CN1712531A

CN1712531A - 硬粒小麦高分子量谷蛋白By8基因及其应用

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Publication number: CN1712531A
Application number: CN 200510072140
Authority: CN
Inventors: 晏月明; 姜怡; 安学丽; 肖英华; 裴玉贺; 司晓敏; 胡英考
Original assignee: Capital Normal University
Current assignee: Capital Normal University
Priority date: 2005-05-25
Filing date: 2005-05-25
Publication date: 2005-12-28
Anticipated expiration: 2025-05-25
Also published as: CN100370027C

Abstract

本发明属于生物基因工程技术领域，特别涉及一种硬粒小麦高分子量谷蛋白By8基因以及基于此基因通过生物技术方法改良小麦品质的应用。目前分离谷蛋白基因主要采用建库筛选和PCR方法，本发明通过等位基因特异PCR技术，结合单、双向凝胶电泳和毛细管电泳方法，在硬粒小麦中分离了一个新的高分子量谷蛋白亚基HMW－GS By8及其编码基因By8，该基因序列能显著增加面筋强度，可以在小麦品质改良中发挥重要作用。

Description

硬粒小麦高分子量谷蛋白By8基因及其应用

技术领域

本发明属于生物基因工程技术领域，特别涉及一种硬粒小麦高分子量谷蛋白By8基因序列、功能鉴定以及基于此基因通过生物技术方法改良小麦品质的应用。

背景技术

小麦是世界上栽培面积最大、产量最高、地理分布最广的重要农作物，其种植面积和产量约占谷物种植面积的30％，被广泛应用于食品加工与家畜饲养上。小麦种子中含有其他粮食作物中所欠缺的面筋蛋白，可制作面包、面条、饼干、糕点和馒头等多种专用食品。因此，种子蛋白的组成和含量在很大程度上决定小麦加工品质的优劣。

根据溶解特点的不同将小麦种子蛋白分为以下四类：清蛋白和球蛋白、麦醇溶蛋白、麦谷蛋白。研究表明，小麦谷蛋白多聚体是自然界最大的蛋白分子。通常所说的小麦贮藏蛋白是指醇溶蛋白和麦谷蛋白，其中麦谷蛋白约占贮藏蛋白的40％左右。根据还原条件下在SDS-PAGE中的迁移率不同，又可将麦谷蛋白分为两类：高分子量谷蛋白亚基(HMW-GS)和低分子量谷蛋白亚基(LMW-GS)。HMW-GS只占小麦贮藏蛋白的10％，因其在组成高分子聚合体(提供面粉弹性)中起到很重要的作用，所以它的组成和功能可直接影响小麦面粉的烘烤质量。目前已清楚HMW-GS的编码基因位于第一部分同源群染色体长臂靠近着丝点的Glu-A1、Glu-B1和Glu-D1三个位点上，每个位点有两个紧密连锁基因，分别编码一个分子量大的x-型亚基和分子量较小的y-型亚基，但由于存在基因沉默，有的位点y-型亚基或x-型亚基基因不表达，所以一个品种一般只有3-5个亚基，其中0-1种由Glu-A1编码(A1位点的Y型亚基基因总是处于“沉默”状态)、1-2种分别由Glu-B1和Glu-D1编码。

HMW-GS组成与烘烤品质的关系已较清楚。依据亚基间沉淀值差异对亚基烘烤品质进行了评分，对于紧密连锁的位点，则以亚基对为参评单位。评分等级最高的是1Dx5+1Dy10亚基对，其后为1Ax1、1Ax2^*、1By17+1By18、1By7+1By8，而亚基1Dy2+1Dy12的品质较差，1By6+1By8的评分等级最低，并推测在B组亚基中1By7好于1By6，1By8好于1By9。一些研究还发现1Bx13+1By16、1Bx4+1By12、1Bx14+1By15对品质也具有重要作用。

通过转基因技术改良小麦品质已被证明是一条有效途径。因此，优质蛋白基因的分离克隆成为当前国内外的研究热点。由于小麦高分子量谷蛋白亚基对品质具有重要作用，国内外都试图克隆优质HMW-GS基因，然后通过基因工程手段定向改良小麦品质。迄今为止，在普通小麦中已克隆了1Dx5、1Dy10、1Ax1、1Ax2^*、1By17、1By7等多个对品质有重要作用的HMW-GS基因，并在转基因优质小麦品种的培育方面取得重要进展。

硬粒小麦(Triticum durum，2n＝4x＝28，AABB)是四倍体种，在欧美等国家有广泛栽培。例如在意大利，硬粒小麦是制作优质面条、饼干、糕点等食品的重要原料。Simeto是意大利优质硬粒小麦品种，品质评分达到75。该品种HMW-GS组成为1Bx7+1By8，而By8亚基基因一直未能克隆。

发明内容

本发明的目的在于从硬粒小麦中克隆得到一个编码高分子量谷蛋白亚基(HMW-GS)By8的基因，通过常用基因工程技术，可培育优质转基因小麦，从而改善小麦品质。

本发明采用的技术方案是：一种硬粒小麦高分子量谷蛋白的By8基因，其特征在该基因具有序列表中SEQ ID NO.1第1位到2163位所示的核苷酸序列。

上述的硬粒小麦高分子量谷蛋白By8基因具有的核苷酸序列还可以是序列表中SEQ ID NO.1第1位到2163位中因一个或多个核苷酸的缺失、插入或替换而形成的具有功能活性的等位基因。

目前分离谷蛋白基因主要采用建库筛选和PCR方法，本发明通过等位基因特异PCR技术，结合单、双向凝胶电泳、毛细管电泳和质谱方法，在硬粒小麦中鉴定、分离了一个新的HMW-GS By8亚基及其基因By8，该基因可显著增加面筋强度，可以在小麦品质改良中发挥重要作用。

基因结构特征：

硬粒小麦高分子量谷蛋白亚基的单、双向凝胶电泳、毛细管电泳和质谱鉴定图谱如图1、图2所示，硬粒小麦simeto只有一个y-型亚基即HMW-GS8，x-型亚基为HMW-GS7。为了克隆编码HMW-GS8的基因即基因1By8，根据蛋白质N-端保守序列和已发表的基因序列设计不同的AS-PCR引物，其中引物P1+P2+P3用于扩增1By8基因的编码区，引物P4+P5用于扩增1By8基因上游启动子序列，分别获得了2166bp和854bp单一扩增产物，它们正好相对于y-型HMW谷蛋白1By8基因的编码区和上游启动子大小，而且从叶片和种子DNA获得的结果一致，说明所设计的引物特异性高。

两单一片段经克隆测序与连接后获得了By8基因共3020bp如序列表SEQID NO.1所示的编码全序列。该基因包括一个无内含子的2166bp可读框(编码720个氨基酸残基)和854bp的上游序列。By8基因上游区包括一些典型的真核基因序列，如一个TATA框，存在于启始密码ATG上游-82到-88bp的位置。另外，还有三个与其它植物基因相似的类CCAAT序列：分别位于-112、-188、-226的位置。在启始密码ATG上游-206到-243bp，有一个增强子序列：GTTTTGCAAAGCTCCAATTGCTCCTTGCTTATCCAGCT，该序列由Thomas和Flavell在1990年鉴定，是基因表达的主要调节因子。从-421to-444bp还存在一个24bp序列，叫做-300元件，且在-549、-571、-594处有三个“-300元件”序列部分区段的重复片段，它在其它贮藏蛋白基因中是保守的。

由DNA序列推导出的氨基酸序列如序列表中SEQ ID NO.2所示，该氨基酸序列显示，By8亚基与其它y-型HMW谷蛋白亚基相似，前面是21个信号肽残基，然后与其它HMW谷蛋白亚基一样，有三个明显的结构区域：104个残基的非重复N-端区，553个残基的中央重复区和42个残基的非重复C-端区。1By8亚基有7个半胱氨酸残基：N-端5个、C-端1个、重复区末端靠近C-端1个。重复区由六肽(PGQGQQ)和九肽(GYYPTSLQQ)组成的典型y-型HMW谷蛋白结构(无三肽重复)。

By8亚基基因与已克隆的By9亚基基因同源性较高，而与劣质亚基1Dy12基因存在很大差异。与By9亚基相比，只有两个氨基酸残基的替换(分别在78处的异亮氨酸/脯氨酸替换和442处的精氨酸/谷氨酸替换)和342处15个氨基酸残基(QYPASQQQPAQGQQG)的插入。By8基因的这一结构特征很可能对小麦面筋品质具有重要作用。

HMW-GS对面包烘烤品质所起的重要作用已被众多的研究者所证实(Wrigley，1996)。具有1Dx5+1Dy10亚基(由1D染色体上Glu-D1位点上的基因编码)的品种面包烘烤品质明显优于其它亚基组合。研究发现以1或2^*亚基代替N，以7+8亚基代替7+9亚基，以5+10亚基代替2+12亚基将显著改善小麦的烘烤品质。一般认为：具有1Dx5+1Dy10亚基组合(品质评分为4)的品种具较好的烘烤品质，其次是1Ax1、1Ax2^*、1Bx7+1By8、1Bx17+1By18(品质评分均为3)，而具有亚基组合2+12的品种烘烤品质较差。因此，改善麦谷蛋白的高分子量亚基构成，将是改良我国小麦品种烘烤品质的重要途径。研究显示，通过优质谷蛋白基因(包括从硬粒小麦获得的优质谷蛋白基因)的转化，培育转基因小麦可显著改善面粉品质。

附图说明

图1 硬粒小麦Simeto高分子量谷蛋白亚基的单、双向凝胶电泳鉴定

a-SDS-PAGE

b-A-PAGE

c-A-PAGE x SDS-PAGE

图2 硬粒小麦Simeto高分子量谷蛋白亚基的毛细管电泳和质谱鉴定

a-高分子量谷蛋白亚基的毛细管电泳HPCE

b-高分子量谷蛋白亚基的质谱鉴定MALDI-TOF-MS

图3 Simeto HMW-GS By8基因上游和编码区的PCR扩增

a.1-1kb DNA ladder Marker

2-By8基因上游

b.1-1kb DNA ladder Marker

2-阴性对照

3-By8基因编码区

图4 By8基因在大肠杆菌E.coli中的表达

1-蛋白质分子量标记

2-Simeto种子中的By8亚基

3-未转化的BLR-21(DE3)pLysS

4-By8重组质粒转化没有IPTG诱导的对照细菌培养

5-IPTG诱导的By8重组质粒溶菌液

图5 Simeto By8亚基配粉品质检测和面图

a-10g面粉+6ml水

b-10g面粉+6ml水+0.1％乙酸

c-10g面粉+6ml水+0.1％乙酸+DTT+碘酸钾+0.1％SDS

d-10g面粉+6ml水+0.1％乙酸+DTT+碘酸钾+0.1％SDS+10mg By8蛋白

具体实施方式

实施例1硬粒小麦simeto高分子量谷蛋白HMW-GS8亚基的鉴定

(1)植物材料：意大利优质硬粒小麦品种simeto。

(2)HMW-GS提取：

①SDS-PAGE电泳样品制备：半粒种子扎碎后将面粉放入1ml离心管，然后加入0.3ml 55％异丙醇，涡旋1分钟，65℃水浴振荡30分钟，10000rpm离心10分钟，弃上清。上述处理面粉的操作重复3次，用滤纸吸去残余上清，将醇溶蛋白去除干净；加0.1ml 55％异丙醇，0.08M Tris-HCL，pH8.0，含1％二硫苏糖醇(DTT，新鲜加入)，充分混合，65℃水浴充分振荡30分钟；加0.1ml55％异丙醇，0.08M Tris-HCL，pH8.0，含1.4％新鲜混合的4-乙烯基吡啶，混合并在65℃水浴中振荡30分钟，12000rpm离心10分钟；将0.06ml上清转入新管，加0.06ml样品缓冲液(2％SDS，0.02％溴酚蓝，0.08M Tris-HCl，pH8.0，40％甘油)，65℃水浴中振荡30分钟，12000rpm离心10分钟，作SDS-PAGE上样用。

②A-PAGE电泳样品制备：余下上清液转入新管，加0.3ml冷丙酮将谷蛋白沉淀15分钟，12000rpm离心10分钟，弃上清。室温干燥谷蛋白后用50μl样品缓冲液(6M尿素，30％甘油和25mM乙酸)，充分混合，12000rpm离心10分钟，取8-10μl作A-PAGE上样用。

③毛细管电泳样品制备：如上所述，去掉醇溶蛋白往离心管沉淀中加入50％正丙醇含新鲜加入的1％DTT 800μl，45℃震荡提取30分钟，12000rpm离心10分钟，取上清液600ul转入干净1.5ml离心管中，加入预冷分析纯丙酮至终浓度40％，室温静置沉淀30分钟，12000rpm离心15分钟，所得沉淀即为HMW-GS。室温干燥后加入300μl 20％乙氰和0.1％三氟乙酸(TFA)，充分溶解、离心后即可进行CE分析。

④质谱分析样品制备：一粒种子砸成粉末状放入1 ml离心管，加入0.5ml70％乙醇，涡旋1/2个到1个小时，13000g离心5min，去上清。加入0.5ml 55％异丙醇，混匀，65℃水浴30min，13000g离心5min，去上清并用滤纸吸干净，此步骤重复3次。加入0.5ml 50ml异丙醇+8ml 1M Tris-HCl(pH8.0)+42ml ddH₂O溶液(新鲜加入β-巯基乙醇达5％)，混匀，65℃水浴30min。取上清加入-20℃预冷的丙酮(丙酮浓度达40％)，沉淀1-2小时，13000g离心5min，去上清，室温干燥。加入10μl 0.5％TFA+50％乙腈溶液溶解。

(3)用下列5种方法分别对HMW谷蛋白亚基进行鉴定

①SDS-PAGE电泳利用Boi-Rad Mini-PROTEAN 3电泳槽、4％浓缩胶、12％分离胶，磷酸-甘氨酸缓冲液系统，10mA电泳2小时，0.1％考马斯亮蓝R-250染色，25％甲醇和乙酸7％脱色，电泳图谱如图1中的a图所示。

②A-PAGE电泳电泳槽同上，利用5％浓缩胶和10％分离胶，0.375％双丙烯酰胺，2M尿素，0.1％抗坏血酸，0.0007％硫酸亚铁，冰醋酸-甘氨酸缓冲液系统pH3.1，恒压500V，电泳1～2小时。1％考马斯亮蓝R-250染色，电泳图谱如图1中的b图所示。

③双向A-PAGE×SDS-PAGE电泳A-PAGE后，染色1小时，按泳道将胶条切下，做方向标记，在20-50ml孵育液(2％SDS，40％甘油，62.5mMTris-HCl，pH6.8)中孵育30分钟，然后放在SDS-PAGE胶上(方法同①，在分离胶上端留1cm空)，先15毫安电泳，待样品进入分离胶后加大至30毫安(电压80-100伏)，电泳2.5小时。1％考马斯亮蓝R-250染色24小时，电泳图谱如图1中的c图所示。

④高效毛细管电泳(HPCE)采用Bio-Rad公司生产的BioFocus 3000型高效毛细管电泳仪系统。弹性石英毛细管柱由河北省永年光导纤维厂生产，内径为50μm、长度为25.5cm(检测长度20cm)，外层涂有聚酰亚胺保护层，内壁均未涂层。电泳缓冲液为：100mm磷酸—甘氨酸缓冲液(pH2.50，含20％乙氰和0.05％羟脯氨酰甲基纤维素HPMC)。毛细管柱冲洗方法：新毛细管预处理为：H₂O 5min；1M NaOH 5min；H₂O 5min；1M H₃PO₄ 5min；Buffer 30min。样品间冲洗程序：1M H₃PO₄ 4min；H₂O 2min；Buffer 3min。电泳参数：运行电压：12.5kV，毛细管温度：35℃，样品槽温度：15℃，进样：8kM 5sec，电极：由+向-，电泳图谱如图2所示。

⑤MALDI-TOF-MS使用岛津AX1MA-CFRTMPlus型基质辅助激光解析附电离飞行质谱仪(配有软件用于系统操作和数据处理)：全自动样品处理，软件控制精确定位，具有延迟提取(DE)、源后裂解(PSD)功能。

靶板的清洗(384型)：用棉球沾取甲醇，擦去靶板上的样品，B.1％甲酸超声10-15min，ddH₂O冲洗，D.加丙酮超声10-15min，加甲醇超声10-15min，加水超声10-15min，取出靶板，用甲醇冲洗，通风橱中干燥。

基质的选择与制备：SA(3，5-Dimethexycinnamic acid)，10mg基质溶于1ml50％已睛+0.05％TFA中，避光保存。

标样的制备与选择：HMW-GS分子量的测定：Albumin(66430.09)，0.1％TFA溶解

上样前处理：1％TFA平衡ZIPtip，过滤样品：反复抽吸5-10次，1％TFA过滤，0.4ulμElution Buffer洗脱样品

参数的设置：大分子量的测定采用线性模式，分子量范围10000-100000。

点样(三明治法)：基质0.5μl，样品0.5μl，基质0.5μl。

实施例2硬粒小麦simeto高分子量谷蛋白By8基因的鉴定

(1)亚基转膜与N-端微量测序

将双向电泳凝胶上的蛋白点切下，回收纯化后利用毛细管电泳检测纯度，然后通过Bio-Rad MiniTrans-Blot电转印到PVDF膜上，在ABI cLC 491蛋白质测序仪上进行N-端微量测序。

(2)AS-PCR引物设计

根据所得到的HMW谷蛋白N-端序列和已发表的相关基因保守序列设计AS-PCR引物，用以扩增y-型HMW亚基基因的编码区和上游序列。引物序列如下：

①编码区PCR引物

P1：5’-ATGGCTAAGCGGTTGGTCCT-3’

P2：5’-GGCTAGCCGACAATGCGTCG-3’

P3：5’-TCACTGGCTAGCCGACAATG-3’

②上游PCR引物

P4：5’-ACCACAGTTTGCTCATATTGTCTTG-3’

P5：5’-ACGTCTACACTTCTGCAAACAATACC-3’

(3)叶片与种子基因组DNA提取

选取硬粒小麦品种Simeto饱满种子，用7％次氯酸钠消毒10分钟，25℃条件下浸种催芽过夜，黑暗25℃培养7～8天。用0.1克黄化苗按CTAB法提取总DNA。

取20mg砸碎的种子提取gDNA，于1.5ml eppendorf离心管内，加入100μl提取缓冲液(200mM Tris-Hcl，pH7.5，288mM NaCl，25mM EDTA，0.5％SDS)浸解。再加入700μl提取缓冲液，涡旋20sec后，12000rpm离心5min。取上清，加入700μl氯仿∶异戊醇(24∶1)，12000rpm离心10min。保留上清，加入700μl异丙醇，沉淀2min，12000rpm离心15min，弃上清，干燥后向沉淀中加入40μl TE缓冲液(10mM Tris-HCl，pH8.0，1mM EDTA，pH8.0)，溶解24小时后，电泳检测DNA浓度，-20℃保存。

(4)HMW-GS编码基因的PCR扩增

引物由上海Sangong公司合成；PCR用酶购自TaKaLa宝生物工程公司；PCR回收Kit购自上海Sangong公司；T-Vector连接Kit为Promega产品。

PCR反应体系

①编码区PCR体系和程序

A.50ul体系：

La Taq酶 2.5U

2×GC Buffer II(MgCl²⁺Plus) 25μl

dNTP 0.4mM

每条引物 0.5μM

模板DNA 100ng

灭菌蒸馏水 50μl

B.反应程序：94℃变性2分钟；94℃变性45秒，63℃退火1分钟，72℃延伸2分钟，共35个循环；最后72℃延伸10分钟。用1％琼脂糖胶检测PCR产物。

②上游PCR体系和程序

A.50ul体系：

Taq酶 2.5U

10×PCR Buffer(MgCl²⁺Plus) 5μl

dNTP 0.4mM

每条引物 0.5μM

模板DNA 100ng

灭菌蒸馏水 50μl

B.反应程序：94℃变性2分钟；94℃变性45秒，64℃退火1分钟，72℃延伸1.5分钟，共35个循环；最后72℃延伸10分钟。用1％琼脂糖凝胶检测PCR产物。

Southern杂交

利用HMW-GS基因克隆制备探针进行Southern杂交，鉴定PCR产物。

PCR产物的回收

①将所需的电泳凝胶切下放于1.5ml离心管中，加入700μl Binding Buffer，并于50℃-60℃水浴使琼脂糖凝胶充分溶解；

②将UNIQ-10柱放入2ml收集管中，将凝胶溶解物转移到UNIQ-10柱中，室温放置2分钟后以8000rpm离心1分钟；

③取下UNIQ-10柱，倒掉收集管中的废液，将UNIQ-10柱放入同一收集管中，加入500ul Binding Buffer，8000rpm离心1分钟；

④取下UNIQ-10柱，去掉管中液体，加入500ul Wash Buffer，8000rpm离心1分钟；重复一次；

⑤取下UNIQ-10柱，去掉管中液体，将UNIQ-10柱放入同一收集管中，让离心管盖开着，室温12000rpm离心1分钟；

⑥将UNIQ-10柱放入一新1.5ml离心管中，在柱子膜中央加30μl水到UNIQ-10柱中，室温或37℃放置2分钟；

⑦室温12000rpm离心1分钟后即得到回收产物，可立即使用或-20℃保存。

(5)HMW-GS编码基因的PCR克隆和鉴定

①连接反应体系：

2^*rapid ligation buffer 5μl

pGEM-T Vector 0.5μl

T4 DNALigase 1μl

PCR回收产物 3.5μl

共10ul体积，4℃连接过夜。

②连接产物转化大肠杆菌DH-5α感受态细胞

A.大肠杆菌感受态细胞DH-5α的制备：划板复壮宿主菌后，挑一单菌落于20ml的LB(Tryptone 10g/L；Yeast extract 5g/L；NaCl 5g/L；pH7.0)液体培养基中，37℃摇至OD₆₀₀＝0.3-0.4，取出置于冰上20分钟。将菌液移至一灭菌的50ml离心管中，4℃4000rpm离心10分钟，回收细胞。将细胞沉淀以10ml冰预冷的0.1mol/L的CaCl₂重悬，并置于冰上30分钟。4℃4000rpm离心10分钟，弃上清，用4ml冰预冷的0.1mol/L的CaCl₂重悬菌体，加入灭菌甘油至终浓度30％，分装后存于-70℃。

B.重组质粒向宿主菌的转化：取100ul DH-5α感受态细胞0.5ml的离心管中，加入10ul的连接产物并轻旋以混匀内含物，置于冰上30分钟。42℃热激90秒，置于冰上1-2分钟。加入400ul 37℃预热的LB培养基，37℃ 150rpm，摇培45分钟。取150ul菌液铺于涂有IPTG和X-Gal的LB平板上(Amp80ul/ml)，37℃倒置培养12-16小时。

③质粒的提取

A.挑取单菌落于10ml LB(Amp 80ul/ml)液体培养基，37℃培养过夜。将菌液移至1.5ml的离心管中，12000rpm离心2分钟，弃上清，收集菌体；

B.加入100ul冰预冷的溶液I(50mM葡萄糖、25mM Tris-HCl pH8.0、10mMEDTApH8.0)，充分悬浮菌液，室温放置5分钟；

C.加入新鲜配制的200ul的溶液II(0.2MnaOH、1％SDS)，轻摇菌液，冰上放置5分钟；

D.加入150ul冰预冷的溶液III(60ml 5M乙酸钾、11.5ml冰乙酸、28.5ml双蒸水)清摇菌液，冰上放置5分钟，12000rpm离心10分钟，移上清至一新离心管；

E.加入等体积的酚/氯仿(1∶1)抽提一次，12000rpm离心5分钟，移上清至一新离心管；

F.加入2倍体积的无水乙醇，振荡，室温放置5分钟，12000rpm离心10分钟；

G.用75％乙醇洗涤沉淀两次，每次12000rpm离心5分钟；

H.吹干，溶于灭菌双蒸水或TE缓冲液(含0.02mg/mlRNase)，做电泳检测。

④重组质粒PCR法鉴定与序列测定

A.按前述PCR反应体系和程序进行重组质粒鉴定；

B.经鉴定的质粒进行DNA序列测定，由TaKaRa Biotech公司完成，得到了By8基因共3020bp，如序列表中SEQ ID NO.1所示的编码全序列，该核苷酸序列包括一个无内含子的2166bp可读框(编码720个氨基酸残基)和854bp的上游序列。

实施例3硬粒小麦Simeto高分子量谷蛋白By8基因的表达与鉴定

(1)PCR产物的纯化回收

以硬粒小麦Simeto的基因组DNA为模板，扩增By8基因的PCR产物在1％的琼脂糖凝胶中进行电泳(稳压50v)1小时，在紫外灯下将DNA条带切下，用DNA凝胶纯化试剂盒(Agarose Gel DNA Purification Kit，Takara)将特异扩增条带纯化回收。

(2)PCR产物和表达载体PET-30a(Novagen)的双酶切

将回收的PCR产物和PET-30a质粒用EcoR I(TaKaRa)及Xho I(TaKaRa)进行双酶切，酶切3小时后将酶切产物用Agarose Gel DNA Purification Kit(TaKaRa)回收。

(3)连接与鉴定

将待插入片段的双酶切产物和PET-30a质粒的双酶切产物按质量比3∶1的比例混合，加入T4 DNA连接酶(Promega)，16℃连接，反应过夜。

取连接产物加入大肠杆菌DH-5α感受态细胞中进行转化，并进行蓝白筛选和卡那霉素(Kan)抗性筛选，挑白色单菌落于含Kan(50ug/ml)的LB培养基中在37℃下培养过夜，碱裂解法小量制备质粒，对质粒进行酶切鉴定(EcoR I和Xho I)，以确定插入片段已连接到表达载体上。

(4)转化及蛋白质表达

取已制备的含插入片段的PET-30a质粒加入大肠杆菌BL-21(DE3)感受态细胞中转化，挑取白色单菌落于含Kan(50ug/ml)的LB培养基中培养过夜获得饱和培养物，取饱和培养物100ul加入10ml含Kan(50ug/ml)LB培养基中37℃培养3小时，向其中加入IPTG(异丙基硫代半乳糖苷)使其在菌液中终浓度为1mmol/L，对培养物进行诱导，继续培养三小时。

(5)表达蛋白提取与鉴定

表达培养结束后，取菌液提取蛋白进行SDS-PAGE(方法同实施例1中所述)鉴定或者免疫印迹杂交鉴定(Immunobloting)，可以确定By8亚基基因编码的蛋白已经表达。

实施例4硬粒小麦Simeto高分子量谷蛋白By8基因功能初步鉴定

从硬粒小麦品种Simeto以及大肠杆菌表达蛋白中回收纯化By8亚基，通过10g和面仪(10g面粉+10mg回收蛋白)测定揉面特性，初步鉴定By8基因的功能特性。分析结果图5所示。从图中可以看出：添加By8亚基后，形成时间加长(添加后形成时间为4.5分钟，比对照增加了2.1分钟)。同时衰落角减小，10分钟时的尾高和尾宽也都明显增加，揉面特性变好。可以初步得出结论：By8亚基可明显改善面粉的揉面特性，具有改善小麦品质的作用，属于优质亚基。

实施例5高分子量谷蛋白By8基因的应用

通过基因表达和免疫印迹杂交鉴定，证实基因By8可在E.coli高效表达，并具有功能活性。利用基因工程技术可对高分子量谷蛋白By8基因加以转移利用，如通过基因枪、花粉管通道、农杆菌转化等方法转化该基因，进而培育品质优良的转基因小麦。

序列表

<160>2

<210>1

<211>2163

<212>DNA

<213>小麦属硬粒小麦(Triticum durum)

<220>

<221>CDS

<222>(1)…(2163)

<400>1

atggctaagc ggttggtcct ctttgcgaca gtagtcatca ccctcgtggc 50

tctcactgct gctgaaggtg aggcctctag gcaactacag tgtgagcgcg 100

agctccagga gagctcgctt gaggcatgcc gacaggtcgt ggaccaacag 150

ttggccggtc ggctgccatg gagcacgggg ctccagatgc gatgctgcca 200

gcagctccga gatgttagcg ctaagtgccg cctcgtcgcc gtcagccaag 250

tcgtaagaca atatgagcaa accgtggtgc cgcccaaggg cggatccttc 300

taccctggcg agaccacacc actgcagcaa ctccaacaag taatattttg 350

gggaacatct tcacaaacag tacaagggta ttacccaagc gtaagttctc 400

ctcagcaggg gccatattat ccaggccaag cttctccaca acagccagga 450

caagggcaac agccaggcaa atggcaagaa ctgggacaag ggcaacaagg 500

gtactaccca acttctctgc atcagtcagg acaaggacaa caagggtact 550

acccatcttc tctgcagcaa ccaggacaag ggcaacagat aggacaaggg 600

caacaaggat actacccaac ttctctgcag cagccaggac aagggcaaca 650

gataggacaa ggacaacaag ggtactaccc aacttctccg caacacccag 700

gacaaaggca acaaccagga caagggcagc aaataggaca agggcaacaa 750

ctaggacaag ggcggcaaat aggacaaggg caacaatcag gacaagggca 800

acaagggtac tatccaactt ctccacagca gctaggacaa gggcaacaac 850

caggacaatg gcaacaatca ggacaagggc aacaagggta ctacccaact 900

tctcagcagc agccaggaca agggcaacaa gggcagtacc cagcttctca 950

gcagcagcca ggacaagggc aacaagggca gtacccagct tctcagcagc 1000

agccaggaca agggcaacaa gggcagtacc cagcttctca gcagcagcca 1050

gcacaagggc aacaagggca gtacccagct tctcaacaac agccaggaca 1100

agggcaacaa gggcactacc tagcttctca gcagcagcca ggacaagggc 1150

aacaacggca ctacccagct tctctgcagc aaccaggaca agggcaacaa 1200

gggcattaca cagcttctct gcagcaacca ggacaagggc aacaagggca 1250

ttacccagct tctctgcagc aggtaggtca aggacaacaa ataggacagc 1300

taggacaaag gcaacaacca ggacgagggc aacaaacaag acaagggcaa 1350

caactagaac aagggcaaca accaggacaa gggcaacaaa caagacaagg 1400

gcaacaacta gaacaagggc aacaaccagg acaagggcaa caagggtact 1450

atccaacttc tccacaacag tcgggacaag ggcaacaacc aggacaatca 1500

caacaaccag gacaagggca acaagggtac tactcaagtt ctctacaaca 1550

gccaggacaa gggctacaag ggcactaccc agcttctctg cagcagccag 1600

gacaaggaca tccaggacaa aggcaacaac caggacaagg gcaacaacca 1650

gaacaagggc aacaaccagg acaggggcaa caagggtatt atccaacttc 1700

tccgcagcag ccaggacaag ggaaacaact aggacaaggg caacaagggt 1750

actacccaac ttctccgcaa cagccaggac aagggcaaca accaggacaa 1800

gggcaacaag ggcactgccc aacttctccg cagcagacag gacaagcgca 1850

acaaccagga caaggccaac aaataggaca agtgcaacaa ccaggacaag 1900

ggcaacaagg gtactaccca atttctctgc aacagtcagg acaagggcaa 1950

cagtcaggac aagggcaaca atcaggacaa ggacaccaac taggacaagg 2000

gcagcaatca ggacaagagc aacaaggcta cgacaaccca taccatgtta 2050

acacagagca gcaaacggcc agcccaaagg tggcaaaggt gcagcaaccc 2100

gcgacacagc tgccgataat gtgtcggatg gaggggggcg acgcattgtc 2150

ggctagccag tga 2163

<210>2

<211>720

<212>PRT

<213>小麦属硬粒小麦(Triticum duruum)

<400>2

Met Ala Lys Arg Leu Val Leu Phe Ala Thr Val Val Ile Thr Leu

1 5 10 15

Val Ala Leu Thr Ala Ala Glu Gly Glu Ala Ser Arg Gln Leu Gln

20 25 30

Cys Glu Arg Glu Leu Gln Glu Ser Ser Leu Glu Ala Cys Arg Gln

35 40 45

Val Val Asp Gln Gln Leu Ala Gly Arg Leu Pro Trp Ser Thr Gly

50 55 60

Leu Gln Met Arg Cys Cys Gln Gln Leu Arg Asp Val Ser Ala Lys

65 70 75

Cys Arg Leu Val Ala Val Ser Gln Val Val Arg Gln Tyr Glu Gln

80 85 90

Thr Val Val Pro Pro Lys Gly Gly Ser Phe Tyr Pro Gly Glu Thr

95 100 105

Thr Pro Leu Gln Gln Leu Gln Gln Val Ile Phe Trp Gly Thr Ser

110 115 120

Ser Gln Thr Val Gln Gly Tyr Tyr Pro Ser Val Ser Ser Pro Gln

125 130 135

Gln Gly Pro Tyr Tyr Pro Gly Gln Ala Ser Pro Gln Gln Pro Gly

140 145 150

Gln Gly Gln Gln Pro Gly Lys Trp Gln Glu Leu Gly Gln Gly Gln

155 160 165

Gln Gly Tyr Tyr Pro Thr Ser Leu His Gln Ser Gly Gln Gly Gln

170 175 180

Gln Gly Tyr Tyr Pro Ser Ser Leu Gln Gln Pro Gly Gln Gly Gln

185 190 195

Gln Ile Gly Gln Gly Gln Gln Gly Tyr Tyr Pro Thr Ser Leu Gln

200 205 210

Gln Pro Gly Gln Gly Gln Gln Ile Gly Gln Gly Gln Gln Gly Tyr

215 220 225

Tyr Pro Thr Ser Pro Gln His Pro Gly Gln Arg Gln Gln Pro Gly

230 235 240

Gln Gly Gln Gln Ile Gly Gln Gly Gln Gln Leu Gly Gln Gly Arg

245 250 255

Gln Ile Gly Gln Gly Gln Gln Ser Gly Gln Gly Gln Gln Gly Tyr

260 265 270

Tyr Pro Thr Ser Pro Gln Gln Leu Gly Gln Gly Gln Gln Pro Gly

275 280 285

Gln Trp Gln Gln Ser Gly Gln Gly Gln Gln Gly Tyr Tyr Pro Thr

290 295 300

Ser Gln Gln Gln Pro Gly Gln Gly Gln Gln Gly Gln Tyr Pro Ala

305 310 315

Ser Gln Gln Gln Pro Gly Gln Gly Gln Gln Gly Gln Tyr Pro Ala

320 325 330

Ser Gln Gln Gln Pro Gly Gln Gly Gln Gln Gly Gln Tyr Pro Ala

335 340 345

Ser Gln Gln Gln Pro Ala Gln Gly Gln Gln Gly Gln Tyr Pro Ala

350 355 360

Ser Gln Gln Gln Pro Gly Gln Gly Gln Gln Gly His Tyr Leu Ala

365 370 375

Ser Gln Gln Gln Pro Gly Gln Gly Gln Gln Arg His Tyr Pro Ala

380 385 390

Ser Leu Gln Gln Pro Gly Gln Gly Gln Gln Gly His Tyr Thr Ala

395 400 405

Ser Leu Gln Gln Pro Gly Gln Gly Gln Gln Gly His Tyr Pro Ala

410 415 420

Ser Leu Gln Gln Val Gly Gln Gly Gln Gln Ile Gly Gln Leu Gly

425 430 435

Gln Arg Gln Gln Pro Gly Arg Gly Gln Gln Thr Arg Gln Gly Gln

440 445 450

Gln Leu Glu Gln Gly Gln Gln Pro Gly Gln Gly Gln Gln Thr Arg

455 460 465

Gln Gly Gln Gln Leu Glu Gln Gly Gln Gln Pro Gly Gln Gly Gln

470 475 480

Gln Gly Tyr Tyr Pro Thr Ser Pro Gln Gln Ser Gly Gln Gly Gln

485 490 495

Gln Pro Gly Gln Ser Gln Gln Pro Gly Gln Gly Gln Gln Gly Tyr

500 505 510

Tyr Ser Ser Ser Leu Gln Gln Pro Gly Gln Gly Leu Gln Gly His

515 520 525

Tyr Pro Ala Ser Leu Gln Gln Pro Gly Gln Gly His Pro Gly Gln

530 535 540

Arg Gln Gln Pro Gly Gln Gly Gln Gln Pro Glu Gln Gly Gln Gln

545 550 555

Pro Gly Gln Gly Gln Gln Gly Tyr Tyr Pro Thr Ser Pro Gln Gln

560 565 570

Pro Gly Gln Gly Lys Gln Leu Gly Gln Gly Gln Gln Gly Tyr Tyr

575 580 585

Pro Thr Ser Pro Gln Gln Pro Gly Gln Gly Gln Gln Pro Gly Gln

590 595 600

Gly Gln Gln Gly His Cys Pro Thr Ser Pro Gln Gln Thr Gly Gln

605 610 615

Ala Gln Gln Pro Gly Gln Gly Gln Gln Ile Gly Gln Val Gln Gln

620 625 630

Pro Gly Gln Gly Gln Gln Gly Tyr Tyr Pro Ile Ser Leu Gln Gln

635 640 645

Ser Gly Gln Gly Gln Gln Ser Gly Gln Gly Gln Gln Ser Gly Gln

650 655 660

Gly His Gln Leu Gly Gln Gly Gln Gln Ser Gly Gln Glu Gln Gln

665 670 675

Gly Tyr Asp Asn Pro Tyr His Val Asn Thr Glu Gln Gln Thr Ala

680 685 690

Ser Pro Lys Val Ala Lys Val Gln Gln Pro Ala Thr Gln Leu Pro

695 700 705

Ile Met Cys Arg Met Glu Gly Gly Asp Ala Leu Ser Ala Ser Gln

710 715 720

End

721

Claims

1.一种硬粒小麦高分子量谷蛋白By8基因，其特征在该基因具有序列表中SEQ ID NO.1第1位到2163位所示的核苷酸序列。

2.根据权利要求1所述的硬粒小麦高分子量谷蛋白By8基因，其特征在于所述基因具有的核苷酸序列还可以是序列表中SEQ ID NO.1第1位到2163位中因一个或多个核苷酸的缺失、插入或替换而形成的具有功能活性的等位基因。

3.一种含有权利要求1或2所述的硬粒小麦高分子量谷蛋白By8基因的质粒。

4.一种含有权利要求1或2所述的硬粒小麦高分子量谷蛋白By8基因的植物表达载体。

5.权利要求1或2所述的硬粒小麦高分子量谷蛋白By8基因在培育转基因小麦方面的应用。