CN1800211A - 一种小麦低分子量谷蛋白亚基及其编码基因与应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种栽培一粒小麦低分子量谷蛋白亚基及其编码基因与应用。本发明提供的小麦低分子量谷蛋白亚基，是具有序列表中SEQ ID NO：2氨基酸残基序列的蛋白质，或者是SEQ ID NO：2的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代、缺失或添加且具有与SEQ ID NO：2的氨基酸残基序列相同活性的由SEQ ID NO：2衍生的蛋白质。小麦低分子量谷蛋白亚基的编码基因，是下列核苷酸序列之一：1)序列表中SEQ ID NO：1的DNA序列；2)编码序列表中SEQ ID NO：2蛋白质序列的多核苷酸；3)与序列表中SEQ IDNO：1限定的DNA序列具有90％以上的同源性，且编码相同功能蛋白质的DNA序列。该基因可用在培育转基因小麦方面。

Description

一种小麦低分子量谷蛋白亚基及其编码基因与应用

技术领域

本发明属于生物基因工程技术领域，特别涉及一种栽培一粒小麦低分子量谷蛋白亚基LMW-M5及其编码基因与该基因通过生物技术方法改良小麦品质的应用。

背景技术

小麦是世界上栽培面积最大、产量最高、地理分布最广的三大主要粮食作物之一，在食品加工及家畜饲料等方面用途广泛。胚乳贮藏蛋白(醇溶蛋白和谷蛋白)在面团中起“骨架”作用，并赋予面包、面条以及其他食品生产所需的粘弹性。麦谷蛋白由高分子量谷蛋白亚基(HMW-GS)和低分子量谷蛋白亚基(LMW-GS)组成，其中LMW-GS约占谷蛋白含量的80％左右。大量研究表明LMW-GS与小麦品质的优劣高度相关，对小麦加工品质具有重要作用。关于LMW-GS结构及其与品质关系的研究已取得了一定进展(Metakovsky et al.，1990)。LMW-GS基因主要定位于第一部分同源群染色体短臂末端的Glu-A3，Glu-B3，Glu-D3三个位点上，与染色体上编码醇溶蛋白的Gli-1位点紧密连锁。少部分LMW-GS由染色体1B上的Glu-B2位点编码，位于Gli-B1与着丝点之间。LMW-GS在组成上具有高度异质性和复杂性，对其分离分析比较困难，因此相关研究远远落后于HMW-GS。在还原条件下根据SDS-PAGE中迁移的快慢，将LMW-GS分为B，C，D三种类型的亚基。C亚基分子量为30,000～40,000道尔顿，B亚基分子量40,000～50,000道尔顿，D亚基是LMW-GS中分子量较大、数量较少的一类亚基。根据成熟蛋白N-端氨基酸序列的第一个氨基酸组成，LMW-GS又可分为LMW-m，LMW-s和LMW-i三种类型。

LMW-GS基因克隆研究始于80年代初，Bartels和Thompson(1983)利用cDNA基因克隆方法从普通小麦中国春得到第一个LMW-GS基因的部分序列。1998年Cassidy等根据已克隆的17个LMW-GS基因，分析对比它们的氨基酸序列，构建了LMW-GS的一般结构模式。LMW-GS依次由20个氨基酸的信号肽，13个氨基酸的N-端保守区，70-186个氨基酸的中间重复区和C-端保守区组成(Lee et al.，1999；D’Ovidio et al.，1999；D’Ovidio et al.，2004)。目前已克隆的LMW-GS基因大约70-80个左右，大多为C类亚基，B类亚基较少，现在用于LMW-GS基因克隆的方法主要有cDNA基因克隆、基因组DNA克隆、PCR克隆等。PCR基因克隆方法是根据LMW-GS基因两端保守序列来设计特异引物，用PCR直接扩增得到谷蛋白基因，然后克隆到载体上并测序。这个方法利用了PCR迅速、灵敏等优点，避免了前两种方法建库筛库的繁重工作，因此近几年来成为分离克隆LMW-GS基因的重要手段。

栽培一粒小麦(Triticum monococcum L.，2n＝2x＝14，A^mA^m)与六倍体面包小麦的祖先乌拉尔图小麦(Triticum urartu，2n＝2x＝14，A^uA^u)的亲缘关系很近(Dvorak et al.，1988)。栽培一粒小麦中存在着广泛的谷蛋白亚基变异，LMW-GS的丰富变异将为面包小麦品质改良提供重要的基因资源(Borghi et al.，1996)。目前关于栽培一粒小麦中LMW-GS的鉴定和分子克隆仅有少量报道(Corbelliniet al.，1999；Tranquilli et al.，2002；Wicker et al.，2003)，从栽培一粒小麦中克隆新的候选优质基因对小麦品质的改良具有重要的现实意义。

发明内容

本发明的目的在于从栽培一粒小麦TM-M5中分离、鉴定低分子量谷蛋白亚基LMW-M5和克隆得到其编码基因，通过常用基因工程技术，可培育优质转基因小麦，从而改善小麦品质。

本发明所提供的小麦低分子量谷蛋白亚基LMW-M5，来源于栽培一粒小麦TM-M5，它是具有序列表中SEQ ID NO：2的氨基酸残基序列的蛋白质，或者是SEQ ID NO：2的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代、缺失或添加且具有与SEQ ID NO：2的氨基酸残基序列相同活性的由SEQ ID NO：2衍生的蛋白质。

序列表中的SEQ ID NO：2是由353个氨基酸残基组成的蛋白质。

小麦低分子量谷蛋白亚基LMW-M5的编码基因，是下列核苷酸序列之一：

1)序列表中SEQ ID NO：1的DNA序列；

2)编码序列表中SEQ ID NO：2蛋白质序列的多核苷酸；

3)与序列表中SEQ ID NO：1限定的DNA序列具有90％以上的同源性，且编码相同功能蛋白质的DNA序列。

目前克隆谷蛋白基因主要采用建库筛选和PCR方法，本发明通过等位基因特异PCR(AS-PCR)技术，结合SDS凝胶电泳和基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)方法，在栽培一粒小麦中鉴定、分离了一个新的低分子量谷蛋白LMW-M5亚基及其编码基因。LMW-M5亚基是目前发现的第一个含有9个半胱氨酸残基的LMW-i型亚基。根据LMW-GS的结构特征，LMW-M5亚基中这个额外的半胱氨酸残基将增加分子间的二硫键，可能与其它麦谷蛋白亚基交联进而产生更加复杂的聚合体，像优质HMW谷蛋白亚基1Dx5那样产生更加富有弹性的麦谷蛋白聚合体(Shewry et al.，1992)，从而增加面团粘弹性和延伸性。因此，可以预测LMW-M5基因有可能是对小麦品质具有重要作用的候选优质基因。

基因结构特征

栽培一粒小麦TM-M5低分子量谷蛋白亚基的SDS凝胶电泳和MALDI-TOF-MS鉴定图谱如图1、图2所示。TM-M5的LMW-GS主要由B和C类亚基组成，分子量在30KD-44kD之间，根据蛋白质N-端、C-端保守序列和已发表的基因序列设计AS-PCR引物，用引物LMW-3+LMW-4扩增LMW-M5基因，得到长度为1646bp单一扩增产物，正好相对于LMW-GS基因的编码区加上游启动子序列大小，而且从叶片和种子DNA获得的结果一致，说明所设计的引物特异性高。

序列分析表明，该基因由386bp的上游、1059bp编码区和195bp的下游组成。LMW-M5基因上游区包括一些典型的真核基因序列，如一个CAAT框，位于启始密码子ATG上游-6bp到-10bp的位置。两个TATA框分别位于-57bp到-62bp和-74bp到-79bp的位置。在启始密码ATG上游-305bp到-279bp，有一个保守的胚乳框序列：ACATGTAAAGTTAATAAGGTGGAGTCAT，该序列也称为-300元件(Colot et al.，1987；Forde et al.，1985)，结合控制转录水平的转座因子(Bartels and Thompson，1986)。195bp的下游区域含有三个序列为AATAAA的多腺苷酸化信号，分别位于终止密码子下游73到78，131-136和141到146三个位置。

LMW-M5基因包括一个无内含子的1059bp开放阅读框(编码353个氨基酸残基)，末端有两个终止密码子，由DNA序列推导出的氨基酸序列如序列表中SEQ ID NO：2所示。氨基酸序列显示为典型的LMW-GS多肽结构，包括四个主要的结构区域：20个氨基酸残基组成的信号肽，接下来为13个氨基酸残基组成的短5’N-端区，然后为富含谷酰氨和脯氨酸的重复区，由156个氨基酸残基组成。最后为富含半胱氨酸残基的3’C端区。N-端区第一个氨基酸为异亮氨酸，所以LMW-M5亚基为LMW-i型亚基。重复区主要由P1-2FSQ2-6重复序列构成。C端区除含有8个保守的半胱氨酸残基外，在第67位氨基酸残基上又出现一个新的半胱氨酸残基，由单核苷酸突变即T-C的转换，导致了精氨酸—半胱氨酸的替换。根据氨基酸序列推导的LMW-M5亚基的分子量是38.5206kD，比MALDI-TOF-MS的检测结果(39.0080kD)低487.4Da，推测该蛋白亚基可能存在某种形式的蛋白质翻译后修饰(PTMs)，如蛋白质磷酸化或糖基化等。

LMW-M5亚基基因与已克隆的LMW-i型亚基AY542896基因(Cloutier et al.，2001)同源性较高，与该亚基相比，有27个氨基酸残基的替换，5个片断的缺失，具有97％的相似性，AY542896已被证明为优质基因。另外，也具有9个半胱氨酸残基的LMW-m型亚基基因AY263369可能是面包小麦小偃6号优良品质的重要原因(赵慧贤等2004，做物学报，30：126-130)，这一结构特征很可能对小麦面筋品质具有重要作用。LMW-M5亚基是在栽培一粒小麦中首次发现的具有9个半胱氨酸残基的LMW-i型亚基，它很可能是面包小麦品质改良中具有应用前景的候选优质基因。

附图说明

图1：栽培一粒小麦TM-M5高低分子量谷蛋白亚基SDS-PAGE凝胶电泳鉴定(图中箭头所示为LMW-M5亚基)，1为蛋白Marker，2为中国春(CK)，3为TM-M5。

图2：栽培一粒小麦TM-M5低分子量谷蛋白亚基MALDI-TOF-MS鉴定(括弧内为基因编码序列推导的分子量)。

图3：栽培一粒小麦TM-M5低分子量谷蛋白亚基LMW-M5基因的PCR扩增，1为1kb DNA ladder Marker，2为LMW-M5基因(种子基因组DNA)。

具体实施方式

实施例1  栽培一粒小麦TM-M5低分子量谷蛋白亚基LMW-M5的SDS-PAGE鉴定

(1)植物材料：栽培一粒小麦TM-M5，普通小麦中国春作对照。

(2)谷蛋白的提取与样品制备

半粒种子扎碎后将面粉放入1ml离心管，然后加入0.3ml 55％异丙醇，涡旋1分钟，65℃水浴振荡30分钟，10000rpm离心10分钟，弃上清。上述处理面粉的操作重复3次，用滤纸吸去残余上清，将醇溶蛋白去除干净；加0.1ml 55％异丙醇(含有0.08M Tris-HCL，pH8.0，和1％二硫苏糖醇，新鲜加入)，充分混合，65℃水浴充分振荡30分钟；加0.1ml 55％异丙醇，0.08M Tris-HCL，pH8.0，含1.4％新鲜混合的4-乙烯基吡啶，混合并在65℃水浴中振荡30分钟，12000rpm离心10分钟；将0.06ml上清转入新管，加0.06ml样品缓冲液(2％SDS，0.02％溴酚蓝，0.08M Tris-HCl，pH8.0，40％甘油)，65℃水浴中振荡30分钟，12000rpm离心10分钟，作SDS-PAGE上样用。

(3)SDS-PAGE鉴定

利用Boi-Rad Mini-PROTEAN 3电泳槽、4％浓缩胶、10％分离胶，磷酸-甘氨酸缓冲液系统，10mA电泳2小时，0.1％考马斯亮蓝R-250染色，25％甲醇和乙酸7％脱色，电泳图谱如图1所示。图中箭头所指为LMW-M5亚基，分子量大约在40kD左右。

实施例2  栽培一粒小麦TM-M5低分子量谷蛋白亚基LMW-M5的MALDI-TOF-MS鉴定

(1)样品制备

一粒种子砸成粉末状放入1ml离心管，加入0.5ml 70％乙醇，涡旋1/2个到1个小时，13000g离心5min，去上清。加入0.5ml 55％异丙醇，混匀，65℃水浴30min，13000g离心5min，去上清并用滤纸吸干净，此步骤重复3次。加入0.5ml55％异丙醇(含有0.08M Tris-HCL，pH8.0，和5％β-巯基乙醇)，混匀65℃水浴30min。取上清加入-20℃预冷的丙酮(丙酮浓度达80％)，沉淀1-2小时，13000g离心5min，去上清，室温干燥。加入10μl 0.5％TFA+50％乙腈溶液溶解。

(2)MALDI-TOF-MS鉴定

使用岛津AX1MA-CFRTMPlus型基质辅助激光解析附电离飞行质谱仪(配有软件用于系统操作和数据处理)：全自动样品处理，软件控制精确定位，具有延迟提取(DE)、源后裂解(PSD)功能。

靶板的清洗(384型)：用棉球沾取甲醇，擦去靶板上的样品，1％甲酸超声10-15min，ddH₂O冲洗，加丙酮超声10-15min，加甲醇超声10-15min，加水超声10-15min，取出靶板，用甲醇冲洗，通风橱中干燥。

基质的选择与制备：选用芥子酸SA(3，5-Dimethexycinnamic acid)，10mg基质溶于1ml 50％乙腈+0.05％TFA中，避光保存。

标样的制备与选择：Albumin(39212.88Da、66431.08Da)，0.1％TFA溶解

上样前处理：1％TFA平衡ZIPtip，过滤样品：反复抽吸5-10次，1％TFA过滤，0.4ulμElution Buffer洗脱样品

参数的设置：大分子量的测定采用线性模式，分子量范围10000-100000Da。

利用上述方法获得了TM-M5低分子量谷蛋白亚基组成图谱及其精确分子量(如图2所示)，其中LMW-M5亚基测得的分子量为39008.0kD(图2箭头所指的蛋白峰，括弧内为其基因编码序列推导的分子量)。

实施例3栽培一粒小麦TM-M5低分子量谷蛋白LMW-M5基因的分离与鉴定

(1)亚基转膜与N-端微量测序(microsequencing)

将SDS凝胶电泳上的蛋白条带切下，回收纯化后利用毛细管电泳检测纯度，然后通过Bio-Rad MiniTrans-Blot电转印到PVDF膜上，在ABI cLC 491蛋白质测序仪上进行N-端微量测序。

(2)AS-PCR引物设计

根据所得到的LMW谷蛋白N-端序列和已发表的相关基因保守序列设计AS-PCR引物，用以扩增LMW亚基基因的上游序列、编码区和下游序列。引物序列如下：

LMW-3：5’-GCCTTTCTTGTTTACGGCTG-3’

LMW-4：5’-TCAGATTGACATCCACACAAT-3’

(3)叶片与种子基因组DNA提取

选取饱满的种子，用7％次氯酸钠消毒10分钟，25℃条件下浸种催芽过夜，黑暗25℃培养7～8天。用0.1克黄化苗按CTAB法提取基因组DNA。

取20mg砸碎的种子提取gDNA，于1.5ml eppendorf离心管内，加入100μl提取缓冲液(200mM Tris-HCl，pH7.5，288mM NaCl，25mM EDTA，0.5％SDS)浸泡10min。再加入700μl提取缓冲液，涡旋20sec后，12000rpm离心5min。取上清，加入700μl氯仿∶异戊醇(24∶1)，12000rpm离心10min。保留上清，加入700μl异丙醇，沉淀10min，12000rpm离心15min，弃上清，干燥后向沉淀中加入40μl TE缓冲液(10mM Tris-HCl，pH8.0，1mM EDTA，pH8.0)，溶解24小时后，电泳检测DNA浓度，-20℃保存。

(4)LMW-GS全基因序列的PCR扩增

引物由上海Sangong公司合成，PCR用酶购自TaKaLa宝生物工程公司，PCR回收Kit购自上海Sangong公司，T-Vector连接Kit为Promega产品。

PCR反应体系

①编码区PCR体系和程序

A.50μl体系：

La Taq酶                        2.5U

2×GC Buffer II(MgCl²⁺Plus)    25μl

dNTP                            0.4mM

每条引物                        0.5μM

模板DNA                         100ng

灭菌蒸馏水                      Xμl

总体积                          50μl

B.反应程序：94℃变性2分钟；94℃变性45秒，58℃退火1分钟，72℃延伸2分钟，共35个循环；最后72℃延伸10分钟。用1％琼脂糖凝胶检测PCR产物，结果如图3，叶片与种子基因组DNA的PCR结果一致，均扩增出约1700bp的单一条带，与一个LMW-GS基因全编码序列相当。

PCR产物的回收

①将所需的凝胶电泳条带切下放于1.5ml离心管中，加入3倍体积的Binding Buffer，并于75℃水浴中使琼脂糖凝胶充分溶解。

②将UNIQ-10柱放入2ml收集管中，将凝胶溶解物转移到UNIQ-10柱中，室温放置2分钟后以8000rpm离心1分钟。

③取下UNIQ-10柱，倒掉收集管中的废液，将UNIQ-10柱放入同一收集管中，加入500μl Binding Buffer，8000rpm离心1分钟。

④取下UNIQ-10柱，去掉管中液体，加入500μl Wash Buffer，8000rpm离心1分钟；重复一次。

⑤取下UNIQ-10柱，去掉管中液体，将UNIQ-10柱放入同一收集管中，让离心管盖开着，室温12000rpm离心1分钟。

⑥将UNIQ-10柱放入一新1.5ml离心管中，在柱子膜中央加30μl ddH₂O，室温或60℃放置2分钟。

⑦室温12000rpm离心1分钟后即得到回收产物，可立即使用或-20℃保存。

(5)LMW-GS基因的PCR克隆和鉴定

①连接反应体系：

2^*rapid ligation buffer           5μl

pGEM-T Vector                      0.5μl

T4 DNA Ligase              1μl

PCR回收产物                3.5μl

共10μl体积，4℃连接过夜。

②连接产物转化大肠杆菌DH-5α感受态细胞

A.大肠杆菌感受态细胞DH-5α的制备：划板复壮宿主菌后，挑一单菌落于50ml的LB(Tryptone 10g/L；Yeast extract 5g/L；NaCl 5g/L；pH7.0)液体培养基中，37℃摇至OD₆₀₀＝0.3-0.4，取出置于冰上20分钟。将菌液移至一灭菌的50ml离心管中，4℃4000rpm离心10分钟，回收细胞。将细胞沉淀以10ml冰预冷的0.1mol/L的CaCl₂重悬，并置于冰上30分钟。4℃4000rpm离心10分钟，弃上清，用4ml冰预冷的0.1mol/L的CaCl₂重悬菌体，加入灭菌甘油至终浓度30％，分装后存于-70℃。

B.重组质粒向宿主菌的转化：取100μl DH-5α感受态细胞0.5ml的离心管中，加入10μl的连接产物并轻旋以混匀内含物，置于冰上30分钟。42℃热激90秒，置于冰上1-2分钟。加入400ul 37℃预热的LB培养基，37℃ 150rpm，摇培45分钟。取150μl菌液铺于涂有IPTG和X-Gal的LB平板上(Amp100μl/ml)，37℃倒置培养12-16小时。

③质粒的提取

A.挑取单菌落于10ml LB(Amp 80μl/ml)液体培养基，37℃培养过夜。将菌液移至1.5ml的离心管中，12000rpm离心2分钟，弃上清，收集菌体。

B.加入100μl冰预冷的溶液I(50mM葡萄糖、25mM Tris-HCl pH8.0、10mMEDTA pH8.0)，充分悬浮菌液，室温放置5分钟。

C.加入新鲜配制的200μl的溶液II(0.2MnaOH、1％SDS)，轻摇菌液，冰上放置5分钟。

D.加入150μl冰预冷的溶液III(60ml 5M乙酸钾、11.5ml冰乙酸、28.5ml双蒸水)清摇菌液，冰上放置5分钟，12000rpm离心10分钟，移上清至一新离心管。

E.加入等体积的酚/氯仿(1∶1)抽提一次，12000rpm离心5分钟，移上清至一新离心管。

F.加入2倍体积的无水乙醇，-20℃沉淀1小时，12000rpm离心10分钟。

G.用75％乙醇洗涤沉淀两次，12000rpm离心5分钟。

H.吹干，溶于灭菌的ddH₂O(含0.02mg/mlRNase)，做电泳检测。

④重组质粒PCR法鉴定与序列测定

A.按前述PCR反应体系和程序进行重组质粒鉴定。

B.经鉴定的质粒进行DNA序列测定，测3个重组质粒，由TaKaRa Biotech公司完成，得到了LMW-M5基因共1646bp，如序列表中SEQ ID NO：1所示的编码全序列，该核苷酸序列包括一个386bp的上游、1059bp无内含子的可读框(编码353个氨基酸残基)和195bp的下游序列。

实施例4  低分子量谷蛋白LMW-M5基因的应用

小麦LMW-GS对面包烘烤及面条加工品质所起的重要作用已被众多的研究者所证实，改善麦谷蛋白的低分子量亚基构成，将是改良小麦品种加工品质的重要途径。可利用基因工程技术对低分子量谷蛋白LMW-M5基因加以转移利用，如通过基因枪、花粉管通道、农杆菌转化等方法转化该基因，进而培育品质优良的转基因小麦。

                         序列表

<160>2

<210>1

<211>1646

<212>DNA

<213>栽培一粒小麦(Triticum monococcum)

<400>1

gcctttcttg  tttacggctg  acagcctata  caaggttcca  aactcggctg    50

caaaagtgat  actatcctga  taagtgcgtg  acatgtaaag  ttaataaggt    100

gagtcatatg  taccaaacat  tgaggtttct  ctactttgtg  tgtgatcata    150

tgcacaacta  aaaagcaact  ttgatgatga  atccaaaagt  acgcttttgt    200

agctagtgca  acccaacaca  atgtacaaaa  aaaattcatt  tcagatgcat    250

ccaaacagaa  ttattaaagc  tgatgcaaag  aaggaaaaga  ggtggtgtcc    300

cggctactat  aaataggcac  gaagtataaa  tatcatcaca  agcacaagca    350

tcaaaaccga  gcaacactag  ttaacaccaa  tccacaatga  agaccttcct    400

cgtctttgcc  ctcctcgctc  ttgcggcggc  aagtgccgtt  gcgcaaattt    450

cacagcaaca  acaacaacca  ccattttcac  agcaacaaca  accaccgttt    500

ttacagcatc  agcaaccacc  attttcgcag  caacagcaat  caccattctc    550

gcagcaacaa  gaacaacaac  aacaaccact  attttcgcag  caacaacaaa    600

caccaatttc  acggcagcaa  caaccaccat  tttcacagca  acagcaacca    650

tcattttcgc  agcaacaaca  gccaccgtat  gcgcagcaac  aacagccacc    700

atattcgcag  caacaacaac  caccattttc  acaacaacaa  caagcaccat    750

tttcgcagca  acaacagcca  ccattttcgc  agcaacaaca  acaacaacca    800

tttacacaac  aacaacaacc  accgttttca  caacaaccac  caatttcaca    850

gcagcaacaa  ccactatttt  cgcagcaaca  acaaccacca  ttttcacagc    900

aacaacaaat  accagttatt  catccatctg  ttctgcagca  gctaaaccca    950

tgcaaggtat  tcctccagca  gcagtgcatc  cctgtggaaa  tgcagcgatg    1000

tcttgctagg  tcgcaaatgt  tgcagcagag  catttgccat  gtgatgcagc    1050

aacaatgttg  ccagcagttg  cggcaaatcc  ccgagcaatc  ccgccatggg    1100

tcaatctgtg  ctatcgtcta  ctctatcatc  ctgcagcagc  aacagcagca    1150

gcaacaacaa  caacaacagg  ctcagagtgt  catccattat  cagcaacaac    1200

aaccccaaca  gttgggccaa  tgtgtctccc  aaccccaaca  gcagttgcag    1250

cagcaactcg  ggcagcaacc  tcaacaacaa  caactggcac  atggtacctt    1300

tttgcagcca  caccagatag  ctcagcttga  ggtgatgact  tccattgcac    1350

tccgtaactt  gccgacgatg  tgcagtgtca  acgtgccgtt  gtacgaaacc    1400

accactagtc  tgccattagg  cgttggcatc  ggagttggtg  tctactgata    1450

agaaaagatc  tctagtaata  tatagttgga  tcaccgttgt  ttagtcgatg    1500

gatatgtcga  tgtagcgttg  acaaataaag  tgccacacaa  cgtcatgtgt    1550

gaccctgtca  aactagttgt  ttaaattctg  aaataaaatg  caataaagtt     1600

gtatcaagac  aatgttcata  tcggcattgt  gtggatgtca  atctga         1646

<210>2

<211>353

<212>PRT

<213>栽培一粒小麦(Triticum monococcum)

<400>2

Met Lys Thr Phe Leu Val Phe Ala Leu Leu Ala Leu Ala Ala Ala

1               5                   10                  15

Ser Ala Val Ala Gln Ile Ser Gln Gln Gln Gln Gln Pro Pro Phe

                20                  25                  30

Ser Gln Gln Gln Gln Pro Pro Phe Leu Gln His Gln Gln Pro Pro

                35                  40                  45

Phe Ser Gln Gln Gln Gln Ser Pro Phe Ser Gln Gln Gln Glu Gln

                50                  55                   60

Gln Gln Gln Pro Leu Phe Ser Gln Gln Gln Gln Thr Pro Ile Ser

                65                  70                  75

Arg Gln Gln Gln Pro Pro Phe Ser Gln Gln Gln Gln Pro Ser Phe

                80                  85                  90

Ser Gln Gln Gln Gln Pro Pro Tyr Ala Gln Gln Gln Gln Pro Pro

                95                  100                 105

Tyr Ser Gln Gln Gln Gln Pro Pro Phe Ser Gln Gln Gln Gln Ala

                110                 115                 120

Pro Phe Ser Gln Gln Gln Gln Pro Pro Phe Ser Gln Gln Gln Gln

                125                 130                 135

Gln Gln Pro Phe Thr Gln Gln Gln Gln Pro Pro Phe Ser Gln Gln

                140                 145                 150

Pro Pro Ile Ser Gln Gln Gln Gln Pro Leu Phe Ser Gln Gln Gln

                155                 160                 165

Gln Pro Pro Phe Ser Gln Gln Gln Gln Ile Pro Val Ile His Pro

                170                 175                 180

Ser Val Leu Gln Gln Leu Asn Pro Cys Lys Val Phe Leu Gln Gln

                185                 190                 195

Gln Cys Ile Pro Val Glu Met Gln Arg Cys Leu Ala Arg Ser Gln

                200                 205                 210

Met Leu Gln Gln Ser Ile Cys His Val Met Gln Gln Gln Cys Cys

                215                 220                 225

Gln Gln Leu Arg Gln Ile Pro Glu Gln Ser Arg His Gly Ser Ile

                230                 235                 240

Cys Ala Ile Val Tyr Ser Ile Ile Leu Gln Gln Gln Gln Gln Gln

                245                 250                 255

Gln Gln Gln Gln Gln Gln Ala Gln Ser Val Ile His Tyr Gln Gln

                260                 265                 270

Gln Gln Pro Gln Gln Leu Gly Gln Cys Val Ser Gln Pro Gln Gln

                275                 280                 285

Gln Leu Gln Gln Gln Leu Gly Gln Gln Pro Gln Gln Gln Gln Leu

                290                 295                 300

Ala His Gly Thr Phe Leu Gln Pro His Gln Ile Ala Gln Leu Glu

                305                 310                 315

Val Met Thr Ser Ile Ala Leu Arg Ash Leu Pro Thr Met Cys Ser

                320                 325                 330

Val Asn Val Pro Leu Tyr Glu Thr Thr Thr Ser Leu Pro Leu Gly

                335                 340                 345

Val Gly Ile Gly Val Gly Val Tyr

                350         End

Claims (8)

1.一种小麦低分子量谷蛋白亚基，它是具有序列表中SEQ ID NO：2氨基酸残基序列的蛋白质，或者是SEQ ID NO：2的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代、缺失或添加且具有与SEQ ID NO：2的氨基酸残基序列相同活性的由SEQ ID NO：2衍生的蛋白质。

2.根据权利要求1所述的小麦低分子量谷蛋白亚基，其特征在于所述小麦低分子量谷蛋白亚基是序列表中的SEQ ID NO：2。

3.一种小麦低分子量谷蛋白亚基的编码基因，是下列核苷酸序列之一：

1)序列表中SEQ ID NO：1的DNA序列；

2)编码序列表中SEQ ID NO：2蛋白质序列的多核苷酸；

3)与序列表中SEQ ID NO：1限定的DNA序列具有90％以上的同源性，且编码相同功能蛋白质的DNA序列。

4.根据权利要求3所述的基因，其特征在于所述的小麦低分子量谷蛋白亚基的编码基因是序列表中的SEQ ID NO：1。

5.含有权利要求3所述的小麦低分子量谷蛋白亚基基因的质粒。

6.含有权利要求3所述的小麦低分子量谷蛋白亚基基因的表达载体。

7.含有权利要求3所述的小麦低分子量谷蛋白亚基基因的细胞系。

8.权利要求3所述的小麦低分子量谷蛋白亚基基因在培育转基因小麦方面的应用。