CN1245514C - 红树甜菜碱醛脱氢酶基因以及提高植物耐盐性的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了红树甜菜碱醛脱氢酶基因，其序列为序列表中SeQ ID No1和SeQ IDNo2所示的DNA碱基序列。红树甜菜碱醛脱氢酶，其蛋白质一级结构如序列表中SeQID No1所示的碱基序列编码的352个氨基酸序列或SeQ ID No2所示的碱基序列编码的178个氨基酸序列。一种适于植物细胞中表达的PBI 121载体，它包含序列表中SeQ IDNo1或SeQ ID No2序列。一种提高植物耐盐性的方法，该方法包括：1)构建植物表达载体PBI 121，它包含序列表中SeQ ID No1或SeQ ID No2序列；2)将构建的植物表达载体PBI 121导入植物细胞；获得抗盐能力提高的转基因后代，包括植物各部分组织。

Description

红树甜菜碱醛脱氢酶基因以及提高植物耐盐性的方法

技术领域

本发明涉及红树甜菜碱醛脱氢酶基因的DNA序列以及包含所说的DNA序列的表达载体，尤指将外源基因引入宿主植物，使之得到表达，从而提高植物耐盐性。

背景技术

干旱、低温、高盐等环境因素限制了植物的生长和农作物产量，为应答非生物胁迫，细胞内往往积累一些小分子有机化合物，甜菜碱就是其中之一。甜菜碱是重要的渗透调节剂之一，在自然条件下生物体内合成的甜菜碱主要有两个方面的功能：(1)调节在高盐环境和干旱而直接导致细胞内水分随蒸腾作用而丧失。(2)保护细胞膜和酶类，高浓度的甜菜碱可以保护细胞膜和稳定细胞中的生物大分子，如蛋白酶的正常生理功能。植物的甜菜碱醛脱氢酶主要存在于叶绿体基质中，另外，细胞质中也有少量的同功酶。天然状态下的酶是由两个相联的亚基组成，它们分别由核内的两个等位基因编码，甜菜碱醛脱氢酶基因(BADH)最初是从菠菜(Spinaciavleracea)cDNA文库中克隆得到，相继又从山菠菜(Afriplex horfensis)，大麦和甜菜中被克隆；它们之间大多数核苷酸序列都有60％左右的同源性，与大肠杆菌BADH编码序列也有35％左右的同源。

把目的基因导入细胞而进行的高等植物遗传转化是一个高度复杂的过程，它涉及到外源DNA的摄入和体细胞异种环境中的整合、复制、表达和传代。我们在离体条件下把与耐盐相关DNA片段与作为分子载体的质粒DNA进行新的重组，构建了新的植物表达载体，通过农杆菌中介基因感染寄主细胞，诱导植物愈伤组织生瘤并在那里表达。经过在卡那霉素培养基上分化出幼苗，再通过NaCl梯度浓度进行筛选，得到一批耐盐性很高的转基因植株，基因检测证明了外源基因已导入烟草中。

在中国发明专利(申请号：97125830.9；申请日：1997年12月25日)公开了新的山菠菜甜菜碱醛脱氢酶基因，提供了将该基因转化到宿主植物并使之在其中表达的载体。

发明内容

本发明的目的是提供了红树甜菜碱醛脱氢酶的DAN序列，而所提供的红树BADH基因的序列与前述的基因序列无任何同源关系。

本发明的第二个目的是提供了红树甜菜碱醛脱氢酶基因植物表达载体，以及含有这种载体的宿主细胞，这种宿主细胞是原核细胞或真核细胞。

本发明的第三个目的是公开一种将红树甜菜碱醛脱氢酶基因转化为植物并在其中表达，从而提高植物耐盐性的方法。

本发明的第四个目的是提供了转红树甜菜碱醛脱氢酶基因的植物，该转基因植物具有高耐盐性。其中所述基因由植物表达载体携带转化植物组织或细胞。

为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：

红树甜菜碱醛脱氢酶基因，其序列为序列表中SeQ ID No1所示的DNA碱基序列。

红树甜菜碱醛脱氢酶基因，其序列为序列表中SeQ ID No2所示的DNA碱基序列。

红树甜菜碱醛脱氢酶，其蛋白质一级结构如序列表中SeQ ID No1所示的碱基序列编码的352个氨基酸。

红树甜菜碱醛脱氢酶，其蛋白质一级结构如序列表中SeQ ID No2所示的碱基序列编码的178个氨基酸序列。

一种适于植物细胞中表达的PBI 121载体，它包含序列表中SeQ ID No1或SeQ IDNo2序列。

所述的表达载体，CaMV，35S启动子序列具有SeQ ID No1或SeQ ID No2的核苷酸序列。

一对与红树甜菜碱醛脱氢酶基因相关引物的序列：

上游：5′AGA GGA TCT TCC CAA TTC CTG CTC 3′

下游：3′TGG GGA TGG TAC AAG TCT G从TTC GAA 5′

一种提高植物耐盐性的方法，该方法包括：

1)构建植物表达载体PBI 121，它包含序列表中SeQ ID No1或SeQ ID No2序列；

2)将含RA-BADH基因的植物表达载体PBI 121导入植物细胞；获得抗盐能力提高的转基因后代，包括植物各部分组织。

本发明采用的提高植物耐盐性的方法是把基因转化到植物细胞，转化的植物细胞再生成小植株。

其中的植物为双子叶及单子叶植物，更具体地说，其中的植物为烟草类植物。其中转化过程是农杆菌介导。

并且，其中所述的转化过程包括以下步骤：

i)提取、纯化红树总DNA；

ii)设计出一对与甜菜碱醛脱氢酶基因相关引物，用红树叶片DNA为模板，扩增得到两特异片段，并克隆所述DNA片段；

其中所述与甜菜碱醛脱氢酶基因相关引物的序列为：

上游：5′AGA GGA TCT TCC CAA TTC CTG CTC 3′

下游：3′TGG GGA TGG TAC AAG TCT GAA TTC GAA 5′

iii)用双酶切出插入的DNA片段，用双酶切把插入的DNA片段切出；

iv)将回收的特异DNA片段与载体进行新的重组，构成植物表达载体，再通过电击法导入农杆菌；其中所述载体为PBI 121载体。

v)活化含有插入的外源基因的农杆菌，并将植物愈伤组织浸泡在含红树甜菜碱醛脱氢酶基因活化的农杆菌菌液中进行培养，直至在培养基上分化了幼苗，然后接种在氯化钠培养基上进行生长。

作为本发明的具体方案，根据甜菜碱醛脱氢酶基因的结构区域，应用生物软件设计一对相应的引物，以红树叶片提取的总DNA为模板，用PCR方法分别扩增得到两条(1.09kb和0.45kb)特异片段，被命名为RA-BADH1和RA-BADH2进一步将RA-BADH DNA片段克隆，并进行了序列分析，全序在GenBank网中查询与曾报道的其它BADH基因的序列存在很大差异，其结果表明，不同物种间的BADH基因的生物活性也存在差异。我们构建了RA-BADH基因的植物表达载体并通过农杆菌介导法对烟草愈伤组织进行遗传转化，获得了四株在2％NaCl培养基上生长良好的转基因植株PCR基因检测均为阳性，而对照在0.5％NaCl培养基上停滞或死亡，排除了烟草本能对环境的相对适应的关系。

1.材料：

1.1红树叶片，来自深圳红树林自然保护区

1.2烟草愈伤组织，深圳创世纪转基因技术有限公司研究中心培育

1.3农杆菌由中国科学院微生物所赐，保藏号为LBA4404

1.4化学试剂购自生工公司

具体效果：

盐生植物在受到外界胁迫的影响细胞中的叶绿体、微粒体和胞质中迅速激活起主效作用的抗逆基因，即甜菜碱醛脱氢酶基因，以合成足够量的甜菜碱调节体内的渗透压并对细胞正常代谢中的一些主要酶类起到有效保护作用。大量的试验充分证明甜菜碱醛脱氢酶基因的活性受盐诱导，在曾经报道过的山菠菜(黎科植物)等，被克隆的BADH基因导入非盐生植物后虽然也有的耐盐性的提高，但是和植物自身对环境耐受力没有明显的区别，我们把红树中的甜菜碱醛脱氢酶基因导入烟草后的试验结果表明，转基因后的植株耐盐性非常明显，这体现了红树与其它盐生植物抗击胁迫能力与BADH活性有关，根据序列分析表明，曾经报道过的不同来源的BADH基因结构序列都有相当大的一部分同源性，而来自红树的BADH基因与上述基因序列无任何同源关系。

本发明的优点是：红树BADH基因与其它盐生植物BADH基因编码区的核苷酸序列无任何同源性，其转基因烟草的耐盐性可达到1.5％-2％大大超过其它转基因植物。

附图说明

图1是Puc-T Vector质粒图。

图2是R1和R2的序列分析图。

图3是R1和R2 DNA片段与PBI 121载体导入农杆菌的序列分析图。

图4是植物表达载体图。

图5是转基因植株在无激素培养基上的生长情况。

图6是转基因植株0.5％NaCl培养基上的生长情况。

图7是在1.5％ NaCl培养基上的生长情况。

图8是在2％ NaCl培养基上的生长情况。

图9转基因植株的PCR检测。

具体实施方式

下面结合附图对实施例做进一步的说明

材料：

1.红树叶片，来自深圳红树林自然保护区

2.烟草愈伤组织，本研究中心培育。

3.农杆菌由中国科学院微生物所，微生物保藏号为LBA4404。

4.化学试剂购自生工公司

实施例1：红树总DNA提取、纯化(均按CTAB方法)

取红树叶片1g在研磨中磨成粉末状，放在1.5ml微量离心管中；加入500ul的CTAB溶液(100m mol/L Tris-HCl PH8.0，20mmol/L EDTA PH8.0，1.4mol/L NaCl，2％ CTAB)和10ul巯基乙醇，振荡混合，65℃温育30min，加等量的三氯甲烷，轻轻摇动5min，12000rpm离心15min然后将液相移到另一新的离心管中；加2倍体积乙醇沉淀DNA，离心1000rpm 10min用500ul 70％乙醇清洗DNA，室温干燥备用。

实施例2：设计出一对与BADH基因相关引物：

上游：AGA GGA TCT TCC CAA TTC CTG CTC

下游：TGG GGA TGG TAC AAG TCT GAA TTC GAA

以红树叶片DNA为模板，扩增出两条特异性DNA片段，分别克隆在Pucm-T Vector上并进行序列分析。

实施例3：测序

R1测序结果：

AGA GGA TCT TCC CAA TTC CTG CTC TAT GGA GAA TCC ATT GTG GCC ATC TCC ACT GAA

CAA GAG GAA GAT CCC AAT TCG TTT AAG GAG ACT ATA GAT GAT GTA GAC GCT GAC CAT

TGG AGG AGT GCA ATG GTT CAG AAA TGA ATT CTA TGTACA CTA ACT CTA TCT GGG ATC TTG

TAG ACA AAC CTG AGG GGG TAA AAC CTA TCG GAT GCA GGT GGG TCT ACA AGA GAA AGA

GAG GAA TAG ATG GTA AGG TTG AAA CCT TTA AAG CTA GAT TGG TTG CCA AGG GTT ACA

CCC AGC GAG AGG GCA TCG ATT ACG AAG AAA CCT TTT TGC CGG TAG CCA TGC TAA AGT

CTA TTC GGA TTC TCT TAT CCA TTG CAG CAC ATT TCG ATT ACG AGA TAT GGC AAA TGG

ATG TCA AGA CCG CTT TCC TTA ATG GAA ATC TTG ACG AAT GCA TCT ATA TGA TGC AAC

CAG ATG GTT TTA TCC AAA AGG GTC AAG AGC ATA AAG TAT GCA AAC TGA ATA GGT CTA

TTT ATG GAC TTA AAC AGG CGT CTA GGT CCT GGA ACA TCA GGT TTG ATC AAG CTG TAA

GAG ATT ATG GTT TTG ATC AAA ACC CAG ATG AGC CTT GCG TCT ATT AGA AGA TAA AAG

GAA AAA GTG TAG TTT TCC TCG TGC TAT ATG TGG ATG ACA TCC TAC TGA TTG GAA ATG

ATG TGG GGG GTG TTA ACA TTA GCG AAG AAC TGG TTG GCT CAG CAA TTT GAT ATG AGG

TCT TGG GAG AAG CAA ATT ATG TTT TGG GAA CAC AAA TCT TGC GAG ATA GGG AAA ACA

GGA TGA TTG CTT TAT CCC AAG CCT CAT ACA TTG ACG GAA TAC TGG TGA GGT TTG CTA

TGC AGA ATT CCA AGA AAG GTC AAA CAC CTT TCA GAC ATG GAA TCC ACT TGT CAC GGG

AGC AGT CTC CAA AAA CTC CTA ATG AAG TGG AGT ACA TGA AAC GGG TTC CTT ATA GCT

CTG CTC TAG GAA GTC TCA TGT ATG CTA TGC TAT GTA CTC GAC CAG ATA TTT GTT ATG

CTG TGG GGA TGG TAC AAG TCT GAA TTC GAA

R2测序结果：

AGA GGA TCT TCC CAA TTC CTG CTC CTG TCT ACT TTG TTA TTC GGT ACG GAT GCA TCA

ATG TCT GAT AAA CAA GGA GAT CGC CCT ACA CGA TCA ATT TAA TTA GGA AAA GTA ATT

AGT ACA AGT TCC TTG AAA GAG AGG CTC TAC AAT GAA AAT GTC ATT TGA CAC TGA GTT

TTT GCA ACG ACA ATA TCG TAC CTA AAA ATT AAG TTT ATA AGA CTA CAT ATC ATC TCA

AAA GAC ATG ACA TAT CCT CAC AAT CAA AAA ATG ATT ACA TCT TAC AAT TTC ATA CTA

AAA AAT TAT AAC ATA ATA TCA TAA TTA TAA ATA ATA ATA AAA GAA ACG ACA AAG CTT

ATT TGT AAT GAG GTT GTT TAA ACT ACT AAT TAG CGA TGA CAT TTA TCT CTA ATA CTA

TAT TTG TAA TTA CTT GTT GCC ATT TGT TAT CCT TTG AGG CGC TTA TTT GAT GTC TCA

AGA AAT TAA TTT CAT TAT GGA GAG ATT TAA ATG AGA ACA ACC TCC ATT TTG TGG GGA

TGG TAC AAG TCT GAA TTC GAA

R1，蛋白质一级结构

Arg Gly Trp Gln Gln Phe Leu His Tyr Gly Glu Ser Ile Val Ala Ile Gln

Ile Glu Aln Glu Glu Asp Tyr Asn Gln Phe Lys Glu Arg Ile Asp Asp Asp

Asp Ala Asp Ile Trp Gln Ser Ile Met Val Gln Asn Glu Ile His Trp Thr His Tyr

His Trp Gly Gln Leu Tyr Thr Asn Leu Gln Gly Asn Asn His Ala Asp Ile Gly Gly

Trp Ser Thr Glu Arg Glu Glu Ile Met Val Gln Leu Asn Pro Phe Lys His Asp Trp

Leu Pro Arg Val Thr Pro Lys Glu Arg Glu Ile Asp Leu Glu Glu Ser Phe Leu Pro

Val Ala Met His Lys Trp Ile Gln Ile His Tyr Pro Ile Gln His Trp Glu Trp Lys

Thr Tyr Gly Asn Trp Met Ser Thr Pro Leu Gln Phe Met Glu Gln Leu Lys Asn Ile

Thr Ile Trp Cys Asn Gln Met Val Phe Gln Asn Gln Vol Asn Ser Asn Tyr Ile Asn

Trp Ile Gly His Phe Met Asp Phe Asn Gln Arg His Gly Pro Gly Thr Ser Gly Leu

Ile Lys Leu Tyr Glu Trp Met Val Ile Asn Ser Gln Met Ser Leu Ala Trp Ile Phr

Thr Leu Asn Glu Asn Val Tyr Phe Ser Trp Cys Tyr Met Trp Met Ser Ser Tyr Cys

Leu Glu Met Met Trp Gly Val Phe Ser Phe Ala Lys Asn Trp Leu Ala Gln Arg Phe

Asp Met Arg Trp Trp Glu Lys Arg Trp Met Phe Trp Glu His Asn Trp Cys Glu Gln

Gly Asn Thr Gly Cys Leu Leu Trp Pro Asn Leu His Ser Leu Lys Glu Leu Trp Cys

Gly Leu His Cys Thr Trp Pro Arg Lys Asp Asn His Leu Ser Asp Met Glu Gln Tyr

Trp His Gly Ser Ser His Gln Asn His His Met Asn Trp Ser Thr Cys Asn Gly Phe

leu Ile Ala Leu His Tyr Glu Val Ser Cys Met His Cys Tyr Val His Asp Gln Ile

Phe Val Met Leu Trp Gly Trp Leu Lys Leu Trp Glu Phe Glu

R2，蛋白质一级结构

Arg Gly Trp Gln Gln Phe Leu His Leu Thr Thr Leu Phe Phe Gly Lys Asp

Ala Ser Met Trp Asp Asn Gln Gly Asp Arg Pro Thr Arg Ser Ile Tyr Phe Gly Asn

Val Ile Trp Ser Thr Gln Leu Asn Glu Arg His Leu Asn Glu Asn Val Trp Cys His

Trp Val Phe Ile Ser Thr Met Pro Tyr His Asn Trp Lys Phe Met Thr His Gln Gln

Gln Ser Asn Asp Met Thr Tyr Pro His Asn Arg Asn Met Trp Ser Thr Tyr Asn Phe

Arg His Asn Asn Tyr Asn Gln Glu Ser Arg Phe Arg Gln Gln Gln Asn Glu Lys Thr

Lys Leu Trp Arg Asn Glu Val Val Tyr Tyr Tyr Asn Leu Arg Cys Gln Phe Thr His

Met His Tyr Leu Asn Phe Leu Val Ala Trp Cys Tyr Pro Leu Gln Arg Phe Phe Asp

Val Trp Arg Asn Tyr Phe His Tyr Gly Glu Ile Tyr Met Arg Ser Ser Ile Leu Trp

Gly Gly Trp Tyr Asn Trp Glu Phe Glu

实施例4：构建植物表达载体，导入宿主细胞

用xbaI和sacI双酶切把插入的DNA片段切出，用玻璃奶回收R1和R2 DNA片段与PBI121载体进行新的重组，构建植物表达载体，如图4所示。

取重组植物表达载体2ul(30ng/ul)DNA与枯草芽孢杆菌LBA4404的菌液10ul混合，用加样皿注射到电击杆中，通过高压电击把DNA导入枯草芽孢杆菌细胞中，完成外源DNA直接导入受体细胞。图3是R1和R2DNA片段与PBI 121载体导入农杆菌的序列分析图。

实施例5：农杆菌的活化

挑取含外源基因插入的农杆菌单菌落于3ml YEP培养基中27℃培养到OD600≈0.9，500rpm离心5min，收集沉淀重悬在新鲜YEP中，继续培养到OD600≈0.5，然后进行植物转化和转基因植株筛选。

将烟草愈伤组织浸泡在含RA-BADH基因活化的农杆菌菌液中，十五分钟后转移到无激素组培培养基上，在暗室中连续培养三天。其中的无激素培养基包括：10％大量元素、1％微量元素、1％有机物质、1％铁盐、0.8％琼脂粉。

再移到室温光照培养，直到在卡那培养基上分化出幼芽，分离幼芽接种在含0.5％NaCl培养基上生长数天。图5是转基因植株在无激素培养基上的生长情况。而图6是在0.5％NaCl培养基上的生长情况。

幼苗生长稳定后，分别接到1.5％和2％ NaCl培养基上训化。图7是在1.5％NaCl培养基上的生长情况，图8是在2％ NaCl培养基上的生长情况。

从图片对比中可以看出，转基因植株在1％或2％ NaCl培养基上表现稳定，训化后的转基因植株具有表现极强耐盐特性，最高耐受2％接近海水灌浇水平，明显区别于对照。

提取转基因植株叶片中的DNA进行PCR分子检测，结果见图9所示，其结果与预期界定的DNA片段大小相吻合，此结果证明了外源基因被整合到烟草基因组中。

盐生植物在受到外界胁迫的影响，细胞中的叶绿体，微粒体和胞质中迅速激活起主效作用的抗逆基因，即甜菜碱醛脱氢酶基因，以合成足够量的甜菜碱调节体内的渗透压并对细胞正常代谢中的一些主要酶类起到有效保护作用。大量的试验充分证明甜菜碱醛脱氢酶基因的活性受盐诱导，在曾经报道过的山菠菜(黎科植物)等，被克隆的BADH基因导入盐生植物后虽然也有的耐盐性的提高，但是和植物自身对环境耐受力没有明显的区别，我们把红树中的甜菜碱醛脱氢酶基因导入烟草后的试验结果表明，转基因后的植株耐盐性非常明显，这体现了红树与其它盐生植物抗击胁迫能力与BADH活性有关，根据序列分析表明，曾经报道过的不同来源的BADH基因结构序列都有相当大的一部分同源性，而来自红树的BADH基因与上述基因序列无任何同源关系。

尽管本发明已作了详细的说明并引证了具体的实例，但对于本领域的普通技术人员，显然可以按照上述说明作出种种替代方案、修改和改动。因此，所有这些替代方案、修正和改动，都应该包括在权利要求的精神和范围之内。

                                  序列表

<110>刘，风华

<120>红树甜菜碱醛脱氢酶基因以及提高植物耐盐性的方法

<130>

<160>6

<170>PatentIn version 3.2

<210>1

<211>1061

<212>DNA

<213>红树属(Rhizophora L.)

<400>1

agaggatctt cccaattcct gctctatgga gaatccattg tggccatctc cactgaacaa  60

gaggaagatc ccaattcgtt taaggagact atagatgatg tagacgctga ccattggagg 120

agtgcaatgg ttcagaaaga aattctatgt acactaactc tatctgggat cttgtagaca 180

aacctgaggg ggtaaaacct atcggatgca ggtgggtcta caagagaaag agaggaatag 240

atggtaaggt tgaaaccttt aaagctagat tggttgccaa gggttacacc cagagagagg 300

gagatcgatt acgaagaaac ctttttgccg gtagccatgc taaagtctat tcggattctc 360

ttatccattg cagcacattc tgattacgag atatgacaaa tggatgtcaa gaccgctttc 420

cttaatggaa atcttgacga atgcatctat atgatgcaac cagatggttt tatccaaaag 480

gatcaagaga gtaaagtatg caaactgaat aggtctattt atggacttaa acaggcgtct 540

aggtcctgga acatcaggtt tgatcagtct gtaagagatt atggttttga tcaaaaccca 600

gatgagcctt gcgtctatta gaagataaaa ggaaaaagtg tagttttcct cgtgctatat 660

gtggatgaca tcctactgat tggaaatgat gtggggggtg ttaacattag cgaagaactg 720

gttggctcag caatttgata tgaggtcttg ggagaagcaa attatgtttt gggaacacaa 780

atcttgcgag atagggaaaa caggatgatt gctttatccc aagcctcata cattgacgga 840

atactggtga ggtttgctat ctagaacttc caagaaaggt caaacacctt tcagacatgg 900

aatccacttg tcaggtgagc agtctccaaa aactcctaat gaagtggagt acatgaaacg  960

ggttccttat agctctgctc taggaagtct catgtatgct atcttatgta ctcgaccaga 1020

tatttcttat gctgtgggga tggtacaagt ctgaattcga a                     1061

<210>2

<211>534

<212>DNA

<213>红树属(Rhizophora L.)

<400>2

agaggatctt cccaattcct gctcctgtct actttgttat tcggtacgga tgcatcaatg  60

tctgataaac aaggagatcg ccctacacga tcaatttaat taggaaaagt aattagtaca 120

agttccttga aagagaggct ctacaatgaa aatgtcattt gacactgagt ttttgcaacg 180

acaatatcgt acctaaaaat taagtttata agactacata tcatctcaaa agacatgaca 240

tatcctcaca atcaaaaaat gattacatct tacaatttca tactaaaaaa ttataacata 300

atatcataat tataaataat aataaaagaa acgacaaagc ttatttgtaa tgaggttgtt 360

taaactacta attagcgatg acatttatct ctaatactat atttgtaatt acttgttgcc 420

atttgttatc ctttgaggcg cttatttgat gtctcaagaa attaatttca ttatggagag 480

atttaaatga gaacaacctc cattttgtgg ggatggtaca agtctgaatt cgaa       534

<210>3

<211>24

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>红树甜菜碱醛脱氢酶基因相关上游引物

<400>3

agaggatctt cccaattcct gctc  24

<210>4

<211>27

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>红树甜菜碱醛脱氢酶基因相关下游引物

<400>4

tggggatggt acaagtctga attcgaa  27

<210>5

<211>352

<212>PRT

<213>红树属(Rhizophora L.)

<400>5

Arg Gly Trp Gln Gln Phe Leu His Tyr Gly Glu Ser Ile Val Ala Ile

1               5                   10                  15

Gln Ile Glu Aln Glu Glu Asp Tyr Asn Gln Phe Lys Glu Arg Ile Asp

            20                  25                  30

Asp Asp Asp Ala Asp Ile Trp Gln Ser Ile Met Val Gln Asn Glu Ile

        35                  40                  45

His Trp Thr His Tyr His Trp Gly Gln Leu Tyr Thr Asn Leu Gln Gly

    50                  55                  60

Asn Asn His Ala Asp Ile Gly Gly Trp Ser Thr Glu Arg Glu Glu Ile

65                  70                  75                  80

Met Val Gln Leu Asn Pro Phe Lys His Asp Trp Leu Pro Arg Val Thr

                85                  90                  95

Pro Lys Glu Arg Glu Ile Asp Leu Glu Glu Ser Phe Leu Pro Val Ala

            100                 105                 110

Met His Lys Trp Ile Gln Ile His Tyr Pro Ile Gln His Trp Glu Trp

        115                 120                 125

Lys Thr Tyr Gly Asn Trp Met Ser Thr Pro Leu Gln Phe Met Glu Gln

    130                 135                 140

Leu Lys Asn Ile Thr Ile Trp Cys Asn Gln Met Val Phe Gln Asn Gln

145                 150                 155                 160

Vol Asn Ser Asn Tyr Ile Asn Trp Ile Gly His Phe Met Asp Phe Asn

                165                 170                 175

Gln Arg His Gly Pro Gly Thr Ser Gly Leu Ile Lys Leu Tyr Glu Trp

            180                 185                 190

Met Val Ile Asn Ser Gln Met Ser Leu Ala Trp Ile Phr Thr Leu Asn

        195                 200                 205

Glu Asn Val Tyr Phe Ser Trp Cys Tyr Met Trp Met Ser Ser Tyr Cys

    210                 215                 220

Leu Glu Met Met Trp Gly Val Phe Ser Phe Ala Lys Asn Trp Leu Ala

225                 230                 235                 240

Gln Arg Phe Asp Met Arg Trp Trp Glu Lys Arg Trp Met Phe Trp Glu

                245                 250                 255

His Asn Trp Cys Glu Gln Gly Asn Thr Gly Cys Leu Leu Trp Pro Asn

            260                 265                 270

Leu His Ser Leu Lys Glu Leu Trp Cys Gly Leu His Cys Thr Trp Pro

        275                 280                 285

Arg Lys Asp Asn His Leu Ser Asp Met Glu Gln Tyr Trp His Gly Ser

    290                 295                 300

Ser His Gln Asn His His Met Asn Trp Ser Thr Cys Asn Gly Phe leu

305                 310                 315                 320

Ile Ala Leu His Tyr Glu Val Ser Cys Met His Cys Tyr Val His Asp

                325                 330                 335

Gln Ile Phe Val Met Leu Trp Gly Trp Leu Lys Leu Trp Glu Phe Glu

            340                 345                 350

<210>6

<211>178

<212>PRT

<213>红树属(Rhizophora L.)

<400>6

Arg Gly Trp Gln Gln Phe Leu His Leu Thr Thr Leu Phe Phe Gly Lys

1               5                   10                  15

Asp Ala Ser Met Trp Asp Asn Gln Gly Asp Arg Pro Thr Arg Ser Ile

            20                  25                  30

Tyr Phe Gly Asn Val Ile Trp Ser Thr Gln Leu Asn Glu Arg His Leu

        35                  40                  45

Asn Glu Asn Val Trp Cys His Trp Val Phe Ile Ser Thr Met Pro Tyr

    50                  55                  60

His Asn Trp Lys Phe Met Thr His Gln Gln Gln Ser Asn Asp Met Thr

65                  70                  75                  80

Tyr Pro His Asn Arg Asn Met Trp Ser Thr Tyr Asn Phe Arg His Asn

                85                  90                  95

Asn Tyr Asn Gln Glu Ser Arg Phe Arg Gln Gln Gln Asn Glu Lys Thr

            100                 105                 110

Lys Leu Trp Arg Asn Glu Val Val Tyr Tyr Tyr Asn Leu Arg Cys Gln

        115                 120                 125

Phe Thr His Met His Tyr Leu Asn Phe Leu Val Ala Trp Cys Tyr Pro

    130                 135                 140

Leu Gln Arg Phe Phe Asp Val Trp Arg Asn Tyr Phe His Tyr Gly Glu

145                 150                 155                 160

Ile Tyr Met Arg Ser Ser Ile Leu Trp Gly Gly Trp Tyr Asn Trp Glu

                165                 170                 175

Phe Glu

Claims (8)

1、红树甜菜碱醛脱氢酶基因，其序列为序列表中SeQ ID No1所示的DNA碱基序列。

2.红树甜菜碱醛脱氢酶基因，其序列为序列表中SeQ ID No2所示的DNA碱基序列。

3、红树甜菜碱醛脱氢酶，其特征在于：其蛋白质一级结构如序列表中SeQ ID No1所示的碱基序列编码的352个氨基酸。

4、红树甜菜碱醛脱氢酶，其特征在于：其蛋白质一级结构如序列表中SeQ ID No2所示的碱基序列编码的178个氨基酸。

5、一种适于植物细胞中表达的PBI 121载体，其特征在于：它包含序列表中SeQID No1或SeQ ID No2序列。

6、一对与红树甜菜碱醛脱氢酶基因相关引物的序列：

上游：5′AGA GGA TCT TCC CAA TTC CTG CTC 3′

下游：3′TGG GGA TGG TAC AAG TCT GAA TTC GAA 5′。

7、一种提高植物耐盐性的方法，该方法包括：

1)构建植物表达载体PBI 121，它包含序列表中SeQ ID No1或SeQ ID No2序列；

2)将构建的植物表达载体PBI 121导入植物细胞；获得抗盐能力提高的转基因后代，包括植物各部分组织。

8、根据权利要求7所述的方法，其特征在于：所述的植物是烟草。

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