CN101880678B - 一种红树甜菜碱醛脱氢酶基因及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及植物基因工程领域，提供了一种红树甜菜碱醛脱氢酶基因及其在耐盐、耐旱、耐低温植物新品种培育研究中的应用。红树甜菜碱醛脱氢酶基因，具有SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列。用所述红树甜菜碱醛脱氢酶基因构建原核表达载体和双元植物表达载体，分别转化大肠杆菌和烟草，对转BADH基因大肠杆菌进行高盐培养，对转BADH基因阳性烟草进行逆境胁迫实验，红树甜菜碱醛脱氢酶基因可在大肠杆菌中高效表达，且在高盐环境下，转BADH基因的大肠杆菌生长状况要好于未转BADH基因的大肠杆菌。转基因烟草鉴定结果表明所克隆的的红树甜菜碱醛脱氢酶基因能在烟草内高效表达，获得的转基因烟草具有较好的耐受一些非生物逆境胁迫的能力。

Description

一种红树甜菜碱醛脱氢酶基因及其应用

技术领域

本发明涉及植物基因工程领域，尤其涉及一种红树甜菜碱醛脱氢酶基因及其在耐盐、耐寒、耐旱转基因植物研制方面的应用。

背景技术

高盐、低温、干旱是影响植物生长和生产力最主要的非生物胁迫因子。高等植物适应环境胁迫的重要生理对策之一是渗透调节，通过在细胞中主动积累大量的小分子有机渗调物质，如多元醇类、糖类、氨基酸及其衍生物等，以维持渗透平衡和体内水分，这些物质被称为渗透调节剂。

甜菜碱是公认的在细菌、植物、动物等生物体中起着无毒渗透保护作用的最主要的细胞相溶性物质，它是一类季铵化合物，有研究表明，甜菜碱合成后几乎不再被进一步代谢，属于永久性或半永久性渗透调节剂，在植物抗盐、耐旱、耐寒研究中越来越受到重视。

植物中的甜菜碱按其结构和合成途径不同可分为4种类型，即甘氨酸甜菜碱(Glybetaine)、脯氨酸甜菜碱(Pro betaine)、羟脯氨酸甜菜碱(Hydroxyprolinebetaine)和丙氨酸甜菜碱(β-2α-betaine)。许多研究表明，甘氨酸甜菜碱的渗透保护作用通常是最强的，并且所述甘氨酸甜菜碱在多种藻类和至少10个科的种子植物中存在，因些，现有研究多以甘氨酸甜菜碱为主。

在高等植物中，甜菜碱醛脱氢酶(BADH)是合成甜菜碱的关键酶。自1981年从高等植物中分离到BADH后，有关甜菜碱合成酶分子生物学的研究很快引起了广泛关注。1987年，Arakawa等从菠菜叶中分离纯化了BADH并制备抗体。1989年，Weretilnyk等首先从菠菜中分离了BADH的mRNA，在成功实现其体外表达的基础上，证明其受盐调节。1990年，Weretilnyk等又从菠菜中首次克隆了BADH基因的cDNA，此基因全长1819bp，包括67bp的5’端非编码区，1491bp开放阅读框架和239bp的3’端非编码区。目前，菠菜和千穗谷的BADH基因全序列、水稻除5”端和3’端侧翼序列以外的全部外显子区和内含子区也已被克隆。高等植物的BADH基因在结构、表达特性及其与植物系统进化的关系方面均在一定程度上得到了研究。

发明内容

本发明的目的在于提供一种红树甜菜碱醛脱氢酶基因，其可以提高转基因植物的对盐碱、干旱和低温所造成非生物胁迫的耐受能力。

从红树中克隆一种红树甜菜碱醛脱氢酶基因，具有SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列。

本发明的第二个目的在于提供一种含有红树甜菜碱醛脱氢酶基因的原核表达载体和真核表达载体。

所述真核表达载体为植物表达载体。

用所述植物表达载体转化的植物细胞、组织或植株。

本发明的第三个目的在于提供红树甜菜碱醛脱氢酶基因在培育耐盐、耐旱、耐寒植物品种中的应用。

本发明的第四个目的在于提供一种红树甜菜碱醛脱氢酶基因编码的蛋白质序列，具有SEQ ID NO：3所示的氨基酸序列。

所述蛋白质在受体植物中的表达是本发明耐盐、耐旱、耐寒植物品种培育得以实现的关键。

本发明从红树中克隆了红树甜菜碱醛脱氢酶(BADH)基因，其基因序列和目前文献报导的耐盐类BADH基因同源性最高，其编码的蛋白质具有同类蛋白所特有的氨基酸保守序列：QLFIDGE。用红树甜菜碱醛脱氢酶基因构建原核表达载体和双元植物表达载体。红树甜菜碱醛脱氢酶基因可在大肠杆菌中高效表达，且在高盐环境下，转BADH基因的大肠杆菌生长状况要好于未转BADH基因的大肠杆菌。转基因烟草鉴定结果表明所克隆的的红树甜菜碱醛脱氢酶基因能在烟草内高效表达，获得的转基因烟草对盐胁迫、渗透胁迫和低温胁迫的耐受能力有明显改善。

附图说明

图1是红树RNA电泳检测示意图；

图2是红树BADH基因的5’Race鉴定结果示意图；

图3是红树BADH基因的3’Race鉴定结果示意图；

图4是原核表达载体EPSPS-pET30a构建流程图；

图5是红树BADH基因在大肠杆菌中表达鉴定结果示意图；

图6是对照大肠杆菌在不同NaCl浓度LB培养基中的生长状况示意图；

图7是BADH工程菌在不同NaCl浓度LB培养基中的生长状况示意图；

图8a和8b是双元植物表达载体pCAMBIA300BADH构建流程图；

图9是种子萌发测试实验结果示意图。

具体实施方式

本发明整体思路包括以下几点：从耐盐植物红树中克隆甜菜碱醛脱氢酶基因(BADH基因)，构建原核表达载体和双元植物表达载体，分别转化大肠杆菌和烟草，对转BADH基因大肠杆菌进行高盐培养，对转BADH基因阳性烟草进行逆境胁迫实验，验证BADH基因的功能。以上各点皆为单独实施例，以下将结合具体实施例做进一步详细说明。

实施例1红树甜菜碱醛脱氢酶(BADH)基因的克隆

包括以下步骤：1、提取红树总RAN，反转录制备cDNA；2、用PCR方法从红树cDNA中扩增BADH基因的表达序列标签；3、用RACE方法克隆BADH基因全长序列。以下进一步详细描述：

1、提取红树总RNA并反转录制备cDNA

1)用液氮研磨0.1g叶子加入到含有1毫升Trizol的1.5毫升离心管中。

2)室温放置5min，再加入200微升氯仿，混匀，12000g离心10min。

3)取上清加入等体积氯仿，混匀12000g离心10min。

4)再取上清加入等体积异丙醇，沉淀，12000g离心10min。

5)用75％乙醇洗涤沉淀，晾干用500ul水溶解。

6)加入等体积酚/氯仿(1∶1)混匀，室温放置5min，12000g离心10min。

7)取上清加入等体积氯仿，混匀，12000g离心5min。

8)再取上清加入等体积异丙醇，12000g离心10min。

9)用75％乙醇洗涤沉淀2次，晾干，用适量的水溶解。

10)电泳检测，并做反转录获得cDNA。

反转录步骤：

(1)在0.2ml tube中，加入下列成分：

总RNA(0.1μg/μl)        2.0μl

Oligo(dT_12-18)(2μM)     2.0μl

(2)70℃水浴10分钟。立即放置在冰浴中；

(3)加入下列成分：2.0μl 10×RT buffer；2.0μl 250μM dNTP mix；2.0μl 100mM DTT；9.8μl DEPC H₂O；0.2μl 200Uμ/l SuperScript II；

(4)进行下列反应：42℃ 90分钟；70℃ 15分钟；-20℃保存。

红树RNA电泳检测结果见图1。

2、用PCR方法从红树cDNA中扩增BADH基因的表达序列标签

1)简并引物的设计

依据Genebank上发布的已知BADH基因序列保守区设计简并引物，

P1：5’-GGRCCAAGYCKGCADCCTTCYTC-3’

P2：5’-TTcTGGACaAAYGGwCARATHTG-3’

2)红树BADH基因EST的获得

以红树cDNA为模板，用上述简并引物P1和P2进行PCR扩增，获得BADH基因的表达序列标签(EST)，其碱基序列如SEQ ID NO：2所示。

并通过genebank作序列对比发现这个EST序列与已知BADH基因同源性很高，最高达88％，确定克隆到的序列是红树BADH基因的EST序列。

3、用RACE方法克隆红树BADH基因

1)红树BADH基因的5’Race

设计并合成5’RACE引物，

GSP-RT：5′-GGGTCCGATACTTTGATG-3′

GSP1：  5′-CCGATACTTTGATGTTCTCAGAC-3′

GSP2：  5′-CTCCAAAAGTTGTGCTGCAATGCTCTC-3′

AAP：5′-GGCCACGCGTCGACTAGTACGGGIIGGGIIGGGIIG-3′

AUAP：5′-GGCCACGCGTCGACTAGTAC-3′

5’RACE方法步骤：

A.逆转录

(1)在0.5ml离心管中加入以下成分：

1μl 10μM GSP1；12.5μl(1-5μg)Total RNA；13.5μl DEPC H₂O；

(2)混匀，70℃变性5分钟，置于冰浴中至少2分钟，离心；

(3)按下表加入以下成分：

2.5μl 10×PCR buffer；2.5μl 0.1M DTT；1.25μl RNaseOUT(40U/μl)；3μl 25Mm MgCl₂；1.25μl 10mM dNTP，以上各种成分可在另一管中混匀，在45℃预热；

(4)混匀各种成分，离心，42℃温育1-2分钟；

(5)加入1μl Superscript II RT混匀，42℃ 10分钟，50℃ 1-1.5小时；

(6)70℃ 15分钟，以终止反应；

(7)离心10-20秒，37℃温育，加入1μl RNase Mix混匀，37℃ 30分钟；

(8)离心，冰浴。

B.GlassMAX纯化cDNA

(1)将binding solution平衡至室温；

(2)取100μl ddH₂O 70℃温育；

(3)将120μl binding solution(6M NaI)加入到第一链合成混合物中，混匀；

(4)将cDNA/NaI混合物转移到GlassMAX离心柱中，13000g离心20s；

(5)从管中取出柱子，将滤过液转移至另一干净离心管中，保存此管直至cDNA纯化完成，将离心柱放回原来的离心管中；

(6)将0.4ml冷1×wash buffer加入到柱子中，13000g离心20秒，弃滤过液重复3次；

(7)用0.4ml冷70％乙醇洗2次柱子；

(8)13000g离心1分钟，以彻底除去残留的乙醇；

(9)将柱子转移到另一个离心管中，加入50μl 65℃预热的ddH₂O，13000g离心20秒；

C.cDNA加尾

(1)在0.5ml离心管中加入以下成分：

5.0μl 5×tailing buffer；2.5μl 2mM dCTP；16.5μlcDNA sample；24.0μlH₂O

(2)94℃3分钟，置于冰上1分钟，离心；

(3)加入1μl TdT，混匀，37℃ 10分钟；

(4)65℃ 加热10分钟，离心，冰浴保存。

D.加尾cDNA PCR扩增

(1)在冰上，向0.2ml离心管中加入以下成分：

5μl 10×PCR buffer；3.0μl 25mM MgCl₂；1.0μl 10mM dNTP；2.0μl 10μM GSP2；2.0μl 10μM AAP；5.0μl dC-tailed cDNA；31.5μl ddH₂O；

(2)94℃变性5分钟；

(3)加入0.5μl Taq酶，混匀；

(4)循环参数：94℃ 5分钟；94℃ 30秒，55℃ 30秒，72℃ 2分钟；30个循环；72℃ 7分钟；5℃；

(5)取5-20μl电泳检测。

E.巢式PCR

(1)取5μl第一轮PCR产物加入495μl TE buffer；

(2)在冰上，向0.2μl离心管中，加入以下成分：

5μl 10×PCR buffer；3.0μl 25mM MgCl₂；1.0μl 10mM dNTP；2.0μl 10μM GSP2；2.0μl 10μM AAP；5.0μl dC-tailed cDNA；31.5μl ddH₂O；

(3)94℃ 5分钟；

(4)加入0.5μl Taq酶，混匀；

(5)循环参数：94℃ 30秒，55℃ 30秒，72℃ 2分钟30个循环；72℃ 7分钟；5℃。

利用RACE方法获得红树BADH基因5’端序列，PCR鉴定结果见图2。

2)红树BADH基因的3’Race

设计并合成3’RACE引物：

通用引物：APT18：5′-CGCTACGTAACGGCATGACAGTG(T)18-3′

AP：5′-CGCTACGTAACGGCATGACAGTG-3′

PCR扩增条件为：94℃ 5分；94℃ 30秒，52℃ 30秒，72℃ 2分钟30个循环；72℃ 7分钟；5℃。

PCR鉴定结果见图3。

3)红树BADH基因cDNA全长序列的获得

5’Race和3’Race的结果用DNAman软件拼接后获得红树BADH基因全长序列，其碱基序列如SEQ ID NO：1所示。BADH基因全长序列可用RT-PCR方法获得，引物为BADH5’：5’-CAAAACCCACTGAAGAGTCC-3’

BADH3’：5’-GTTCAGTCTGGCAGTAGAGG-3’

扩增条件为：94℃ 5分钟；94℃ 30秒 56℃ 45秒 72℃ 1分钟30循环；72度5分钟。

带有5’UTR和3’UTR序列的红树BADH基因，其碱基序列如SEQ ID NO：4所示。

在gene bank中Blast表明本申请克隆的红树BADH基因与已经克隆的一个红树BADH基因同源性为82％。

本申请所述红树BADH基因编码的甜菜碱醛脱氢酶，其氨基酸序列如SEQ ID NO：3所示。

实施例2红树BADH基因原核表达载体的构建及其在大肠杆菌中的表达

构建PET系统原核表达载体EPSPS-pET30a，具体构建流程如图4，用原核表达载体EPSPS-pET30a转化大肠杆菌DH5α，红树BADH基因在大肠杆菌DH5α中特异表达出大小为55KD的蛋白质条带，其SDS-PAGE电泳鉴定结果见图5。

由于大肠杆菌DH5α自身含有BADH基因代谢所需的底物，所以直接使用大肠杆菌DH5α初步验证BADH基因的功能。大肠杆菌DH5α在IPTG诱导表达3小时后，直接转入不同NaCl浓度(1％，3％，5％，7％)的LB培养基中，分不同时间测其OD值(菌体浓度)，监控其生长状况，结果见表1和表2。

表1：不同NaCl浓度下对照菌体生长不同时间的菌体浓度(OD值)

表2：不同NaCl浓度下转BADH基因菌体生长不同时间的菌体浓度(OD值)

由图6和图7中的生长数据可以看出随NaCl浓度的上升，菌体生长速度下降。在1％的基本NaCl浓度培养基中，转BADH基因的大肠杆菌的增长速度和对照大肠杆菌生长速度相当。在3％的NaCl浓度培养基中对比两个样品数据，BADH基因的表达明显改善了大肠杆菌的生长，使其在5.5hour培养后浓度达到接近1％NaCl浓度时的水平，而对照浓度明显低于1％的对照。在NaCl浓度为5％的培养基中，样品经过一段适应期后菌体浓度开始有所增加；而对照组却一直处于抑制生长状态。在NaCl浓度为7％的培养基中，样品和对照都出现明显的生长抑制，但是只有对照组中出现较明显的菌体死亡情况，样品组在经过一段时间生长后出现恢复生长的迹象。

实施例3红树BADH基因真核表达载体的构建

构建干旱诱导型启动子RD29A驱动BADH基因表达的双元植物表达载体pCAMBIA300BADH，参阅图8a和8b，具体构建流程：

1、Nco I和Sal I双酶切BaDH基因PCR产物和KTP-HT7-BT-PBS载体，将KTP-HT7-BT-PBS载体中的BT基因替换成BaDH基因，构建后载体命名为KTP-HT7-BADH-PBS；

2、Sal I酶切KTP-HT7-BADH-PBS后补平，再用BamH I进行酶切；将此片段插入Rd29A-TPS-Tnos-PMD载体中替换TPS片段，构建后载体命名为Rd29A-BADH-Tnos-PMD；

3、Sph I酶切载体Rd29A-BADH-Tnos-PMD后补平，再用EcoRI酶切，获得Ra29A启动子驱动BADH基因表达的植物表达盒片段，将此片段插入载体pCAMBIA2300，最终载体命名为pCAMBIA2 300BADH。

实施例4红树BADH基因在烟草中的功能鉴定

对实验室现有非转基因烟草进行NaCl浓度的筛选，利用BADH具有耐盐功能的特点，直接以NaCl为筛选物质对转基因烟草进行筛选。

用75％酒精浸泡烟草种子30s，再用0.1％升汞浸泡8min，进行表面消毒。将消过毒的烟草种子置于MS培养基(加蔗糖30g/L)上无菌发芽，制备无菌苗。取无菌苗叶片剪成5mm×5mm大小的叶盘，将非转基因的烟草叶盘转入分别含1.5％、2％、2.5％、3％NaCl的分化培养基中，以不添加NaCl的分化培养基为对照。经观察，在含2.5％NaCl条件下的烟草叶盘已大面积枯黄，NaCl浓度达3％时烟草叶盘枯死，而用含有双元植物表达载体pCAMBIA300BADH的农杆菌浸染烟草叶盘后，将烟草叶盘转入含有5％NaCl的分化培养中，15天后观察发现，叶盘有分化现象，长出新芽。以上结果表明，转红树BADH基因的烟草具有较好的耐盐性。

将转基因T1代种子和非转基因种子，在含5％NaCl的MS培养基上培养，结果见图9，A平皿中是转基因T1代种子，其中至少90％的转基因T1代种子可以萌发，B平皿中是对照非转基因种子，萌发率约为15％，表明转基因种子对盐分胁迫具有更好的耐受能力。用含有5％PEG的MS培养基、以及4℃低温处理的萌发试验也验证了转基因种子对渗透胁迫、低温胁迫也具有较好耐受能力。

            SEQUENCE LISTING

<110>创世纪转基因技术有限公司

<120>一种红树甜菜碱醛脱氢酶基因及其应用

<130>P11022

<160>4

<170>PatentIn version 3.3

<210>1

<211>1512

<212>DNA

<213>红树属(Rhizophora L.)

<400>1

atgatgtttc cggtcctgac gcggcaatta ttcatcgacg gcgagtggcg agagcccatc    60

aaagggaaac gcataccgat cgtcaaccct accaccgaag aaaccatcgg ggacattccg    120

gcggctactg ccgaagatgt tgatgtggct gtggaggctg cccgcaaggc gtttttcagg    180

aatgggggca aggattggac ttcggctact gggacttacc gggccaagta tttgagagct    240

attgctgcaa agatcaaaga aaagaagtca gagctagcaa agcttgaagc aattgattgt    300

gggaagccac tggatgaagc agcttgggat atagatgatg tttctggatg ttttgagtac    360

tttgctgatg ctgctgaaaa attagattcc aaacaaaaga gtccagtatc actgccaatg    420

gaaggattta agtctcatgt tctgagagaa cccattggtg tagttggttt aatctcacca    480

tggaactacc ctctattaat ggcaacatgg aaagttgccc ctgccttagc agcaggatgc    540

actgctatac ttaaaccgtc tgaactggct tcagtgacgt gtttggagtt gggtgaagta    600

tgtagagaag ttgggcttcc acccggtgta ctcaacattt tgtctggctt ggggccagaa    660

gctggcgccc ctttggctgc gcatcctaag gttggcaaga tagcattcac agggagtagc    720

gctaccggaa ccaaagttat gactgctgca gcccaacttg tgaaacccgt tacattggaa    780

cttggtggaa agagcccaat tgttgtgttt gaggatgttg atcttgataa agctgctgag    840

tggaccattt ttggttgctt ttggacaaat ggtcaaatat gcagtgctac ttctcgactc    900

atagttcatg agagcattgc agcacaactt ttggagaagc ttgtgaaatg gtctgagaac    960

atcaaagtat cggacccctt agaagaaggt tgcagactcg ggcctatagt cagtgcatca    1020

cagtatgaga aagtgatgaa gtacatctcg actgcgaagg aggaaggtgc caaaattgta    1080

cacgggggtg cacggccacc gcacttgaag aaaggcttct ttgttcaacc gaccattata    1140

acagatgtga agacctcaat gcaaatatgg aaagaggagg tattcggacc tgttctgtgt    1200

gttaaaacat ttgcgactga ggaagaagcc cttgagctcg caaatgacac tgtgtatggt    1260

ttggcagccg ctgtactatc tgatgatcta gaaaggtgtg atcgggtggt aaaggcactt    1320

caggtaggct gtgtctgggt caactgctcg caaccgtgtt tctgccaagc cccttgggga    1380

ggcaaaaagc gcagtggttt tgggcgcgaa cttggtgaat gggggctcga caactacttg    1440

aacataaagc aggtcacaga gtacatctcg agcgagccgt ggggttggta cactccccct    1500

tccaagccat ga                                                        1512

<210>2

<211>146

<212>DNA

<213>红树属(Rhizophora L.)

<400>2

ttctggacaa atggtcagat atgcagtgct acttctcgac tcatagttca tgagagcatt    60

gcagcacaac ttttggagaa gcttgtgaaa tggtctgaga acatcaaagt atcggacccc    120

ttagaggaag gttgccggct tggccc                                         146

<210>3

<211>503

<212>PRT

<213>红树属(Rhizophora L.)

<400>3

Met Met Phe Pro Val Leu Thr Arg Gln Leu Phe Ile Asp Gly Glu Trp

1                 5                      10                      15

Arg Glu Pro Ile Lys Gly Lys Arg Ile Pro Ile Val Asn Pro Thr Thr

              20                      25                       30

Glu Glu Thr Ile Gly Asp Ile Pro Ala Ala Thr Ala Glu Asp Val Asp

         35                       40                      45

Val Ala Val Glu Ala Ala Arg Lys Ala Phe Phe Arg Asn Gly Gly Lys

     50                      55                     60

Asp Trp Thr Ser Ala Thr Gly Thr Tyr Arg Ala Lys Tyr Leu Arg Ala

65                        70                     75                 80

Ile Ala Ala Lys Ile Lys Glu Lys Lys Ser Glu Leu Ala Lys Leu Glu

                     85                      90                  95

Ala Ile Asp Cys Gly Lys Pro Leu Asp Glu Ala Ala Trp Asp Ile Asp

              100                    105                      110

Asp Val Ser Gly Cys Phe Glu Tyr Phe Ala Asp Ala Ala Glu Lys Leu

         115                     120                    125

Asp Ser Lys Gln Lys Ser Pro Val Ser Leu Pro Met Glu Gly Phe Lys

    130                     135                     140

Ser His Val Leu Arg Glu Pro Ile Gly Val Val Gly Leu Ile Ser Pro

145                     150                     155                160

Trp Asn Tyr Pro Leu Leu Met Ala Thr Trp Lys Val Ala Pro Ala Leu

                   165                   170                    175

Ala Ala Gly Cys Thr Ala Ile Leu Lys Pro Ser Glu Leu Ala Ser Val

             180                      185                     190

Thr Cys Leu Glu Leu Gly Glu Val Cys Arg Glu Val Gly Leu Pro Pro

         195                    200                    205

Gly Val Leu Asn Ile Leu Ser Gly Leu Gly Pro Glu Ala Gly Ala Pro

    210                      215                     220

Leu Ala Ala His Pro Lys Val Gly Lys Ile Ala Phe Thr Gly Ser Ser

225                     230                     235                 240

Ala Thr Gly Thr Lys Val Met Thr Ala Ala Ala Gln Leu Val Lys Pro

                  245                     250                   255

Val Thr Leu Glu Leu Gly Gly Lys Ser Pro Ile Val Val Phe Glu Asp

             260                     265                      270

Val Asp Leu Asp Lys Ala Ala Glu Trp Thr Ile Phe Gly Cys Phe Trp

         275                    280                     285

Thr Asn Gly Gln Ile Cys Ser Ala Thr Ser Arg Leu Ile Val His Glu

    290                     295                      300

Ser Ile Ala Ala Gln Leu Leu Glu Lys Leu Val Lys Trp Ser Glu Asn

305                     310                     315                320

Ile Lys Val Ser Asp Pro Leu Glu Glu Gly Cys Arg Leu Gly Pro Ile

                    325                   330                    335

Val Ser Ala Ser Gln Tyr Glu Lys Val Met Lys Tyr Ile Ser Thr Ala

              340                     345                       350

Lys Glu Glu Gly Ala Lys Ile Val His Gly Gly Ala Arg Pro Pro His

         355                     360                      365

Leu Lys Lys Gly Phe Phe Val Gln Pro Thr Ile Ile Thr Asp Val Lys

    370                    375                       380

Thr Ser Met Gln Ile Trp Lys Glu Glu Val Phe Gly Pro Val Leu Cys

385                     390                     395                400

Val Lys Thr Phe Ala Thr Glu Glu Glu Ala Leu Glu Leu Ala Asn Asp

                  405                     410                   415

Thr Val Tyr Gly Leu Ala Ala Ala Val Leu Ser Asp Asp Leu Glu Arg

              420                     425                    430

Cys Asp Arg Val Val Lys Ala Leu Gln Val Gly Cys Val Trp Val Asn

        435                     440                     445

Cys Ser Gln Pro Cys Phe Cys Gln Ala Pro Trp Gly Gly Lys Lys Arg

    450                    455                     460

Ser Gly Phe Gly Arg Glu Leu Gly Glu Trp Gly Leu Asp Asn Tyr Leu

465                    470                    475                480

Asn Ile Lys Gln Val Thr Glu Tyr Ile Ser Ser Glu Pro Trp Gly Trp

                   485                      490                 495

Tyr Thr Pro Pro Ser Lys Pro

           500

<210>4

<211>1762

<212>DNA

<213>红树属(Rhizophora L.)

<400>4

acaaaaccca ctgaagagtc cagaggccgt tgctgtagtg ggtttggttg agtgggtcag     60

tgagcgacgc agctatgatg tttccggtcc tgacgcggca attattcatc gacggcgagt    120

ggcgagagcc catcaaaggg aaacgcatac cgatcgtcaa ccctaccacc gaagaaacca    180

tcggggacat tccggcggct actgccgaag atgttgatgt ggctgtggag gctgcccgca    240

aggcgttttt caggaatggg ggcaaggatt ggacttcggc tactgggact taccgggcca    300

agtatttgag agctattgct gcaaagatca aagaaaagaa gtcagagcta gcaaagcttg    360

aagcaattga ttgtgggaag ccactggatg aagcagcttg ggatatagat gatgtttctg    420

gatgttttga gtactttgct gatgctgctg aaaaattaga ttccaaacaa aagagtccag    480

tatcactgcc aatggaagga tttaagtctc atgttctgag agaacccatt ggtgtagttg    540

gtttaatctc accatggaac taccctctat taatggcaac atggaaagtt gcccctgcct    600

tagcagcagg atgcactgct atacttaaac cgtctgaact ggcttcagtg acgtgtttgg    660

agttgggtga agtatgtaga gaagttgggc ttccacccgg tgtactcaac attttgtctg    720

gcttggggcc agaagctggc gcccctttgg ctgcgcatcc taaggttggc aagatagcat    780

tcacagggag tagcgctacc ggaaccaaag ttatgactgc tgcagcccaa cttgtgaaac    840

ccgttacatt ggaacttggt ggaaagagcc caattgttgt gtttgaggat gttgatcttg    900

ataaagctgc tgagtggacc atttttggtt gcttttggac aaatggtcaa atatgcagtg    960

ctacttctcg actcatagtt catgagagca ttgcagcaca acttttggag aagcttgtga    1020

aatggtctga gaacatcaaa gtatcggacc ccttagaaga aggttgcaga ctcgggccta    1080

tagtcagtgc atcacagtat gagaaagtga tgaagtacat ctcgactgcg aaggaggaag    1140

gtgccaaaat tgtacacggg ggtgcacggc caccgcactt gaagaaaggc ttctttgttc    1200

aaccgaccat tataacagat gtgaagacct caatgcaaat atggaaagag gaggtattcg    1260

gacctgttct gtgtgttaaa acatttgcga ctgaggaaga agcccttgag ctcgcaaatg    1320

acactgtgta tggtttggca gccgctgtac tatctgatga tctagaaagg tgtgatcggg    1380

tggtaaaggc acttcaggta ggctgtgtct gggtcaactg ctcgcaaccg tgtttctgcc    1440

aagccccttg gggaggcaaa aagcgcagtg gttttgggcg cgaacttggt gaatgggggc    1500

tcgacaacta cttgaacata aagcaggtca cagagtacat ctcgagcgag ccgtggggtt    1560

ggtacactcc cccttccaag ccatgaactt cctccggagg ctagctccca tgaatgtctg    1620

aagttttggg gggatatggc aattgtgtgc tatatgttgt gctttgtttt ggttatcaaa    1680

caatttcctc tactgccaga ctgaactctg aacagaatat tccgaataag agtcaattct    1740

gttgccaaaa aaaaaaaaaa aa                                             1762

Claims (6)

1.一种红树甜菜碱醛脱氢酶基因，其特征在于：所述基因是SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列。

2.含有权利要求1所述红树甜菜碱醛脱氢酶基因的原核表达载体。

3.含有权利要求1所述红树甜菜碱醛脱氢酶基因的真核表达载体。

4.根据权利要求3所述的含有红树甜菜碱醛脱氢酶基因的真核表达载体，其特征在于：所述真核表达载体为植物表达载体。

5.权利要求4所述植物表达载体在培育耐盐植物品种中的应用。

6.权利要求1所述红树甜菜碱醛脱氢酶基因编码的蛋白质序列，其特征在于：所述蛋白质是SEQ ID NO：3所示的氨基酸序列。

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