物組織
の培養では含まれる植物ホルモンを欠く培地上で９組織
培養することができる。従来の植菌および培養技術は、
ホルモン独立増殖のできない武装解除ベクター（例えば
Ｐ、　Ｚａｍｂｒｙｓｋｉｅｔ　　ａ）、　（ｉ９８４
）＋　Ｇｅｎｅｔｉｃ　Ｂ７．　Ｐｒ１ｎｉａｎｄ　　
Ｍｅｔｈｏｄｓ、　　　　６．　　ｅｄＳ：　　八、　
　Ｈｏ１１．ａｅｎｄｅｒ　　ａｎｄ　　Ｊ。

Ｓｅｔｔｏｗ）の使用用に、変更しても良い。

アグロバクテリウム（釦皿崩μｍ９Ｌ匡ｍｌ−はまた単
１７ｉｉ１細胞、培養で成育した細胞、カルス細胞およ
び華離プロトプラスト 例えば、　Ｒ．　Ｂ．　ｌｌｏｒｓｃｈ　ａｎｄ　Ｒ．
　Ｔ．　Ｆｒａｌｅｙ　（ｉ９８３Ｌ２Ｑ）、　ｅｄｓ
：　Ｋ．　Ｄｏｗｎｅｙ　、Ｌ′！ｔ−　　ａｌ．、　
Ｉ”、　５７６　：　１７．　Ｔ。

Ｆｒａｌｅｙ　　ｅｔ　　ａｌ．　　（ｉ９８４）　Ｐ
ｌａｎｔ　Ｍｏ１．　Ｂｉｏｌ．　３　：３７１−３７
８；　Ｒ．　Ｔ．　Ｆｒａｌｅｙ　ａｎｄ　Ｒ．　Ｂ．
　Ｉｌｏｒｓｃｈ　（ｉ９８３）Ｇ靭旦区旦岨ｍｑヅｊ
−１」−ゲノー１ー胡旦タツルーＡＢｒｉ剪旦どｐ」１
’ｃｒｓｐｅｃｔｉｖｅ，　Ｔ．　Ｋｏｓｕｇｅ　　ｃ
ｔ．ａｌ．　ｐｐ．１７７−１９４；Ａ．　Ｍｕｌｌｅ
ｒ　ｅｔ　　ａｌ．　（ｉ９８３）　Ｂｉｏｃｈｅｍ．
旧ｏｐｈｙｓ．　Ｒｅｓ。

Ｃｏｍｍ．　１２３　：　４５８−４６２）。植菌カル
ス断片の形質転換頻度はオピンまたはオピン前駆体の添
加により」二げることができる（Ｌ．　Ｍ．　Ｃｅｌｌ
ｏ　ａｎｄ　Ｗ．　Ｌ．　Ｏｌｓｅｎ。

１１、　Ｓ．　Ｐａｔｅｎｔ　４，４５９，３５５）。

クラウンゴール病原性の宿主範囲は，　９ｎ（≧遺伝子
のようなＴ−ＤＮＡにコードされている機能により影響
される　（八．　ｌｌｏｅｋｅｍａ　　、ｇ−ｔ　　ａ
ｌ．　　（ｉ．９８４）　Ｊ。

Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．　　　１５８Ｌ−：　　３８３−
３８５　　；　　八．　　Ｈｏｅｋｅｍａ　　　ｅ↓ａ
ｌ　　、　　（ｉ９８４）　　Ｅ門ＢＯ　Ｊ．　　３　
：　３０４３−３０４７　：　會．Ｃ。

Ｂｕｃｈｈｏｌｚ　　ａｎｄ　　Ｍ．Ｆ．Ｔｈｏｍａｓ
ｓｈｏｗ　　（ｉ９８４）Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ刊し
：　３２７−３３２）、　　Ｒ．　　Ｌ．　　Δｕｓｉ
ｃｈ，　　Ｅｕｒｏｐｅａｎ　ＰａｔｅｎｔＡｐｐｌｉ
ｃａｔｉｏｎ　１０８，５８０はアグロバクテリウム・
チューメファシエンス（ガご屯匹切償−Ｖヒ　９μ江匹
功ｎｓ）から緑色藻類細胞へのＴ−ＤＮＡの転移と，そ
こでのオフＩ・ピンシンターゼ遺伝子およびＴｎ５カナ
マイシン耐性遺伝子の発現を報告している。Ｇ．　Ｍ．
　Ｓ。

Ｈｏｏｙｋａａｓｖａｎ　Ｓｌｏｇｔｅｒｅｎ　ｅｔ　
　ａｌ．　（ｉ９Ｂ４）　Ｎａｔｕｒｅバクテリウム（
ｉＭ」ｂａｃｔｅｒｉｕｍ）による単子葉植物細胞の，
従来の腫瘍形成を伴い，形質転換を示した。

栢１げｌ平生 正常な形態を有する分化植物組織がクラウンゴール腫瘍
から得られている。例えば、Ｔｉプラスミド変異を用い
て，自己稔性花を形成するシュートを繁殖させる腫瘍が
作られた。結果として生じた種子は，　Ｔ−ＤＮＡを含
みオピンをつくる植物に発芽した。−如五二，」鼾ニー
、　Ｔ−ＤＮＡにより形質転換された組織の根のない表
現型は，出根部分を洗うことにより，部分的に解決でき
，また正常な株への継ぎ木により回避できる（八．同ｓ
ｔｅｍａｙｅｒ　ｅｔ　　−ａｌ。

（ｉ９８４）　Ｍｏ１．　Ｇｅｎ．　Ｇｅｎｅｔ．　旦
［：　５００−５０７）。　ｔｍｒ−　。

Ｔ−ＤＮＡを用いる同様の実験は，そして完全長のＴ−
ＤＮＡが減数分裂を通して子孫に伝えられ得ること。

これらの子孫では，レベルは変動するが，ツバリン遺伝
子を発現させ得ることを示した（Ｋ．　Ａ．　Ｂａｒｔ
ｏｎ帖　ａｌ．　（ｉ９８３）　Ｃｅ１１．　　牝：　
　１０３３４０４３）。

オピン異化に関与する遺伝子は，減数分裂を通して伝わ
ることができたが，　Ｔ−ＤＮＡが武装解除されていな
げればその植物は雄性不稔であった。恐らく，変化して
いないＴ−ＤＮＡと機能のある外来遺伝子は，優性メン
デル則で．密接に連関して，遺伝させることができる（
例えば、　Ｒ，　Ｂ，　Ｈｏｒｓｃｈｅｔ　　ａｌ．　
（ｉ９８４）　Ｓｃｉｅｎｃｅ　　２２３　：　４９６
−４９８　；　Ｄ。

Ｔｅｐｆｅｒ　（ｉ９Ｂ４）　Ｃｅｌｌ　　３％　：　
９５９−９６７　；　Ｍ．　Ｄｅ　Ｂｌｏｃｋ肛：　５
００−５０７を参照）。

最初に形質転換された植物細胞の後成説的状態は再生能
力に影響を与え得る（Ｇ．　Ｍ．　Ｓ．　ｖａｎ　Ｓｌ
ｏｇｔｅｒｅｎｅｔ　　ａｌ．　（ｉ９８３）　Ｐｌａ
ｎｔ　Ｍｏ１．　Ｂｉｏｌ．　２　：　３２１−３３３
）。

アグロバクテリウム・リゾゲネス（榎江仲μ：ｔｅｒｉ
ｕｍー０１印ｐ狙）による形質転換後の再生はＭ．−Ｄ
。

７６；およびＰ．　Ｃｏｓｔａｎｔｉｎｏ　　ｅｔ　　
ａｌ．　（ｉ９８４）　Ｊ。

Ｍｏ１．八ｐｐ１．　Ｇｅｎｅｔ．　２　：　４６５−
４７０により％ｔじられている。

ｆｆｉＪ！形遺琴Ｊプラスし１’Ｊ＝（７）進仮予ＡＴ
ＣＣ１５９５５に見られるオクトピン型プラスミドｐＴ
ｉ１５９５５のＴ−ＤＮＡの完全な配列が，　ｐＴｉＡ
ｃｈ５のＴＬＭ域（Ｊ．　Ｇｉｅｌｅｎ　ｅｔ　　ａｌ
．　（ｉ９８４）　ＥＭＢＯ　Ｊ．　３：８３５−８４
６）を有するものとして，報告された（Ｒ．　Ｆ。

Ｂａｒｋｅｒ　　ｅｔ　　ａｌ．　（ｉ９８３）　Ｐｌ
ａｎｔ　Ｍｏｌｅｃ．　Ｂｉｏｌ．　２　：３３５−３
５０）。報告されたＴ−ＤＮＡ遺伝子はイントロンを含
んでいない。標準的真核プロモーター要素に類似した配
列およびポリアデニル化部位が認められる。

多数の遺伝子が形質転換誘導プラスミドのＴ−１）Ｎ／
１内に同定された。いくつかのオクトピンプラスミドＴ
−ＤＮＡ転写物がマツピングされ（例えば、１．。

Ｗｉｌｌｍｉｔｚｅｒ　　ｅｔ　　ａ）、　（ｉ９８２
）　ＩＥＭＢＯＪ、　　１　：　１３９−１４６　；　
Ｓ、　Ｊ、　Ｋａｒｃｈｅｒ　ｅｔ、　　ａｌ−、（ｉ
９８４）　Ｍｏ１．　Ｇｅｎ。

Ｇｅｎｅｔ、　　１９４　：　１５９−１６５）、そし
ていくつかの機能が明らかにされた。これら領域のいく
つか、特に−ｔ−ｑ　ｒと１−をコードするもの、は原
核細胞でもまた転写され得る（Ｇ、　５ｃｈｒ３ｄｅｒ
　ｅ−、−（ａ小（ｉ９８３）ＥＭＢＯＪ、　２　：　
４０３−４０９　）。遺伝子垣−，ｔｎＨｒ、、　　ｔ
ｍｌ−およびｏｃｓに変異を持つＴｉプラスミドは、そ
れぞれ、シュー１〜を生しる。根が発達する。正常より
大きい腫瘍、そしてオクトピンを合成できない。

ニコチアナ・ツバカム（坦μ壮Ｉル＞　　ｔａｂａＵ虹
の腫瘍カルスを生じる。すなわち９（シ以外のすべては
９竺（発癌性）遺伝子である。他の宿主では。

これらの遺伝子の変異は巽なった表現型を誘導すること
ができる（Ｂｅｖａｎ　ａｎｄ　Ｃｈｉｌｔｏｎ　（ｉ
９８２）八ｎｎ。

Ｒｅｖ、　Ｇｅｎｅｔ、＋前出、を参照）。Ｔ−ＤＮＡ
遺伝子での変異はＴ−ＴＩＮＡの植物ゲノムへの挿入に
影ひしない（，１，Ｌｅｅｍａｎｓ　　ｅｔ旦、　（ｉ
９８２）　ＥＭＢＯＪ、　　１　：　１４７−１５２　
；　Ｌ、　Ｗ、　Ｒｅａｍ　　ｅｔ　　ａｌ−、（ｉ９
８３）　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ。

八ｃａｄ、　　Ｓｃｉ、　　ｌノＳＡ　　　８−０　　
：　　１６６０−１６６４）　　。

オクトピンＴｉプラスミドはオクトピンシンクーゼ（リ
ソピンデヒドロゲナーゼ）をコードする旦遺公子を有す
る。Ｃ，Ｋｏｎｃｚ　　ｅ％　　ａ−、，１，−、（ｉ
９８３）　ＥＭＢｏ、１．　２　：　１５９７−１６０
３．は匹しの機能の分析を行った。

Ｐ、　Ｄｈａｅｓｅ　ｅｔ、　　ｑ、　　（ｉ９８３）
　Ｉ！ＭＢＯＪ、　　、２　：　４１９−４２６゜は“
転写物７”　（Ｂｅｒｋｅｒ　　ｅｔ−ａ）、、前出、
のＯＲＦ３）と胛−による種々のポリアデニル化部位の
利用を報告した。組織内でのオフＩ・ピンシンクーゼ酵
素の存在は、その組織を種々のアミノ酸アナログの毒性
効果から保護する（Ｇ、八、　Ｄａｈｌ　ａｎｄ　Ｊ、
　Ｔｅｍｐｅ（ｉ９８３）　　Ｔｈｅｏｒ、　　八ｐｐ
１．　　Ｇｅｎｅｔ、　　　６６、　　：　　２３３−
２３９　　：　　Ｍ。

Ｇ、　　Ｋｏｚｉｃｌ　　ｅｔ　　　ａ）、　　（ｉ９
８４）　　Ｊ、　　Ｍｏ１．　　八ｐｐ）、　　Ｇｅｎ
ｅｔ。

−２！　：　５４９−５６２　）。

ツバリンＴｉプラスミドはツバリンシンターゼ遺伝子＜
ｎｏｓ）（八、　Ｄｅｐｉｃｋｅｒ　ｅｔ　　ａ）、　
（ｉ９８２）　Ｊ。

Ｍｏ１．　Ａｐｐ）、　Ｇｅｎｅｔ、　１　：　５６１
−５７３．により配列決定された）をコードする。Ｃ，
Ｈ，Ｓｈａ皆　叩　ｐユ、（ｉ９８４）　　Ｎｕｃ）、
　　八ｃｉｄｓ　　Ｒｅｓ、　　　１２　　：　　７８
３１−７８４６．　　は旦旦旦−の機能分析を行った。

虱とｔｍｒに等価な遺伝子がツバリン型プラスミド上に
同定され、そして多くの転写物がマツピングされた（Ｌ
、　Ｗｉｌ１ｍｉｔｚｅｒ県旦、　（ｉ９８３）　Ｃｅ
１ｌ　３２　：　１０４５−１．０５６）。

Ｔ−ＤＮＡ領域外の形質転換誘導プラスミド遺伝子は■
Ｌ遺伝子を含み、これが変異するとＴｉプラスミドは非
毒性になる。いくつかのｖｉｒ遺伝子が正確にマツピン
グされ、そして種にのＴｉプラスミド間に保存されてい
る領域に位置することがわかった（Ｖ、　Ｎ、　Ｉｙｅ
ｒ　ｅｔ　ａ）、　（ｉ９８２）　Ｍｏ１．　Ｇｅｎ、
　Ｇｅｎｅｔ。

１８８　：　４１８−４２４）。この肛遺公子はトラン
スに機能し、異なったプラスミド型でしかも物理的に他
のプラスミドに位置しているＴ−ＤＮＡで植物細胞の形
質転換を起こすことができる（例えばＡ、　Ｊ、　ｄｅ
Ｆｒａｍｏｎｄ　ｅｔ　　ａｊ、　（ｉ９８３）　Ｂｉ
ｏｔｅｃｈｎｏ）、　　１　：　２６２−２６９　；　
Ａ、　Ｈｏｅｋｅｍａ　　ｅｔ　　ａ）、　（ｉ９８３
）　Ｎａｔｕｒｅ　３０３　：１７９−１８０　；　Ｊ
、　Ｈｉｌｌｅ　　ｅｔ　　ａ）、　（］９８４）　Ｊ
、　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ。

１５８　　：　　７５４−７５６　　、　　八、　　Ｈ
ｏｅｋｅｍａ　　　ｅｔ　　　ａ）、　　（ｉ９８４）
Ｊ、　　Ｂａｃｔｅｒｉｏ）、　　１！Σ８　　：　　
３８３−３８５　　；　　Ｇ、　　八ｎ、　　　ｅｔ　
　　ａｌ。

（ｉ９８５）　ＥＭＢＯＪ、　　４　：　２７７−２８
４）。このような配置は２元系として知られている。Ｃ
ｈｉｌｔｏｎ　；ｔ　　ａｌ。

（ｉ９８３）　１５ｔｈ　Ｍｉａｍｉ　Ｗｉｎｔｅｒ　
Ｓｙｍｐ、、はｄｅ　Ｆｒａｍｏｎｄｌ　１１．前出（
記述についてばＥｕｒｏｐｅａｎ　ｐａｔｅｎｔａｐｐ
ｌｉｃａｔｉｏｎ　１２６，５４６参照）のミニ−Ｔｉ
プラスミドの再分割によりつくられた“ミクロ−Ｔｉ”
プラスミドを述べた。Ｇ、　Ａ、　Ｄａｈｌ　　旦　１
．、米国特許番号５３２．２８０．および八、　Ｉｌｏ
ｅｋｅｍａ　（ｉ，９８５）　Ｐｈ、　Ｄ。

Ｔｈｅｓｉｓ＋　Ｒｉｊｋｓｕｎｉｖｅｒｓｉｔｅｉｔ
　ＬｅＭｅｎ、↑ｈｅ　Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ。

はオクトピン型プラスミドｐＴｉ１５９５５のＴＬｊｌ
域からつくられたｏｃｓ遺伝子を有するミクロ−Ｔ１プ
ラスミドを開示している。Ｍ、　Ｂｅｖａｎ　（ｉ９８
４）　Ｎｕｃｌ。

Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、　　１２　：　８７１１−８７２
１　はカナマイシン耐性ミクロ−Ｔｉを開示している。

Ｔ−ＤＮＡは植物細胞を形質転換するのにプラスミド上
になくてもよい；染色体上にあるＴ−ＤＮＡは機能する
（八、　Ｈｏｅｋｅｍａ５肩（□ａ１．　　（ｉ９８４
）　　ＥＭＢＯＪ、　　　３　　：　　２４８５−２４
９０）　。　Ｔ−１）Ｎ八は境界、即ちＴ−ＤＮＡ　／
植物ＤＮＡ結合部、に連関した約２５塩基対の正方向繰
り返しを持ち、これが７グロハクテリウム（釦ｐ地μｍ
ｑ、ｚ九吋からの転移または宿主ゲノムへの組み込みの
いずれかに関与するらしい。４つのｐＴｉ１５９５５境
界ばＢａｒｋｅｒ　、ｅｔ計、、前出、によりＡ、　Ｂ
、　Ｃ，およびＤと名イ」けられた。Ｔｉプラスミドの
決定する特徴は、　Ｍｅｒｌｏ　。

前出（特にそこの表■参照）およびＲｅａｍ　ａｎｄ　
Ｇｏｒｄｏｎ。

前出、により総説されている。

予脣転狽濡１り“ラスミド世Ｊ− オクトピン型Ｔ１プラスミドを含むいくつかの形質転換
誘導プラスミドは、２つの分離したＴ−ＤＮＡ　。

すなわちＴＬ−ＤＮＡとＴＲ−ＤＮＡ、をそれぞれＴ−
ＤＮＡの左と右に絹み込む。ｐＴｉＴ）、およびｐＴｉ
Ｔ、のコピー数ば異なった腫瘍系列で変動する。オクト
ピンＴ−ＤＮＡの中芯は、ツバリンＴ−ＤＮＡ　と高い
相同性を有し、腫瘍維持に必要であり、Ｔ＋、に見出さ
れ。

一般に細胞内たり１コピー存在し、そして腫瘍形態遺伝
子をコードする。（いくつかのＴｉプラスミドの腫瘍遺
伝子は２つの区分にｆＪｌみ込まれるらし（ｉ９８４）
　Ｊ、　Ｒａｃｔ、ｅｒｉｏ）、　　１６０　：　３１
９−３２６））　　、　ＴＲは全くなくても良いが、高
コピー数で見出されるＴ−ＤＮＡは時に植物ゲノムへ取
り込まれた後欠失するが、一般に安定である。Ｔ−ＤＮ
Ａの組み込みが異なる細胞の混合を含む腫瘍は１時々多
重形質転換現象の結果である。ツバリンＴ−ＤＮＡは分
断されない断片として宿主ゲノムに組み込まれる。

Ｔ−ＤＮＡ　／隣接植物ＤＮＡ連結部の境界繰り返しに
関する正確な位置は変動し、そして境界繰り返し内にあ
る必要はない。毒性は１通常のツバリンＴ−ＤＮＡ境界
配列のいずれか１つの欠失後も、必ずしも消失しない（
ｔＬ　Ｊｏｏｓ　ｅｔ　　ａ）、　（ｉ９８３）　Ｃｅ
１ｌ　３２　：１０５７−１０６７をに、　Ｗａｎｇ　
ｅｔ　、１１．　（ｉ９８４）　Ｃｅ１ｌ　３８　：４
５５−４６２およびＣ，１１，Ｓｈａｗ　ｅｔ　　ａ）
、　（ｉ９８４）　Ｎｕｃｌ。

Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、　　１２ｊ　：　６０３１−６０
４１と、右境界に関して比較せよ）。右ツバリン境界の
方向は機能の完全な消失なしに逆向きにでき、そして１
つの境界配列で密接に連関した配列を転移できる（Ｍ、
　Ｄｅ。

Ｂｌｏｃｋ　ｅｔ　　ａ）、　（ｉ９８４）　ＥＭＢＯ
Ｊ、　　３　：　１６８１−１６８９）。

２５ｂｐの合成ツバリン右境界繰り返しが機能的である
（ＷａＢ　　帖　計、前出）。

之土寸フリ上 Ｇ、　　Ｂ、Ｒｕｖｋｕｎ　　ａｎｄ　　Ｆ、Ｍ、Ａｕ
５ｕｂｅｌ　　（ｉ９８］）Ｎａｔｕｒｅ３８９　：　
８５−８８．により開発された“シャトルヘクター”は
外来遺伝物質を巨大ＤＮＡ分子に挿入する方法を提供す
る。シャＩ・ルベクターは、そこへ外来遺伝物質が挿入
される。受容ゲノムＤＮＡ配列のコピーを含む。これら
は、三組交雑技術（Ｒｕｖｋｉｎ　ａｎｄＡｕｓｕｂｅ
ｌ　、前出）、二組交雑における自己可動ヘクターの直
接転移、アグロバクテリウム（釦皿よりａｃｔｅｒｉｕ
ｍ）細胞による外来ＤＮＩＩの直接取込め（″形質転換
″）、アグロバクテリウム（ｑ　ｒ　ｏ　ｂ　ａ　ｃ　
ｔ　ｅ　ｒ　ｉ　ｕ　ｍ　）と他の細菌細胞とのスフェ
ロプラスト融合、あるいはリポソーム封入ＤＮＡの取込
み、を含む公知方法により、最終的な受容細胞へ導入す
ることができる。

シャトルヘクターを受容細胞へ導入後、可能な現象には
、マーカーのいずれかの側での１回組み換えでの二重交
叉がある（ホモ部分二倍体化）。

表現型として優性な性質は１回交叉により導入されるで
あろう（共同組み込み）　　（Ａ、　Ｃａｐｌａｎ　ｅ
＋□ａ１．　（ｉ９８３）　５ｃｉｅｎｃｅ　　２２２
　：　８１５−８２１　；　Ｒ，Ｂ。

Ｈｏｒｓｃｌ＋　　ｅｔ　　−ａ）、　（ｉ９８４）　
５ｃｉｅｎｃｅ　　２２３　：　４９６−４９８）；結
果として生じる縦列重複の欠失に対して保護しなければ
ならない。シャトルヘクターはアグロバクテリウム（伺
μ■ｑｃｔｅｒｉｕｍ）プラスミドの操作に有用であっ
た。

゛′自殺ベクター”　（例えばＳｉｍｏｎ　　ｅｔ　　
ａ）、　（ｉ９８３）　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏ）、　１　
：　７８４−７９１）は、受容細胞内で独立に維持され
得ないレプリコンを持つシャトルヘクターである。Ｔｉ
プラスミドへＤＮＡ配列を転移させるための自殺ヘクタ
ーの利用が報告されている（例えばＥ、　Ｖａｎ　Ｈａ
ｕｔｅ　ｅ％　旦、　（ｉ，９８３）　ＥＭＢＯＪ、　
　２　：　４］１−４１７　；　Ｌ、　Ｃｏｍａｉ　　
ｅｔ　　ａ）、　（ｉ９８３）Ｐｌａｓｍｉｄ　１０　
：　２１−３０　；　Ｐ、　Ｚａｍｂｒｙｓｋｉ　ｅｔ
　　計、（ｉ９８３）　ＥＭＢＯＪ、　２　：　２１４
３−２１５０　；　Ｐ、　Ｚａｍｂｒｙｓｋｉｅｔ　　
ａ）、　（ｉ９８４）　ｉｎ　ＧｅｎｅＪｉｎｅｅｒｉ
１７１ｅｓ。

立川４−Ｍ９ｔｈｏｄｓ、　　　６＋　　ｅｄｓ　　：
　　八、　　Ｈｏ１ｌａｅｎｄｅｒ　　ａｎｄ　　Ｊ。

Ｓｅｔｌｏｗ　；　Ｐ、　Ｚａｈｎ　　ｅｔ　　旦、（
ｉ９８４）　Ｍｏ１．　Ｇｅｎ。

Ｇｅｎｅｔ、　　１９４　：　１８８−１９４　；　Ｃ
ａｐｌａｎ　　ｅｔ　　ａ）、、　５ｕｐｒａ　；Ｃ，
）１．　Ｓｈａｗ　　ｅＬ　　；１．　　（ｉ９８３）
　Ｇｅｎｅ　２３．　：　３１５−３３０）　　。

方法」３云１ ツバリンシンターゼ遺伝子は、オクトピンＴ−１’ｌＮ
Ａに挿入され、植物組織を形質転換した場合、完全に機
能するごとがわかった（Ｃ，Ｌ、　Ｐｉｎｋ　（ｉ９８
２）Ｍ、　Ｓ、　ｔｈｅｓｉｓ、　Ｌｌｎｉｖｃｒｓｉ
ｔｙ　ｏｆ　Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ−Ｍａｄｉｓｏｎ）。

マメファゼオリンをコードする遺伝子がヒマワリ腫瘍に
導入され９発現した。転写は正しい位置で始まり、停止
し、そしてイントロンは転写後に正しくプロセッシング
された（Ｎ、　Ｍｕｒａｉ　　ｐｉ　　ａｌ。

（ｉ９８３）　５ｃｉｅｎｃｅ　　’；３２幻−：　４
７６−４８２）。−ｉｉ′Ｌ子葉植物ジー・メイ（ハ虹
　鼾■旦）の胚乳タンパク、ゼインのイントロンを含ま
ない遺伝子は、ヒマワリのカルス内で転写されるが翻訳
はされない（Ｍ、　Ａ、　Ｍａｔｚｋｅｅｔ　　ａ）、
　　（ｉ９８４）　Ｅ台ＢＯＪ、　　鉦：　１．５２５
−１．５３１）。マメのＲｕＢＰ−カルボキシラーゼの
小ザブユニット遺伝子の発現は、形質転換ペチュニア細
胞で光に制御される；生成したマメ小ザブユニソＩ・タ
ンパクは正しくプロセッシングされ、クロロプラストへ
入る（Ｒ，Ｂｒｏ（Ｈｌｉｅ　ｅｔ　ａｊ、　（ｉ９８
４）　５ｃｉｅｎｃｅ　３３４　ニア ８３８−８４３）。小ザブユニット／ＩＮｌ］Ｔ２キメ
ラタンパクもクロロプラストへ移る（Ｇ、　Ｖａｎ　ｄ
ｅｎ　Ｂｒｏｅｃｋ　、ｇｔａ）、　（ｉ９８５）　Ｎ
ａｔｕｒｅ　３１３　：　３５８−３６３）。この遺伝
子のプロモーターは、カルスでの光誘導発現を細菌の＋
１４造遺伝子に与える（Ｌ、　）Ｉｅｒｒｅｒａ４ｓｔ
ｒｅｌｌａ　ｅｔａ）、　（＋９８４）　Ｎａｔｕｒｅ
　３１０　：　１１５−１２０　；　Ｄ、　Ｆａｃｃｉ
ｏｔｔｉｅｔ、　　ａ）、　（ｉ９８５）　Ｂ１５ｔｅ
ｃｈｎｏ１．　３　：　２４１−２４６）。

！！μしプロモーターは、形質転換植物細胞の選択に有
用な薬剤耐性構造遺伝子を発現させることができる。Ｍ
、　Ｗ、　Ｂｅｖａｎ　ｅｔ　　ａ）、　（＋９８３）
　Ｎａｔｕｒｅ　３０４　：１８４−１８７　：　Ｒ，
Ｔ、　Ｆｒａｌｅｙ　　ａｔ鮭、（ｉ９８３）　Ｐｒｏ
ｃ。

Ｎａｔ）、八ｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ　　８０　：
　４８０３−４８０７　；およびり、　Ｈｅｒｒｅｒａ
４ｓｔｒｅｌｌａ　ａｔ　　Ｑ、　（ｉ９８３）　ＥＭ
ＢＯＪ、２　：９８７−９９５．ばＴｎ５−遺伝子の細
菌カナマイシン耐性構造遺伝子（不オマイシンホスボト
ランスフェラーゼＩＴ、　ＮＰＴ２）　、または」邦を
ノバリンシンクーゼブロモーターの後（すなわち支配下
）に挿入した。

この構築物が植物細胞の形質転換に用いられ、その細胞
は培養においてカナマイシン５およびネオマイシンやＧ
４］８のようなそのアナログに耐性であった。オクトピ
ンＴＬ遺伝子ＯＲＦ２４とＯ１？Ｆ２５のプロモーター
はまた」亜構造遺伝子の発現をもたらす（Ｊ、　Ｖｅｌ
ｔｅｎ　ｅｔ−ａ）、　（ｉ９８４）　ＥＭＢＯＪ、　
３　：　２７２３−２７３０）、　Ｈｅｒｒｅｒａ−Ｅ
ｓｔｒｅｌｌａ　ｅｔ　　ａ）、、前出、は同様な構築
物を報告し、それではＴｎ７のメトトレキセート耐性遺
伝子（ジヒドロフオレートレダクターゼ）がμ竺プロモ
ーターの後に置かれた。形質転換細胞はメトトレキセー
トに耐性であった。カリフラワーモザイクウィルスプロ
モーターの支配下にあるＮＰＴ２遺伝子は、　ＤＮＡを
直接細胞に取り込ませる（、１．　Ｐａｓｚｋｏｗｓｋ
ｉ　ｅｔ　　ａ）、　（ｉ９８４）　ＥＭＩＩＯＪ。

３　：　２７１７−２７２２　；　Ｒ，Ｃ，Ｇａｒｄｎ
ｅｒ　ｅｔ　　ａ）、　（ｉ９８４）Ｐｌａｎｔ　Ｍｏ
１．　Ｂｉｏ）、　Ｒｅｐｏｒｔｅｒ　２−：　３−８
か、またはＴ−ＤＮＡ　　（Ｍ、　Ｇ、　Ｋｏｚｉｅｌ
　　、ｅｔ　　ａ）、　（ｉ９８４）　Ｊ、　Ｍｏｌ。

Ａｐｐ）、　Ｇｅｎｅｔ、　　２　：　５４９−５６２
）により形質転換された植物細胞で発現する。さらに１
．、　ｌ１ｅｒｒｅｒａ−ＩＥｓｔｒｅｌｌａ旦　旦、
　（ｉ９８３）　Ｎａｔｕｒｅ　３０３　：　２０９−
２１３　、ば構造遺伝子を二プロモーターの支配下に置
くことＱこより、オクトピンシンターゼとクロラムフェ
ニコールアセチルトランスフェラーゼの酵素活性の植物
細胞での発現を達成した。Ｇ、　ｌｌｅｌｍｅｒ　ｅＬ
　１−０（ｉ９８４）　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏ）、　　２
　：　５２０−５２７　、　　は肌のプロモーターおよ
び構造遺伝子の５″末端をエセリシア・コリー（ハ且ｈ
ｅｒｉｃｈｉａ　　皿）のβ−ガラクトシダーゼ（Ｉａ
ｃ　Ｚ　）配列に融合させた選択マーカーとして有用な
融合遺伝子を作成した。

Ｍｕｒａｉ　ｅｔ　　ａ）、、前出、ば二構造遺伝子の
プロモーターと５゛末端のファゼオリン構造遺伝子への
融合を報告した。コードされる融合タンパクはＴ−ＤＮ
Ｉ’ｌのプロモーター支配下で生産された。ファゼオリ
ン由来のイントロンは転写後に正しくプロセッシングさ
れた。

（発明が解決しようとする問題点） 本発明の１つの目的は、構造遺伝子を植物細胞内で発現
させる方法であって、前記遺伝子が前記細胞に対し外来
である方法を提供することにある。

他の目的は、形態上正常な植物の生育と和合可能な武装
解除植物形質転換ヘクターを提供することにある。さら
に他の目的は、その中に外来構造遺伝子によりコードさ
れるタンパクを有し、そしてこのタンパクが酵素である
場合、遺伝子が挿入される細胞内で本来存在しない代謝
物または化学物質を有するか、または本来存在するこれ
らを欠く。

特殊な植物組織および植物体を捉イバすることにある。

この目的に対し、　ＴＲ−ＤＮＡを含むサブ−Ｔｉプラ
スミドを提供する。さらなる目的と利点は以下の記述で
明らかになるであろう。

（以下余白） （問題点を解決するための手段） 上記目的を達成するため７本発明のＤＮＡ分子は。

以下の（Ａ）および（Ｂ）を含有するＤＮＡ分子であっ
て、（Ａ）は植物ＤＮＡ　、そして（Ｂ）は修飾Ｔ−Ｆ
ＩＮ八であり、そして、該Ｔ−ＤＮＡは該植物ＤＮＡ内
に挿入され、また８亥Ｔ−ＤＮＡば以下の（ａｉ、　（
ｂ）、　（ｃ）、　（ｄｉおよびｆＱ）を含有する。　
ＤＮＡ分子であって、（ａ）は付属的コードＤＮＡ　、
　Ｆｂ）は外来構造遺伝子、（Ｃ）はＴ−ＤＮＡプロモ
ーター、（ｄ）はＴ−ＤＮＡポリアデニル化部位、そし
て（ｅ）はオクトピン型Ｔ−ＤＮＡ境界ＣおよびＤであ
り。

ここで、（ｆ）該プロモーターおよび該ポリアデニル化
部位は異なるＴ−ＤＮＡ遺伝子に由来し；（ｇ）該プロ
モーター、該構造遺伝子および該ポリアデニル化部位は
、互いに、植物細胞内での該構造遺伝子の転写が該プロ
モーターと該ポリアデニル化部位の支配下にあるような
位置および方向にあり；（ｈ）該プロモーター／構造遺
伝子／ポリアデニル化部位の組合せ、付属的コードＩＩ
ＮＡおよび境界ＣとＤは。

互いに、″境界Ｃ−組合せ−コードＤＮＡ−境界Ｄ”の
配置または“境界Ｃ−コードＤＮＡ−組合せ一境界Ｄ　
”の配置のいずれかの位置にあり；（ｉ）該Ｔ−ＤＮＡ
はオクトピン型Ｔ−ＤＮＡ境界へを欠き；そして（ｊ）
８ｆＴ−ＤＮＡ分子はすべてのオクトピン型ＴＬ−ＤＮ
Ａ　ｏ匹遺公子を欠く。

本発明のＤＮＡ分子は、以下の（ａ）、　（ｂＬ　（ｃ
）、　（ａ）。

（ｅ）、（ｅｌを含有するＤＮＡ分子であって、（ａ）
は外来構造遺伝子２（ｂ）はＴ−ＤＮＡプロモーター、
（Ｃ）はＴ−ＤＮＡポリアデニル化部位、（ｄ）はオク
トピン型Ｔ−ＤＮＡ境界Ｃおよびり、（ｅｌはアグロバ
クテリウム（釦皿−ｂａｃｔｅｒｉｕｍ）内での複製を
可能にするレプリコン。

そして（ｆｌは付属的コードＩ）ＮＡであり、そして、
（ｇ）該プロモーターおよび該ポリアデニル化部位は異
なるＴ−ＤＮＡ遺伝子に由来し；（ｈ）該プロモーター
。

該構造遺伝子および該ポリアデニル化部位は、互いに、
植物細胞内での該構造遺伝子の転写が該プロモーターと
該ポリアデニル化部位の支配下にあるような位置および
方向にあり；（ｉ）該プロモーター／構造遺伝子／ポリ
アデニル化部位の組合せ。

該付属的コードＤＮＡおよび境界ＣとＤは、互いに。

“境界Ｃ−組合せ−コードＤＮＡ　−境界Ｄ”の配置ま
たは“境界Ｃ−コードＤＮＡ−組合せ一境界Ｄ”の配置
のいずれかの位置にあり；（ｊ）該ＤＮＡ分子はオクト
ピン型Ｔ−ＤＮＡ境界へを欠き；そして（ｋ）該ＤＮＡ
分子はすべてのオクトピン型ＴＬ−ＤＮＡ　ｏｎｃ遺伝
子を欠く。

本発明のＤＮＡ分子は、以下の（ａ＋、　（ｂｌ、（ｂ
）を含有するＤＮＡ分子であって、（ａ）はネオマイシ
ンポスホトランスフェラーゼをコードする構造遺伝子。

（ｂｌはＯＲＦ２４プロモーター、そして（Ｃ）はＯＲ
Ｆ２５またはＯＲＦ２６のポリアデニル化部位であり、
そして。

該プロモーター、該構造遺伝子および該ポリアデニル化
部位が、互いに、植物細胞内での該構造遺伝子の転写が
該プロモーターと該ポリアデニル化部位の支配下にある
ような位置および方向にある。

本発明のＤＮＡ分子を修飾する方法は、　ＯＲＦ２５ポ
リアデニル化部位およびＯＲＦ２６ポリアデニル化部位
の両方を有するＤＮＡ区分を構造遺伝子を有するＤＮＡ
区分の３゛末端に連結する工程を含有し、これにより植
物細胞内で、　ＯＲＦ２５ポリアデニル化部位またはＯ
ＲＦ２６ポリアデニル化部位のいずれかにより構造遺伝
子がコードする転写物の３゛末端が決定される。

本発明の植物細胞の形質転換法は、以下の（ａ）。

（ｂ）　、　（ｃｌ　、　（ｄｉ　、　（ｅ）、（ｅ）
を含有するＤＮＡ分子を保持するアグロバクテリウム（
釦筏（ロ）ｃｔｅｒｉｕす□細胞に植物細胞を接触させ
る工程を含む植物細胞の形質転換法であって、（δ）は
外来構造遺伝子、（ｂ）ばＴ−ＤＮＡプロモーター、（
Ｃ）はＴ−ＤＮＡリアデニル化部位、（ｄ）はオクトピ
ン型Ｔ、−ＤＮＡ境界ＣおよびＤｉ＋４１はアグロバク
テリウム（Ｉ１ｇｒ巴ｂａｃｔｅｒｉすΣ内での複製を
可能にするレプリコン、そして（ｆｌは付属的コードＤ
ＮＡであり、そして、（ｇ）該プロモーターおよび該ポ
リアデニル化部位は異なるＴ−ＤＮＡ遺伝子に由来し；
（ｈ）該プロモーター、該構造遺伝子および該ポリアデ
ニル化部位は、互いに、植物細胞内での該構造遺伝子の
転写が該プロモーターと該ポリアデニル化部位の支配下
にあるような位置および方向にあり；（ｉ）該プロモー
ター／構造遺伝子／ポリアデニル化部位の組合せ、該付
属的コードＤＮＡおよび境界ＣとＤは、互いに、Ｕ境界
Ｃ−組合せ−コードＤＮＡ　−境界Ｄ″の配置または“
境界Ｃ＝コードＤＮＡ　−組合せ一境界Ｄ”の配置のい
ずれかの位置にあり；（ｊ）該ＤＮＡ分子はオクトピン
型Ｔ−ＤＮＡ境界へを欠き；そして（ｋ＋該ＤＮＡ分子
はすべてのオフ１−ピン型Ｔ　Ｉ、〜ｌ’ｌＮＡ　ｏｒ
Ｂ−ｃ、遺伝子を欠く。

本発明の植物細胞の形質転換法により生産される植物細
胞、植物組織、植物体、または植物種子は、該形質転換
法が以下の（ａ）、　（ｂ）、　（ｃ）、　（ｄＬ　（
ｅ）、（ｅ）を含有するＤＮＡ分子を保持するアグロバ
クテリウム（Ａ鉦ｑ−１〕−ｇ−ｃ、ぷ償」昨細胞に植
物細胞を接触させる工程を含む形質転換法であり、（ａ
）は外来構造遺伝子、（ｂ）ばＴ−ＤＮＡプロモーター
、（Ｃ）はＴ−ＤＮＡポリアデニル化部位、（ｄ）はオ
クトピン型Ｔ　−Ｄ　Ｎ　Ａ　境界Ｃおよびり、（［り
はアグロバクテリウム（釦皿−帥μｅｒｉｕｍ）内での
複製を可能にするレプリコン。

そして（ｆ）は付属的コードＤＮＡであり、そして、（
ｇ）該プロモーターおよび該ポリアデニル化部位は異な
るＴ−ＤＮＡ遺伝子に由来し；（ｈ）該プロモーター。

該構造遺伝子および該ポリアデニル化部位は、互いに、
植物細胞内での該構造遺伝子の転写が該プロ ０モーターと該ポリアデニル化部位の支配下にあるよう
な位置および方向にあり；（ｉ）該プロモーター／構造
遺伝子／ポリアデニル化部位の組合せ。

該付属的コードＤＮＡおよび境界ＣとＤば、互いに。

゛′境界Ｃ−組合せ−コードＤＮＡ　−境界Ｄ　”の配
置またはパ境界Ｃ−コードＤＮＡ−組合せ一境界Ｄ”の
配置のいずれかの位置にあり；（ｊ）該ＤＮＡ分子はオ
クトピン型Ｔ−ＤＮＡ境界へを欠き、そして（ｋ）該Ｄ
ＮＡ子はすべてのオクトピン型ＴＬ−ＤＮＡ　ｏｎｃ遺
伝子を欠く。

（以下余白） ここで開示する発明は、境界ＣとＤを有し境界へを欠く
オクトピンｐＴｉ　Ｔ　Ｒ−ＤＮＡに基づくサブ−Ｔｉ
プラスミドを提供する。好ましい実施態様として、これ
らのサブ−Ｔｉプラスミドは二遺公子を欠き、そしてオ
クトピン型ｐＴｉ　Ｂａｍ旧断片２の外側のＤＮＡを欠
く。Ｔ−ＤＮＡの植物ゲノムへの取込みに関与する正方
向境界繰り返しを含むサブ−Ｔｉプラスミドの使用は以
下の有用な結果をもたらすことができる：１．ｏｎｃ遺
伝子を欠失させることができ、形質転換組織培養または
プロトプラストからの植物再生が極めてうまく行く。２
．植物細胞はＴＬあるいはＴＲ，またはＴ　ｔとＴ、１
両者により形質転換され得る。ＴＲの多コピーが形質転
換植物ゲノムに見出すことができ、そしてそれは活発に
転写されるので、ＴＬのすべてまたは一部の欠失が９種
々の二遺公子の不在下で、外来遺伝子の高レベル発現を
もたらすことができる。３゜サブ−Ｔｉプラスミドは比
較的小さく、それにより植物形質転換の過程で要求され
る多くの操作が軽減されるかまたは不要になる。

本発明はまた。このようなサブ−Ｔｉプラスミドにより
導入された外来構造遺伝子を有し、そこで。

ここに例証されるように、　Ｔ−ＤＮＡ由来の植物で発
現可能な転写制御配列の支配下で発現する。遺伝的に修
飾された植物細胞を含む植物体を提供する。

さらに１本発明は、　Ｔ−ＤＮＡ由来の植物で発現可能
な転写制′４′ｎ配列に関し、これらの配列の制御下で
植物細胞で発現できるような方向と間隔で挿入された外
来構造遺伝子を含むゲノムを有する植物細胞を含有する
植物組織を提供する。また、　Ｔ−ＤＮＡを含め、複製
する細菌の新規な株を提供し、ごのＴ−ＤＮＡは、挿入
外来構造遺伝子を、　Ｔ−ＤＮＡ由来プロモーターとＴ
−ＤＮＡ由来転写ターミネータ−に関し、前記プロモー
ター領域とターミネータ−の制御下で植物で発現できる
ような方向と間隔で、含むように修飾されている。さら
に９本発明は植物を形質転換するのに有用な新規ベクタ
ーを提供する。これらのベクターは細菌内で複製する能
力を有し、　ＴＲ−ＤＮＡを含む。これらはさらに、ヘ
ククー内に含まれるＴ　Ｒ−ＤＮＡ内に挿入された外来
構造遺伝子を、　Ｔ−ＤＮＡ由来プロモーター領域とＴ
−ＤＮｆ１転写ターミネータ−の制御下で植物細胞また
は細菌で発現できるように、含む。さらに前記ベクター
を保持する細菌の株を開示する。

本発明は、プロモーターの支配下にある外来構造遺伝子
を含み、前記プロモーター／遺伝子の組合せはオクトピ
ン型ＴｉプラスミドＴＲ−ＤＮ八に基づくザブ−Ｔｉプ
ラスミドを用いて細胞に挿入されている。さらに特異的
には、その好ましい実施態様においては、ここに開示さ
れた本発明はさらに。

Ｔ−ＤＮＡを介する導入７ｉ、　ＯＲＦ２４の隣接ＤＮ
Ａに由来する。あるＴ、−ＤＮＡ来の植物発現プロモー
ターの制御下の外来構造遺伝子の植物細胞内での発現を
含む、つまり、　ＯＲＦ２４ブロモ−クーの制御下で。

そしてＯＲＦ２５またはＯＲＦ２６のポリアデニル化部
位の前に、外来構造遺伝子をＴ−ＤＮＡに挿入し、この
挿入を含むＴ−ＤＮＡを既知の方法により植物細胞に導
入するものである。一度、外来構造遺伝子を発現する植
物細胞が得られれば、植物組織および完全植物体を当該
分野の方法と技術を用いて、それから再往できる。再生
植物を次に簡便法でｉｌ殖させ、導入された遺伝子は簡
便な植物育種技術により他の株および栽培物に移すこと
ができる。本発明は原理的には、そこへＤＮＡが導入さ
れるいかなる植物種へのいかなる外来構造遺伝子の導入
をも応用する。

本発明は他の種、生物２または株の有用な外来構造遺伝
子の挿入により、細菌、植物細胞、植物組織、および完
全植物体を遺伝的に修飾するのに有用である。そのよう
な有用な構造遺伝子は以下の同定できる表現型を存する
遺伝子を含むが、これに限らない：極端な熱または寒さ
に対する改良された抵抗性；嫌気条件（例えば、水浸し
）、乾燥、または浸透圧ストレスに対する改良された抵
抗性；昆虫（例えばバチルス・チューリンギエンシス（
地猥１Ｊ至　■肛」…ニー牡し）の結晶タンパクのよう
な殺虫毒素）、クモ、線虫、または着生植物害虫、およ
びカビによる病気、細菌病、またはウィルス病に対する
改良された耐性または抵抗性；該Ｍｉ織または植物に通
常存在しない酵素または二次代謝物の生産；繊維、また
はヒトまたは動物食糧に用いる場合の改良された栄養的
特性（例えばレクチンおよびゼインまたはファセオリン
のような貯蔵タンパクン、味（例えばクウマチンのよう
な甘味タンパク）、または繊維あるいはヒトまたは動物
食糧に使用される場合の加工上の特性；変化した形態的
性質または発達パターン（例えば植物を昆虫から守る集
毛２美的に喜ばれる着色。

変化した植物生長習性、小さな植物、植物の成熟に要す
る時間の短縮１通常遺伝子が発現しない組織または時期
での遺伝子の発現５その他）；雄性不稔；改良された光
合成効率（低下した光呼吸を含む）、改良された窒素固
定；改良された栄養物の取込み、除草剤（例えばグリホ
セートまたはトリアジン）に対する改良された抵抗性；
増大した穀物収量；他の植物との改良された競合性；遺
伝的に修飾された細胞に新規な遺伝的マーカー；および
その他。遺伝的マーカーは、１つまたはそれ以上の特徴
的な核酸配列、タンパク、遺伝子産物。

または同定はされる表現型の存在により、改良された胚
性の同定に用いることができる。遺伝的マーカーは２本
発明の遺伝的に修飾された植物体。

植物細胞または細菌細胞を、そのように修飾されていな
い植物体、植物細胞または細菌と区別し。

遺伝的に関連しているまたは共に形質転換された人工導
入ＤＮＡ配列、または他の遺伝子型に対し他の方法（例
えば有性的）による表現型、の伝達を容易にすることが
できる。または、特許によりまたは植物変種保護証明に
より守られる植物の同定を容易にすることができる。ス
クリーニング（例えば明瞭な細胞表面抗原、またはβ−
ガラクＩ−シダーゼ、これは容易に目に見える。のよう
な酵素などのスクリーニングできるマーカー）の間に容
易に同定される選択薬剤（即ち選択マーカー）およびマ
ーカーに対する細胞または培養組織の耐性（または抵抗
性）はまた有用な遺伝的マーカーである。本発明はＴｎ
５のネオマイシンホスボＩ−ランスフェラーゼＩＴ　（
ＮＰＴ２）をコードする構造遺伝子を、自然界ではＯＲ
Ｆ２４の発現を制御しているブロモ−クー領域の支配下
で、そしてＯＲＦ２５とＯＲＦ２６の間にあるポリアデ
ニル化部位の前に置くことにより、そしてカナマイシン
およびそのアナログ（Ｂ　ａ−ｎ−遺伝子）の効果に対
し耐性である表現型を与えることにより１例証される。

プロモーター／ｋａｎ−ポリアデニル化部位の絹合せは
、この組合せにより形質転換された細胞を検出し選択す
るのに用いることができる。この組合せに連接したいか
なるＤＮＡ配列も真核および原核生物両者で４選択され
るであろうし、したがって、連接ＤＮＡ配列により形質
転換された細胞は、当業者に理解されるように、同定さ
れるであろう。本発明の他の用途１種々植物種に導入さ
れた他の構造遺伝子の性質を探ること、は当業者に容易
に明らかである。

以下に本発明の詳細な説明する。

明細書および特許請求の範囲での意図およびその使用の
面で不明確さを除くために、以下の定義を行う。

Ｌ！−！％　−、＆−：構造遺伝子の５゛末端の転写開
始に関する配列を指す。ここで例示される自然界のＴ−
ＤＮＡプロモーター領域の配列はＯＲＦ２４のクララン
ゴール腫瘍での転写を起こす。真核プロモーター配列は
、　ｍＲＮＡの５゛末端（ギャップ部位）の位置から５
゛側へ約１０〜３０塩基対（ｂｐ）にある５”・・・Ｔ
ΔＴＩＩＡ・・・３′の標準型に相同なりＮＡ配列の存
在により、一般に８忍識される。ＴＡＴＡＡの５゛イ則
へ約３ｏｂｐに別の標準配列がしばしば見出され、これ
は５゛・・・ＣＣＡＡＴ・・・３゛の標準型に相同なり
ＮＡ配列の存在により認識される。翻訳開始はキヤ・７
プ部位から３′側へ最初の５′・・・ＡＵＧ・・・３′
で、一般に最も有効である。

！Ｊクーミネータニー：ここでは転写物の３゛末端の位
置を決定することができる。いかなる核酸配列をも示す
。転写ターミネータ−ＤＮＡ区分は、それ自身、自然に
存在するまたは合成の、原核または真核の、複数の起源
に由来する区分の混成物かも知れず、またゲノムＤＮＡ
またはｍＲＮＡ山来ｃ由来Ａのものかも知れない、転写
終結部位はポリアデニル化部位、およびリボゾームｔｌ
Ｎへ（ｒＲＮＡ）　、転移ＲＮＡ（ｔＲＮＡ）および非
ポリアデニル化メツセンジャーＲＮへ（ｍＲＮＡ）　　
（例えばヒストンｍＲＮＡ、　Ｐ、八、　Ｋｒｉｅｇａ
ｎｄ　　Ｄ、　　八、　　Ｍｅｌｔｏｎ　　（ｉ９８４
）　　Ｎａｔｕｒｅ　　　３０−８−：　　２０３−２
０６）の３′末端を決定する部位を含む。

、共謀ラー元壬」召ζ部−位：ここでは真核生物のｍＲ
ＮＡのポリアデニル化、すなわち転写終結後ポリアデニ
ル酸“尾”がｍＲＮＡ前駆体の３゛末端に付加されるこ
と、に関連する核酸配列を示す。ポリアデニル化部位は
、一般に標準型５゛０．・ＡＡＴＡＡＡ・・・３゛に相
同な配列の存在により認識されるが、転写物の５゛から
３゛末端の距離の変動１部分的な“読み越し”。

および多重縦列標準配列は特殊ではない。転写物の３′
末端の下流２０と３５ｂｐの間のＤＮＡ配列が必要であ
るらしい（Ｍ、八、　ＭｃＤｅｖｉｔｔ　　ｅｔ　　旦
、　（ｉ９８４）Ｃｅｌ１３７　：　９９３−９９９）
。標準的な“ポリアデニル化部位”はｍＲＮＡの３゛末
端の位置を実際決定するもので、ポリアデニル化自身を
決めるものでないことを認識すべきである（Ｎ、　Ｐｒ
ｏｕｄｆｏｏｔ　（ｉ９８４）　Ｎａｔｕｒｅ　　３０
７　：４１２−４１３）。

転写刷朗酊列：構造遺伝子に隣接するプロモーター／ポ
リアデニル化部位の組合せを指す。

外来橡道道梃子−：ここでの使用は、　ＴＲ−ＤＮ直こ
対し外来の、すなわちそこに自然界でしょ存在しない、
　　ＲＮＡ、タンパク、ポリペプチド、またはそれの一
部、できれば翻訳開始コドンを含む、をコードするＤＮ
Ａ区分を含有する遺伝子の部分を指す。

外来構造遺伝子は、全体または一部を、原核ＤＮＡ　。

真核ＤＮＡエピソ゛−ムＯＮ八へプラスミド叶八へフ゛
ラスチドｒ）ＮＡ　、　ゲノムＤＮＡ　、　ｃＤＮＡ、
　　ウィルスＤＮＡ　。

ウィルスｃＤＮＡ　、化学合成りＮＡ　、またはその他
、に由来するであろう。外来構造遺伝子は、発現産物の
生物学的活性または化学的構造１発現度、または発現制
御の様式に影響し得る。コード区分または非翻訳領域い
ずれかでの１つまたはそれ以−１−の修飾を含むかも知
れない事、かさらに考えられる。

そのような修飾には、１つまたはそれ以Ｊ−のヌクレオ
チドの変異、挿入、欠失、および置換、そして発現産物
の化学構造を変えないが発現産物の細胞内局在性、輸送
７分泌、または安定ＩＶＵ−に影響を与える゛静かな”
修飾、がある。構造遺伝子は分断されないコード配列を
構成するかも知れないし。

または適切な植物で機能するスプライス結合部により連
結された１つまたはそれ以」二のイントロンを含むかも
知れない。そしてこれらは合成または自然に存在するも
のから得られるであろう。構造遺伝子は、混成タンパク
（該混成タンパクは遺伝子がｍ−人されそして発現する
細胞に対し外来であるか、あるいは一部外来タンパクに
由来する）をコードする自然界のまたは合成の複数の起
源に由来する区分の混成物であるかも知れない。外来構
造遺伝子は融合タンパクをコードするかも知れないし、
そして特に、転写制御配列が由来するＴＲ−ＤＮＡ構造
遺伝子のすべてまたは一部と融合しているかも知れない
。

付属」勺−に上器（：植物細胞で発現する場合に。

有用なまたは同定できる表現型を運ぶＤＮＡ区分を指す
。そのような表現型は要約で外来構造遺伝子に対して示
唆されたものを含む。付属的コードＤＮＡは通常、　Ｒ
ＮＡとして発現されプロモーターと転写ターミネータ−
に隣接する。　ＤＮＡ配列を含むであろう。多くの場合
９発現したＲＮＡは翻訳可能なメツセンジャーＩＩＮＡ
であろう。ここで例証されるように、付属的コー１”Ｄ
ＮＡはトウモロコシ（セン・メイズ）種子貯蔵タンパク
（ゼイン）遺伝子である。

ｋプリコ−／−：ここでは細菌細胞１例えばアグロバク
テリウ１１．内で自発的に複製するのに充分なすべての
遺伝的要素を含む基本的複製中７位を指す。

個々のレプリコンは、それらが異なった宿主細胞種で機
能する程度に差がある。遺伝子工学でプラスミドに共通
用いられる多くのレプリコンは、エセリシア・コリー（
５旦Ｉｕ励１ａ−９四−１−０群の細菌でのみ機能があ
る。他はアグロバクテリウム（釦ｐ畑−ａガハ吋を含む
広範囲のダラム陰性細菌宿主で複製が可能である。Ｉ／
プリコンは常に複製の起点を含む。レプリコンはまた。

宿主細胞からは供給されない、特定の宿主細胞でのＤＮ
Ａ複製に必要な機能に関する遺伝子を含む。

」ｌＩし根、シュート、花粉９種子、クラウンゴールの
ような腫瘍組織、および胚芽やカルスのような培養での
植物細胞の種々の型の集合体を含む（但し、これに限ら
ないが）植物の分化および未分化組織を含む。植物組織
は植物体（如　ｐｌａｎｔａ）または器官、組織、また
は細胞培養であるかも知れない。

猜上組膳：ここでの使用は植物体（ｉｎ　　Ｕ−堕１り
の植物細胞、植物細胞、および培養プロトプラストを含
む。

狙逍織胞：ここでの使用は、生物学的な純粋培養（但し
これに限らないが）を含む培養での細菌。

および環境に分散している細菌を含む。

オクトピンＴ−ＤＮＡのオーブンリーディングフレーム
（ＯＲＦ）および境界配列の位置は数字で示されるかＲ
，Ｆ、　Ｂａｒｋｅｒ　ｅｔ　　ａｔ、　（ｉ９８３）
　Ｐｌａｎｔ　Ｍｏｌ。

Ｂｉｏ）、　２　：　３３５−３５０　、に示されてい
る。

ＴＲ−ＤＮ、ｌｌ由来サブ−Ｔｉプラスミドで形質転換
された遺伝的修飾細胞の生産、およびＴ−１１ＮＡプロ
モーター／外来構造遺伝子／Ｔ−１１ＮＡ転写ターミネ
ータ−の組合の発現は、今回の開示での特別の教示を当
該分野の種々の技術および手段と組み合わせたものであ
る。多くの例では、他の手段が全体のプロセスの各段階
に存在する。他の手段には、すブーＴｉプラスミドヘル
パーとして用いられる特別なｙ−ｉ　ｒ　−遺伝子含有
ヘルパー株、用いられる特別のＴ−ＤＮＡプロ干−ター
、外来構造遺伝子、またはＴ−ＤＮＡ転写転写ターミグ
−クーよび修飾される植物種そして望ましい再生手段が
あるが、これに限定されない；これらのすべてに当業者
がｉｌＫ択し。

望ましい結果を達成できる他のプロセス段階がある。例
えば、　ＴＲ−ＤＮＡ由来サブ−Ｔｉプラスミドを得る
出発点は、今回の適用ではｐＴｉＡ６から（ｉ′Ｌ離さ
れたＴ−ＤＮＡにより例証されているが、適当な修飾を
プロモーター領域の単離と操作手順に施す限り。

他の相同なＴｉプラスミドのＤＮＡ配列で置き換えても
よい。　（しばしば、　　ｐＴｉ１５９５５がオクトピ
ン型Ｔ−ＤＮＡ配列の他の起源として用いられる。）　
ｐＴｉＡ６に由来するもの以外のサブ−Ｔｉプラスミド
が発見され、または構築されるであろう。当業者には。

相同な遺伝子が、当該分野でよく知られているように、
相同な核酸の適当な戯密さの条件下での交叉ハイブリダ
イズ能により、または核酸またはタンパクの配列の比較
により、同定されるであろう。

今回の適用で利用されるまたは示される遺伝子配列内に
は少しの配列の変動があることはわかるであろう。これ
らの変動は標準技術により決定され。

従って、当業者はそのような相同な遺伝子のプロモータ
ー領域を操作でき使用できるであろう。新規のヘルパー
プラスミドを保持する株の二元植物形質転換系での利用
が開発されるように、当業者は望ましい結果を達成する
為に、これらの別のプロセス段階の中からｊｘ択できる
であろう。本発明の基本的観点は、　ＴＬ−ＤＮＡ由来
サブ−Ｔｉプラスミドの性質、およびプロモーター／構
造遺伝子／転写ターミネータ−の組合せまたはそのよう
な組合せの誘導体による植物細胞の形質転換へのその使
用にある。他の観点には、外来構造遺伝子の性質と構造
、および植物細胞でのプロモーター制ｆ７１構造遺伝子
発現がある。遺伝的に修飾された植物を得るための好ま
しい実施態様の残された段階には。

プロモーター／構造遺伝子／転写ターミネータ−の組合
せのＴ、１−ＤＮＡ由来ザブ−Ｔｉプラスミドへの挿入
、このザブ−Ｔｉプラスミドのアグロハクテリラム（Ａ
ＢＬ吐煕切償１畔ヘルパー細胞への移送およびそれに続
＜　ＴＲ−ＤＮＡが植物細胞ゲノムの一部として安定に
そこに組み込まれる植物細胞の形質転換ｉｎ　　ｖｉｔ
ｒｏ培養および完全植物体への事実上の再生の技術（こ
れには形質転換植物細胞の選択と検出の段階、および最
初の形質転換株から商業的に受は入れられる栽培物への
導入Ｔ−ＤＮＡの転移の段階が含まれる）、および形質
転換植物での発現のモニター、がある。

好ましい実施態様における本発明の原理的特徴は、用語
が上で定義されたように、外来構造遺伝子と結合したＴ
−ＤＮＡ由来ブロモ−クーとＴ−ＤＮＡ由来由来転写ク
ーミグ−ターするＴ−ＤＮＡ誘導体の構築である構造遺
伝子は、プロモーターと転写ターミネーターの両者に関
し、正しい位置と方向で挿入されねばならない。真核プ
ロモーターと転写ターミネータ−はＤＮＡに沿った一方
向のみで転写を促進および終結させることがわかってい
る。ＯＮへのターミネータ−領域は、転写される構造遺
伝子の“′下流”または“後に”２あるいは３゛側に”
あると言われる。同様に、プロモーターは構造遺伝子の
″上流゛、“前に”、または“５゛側に”ある。従って
９機能を果たすには、プロモーターまたはターミネータ
−の正しい位置はそれぞれ外来構造遺伝子の“上流”ま
たは“下流”になければならない。方向とは構造遺伝子
の方向性を示す。

外来タンパクのアミノ末端を最終的にコードする構造遺
伝子の部分を構造遺伝子の５゛末端と呼び。

一方そのタンパクのカルボキシル末端に近いアミノ酸を
コードする端をその構造遺伝子の３′末端と呼ぶ。外来
構造遺伝子の正しい方向では、プロモーターに近い側に
その５゛末端が、そして転写ターミネータ−に近い側に
その３“末端がある。

・その好ましい実施態様における本発明の他の原理的特
徴は、ＴＲ−ｌ３ＮＡまたは修飾ＴＲ−ＤＮＡを含むプ
ラスミドの使用にあり、そこへプロモーター／構造遺伝
子／転写ターミネータ−の組合せが挿入され、前記プラ
スミドはアグロバクテリウム（如−ｂ　ａ　ｃ　ｔ　ｅ
　ｒ　ｉ　ｍ１株内で独立に複製できるものである。

従来の技術で述べたように、そのようなプラスミドの境
界を定められたＴ−ＤＮＡは、アグロバクテリウム（何
９−匝０町刀県Σ株が、その機能がＴ−ＤＮＡの植物細
胞への転移を促進するようなあるトランスに作用する遺
伝子を含む場合６そのアグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂ
ａｃｔｅ−ｒｉｕｍ）株から植物細胞へ移ることができ
る。境界は自己相補性でない極性配列である。境界の対
は、平行な方向に存在する場合。

ずなわち同−ＤＮＡ鏡上に相同配列を持つ場合、−諸に
機能することができる。報告された境界配列の比較によ
り、共通配列 が存在し、ここで１文献で便宜上マツプされている（例
えば第２図のように）ように、５′末端と３゛末端はそ
れぞれツバリンおよびオフ）・ピンＴ−ＤＩＩＡ両者の
左端および右端に向かっている。この境界が転移機能に
充分であるか、境界に隣接する配列が形質転換効率に影
響すること、が当該分野で知られている。この境界に結
合しているＴ−ＤＮＡを含み、アグロバクテリウム（Ａ
Ｂ−ｒ−ｏ、、ｂ、ｐ倶９工ｉ−ｇＦ−＞−株で独立に
複製できるプラスミドを、ここでザブ−ＴｉグラスミＩ
−と呼ぷ。ザブ−ＴｉプラスミドはＴｉプラスミド、Ｒ
ｊプラスミド、または合成＋）Ｎへ由来の境界を持つか
も知れない。サブ−Ｔｉプラスミドはそれが含むＴ−Ｄ
ＮＡの量の差により変動が可能である。

その変動の一方の極端は、形質転換誘導プラスミドのＴ
−ＤＮＡすべてを含み、そしてこればミニ−Ｔｉプラス
ミドと呼ばれる。変動の他の極端は、　Ｔ−ＤＮＡの境
界にあるＤＮＡ以外すべてが欠失し、残った部分がザブ
−Ｔｉプラスミドを宿主へ移し９組み込ませるのに必要
最小限のものである。このようなプラスミドをここでミ
クロ＝Ｔｉと呼ぶ。ザブ−Ｔｉプラスミドは、それが小
さく、比較的容易に直接操作でき、遺伝子をシャトルヘ
クターからＴ−ＩＩＮＡへ相同組み換えムこより移す必
要がないという点で有利である。望ましい構造遺伝子を
挿入した後、それらを容易に、　Ｔ−ＤＮＡの転移を促
進するＩ・ランスに作用する柑−遺伝子を含むアグロバ
クテリウム・チューメファシエンス（卸ご戊匹劫這遅１
　前頭ｅｆａｃｉｅｎｓ）またはアグロバクテリウム・
リゾゲネス（Ａｇｒｏ−掠工切Ｃ−リ−Ｉ叫μ冴晒競）
の細胞へ、直接導入できる。アグロバクテリウム（句ド
辺り立接□はり）株への導入は、アグロバクテリウム（
釦ｒ９旦ａｃｔｅｒｉｕｍ）株の形質転換または供与細
菌細胞からの接合伝達のいずれかにより、簡単にでき、
これらの技術は当業者に熟知されている。本発明は、　
ＴＲ−ＤＮＡに基づく、ずなわら、境界ＣおよびＤを有
し、境界Ａそして恐らく境界Ｂを欠く、ザブ−Ｔｉプラ
スミドを含んでいる。

Ｔｌ１−ＤＮＡ由来サブ−Ｔｉプラスミドは、それらが
通常すべての虱遺公子を欠き、従って武装解除されてい
る点で、有利である。実施例６はそのようなザブ−Ｔｉ
プラスミド、一般的にはＴＲに基づくもの、を開示し、
そしてさらに詳細な考察を述べている。

当業者には明らかなように、プロモーター／外来構造遺
伝子／転写ターミネータ−の組合せは。

それを有するプラスミドから該組合せを除去するのに容
易な、そして選ばれた植物形質転換ヘクターまたはシャ
Ｉ−ルヘクターへの挿入に容易な、いすれかの制限部位
の間に入れられるであろう。植物形質転換ヘクター内の
組合せ挿入部位の位置は。

Ｔ−ＤＮＡ境界のすく近くの配列の転移機能が破壊され
ない限り、厳密ではない。これは、以前の文献の研究で
はこれらの領域は修飾Ｔ−ＤＮＡの植物ゲノムへの挿入
に必須であるらしいからである。また。

この組合せは、形質転換植物細胞の同定に必要ないずれ
の選択または選別マーカーの機能をも破壊してはならな
い。この組合せがそこへ挿入されるＴ−ＤＮＡは、プラ
スミドを含むいかなる形質転換からでも得られ、そして
この組合せは当業者に既知の標準技術により挿入される
。内生Ｔ−１）ＮＡまたはヘクター遺伝子の転写および
翻訳の方向に関して。

この聞合せの方向は厳密ではなく、２つの可能な方向の
いずれでも機能的である。植物での発現率の差は、ある
絹合せがＴ−ＤＮＡ内の異なった位置に挿入された場合
に、観察されるであろうし、これは多分ＤＮＡメチル化
およびクロマチン構造のような要因による。

ここで述べた方針に従い、修飾Ｔ−ＤＮＡを当該分野の
いかなる技術１例えば植物の直接感染１葉のティスフの
感染、または植物細胞とＴ−ＤＮＡ内に取り込まれた外
来構造遺伝子を含む新規アグロハクテリウＪ１（釦印埠
〕り鼾↓呵株との共存培養により。

植物細胞へ移すことができる〈従来技術の項参照）。

形質転換細胞は、それらと非形質転換細胞を区別するた
めに選択または選別されなげればならない。

選択はＴ−１１ＮＡに取り込まれた選択マーカーにより
最も容易に達せられる（従来技術の項参照）。ごこて例
証されるように、プロモーター／構造遺伝子／転写ター
ミネータ−は、形質転換植物組織の選択に適切な、ｊｚ
択ママ−カー　ＯＲＦ２４プロモーター　／ＮＰＴ２構
造遺伝子１ＯＲＦ２５またはＯＲＦ２６のポリアデニル
化部位の組合せである。当業者に周知の選択法には、特
徴的核酸配列に対する時宜的ハイブリダイゼーション、
または免疫的分析が含まれるが、これに限らない。さら
に、　Ｔ−ＤＮＡの境界間に位置するいかなる発現遺伝
子の表現型を形質転換ＭＩ織の同定に用いることができ
る。

形質転換細胞および組織の再生は既知技術の使用で達せ
られる。再生段階の目的は、それが組み込まれたＴ−Ｄ
ＮＡを保持する以外は正常に発育し増殖する完全植物体
を得ることにある。再生の技術は当該分野の原理に従い
、　Ｔ−ＤＮＡの起源、そこに施された修飾の性質、お
よび形質転換植物の種の依存し、変わる。オフＩ・ピン
型Ｔ　Ｒ−ＤＮＡに基づくザブ−Ｔ１プラスミドはすべ
ての頒（遺伝子を欠き。

完全に武装解除されており、したがって、非形質転換組
織に対し開発された手順にそのまま従った手順により再
生されるであろう形質転換組織を生しる。形質転換組織
再生手順は、−・般に非形質転換組織の再生手順の適用
辺土に余分の実験を必要としないし、主に植物組織感染
段階の結果として生した形質転換組織内のＴ　ｌｌ−Ｄ
ＮＡヘクターの存在にはよらない、変化だけであろう。

形質転換された植物組織の遺伝子型は、その細胞が一す
−！１ｔ−ｒ−ｏ−培養で成育でき、再生できるのを容
易にするため、そして用いられる選択剤に対する感受性
のため、しばしば選ばれる。農業上の対象となる栽培物
にこの操作を用いることが適当でなりれば、もっとやり
易い変種がまず形質転換される。再生後、新しく導入さ
れた外来構造遺伝子／転写ターミネータ−／ＴＲ−ＤＮ
Ａ由来ザブ−ＴｉプラスミドＴＲ−ＤＮＡの組合せが、
植物ｊ′」１屯および植物遺伝学の当業者に熟知の技術
により、望ましい農業栽培物へ容易に移される。形質転
換植物と農業栽培物との有性交雑で一代雑種ができる。

これらの雑種は望ましい遺伝的背景をもった植物と戻し
交雑できる。子孫は９組み込まれた外来ＤＮＡの持続し
た存在、または挿入外来ＤＮＡに運ばれる遺伝子の発現
による新しい表現型に対し、連続的に。

選択および／または選別される。このようにして。

多数回の戻し交雑と選択の後、挿入外来ＤＮＡ配列の付
加された農業的に好ましい親に実質的に同一の遺伝型を
有する植物を生産することができる。

（以下余白） （実施例） 以下の実施例を本発明の範囲内で、この範囲を制限する
ことなく、特定の実施態様を示す目的で述べる；この範
囲は特許請求の範囲により特定される。多数の変形が当
業者には容易に明らかであろう。

本実施例は分子生物学、および形質転換誘導プラスミド
とアグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）
の操作の当業者には熟知かつ受は入れられる多くの技術
を用いる；そのような方法はここで詳しく述べてなくて
も１つまたはそれ以上の引用文献に完全に記載されてい
る。酵素は市販のものを用い。

供給者の勧告に従うか、当該分野での既知の変形法で用
いた。試薬、緩衝液、および培養条件はまた当業者に既
知のものである。そのような標準技術を含んでいる参考
となる研究には以下のものがある：Ｒ，Ｗｕ、　ｅｄ、
　　（ｉ，９７９）　Ｍｅｔｈ、　Ｅｎｚｙｍｏ）、　
　６８゜Ｒ，Ｗｕ　１　計、、　ｅｄｓ、　（ｉ９８３
）　Ｍｅｔｈ、　Ｅｎｚｙｍｏ）、　１００ａｎｄ　１
０ｊ、　Ｌ、　Ｇｒｏｓｓｍａｎ　ａｎｄ　Ｋ、　Ｍｏ
１ｄａｖｅ、　ｅｄｓ、　（］、９８０）　Ｍｅｔｈ、
　Ｅｒ＋ｚｙｍｏ１．　６５．　Ｊ、　Ｉ）、　Ｍｉｌ
ｌｅｒ　（ｉ９７２）旦汐ｐｅｒｉｍｅｎｔｓ　ｉｎ　
Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　…知−ｐｓ、　Ｒ，Ｄａｖｉｓす
□　−倶１．　　（ｉ９８０）−Ａ戯−り笠（障且切員
−娼一り几蛙ド炎、−Ｒ，Ｆ、　５ｃｈｌｅｉｆ　ａｎ
ｄ　Ｐ、　Ｃ，Ｗｅｎｓｉｎｋ　（ｉ９８２）　、、Ｉ
’ｒ旦ｃ−１ｉ−ｃｇ−ＩＰ、　　Ｌａｔｈｅ　　ｅｔ
　　ａ）、　　（ｉ９８３）　Ｇｅｎｅｔ、　　ＥｎＨ
ｉｎ、　　４Ｉ　　：１−５６はＩＩＮＡ操作に有用な
助言を与える。

本文中で制限エンドヌクレアーゼ名を単独で使用する場
合９例えばＢｃｊ、、−Ｔ”は酵素消化でのその酵素の
使用を意味し１例外として図式中では。

それはその酵素の作用を受ける配列の部位２例えば制限
部位、を表ずことができる。本文中では。

制限部位は用語６部位”をつけることにより２例えば“
Ｂｃｊ　１部位”と示される。“断片゛という語の付加
的使用１例えば“’Ｂｃｌ　　Ｉ断片゛は呼ばれる酵素
の作用により生じた末端を有する線状二本鎖ＤＮＡ分子
を指す（例えば制限断片）。“財し■／Ｓｍａ　　Ｔ断
片”のような語は制限断片が２つの異なる酵素作用、こ
こではＱｃｌ　　ＪとＳμ］　　１．　により生し、異
なる酵素作用により生じた２つの末端があることを示す
。末端は“粘着性”　（即ち相補的な一本鎖オリゴヌク
レオチドと塩基対を形成できる一本鎖のはみ出しを有す
る）または゛平滑性゛′の性質を有すること、そして粘
着末端の特異性はそれを住しる酵素の特異性により決定
されるであろうことに注意されたい。

オクトピン型Ｔ−ＤＮＡのオープンリーディングフレー
１、（ＯＲＦ）の位置はｐＴｉ１５９５５に定義された
もので、それはＲ，Ｆ、　Ｂａｒｋｅｒ　ｅｔ　　ａ）
、　（ｉ９８３）　Ｐ）、ａｎｔＭｏ）、　Ｂｉｏ）、
　　２　：　３３５−３５０によれば、　　ｐＴｉＡ６
のものと実質的に同一のＴ−ＤＮＡを有し、そして第２
図に図式化されている。

一般に、プラスミドは、プラスミドに限るが。

前に“ｐ”を付け２例えばｐＴｉ１５９５５またはｐＵ
ｃ１３と示すが２例外はプラスミドＥ４５である。括弧
で示した菌株はその中に保持されるプラスミドを示し１
例えばアグロバクテリウム・チューメファシエンス（ｉ
ｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　　ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）
　（ｐＴｉ１５９５５）またはエセリシア・コリー（腓
ｈｅｒｊｃｌ虹ｃｏｌｉ）ＪＭ８３　（ｐＬＩｃ）、３
　）である。次の菌株は寄託されている： エセリシア・コリー（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　　ｃｏ
旦）Ｋ１２ＲＲＩ　（ｐＲＫ２９０　Ｋａｎ−１）　　
　　　　ＮＲＲＬ　Ｂ−１５７３６アグロバクテリウム
・チューメファシエンス（Ａ　ｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ
　　ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）（ｐＴｉ１５９５５）八
ＴＣＣ１５９５５ 他のプラスミドと菌株は当該分野で広く利用されており
入手しゃずい；例えばｐＵｃｌＢとｐＵｃｌＢは市販さ
れているし、　１９８４　Ｐｈａｒｍａｃｉａ　Ｍｏ１
ｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏ−１ｏｇｉｃａｌｓ　ｃａｔａｌ
ｏｇ　（Ｐｈａｒｍａｃｉａ、　Ｉｎｃ、、　８００　
ＣｅｎｔｅｎｎｉａｌＡｖｅ、、　Ｐｉｓｃａｔａｗａ
ｙ、　ＮＪ　０８８５４　ＵＳＡ）にそれぞれ２７−４
９５４−０１および２７−４９４９−０１　という記号
でリストされている。

実芙」匪 この実施例は特定の材料と方法を示す。

１．１　　土ｆ玉［窺ト≦ヂ￥ヒーイ’ｔｈ組み換えプ
ラスミドを保持するエセリシア・コリー（Ｅｓｃｈｅｒ
ｉｃｈｊａ　　ｃｏｌｔ）株を０．２％カサミノ酸を添
加したし培地で増殖させた。用いた抗生物質濃度はエセ
リシア・コリー（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　　ｃｏｌｉ
）については：アンピシリン、　５０−１００μｇ７ｍ
ｌ−：テトラサイクリ７　、１０　／Ｉ　ｇ７ｍｌ　；
カナマイシン、２０μｇ／ｍＲ；そしてアグロバクテリ
ウム・チューメファシエンス（釦皿匝旦肛ハＬ　旦匹Ｕ
旦並醇については：カルへニジリン、１００μｇ／ｍＥ
；テトラサイクリン。

５、ｃ＋ｇ＃＋１カナマイシン、１００μｇ７ｍｌ！；
リファンピシン、１０μｇ／ｍｆｆ；ゲンタマイシン、
　　１００μｇ／ｍｆｆである。

１．２　組み　えＤＮＡプラスしＬ９敗策Ｂａｍ旧断片
２　（第１図）をアグロバクテリウム・チューメファシ
エンス（ガμ再些遵ｍ国ｍ　　ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ
）プラスミドｐＴｉ８６８０６　　（Ａ２７７株で生育
）からｐＢＲ３２２に当業者に熟知の標準手順でクロー
ン化した。

すべての制限エンドヌクレアーゼ反応は、供給者（Ｂｅ
ｔｈｅｓｄａ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒ
ｉｅｓ　（ＢＲＬ）、　Ｐ、　Ｌ。

Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ、またはＮｅｗ　Ｅｎｇｌａ
ｎｄ　Ｂｉｏｌａｂｓ）の指示に従って行った。Ｔ４　
ＤＮ＾リガーゼはＢＲＬから入手した。組み換えプラス
ミドはクリアードライゼイト法（Ｄ、　Ｇ、　Ｂｌａｉ
ｒ　ｅｔ　　ａ）、　　（ｉ９７２）　Ｐｒｏｃ。

Ｎａｔ）、八ｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ　　６９　：
　２５１８−２５２２）またはアルカリ溶菌性（Ｎ、　
Ｃ，Ｂｉｒｎｂｏｉｍ　ａｎｄ　Ｊ、　Ｄｏｌｙ　（ｉ
９７９）　Ｎｕｃｌｅｉｃ、八ｃｉｄｓ　Ｒｅｓ、　７
　：　１５１３−１５２３）によりエセリシア・コリー
リー匹担狙■」↓ａ−製置）カら単離した。

１．３　ミ規交蒲 三組交雑は一般的に以下のように行った；当業者に既知
の他の変法もまた可能である。ｐｌ？に２９０とｐＲＫ
２０１３はＧ、　Ｄｉｔｔａ　ｅｔ　　ａｔ、　（ｉ９
８０）　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ。

Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＩＪＳＡ　　７７　：　７３，
１７−７３５７．およびｐＰＩ１１月はＰ、　Ｒ，旧ｒ
ｓｈ　（］９７８）　Ｔｈｅｓｉｓ、　Ｕｎｉｖ、　Ｅ
、八ｎｇｌｉａにより示されている。エセリシア・コリ
ー（Ｅ　ｓ叩服ＬＬ薊ハ　仔１１）　ＲＲＩ（ｐＲＫ２
９０に基づくシャトルベクター）またはエセリシア・コ
リー（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ典旦）　Ｋ８０２（ｐＲ
Ｋ２９０に基づくシャトルベクター）を、エセリシア・
コリー（ハリはすり中−並置）ＲＲ）、　（ｐＲＫ２０
１．３）　、および形質転換誘導プラスミドを保持する
アグロバクテリウム・チューメファシェンス（−酊廁±
９償準１　Ｉμ迂。ｃｉ耶醇のリファンピシン耐性株へ
３４８と交雑した。ｐＲＫ２０１．３をシャトルベクタ
ーを有する株に移した７１．　ｐｌ？に２０１３をアグ
ロバクテリウム（Ａ３ｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）に移す
為にｐＲＫ２９０に基づくシャトルベクターに移動させ
た。

リファンピシンと２　シャ１〜ルヘクターが耐性の薬剤
、しばしばカナマイシンまたはカルへニジリン（アンピ
シリン　アナログ）のいずれか、とを含む、エセリシア
・コリー惺銭伸旦−０±し　製置）が増殖できない最小
培地ＡＨグルコースでの成育により、　ｐＲＫ２９０に
基づくシャトルベクター配列を含むアグロバクテリウム
（へＥＬ９畑ｃｔｅｒ刊般細胞の選択ができる。エセリ
シア・コリー（ｌＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　−ｑ但）　
（ｐＰＨ）、Ｊｌ）、　２］、０４株とこれら細胞との
交雑によりｐＰＨＩＪｌをアグロバクテリウム（ＩｊＢ
ｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）−細胞へ移ず。ｐ　Ｐ　ｉｔ
　］、　Ｊ　ＩとｐＲＫ２９０に基づ（シャトルベクタ
ーは同一細胞内で長く共存できない。ゲンタマイシンと
カナマイシンでの増殖により、シャトルベクターと一回
または２回相同組み換え（それぞれ共同組み込みまたは
ホモ部分二倍体化）を行って今や望ましい構築物を有す
るＴｉプラスミドを持つ細胞を選択する。選択に用いる
抗生物質の濃度は実施例１．１に示されている。エセリ
シア・コリー（ｐｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ−ｃｏｌｔ）株
は通常０．２％カザミノ酸を添加したし培地で３７°Ｃ
で、そしてアグロバクテリウム・チューメファシェンス
（細工ｏａ　ｃ　Ｌ　ｅ　ｒ　ｒ　ｕ　ｍ馳見ρ（匹’
＞−牲１株はＹＥＰ培地で３０’ｃで増殖させた。

尖厳瞥？− この実施例は２つの転写ターミネータ−を有するＤＮＡ
断片とプロモーター／構造遺伝子　組合せの調製方法を
示す。

主は一列契をｈ肛１ 簡潔に、　Ｓ、　Ｂ、　Ｇｅ１ｖｉｎ　　ｅｔ　　ａ）
、　（ｉ９８５）　Ｍｏｌ。

Ｇｅｎ、　Ｇｅｎｅｔ、　１９９　：　２４０−２４８
により述べられたｐＲＫ２９０　Ｒａｎ−１を以下のよ
うに構築した：　ｐＲＫ２９０のＥＣ（２Ｒ１部位へ挿
入された１６，２０２と２１，６３１）位置の」並ＲＩ
部位間のｐＴｉＡ６　Ｔ−ＤＮＡ（ＥｃｏＲＩ断片１３
．第２図）を持つ組み換えＤＮＡプラスミドをＣ１ａ　
Ｔで分解し、自己再結合し、これにより１８．８９０と
２０．１２８の位置の−りＡＴ部位の間のＴ−ＤＮＡを
欠失させた。

ネオマイシンホスホトランスフェラーゼＴＩ　（ＮＰＴ
２）酵素をコードするＴｎ５カナマイシン耐性（ｋａｎ
　）構造遺伝子（Ｅ、　Ｂｅｃｋ　ｅｔ　　ａ）、　（
ｉ９８２）　Ｇｅｎｅ旦：３２７−３３６により配列決
定された）を有する１、ｋｂｐＳｍａ　　Ｉ　／欺辷ｎ
断片を、　ｐＵｃ１３（Ｊ、　Ｍｅｓｓｉｎｇ　（ｉ９
８３）Ｍｅｔｈ、　Ｅｎｚｙｍｏ）、　１０１　：　２
Ｏ−７８）のポリリンカーのＢａｍ８１部位とＳｍａ　
　１部位の間に結合させた。このｐ　Ｕ　Ｃ１３／ハＬ
組合せを次にポリリンカーのＡｃｃ　　１部位で切断し
、　Ｃｌａ　　Ｔの欠失したｐＲＫ２９０／断片１３組
合せの特異的なＣ１ａ　　Ｔ部位へ挿入し、これにより
１８．８９０と２０．１２８の位置の財し■部位間のＴ
−ＤＮＡをｐＵｃ１３／ｋａｎ組合せで置換した。この
プラスミドｐＲＫ２９０Ｋａｎ−１（第１図）は寄託菌
株ＮＲＲＬ　Ｂ−１５７３６（エセリシア・コリー（Ｅ
ｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　　ｐｏｌｉ）　Ｋ１２　ＲＲＩ
（ｐＲＫ２９０　Ｋａｎ−１））に保持されている。

ｐＲＫ２９０　Ｋａｎ−１のｋａｎ構造遺伝子はＯＲＦ
２４のプロモーターの支配下で植物細胞で、また細菌細
胞で発現する。ＯＲＦ２４　（７）転写ターミネータ−
はｐＲＫ２９０Ｋａｎ−１から欠失している。ＯＲＦ２
４構造遺伝子の両側のＴ−ＤＮＡと相同なｐＲＫ２９０
　Ｋａｎ−１は、アグロバクテリウム・チューメファシ
エンス情Ｂｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｊｕｍｅｆａｃｉｅ
ｎｓ）細胞の直接形質転換およびカルベニシリン耐性の
選択後、二重相同組み換えによるオクトピン型Ｔｉプラ
スミドへの組み込みに適当である。ホモ部分二倍体化後
、このＴ−ＤＮＡは機能するＯＲＦ２４を持たず、そし
て形質転換植物細胞はオビンのマンノピンまたはアグロ
ピンをつくらなくなる。共同組み込み後、この構築物は
細菌に対しカルへニジリン耐性を与え、そして植物細胞
てアグロピンとマンノピン合成をさせる。ｐＲＫ２９０
　Ｋａｎ−１はアグロバクテリウム・チューメファシエ
ンス（、＾−□ｔｅｒｉｕｍ　　ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎ
ｓ）　Ａ３４８（ｐＴｉＡ６）に形質転換された。植物
のホモ部分二倍体化形質転換株での植菌はオクトピン“
アグロビンーマンノピンーｋａｎｒ形質転換植物組織を
生じる。

２．２　１？に２９０　Ｋａｎ−１７藷ｄ江跋幻ルグλ
人ｐＲＫ２９０に基づくプラスミドばかなり大きり（２
０ｋｂｐ以上）、従ってしばしば糺み換えＤＮＡ操作を
行うのに困難がある。ｐ［Ｉｃ１３　レプリコンを介し
て複製するプラスミドの構築を以下に示し、第１図に系
統的に図示する。

ｐＲＫ２９０　Ｒａｎ−Ｉ　ＤＮＡをＥｃｏＲＶで完全
分解し、自己結合させ、これによりｐＲＫ２９０．１６
，２０２の」ｑｏＲＴＩ 部位と１．８，０２７のＥｃｏＲＶ部位間）Ｔ−ＤＮＡ
　、および２１，５２２のＥｃｏＲＶ部位と２１，６３
１．（７）　ＥｃｏＲ１部位間ノＴ−ＤＮＡ　ヲ欠失さ
せた。連結混合物を次にエセリシア・コリー（旦５ｃｈ
ｅｒｉｃｈｉａ　　ｃｏ旦）　Ｋ１２　ＪＭ８３　（Ｊ
、　Ｍｅｓｓｉｎｇ（ｉ９７９）　　Ｒｅｃｏｍｂ、　
　ＤＮＡ　　Ｔｅｃｋ、　　Ｂｕｌ）、２　　（２）：
　　４３−４８゜ＮＩＨＰｕｂ）、　Ｎｏ、７９−９９
）、　ｐＵｃ１３に存在するアンピシリン耐性遺伝子の
存在の選択に勧められる株、に形質転換した。プラスミ
ドをアンピシリン耐性。

テトラサイクリン感受性形質転換体から単離し。

制限酵素分析により特徴づけ、そしてｐＵｃ１３．ハ虹
。

および２　ツノＴ−ＤＮＡ　　ＥｃｏＲＶ／Ｃ１ａ　　
Ｉ断片（位？１ｉ１８，０２７から１８，８９０．およ
び２０，１２８から２１，５２２）の配列を有する。ｐ
Ｖｉｃｌと呼ぶプラスミドを含むコロニーを同定した。

叉ぶし可Ｖヘクターへ熊策 ｐＵＣ系列のプラスミド（例えばｐＵｃ１３に基づくプ
ラスミド）はエセリシア・コリー（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈ
ｉａ印丼）からアグロバクテリウム・チューメファシエ
ンス（細工０−耳ｔｅｒｉｕｍ　　ｔｕｍｅｆａｃｉｅ
ｎｓ）へｐＲＫ２０１３により接合伝達で移動すること
ができず、従って受容菌アグロバクテリウム（駐旦ｂａ
ｃｔｅｒｉｕ煎細胞へ直接形質転換されねばならない。

しかし、　　ｐＢ１１３２２に基づくプラスミドばρＲ
Ｋ２０１３により可動で。

しかしアグロバクテリウム（紅Ｄｂ　ａ　ｃ　ｔ　ｅ　
ｒ　ｉ　ｕ　ｍ　）内で複製しないので、そのようなプ
ラスミドはＯＲＦ２４プロモーター／展選択マーカーの
オクトピン型Ｔｉプラスミドへの移動に有用な自殺ベク
ターである。

ｐＶｉｃｌ　とｐＢ１１３２２のＤＮＡをそれぞれ■１
■と」ｃｏＲＴで分解し、混合し、連結し、そしてＲＲ
Ｉへ形質転換した。アンピシリン耐性形質転換体から単
離したプラスミドＤＮＡを制限地図で特徴づけ、　ｐＶ
ｉｃｌのｐＵｃ１３配列がｐＢＲ３２２で置換されたコ
ピーを持つｐＶｉｃ２と名付けたプラスミドを保持する
コロニーを同定した。ｐＶｉｃ２はＴＲへ共同組み込み
またはホモ部分二倍体化できる可動自殺ベクターである
。

ｎ貫ｌ この実施例はＴ−ＤＮＡの転写ターミネータ−とｋａｎ
構造遺伝子の３゛末端の連結を述べる。

ｐＴｉＡ６　とｐＴｉ１５９５５のＯＲＦ２５と２６の
転写ターミネーターは、　Ｂａｒｋｅｒ　　ｅｔ　　ａ
ｔ、、前出、により明らかにされたように２両方とも、
　２１，７２７と２２．４４０の位置のｌｌｌｎｃｌｌ
部位に結合したＩＩＩＮＡ区分内に位置する。この７１
３ｂｐＨｉｎｃ　Ｉｔ断断片２つの反平行遺伝子ＯＲＦ
２５とＯＲＦ２６のポリアデニル化部位を含む。このＨ
ｉｎｃＩＩ断片、または２つの反平行ポリアデニル化部
位を有する何らかのＤＮＡ分を構造遺伝子の後に置くと
、一方または他方のポリアデニル化部位が植物細胞内で
転写終結の促進に働くであろう。

この、ＨｉｎｃＴＩ断片はオクトピンｐＴｉ　ＥｃｏＲ
Ｉ断片２２の部分断片である。

ＥｃｏＲＩ断片２２のｐＢ１１３２２クローンをＨｉｎ
ｃＩＩで分解した。生じた断片を、釦り位置で線状化し
たｐＶｉｃ２ＤＮＡと混ぜ、これに平滑末端連結した。

アンピシリン耐性ＲＲＩ形質転換体を制限地図で調べ、
　ＯＲＦ２４プロモーター／庖り別合せの３゛側に約７
１３ｂｐ財匹■断片を有する。　ｐＫａｎ２と名付けた
プラスミドを保持するコロニーを同定した。ＮＰＴ２を
コードする転写物はＯＲＦ２５またはＯＲＦ２６のポリ
アデニル化部位のいずれかで終わり；どちらの転写ター
ミネークーが用いられたかの性格づけは不要であった。

反平行転写ターミネータ−を有するいくつかの別の平滑
末端ｐＴ　ｉ　１５９５５由来の断片、それらを生じる
制限酵素、およびその大きさは次の通りである： 冊ハ　　　　Ｍ−素耶１−　　　　人−ぎ−図（ｉ）回
９　／　１．０　　　　　　１切児Ｉ　　　　　　　　
　１０３４９　／　１．０　　　　　　１Ｊ−ａ　９−
　ｍ　　　　　　　　　９　］、　５９／１０　　　　
　Ｎａｅ　Ｔ　／」ｕＴ　　　　　８０７２１／２４　
　　　　　、　Ａ罰■７５５２１／２４　　　　　　　
Ｔｉリ−■９６０２５／２６　　　　　１Ｌ＋−ｑ　１
　　　　　　　　１．１６３２５／２６　　　　　Ｐｖ
ｔＵＩＩ　／　Ｓ旦１　　　　１０３６非平滑末端区分
を得ることができ、そして直接用いられるか、または当
該分野の方法で粘着末端を平滑末端に変え、用いてもよ
い；例えば１．］、１ｋｂｐ追−ｂｖｌ／す」−■断片
はｐＴｉ］５９５５　Ｔ−ＤＮＡのＯＲＦＩと３のター
ミネータ−を有する。

尖施貫−生− この実施例はＴＲのすべてを含む・す・ブーＴｉゲラス
ミドの構築を示す。Ｔ１１は形質転換細胞のホルモン独
立増殖の表現型を起こす遺伝子を持たない。

また、脹−がここで言義論されるプラスミドのいくつか
で選択マーカーとしての機能に利用できる場合、　ＯＲ
Ｆ２４を選択マーカー（例えば勿）の発現の為に用いる
必要性はなくなることに注目されたい。

一ム土」Ｗ尾炎有するＴ−叶人−ｙｌ彫製−プラスミド
Ｅ４５は、　ｐＴｉ１５９５５で位置１３．７７４から
右に伸びるオクトピンｐＴｊ−ル訓）ｉ１断片２のｐＢ
Ｒ３２２クローンである。−Ｐ、−ｐ　ｍ旧断片２はす
べてのＴ　＋、遺伝子を欠くが、ＴＲ，ＴｃおよびＴ　
ｔの右端を有し、そしてＢａｒｋｅｒ　ｇ％　　ａ）、
、前出、により定義された境界Ｂ、　　Ｃ，およびＤを
含む。ｐＢＲ３２２は、　ｐＵＣ１８は持たないが、下
に述べる操作に不便な一恥ｐ、ＲＶ部位を持っている。

Ｅ４５　ＤＮＡを」憇旧で分解後。

脱リン酸し、そして□殿枦旧で線状化したｐＨｃ１８　
ＤＮＡ（Ｊ、　　Ｎｏｒｒａｎｄｅｒ　　ｅｔ　　ａユ
、　　（ｉ９８３）Ｇｅｕｅ　　２６　　：　　ｌ０Ｌ
１０６）と混ぜ、連結した。アンピシリン耐性、テトラ
サイクリン感受性エセリシア・コリー（Ｅｓｃｈｅｒｌ
ｉ−薊圏　９■−Ｖ）形質転換体から単離したプラスミ
ドＤＮＡを制限酵素分析で選別し、そしてｐＵＣ１８の
」ザ旧部位に挿入されたオクトピンＴ−１）ＮＡ　　Ｂ
ａｍ旧断片２を有する。　ｐＵＣ１８−Ｅ４５と名付け
たプラスミドを保持するコロニーを同定した。

ｐＵｃ）、８−Ｆ、４５　ＯＮＡを−Ｅ鵠ＲＶ　”？：
分解り、　　自己連結シ。

これにより、生じた連結部にＥｃｏＲＶ部位を再生した
。連結混合物を次いでエセリシア・コリー（Ｅｓｃｈｅ
ｒｉ−軌田延）に形質転換した。アンピシリン耐性形質
転換体のプラスミドＤＮＡの制限地図作成により２位置
１８　、０２７と２２，０４１のＥＣ！：ＩＲＶ部位間
（７）Ｔ−ＤＮＡを欠失したｐｔｌｃ１８４４５　（ｄ
ｅｌ　）と名付けたプラスミドを保持するコロニーを同
定した。

土、２−−均一≠江辷礼二外−１１生ｑ堤界叫会勿鳳 ＥｃｏＲＶで分解したｐＫａｎ２　ＤＮＡをＥＣＱＲＶ
で線状化したｐＵＣ１８−Ｅ４５（ｄｅｌ）ＤＮＡ　と
混ぜ連結した。エセリシア・コリー（Ｅｓｃｈｅｒｉｃ
ｈｉ＋し　延）を形質転換後、アンピシリンとカナマイ
シンに耐性の形質転換体のプラスミドＩＩＩＮＡを制限
部位マ・ッピングにより特徴づけた。ｐＵＣ１８−ｋａ
ｎｒ　と名付けたｐＵｃ１８由来プラスミドを保持する
コロニーを同定した。ｐＵＣ１８−ｋａｎｒはｐＵＣ１
８−Ｅ４５　（ｄｅｌ　）のＥｃｏＲＴ結合部に挿入さ
れたｐＫａｎ２由来の断片を有する。このｐＫａｎ２由
来断片自身は、　ＯＲＦ２４のプロモーターを有するＣ
１ａｎ／ＥｃｏＲＶ　Ｔ−ＤＮＡ断片（位置２０，１２
８から２１，５２２）　、小さなｐＵｃ）、３由来リン
カ−配列、　Ｔｎ人山来ＮＰＴ　Ｈ構造遺伝子、および
２２，０４１（７１）　Ｅｃ＜４ＲＶ部位から２１　、
７２７または２２．４４０いずれかのｌｌｉｎｅｌＴ部
位にまたがるポリアデニル化部位を存するＴ−ＤＮＡ断
片から成る。

ｐＵＣ１８−ｋａｎｒはＣｏ１Ｅ］の複製起点を有し、
アグロバクテリウム（、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）
内では独立に維持されることができない。

４．３　ザブ−Ｔｉプラスミドの１− ｐＵＣ１８−ｋａｎｒを、　ｐＵＣ１８のポリリンカー
内とＴ−Ｉ）ＮＡの２４　、３３７の位置の」Ｐ、　１
部位で切断する。恥Ｌ■で分解し、生じた粘着末端をＴ
４　ＤＮＡポリメラーゼで除いた。得られた９、２ｋｂ
ｐの線状、平滑末端分子を市販の勿旧リンカ−と混ぜ結
合させた。

過剰のリンカ−を」竺旧分解で除去後、このｐｔｌＣ１
８−ｋａｎ”　ＤＮＡ断片をｌｊｇ−］−１’Ｊで線状
化したｐＲＸ２９０　ＤＮＡと混ぜ結合させた。アンピ
シリンとテトう′す′イノリンの両刃に耐性のエセリシ
ア・コリー（Ｅｓｑ−１］、ｅｒ　ｉ　−ｃｈｉａ　　
ｃｏ旦）形質転換体から単離したプラスミドＤＮＡの制
限酵素マツピングを行い、　ｐＲＫ２９０に挿入された
ｐＵｃ１８−ｋａｎｒ由来Ｔ−ＤＮＡを有する。　ｐＫ
ａｎ３ａと名句けたプラスミドを保持するコロニーを同
定した。ｐＫａｎ３ａは、エセリシア・コリー（Ｅｓｃ
ｈｅｒｉｃｈｉａ−−兜」ユ）とアグロバクテリウム（
展匝ゆ９工し可両者で維持され得、境界Ｂ、　　Ｃ，お
よびＤ（境界ＣとＤの間に植物で発現可能なカナマイシ
ン遺伝子がある）を持ち、そして植物発現カナマイシン
遺伝子と境界りの間に少なくとも３つの特異な制限部位
（位置２３，０３３．２２，８６５および２２．９３０
にそれぞれ−×ぜ■、−貼１ｔｌＥＩＴおよび一１ｇ１
ＴＩ）を持つ、ミクロ−Ｔｉプラスミドである。ポリリ
ンカー、即ち。

数種の異なった制限酵素により認識されろ合成ＩＩＮＡ
区分、を」二連の３つの制限部位の１つに、または境界
ＣとＤの間にある他の特異な制限部位に挿入しても良い
ことに注意されたい。有用な制限部位とは得られたｐＫ
ａｎ３ａ誘導体のどこにもないものである。

４．４　変［ｉ　Ｔ’　Ｒ茸］≦ポサブ＝Ｔ＋−グラブ
ス上ｐＫａｎ３ａばＢａｍｊｌＩ断片２（第２図）に基
づくザブ−Ｔｉプラスミドのクラスの代表例である。こ
れらのプラスミドはＴＲの両境界（ＣとＤ）に加えＴＩ
。

の右境界を含んでいるが、すべてのＴｌ−ＤＮＡ遺伝子
を欠失している。オフＩ・ピン型プラスミドｐＴｉ１５
９５５のＴｌｌを分解せず、そして機能する」匹遺公子
を欠くザブ−Ｔｉプラスミドの構築に有用であろう他の
酵素に」匣■、づ息１　（ハしの一部１匹虹。

Ｍｌｕ　　＋およびｊｊｐａＴ　　（ｏｃｓの一部）が
ある。（括弧で示したＴＩ、の構造遺伝子またはオープ
ンリーディングフレーム（Ｏ１？Ｆ）はここで述べた酵
素で生ずる断片に含まれる。）　」紅ＩＩ　（ｏｃｓ）
は通常Ｔ、−ＤＮ八を切断するが１位置１８，８９０と
２０．１２８の副ハエ部位間が欠失したＴＲ誘導体を切
断しない。当業者は、湧配列は１つのＢｇ４ＴＩ部位を
有し、そしてｐＢＲ３２２とｐＵＣ系列のプラスミドに
はＨｉｎｄＩ１１部位があることに気イ」＜であろう。

当該分野で既知のＩｎ部分分解条件をうまく用いること
が、ここで述べた選択マーカー構築に基づくサブ−Ｔｉ
プラスミドを構築する場合に必要であろう。

」旦■と」旦Ｉなどの他の酵素も、境界Ｂを含まないｐ
Ｔｉ１５９５５　Ｔ　Ｒ−ＤＮＡに基づくザブ−Ｔｉプ
ラスミドの構築に使ってもよい。特に、適当なメチル化
できる宿主１例えばエセリシア・コリー（ハ画肛Ｌｃｈ
ｉａ　　　ｃｏｌｉ）　　Ｋ２Ｏ２（Ｗ、　　Ｂ、　　
Ｗｏｏｄ　　（ｉ９６６）　　Ｊ、　　Ｍｏｌ。

Ｂｉｏ）、　１６　：　１］、８）　、で増殖する場合
、ｐＲＫ２９０　Ｋａｎ−■のホモ部分二倍体化Ｔ−Ｄ
ＮＡ誘導体、　ｐＶｉｃｌおよびｐＶｉｃ２はＴＲ内に
メチル化されていない分解可能なＣ１ａ　１部位を持た
ないが、境界Ｂを除くためｂこ当業者が用いることがで
きる境界Ｃと境界Ｂの間に２分解できるＣ１ａ　Ｉ部位
を有する。

ここで述べたサブ−Ｔｉプラスミドの大きさを縮めるた
めに、小さいベクターをｐＲＫ２９０と置換してもよい
。アグロバクテリウム（Ａ　ｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）
で維持できるプラスミドにＲ，Ｃ，Ｔａ１ｔ　ｅｔ　　
ａｌ。

（ｉ９８２）　Ｇｅｎｅ　２０　：　３９−４９．　Ｊ
、　Ｌｅｅｍａｎｓ　　叶ａｌ。

（ｉ９８２）　Ｇｅｎｅ　１９　：　３６Ｌ３６４．　
Ｊ、旧１１ｅ　ａｎｄ　Ｒ。

Ｓｃｈｉｌｐｅｒｏｏｒｔ　（ｉ９８１）　Ｐｌａｓｍ
ｉｄ　６　：　３６０−３６２およびＧ、Ｄｉｔｔａ　
ｅｔ　　ａ）、　（ｉ９８５）　Ｐｌａｓｍｉｄ　　１
３　：　１４９−１５３に述べられているものがあるが
、これに限らない。

（」シ」脱則抛辺Ｊ」１４咋括」少 ｐＫａｎ３ａを保持するアグロバクテリウム・チューメ
ファシエンス（ＡＢ−ｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　　ｔｕ
ｍｅｆａｃｉｅｎｓ）株で形質転換された植物細胞はカ
ナマイシンおよびそのアナログの効果に耐性であったが
、対照はそうでなかった。ＬＢＡ４４０４　（ｐＫａｎ
３ａ）で形質転換されたトマトのカルスは２０ｍｇ／β
のＧ４１８に耐性であった（ＬＢＡ４４０４　：　Ｇ、
　Ｏｏｍｓ　ｅｔ　　ａ）、　（ｉ９８１，）　Ｇｅｎ
ｅ１４　：　３３−５０参照）　、　Ｂｏ３４２　（ｐ
Ｋａｎ３ａ）で形質転換されたヒマコリの胚軸に由来す
るカルスは２５■／ｌの６４１８に耐性であった（Ｂｏ
！Ｍ２　：　Ｅ、　Ｅ、　Ｈｏｏｄ　　ｅｔａ）、　（
ｉ９８４）　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏ）、　２　：　７０２
−７０９参照）。ＬＢＡ４４０４　（ｐＫａｎ３ａ）で
形質転換されたタバコ茎ディスク（従来技術の項を参照
）から生じたシュートは３００■／βのカナマイシンに
耐性であったが、対照の組織は１００ｍｇ／Ｉ）のカナ
マイシンで育てた場合死滅した。

尖施開ｊ ごの実施例はトウモロコシのゼイン遺伝子のｐＫａｎ３
ａへの挿入とこの遺伝子のヒマワリ組織での発現を示す
。

１９ｋｄゼインタンパクをコードするゼイン遺伝子は既
にプラスミドｐＢｌ？３２２にクローニングされた（Ｋ
、　Ｐｅｄｅｒｓｏｎ　ｅｔ　　旦、　　（ｉ９８２）
　Ｃｅ１ｌ　２９：　１０１５−１０２６）。特異的Ｈ
ｉｎｄＩｎ制限部位がゼイン遺伝子の３゛末端のすぐ横
のｐＢＩ７３２２配列中に存在する。ｐＫａｎ３ａは財
皿■部位を持たない。」Σ（ＥＩＩで分解したｐＫａｎ
３ａＤＩＬＡの粘着末端をエセリシア・コリー（Ｅｓｃ
ｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ）　ＤＮＡポリメラーゼＴの
クレノー断片との反応により平滑末端に変える。生じた
平滑末端ＤＮＡをＵ皿■リンカ−と混ぜ連結後、それを
ｕ岨ｍで分解する。ゼイン遺伝子を含むプラスミドを酵
素１１ｉｎ４ＴＩＩで分解し、完全に線状にしたプラス
ミドを線状化した。財皿■末端をもつｐＫａｎ３ａと混
ぜ、連結する。線状ゼイン−ｐＢＲ３２２プラスミドの
ｐＫａｎ３ａへの挿入により得た組み換えプラスミドを
ｐＫａｎ３ａ−ゼインと呼ふ。ｐＫａｎ３ａ−ゼインを
エセリシア・コリー（−恥９回ル辻匡　　只３ｊ）に形
質転換し７次いでアグロバクテリウム・チューメファシ
ェンス（７ｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　　ｔｕｍｅｆａｃｉ
ｅｎｓ）−ヘルパー株２例えばＬＢＡ　４４０４に三組
交雑法により移す。ＬＢＡ４４０４　（ｐＫａｎ３ａ−
ゼイン）を植物組織９例えばヒマワリの葉ディスク、に
植える。カナマイシンまたはそのアナログを含む培地で
ある期間増殖後、形質転換植物細胞が増える。得られた
組織からＲＮＡを抽出し、ゼインｍＲＮΔの存在を当該
分野の方法２例えばＳ１ヌクレア一ゼ保護分析、により
示す。さらに、タンパクを増殖組織からまた抽出し、ゼ
インタンパクの存在を特異的分析により示す。ゼイン遺
伝子の転写と翻訳は自身の真核プロモーターの支配下に
あることに注意されたい。

（発明の概要） オクトピン型ＴｉプラスミドのＴＲ−ＤＮＡに基づくサ
ブ−Ｔｉプラスミドを開示する。植物形質転換において
ベクターと方法が有用なものとして、真核生物と原核生
物で機能する選択マーカーをまた例示した。

↓−１…ｕｌト旧位礼所 第１図は実施例２，３．および４に用いられるＤＮＡ操
作の系統的概略であり、長さは正確ではない。細い曲線
はベクター（ｐＲＫ２９０．　ｐＢＲ３２２，ｐＵｃ１
３゜およびｐＵｃ１８）配列を示す；白抜き部はＴ−Ｄ
ＮＡを表す；黒塗りの部分は転写ターミネークー区分を
示し；そして斜線部分ばＴｎ５配列を示す。制限酵素の
作用を受ける部位は以下のように示される：へＣは−Ａ
ｃｃｌＨＢａはＢａｍＨＩ　；　ＢｇはｌユＴＴ；Ｂｓ
はＢｓｔＥ］Ｉ　；Ｃ１はＣ］ａＩ；Ｅ　　ばＥｃｏＲ
Ｉ　；　）Ｉ　　はＨｉｎｄｌ［；　ｌｌｃは）Ｉｉｎ
ｃＩＩ　；Ｋ　は−９ｎｌ；Ｓ　　はＳｍａｌｉＶ　は
ＥｃｏＲＶ　；およびＸはＸｏｒ　Ｕを示す。もはや酵
素作用を受けない部位または２つの部位の組合せは酵素
名に括弧をつけて示されている。′Ｐ”はＯＲＦ２４の
プロモーターを示し；Ａ″は転写ターミネータ−（ポリ
アデニル化部位）を示し”　”　ｐ＋　ｔ　ｅ　ｔ　＋
　およびｋａｎは抗生物質耐性である；そしてＢ″、″
Ｃ”、および“Ｄ”は対応するオクトピンＴ−ＤＮＡの
境界繰り返し配列を示す；そしていずれかの方向で存在
するであろうＤＮＡ区分ば星印°′★゛′で示される。

構造遺伝子の部分と極性は矢印で示される。プラスミド
の名前はプラスミドを表す輪の中にある。“Ｅｘ”は特
定の操作を記述しである実施例を示す。

第２図はオクＩ−ピン型Ｔ−ＤＮＡのマツプである。

実施例に関連する制限部位と断片の位置のマツプは距離
尺度の下に示される。マツプの白抜き部分内の数字は特
定の制限断片を示す。真核オープンリーディングフレー
ムの位置と方向は矢印で示される。境界繰り返しの位置
は垂直の線で示される。

以上

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、以下の（Ａ）および（Ｂ）を含有するＤＮＡ分子で
   あって、 （Ａ）は植物ＤＮＡ、そして （Ｂ）は修飾Ｔ−ＤＮＡであり、 そして、 該Ｔ−ＤＮＡは該植物ＤＮＡ内に挿入され、また該Ｔ−
   ＤＮＡは以下の（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）および
   （ｅ）を含有する、ＤＮＡ分子であって、 （ａ）は付属的コードＤＮＡ、 （ｂ）は外来構造遺伝子、 （ｃ）はＴ−ＤＮＡプロモーター、 （ｄ）はＴ−ＤＮＡポリアデニル化部位、そして（ｅ）
   はオクトピン型Ｔ−ＤＮＡ境界ＣおよびＤであり、ここ
   で、 （ｆ）該プロモーターおよび該ポリアデニル化部位は異
   なるＹ−ＤＮＡ遺伝子に由来し； （ｇ）該プロモーター、該構造遺伝子および該ポリアデ
   ニル化部位は、互いに、植物細胞内での該構造遺伝子の
   転写が該プロモーターと該ポリアデニル化部位の支配下
   にあるような位置および方向にあり； （ｈ）該プロモーター／構造遺伝子／ポリアデニル化部
   位の組合せ、付属的コードＤＮＡおよび境界ＣとＤは、
   互いに、“境界Ｃ−組合せ−コードＤＮＡ−境界Ｄ”の
   配置または“境界Ｃ−コードＤＮＡ−組合せ−境界Ｄ”
   の配置のいずれかの位置にあり；（ｉ）該Ｔ−ＤＮＡは
   オクトピン型Ｔ−ＤＮＡ境界Ａを欠き；そして （ｊ）該Ｔ−ＤＮＡ分子はすべてのオクトピン型Ｔ＿Ｌ
   −ＤＮＡ￥ｏｎｃ￥遺伝子を欠く； ＤＮＡ分子。 ２、前記プロモーターがＯＲＦ２４プロモーターである
   特許請求の範囲第１項に記載のＤＮＡ分子。 ３、前記ポリアデニル化部位がＯＲＦ２５またはＯＲＦ
   ２６のポリアデニル化部位である特許請求の範囲第１項
   に記載のＤＮＡ分子。 ４、前記構造遺伝子がネオマイシンホスホトランスフェ
   ラーゼをコードする特許請求の範囲第１項に記載のＤＮ
   Ａ分子。 ５、前記ＤＮＡがｐＵＣ１８−ｋａｎ＾ｒまたはｐＫａ
   ｎ３ａのＴ−ＤＮＡ配列を含有する特許請求の範囲第４
   項に記載のＤＮＡ分子。 ６、前記ＤＮＡが植物ＤＮＡに隣接する特許請求の範囲
   第３項に記載のＤＮＡ分子。 ７、前記ＤＮＡが植物細胞、植物組織、植物体または植
   物種子に含まれている特許請求の範囲第６項に記載のＤ
   ＮＡ分子。 ８、以下の（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）お
   よび（ｆ）を含有するＤＮＡ分子であって、 （ａ）は外来構造遺伝子、 （ｂ）はＴ−ＤＮＡプロモーター、 （ｃ）はＴ−ＤＮＡポリアデニル化部位、 （ｄ）はオクトピン型Ｔ−ＤＮＡ境界ＣおよびＤ、（ｅ
   ）はアグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ
   ）内での複製を可能にするレプリコン、そして （ｆ）は付属的コードＤＮＡであり、 そして、 （ｇ）該プロモーターおよび該ポリアデニル化部位は異
   なるＴ−ＤＮＡ遺伝子に由来し； （ｈ）該プロモーター、該構造遺伝子および該ポリアデ
   ニル化部位は、互いに、植物細胞内での該構造遺伝子の
   転写が該プロモーターと該ポリアデニル化部位の支配下
   にあるような位置および方向にあり； （ｉ）該プロモーター／構造遺伝子／ポリアデニル化部
   位の組合せ、該付属的コードＤＮＡおよび境界ＣとＤは
   、互いに、“境界Ｃ−組合せ−コードＤＮＡ−境界Ｄ”
   の配置または“境界Ｃ−コードＤＮＡ−組合せ−境界Ｄ
   ”の配置のいずれかの位置にあり；（ｊ）該ＤＮＡ分子
   はオクトピン型Ｔ−ＤＮＡ境界Ａを欠き；そして （ｋ）該ＤＮＡ分子はすべてのオクトピン型Ｔ＿Ｌ−Ｄ
   ＮＡ￥ｏｎｃ￥遺伝子を欠く； ＤＮＡ分子。 ９、前記プロモーターがＯＲＦ２４プロモーターである
   特許請求の範囲第８項に記載のＤＮＡ分子。 １０、前記ポリアデニル化部位がＯＲＦ２５またはＯＲ
   Ｆ２６のポリアデニル化部位である特許請求の範囲第８
   項に記載のＤＮＡ分子。 １１、前記構造遺伝子がネオマイシンホスホトランスフ
   ェラーゼをコードする特許請求の範囲第８項に記載のＤ
   ＮＡ分子。 １２、前記ＤＮＡがｐＵＣ１８−ｋａｎ＾ｒまたはｐＫ
   ａｎ３ａに由来する特許請求の範囲第１１項に記載のＤ
   ＮＡ分子。 １３、前記ＤＮＡが細菌に含まれている特許請求の範囲
   第９項に記載のＤＮＡ分子。 １４、以下の（ａ）、（ｂ）および（ｃ）を含有するＤ
   ＮＡ分子であって、 （ａ）はネオマイシンホスホトランスフェラーゼをコー
   ドする構造遺伝子、 （ｂ）はＯＲＦ２４プロモーター、そして （ｃ）はＯＲＦ２５またはＯＲＦ２６のポリアデニル化
   部位であり、 そして、 該プロモーター、該構造遺伝子および該ポリアデニル化
   部位が、互いに、植物細胞内での該構造遺伝子の転写が
   該プロモーターと該ポリアデニル化部位の支配下にある
   ような位置および方向にあるＤＮＡ分子。 １５、前記ＤＮＡがｐＫａｎ２、ｐＵＣ１８−ｋａｎ＾
   ｒまたはｐＫａｎ３ａの前記プロモーター／構造遺伝子
   ／ポリアデニル化部位の組合せと実質的に同一である特
   許請求の範囲第１４項に記載のＤＮＡ分子。 １６、前記ＤＮＡがｐＫａｎ２、ｐＵＣ１８−ｋａｎ＾
   ｒまたはｐＫａｎ３ａである特許請求の範囲第１５項に
   記載のＤＮＡ分子。 １７、ＤＮＡ分子を修飾する方法であって、ＯＲＦ２５
   ポリアデニル化部位およびＯＲＦ２６ポリアデニル化部
   位の両方を有するＤＮＡ区分を構造遺伝子を有するＤＮ
   Ａ区分の３′末端に連結する工程を含有し、これにより
   植物細胞内で、ＯＲＦ２５ポリアデニル化部位またはＯ
   ＲＦ２６ポリアデニル化部位のいずれかにより構造遺伝
   子がコードする転写物の３′末端が決定される、ＤＮＡ
   分子を修飾する方法。 １８、前記ポリアデニル化部位を有するＤＮＡ区分が、
   位置２１、７２７と位置２２、４４０のＨｉｎｃII部位
   間のオクトピン型Ｔ−ＤＮＡ区分であるか、またはそれ
   に由来する特許請求の範囲第１７項に記載の方法。 １９、植物細胞の形質転換法であって、 以下の（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）および
   （ｆ）を含有するＤＮＡ分子を保持するアグロバクテリ
   ウム（￥Ａｇｒｏ−ｂａｃｔｅｒｉｕｍ）￥細胞に植物
   細胞を接触させる工程を含む植物細胞の形質転換法であ
   って、 （ａ）は外来構造遺伝子、 （ｂ）はＴ−ＤＮＡプロモーター、 （ｃ）はＴ−ＤＮＡポリアデニル化部位、 （ｄ）はオクトピン型Ｔ−ＤＮＡ境界ＣおよびＤ、（ｅ
   ）はアグロバクテリウム（￥Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕ
   ｍ）￥内での複製を可能にするレプリコン、そして （ｆ）は付属的コードＤＮＡであり、 そして、 （ｇ）該プロモーターおよび該ポリアデニル化部位は異
   なるＴ−ＤＮＡ遺伝子に由来し； （ｈ）該プロモーター、該構造遺伝子および該ポリアデ
   ニル化部位は、互いに、植物細胞内での該構造遺伝子の
   転写が該プロモーターと該ポリアデニル化部位の支配下
   にあるような位置および方向にあり； （ｉ）該プロモーター／構造遺伝子／ポリアデニル化部
   位の組合せ、該付属的コードＤＮＡおよび境界ＣとＤは
   、互いに、“境界Ｃ−組合せ−コードＤＮＡ−境界Ｄ”
   の配置または“境界Ｃ−コードＤＮＡ−組合せ−境界Ｄ
   ”の配置のいずれかの位置にあり；（ｊ）該ＤＮＡ分子
   はオクトピン型Ｔ−ＤＮＡ境界Ａを欠き；そして （ｋ）該ＤＮＡ分子はすべてのオクトピン型Ｔ＿Ｌ−Ｄ
   ＮＡ￥ｏｎｃ￥遺伝子を欠く； 植物細胞の形質転換法。 ２０、前記プロモーターがＯＲＦ２４プロモーターであ
   り、前記構造遺伝子がネオマイシンホスホトランスフェ
   ラーゼをコードし、そして前記ポリアデニル化部位がＯ
   ＲＦ２５ポリアデニル化部位またはＯＲＦ２６ポリアデ
   ニル化部位のいずれかである特許請求の範囲第１９項に
   記載の方法。 ２１、前記ＤＮＡがｐＵＣ１８−ｋａｎ＾ｒまたはｐＫ
   ａｎ３ａの前記プロモーター／構造遺伝子／ポリアデニ
   ル化部位の組合せと実質的に同一である特許請求の範囲
   第２０項に記載の方法。 ２２、植物細胞の形質転換法により生産される植物細胞
   、植物組織、植物体、または植物種子であって、該形質
   転換法が以下の（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ
   ）および（ｆ）を含有するＤＮＡ分子を保持するアグロ
   バクテリウム（￥Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）￥細胞
   に植物細胞を接触させる工程を含む形質転換法であり、 （ａ）は外来構造遺伝子、 （ｂ）はＴ−ＤＮＡプロモーター、 （ｃ）はＴ−ＤＮＡポリアデニル化部位、 （ｄ）はオクトピン型Ｔ−ＤＮＡ境界ＣおよびＤ、（ｅ
   ）はアグロバクテリウム（￥Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕ
   ｍ）￥内での複製を可能にするレプリコン、そして （ｆ）は付属的コードＤＮＡであり、 そして、 （ｇ）該プロモーターおよび該ポリアデニル化部位は異
   なるＴ−ＤＮＡ遺伝子に由来し； （ｈ）該プロモーター、該構造遺伝子および該ポリアデ
   ニル化部位は、互いに、植物細胞内での該構造遺伝子の
   転写が該プロモーターと該ポリアデニル化部位の支配下
   にあるような位置および方向にあり； （ｉ）該プロモーター／構造遺伝子／ポリアデニル化部
   位の組合せ、該付属的コードＤＮＡおよび境界ＣとＤは
   、互いに、“境界Ｃ−組合せ−コードＤＮＡ−境界Ｄ”
   の配置または“境界Ｃ−コードＤＮＡ−組合せ−境界Ｄ
   ”の配置のいずれかの位置にあり；（ｊ）該ＤＮＡ分子
   はオクトピン型Ｔ−ＤＮＡ境界Ａを欠き、そして （ｋ）該ＤＮＡ分子はすべてのオクトピン型Ｔ＿Ｌ−Ｄ
   ＮＡ￥ｏｎｃ￥遺伝子を欠き； これにより生産される植物細胞、植物組織、植物体、ま
   たは植物種子。