CN1280415C - 小麦抗病基因Lr－L1及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及植物基因工程技术领域，特别是涉及一种小麦抗病基因Lr-L1及其应用。本发明小麦抗病基因Lr-L1全长cDNA为2326bp，包括135bp的5′-非编码区，249bp的3′-非编码区，1911bp的编码区，终止子，和28bp的多聚腺苷酸尾，3′-非编码区包含3个典型的加尾信号序列，可强化基因转录后的加尾过程。本发明小麦抗病基因Lr-L1可以插入到不同类型的启动子下游，构建成植物表达载体，通过基因工程技术进行植物抗病改良，也可将该基因的克隆用于小麦基因芯片制作，应用于小麦抗病等研究中。

Description

小麦抗病基因Lr-L1及其应用

一.技术领域：本发明涉及植物基因工程技术领域，特别是涉及一种小麦抗病基因Lr-L1及其应用。

二.背景技术：

植物转基因研究源于80年代初期，1983年Zambryski获得了世界上第一例转基因植株，1985年Horch创造了农杆菌转化中的叶盘法，自此以后，分别建立了农杆菌介导法、病毒介导法、PEG介导法、电激穿孔法、显微注射法、花粉管通道法、超声波法、基因枪法等，转基因成功的物种不断扩大，涉及50多个物种共110多种植物，其中，农杆菌介导法获得的转基因植物占转基因植物总数的85％以上，基因枪法获得的转基因植物占10％左右，双子叶植物是农杆菌的天然寄主，利用农杆菌Ti质粒介导法已经建立了多种双子叶植物的基因转移体系，并将一些优良外源基因转入了双子叶植物，育成了转基因品种，但是利用农杆菌介导法对单子叶植物进行基因转化的工作进展相对较慢。

小麦是最主要的粮食作物之一，但其基因工程的研究进程已落后于其它作物，小麦转基因研究开始于80年代初期。1992年Vasil等利用基因枪介导法获得了世界上第一例小麦转基因植株，1994年曾君祉、成卓敏等利用花粉管通道法分别获得了小麦转基因植株。在以后的几年内，小麦转基因研究基本上借助于基因枪介导法。据统计，到目前为止获得小麦转基因的报道中，基因枪法占90％左右，其它方法仅占10％上下，原因在于基因枪介导法的方法比较成熟，农杆菌介导法还比较困难。但是，与基因枪介导法相比，农杆菌介导法具有操作简单、成本低、转化效率高、重复性好、可以导入大片段DNA等优点，且导入的基因一般为单拷贝整合，不至于发生基因沉默现象，然而，小麦农杆菌介导的基因转移一直是世界上的一道难题，虽然Hess、Mooney等曾先后做过尝试，但未能获得转基因植株。随着基因分离技术和克隆手段的提高，今后将有更多与小麦改良有关的重要基因被克隆出来，同时小麦生产中的一些实际问题，如蚜虫、赤霉病、白粉病、锈病、全蚀病、纹枯病、土传病毒病、干旱、盐碱等问题相继出来，而基因工程育种可能是最好的解决途径。

植物在生长的过程中，受到许多病原物的侵害，植物病原物的种类繁多，包括病毒、细菌、霉菌和线虫等。病原物侵入植物导致两种结果：1.病原物成功的在寄主植物内繁殖，引起相关的病症；2.寄主植物产生防卫反应，杀死病原物或阻止其生长。病害是小麦生产的主要障碍，小麦的大多数病害属于真菌性病害，将外源抗真菌基因导入小麦是防治小麦病害的途径之一，一般常用农杆菌介导法对小麦进行基因转化。专利申请号为03109435.X，发明名称为《一种用农杆菌介导对小麦进行基因转化的方法》中公开了一种用农杆菌介导对小麦进行基因转化的方法，它是将小麦愈伤组织与含有Ti质粒载体的农杆菌共培养，将质粒载体上的外源基因转移到受体基因组中，但在转化前要用含有乙磺酸、赖氨酸、章鱼碱、谷氨酰胺、乙酰丁香酮、葡萄糖、麦芽糖等的培养液进行重悬。目前在世界范围内，对小麦抗病基因的分离、克隆以及抗病反应的研究相对来说比较少。

三.发明内容：

本发明的目的是：克服目前小麦抗病基因存在的不足，提供一种新的小麦抗病基因Lr-L1以及该基因的应用。

本发明的技术方案是：

一种小麦抗病基因Lr-L1的全长cDNA序列，核苷酸序列碱基组成为：

672a    534c    535g    585t

1    acgcggggaa ttgaaacact ctcctcgtcc tcagaggcct aactatcaat agagcatgac

61   tctgactgcg tacctactcg ccactccact tcttcttcct ctgtgctcac catcttggta

121  caacagtaca gaaagatgag taaattactt gccatagcac tgctgctgct gcatcttatc

181  aaccacaaaa tcaacatggc aacggcatgg gatgatcaag atttcttcaa atactgccca

241  ccatcccact gcagccaaca tggcccagag atcaggtatc ctttctgcct tgaatccaac

301  aatacatcat catgtggatg tagtgggaaa tcaatcagga agatagcatg ctctggccaa

361  gacaccattc tagtccaccc agttctttgc ccatacagtg tcagcgccat agattacaag

421  cgttcttcca tgaagatcac cccacttgta gacccctgtt tggtactcca gcagaagctc

481  gccatctcca gaagctcgtc atctccacag gttgatgtta tcaacgatga gaagccaagt

541  cttgacagat atttattttg gagttctaca atttccctag tacgctgttc aagagagttt

601  gcacctggtg cagccgatgg gattgctggc ccagtctcct gccttagcaa cataacccac

661  ttcttttatt tggtgaatgg ttatgaagac atgtctattc ttccgttgga ctgcaaggtc

721  gtcccaccct cagatggtgt cggtggcggt cagataacca tgtatatgtt tgacgaccca

781  atgtcagaca cgctctcact gtccttcaag gaacgcacag aaagaatcct cggttttgct

841  gagacgacag tgtattggta taattactat tgcaaaggat gtgaacgcag tgggggacgc

901  tgcgcgttca gctcacaaag ggatagaaaa ttctgcatgc ccggcccaca tggttcacgt

961  atcaaagtca ttgcagctac atcatcagtg gccgcatttg tggttctttt gttaacggtg

1021 gccactgtgc tttatctttc actcaagaca agatataatg cagagataca tttgaaggtt

1081 gaaatgttcc tcaagacata tggcacatcg aaacccacaa ggtacacttt ctctgaagtt

1141 aagaagatgg caagacggtt taaggaaaaa gtagggcagg gaggatttgg gagcgtatac

1201 aaaggtgagc tgccaaatgg agtgcccgtg gcagtcaaga tgctagagaa ctctacagga

1261 gagggagaag cattcatcaa tgaagttgca accatcggac ttatccatca tgccaatatt

1321 gtccgcctcc tgggattctg ctctgaagga atgaggcggg ctcttattta tgaattcatg

1381 cctaatgagt cactggagaa atacatattc tctgacgact ctaatatttt tcagaatctt

1441 ctagtaccag ataaactgct agatattgct ttaggcatcg cccgaggtat ggagtacttg

1501 catcaagggt gcaaccagcg catcctccac tttgacatca agcctcacaa tatcctgctg

1561 gactacaact tcaatccaaa gatctcagac tttggccttg caaagctgtg cgcaagggac

1621 caaagcatcg tgaccttaac agcagcaaga ggcacaatgg gctacattgc accagagcta

1681 tactcccgga actttggggg agtatcgtac aagtcagacg tgtacagttt cgggatgctg

1741 gtgctagaaa tggtgagcgg gaggaggaat tcaggcccaa gaatcgggag ccaggacgat

1801 gtttacctcc ctgagtggat ctacgagaaa gtggtcaatg gggaggactt ggcgcttact

1861 ttggaaacga ctgaagaaga taaagaaaag gtgaggaagc tggctatggt ggcactgtgg

1921 tgtatccagt ggaacccaag aaaccggccg tcgatgacaa aggtcgtgaa catgctaact

1981 gggaggcttc agagtctgca gatgccacca aagccttatg tctcatccga gaatgaactt

2041 atgccataaa ttaaagcatg tcgcacggac taccatactc tgtcaggttg tactttgtcc

2101 acgcgtgcgc tgcaaataat agcaaccact gtgtttcgac gctttcagtc agtcaattag

2161 gtctgaagat gtatgaataa tcaccggaca ctagcagcat gtaatagtgt cactagttgt

2221 ttgcaagata ctggtgcttc catatttatg tccaaaaact tgcaatagag ctgtgtaaaa

2281 taaaataata atctgtcgaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaa

小麦抗病基因Lr-L1编码的蛋白，其氨基酸序列为：

1    MSKLLAIALL LLHLINHKIN MATAWDDQDF FKYCPPSHCS QHGPEIRYPF CLESNNTSSC

61   GCSGKSIRKI ACSGQDTILV HPVLCPYSVS AIDYKRSSMK ITPLVDPCLV LQQKLAISRS

121  SSSPQVDVIN DEKPSLDRYL FWSSTISLVR CSREFAPGAA DGIAGPVSCL SVITHFFYLV

181  NGYEDMSILP LDCKVVPPSD GVGGGQITMY MFDDPMSDTL SLSFKERTER ILGFAETTVY

241  WYNYYCKGCE RSGGRCAFSS QRDRKFCMPG PHGSRIKVIA ATSSVAAFVV LLLTVATVLY

301  LSLKTRYNAE IHLKVEMFLK TYGTSKPTRY TFSEVKKMAR RFKEKVGQGG FGSVYKGELP

361  NGVPVAVKML ENSTGEGEAF INEVATIGLI HHANIVRLLG FCSEGMRRAL IYEFMPNESL

421  EKYIFSDDSN IFQNLLVPDK LLDIALGIAR GMEYLHQGCN QRILHFDIKP HNILLDYNFN

481  PKISDFGLAK LCARDQSIVT LTAARGTMGY IAPELYSRNF GGVSYKSDVY SFGMLVLEMV

541  SGRRNSGPRI GSQDDVYLPE WIYEKVVNGE DLALTLETTE EDKEKVRKLA MVALWCIQWN

601  PRNRPSMTKV VNMLTGRLQS LQMPPKPYVS SENELMP。

小麦抗病基因Lr-L1编码的蛋白是一种类受体蛋白激酶，包括N-端信号肽、细胞外结构域、中部跨膜结构域、高荷电序列和C-端蛋白激酶结构域。

小麦抗病基因Lr-L1在转基因抗病育种中的应用。

小麦抗病基因Lr-L1在小麦基因芯片制作中的应用。

小麦抗病基因Lr-L1在合成新的抗病基因中的应用。

本发明的积极有益效果是：

1.转基因抗病育种：本发明的小麦抗病相关基因Lr-L1可以插入到不同类型的启动子下游，构建成植物表达载体，通过基因工程技术进行植物抗病改良。启动子可以是组成型表达的启动子，如花椰菜花叶病毒35S启动子、玉米泛素启动子Ubi等。连接在组成型表达启动子下游的基因将在转基因植物的任何组织和任何发育时期表达；启动子也可以是病原菌诱导表达的启动子、或组织特异性表达的启动子。连接在这些启动子下的基因仅在病原菌存在时、或在特定组织中表达，使该基因的表达受到更精确的控制。

2.设计合成新抗病基因：将小麦抗病基因Lr-L1与LRK10、YRK1抗病蛋白激酶比较可知，这些蛋白的羧基端蛋白激酶功能域高度保守，而在氨基端的细胞外结构域有较大差异。因此，与人类的免疫球蛋白相似，氨基端的细胞外结构域变化决定基因抗病的特异性。通过定点突变、或基因序列重组等技术，可以人工合成很多具有新的抗病特性的基因，通过基因工程技术应用于植物抗病改良中。

3.基因芯片制作：可将该小麦抗病基因Lr-L1的克隆用于小麦基因芯片制作，应用于小麦抗病等研究中。根据Lr-L1基因cDNA序列设计PCR引物，在含本基因的克隆中扩增Lr-L1基因的全长cDNA，或扩增编码细胞外结构域的基因特异性强的区段，进行基因芯片的制作。

4.Lr-L1基因在抗白粉病反应中的表达：Lr-L1基因在小麦叶片中特异性表达，在幼茎和幼穗中仅有很微量的表达，在根部不表达。在受到小麦白粉病菌的攻击时，表达显著增强，增强幅度可达5倍以上，如图1所示，Lr-L1的表达谱变化证明了其在小麦抗白粉病反应中起重要作用。

5.本发明的小麦抗病基因Lr-L1所编码蛋白的特点为：该基因编码一个类受体蛋白激酶(RLK)，这一类受体蛋白激酶包括N-端信号肽、细胞外结构域、中部跨膜结构域和C-端蛋白激酶结构域等几个部分，其结构与已经克隆的小麦抗叶绣病蛋白激酶LRK10(Feuillet等1997；GanBank查询号：gi|1680686|gb|AAC49629.1|)和小麦抗条绣病蛋白激酶YRK1(GanBank查询号：gi|34809101|gb|AAQ82627.1|)高度相似，从分子结构上说明本发明的小麦抗病基因Lr-L1具有抗病性。

四.附图说明：

图1为通过定量RT-PCR技术分析Lr-L1基因在小麦抗白粉病反应中的表达变化，图上M为分子量标准，0、1、12、24等数字为小麦白粉病菌接种诱导时间；Actin为小麦肌动蛋白基因，rRNA为核糖体RNA，均为稳定表达基因，作为基因表达变化的对照。结果可见，Lr-L1基因在白粉病菌接种后表达显著增强，白粉病菌接种后24小时基因的表达量达到未接种时的大约5倍。

五.具体实施方式：

实施例一：小麦抗病基因Lr-L1的克隆过程：

小麦Lr-L1基因是从对白粉病、锈病抗性程度很高的小麦抗病新品系“99-2439”中分离的。以白粉病菌诱导后22小时的叶片为材料提取总RNA(核糖核酸)，再进一步分离mRNA(信使核糖核酸)，通过反转录将mRNA转录为cDNA(互补脱氧核糖核酸)，用该cDNA为模板进行基因克隆。根据植物蛋白激酶保守的第VI  功能域设计了一个兼并性引物(序列为：5′-GTGAGGCTT(G/A)A(T/C)(G/A)TC(A/G)AA(G/A)T(G/A)GAG(G/A)ATGCG-3′)，通过快速扩增cDNA末端技术(5′-RACE)，获得了很多产物，其中一个约1500bp的扩增产物经回收，克隆于pGEM-T Eseay载体上，测序后通过序列分析证明这个cDNA片段是类受体蛋白激酶基因的一部分。

使用专门的试剂盒(SMARTTM RACE cDNA Amplification Kit)进行扩增。溶液配制按说明书进行。扩增程序为5个循环的94℃变性15秒，72℃退火和延伸3分钟；25个循环的94℃变性15秒，68℃退火30秒，72℃延伸3分钟；最后在72℃延伸7分钟。扩增产物在1％的琼脂糖凝胶上电泳分离。将含有目的DNA片段的琼脂糖凝胶切割下来，用液氮反复冻融回收，等体积氯仿抽提纯化，2倍体积的酒精沉淀。回收的DNA片段用超纯水溶解后，用T4-DNA连接酶将其与pGEM-T Eseay载体连接，4℃连接过夜。用CaCl₂热击法，在42℃热击90秒，将连接产物转化到大肠杆菌DH10B菌株中。用质粒小量提取法提取质粒DNA。在大连宝生物公司用ABI377自动测序仪测序。测序结果用BLASTt和BLASTp计算机辅助程序(Altschul等1997)在美国国家生物信息中心网站NCBI( http://www.ncbi.nlm.nih.gov)和相关的连网站点进行同源序列查询比较。在NCBI网站用Marchler-Bauer等(2003)的方法进行保守功能域数据分析。在此基础上，又设计了一条基因特异性引物(序列为：5′-ACCTACTCGCCACTCCACTTCTTCTTCCTC-3′)，通过快速扩增cDNA末端技术(3′-RACE)获得了全长cDNA克隆。该基因插入在pGEM-T Esay载体上，并保存在大肠杆菌DH10B菌株中。

在GenBank中进行相似性查询比较，证明所克隆的全长cDNA为新的小麦基因，命名为小麦抗病基因Lr-L1。该基因的前1551bp部分已经作为小麦新基因在GenBank中登录，编号为： AY584533。

小麦抗病基因Lr-L1的结构与已经克隆的小麦抗叶绣病蛋白激酶LRK10(Feuillet等1997；GanBank查询号： gi|1680686|gb|AAC49629.1|)和小麦抗条绣病蛋白激酶YRK1(GanBank查询号： gi|34809101|gb|AAQ82627.1|)高度相似，其比较结果如下：

(1)Lr-L1类受体蛋白激酶与小麦抗叶锈蛋白激酶(LRK10)的比较：

Lr-L1：1    MSKLLAIALLLLHLINHKINMATAWDDQDFFKYCPPSHCSQHGPEIRYPFCLESNNTSS- 59

            MSKLL IALLLL LINH I +ATAWDDQDFFKYCPPS CSQHGP IRYP CLES+NTSS

LRK10：1    MSKLLVIALLLLPLINHGIYLATAWDDQDFFKYCPPSKCSQHGPMIRYPLCLESSNTSSS 60

Lr-L1：60   --CGCSGKSIRKIACSGQDTILVHPVLCPYSVSAIDYKRSSMKITPLVDPCLVLQQKLAI 117

              CGC+G+SI K+ACSGQDTILVHPVL PYSVSAIDY+RSSMKITPLVDPCLVLQQKL I

LRK10：61   SSCGCAGRSIWKLACSGQDTILVHPVLGPYSVSAIDYRRSSMKITPLVDPCLVLQQKLII 120

Lr-L1：118  SRSSSSPQVDVINDEKPSLDRYLFWSSTISLVRCSREFAPGAA--DGIAGPVSCLSNITH 175

            SRSSSSPQVDVINDEKPS D   F SS+ ++V CSREF P AA  D IAGPVSCLSN TH

LRK10：121  SRSSSSPQVDVINDEKPSFDENFFESSSATIVHCSREFTPAAAHADSIAGPVSCLSNTTH 180

Lr-L1：176  FFYLVNGYEDMSILPLDCKVVPPSDGVGGGQITMYMFDDPMSDTLSLSFKERTERILGFA 235

            FFYLVN  EDMSILPLDCKVVP SD   GG    +M  D M      +F E  ++I  FA

LRK10：181  FFYLVNSDEDMSILPLDCKVVPVSDR--GGISLPHMLKDQMF----YNFTETAKKIPSFA 234

Lr-L1：236  ETTVYWYNYYCKGCERSGGRCAFSSQRDRKFCMPGPHGSRIKVIAATSSVAAFVVLLLTV 295

            ET V W    C+ CE SG RCAFSSQRDR+FCMP PHGS IKVIAATSSVAAFV LLLTV

LRK10：235  ETAVSWDEGDCRECELSGRRCAFSSQRDREFCMPDPHGSHIKVIAATSSVAAFVALLLTV 294

Lr-L1：296  ATVLYLSLKTRYNAEIHLKVEMFLKTYGTSKPTRYTFSEVKKMARRFKEKVGQGGFGSVY 355

            ATVLYLSLKTRYNAEIH+KVEMFLKTYGTSKPTRYTFSEVKKMARRFKEKVGQGGFGSVY

LRK10：295  ATVLYLSLKTRYNAEIHMKVEMFLKTYGTSKPTRYTFSEVKKMARRFKEKVGQGGFGSVY 354

Lr-L1：356  KGELPNGVPVAVKMLENSTGEGEAFINEVATIGLIHHANIVRLLGFCSEGMRRALIYEFM 415

            KGELPNGVPVAVKMLENSTGEGE+FINEVATIGLIHHANIVRLLGFCSEGMRRALIYEFM

LRK10：355  KGELPNGVPVAVKMLENSTGEGESFINEVATIGLIHHANIVRLLGFCSEGMRRALIYEFM 414

Lr-L1：416  PNESLEKYIFSDDSNIFQNLLVPDKLLDIALGIARGMEYLHQGCNQRILHFDIKPHNILL 475

            PNESLEKYIFSDDSNIFQNLLVP+KLLDIALGIARGMEYLHQGCNQRILHFDIKPHNILL

LRK10：415  PNESLEKYIFSDDSNIFQNLLVPEKLLDIALGIARGMEYLHQGCNQRILHFDIKPHNILL 474

Lr-L1：476  DYNFNPKISDFGLAKLCARDQSIVTLTAARGTMGYIAPELYSRNFGGVSYKSDVYSFGML 535

            DYNFNPKISDFGLAKLCARDQSIVTLTAARGTMGYIAPELYSRNFGGVSYK+DVYSFGML

LRK10：475  DYNFNPKISDFGLAKLCARDQSIVTLTAARGTMGYIAPELYSRNFGGVSYKADVYSFGML 534

Lr-L1：536  VLEMVSGRRNSGPRIGSQDDVYLPEWIYEKVVNGEDLALTLETTEEDKEKVRKLAMVALW 595

            VLEMVSGRRNS PRIGSQDDVYLPEWIYEKV+NGE+LALTLETT+E+K+KVR+LAMVALW

LRK10：535  VLEMVSGRRNSDPRIGSQDDVYLPEWIYEKVINGEELALTLETTQEEKDKVRQLAMVALW 594

Lr-L1：596  CIQWNPRNRPSMTKVVNMLTGRLQSLQMPPKPYVSSENELM 636

            CIQWNPRNRPSMTKVVNMLTGRLQSLQMPPKP+VSSENELM

LRK10：595  CIQWNPRNRPSMTKVVNMLTGRLQSLQMPPKPFVSSENELM 635

(2)Lr-L1类受体蛋白激酶与小麦抗条锈蛋白激酶YRK1的比较

Lr-L1：1    MSKLLAIALLLLHLINHKINMATAWDDQDFFKYCPPSHCSQHGPEIRYPFCLESNNTSSC 60

            MSKLL IALLLL LINH I +ATAWDDQDFFKYCPPS+CSQHGPE+R+PFCLES+NTS+

YRK 1：1    MSKLLVIALLLLPLINHGIYLATAWDDQDFFKYCPPSNCSQHGPEVRFPFCLESSNTSAV 60

Lr-L1：61   GCSGKS----------IRKIACSGQDTILVHPVLCPYSVSAIDYKRSSMKITPLVDPCLV 110

              +  +          I K+AC GQDTILVHPVL  YSVSAIDY+RSS+K+ PLVDPCL+

YRK1：61    AAAAAASCGCSSTDGLIWKLACFGQDTILVHPVLGSYSVSAIDYRRSSVKLIPLVDPCLM 120

Lr-L1：111  LQQKLAISRSSSSPQVDVIND-EKPSLDRYLFWSSTISLVRCSREFAPGA--ADGIAGPV 167

            LQQKLAISR  SS QVDVI+  + P     +      +LV CS EF P A  AD IAGPV

YRK1：121   LQQKLAISRRWSSRQVDVIDGMQLPDRQFSILSYKYATLVCCSSEFTPAAVDADSIAGPV 180

Lr-L1：168  SCLSNITHFFYLVNGYEDMSILPLDCKVVPPSDGVGGGQITMYMFDDPMSDT-LSLSFKE 226

            SCLSN T F YLV  Y+DMSILPLDCKV P SDGV G  I MYM +DPMS T  SLSFKE

YRK1：181   SCLSNTTLFLYLVAAYKDMSILPLDCKVFPVSDGVSGRLIPMYMLEDPMSGTPFSLSFKE 240

Lr-L1：227  RTERILGFAETTVYWYNYYCKGCERSGGRCAFSSQRDRKFCMPGPHGSRIKVIAATSSVA 286

            R ER+L FAETTVYW+   C+ CE SG RCAFSSQRD  FC+P PHGSRIKVIAATSSVA

YRK1：241   RAERMLSFAETTVYWFGGNCRQCELSGQRCAFSSQRDETFCIPDPHGSRIKVIAATSSVA 300

Lr-L1：287  AFVVLLLTVATVLYLSLKTRYNAEIHLKVEMFLKTYGTSKPTRYTFSEVKKMARRFKEKV 346

            AFVVLL+TVATVLY SLKTRYNAEIHLKVEMFLKTYGTSKPTRYTFSEVKKMARRFKEKV

YRK1：301   AFVVLLVTVATVLYPSLKTRYNAEIHLKVEMFLKTYGTSKPTRYTFSEVKKMARRFKEKV 360

Lr-L1：347  GQGGFGSVYKGELPNGVPVAVKMLENSTGEGEAFINEVATIGLIHHANIVRLLGFCSEGM 406

            GQGGFGSVYKGEL NGVPVAVKMLENSTGEGEAFINEVATIGLI+HANIV+LLGFCSEGM

YRK1：361   GQGGFGSVYKGELQNGVPVAVKMLENSTGEGEAFINEVATIGLIYHANIVQLLGFCSEGM 420

Lr-L1：407  RRALIYEFMPNESLEKYIFSDDSNIFQNLLVPDKLLDIALGIARGMEYLHQGCNQRILHF 466

            RRALIYEFMPNESLEKYIFS DS  FQ+LLVPDKLLDIALGIARGMEYLHQGCNQRILHF

YRK1：421   RRALIYEFMPNESLEKYIFSRDSANFQHLLVPDKLLDIALGIARGMEYLHQGCNQRILHF 480

Lr-L1：467  DIKPHNILLDYNFNPKISDFGLAKLCARDQSIVTLTAARGTMGYIAPELYSRNFGGVSYK 526

            DIKPHNILLDYNFNPKISDFGLAKLCARDQSIVTLTAARG MGYIAPELYSRNFGGVSYK

YRK1：481   DIKPHNILLDYNFNPKISDFGLAKLCARDQSIVTLTAARGKMGYIAPELYSRNFGGVSYK 540

Lr-L1：527  SDVYSFGMLVLEMVSGRRNSGPRIGSQDDVYLPEWIYEKVVNGEDLALTLETTEEDKEKV 586

            SDVYSFGMLVLEMVSGRRNS PRIGSQDDVYLPEWIYEKV+NGE+LALTLETT+E+K+KV

YRK1：541   SDVYSFGMLVLEMVSGRRNSDPRIGSQDDVYLPEWIYEKVINGEELALTLETTQEEKDKV 600

Lr-L1：587  RKLAMVALWCIQWNPRNRPSMTKVVNMLTGRLQSLQMPPKPYVSSENELMP 637

             +LAMVALWCIQWNPRNRPSMTKVVNMLTGRLQSLQMPPKP+VS ENE MP

YRK1：601   SQLAMVALWCIQWNPRNRPSMTKVVNMLTGRLQSLQMPPKPFVSYENEPMP 651

以上的比较结果可以从分子结构上说明本发明的小麦抗病基因Lr-L1具有抗病性。

实施例二：转基因抗病育种：

将Lr-L1基因从pGEM-T easy载体上酶切下来，或用高保真Taq-DNA聚合酶和基因特异性引物扩增下来。用T4-DNA连接酶将Lr-L1连接在玉米泛素高效启动子Ubi(Ubiquitin-1)的下游，再插入到pCAMBIA-Bar植物表达载体中，从而构建成pCAMBIA-Ubi-Lr-L1表达载体质粒。将该表达载体转化到大肠杆菌DH10B菌株中繁殖，提取该载体的质粒，即可进行转基因抗病育种。通过基因枪(如伯乐公司的高压氦气基因枪，PDS-1000/He)将pCAMBIA-Ubi-Lr-L1表达载体质粒转化到高产、优质，但抗病性差的小麦品种的幼胚愈伤组织中。利用表达载体上的筛选标记基因——抗除草剂基因Bar，在加有除草剂PPT的MS固体培养基中筛选，获得抗PPT的转基因愈伤组织。再将筛选获得的转基因愈伤组织转到新的诱导组织分化的分化培养基(含3mg/L的PPT；1mg/L的Zeatin，和1mg/L的IAA，1/2的MS固体培养基)中培养，诱导产生新的再生植株。这样就获得了转基因小麦。用基因特异性引物通过PCR技术对转基因植株的后代进行检测，选择基因纯合，抗病性好的理想转基因品系，即可进行大田种植、推广。

实施例三：设计合成新抗病基因：

现代DNA合成技术已经可以合成全长基因。因此，根据Lr-L1基因和LRK10基因的差异，将LRK10基因编码1-180氨基酸残基的cDNA合成后与Lr-L1基因编码176位氨基酸残基到基因cDNA末端部分相连接，这样就合成了全新的基因。然后，通过测序验证合成基因的编码框(ORF)是否正确。通过验证的基因即可进一步构建到植物表达载体中，通过转基因技术对合成基因的抗病性进行检测。具有良好抗病性的合成基因可以用于转基因抗病小麦新品种的培育(植物表达载体的构建和转基因的具体操作如(1)中示例所述)。

实施例四：基因芯片制作：

以Lr-L1基因cDNA克隆为模板，用基因特异性引物或pGEM-T easy载体上的M13通用引物通过PCR扩增获得DNA产物。对产物进行纯化，溶解后，按照基因芯片制作程序制作小麦基因芯片，用于抗病等相关研究。如可以用英国的BioRobotics自动点膜仪将标本点在8×12厘米的尼龙膜上。每个样品点2个点，每个点的DNA量为几纳克，同时点上看家基因(如18sRNA和actin基因)作为稳定表达基因对照。试验研究材料的mRNA提取后用同位素(如³³p)标记作为探针，与基因芯片进行杂交。用记录仪分析杂交信号。根据杂交信号的强弱分析不同实验条件下Lr-L1基因的表达变化。研究Lr-L1基因与抗病等反应的关系。

实施例五：Lr-L1基因在抗白粉病反应中的表达：

表达分析的具体方法：(1)稳定表达对照基因—小麦肌动蛋白基因(actin)的扩增：根据GenBank中的actin基因cDNA片段的序列(GenBank查询号：gi：48927617)设计了一对引物，WAC-F：5′-GTTCCAATCTATG AGGGATACACGC-3′和WAC-R：5′-GAACCTCCACTGAGAACAACATTACC-3′。反转录PCR在Perkin-Elmer9600基因扩增仪上进行。反应液为25μL体系，包括3μL的经过定量的等量cDNA，0.4μmol/L的每种基因特异性引物，200μmol/L的dNTP，1倍的PCR缓冲液，1.5mmol/L的MgCl₂，1-2个单位的Taq-DNA聚合酶。扩增程序为：94℃变性3分钟；18个循环的94℃变性15秒，55℃退火15秒，72℃延伸1分钟；最后在72℃延伸7分钟。扩增产物在1％琼脂糖凝胶中电泳分离，溴化钇锭染色，紫外灯下观察、照相。小麦肌动蛋白基因的特异性扩增产物为422bp长。(2)小麦Lr-L1基因的扩增：方法与上述方法相同，只是扩增的退火温度不同，为53℃。基因特异性引物为：p1：5′-TATCAACGATGAGAAGCCAAGT-3′；p2：5′-TCCCAAATCCTC CCTGCCCTAC-3′。Lr-L1基因的特异性扩增产物为674bp长。

本发明主要参考文献：

1.Feuillet C，Schachermayr G，Keller B.1997.Molecular cloning of a newreceptor-like kinase gene encoded at the Lr10 disease resistance locus of wheat.Plant J，11：45-52

2.Altschul S F，Madden T L，Schffer A A，Zhang J，Zhang Z，Miller W，LipmanD J.1997.Gapped BLAST and PSI-BLAST：a new generation of protein databasesearch program.Nucleic Acids Res，25：3389-3402.

3.Marchler-Bauer A，Anderson J B，De Weese-Scott C，Fedorova N D，Geer L Y，He S，Hurwitz D I，Jackson J D，Jacobs A R，Lanczycki C J，Liebert C A，Liu C，Maddj T，Marchler G H，Mazumder R，Nikolskaya A N，Panchenko A R，Rao B S，Shoemaker B A，Simonyan V，Song J S，Thiessen P A，Vasudevan S，Wang Y，Yamashita R A，Yin J J，Bryant S H.2003.“CDD：a curated Entrez database ofconserved domain alignments”.Nucleic Acids Res.31：383-387

                            序列表

<110>河南农业大学

<120>小麦抗病基因Lr-L1及其应用

<160>2

<210>1

<211>2326

<212>DNA

<213>普通小麦(Triticum aestivum L.)

<400>1

acgcggggaa ttgaaacact ctcctcgtcc tcagaggcct aactatcaat agagcatgac    60

tctgactgcg tacctactcg ccactccact tcttcttcct ctgtgctcac catcttggta   120

caacagtaca gaaagatgag taaattactt gccatagcac tgctgctgct gcatcttatc   180

aaccacaaaa tcaacatggc aacggcatgg gatgatcaag atttcttcaa atactgccca   240

ccatcccact gcagccaaca tggcccagag atcaggtatc ctttctgcct tgaatccaac   300

aatacatcat catgtggatg tagtgggaaa tcaatcagga agatagcatg ctctggccaa   360

gacaccattc tagtccaccc agttctttgc ccatacagtg tcagcgccat agattacaag   420

cgttcttcca tgaagatcac cccacttgta gacccctgtt tggtactcca gcagaagctc   480

gccatctcca gaagctcgtc atctccacag gttgatgtta tcaacgatga gaagccaagt   540

cttgacagat atttattttg gagttctaca atttccctag tacgctgttc aagagagttt   600

gcacctggtg cagccgatgg gattgctggc ccagtctcct gccttagcaa cataacccac   660

ttcttttatt tggtgaatgg ttatgaagac atgtctattc ttccgttgga ctgcaaggtc   720

gtcccaccct cagatggtgt cggtggcggt cagataacca tgtatatgtt tgacgaccca   780

atgtcagaca cgctctcact gtccttcaag gaacgcacag aaagaatcct cggttttgct   840

gagacgacag tgtattggta taattactat tgcaaaggat gtgaacgcag tgggggacgc   900

tgcgcgttca gctcacaaag ggatagaaaa ttctgcatgc ccggcccaca tggttcacgt   960

atcaaagtca ttgcagctac atcatcagtg gccgcatttg tggttctttt gttaacggtg  1020

gccactgtgc tttatctttc actcaagaca agatataatg cagagataca tttgaaggtt  1080

gaaatgttcc tcaagacata tggcacatcg aaacccacaa ggtacacttt ctctgaagtt  1140

aagaagatgg caagacggtt taaggaaaaa gtagggcagg gaggatttgg gagcgtatac  1200

aaaggtgagc tgccaaatgg agtgcccgtg gcagtcaaga tgctagagaa ctctacagga  1260

gagggagaag cattcatcaa tgaagttgca accatcggac ttatccatca tgccaatatt  1320

gtccgcctcc tgggattctg ctctgaagga atgaggcggg ctcttattta tgaattcatg  1380

cctaatgagt cactggagaa atacatattc tctgacgact ctaatatttt tcagaatctt  1440

ctagtaccag ataaactgct agatattgct ttaggcatcg cccgaggtat ggagtacttg  1500

catcaagggt gcaaccagcg catcctccac tttgacatca agcctcacaa tatcctgctg  1560

gactacaact tcaatccaaa gatctcagac tttggccttg caaagctgtg cgcaagggac  1620

caaagcatcg tgaccttaac agcagcaaga ggcacaatgg gctacattgc accagagcta  1680

tactcccgga actttggggg agtatcgtac aagtcagacg tgtacagttt cgggatgctg  1740

gtgctagaaa tggtgagcgg gaggaggaat tcaggcccaa gaatcgggag ccaggacgat  1800

gtttacctcc ctgagtggat ctacgagaaa gtggtcaatg gggaggactt ggcgcttact  1860

ttggaaacga ctgaagaaga taaagaaaag gtgaggaagc tggctatggt ggcactgtgg  1920

tgtatccagt ggaacccaag aaaccggccg tcgatgacaa aggtcgtgaa catgctaact  1980

gggaggcttc agagtctgca gatgccacca aagccttatg tctcatccga gaatgaactt  2040

atgccataaa ttaaagcatg tcgcacggac taccatactc tgtcaggttg tactttgtcc  2100

acgcgtgcgc tgcaaataat agcaaccact gtgtttcgac gctttcagtc agtcaattag  2160

gtctgaagat gtatgaataa tcaccggaca ctagcagcat gtaatagtgt cactagttgt  2220

ttgcaagata ctggtgcttc catatttatg tccaaaaact tgcaatagag ctgtgtaaaa  2280

taaaataata atctgtcgaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaa                 2326

<210>2

<211>637

<212>PRT

<213>普通小麦(Triticum aestivum L.)

<400>2

Met Ser Lys Leu Leu Ala Ile Ala Leu Leu Leu Leu His Leu Ile

1               5                   10                  15

Asn His Lys Ile Asn Met Ala Thr Ala Trp Asp Asp Gln Asp Phe

                20                  25                  30

Phe Lys Tyr Cys Pro Pro Ser His Cys Ser Gln His Gly Pro Glu

                35                  40                  45

Ile Arg Tyr Pro Phe Cys Leu Glu Ser Asn Asn Thr Ser Ser Cys

                50                  55                  60

Gly Cys Ser Gly Lys Ser Ile Arg Lys Ile Ala Cys Ser Gly Gln

                60                  70                  75

Asp Thr Ile Leu Val His Pro Val Leu Cys Pro Tyr Ser Val Ser

                80                  85                  90

Ala Ile Asp Tyr Lys Arg Ser Ser Met Lys Ile Thr Pro Leu Val

                95                  100                 105

Asp Pro Cys Leu Val Leu Gln Gln Lys Leu Ala Ile Ser Arg Ser

                110                 115                 120

Ser Ser Ser Pro Gln Val Asp Val Ile Asn Asp Glu Lys Pro Ser

                125                 130                 135

Leu Asp Arg Tyr Leu Phe Trp Ser Ser Thr Ile Ser Leu Val Arg

                140                 145                 150

Cys Ser Arg Glu Phe Ala Pro Gly Ala Ala Asp Gly Ile Ala Gly

                155                 160                 165

Pro Val Ser Cys Leu Ser Asn Ile Thr His Phe Phe Tyr Leu Val

                170                 175                 180

Asn Gly Tyr Glu Asp Met Ser Ile Leu Pro Leu Asp Cys Lys Val

                185                 190                 195

Val Pro Pro Ser Asp Gly Val Gly Gly Gly Gln Ile Thr Met Tyr

                200                 205                 210

Met Phe Asp Asp Pro Met Ser Asp Thr Leu Ser Leu Ser Phe Lys

                215                 220                 225

Glu Arg Thr Glu Arg Ile Leu Gly Phe Ala Glu Thr Thr Val Tyr

                230                 235                 240

Trp Tyr Asn Tyr Tyr Cys Lys Gly Cys Glu Arg Ser Gly Gly Arg

                245                 250                 255

Cys Ala Phe Ser Ser Gln Arg Asp Arg Lys Phe Cys Met Pro Gly

                260                 265                 270

Pro His Gly Ser Arg Ile Lys Val Ile Ala Ala Thr Ser Ser Val

                275                 280                 285

Ala Ala Phe Val Val Leu Leu Leu Thr Val Ala Thr Val Leu Tyr

                290                 295                 300

Leu Ser Leu Lys Thr Arg Tyr Asn Ala Glu Ile His Leu Lys Val

                305                 310                 315

Glu Met Phe Leu Lys Thr Tyr Gly Thr Ser Lys Pro Thr Arg Tyr

                320                 325                 330

Thr Phe Ser Glu Val Lys Lys Met Ala Arg Arg Phe Lys Glu Lys

                335                 340                 345

Val Gly Gln Gly Gly Phe Gly Ser Val Tyr Lys Gly Glu Leu Pro

                350                 355                 360

Asn Gly Val Pro Val Ala Val Lys Met Leu Glu Asn Ser Thr Gly

                365                 370                 375

Glu Gly Glu Ala Phe Ile Asn Glu Val Ala Thr Ile Gly Leu Ile

                380                 385                 390

His His Ala Asn Ile Val Arg Leu Leu Gly Phe Cys Ser Glu Gly

                395                 400                 405

Met Arg Arg Ala Leu Ile Tyr Glu Phe Met Pro Asn Glu Ser Leu

                410                 415                 420

Glu Lys Tyr Ile Phe Ser Asp Asp Ser Asn Ile Phe Gln Asn Leu

                425                 430                 435

Leu Val Pro Asp Lys Leu Leu Asp Ile Ala Leu Gly Ile Ala Arg

                440                 445                 450

Gly Met Glu Tyr Leu His Gln Gly Cys Asn Gln Arg Ile Leu His

                455                 460                 465

Phe Asp Ile Lys Pro His Asn Ile Leu Leu Asp Tyr Asn Phe Asn

                470                 475                 480

Pro Lys Ile Ser Asp Phe Gly Leu Ala Lys Leu Cys Ala Arg Asp

                485                 490                 495

Gln Ser Ile Val Thr Leu Thr Ala Ala Arg Gly Thr Met Gly Tyr

                500                 505                 510

Ile Ala Pro Glu Leu Tyr Ser Arg Asn Phe Gly Gly Val Ser Tyr

                515                 520                 525

Lys Ser Asp Val Tyr Ser Phe Gly Met Leu Val Leu Glu Met Val

                530                 535                 540

Ser Gly Arg Arg Asn Ser Gly Pro Arg Ile Gly Ser Gln Asp Asp

                545                 550                 555

Val Tyr Leu Pro Glu Trp Ile Tyr Glu Lys Val Val Asn Gly Glu

                560                 565                 570

Asp Leu Ala Leu Thr Leu Glu Thr Thr Glu Glu Asp Lys Glu Lys

                575                 580                 585

Val Arg Lys Leu Ala Met Val Ala Leu Trp Cys Ile Gln Trp Asn

                590                 595                 600

Pro Arg Asn Arg Pro Ser Met Thr Lys Val Val Asn Met Leu Thr

                605                 610                 615

Gly Arg Leu Gln Ser Leu Gln Met Pro Pro Lys Pro Tyr Val Ser

                620                 625                 630

Ser Glu Asn Glu Leu Met Pro

                635     637

Claims (6)

1.一种小麦抗病基因Lr-L1，其特征是：小麦抗病基因Lr-L1的全长cDNA序列，核苷酸序列碱基组成为：672a 534c 535g 585t

1    acgcggggaa ttgaaacact ctcctcgtcc tcagaggcct aactatcaat agagcatgac

61   tctgactgcg tacctactcg ccactccact tcttcttcct ctgtgctcac catcttggta

121  caacagtaca gaaagatgag taaattactt gccatagcac tgctgctgct gcatcttatc

181  aaccacaaaa tcaacatggc aacggcatgg gatgatcaag atttcttcaa atactgccca

241  ccatcccact gcagccaaca tggcccagag atcaggtatc ctttctgcct tgaatccaac

301  aatacatcat catgtggatg tagtgggaaa tcaatcagga agatagcatg ctctggccaa

361  gacaccattc tagtccaccc agttctttgc ccatacagtg tcagcgccat agattacaag

421  cgttcttcca tgaagatcac cccacttgta gacccctgtt tggtactcca gcagaagctc

481  gccatctcca gaagctcgtc atctccacag gttgatgtta tcaacgatga gaagccaagt

541  cttgacagat atttattttg gagttctaca atttccctag tacgctgttc aagagagttt

601  gcacctggtg cagccgatgg gattgctggc ccagtctcct gccttagcaa cataacccac

661  ttcttttatt tggtgaatgg ttatgaagac atgtctattc ttccgttgga ctgcaaggtc

721  gtcccaccct cagatggtgt cggtggcggt cagataacca tgtatatgtt tgacgaccca

781  atgtcagaca cgctctcact gtccttcaag gaacgcacag aaagaatcct cggttttgct

841  gagacgacag tgtattggta taattactat tgcaaaggat gtgaacgcag tgggggacgc

901  tgcgcgttca gctcacaaag ggatagaaaa ttctgcatgc ccggcccaca tggttcacgt

961  atcaaagtca ttgcagctac atcatcagtg gccgcatttg tggttctttt gttaacggtg

1021 gccactgtgc tttatctttc actcaagaca agatataatg cagagataca tttgaaggtt

1081 gaaatgttcc tcaagacata tggcacatcg aaacccacaa ggtacacttt ctctgaagtt

1141 aagaagatgg caagacggtt taaggaaaaa gtagggcagg gaggatttgg gagcgtatac

1201 aaaggtgagc tgccaaatgg agtgcccgtg gcagtcaaga tgctagagaa ctctacagga

1261 gagggagaag cattcatcaa tgaagttgca accatcggac ttatccatca tgccaatatt

1321 gtccgcctcc tgggattctg ctctgaagga atgaggcggg ctcttattta tgaattcatg

1381 cctaatgagt cactggagaa atacatattc tctgacgact ctaatatttt tcagaatctt

1441 ctagtaccag ataaactgct agatattgct ttaggcatcg cccgaggtat ggagtacttg

1501 catcaagggt gcaaccagcg catcctccac tttgacatca agcctcacaa tatcctgctg

1561 gactacaact tcaatccaaa gatctcagac tttggccttg caaagctgtg cgcaagggac

1621 caaagcatcg tgaccttaac agcagcaaga ggcacaatgg gctacattgc accagagcta

1681 tactcccgga actttggggg agtatcgtac aagtcagacg tgtacagttt cgggatgctg

1741 gtgctagaaa tggtgagcgg gaggaggaat tcaggcccaa gaatcgggag ccaggacgat

1801 gtttacctcc ctgagtggat ctacgagaaa gtggtcaatg gggaggactt ggcgcttact

1861 ttggaaacga ctgaagaaga taaagaaaag gtgaggaagc tggctatggt ggcactgtgg

1921 tgtatccagt ggaacccaag aaaccggccg tcgatgacaa aggtcgtgaa catgctaact

1981 gggaggcttc agagtctgca gatgccacca aagccttatg tctcatccga gaatgaactt

2041 atgccataaa ttaaagcatg tcgcacggac taccatactc tgtcaggttg tactttgtcc

2101 acgcgtgcgc tgcaaataat agcaaccact gtgtttcgac gctttcagtc agtcaattag

2161 gtctgaagat gtatgaataa tcaccggaca ctagcagcat gtaatagtgt cactagttgt

2221 ttgcaagata ctggtgcttc catatttatg tccaaaaact tgcaatagag ctgtgtaaaa

2281 taaaataata atctgtcgaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaa。

2.根据权利要求1所述的小麦抗病基因Lr-L1，其特征是：小麦抗病基因

Lr-L1编码的蛋白，其氨基酸序列为：

1   MSKLLAIALL LLHLINHKIN MATAWDDQDF FKYCPPSHCS QHGPEIRYPF CLESNNTSSC

61  GCSGKSIRKI ACSGQDTILV HPVLCPYSVS AIDYKRSSMK ITPLVDPCLV LQQKLAISRS

121 SSSPQVDVIN DEKPSLDRYL FWSSTISLVR CSREFAPGAA DGIAGPVSCL SNITHFFYLV

181 NGYEDMSILP LDCKVVPPSD GVGGGQITMY MFDDPMSDTL SLSFKERTER ILGFAETTVY

241 WYNYYCKGCE RSGGRCAFSS QRDRKFCMPG PHGSRIKVIA ATSSVAAFVV LLLTVATVLY

301 LSLKTRYNAE IHLKVEMFLK TYGTSKPTRY TFSEVKKMAR RFKEKVGQGG FGSVYKGELP

361 NGVPVAVKML ENSTGEGEAF INEVATIGLI HHANIVRLLG FCSEGMRRAL IYEFMPNESL

421 EKYIFSDDSN IFQNLLVPDK LLDIALGIAR GMEYLHQGCN QRILHFDIKP HNILLDYNFN

481 PKISDFGLAK LCARDQSIVT LTAARGTMGY IAPELYSRNF GGVSYKSDVY SFGMLVLEMV

541 SGRRNSGPRI GSQDDVYLPE WIYEKVVNGE DLALTLETTE EDKEKVRKLA MVALWCIQWN

601 PRNRPSMTKV VNMLTGRLQS LQMPPKPYVS SENELMP。

3.根据权利要求2所述的小麦抗病基因Lr-L1，其特征是：小麦抗病基因Lr-L1编码的蛋白是一种类受体蛋白激酶，包括N-端信号肽、细胞外结构域、中部跨膜结构域、高荷电序列和C-端蛋白激酶结构域。

4.根据权利要求1所述的小麦抗病基因Lr-L1在转基因抗病育种中的应用。

5.根据权利要求1所述的小麦抗病基因Lr-L1在小麦基因芯片制作中的应用。

6.根据权利要求1所述的小麦抗病基因Lr-L1在合成新的抗病基因中的应用。

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